CN117265011A - 一种提高慢病毒滴度的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，提供了一种提高慢病毒滴度的小分子药物及其应用。具体而言，所述小分子药物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344。本发明通过将慢病毒包装系统质粒和转移质粒共同转染病毒包装工具细胞后使用所述小分子药物处理，可显著促进慢病毒的产生至2.44倍，为高滴度慢病毒的制备提供了一种简单经济的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，本发明涉及一种提高慢病毒滴度的药物，及其应用和使用方法。
背景技术
慢病毒是一种单链RNA(ssRNA)病毒，属于逆转录病毒科。从人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)衍生而来的慢病毒载体在过去二十年中被广泛研究。慢病毒载体具有多项优势，如可整合到目标细胞基因组后实现稳定长期表达；具有更大的基因装载能力，包装容量高达9kb；具有感染非分裂细胞/分裂细胞的能力；较小的免疫原性，具有相对安全性。天然状态下HIV可感染CD4+细胞如T细胞和巨噬细胞，感染细胞类型具有局限性；而通过使用水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白(Vesicular Stomatitis VirusGlycoprotein VSV-G)代替HIV包膜蛋白时，可感染多种细胞类型，极大地扩展了慢病毒载体的用途。
目前慢病毒也已广泛用于临床前和临床中的基因递送，而慢病毒的滴度将极大地影响着基因递送效率。然而，高滴度慢病毒的生产是困难和昂贵的，如何简单且经济有效地提高慢病毒滴度一直是研究人员关注的问题。
第二代慢病毒载体系统中慢病毒的生产主要依赖于将编码VSVG包膜蛋白的包膜质粒、编码gag、pol等辅助基因的包装质粒和包含目的基因的转导质粒三个质粒共转染到HEK293T细胞中，在细胞内进行基因的转录翻译、相关蛋白的合成、病毒的组装等一系列过程后，最终病毒颗粒释放至细胞上清中。而利用小分子药物促进上述慢病毒产生途径，将可能为慢病毒滴度提高提供一种简单经济的方法。
染色质由DNA和组蛋白组成，其基本单位是核小体。组蛋白修饰可通过改变细胞核中染色质的构象或招募重构酶，调节基因的转录。其中乙酰化是常见的组蛋白修饰之一。组蛋白乙酰基转移酶(Histone Acetyltransferases，HATs)可催化组蛋白上的乙酰化，使从核小体伸出的N-末端组蛋白尾部的赖氨酸残基带负电荷，通过同种电荷相互排斥使得染色质结构变得松弛而处于更加开放的状态，允许转录因子结合，增加基因表达。而组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)可逆转这一过程。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase Inhibitors，HDACi)是一类具有抑制HDAC活性的化合物，可增强细胞中的转录水平。目前多种HDACi已被开发出来，并根据它们的化学结构进行分类:(1)氧肟酸盐，如TSA、SAHA等；(2)短链脂肪酸，如VPA、丁酸钠等；(3)苯甲酰胺如Entinostat、Tacedinaline和M344等；(4)环肽，如Romidepsin、apicidin等。
然而，到目前为止，仅短链脂肪酸中丙戊酸、丙酸钠、丁酸钠被证实具有提高慢病毒滴度的作用，而尚未见其余HDACi的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高慢病毒滴度的方法，经济有效地实现高滴度慢病毒的制备。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种提高慢病毒滴度的药物，所述药物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344。
本发明提供了M344在提高慢病毒滴度中的应用。
所述的慢病毒可以采用常规方法进行制备，例如将慢病毒包装质粒和核心质粒对病毒包装工具细胞进行转染，将转染后的病毒包装工具细胞进行孵育并收取上清，以便获得慢病毒并进一步测定慢病毒滴度。
本发明的应用中，慢病毒制备可以包括如下步骤：
S1：将慢病毒辅助质粒和转移质粒对病毒包装工具细胞进行转染；
S2：将转染后的病毒包装工具细胞进行培养，收集慢病毒原液并进行浓缩，测定滴度。
优选地，所述病毒包装工具细胞为HEK293T细胞、HEK293FT细胞、HEK293T-17细胞等产毒细胞系。
优选地，所述病毒辅助质粒为psPAX2和pMD2.G等慢病毒辅助质粒。
优选地，细胞转染8-12小时后加入M344，M344浓度范围为0-2.5μM，最优浓度为0.6-1μM，不包括端点。例如，M344在细胞培养基中的浓度为0.01μM、0.06μM、0.125μM、0.25μM、0.45μM、0.60μM、0.65μM、0.70μM、0.80μM、0.90μM等等。
优选地，药物处理时间为12-36小时,更优地，M344处理时间为18-24小时。例如，M344处理细胞的时间为14、16、19、20、21、22、23小时，等。
在本发明的一个优选例中，所述慢病毒制备方法包括如下步骤：
(1)提前12-16小时接种HEK293T细胞。转染时细胞密度达到80％以上并更换DMEM基础培养基；
(2)在OPTI-MEM培养基中加入包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和转移质粒，静置5分钟；另一OPTI-MEM培养基中加入PEI(质粒质量和的3倍)；
(3)将步骤(2)中两种OPTI-MEM溶液混匀后室温静置20分钟，加入HEK293T细胞中。转染12小时后更换含有M344的DMEM完全培养基。收取48小时和72小时病毒上清液，测定慢病毒滴度。
本发明还提供了一种提高病毒包装工具细胞的病毒滴度的方法，所述的方法是在慢病毒的载体系统转染体外培养的病毒包装工具细胞后，病毒包装工具细胞培养过夜，然后在病毒包装工具细胞的培养介质中加入M344。
较好的，加入M344处理后，病毒包装工具细胞的培养时间不少于12小时。
较好的，所述药物M344可以在转染8-12小时后加入HEK293T细胞培养基中，处理时间为12-36小时。M344处理后使用完全培养基继续培养细胞。
在本发明的一个优选例中，所述药物具体为组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344，购自MCE。M344在慢病毒质粒转染12小时后加入HEK293T细胞培养基中，处理时间为36小时。
本发明的积极进步效果在于：
利用本发明的药物可有效提高慢病毒滴度。实验结果表明，与阳性对照丁酸钠相比，组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344具有更强的提高慢病毒滴度作用，慢病毒滴度可提高至未处理组的2.44倍。本发明提供了一种简单而经济有效的提高慢病毒滴度的药物。
附图说明
为了更加清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是丁酸钠和M344对EGFP慢病毒病毒RNA的影响图。
将psPAX2、pMD2.G和FUGW同时转染HEK293T细胞，转染12小时后更换含药物的新鲜培养基，收取转染48小时和72小时细胞培养液，提取病毒液RNA，qPCR检测候选药物对FUGW慢病毒RNA拷贝变化情况(n＝3)。数据表示为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。P值为各药物浓度处理组与未处理组通过Student’s t-test得出。
图2是流式检测病毒感染后的Jurkat细胞GFP表达情况图。
将psPAX2、pMD2.G和FUGW同时转染HEK293T细胞，转染12小时后更换含药物的新鲜培养基，收取转染48小时和72小时细胞培养基，通过流式检测FUGW慢病毒滴度变化情况。浓缩病毒液感染Jurkat细胞，流式检测Jurkat细胞GFP表达情况。
图3是丁酸钠和M344对EGFP慢病毒滴度的影响图。
其中，数据表示为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝3。P值为各药物浓度处理组与未处理组通过Student’s t-test得出。
图4是M344对HEK293T细胞活性的影响图。
其中，数据表示为平均值±SD，**P<0.01，***P<0.001，n＝3。P值为各药物浓度处理组与未处理组通过Student’s t-test得出。
图5是apicidin对EGFP慢病毒滴度的影响图。
图6是apicidin对EGFP慢病毒滴度影响的统计结果。
使用流式细胞仪检测慢病毒感染后的Jurkat细胞GFP表达情况；实验独立重复三次后，统计apicidin对EGFP慢病毒滴度影响的结果，数据表示为平均值±SD，n＝3。P值为各药物浓度处理组与未处理组通过Student’st-test得出。
具体实施方式
本发明提供了一种提高慢病毒滴度的药物，为组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344。本发明经试验表明将慢病毒包装系统质粒和核心质粒共同转染产毒细胞系后使用所述药物处理，可显著提高慢病毒滴度；其中，与阳性对照丁酸钠相比，M344具有更强的提高慢病毒滴度作用，慢病毒滴度可提高至未处理组的2.44倍。本发明的药物将为高滴度慢病毒的制备提供一种简单经济、高效实用的方法。
结合以下优选实施例和说明书的附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制的内容。
实施例1：EGFP慢病毒制备和药物处理
1.HEK293T细胞准备
提前于15mL离心管中加入9mL预热DMEM基础培养基。从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的HEK293T细胞(购自上海中科院细胞库)放至37℃水浴至液体融化后吸取细胞悬液逐滴加到15mL离心管中，100g离心5分钟，仔细吸去上清，使用10mL DMEM完全培养基(DMEM基础培养基+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液)重悬细胞，转移至10cm细胞培养皿中，放入细胞培养箱培养。当细胞密度达到90％以上时进行传代培养，操作如下：吸弃旧培养基，加入2mL1×PBS溶液润洗细胞。加入1-2mL胰酶，轻轻晃动至液体覆盖培养皿底部，37℃放置2-3分钟，使用DMEM完全培养基终止消化并收集所有细胞，100g离心5分钟；弃上清，加入DMEM完全培养基重悬细胞沉淀并按照合适比例传代。
2.转染HEK293T细胞
在6孔板中提前12-16小时根据细胞生长速度按一定密度接种HEK293T细胞，转染时细胞密度达到80％左右。转染前提前30分钟以上将细胞培养基换成DMEM基础培养基，每孔体积为1.6mL，放回细胞培养箱中。配制PEI溶液和质粒溶液，每孔配制体系如下：PEI溶液配制：Ep管中加入200μL OPTI-MEM基础培养基，逐滴加入12μL PEI，颠倒混匀，室温静置5分钟；质粒溶液配制：在Ep管中加入200μL的OPTI-MEM基础培养基，分别加入0.68μgpMD2.G、1.36μg psPAX2和2μg FUGW(表达绿色荧光蛋白EGFP)，颠倒轻弹；将PEI溶液逐滴加入质粒溶液中，颠倒轻弹，室温静置20分钟；将混合液逐滴均匀加到6孔板中，放回细胞培养箱中。
3.药物处理HEK293T细胞
转染12小时后，吸弃上清并使用1×PBS溶液润洗细胞。加入含有药物的DMEM完全培养基，具体选择药物及浓度梯度如下：阳性对照丁酸钠，浓度为10mM、5mM、2.5mM、1.25mM和0.625mM；M344，浓度为2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM。设置加入不含药物的DMEM完全培养基的对照组，放回细胞培养箱中。收取转染48小时后的细胞上清液，加入2mL DMEM完全培养基。收取转染72小时后的细胞上清液。
4.慢病毒的浓缩
将收集的细胞上清液2650g 4℃离心20分钟，吸取上清与5×PEG溶液混匀，4℃冰箱中放置过夜。4℃6000g离心30分钟，吸弃上清，使用RPMI 1640基础培养基重悬沉淀，获得病毒浓缩液。
实施例2：EGFP慢病毒RNA提取、反转录和qPCR
1.慢病毒RNA提取
根据碧云天RNAeasyTM病毒RNA抽提试剂盒提取病毒液RNA，-80℃保存或立即使用。
2.慢病毒RNA反转录
根据BeyoRTTMIII cDNA合成预混液说明书将病毒RNA反转为cDNA，具体程序为：42℃30分钟，80℃10分钟。病毒cDNA-20℃保存或立即使用。
3.qPCR
以WPRE为目的基因合成qPCR引物：
WPRE-F：5’GGCACTGACAATTCCGTGGT 3’(SEQ ID NO 1)；
WPRE-R：5’AGGGACGTAGCAGAAGGACG 3’(SEQ ID NO 2)。
配制除cDNA外的混合液(每孔包含WPRE-F 1μL、WPRE-R 1μL、2×SYBR Green qPCRMix 5μL、ddH2O 3μL)，每组设3个复孔。在384孔板中加入9μL混合液和1μL cDNA，贴好封板膜，3000rpm 4℃离心5分钟。上机开始反应，具体程序为：95℃5分钟，95℃10秒，60℃30秒，共40个循环。根据CT值计算实验组病毒RNA相对拷贝数。
结果显示,在设置浓度下丁酸钠、M344均能显著促进慢病毒产生；其中2.5mM的丁酸钠和0.625μM的M344展现了更佳的效果，病毒RNA拷贝数为未处理组的2.72倍、4.03倍(图1)。
实施例3：EGFP慢病毒滴度检测
在24孔板中每孔接种2×105Jurkat细胞(购自美国ATCC细胞库)，加入浓缩病毒液，补充RPMI 1640基础培养基至感染体系体积为250μL，吹打混匀后放入细胞培养箱中。12小时后100g离心5分钟，弃上清，使用RPMI1640完全培养基(RPMI 1640基础培养基+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液)重悬细胞沉淀转移至新24孔板中，72小时后收集细胞并通过流式检测细胞GFP阳性率。病毒滴度计算公式如下：
病毒滴度TU/mL＝(阳性细胞比例×接种细胞数×1000)/病毒浓缩液体积
结果显示，丁酸钠和M344药物处理组Jurkat细胞GFP阳性率均高于未处理组，证实两种药物可促进活性病毒颗粒的产生，进而提高了Jurkat细胞上的感染效率(图2)。其中丁酸钠(2.5mM)和M344(0.625μM)处理组展现了更佳的效果，计算得到病毒滴度最高可为未处理组的2.11倍、2.44倍(图3)。
实施例4：M344剂量对产毒细胞活性的影响
在96孔板中铺设HEK293T细胞并加入梯度浓度M344处理，每组设置3个复孔。培养36小时后每孔加入10μL CCK8溶液，继续培养1-4小时，使用酶标仪检测450nm处吸光值。
结果显示，当M344浓度为0.625μM时未对细胞产生毒性；随着药物浓度增加，M344细胞毒性显露且逐渐增强，当浓度为5μM时，仅约50％细胞存活(图4)。
实施例5：组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin药物处理HEK293T细胞并不能提高慢病毒滴度
同实施例1方法所述制备和浓缩EGFP慢病毒，其中使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin处理HEK293T细胞，浓度设置为5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM。同实施例3方法所述检测EGFP病毒滴度。结果表明apicidin并未影响慢病毒滴度(图5和图6)。
综上，相比于目前已经被报道的丁酸钠，M344具有更佳的提高慢病毒滴度的作用，当M344浓度为0.625μM时，可提高慢病毒滴度至2.44倍。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.M344的应用，其特征在于，M344在制备提高慢病毒滴度试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是在慢病毒的载体系统转染体外培养的病毒包装工具细胞后，病毒包装工具细胞培养过夜，然后在病毒包装工具细胞的培养介质中加入M344。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，慢病毒的制备步骤如下：
S1：将慢病毒辅助质粒和转移质粒对病毒包装工具细胞进行转染；
S2：在转染后的病毒包装工具细胞的培养介质中加入M344，进行培养，收集慢病毒原液并进行浓缩。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒包装工具细胞选自但不限于HEK293T细胞、HEK293FT细胞、HEK293T-17细胞。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，病毒包装工具细胞转染8-12小时后加入M344，添加M344的浓度范围为0.1-2.5μM；M344处理时间为12-36小时。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒辅助质粒选自但不限于psPAX2、pMD2.G。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，其特征在于，加入M344浓度范围为0.6-1μM，M344处理时间为18-24小时。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下应用方法：
(1)提前12-16小时接种HEK293T细胞，转染时细胞密度达到80％以上后更换为DMEM基础培养基；
(2)在OPTI-MEM培养基中加入包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和转移质粒，静置5分钟；另一OPTI-MEM培养基中加入PEI，PEI的加入量为质粒质量和的3倍；
(3)将步骤(2)所获得的两种OPTI-MEM溶液混匀后室温静置20分钟，加入步骤(1)的HEK293T细胞中，转染12小时后更换含有M344的DMEM完全培养基。
9.一种提高病毒包装工具细胞的病毒滴度的方法，其特征在于，所述的方法是在慢病毒的载体系统转染体外培养的病毒包装工具细胞后，病毒包装工具细胞培养过夜，然后在病毒包装工具细胞的培养介质中加入M344。
10.根据权利要求9所述的提高病毒包装工具细胞的病毒滴度的方法，其特征在于，所述的加入M344处理后，病毒包装工具细胞的培养时间不少于12小时。
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