CN117257781A - 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤 - Google Patents

美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤 Download PDF

Info

Publication number
CN117257781A
CN117257781A CN202210667463.8A CN202210667463A CN117257781A CN 117257781 A CN117257781 A CN 117257781A CN 202210667463 A CN202210667463 A CN 202210667463A CN 117257781 A CN117257781 A CN 117257781A
Authority
CN
China
Prior art keywords
atrial
memantine
atrial fibrillation
pharmaceutically acceptable
cardiomyocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210667463.8A
Other languages
English (en)
Inventor
陈义汉
解端阳
刘懿
梁丹丹
熊珂
苏旭玲
王广华
王路鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Original Assignee
Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital filed Critical Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority to CN202210667463.8A priority Critical patent/CN117257781A/zh
Publication of CN117257781A publication Critical patent/CN117257781A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤。具体地，本发明提供了一种美金刚或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗房颤的药物中的用途。本发明的活性成分可通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体进而有效地防治房颤。

Description

美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤。
背景技术
房颤是临床上最常见的持续性心律失常，可导致脑卒中和心力衰竭(心衰)等严重并发症。本课题组近期研究发现心房心肌细胞中谷氨酸离子型受体(iGluRs)高丰度表达。在电刺激诱发的大鼠离体/在体房颤模型上，抑制这些受体不但可以显著降低房颤诱发率，还可有效终止房颤。然而在目前的房颤临床治疗实践中，没有一种药物是通过干预iGluR来防治房颤。
因此，本领域迫切需要开发新的有效预防和治疗房颤的药物。
发明内容
本发明的目的是提供美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤。具体地，本发明提供了美金刚在防治房颤发生发展中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种美金刚或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于：
(A1)预防和/或治疗房颤；
(A2)减少心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流；
(A3)减少心房心肌细胞钙漏；
(A4)减少心房心肌细胞延迟后除极和触发活动；
(A5)减少房性异位搏动；
(A6)减少心房心肌的折返环数量；和/或
(A7)抑制谷氨酸离子型受体门控电流。
在另一优选例中，所述的房颤选自下组：离体牵张型房颤、离体胆碱能型房颤、离体缺血型房颤、在体牵张型房颤、在体胆碱能型房颤和在体缺血型房颤或其组合。
在另一优选例中，所述制剂或组合物用于：降低房颤的发生率、缩短房颤的持续时间、终止房颤。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有美金刚或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的心肌细胞包括心房心肌细胞。
在另一优选例中，所述的药物组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括：口服制剂、注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述药物采用下列给药方式：口服、静脉内、肌内、皮下和吸入给药。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服制剂，较佳地为：片剂、胶囊和颗粒剂。
本发明的第二方面，提供了一种体外抑制谷氨酸离子型受体的方法，包括步骤：将美金刚或其药学上可接受的盐与谷氨酸离子型受体接触，从而抑制谷氨酸离子型受体。
在另一优选例中，所述的美金刚或其药学上可接受的盐的浓度1μM-1000μM。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的。
本发明的第三方面，提供了一种体外抑制心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流和/或心房心肌细胞钙泄漏的方法，包括步骤：将美金刚或其药学上可接受的盐与心房心肌细胞接触，从而直接抑制心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流和/或间接抑制心房心肌细胞钙泄漏。
在另一优选例中，所述的美金刚或其药学上可接受的盐的浓度为1μM-1000μM。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，包括：
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分为美金刚或其药学上可接受的盐；
(a2)第二活性成分，所述的第二活性成分为额外的用于治疗房颤的药物；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的额外的用于治疗房颤的药物选自下组：胺碘酮、氟卡尼、普罗帕酮和索托洛尔等药物。
本发明的第五方面，提供了一种药盒，包括：
(Z1)第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有药学上可接受的载体和(a1)第一活性成分，其中所述的第一活性成分为美金刚或其药学上可接受的盐；
(Z2)第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有药学上可接受的载体和(a2)第二活性成分，其中所述的第二活性成分为额外的用于治疗房颤的药物。
在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是各自独立的。
本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗房颤的方法，给需要的对象施用美金刚或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的对象包括房颤患者或房颤易感人群。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了房颤时大鼠心房心肌细胞内源性谷氨酸递质系统中，谷氨酸含量显著性上调(数量＝8-9，p<0.05,t检验)。
图2显示了与正常窦性心律相比，房颤大鼠模型中心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流显著性增强(数量＝12-13，p<0.05,t检验)。
图3显示了美金刚可显著减少临床上常见的三种离体房颤动物模型(牵张型、胆碱能型和缺血型房颤动物模型)的房颤的诱发率(数量＝8-13，p<0.05,卡方检验)。
图4显示了美金刚可以在三种在体房颤动物模型(牵张型、胆碱能型和缺血型房颤动物模型)中有效的终止房颤(数量＝8-9，p<0.05，卡方检验)。
图5显示了美金刚显著性减少房颤大鼠心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流(数量＝9-14，p<0.05,t检验)。
图6显示了房颤时大鼠心房心肌细胞的钙泄漏情况，使用美金刚处理后可显著减少房颤大鼠心房心肌细胞的钙泄漏(数量＝15，p<0.05,t检验)。
图7显示了美金刚可显著性减少病理情况下房性异位搏动(数量＝8-10，p<0.05，卡方检验)。
图8显示了美金刚可显著性减少房颤大鼠心房心肌细胞的折返发生率(数量＝8-11，p<0.05，卡方检验)。
图9显示了美金刚可显著性减少病理情况下大鼠心房心肌细胞延迟后除极(数量＝15-18，p<0.05，卡方检验)。
图10显示了美金刚可显著性减少人源诱导的多功能干细胞分化的心房心肌细胞的延迟后除极和心律失常事件发生率(数量＝14-32，p<0.05，t检验)。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地发现，美金刚(MEM)可以有效预防房颤的发生并可以强效终止房颤。研究表明，美金刚可显著性减少房颤时心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流、钙漏、延迟后除极和触发活动、房性异位搏动和折返环数量，从而有效防治房颤的发生发展。在此基础上完成了本发明。
美金刚
美金刚是一种非竞争性离子型谷氨酸受体拮抗剂，是美国食品及药物管理局(FDA)批准的首个应用于中、重度阿尔茨海默病的治疗药物。作为首个应用于中、重度阿尔茨海默病的临床药物，众多的临床研究已证实其安全，有效，耐受性好，中枢不良反应少的特性。
本发明人的研究表明，美金刚可以通过拮抗心房心肌细胞的谷氨酸离子型受体发挥其药理作用。本发明的实验数据表明，美金刚可以显著减少房颤时心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流、钙泄漏、延迟后除极和触发活动、房性异位搏动和折返环数量来有效预防和终止房颤的发生发展。
组合物及应用
基于本发明的意外发现，本发明人提供了本发明活性成分的多种不同应用。
典型地，本发明的活性成分可用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于：
(A1)预防和/或治疗房颤；
(A2)减少心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流；
(A3)减少心房心肌细胞钙漏；
(A4)减少心房心肌细胞延迟后除极和触发活动；
(A5)减少房性异位搏动；
(A6)减少心房心肌的折返环数量；和/或
(A7)抑制谷氨酸离子型受体门控电流。
本发明还提供了含有本发明活性成分的多种不同的组合物，所述组合物包括(但并不限于)：药物组合物、保健品组合物。
以药物组合物为例，如本文所用，术语“活性成分”指的是可用于本发明的美金刚或其药学上可接受的盐。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的主要优点包括：
(1)目前临床上常用房颤药物的疗效较差，而且可以导致致命性心律失常。本发明跳出传统药物治疗房颤的思路，提出了一类全新的房颤药物干预靶点和干预原理。为美金刚用于临床房颤治疗提供了有力的证据。
(2)美金刚是首个FDA批准应用于中、重度阿尔茨海默病的传统临床药物。其临床安全性已经得了广泛的研究和认可。本发明作为老药新用，具有开发周期短、耗时少、风险低等优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和方法
1.动物
本研究根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。所有动物实验方案均由同济大学医学院动物护理和使用委员会批准。
2.体外房颤诱导
成年雄性SD大鼠腹腔注射含120IU肝素的戊巴比妥溶液(25mg/kg)进行麻醉。快速暴露胸腔取出心脏，并将其置于含氧的台式液中，该溶液含有(单位：mM)：140NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1.2KH2PO4、5HEPES、1MgCl2和5.5glucose，用NaOH将pH值调整为7.4。台式液冲洗离体心脏，除去心腔残余血液，然后将离体心脏接到Langendorff装置上，并用37℃含氧台式溶液持续灌注。通过将电极一端连接到心房外侧的游离壁上，另一端连接心室心尖，从而记录灌流心脏的心电图。心电图信号是通过BioAmp和PowerLab(美国AD仪器公司)来进行采集和放大。使用LabChart7软件(美国AD仪器公司)手动分析心电图数据。在整个记录过程中，环境温度保持在37℃。房颤定义为电刺激脉冲起搏后观察到的快速不规则的房性心律并伴有不规则的R-R间期的心脏异常电活动。对于房颤持续时间的测量，是以电刺激脉冲起搏结束为起始点，到快速不规则房性心律后检测到的第一个P波为终止点，计算这两点之间的时长。
离体牵张型房颤动物模型的构建是在之前已发表文献所述的方法学的基础上，加以了简单的修改。急性离体大鼠心房牵张是通过结扎下腔静脉，以及增大灌注速度将心房容积增加到生理容积的两倍来实现的。心房持续扩张牵拉40分钟后，进行快速心房起搏刺激(脉冲宽度2ms)并持续约40S，间隔1分钟后(一个刺激周期)，重复10个周期的刺激以诱发心房颤动。
离体胆碱能型房颤动物模型的构建参考了已发表文献所述的方法学并加以了简单的修改。用含乙酰胆碱(2μM)的灌流液持续灌流大鼠心脏，持续时间为10分钟。同时采用20Hz快速心房起搏刺激(脉冲宽度2ms)持续约40S，间隔1分钟后(一个刺激周期)，重复10个周期的刺激以诱发心房颤动。
离体缺血型房颤动物模型的构建是参考了已发表文献所述的方法学并加以了简单的修改。通过调节灌流液灌流流速至正常流速的五分之一，使心房灌注量减少，从而使心房缺血。同时，通过结扎下腔使得心房能够保持生理状态。心脏缺血30分钟后，采用20Hz快速心房起搏刺激(脉冲宽度2ms)持续约40S，间隔1分钟后(一个刺激周期)，重复10个周期的刺激以诱发心房颤动。
3.在体房颤诱导
在体缺血型房颤动物模型的建立是基于之前已发表文献所述的方法学，并加以简单的优化。在大鼠窒息期间，通过快速心房起搏来在诱发房颤。使用1.5％异氟烷麻醉大鼠，然后大鼠进行插管并连接呼吸机，维持大鼠体温在37℃。通过右颈静脉将起搏导管(1.4F)插入右心房。起搏阈值是通过不断调整刺激电压确定，提高刺激电压直到一次刺激过后能记录到心房电信号的发生。呼吸机停止工作后，用止血钳夹住气管30秒，造成大鼠窒息。窒息10秒后，在2倍起搏阈值电压下进行20Hz快速心房起搏30秒，以诱发房颤。房颤被定义为快速不规则的房性心律和不规则的R-R间期，且刺激停止后持续至少2分钟。
在体胆碱能型房颤动物模型的建立是按之前已发表文献所述的方法学进行。简单地说，通过右颈静脉将起搏导管(1.4F)插入麻醉大鼠的右心房。然后，5秒内给大鼠进行乙酰胆碱单次静脉推注(1mg/kg，0.1mL)。接着，在乙酰胆碱给药后，以2倍起搏阈值电压下进行20Hz快速心房起搏30秒，以诱发房颤。
在体牵张型房颤动物模型的建立是基于之前已发表文献所述的方法学，并加以了简单的优化。简单地说，按文献报道标准手术流程，对大鼠进行了主动脉弓缩窄手术。在术后12周，通过右颈静脉将起搏导管(1.4F)插入麻醉大鼠的右心房，以2倍起搏阈值电压下进行20Hz快速心房起搏30秒，以诱发房颤。
4.成年大鼠心房心肌细胞的分离
成年大鼠心房心肌细胞的分离方法是基于已发表文献所述的方法学并稍作优化，通过Langendorff离体心脏灌流来分离成年雄性SD大鼠心房心肌细胞。简而言之，大鼠麻醉后，迅速打开胸腔并取出心脏，将心脏以主动脉逆行插管悬挂并固定于Langendorff系统上，使用台式液灌注大鼠心脏，冲洗干净残余血液。然后，更换为含1mg/mL II型胶原酶(Worthington)和1.0％BSA的无钙台式液循环灌流，在37℃下消化15分钟。当心脏变得柔软松弛，剪下心房组织，剪成约1mm3的小块，用吸管吹打分散组织，使心房心肌细胞重悬于KB液(mM)：100potassium glutamate,10potassium aspartate,25KCl,10KH2PO4,2MgSO4,20taurine,5creatine,0.5EGTA,20glucose,and 5HEPES and 1.0％BSA，pH值用KOH调至7.2。最后，用孔径100μM的滤网过滤掉组织碎块，得到细胞悬液。用于电生理实验的急性分离心房心肌细胞，需要每30分钟用1M浓度的钙溶液进行梯度复钙，使钙离子终浓度为1.8mM。
5.膜片钳记录
按以前所描述的方法进行心房心肌细胞的全细胞膜片钳记录。本发明使用了两个硼硅玻璃微电极：一个装满细胞内溶液用于细胞电刺激和信号记录(尖端电阻2-5MΩ)；另一个用于脉冲式细胞外给药，针尖内径为10μM，充满台式液或含有谷氨酸(1mM)的台式液。脉冲给药是指通过将玻璃微电极连接到PL1–100微量注射器上来进行局部喷射给药。在电压钳模式下，将电压钳制在-60mV下来记录iGluR电流。细胞动作电位是在电流钳模式下记录。所有膜片钳的数据是按标准膜片钳技术步骤并使用EPC-10放大器进行采集。细胞内液配置(mM)：140KCl、10EGTA、10HEPES、5glucose和3Na2ATP(用KOH将pH值调至7.2)。心房心肌细胞被浸泡在一个连续灌流含氧台式液的培养皿中。所有数据均采用Patchmaster 2.42进行分析。
6.钙成像
将分离的心房心肌细胞加到1mL含有1μM Cal-520 AM和0.04％Pluronic F-127的台式溶液中进行15分钟染色。对于共聚焦钙成像，本发明使用Sp8共焦显微镜和63倍油物镜获得钙成像图像。在Ex/Em＝488/515nm处测量荧光强度。使用线扫描模式记录自发的钙火花和钙瞬变。使用LAS X软件和ImageJ 2.0软件进行数据采集和分析。
7.光学标测
光学标测实验，基本按已发表文献所述的方法步骤进行。简而言之，成年雄性大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(25mg/kg)及120IU的肝素进行抗凝和麻醉后，打开胸腔迅速取出心脏，将心脏连接到Langendorff装置上。37℃连续灌注饱和氧台式溶液，灌流10分钟后，切换到含有电压敏感染料RH237(10μM)的灌流液进行5分钟灌流染色。Blebbistatin(10uM)被添加到饱和氧台式溶液中用来防止心脏运动带来的伪影。电压敏感染料是用550nM的LED光源激发的。光学标测图像是用超高速照相机(MiCAM ULTIMA)拍摄的。激活时间序列被定义为阵列中每个荧光信号的荧光随时间变化的最大时间点(dF/dt)。折返定义为在至少2个脉冲周期内以恒定旋转模式重复返回同一心房区域的电秒冲。所有数据均使用MiCAM ULTIMA采集，用BV_Ana软件(SciMedia)进行数据收集和分析。
8.多电极阵列(MEA)记录
人源诱导的多功能干细胞分化的心房心肌细胞(iPSC-ACMs)来自中国科学院生物物理研究所。冻存细胞复苏之后，使用心肌细胞维持培养基将细胞培养在预涂有玻璃粘连蛋白(0.01μg/μL)的T25培养皿中，维持37℃和5％CO2培养环境。每2天换一次培养基。在复苏后第12天，将细胞消化并重悬，使用心脏恢复培养基调整悬液细胞密度为3x106个/mL。然后，将10uL细胞悬液小心滴在CytoView MEA 24孔板(Axion BioSystems)的每一个孔上。MEA装置自动调节和控制环境参数(37℃和5％CO2)，以维持培养基的温度和pH值。使用Maestro MEA系统(Axion BioSystems)获取细胞电生理数据。本发明基于先前报道的iPSC心律失常诱导方法上进行了一些修改然后应用到了MEA记录系统上。iPSC ACM用50μM索他洛尔处理，并被培养在低氧培养箱中，按低氧(1％氧气)3小时，然后换到常氧(19％氧气)培养(12小时)模式进行循环培养。
9.数据统计
使用Kolmogorov–Smirnov检验统计数据的正态性。对于两组之间的比较，采用双侧Student t检验或者非参数Mann–Whitney检验。百分比差异统计采用卡方检验。有统计学意义被定义为p值≤0.05。电生理实验中使用的每种动物样本和药物都被分配了一个代码编号，直到研究完成后这些信息才被揭盲。所有统计数据均以Mean±SEM形式展示。所有统计分析均采用GraphPad Prism 8软件完成。
实施例1.美金刚干预和终止房颤的有效性评估
如图1-2所示，房颤时大鼠心房心肌细胞内源性谷氨酸递质系统中，不但谷氨酸含量增加，而且其他核心成分包括特定的代谢酶、离子型受体和转运体等也发生显著性改变。
此外，与窦性心律相比，房颤时大鼠心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流显著性增强。基于此，本发明在5种房颤模型上对美金刚预防和终止房颤的有效性进行了评估。
为了检验美金刚对房颤的预防作用，本发明构建了三种离体大鼠房颤模型，涵盖了临床上常见的三种类型的房颤：牵张型、胆碱能型和缺血型房颤动物模型。
如图3所示，美金刚(100μM)预灌流可以有效降低房颤的发生率。
在离体牵张型房颤模型中，对照组房颤发生率为100％，而美金刚组为0％。
在离体胆碱能型房颤模型中，对照组房颤发生率为100％，而美金刚组为0％。
在离体缺血型房颤模型中，对照组房颤发生率为83.33％，而美金刚组为0％。
为了进一步评估美金刚终止房颤的有效性，本发明构建了三种在体大鼠房颤模型：牵张型房颤模型，胆碱能型房颤模型(即5秒内静脉推注乙酰胆碱，1mg/kg，0.1mL)和缺血型房颤模型。
在这三种模型中，房颤发作持续时间均能超过2分钟。所以，当房颤被诱发时，立即给该大鼠进行美金刚(2.5mg/kg，0.1mL)静脉速推。
如图4所示，美金刚在给药之后可以迅速终止房颤。
在牵张型房颤模型中，对照组房颤终止率为0％，而美金刚组为88.9％。
在胆碱能型房颤模型中，对照组房颤终止率为0％，而美金刚组为87.5％。
在缺血型房颤模型中，对照组房颤终止率为0％，而美金刚组为87.5％。
同时，与对照组相比，美金刚组的房颤持续时间明显缩短。
这些离体及在体实验数据有力地表明，美金刚可以在多种房颤模型中有效地预防和终止房颤。
实施例2.美金刚显著抑制了iGluR电流
鉴于在中枢神经系统中，美金刚以神经元iGluRs为靶点，但在心房心肌细胞中美金刚是否以iGluRs为靶点尚不清楚，本发明首先检测了美金刚对心房心肌细胞中iGluR电流的影响。
2.1实验方法
基于文献已发表文献所述方法学，通过Langendorff离体心脏灌流来分离成年雄性SD大鼠心房心肌细胞。急性分离心房心肌细胞，经过梯度复钙之后用于电生理实验。按标准膜片钳技术步骤流程对急性分离心房心肌细胞进行电流记录。在电压钳模式下，将电压钳制在-60mV下来记录iGluR电流。通过PL1–100微量注射器进行脉冲式给药，对心房心肌细胞以脉冲式给予台式液或含有谷氨酸(1mM)的台式液。
2.2结果
研究结果表明，如图5所示，100μM美金刚显著抑制了iGluR电流(电流密度可从8.53±1.97pA/pF降低至1.4±0.61pA/pF)。
实施例3美金刚对心房心肌细胞钙漏的影响
神经元中iGluRs过度激活会让大量的钙离子进入细胞从而导致细胞钙超载，美金刚通过抑制iGluRs可以减轻细胞钙超载。
在本实施例中，进一步评估美金刚对心房心肌细胞钙漏的影响。
3.1实验方法：
基于文献已发表文献所述方法学，通过Langendorff离体心脏灌流来分离成年雄性SD大鼠心房心肌细胞。急性分离心房心肌细胞，经过梯度复钙之后用于电生理实验。将分离的心房心肌细胞加到1mL含有1μM Cal-520 AM和0.04％Pluronic F-127的台式溶液中进行15分钟染色。然后在徕卡Sp8共聚焦显微镜上进行心房心肌细胞的钙成像记录。
3.2结果
研究发现，如图6所示，100μM美金刚显著降低了钙火花频率，可以从0.94±0.16spark/s/100μm降至0.36±0.14spark/s/100μm。
实施例4.美金刚在钙漏介导的异常电生理事件中的作用
钙漏与诱发和维持房颤的异常电生理事件密切相关(如异常自发放电(异位起搏)和心房折返)。另一方面，为了评估美金刚在钙漏介导的异常电生理事件中的作用，本发明在离体大鼠心房心肌组织上进行了光学标测实验。
4.1实验方法
取成年雄性大鼠心脏，将心脏连接到Langendorff装置上。37℃连续灌注饱和氧台式溶液，灌流10分钟后，切换到含有电压敏感染料RH237(10μM)的灌流液进行5分钟灌流染色。Blebbistatin(10uM)被加到饱和氧台式溶液中用来防止心脏运动带来的伪影。用超高速照相机(MiCAM ULTIMA)获取光学标测图像。
4.2结果
如图7-8所示，研究发现100μM美金刚不仅降低了5Hz电刺激起搏和缺氧处理的离体大鼠心房心肌组织的异位活动发生率(从87.5％降至10％)，也显著减少了房颤大鼠离体心房心肌组织中折返的发生率(从100％到9.1％)。
实施例5.美金刚对心房心肌细胞延迟后除极(DADs)的影响
钙泄漏会导致DADs，这是触发活动或异位活动的重要来源之一。为此，本发明进一步探究了美金刚是否会影响心房心肌细胞DADs的产生。
5.1实验方法
基于文献已发表文献所述方法学，通过Langendorff离体心脏灌流来分离成年雄性SD大鼠心房心肌细胞。急性分离心房心肌细胞，经过梯度复钙之后用于电生理实验。按标准膜片钳技术步骤流程对急性分离心房心肌细胞进行动作电位记录。
5.2结果
膜片钳数据显示，如图9所示，在2Hz电刺激起搏的大鼠心房心肌细胞中，100μM美金刚能有效降低发生触发活动的发生率(从75％降至11.1％)以及DADs的发生率(从80％降至16.6％)。
这一系列电生理实验数据均表明，在心房心肌细胞中，美金刚可以通过靶向iGluRs，抑制iGluR电流诱导的钙泄漏，减少或消除异常电生理活动，最终有效干预房颤的发生发展。
实施例6.美金刚对异常电生理活动的作用
本发明还利用人源诱导的多能干细胞分化的心房心肌细胞(iPSC-ACMs)来进一步检测美金刚对异常电生理活动的作用。
6.1实验方法
冻存人源诱导的多功能干细胞分化的心房心肌细胞(iPSC-ACMs)复苏之后，将细胞培养在的T25培养皿中，维持37℃和5％CO2培养环境。在复苏后第12天，将细胞消化并重悬，用于膜片钳或者多阵列微电极(MEA)实验。按标准膜片钳技术步骤流程对iPSC-ACMs进行动作电位记录。使用Maestro MEA系统获取单层iPSC-ACMs电生理数据。iPSC-ACMs的培养基中加入50μM索他洛尔，并进行低氧培养来诱发心律失常事件。
6.2结果
通过使用多电极阵列系统(MEA)，如图10所示，发现50μM美金刚可有效地将iPSC-ACMs的心律失常事件诱发率从93.8％降至21.9％。膜片钳数据进一步显示，50μM美金刚显著降低了iPSC ACM中DADs的发生率(从87.5％降至14.3％)。
综上所述，本发明发现美金刚可通过阻断心房心肌细胞内源性iGluRs来预防和治疗房颤，这一发现为房颤的临床实践提供了新的治疗策略。美金刚是一种通过FDA认证的被广泛用于治疗阿尔茨海默病的经典药物，本发明的研究首次证明了其可以在多种房颤动物模型中表现出干预房颤发生及发展的作用。老药新用可以极大地缩短临床药物开发的进程，所以本发明认为美金刚最终可以被应用于临床的房颤治疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种美金刚或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述的制剂或组合物用于：
(A1)预防和/或治疗房颤；
(A2)减少心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流；
(A3)减少心房心肌细胞钙漏；
(A4)减少心房心肌细胞延迟后除极和触发活动；
(A5)减少房性异位搏动；
(A6)减少心房心肌的折返环数量；和/或
(A7)抑制谷氨酸离子型受体门控电流。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述美金刚或其药学上可接受的盐抑制心房心肌细胞谷氨酸离子型受体。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括：口服制剂、注射剂、冻干剂。
5.一种体外抑制谷氨酸离子型受体的方法，其特征在于，包括步骤：将美金刚或其药学上可接受的盐与谷氨酸离子型受体接触，从而抑制谷氨酸离子型受体。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的美金刚或其药学上可接受的盐的浓度为1μM-1000μM。
7.一种体外抑制心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流和/或心房心肌细胞钙泄漏的方法，其特征在于，包括步骤：将美金刚或其药学上可接受的盐与心房心肌细胞接触，从而直接抑制心房心肌细胞谷氨酸离子型受体门控电流和/或间接抑制心房心肌细胞钙泄漏。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分为美金刚或其药学上可接受的盐；
(a2)第二活性成分，所述的第二活性成分为额外的用于治疗房颤的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
9.一种药盒，其特征在于，包括：
(Z1)第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有药学上可接受的载体和(a1)第一活性成分，其中所述的第一活性成分为美金刚或其药学上可接受的盐；
(Z2)第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有药学上可接受的载体和(a2)第二活性成分，其中所述的第二活性成分为额外的用于治疗房颤的药物。
10.一种预防和/或治疗房颤的方法，其特征在于，给需要的对象施用美金刚或其药学上可接受的盐。
CN202210667463.8A 2022-06-13 2022-06-13 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤 Pending CN117257781A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210667463.8A CN117257781A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210667463.8A CN117257781A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117257781A true CN117257781A (zh) 2023-12-22

Family

ID=89203188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210667463.8A Pending CN117257781A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117257781A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI508726B (zh) 治療心房纖維性顫動之方法
US4364922A (en) Adenosine antagonists in the treatment and diagnosis of A-V node conduction disturbances
CN102056603A (zh) 决奈达隆用于预防持续性心房纤颤
Vos et al. Flunarizine allows differentiation between mechanisms of arrhythmias in the intact heart.
CN108567775B (zh) 硫辛酸在制备治疗压力负荷性心肌损伤的药物组合物中的应用
Babiker et al. Pacing postconditioning: impact of pacing algorithm, gender, and diabetes on its myocardial protective effects
WO2009000149A1 (fr) Utilisation de la notoginsenoside r1 dans la préparation du médicament destiné au traitement de lésions hépatiques
CN108939052B (zh) 艾塞那肽在制备预防或治疗房颤的药物中的用途
CN117257781A (zh) 美金刚通过靶向心房心肌细胞谷氨酸受体有效干预房颤
WO2022077823A1 (zh) 甲氧喹酸在制备用于治疗和/或预防以t-型钙通道为治疗靶点的疾病的药物中的应用
Burashnikov et al. Mild elevation of extracellular potassium greatly potentiates the effect of sodium channel block to cardiovert atrial fibrillation: The Lankenau approach
Guo et al. Effects and pharmacological mechanism of Zhigancao Decoction on electrical and structural remodeling of the atrium of rabbits induced by rapid atrial pacing
CN107737108B (zh) 一种治疗心肌梗死后心室重塑的口服药物组合物
Rude et al. Effects of ortho-lodo sodium benzoate on acute myocardial ischemia, hemodynamic function, and infarct size after coronary artery occlusion in dogs
RU2664668C9 (ru) Антиаритмическое лекарственное средство
WO1998009628A1 (en) Methods for inhibiting cardiac fibroblast growth and cardiac fibrosis
Wang [Retracted] The Protective Effect of Interval Exercise on Myocardial Ischemia‐Reperfusion Injury in Players
HUT66832A (en) A stimulator of vascular endothelial cells and use thereof
CN107569476A (zh) 含有乙酰紫草素的药物组合物及其在肺动脉高压药物中的应用
CN115594654B (zh) 7-去甲基银杏双黄酮和银杏酮酯的提取方法及其应用
JP6153838B2 (ja) 血管透過性抑制剤
CN117180256B (zh) 岩藻黄素在制备改善心肌梗死后心肌结构重构和电生理重构药物中的应用
CN112274535B (zh) 亚精胺修饰巨噬细胞在免疫治疗药物开发中的应用
US9101640B2 (en) Use of Danshensu, Notoginsenoside R1 or their combination in preparation of medicaments for preventing and treating diseases caused by microcirculation disorder
US20210308081A1 (en) Method and Composition for Enhancing the Quality and Benefits of Sleep

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination