CN117255695A - 一种基于干扰素的癌症治疗方法和药物组合 - Google Patents

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Abstract

一种基于干扰素的癌症治疗方法和药物组合。具体而言，一种基于干扰素的癌症治疗方法，包括给对象i)间歇性施用基于干扰素的治疗剂，和ii)施用额外的抗癌剂，优选吉西他滨，其中所述额外的抗癌剂在基于干扰素的治疗剂的所述间隙性施用的首次施用之后开始施用。还涉及用于所述方法的药物组合。

Description

一种基于干扰素的癌症治疗方法和药物组合 发明领域
本发明涉及生物医药领域，公开了一种基于干扰素的癌症治疗方法和药物组合。具体而言，本发明涉及一种基于干扰素的癌症治疗方法，包括给对象i)间歇性施用基于干扰素的治疗剂，和ii)施用额外的抗癌剂，优选吉西他滨，其中所述额外的抗癌剂在基于干扰素的治疗剂的所述间隙性施用的首次施用之后开始施用。本发明还涉及用于所述方法的药物组合。
发明背景
干扰素(IFN)是一类具有多种功能的活性蛋白质，是由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。
目前，干扰素被分成I、II、III型干扰素。I型干扰素包括IFN-α与IFN-β等。IFN-α主要由单核-巨噬细胞产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α；IFN-β主要由成纤维细胞产生。IFN-α/β二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。已知IFNα有23个以上的亚型。IFNβ仅有一种亚型。II型干扰素即γ干扰素，主要由活化的T细胞(包括Th0、Th1细胞和几乎所有的CD8+T细胞)和NK细胞产生，是所谓的淋巴因子的一种。IFN-γ可以以细胞外基质相连的形式存在，故通过旁邻方式控制细胞生长，其可以分布在除成熟红细胞以外的几乎所有细胞表面，IFNγ仅有1个亚型。III型干扰素主要指干扰素λ。
干扰素、干扰素突变体和干扰素衍生物已经被广泛批准用于各类的治疗。目前已批准用于人体临床治疗的干扰素类及突变体包括干扰素α2a，干扰素α2b、干扰素α1b、复合干扰素(干复津)、干扰素突变体(如乐复能)、干扰素β、干扰素γ(1b)等。干扰素衍生物包括聚乙二醇干扰素α2a，聚乙二醇干扰素α2b，集成干扰素等。
此外，近年来随着TLRs、RLRs、STING等信号通路的发现和阐明，一系列作用于上述信号通路以产生干扰素的激动剂被发现和阐明，利用该类激动剂也成为未来以干扰素类物质为治疗基础的新方向，目前该类激动剂已被用于HBV及相关肿瘤治疗研究。
I型IFN是FDA批准临床用于癌症的首批免疫治疗药物。其中，疗效最好的为血液系统肿瘤，淋巴系统肿瘤次之，实体瘤最差，例如恶性黑色素瘤、卵巢瘤、结肠直肠癌等疗效最高不超过20％。此外，干扰素与化疗，放疗及免疫治疗等联合应用是目前干扰素抗肿瘤的常用治疗方法，例如干扰素联用5-氟尿嘧啶治疗肝癌、结直肠癌，干扰素联合顺铂、卡铂等治疗肺癌，这些研究虽然取得一些成效，但是总体效果一般，预后较 差。此外，干扰素在临床上一般采用大剂量、连续的施用方式，不可避免带来药物相关的毒性大、患者的依从性和耐受性差等问题。
综上，干扰素或干扰素联合抗癌剂或放疗等治疗手段，在临床应用上取得了一些进展，但总体上看，疗效并不理想，预后差，毒副作用大。
因此，本领域仍然需要对基于干扰素的疗法进行改进，以获得更佳的治疗效果。
发明简述
在一方面，本发明提供一种在对象中治疗癌症的方法，其包括给所述对象
i)间隔地施用多个连续疗程的基于干扰素的治疗剂；和
ii)施用额外的抗癌剂，
其中所述额外的抗癌剂在所述多个连续疗程中基于干扰素的治疗剂的首次施用之后开始施用。
在一些实施方案中，所述对象在所述多个连续疗程中首次施用基于干扰素的治疗剂之前的至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少六个月、至少12个月或更长时间段之内没有接受额外的抗癌剂。
在一些实施方案中，在所述连续疗程中，所述基于干扰素的治疗剂的施用使得基本上在整个疗程期间，对象体内新喋呤的浓度高于所述疗程首次施用前的新喋呤浓度，例如是首次施用前新喋呤浓度的大约110％、大约120％、大约130％、大约140％、大约150％、大约200％、大约250％或更高。
在一些实施方案中，所述连续疗程的长度为所述疗程内基于干扰素的治疗剂第一次施用至最后一次施用的时间，再加上所述基于干扰素的治疗剂的大约5个体内半衰期。
在一些实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约1周-大约24周，优选大约1周-大约12周，更优选大约1周-大约8周，更优选大约2周-大约6周。
在一些实施方案中，每个连续疗程的长度为大约1周-大约12周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约12周。
在一些实施方案中，各连续疗程之间间隔大约1周-大约24周，优选大约1周-大约12周，更优选大约1周-大约8周，更优选大约2周-大约6周。
在一些实施方案中，每个连续疗程的长度为大约1周-大约8周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约8周。
在一些实施方案中，每个连续疗程的长度为大约2周-大约6周，且其中各疗程之间间隔大约2周-大约6周。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂施用2个-25个或以上的连续疗程。
在一些实施方案中，所述多个连续疗程的长度基本上相同。
在一些实施方案中，所述各连续疗程之间具有基本上相同的时间间隔。
在一些实施方案中，所述额外的抗癌剂在基于干扰素的治疗剂首次施用后开始施用，所述额外的抗癌剂的施用与所述基于干扰素的治疗剂首次施用间隔一个不超过所述基 于干扰素的治疗剂10个体内半衰期的时间段。
在一些实施方案中，在每个连续疗程期间施用所述额外的抗癌剂，且在所述每个连续疗程期间，所述额外的抗癌剂在所述基于干扰素的治疗剂之后施用。
在一些实施方案中，在每个连续疗程之后施用所述额外的抗癌剂，且在所述每个连续疗程期间不施用所述额外的抗癌剂。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素或其突变体或衍生物，或包含编码干扰素或其突变体或衍生物的核酸分子，或包含促进内源干扰素产生的物质。
在一些实施方案中，所述干扰素是I型、II型或III型干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ，优选干扰素α。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素α1b、干扰素λ，或其突变体或衍生物。
在一些实施方案中，所述干扰素或其突变体或衍生物是PEG化修饰的。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂选自P1101、派格宾、派罗欣、佩乐能、干复津、乐复能、甘乐能、罗荛素、运德素、派益生和聚乙二醇干扰素λ。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包括TLRs、RLRs及STINGs信号通路的激动剂。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂选自GS-9620、GS-9688、RO7020531、RO6864018、TQ-A3334、JNJ-4964、SB9200、MIW815、DMXAA、MK-1454和diABZI。
在一些实施方案中，所述癌症选自白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病、多毛细血管白血病)、肝癌、肺癌、结直肠癌、皮肤癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、喉乳头状瘤、滤泡性淋巴瘤、艾滋病相关卡波氏肉瘤和肾细胞癌，优选是肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌或黑色素瘤。
在一些实施方案中，所述抗癌剂是
i)化疗剂，例如烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、司莫司汀；抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、卡培他滨；抗肿瘤抗生素：放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯；抗肿瘤激素类化疗药物：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬；化疗药物杂类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、丙卡巴肼；或
ii)免疫检查点抑制剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA4的抑制剂，例如选自以下的抗体：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab；或
iii)小分子靶向药物，例如伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、来那度胺、舒尼替尼、达沙替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、依维莫司、凡德他尼、克唑替尼、威罗菲尼、ruxolitinib、阿西替尼、vismodegib、卡非佐米、瑞戈非尼、博舒替尼、托法替尼、卡博替尼、帕纳替尼、泊马度胺、曲美替尼、达拉菲尼、阿法替尼、埃克替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、阿帕替尼、帕布昔利布、乐伐替尼、阿西替尼、埃克替尼、阿帕替尼、sonidegib、cobimetinib、osimertinib、alectinib、ixazomib；或
iv)肿瘤相关抗原特异性抗体类，如美罗华、赫赛丁；
优选地，所述抗癌剂选自奥沙利铂、表柔比星、紫杉醇和吉西他滨，更优选是吉西他滨。
在另一方面，本发明提供一种用于对象中治疗癌症的药物组合，其包含基于干扰素的治疗剂和抗癌剂。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素或其突变体或衍生物，或包含编码干扰素或其突变体或衍生物的核酸分子，或包含促进内源干扰素产生的物质。
在一些实施方案中，所述干扰素是I型、II型或III型干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ，优选干扰素α。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素α1b、干扰素λ，或其突变体或衍生物。
在一些实施方案中，所述干扰素或其突变体或衍生物是PEG化修饰的。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂选自P1101、派格宾、派罗欣、佩乐能、干复津、乐复能、甘乐能、罗荛素、运德素、派益生和聚乙二醇干扰素λ。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包括TLRs、RLRs及STINGs信号通路的激动剂。
在一些实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂选自GS-9620、GS-9688、RO7020531、RO6864018、TQ-A3334、JNJ-4964、SB9200、MIW815、DMXAA、MK-1454和diABZI。
在一些实施方案中，所述抗癌剂是
i)化疗剂，例如烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、司莫司汀；抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、卡培他滨；抗肿瘤抗生素：放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯；抗肿瘤激素类化疗药物：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬；化疗药物杂类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、 丙卡巴肼；或
ii)免疫检查点抑制剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA4的抑制剂，例如选自以下的抗体：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab；或
iii)小分子靶向药物，例如伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、来那度胺、舒尼替尼、达沙替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、依维莫司、凡德他尼、克唑替尼、威罗菲尼、ruxolitinib、阿西替尼、vismodegib、卡非佐米、瑞戈非尼、博舒替尼、托法替尼、卡博替尼、帕纳替尼、泊马度胺、曲美替尼、达拉菲尼、阿法替尼、埃克替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、阿帕替尼、帕布昔利布、乐伐替尼、阿西替尼、埃克替尼、阿帕替尼、sonidegib、cobimetinib、osimertinib、alectinib、ixazomib；或
iv)肿瘤相关抗原特异性抗体类，如美罗华、赫赛丁；
优选地，所述抗癌剂选自奥沙利铂、表柔比星、紫杉醇和吉西他滨，更优选是吉西他滨。
在一些实施方案中，所述药物组合用于通过本发明的方法在对象中治疗癌症。
附图说明
图1.mIFN-α4发酵上清液SP Sepharose Fast Flow洗脱图谱。
图2.mIFN-α4 SP Sepharose Fast Flow纯化目的样非还原型SDS-PAGE(分离胶浓度14％，银染显色)电泳结果。
图3.去除糖基mIFN-α4 Q Sepharose Fast Flow纯化洗脱图谱。
图4.去除糖基mIFN-α4 Q Sepharose Fast Flow纯化原液非还原型SDS-PAGE(分离胶浓度14％，银染显色)电泳结果。
图5.PEG-mIFN-α4 SP Sepharose Fast Flow纯化洗脱图谱。
图6.PEG-mIFN-α4原液非还原型SDS-PAGE(银染显色)电泳结果。
图7.BALB/c小鼠单次皮下注射1μg/只PEG-mIFN-α4的血药浓度-时间曲线。
图8.PEG-mIFN-α4连续、间歇给药治疗小鼠移植性肝癌H 22疗效比较实验生存曲线。
图9.PEG-mIFN-α4连续给药、间歇给药、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性肝癌H22疗效比较实验生存曲线(A)和死亡率曲线(B)。
图10.PEG-mIFN-α4连续给药、间歇给药、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性肺癌LLC疗效比较实验死亡率曲线。A：接瘤至45天；B：接瘤至64天。
图11.PEG-mIFN-α4连续给药、间歇给药、联用吉西他滨给药治疗结直肠癌CT26比较实验生存曲线(A)和死亡率曲线(B)。
图12.PEG-mIFN-α4连续给药、间歇给药、联用吉西他滨给药治疗黑色素瘤B16比较实验生存曲线。
图13、PEG-mIFN-α4连续给药、间歇给药、联用吉西他滨给药治疗乳腺癌4T1比较实验死亡率曲线。
图14.间歇施用干扰素联合抗癌剂表柔比星治疗小鼠移植性肝癌H22的生存曲线。
图15.间歇施用干扰素联合抗癌剂奥沙利铂治疗小鼠移植性肝癌H22的生存曲线。
图16.间歇施用干扰素联合抗癌剂紫杉醇治疗小鼠移植性肝癌H22的生存曲线。
图17.干扰素与吉西他滨不同的施用顺序对小鼠移植性肝癌H22的治疗比较试验的肿瘤发生率曲线。
图18.干扰素与吉西他滨不同施用顺序对小鼠移植性肝癌H22的治疗比较试验的生存曲线。
具体实施方式
本发明基于本发明人的意外发现，即相比于在一个固定疗程中连续施用干扰素，通过多个疗程间歇性地施用干扰素可以取得显著更优的治疗效果。不受任何理论约束，认为长时间地连续施用干扰素，将会造成免疫细胞的消耗且难以恢复。干扰素的疗效依赖于免疫系统，因此基于干扰素的治疗在免疫细胞仍然充足的治疗前期能够取得很好的治疗效果例如很高的肿瘤抑制，然而，在治疗后期由于长期施用干扰素导致的免疫细胞消耗，治疗效果将大幅下降，并且即使继续施用干扰素也可能无法提高治疗效力。而通过间歇性施用干扰素，可以避免这一问题。例如，施用一段时间的干扰素取得一定疗效后，在免疫部分抑制和免疫细胞耗竭前停止干扰素的施用一段时间，使得免疫细胞能够尽快恢复，之后再次重新施用干扰素，仍然能够取得较好的治疗效力。在间歇性施用干扰素的基础上，联用抗癌剂能够进一步提高治疗效力。此外，本申请人进一步意外地发现，干扰素和抗癌剂的施用顺序也显著影响治疗效力。
因此，在一方面，本发明提供一种在对象中治疗癌症的方法，其包括给所述对象施用
i)至少一个连续疗程的基于干扰素的治疗剂；和
ii)施用额外的抗癌剂，
其中所述额外的抗癌剂在所述至少一个连续疗程中首次施用基于干扰素的治疗剂之后开始施用。
在一些实施方案中，所述方法包括给所述对象
i)间隔地施用多个连续疗程的基于干扰素的治疗剂；和
ii)施用额外的抗癌剂，
其中所述额外的抗癌剂在所述多个连续疗程中首次施用基于干扰素的治疗剂之后开始施用。
在一些实施方案中，所述对象在所述多个连续疗程中首次施用基于干扰素的治疗剂之前的至少一周之内没有接受额外的抗癌剂。在一些实施方案中，所述对象在首次施用基于干扰素的治疗剂之前的至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少六个月、至少12个月或更长时间段之内没有接受额外的抗癌剂。
“干扰素”可以是人干扰素，例如可以是I、II或III型干扰素，例如干扰素α、干 扰素β、干扰素γ或干扰素λ，优选干扰素α。
如本文所用，“基于干扰素的治疗剂”指的是能够产生天然干扰素的至少部分效果的治疗剂。
例如，“基于干扰素的治疗剂”可以包括天然分离的或重组产生的干扰素，例如I型干扰素，优选干扰素α。合适的干扰素α包括但不限于干扰素α2a、干扰素α2b或干扰素α1b。
“基于干扰素的治疗剂”还可以包括干扰素突变体，例如干复津(重组集成干扰素，Infergen)。
“基于干扰素的治疗剂”还可以包括干扰素衍生物，例如PEG化修饰的干扰素或其突变体、白蛋白化的干扰素或其突变体、以及其它蛋白和有机物修饰的干扰素及其突变体等。PEG化修饰的干扰素或其突变体的实例包括但不限于聚乙二醇干扰素α2a(例如派罗欣，40Kd双分支UPEG-NHS修饰)、聚乙二醇干扰素α2b(例如佩乐能，12Kd线型PEG-SC修饰)、聚乙二醇干扰素α2b(例如派格宾，Y型40Kd PEG修饰)、培集成干扰素α-2(例如派益生)、聚乙二醇干扰素λ、P1101等。
在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”包含长效干扰素，例如PEG化修饰的干扰素或其突变体。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”包含短效干扰素。
在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”包含多种不同类型的干扰素或其突变体或衍生物。
术语“基于干扰素的治疗剂”涵盖了已经获批上市的各种包含干扰素或其突变体或衍生物的治疗剂。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是派格宾(Y型40Kd PEG修饰，聚乙二醇干扰素α2b，特宝生物)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是派罗欣(聚乙二醇干扰素α2a，Roche)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是佩乐能(聚乙二醇干扰素α2b注射剂，Schering-Plough)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是干复津(Infergen，重组集成干扰素，美国安进)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是甘乐能(重组人干扰素α2b，Schering-Plough)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是罗荛素(干扰素α2a，Roche)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是运德素(重组人干扰素α1b，北京三元基因工程有限公司)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是派益生(培集成干扰素α-2注射液，北京凯因科技股份有限公司)。在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”是聚乙二醇干扰素λ(Nanogen Pharmaceutical biotechbology)。
在一些优选实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素α2b。在一些优选实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂包含聚乙二醇修饰的干扰素α2b。在一些优选实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂是派格宾。
在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”包含干扰素或其突变体或衍生物， 所述干扰素或其突变体或衍生物包含SEQ ID NO:1-5中任一项的氨基酸序列，或者所述干扰素或其突变体或衍生物包含与SEQ ID NO:1-5中任一项具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”也包括编码干扰素或其突变体或衍生物的核酸分子例如重组核酸表达载体。合适的表达载体特别是适于治疗应用的表达载体是本领域技术人员能容易确定的。
“基于干扰素的治疗剂”还可以包括能够促进内源干扰素产生的物质，例如TLRs、RLRs及STINGs信号通路的激动剂。促进内源干扰素产生的物质的实例包括但不限于GS-9620、GS-9688、RO7020531、RO6864018、TQ-A3334、JNJ-4964、SB9200、MIW815、DMXAA、MK-1454、diABZI等 [1]-[34]。
如本文所用，“连续疗程”指的是在该疗程中，所述治疗剂的施用使得持续维持患者体内干扰素(外源或内源)的起效浓度(例如起效血液浓度)或者维持干扰素类物质的主要药效学标志物新喋呤(NPT)的体内浓度(例如血液浓度)高于未使用所述治疗剂时的浓度(初始浓度或基线浓度)。由于干扰素类物质的主要药效学标志物新喋呤与干扰素类物质施用具有良好的相关性，因此特别优选地采用新喋呤的体内浓度(如血液浓度)变化作为“连续疗程”的指标。例如，“连续疗程”可以定义为，在该疗程中，施用一或多次基于干扰素的治疗剂，使得基本上在整个疗程期间，对象体内新喋呤的浓度高于首次施用前的新喋呤浓度(基线浓度)，例如是首次施用前新喋呤浓度的大约110％、大约120％、大约130％、大约140％、大约150％、大约200％、大约250％或更高。体内新喋呤浓度的浓度可以通过本领域公知的方法测定。
在所述连续疗程中，基于干扰素的治疗剂的施用方案通常取决于所选治疗剂本身的特性，例如其体内半衰期。例如，对于长效干扰素(体内半衰期通常为30-120小时)，在该连续疗程中可以约每周、约每两周施用一次，或者在提高剂量情况下可每月甚至更长时间施用一次；而对于短效干扰素(体内半衰期通常为2-5小时)，则可以每天或每两天施用一次或每周施用三次，或者在提高剂量(例如9-36MIU或更高剂量)的情况下，可每周施用一次，或者在降低剂量的情况下，可每天施用多次。在所述连续疗程中，基于干扰素的治疗剂的施用次数并没有特别限制，只要其能满足上述连续疗程的定义。本领域技术人员能够根据基于干扰素的治疗剂的药效学标志物例如新喋呤的体内浓度(如血液浓度)确定所述连续疗程。
在一些实施方案中，在所述“连续疗程”中，“基于干扰素的治疗剂”可以以其常规方案施用。例如，干复津(重组集成干扰素，Infergen)、干扰素α2b(如甘乐能)、干扰素α2a(如罗荛素)、干扰素α1b(如运德素)在3-18MIU的剂量区间内可以每日或每两日施用一次或每周施用三次；聚乙二醇干扰素α2a(如派罗欣)、聚乙二醇干扰素α2b(如佩乐能或派格宾)、培集成干扰素α-2(如派益生)或聚乙二醇干扰素λ可以在45-270μg的 剂量区间内每周施用一次。P1101每两周约400μg施用一次。白蛋白化干扰素α2b可以每两周施用约900-约1800μg或每4周施用约1200μg。
所述多个连续疗程各自的时间长度应当允许治疗剂实现一定治疗效果，但是应当避免使免疫细胞过度消耗。疗程中免疫细胞的消耗通常能够通过相关治疗指标的变化来鉴别。例如，当相关治疗指标显示所述治疗剂的疗效变差，则表示免疫细胞可能已经过度消耗。
在一些实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为至少大约1周。
在一些实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为至多大约24周。
在一些实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约1周-大约24周，例如大约1周、大约2周、大约3周、大约4周、大约5周、大约6周、大约7周、大约8周、大约9周、大约10周、大约11周、大约12周、大约13周、大约14周、大约15周、大约16周、大约17周、大约18周、大约19周、大约20周、大约21周、大约22周、大约23周、大约24周。
在一些优选实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约1周-大约12周。在一些更优选的实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约1周-大约8周。在一些进一步优选的实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约2周-大约6周。在一些进一步优选的实施方案中，所述多个连续疗程各自的长度为大约2周。
在一些实施方案中，各个连续疗程的终点(也即连续疗程之间的间隔时间的起点)可以是该连续疗程中最后一次施用基于干扰素的治疗剂再加上所述治疗剂的大约5个体内半衰期的时刻。也就是说，所述连续疗程的长度为所述疗程内第一次施用至最后一次施用的时间，再加上所述治疗剂的大约5个体内半衰期。据认为，在治疗剂施用5个半衰期后，将不再产生实质性的治疗效果。
在本发明的方法中，所述多个连续疗程之间的间隔时间可取决于免疫细胞的再生周期。所述间隔时间长度应当允许患者体内由于治疗而降低的免疫细胞恢复至能够有效实现治疗的水平。通常认为，免疫细胞增殖需要大约1-2周，因此，所述多个连续疗程之间的间隔时间最短可以为大约1周。
在一些实施方案中，其中各连续疗程之间至少间隔大约1周。
在一些实施方案中，所述各连续疗程之间至多间隔大约24周。
在一些实施方案中，各连续疗程之间间隔大约1周-大约24周，例如大约1周、大约2周、大约3周、大约4周、大约5周、大约6周、大约7周、大约8周、大约9周、大约10周、大约11周、大约12周、大约13周、大约14周、大约15周、大约16周、大约17周、大约18周、大约19周、大约20周、大约21周、大约22周、大约23周、大约24周。
在一些优选实施方案中，各连续疗程之间间隔大约1周-大约12周。在一些更优选的实施方案中，各连续疗程之间间隔大约1周-大约8周。在一些进一步优选的实施方案中，各连续疗程之间间隔大约2周-大约6周。
在一些实施方案中，其中每个连续疗程的长度为大约1周-大约24周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约24周。
在一些实施方案中，其中每个连续疗程的长度为大约1周-大约12周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约12周。
在一些实施方案中，其中每个连续疗程的长度为大约1周-大约8周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约8周。
在一些实施方案中，其中每个连续疗程的长度为大约2周-大约6周，且其中各疗程之间间隔大约2周-大约6周。
在一些实施方案中，其中每个连续疗程的长度为大约2周，且其中各疗程之间间隔大约2周。
在一些实施方案中，所述“基于干扰素的治疗剂”施用至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续疗程。
在一些实施方案中，其中所述多个连续疗程的长度基本上相同。
在一些实施方案中，所述各疗程之间具有基本上相同的时间间隔。
在一些具体实施方案中，所述基于干扰素的治疗剂是派格宾，每个连续疗程的长度为大约5周-大约24周，各疗程之间间隔大约2周-8周。
本文所述癌症包括但不限于白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病、多毛细血管白血病)、肝癌、肺癌、结直肠癌、皮肤癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、喉乳头状瘤、滤泡性淋巴瘤、艾滋病相关卡波氏肉瘤、肾细胞癌等。在一些实施方案中，所述疾病是骨髓增殖性肿瘤(MPN)。在一些优选实施方案中，所述疾病是肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌或黑色素瘤。
本文所述“额外的抗癌剂”可以是化疗剂包括但不限于，如烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、司莫司汀；如化疗药物抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、卡培他滨；如化疗药物抗肿瘤抗生素：放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；如化疗药物抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯；如化疗药物抗肿瘤激素类：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬；如化疗药物杂类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、丙卡巴肼。
本文所述“额外的抗癌剂”还可以是小分子靶向药物，包括但不限于伊马替尼、吉 非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、来那度胺、舒尼替尼、达沙替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、依维莫司、凡德他尼、克唑替尼、威罗菲尼、ruxolitinib、阿西替尼、vismodegib、卡非佐米、瑞戈非尼、博舒替尼、托法替尼、卡博替尼、帕纳替尼、泊马度胺、曲美替尼、达拉菲尼、阿法替尼、埃克替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、阿帕替尼、帕布昔利布、乐伐替尼、阿西替尼、埃克替尼、阿帕替尼、sonidegib、cobimetinib、osimertinib、alectinib、ixazomib。
本文所述“额外的抗癌剂”还可以是肿瘤相关抗原特异性抗体类如美罗华、赫赛丁等。
本文所述“额外的抗癌剂”还可以是免疫检查点抑制剂，例如PD1、PDL1、CTLA4等的抑制剂如特异性抗体。免疫检查点抑制剂的实例包括但不限于Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab等。
在一些具体实施方案中，所述化疗剂是奥沙利铂。在一些具体实施方案中，所述化疗剂是表柔比星。在一些具体实施方案中，所述化疗剂是紫杉醇。
在一些优选实施方案中，所述化疗剂是抗代谢类化疗药，如吉西他滨、卡培他滨、安西他滨。在一些最优选实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。
在一些实施方案中，所述额外的抗癌剂在所述多个连续疗程中基于干扰素的治疗剂的首次施用(即第一个连续疗程中的第一次施用)后开始施用。例如，所述额外的抗癌剂的施用与所述基于干扰素的治疗剂首次施用间隔所述基于干扰素的治疗剂大约1个体内半衰期至大约10个体内半衰期的时间段。在一些实施方案中，所述抗癌剂可以按其常规方案施用。
在一些实施方案中，所述额外的抗癌剂在基于干扰素的治疗剂的第一个连续疗程期间开始施用，例如，之后可以按其常规方案施用。
在一些实施方案中，在每次基于干扰素的治疗剂施用后，施用所述额外的抗癌剂。例如，所述额外的抗癌剂的施用与所述基于干扰素的治疗剂的施用间隔所述基于干扰素的治疗剂大约1-大约10个体内半衰期的时间段。
在一些实施方案中，在每个连续疗程期间施用所述额外的抗癌剂，且在所述每个连续疗程期间，所述额外的抗癌剂至少在所述疗程中基于干扰素的治疗剂的首次施用之后施用。
在一些实施方案中，在各个所述基于干扰素的治疗剂的连续疗程之后施用所述额外的抗癌剂。例如，如果基于干扰素的治疗剂施用3个连续疗程，则分别在第一个连续疗程之后施用所述额外的治疗剂，在第2个连续疗程之后施用所述额外的抗癌剂，以及在第3个连续疗程之后施用所述额外的抗癌剂。在一些实施方案中，在所述基于干扰素的治疗剂的连续疗程中，不施用所述额外的抗癌剂。
在一些实施方案中，所述额外的抗癌剂是吉西他滨，且所述吉西他滨的施用方案可以是每四周施用三次：每周一次，施用三周，然后停药一周；每三周施用两次：每周一次，施用两次，然后停药一周；或者每两周施用一次。示例性的吉西他滨的每次剂量为 1000mg/m 2表面积。
在一些实施方案中，本发明的方法导致对象中肿瘤消退或肿瘤体积减小或延长生存期。特别地，本发明的方法导致：减少癌细胞的数目、减少肿瘤体积、抑制(即减缓或停止)癌细胞浸润到外周器官中、抑制(即减缓或停止)肿瘤转移、抑制肿瘤生长、和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状。
在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含基于干扰素的治疗剂，所述药物组合物用于通过本发明的方法在对象中治疗癌症。在一些实施方案中，所述药物组合物还包括额外的抗癌剂。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。
在一方面，本发明提供基于干扰素的治疗剂在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于通过本发明的方法在对象中治疗癌症。在一些实施方案中，所述药物组合物还包括额外的抗癌剂。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。
在一方面，本发明提供基于干扰素的治疗剂在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于与额外的抗癌剂组合在对象中治疗癌症。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。所述基于干扰素的治疗剂和/或额外的抗癌剂可以根据本发明所述的方法施用。
在一方面，本发明提供基于干扰素的治疗剂在制备用于增强额外的抗癌剂的疗效的药物组合物中的用途。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。所述基于干扰素的治疗剂和/或额外的抗癌剂可以根据本发明所述的方法施用。
在一方面，本发明提供一种药物组合，其包含基于干扰素的治疗剂和额外的抗癌剂，所述药物组合用于通过本发明的方法在对象中治疗癌症。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。
在一方面，本发明提供一种药盒，其包含基于干扰素的治疗剂、额外的抗癌剂以及使用说明，所述使用说明提供关于所述基于干扰素的治疗剂和所述额外的抗癌剂可以根据本发明的方法或根据本发明的方法施用以在对象中治疗癌症的描述。所述基于干扰素的治疗剂和抗癌剂如上所定义。
实施例
下文实施例仅仅是为了更好地阐释本发明，而不意在以任何方式限制本发明。
实施例1、重组小鼠干扰素α4(mIFN-α4)的制备
干扰素同样广泛用于癌症治疗，但是效果有待改进。为了研究干扰素是否的确由于连续施用导致免疫部分抑制和免疫细胞耗竭，进而导致后续治疗效果的不佳，在小鼠上进行了干扰素间隙施用和连续施用的效力比较。
大量抗肿瘤效应的研究是以裸鼠(缺乏正常胸腺)为宿主进行实施研究的，而裸鼠的免疫状态弱于正常鼠，难以体现正常状态的免疫反应。而基于正常鼠在抗肿瘤模型中，可部分实现干扰素对免疫系统的效应，体现施用所述干扰素的抗肿瘤疗法的效果。从功 能的实现途径上，干扰素应依托宿主的免疫系统才能更完整发挥抗病毒、抗肿瘤作用。由于干扰素具有较强的种属特异性，因此实施例中以正常小鼠为研究对象时，使用鼠干扰素或其衍生物更能反映出其生理学效应及实施效果。在本发明使用小鼠作为研究模型中，采用了聚乙二醇化重组小鼠干扰素α4(PEG-mIFNα4)作为干扰素类治疗药物及其衍生物的代表。
根据mIFN-α4的氨基酸序列(GenBank NP_034634)，按毕赤酵母偏好密码子进行编码并优化设计出mIFN-α4的cDNA序列，委托金斯瑞生物科技有限公司合成该cDNA。将编码mIFN-α4的cDNA同源重组插入pPIC9K质粒，转化TOP10感受态细胞，涂布LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取单克隆接种LB液体培养基，37℃培养过夜；提取质粒，XhoI、NotI双酶切，核酸电泳鉴定出阳性克隆，并进一步经核酸测序确认。阳性克隆质粒SalI酶切线性化，电转化转入毕赤酵母GS115，涂布RD平板，28-30℃培养3天。挑取阳性转化子接种YPD液体培养基，28-30℃培养过夜；按OD600nm终浓度为约1转接BMMY培养基，28-30℃培养约24小时；补加甲醇至甲醇终浓度为约1％，28-30℃继续培养约24小时。取培养液离心收集上清液，SDS-PAGE电泳检测mIFN-α4表达量。根据SDS-PAGE电泳结果，筛选出表达量较高且表达稳定的工程菌株进行后续上罐发酵。
发酵罐规模为30L，参照“Pichia Fermentation Process Guidelines”进行发酵培养及甲醇诱导，诱导时长约30h；离心收集发酵上清液，5kD中空纤维膜管超滤浓缩3～5倍，并替换缓冲体系为20mM磷酸盐缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐-50mM氯化钠缓冲溶液(pH6.5)；然后上样SP Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare，柱床Φ38mm×160mm)，20mM磷酸盐缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐(pH6.5)(溶液A)清洗约3个柱床体积；用溶液A和20mM磷酸盐缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐–1M氯化钠溶液(pH6.5)(溶液B)进行梯度洗脱，收集mIFN-α4目的样品，取样进行非还原型SDS-PAGE(分离胶浓度为14％，银染显色)检测。洗脱图谱见图1，电泳结果见图2。
mIFN-α4 SP Sepharose Fast Flow纯化目的样用5K超滤膜包超滤浓缩并替换缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液-50mM精氨酸盐酸盐-10mM甲硫氨酸-20mM氯化钠(pH7.0)，调整浓度为约1.0mg/ml；按mIFN-α4蛋白与酶质量比为约20：1加入糖苷酶，25℃酶切约20h去除糖基。酶切样品用5mM硼酸缓冲液-10mM精氨酸盐酸盐(pH9.0)稀释约6倍，上样Q Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare，柱床Φ50mm×154mm)，20mM硼酸缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐-10mM甲硫氨酸(pH9.0)(溶液C)清洗约3个柱床体积；用溶液C和20mM硼酸缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐-10mM甲硫氨酸-0.3M氯化钠(pH9.0)(溶液D)进行梯度洗脱，收集去除糖基mIFN-α4目的样品，并用10％乙酸调pH至约pH5.0；用5K超滤膜包超滤浓缩并替换缓冲液为5mM乙酸/乙酸钠缓冲液-50mM精氨酸盐酸盐-100mM氯化钠(pH5.0)，所得样品即为去糖基化mIFN-α4原液。取样送检，余样-70℃冻存备用。洗脱图谱见图3，SDS-PAGE电泳结果见图4。
去糖基化mIFN-α4原液鲎试剂法测定细菌内毒素含量为＜60EU/mg；以商品化 mIFN-α4(R&D，货号12115-1)为标准品，小鼠成纤维细胞/脑心肌炎病毒(L929/EMCV)细胞病变抑制法测定比活性为5.4×10 8U/mg。
实施例2、PEG化重组鼠干扰素(PEG-mIFN-α4)的制备
去糖基化mIFN-α4原液用5kD超滤膜包超滤替换缓冲液为5mM乙酸/乙酸钠缓冲液-50mM氯化钠(pH5.0)；取约333ml样品(去糖基化mIFNα4含量为约500mg)，加入约22ml 0.8M硼酸/氢氧化钠缓冲液(pH9.4)，搅拌均匀；按蛋白与40kD Y型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(YPEG-NHS)质量比为约1:8加入YPEG-NHS，快速搅拌，室温反应10分钟；加入0.2M甲硫氨酸约20ml终止反应，10％乙酸调pH至5.0。加入550ml纯水，再加入600ml 20mM乙酸/乙酸钠缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐-10mM甲硫氨酸(pH5.1)(溶液E)，混匀；上样SP Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare，柱床Φ50mm×194mm)，溶液E清洗约5个柱床体积；然后用溶液E和20mM乙酸/乙酸钠缓冲液-20mM精氨酸盐酸盐-10mM甲硫氨酸-600mM氯化钠(pH5.1)(溶液F)进行梯度洗脱，收集PEG-mIFN-α4目的样品；5kD超滤膜包超滤替换缓冲液为：20mM磷酸盐缓冲液-123mM氯化钠(pH6.5)并适当浓缩，添加0.5％Tween80至Tween80终浓度为约0.005％，所得样品即为聚乙二醇化鼠干扰素α4原液(PEG-mIFN-α4)；取样送检，余样-70℃冻存备用。洗脱图谱见图5，SDS-PAGE电泳结果见图6。
PEG-mIFN-α4原液鲎试剂法测定细菌内毒素含量为＜15EU/mg；以商品化mIFN-α4(R&D，货号12115-1)为标准品，小鼠成纤维细胞/脑心肌炎病毒(L929/EMCV)细胞病变抑制法测定比活性为6.1×10 6U/mg。
实施例3、健康BALB/c小鼠皮下注射PEG-mIFN-α4的药代动力学研究
[根据细则26改正26.01.2022] 本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。PEG-mIFN-α4血药浓度采用双抗体夹心ELISA法检测。检测试剂盒采用Mouse IFN alpha Platinum ELISA kit(货号BMS6027/BMS6027TEN，Thermo)，但将其报告抗体替换成抗PEG抗体3.3biotin(台湾地区“中央研究院生物医学科学研究所”，中国台湾)，以避免内源性mIFN-α对测定结果的干扰。
6-8周龄、SPF级BALB/c小鼠(N＝60，雌雄各半)于颈背部皮下单次注射1μg/只PEG-mIFN-α4，分别采集药前(0h)和药后6h、15h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、168h、216h、264h、312h的血浆样本，测定血药浓度。采用Phoenix WinNonlin 6.4软件计算药代动力学参数。
血药浓度测定结果见表1，血药浓度-给药时间曲线见图7，药代动力学参数结果见表2。BALB/c小鼠颈背部皮下单次注射1μg/只PEG-mIFN-α4，血浆药物浓度达峰时间(T max)为24h，达峰浓度(C max)为268ng/ml，消除半衰期(T 1/2)为28.3h。
表1、BALB/c小鼠单次皮下注射1μg/只PEG-mIFN-α4血药浓度检测结果(N＝5，ng/ml)
注：在药代动力学分析时，血药浓度低于定量下限的样品，血药浓度达峰前样品按0计，达峰后样品以BLQ表示。
表2、BALB/c小鼠单次皮下注射1μg/只PEG-mIFN-α4的药代动力学参数汇总
实施例4、PEG-mIFN-α4间歇给药和连续给药对小鼠移植性肝癌H 22的疗效比较研究。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠肝癌H 22细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种H 22细胞(0.5×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤当天随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝15，雌7雄8)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝15，雌7雄8)及生理盐水对照组(N＝10，雌5雄5)等。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时；连续4轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次、连续给予21次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
所有组均进行生存分析，比较组间差异。统计分析采用SAS 9.4、office2010软件， 统计检验均为双侧检验。
生存曲线如图8所示，统计比较结果如表3所示。至接瘤40天，生理盐水对照组的中位生存期为19.5天，PEG-mIFN-α4连续给药组为38天；PEG-mIFN-α4间歇给药组的生存率为93.3％，尚无法计算中位生存期。PEG-mIFN-α4连续给药组、间歇给药组的生存曲线与生理盐水对照组的差异均显著；PEG-mIFN-α4连续给药组与间歇给药组的差异也显著(P＝0.0035)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的生存期相对连续给药组显著延长。针对小鼠移植性肝癌H 22的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
表3、PEG-mIFN-α4连续、间歇给药治疗小鼠移植性肝癌H 22疗效比较实验生存分析结果
注：1、与“生理盐水对照组”比较。2、与“PEG-mIFN-α4间歇给药组”比较。3、*：统计学差异显著。
实施例5、间歇式施用干扰素联合吉西他滨治疗小鼠肝癌的研究
本发明人研究了间歇式施用PEG化重组小鼠干扰素α(PEG-mIFN-α4)联合吉西他滨对小鼠肝癌H22的抑瘤作用，探索干扰素与吉西他滨的联合疗效。本发明人惊奇地发现，通过间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时施用吉西他滨，相比于单独施用吉西他滨或单独间歇式施用PEG-mIFN-α4，在H22肿瘤治疗中可以获得显著更优的治疗效果。
在本实施例中，进行了PEG-mIFN-α4间歇(每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时；持续8轮)、连续给药(每48小时给药一次，连续给予42次)、联用吉西他滨给药(每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续6轮；吉西他滨每周给药一次)对小鼠移植性肝癌H22的疗效比较研究。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠肝癌H22细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种H22细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤当天随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝24，雌12雄12)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝24，雌12雄12)、生理盐水对照组(N＝24，雌12雄12)、吉西他滨单用组(N＝24，雌12雄12)、以及PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组(N＝24，雌12雄12)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时，持续8轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组为每48小时给药一次、连续给予3次， 停药240小时，持续6轮；吉西他滨每周给药一次。吉西他滨单用组每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
所有组均进行生存分析，比较组间差异。统计分析采用SAS 9.4、office2010软件，统计检验均为双侧检验。
生存曲线如图9所示，统计比较结果如表4所示。至接瘤108天，PEG-mIFN-α4连续给药组的中位生存期为37.0天，间歇给药组为64.0天，均大于生理盐水对照组的17.5天。PEG-mIFN-α4连续给药组与间歇给药组的生存曲线差异显著(P＝0.0245)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的生存期相对连续给药组显著延长。针对小鼠移植性肝癌H22的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
吉西他滨单用组的中位生存期为58.5天，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组观察期终点(接瘤108天)时的生存率为75.0％，两组的生存曲线差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的生存期相对于吉西他滨单用组显著延长。
PEG-mIFN-α4间歇给药组的中位生存期为64.0天，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的生存率为75.0％，两组的生存曲线差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用组相对于PEG-mIFN-α4间歇给药单用组的生存期显著延长。
结果显示，针对小鼠移植性肝癌H22的治疗，间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α优于连续施用聚乙二醇化鼠干扰素α；间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨的抗癌活性，显著优于单独施用吉西他滨及单独间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α。
表4、PEG-mIFN-α4连续、间歇、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性肝癌H22疗效比较实验生存分析结果
注：1、与“PEG-mIFN-α4间歇给药组”比较。2、与PEG-mIFN-α4间歇施用联合吉西他滨组”比较。3、*：统计学差异显著。
实施例6、间歇式施用干扰素联合吉西他滨治疗小鼠肺癌的研究
本发明人研究了间歇式施用PEG-mIFN-α4联合吉西他滨对小鼠肺癌LLC的抑瘤作用，探索干扰素与吉西他滨的联合疗效。通过实验发现，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时施用吉西他滨，相比于单独施用吉西他滨或单独间歇式施用PEG-mIFN-α4，在肺癌LLC治疗中同样也可以获得显著更优的治疗效果。
本实施例中，进行PEG-mIFN-α4间歇(每48小时给药一次、连续给予4次，停药 192小时；持续5轮)、连续给药(每48小时给药一次，连续给予32次)、联用吉西他滨给药(PEG-mIFN-α4每48小时给药一次、连续给予4次，停药360小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次)对小鼠移植性肺癌LLC的疗效比较研究。
本实施例中，C57BL/6N小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠肺癌LLC细胞株购自中国北京协和细胞资源中心。
6-8周龄、18-22g SPF级C57BL/6N小鼠右前肢腋下皮下接种肺癌LLC(1×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤当天后随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝26，雌13雄13)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝26，雌13雄13)、生理盐水对照组(N＝26，雌13雄13)、吉西他滨单用组(N＝26，雌13雄13)、以及PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组(N＝26，雌13雄13)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予4次，停药192小时；持续5轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组为每48小时给药一次、连续给予4次，停药360小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。
采用SAS 9.4软件比较组间死亡率的差异，统计检验均为双侧检验。
各组死亡率如图10所示，统计比较结果如表5所示。至接瘤45天，PEG-mIFN-α4连续给药组的死亡率为100.0％，间歇给药组为34.6％，两者差异显著(P<0.001)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的死亡率相对连续给药组显著降低。针对小鼠移植性肺癌LLC的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
至接瘤64天，吉西他滨单用组的死亡率为80.8％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为53.8％，两者差异显著(P＝0.0385)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组相对于吉西他滨单用组的死亡率显著降低。
至接瘤64天，PEG-mIFN-α4间歇给药单用组的死亡率为84.6％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为53.8％，两组的死亡率差异显著(P＝0.0162)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率显著低于PEG-mIFN-α4间歇给药单用组。
结果显示，针对小鼠移植性肺癌LLC的治疗，间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α优于连续施用聚乙二醇化鼠干扰素α；间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨的抗癌活性，显著优于单独施用吉西他滨及间歇式单独施用聚乙二醇化鼠干扰素α。
表5、PEG-mIFN-α4连续、间歇、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性肺癌LLC疗效比较实验死亡率结果(接瘤至64天)
注：1、于接瘤45天时与“PEG-mIFN-α4间歇给药组”比较；2、(接瘤至64天)，与PEG-mIFN-α4间歇施用联合吉西他滨组”a比较。3、*：统计学差异显著。
实施例7、间歇式施用干扰素联合吉西他滨治疗结直肠癌的研究
本发明人研究了间歇式施用PEG-mIFN-α4联合吉西他滨对小鼠结直肠癌CT26的抑瘤作用，探索干扰素与吉西他滨的联合疗效。通过实验发现，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时施用吉西他滨，相比于单独施用吉西他滨或单独间歇式施用PEG-mIFN-α4，在结直肠癌CT26治疗中同样也可以获得显著更优的治疗效果。
本实施例中，进行PEG-mIFN-α4间歇(每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时；持续11轮)、连续(每48小时给药一次，连续给予55次)、联用吉西他滨给药(PEG-mIFN-α4每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续8轮；吉西他滨每周给药一次)对小鼠移植性结直肠癌CT26的疗效比较研究。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，CT26小鼠结直肠癌细胞株购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。抗癌剂为吉西他滨(江苏豪森药业)。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种CT26细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤当天随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝24，雌12雄12)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝24，雌12雄12)、生理盐水对照组(N＝24，雌12雄12)、吉西他滨单用组(N＝24，雌12雄12)、以及PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组(N＝24，雌12雄12)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时，持续11轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组为PEG-mIFN-α每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续8轮；吉西他滨每周给药一次。吉西他滨单用组每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
所有组均进行生存分析，比较组间差异。统计分析采用SAS 9.4、office2010软件，统计检验均为双侧检验。
生存曲线如图11所示，统计比较结果如表6所示。至接瘤110天，PEG-mIFN-α4连续给药组为53.5天，间歇给药组为89.0天，均大于生理盐水对照组的49.5天。PEG-mIFN-α4连续给药组与间歇给药组的生存曲线差异显著(P＝0.0150)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的生存期相对连续给药组显著延长。针对小鼠移植性结直肠癌CT26的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
吉西他滨单用组的中位生存期为99.0天，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组观察期终点(接瘤110天)时的生存率为75.0％(相同观察期内，未达中位生存期)，两组的生存曲线差异显著(P＝0.0102)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的生存期相对于吉西他滨单用组显著延长。
PEG-mIFN-α4间歇给药组的中位生存期为89.0天，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组观察期终点(接瘤110天)时的生存率为75.0％，两组的生存曲线差异显著(P＝0.0048)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的生存期相对于PEG-mIFN-α4间歇给药单用组显著延长。
结果显示，针对小鼠移植性结直肠癌CT26的治疗，间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α优于连续施用聚乙二醇化鼠干扰素α；间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨的抗癌活性，显著优于单独施用吉西他滨及间歇式单独施用聚乙二醇化鼠干扰素α。
表6、PEG-mIFN-α4连续、间歇、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性结直肠癌CT26疗效比较实验生存分析结果
注：1、与“PEG-mIFN-α4间歇给药组”比较。2、与PEG-mIFN-α4间歇施用联合吉西他滨组”比较。3、*：统计学差异显著。
实施例8、间歇式施用干扰素联合吉西他滨治疗黑色素瘤的研究
本发明人研究了间歇式施用PEG-mIFN-α4联合吉西他滨对小鼠黑色素瘤B16的抑瘤作用，探索干扰素与吉西他滨的联合疗效。通过实验发现，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时施用吉西他滨，相比于单独施用吉西他滨或单独间歇式施用PEG-mIFN-α4，在黑色素瘤B16治疗中同样也可以获得显著更优的治疗效果。
本实施例进行了PEG-mIFN-α4间歇(每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时；持续4轮)、连续给药(每48小时给药一次，连续给予24次)、联用吉西他滨给药(PEG-mIFN-α4每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次)对小鼠移植性黑色素瘤B16的疗效比较研究。
6-8周龄、18-22g SPFC57BL/6N小鼠右前肢腋下皮下接种B16细胞(1×10 5个/mL，0.2ml/只)。接瘤当天随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝28，雌14雄14)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝28，雌14雄14)、生理盐水对照组(N＝28，雌14雄14)、吉西他滨单用组(N＝28，雌14雄14)、以及PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组(N＝28， 雌14雄14)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续4轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组为PEG-mIFN-α4每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次。吉西他滨单用组每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
采用SAS 9.4软件比较组间死亡率的差异，统计检验均为双侧检验。
各组死亡率如图12所示，统计比较结果如表7所示。至接瘤46天，PEG-mIFN-α4连续给药组的死亡率为100.0％，间歇给药组为39.3％，两者差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的死亡率相对连续给药组显著降低。针对小鼠移植性黑色素瘤B16的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
至接瘤48天，吉西他滨单用组的死亡率为89.3％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为21.4％，两者差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率显著低于吉西他滨单用组。
至接瘤48天，PEG-mIFN-α4间歇给药单用组的死亡率为46.4％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为21.4％，两者差异显著(P＝0.0482)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率显著低于PEG-mIFN-α4间歇给药单用组。
结果显示，针对小鼠移植性黑色素瘤B16的治疗，间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α优于连续施用聚乙二醇化鼠干扰素α；间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨的抗癌活性，显著优于单独施用吉西他滨及间歇式单独施用聚乙二醇化鼠干扰素α。表7、PEG-mIFN-α4连续、间歇、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性黑色素瘤B16疗效比较实验死亡率结果
注：1、于接瘤46天时与“PEG-mIFN-α4间歇给药组”比较；2、于接瘤48天时，与PEG-mIFN-α4间歇施用联合吉西他滨组”比较。3、*：统计学差异显著。
实施例9、间歇式施用干扰素联合吉西他滨治疗乳腺癌的研究
本发明人研究了间歇式施用PEG-mIFN-α4联合吉西他滨对小鼠移植性乳腺癌4T1的抑瘤作用，探索干扰素与吉西他滨的联合疗效。通过实验发现，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时施用吉西他滨，相比于单独施用吉西他滨或单独间歇式施用 PEG-mIFN-α4，在乳腺癌4T1治疗中同样也可以获得显著更优的治疗效果。
本实例进行了PEG-mIFN-α4间歇(每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时；持续5轮)、连续(PEG-mIFN-α4每48小时给药一次，连续给予25次)、联用吉西他滨给药(每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次)对小鼠移植性乳腺癌4T1的疗效比较研究。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠乳腺癌4T1细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种乳腺癌4T1(1×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤4天后随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4连续给药组(N＝24，雌12雄12)、PEG-mIFN-α4间歇给药组(N＝24，雌12雄12)、生理盐水对照组(N＝24，雌12雄12)、吉西他滨单用组(N＝24，雌12雄12)、以及PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组(N＝24，雌12雄12)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1.5微克每只。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4间歇给药组每48小时给药一次、连续给予3次，停药144小时；持续5轮。PEG-mIFN-α连续给药组每48小时给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组为PEG-mIFN-α4每48小时给药一次、连续给予3次，停药240小时，持续4轮；吉西他滨每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。
采用SAS 9.4软件比较组间死亡率的差异，统计检验均为双侧检验。
各组死亡率如图13所示，统计比较结果如表8所示。至接瘤53天，PEG-mIFN-α4连续给药组的死亡率为87.5％，间歇给药组为58.3％，均低于生理盐水对照组的100.0％。PEG-mIFN-α4连续给药组与间歇给药组的死亡率差异显著(P＝0.0230)，PEG-mIFN-α4间歇给药组的死亡率相对连续给药组显著降低。针对小鼠移植性乳腺癌4T1的治疗，PEG-mIFN-α4间歇性施用相对连续施用方式体现出显著更优的疗效。
至接瘤53天，吉西他滨单用组的死亡率为87.5％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为4.2％，两组差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组相对于吉西他滨单用组的死亡率显著降低。
至接瘤53天，PEG-mIFN-α4间歇给药单用组的死亡率为58.3％，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率为4.2％，两组的死亡率差异显著(P<0.0001)，PEG-mIFN-α4间歇给药联用吉西他滨组的死亡率显著低于PEG-mIFN-α4间歇给药单用组。
结果显示，针对小鼠移植性乳腺癌4T1的治疗，间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α优于连续施用聚乙二醇化鼠干扰素α；间歇式施用聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨的抗癌活性，显著优于独施用吉西他滨及间歇式单独施用聚乙二醇化鼠干扰素α。
表8、PEG-mIFN-α4连续、间歇、联用吉西他滨给药治疗小鼠移植性乳腺癌4T1疗效比较实验死亡率结果
注：1、与“PEG-mIFN-α4连续给药组”比较。2、与PEG-mIFN-α4间歇施用联合吉西他滨组”比较。3、*：统计学差异显著
实施例10、间歇施用干扰素联合抗癌剂表柔比星治疗小鼠移植性肝癌H 22的研究
本实施例中采用的抗癌剂为化疗药物中抗肿瘤抗生素类药物表柔比星，考察间歇施用干扰素联合抗癌剂表柔比星治疗小鼠移植性肝癌H 22的实施效果。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠肝癌H 22细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，表柔比星厂家为北京协和药厂。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种肝癌H 22瘤细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)；接瘤3天后，随机分组，每组28只，雌雄各半；实验分组包括生理盐水对照组、表柔比星单用组、PEG-mIFN-α4联用表柔比星组。
分组后当天开始给药，每周给药一次；PEG-mIFN-α4为颈背部皮下注射，每次施用剂量为1微克每只；表柔比星为腹腔注射，剂量为每次3.5毫克每千克；生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
所有组别均进行生存曲线分析，并比较中位生存期；采用SAS 9.4、office2010软件进行统计分析。统计检验均为双侧检验。
各组小鼠的生存曲线如图14所示，中位生存期如表9所示。生理盐水组的中位生存期为13.5天，表柔比星组的中位生存期为15天，PEG-mIFN-α4联用表柔比星组在观察期内的生存率为57.1％。PEG-mIFN-α4联用表柔比星组的生存曲线与生理盐水组的差异具有显著性(P<0.0001)；间歇性施用PEG-mIFN-α4同时联用表柔比星，相比于单独单独施用表柔比星可以显著延长荷瘤小鼠的生存期(P<0.0001)。
该实施例提示，在小鼠移植性肝癌H 22的治疗中，间歇性地施用PEG-mIFN-α4同时联合表柔比星的疗效显著优于单独施用表柔比星。
表9.实施例10生存分析结果
注：P值 1为与“生理盐水(0.2ml/w)”比较，P值 2为与“表柔比星(3.5mg/kg/w)”比较，*具有统计学 差异。
实施例11、间歇施用干扰素联合抗癌剂奥沙利铂治疗小鼠移植性肝癌H 22的研究
本实施例中采用的抗癌剂为化疗药物奥沙利铂，考察间歇施用干扰素联合抗癌剂奥沙利铂治疗小鼠移植性肝癌H 22的实施效果。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，H 22小鼠肝癌细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；奥沙利铂厂家为齐鲁制药(海南)有限公司。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种肝癌H 22瘤细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)；接瘤3天后，随机分组，每组28只，雌雄各半；实验分组包括生理盐水对照组、奥沙利铂单用组、PEG-mIFN-α4联用奥沙利铂组等。
分组后当天开始给药，每周给药一次；PEG-mIFN-α4为颈背部皮下注射，每次施用剂量为1微克每只；奥沙利铂为腹腔注射，每次10毫克每千克；生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。
所有组别均进行生存曲线分析，并比较中位生存期；采用SAS 9.4、office2010软件进行统计分析。统计检验均为双侧检验。
各组小鼠的生存曲线如图15所示，中位生存期如表10所示。生理盐水组的中位生存期为11天，奥沙利铂组的中位生存期为12.5天，PEG-mIFN-α4联用奥沙利铂组的中位生存期为31天。PEG-mIFN-α4联用奥沙利铂组的生存曲线与生理盐水组的差异显著(P＝0.0001)，与单独施用奥沙利铂组的差异也显著(P＝0.0014)；间歇性施用PEG-mIFN-α4同时联用奥沙利铂可以显著延长荷瘤小鼠的生存期。
该实施例提示，在小鼠移植性肝癌H 22的治疗中，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时联合施用奥沙利铂，相比于单独施用奥沙利铂，可以获得显著更优的治疗效果。
表10.实施例11生存分析结果
注：P值 1为与“生理盐水(0.2ml/w)”比较，P值 2为与“奥沙利铂(10mg/kg/w)”比较，*具有统计学差异。
实施例12、间歇施用干扰素联合抗癌剂紫杉醇治疗小鼠移植性肝癌H 22研究
本实施例中采用的抗癌剂为化疗药物紫杉醇，考察间歇施用干扰素联合抗癌剂紫杉醇治疗小鼠移植性肝癌H 22的实施效果。
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，H 22小鼠肝癌细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，紫杉醇厂家为江苏奥赛康药业股份有 限公司。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种肝癌H 22瘤细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)；接瘤3天后，随机分组，每组28只，雌雄各半；实验分组包括生理盐水对照组、紫杉醇单用组、PEG-mIFN-α4联用紫杉醇组。
分组后当天开始给药，每周给药一次；PEG-mIFN-α4为颈背部皮下注射，每次施用剂量为1微克每只；紫杉醇为腹腔注射，每次10毫克每千克。
所有组别均进行生存曲线分析，并比较中位生存期；采用SAS 9.4、office2010软件进行统计分析。统计检验均为双侧检验。
各组小鼠的生存曲线如图16所示，中位生存期如表11所示。生理盐水组的中位生存期为15天，紫杉醇组为17天；在观察期内，PEG-mIFN-α4联用紫杉醇组的生存率为82.1％。PEG-mIFN-α4联用紫杉醇组的生存曲线与生理盐水组的差异显著(P＝0.0001)，与单独施用紫杉醇组的差异也显著(P<0.0001)；间歇性施用PEG-mIFN-α4同时联用紫杉醇可以显著延长荷瘤小鼠的生存期。
该实施例提示，在小鼠移植性肝癌H 22的治疗中，间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时联合施用紫杉醇，相比于单独施用紫杉醇，可以获得显著更优的治疗效果。
表11.实施例12生存分析结果
注：P值 1为与“生理盐水(0.2ml/w)”比较，P值 2为与“紫衫醇(10mg/kg/w)”比较，*具有统计学差异。
本发明上述结果提示，通过间歇性地施用PEG-mIFN-α4并同时联合化疗剂例如施用吉西他滨、紫杉醇、奥沙利铂、表柔比星等，相比于单独施用化疗剂，可以获得显著更优的癌症治疗效果。
上述结果提示，长时间地连续施用干扰素，将会造成免疫抑制和免疫细胞消耗且难以恢复。干扰素的疗效依赖于免疫系统，因此基于干扰素的治疗在免疫细胞仍然充足的治疗前期能够取得很好的治疗效果例如很高的肿瘤抑制，然而，在治疗后期由于长期施用干扰素导致的免疫细胞消耗或免疫抑制，治疗效果将大幅下降，并且即使继续施用干扰素也可能无法持续保持较高的治疗效力。而通过间歇性施用干扰素，可以避免这一问题。例如，施用一段时间的干扰素取得一定疗效后，在免疫部分抑制和免疫细胞耗竭前停止干扰素的施用一段时间，使得免疫细胞能够尽快恢复，之后再次重新施用干扰素，仍然能够取得较好的治疗效力。通过间歇性施用干扰素的治疗剂合理联合其他药物，可取得更好的治疗效果。
实施例13、PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(PEG-mIFN-α4每周给药一次，吉西他滨每周一次，持续19周)、干扰素与吉西他滨不同联用方式对小鼠移植性肝癌H22的疗效比较研究
本实施例中，BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠肝癌H22细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
6-8周龄、18-22g SPF级BALB/c小鼠右前肢腋下皮下接种H22细胞(1×10 6个/mL，0.2ml/只)。接瘤3天后随机分组，实验分组包括PEG-mIFN-α4组(N＝27，雌14雄13)、PEG-mIFN-α4联用同时吉西他滨组(N＝27，雌14雄13)、PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组组(N＝27，雌14雄13)、PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组(N＝27，雌14雄12)及生理盐水对照组(N＝27，雌14雄13)。
PEG-mIFN-α4施用方式为颈背部皮下注射给药，剂量为1微克每只。分组后当天开始给药；PEG-mIFN-α4组每周给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨同步组PEG-mIFN-α4和吉西他滨同天给药，每周给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组为先给吉西他滨3天后再给PEG-mIFN-α4，每周给药一次。PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组为先给PEG-mIFN-α4，3天后再给吉西他滨，每周给药一次。生理盐水对照组给予等体积的生理盐水。吉西他滨为腹腔注射，剂量为60mg/kg。
采用SAS 9.4软件比较组间肿瘤发生率的差异，统计检验均为双侧检验。
以瘤体积大于等于62.5mm^3判为肿瘤发生阳性计算各组的肿瘤发生率。肿瘤发生率变化如图17所示。至接瘤151天，生理盐水对照组的肿瘤发生率为100.0％，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨同时给吉西他滨组为63.0％，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组为29.6％，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组为80.8％。，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组的肿瘤发生率均低于生理盐水对照组和PEG-mIFN-α4单用组。肿瘤发生判为阴性的小鼠经解剖确认，腋下未见实体瘤。统计比较结果如表12所示，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组的肿瘤发生率低于PEG-mIFN-α4联用吉西他滨同步组(P＝0.0140)和PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组(P＝0.0002)。
生存曲线如图18所示，至接瘤151天，生理盐水对照组的中位生存期为19.0天，PEG-mIFN-α4单用组的中位生存期为38.0天，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨同步组为122.0天，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组的生存率为66.7％，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组为94.0天。统计比较结果如表13所示，PEG-mIFN-α4治疗组的生存期均大于生理盐水对照组；PEG-mIFN-α4联用吉西他滨组的生存期均大于PEG-mIFN-α4单用组，生存曲线均具有统计学差异(P<0.0001)；PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组的生存期大于其他方式的联用组，其生存曲线与PEG-mIFN-α4联用吉西他滨同步组和PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给PEG-mIFN-α4)组均有统计学差异(P值分别为0.0241和0.0010)。
结果显示，针对小鼠移植性肝癌H22的治疗，聚乙二醇化鼠干扰素α与吉西他滨的不同联合方式均具有抗癌活性。聚乙二醇化鼠干扰素α联合吉西他滨组中，聚乙二醇化鼠干扰素α与吉西他滨不同给药的节律，抗癌活性有所区别，PEG-mIFN-α4联用吉西他滨，给PEG-mIFN-α4 72h后给吉西他滨组显著优于其他方式的联用。
表12、干扰素与吉西他滨不同联用方式对小鼠移植性肝癌H22的治疗比较试验的肿瘤发生率分析结果
注：1、与“生理盐水对照组”比较。2、与“PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组”比较。3、*：统计学差异显著。
表13、干扰素与吉西他滨不同联用方式对小鼠移植性肝癌H22的治疗比较试验的生存分析结果
注：1、与“生理盐水对照组”比较。2、与“PEG-mIFN-α4联用吉西他滨(72h后给吉西他滨)组”比较。3、*：统计学差异显著。
序列及说明
>SEQ ID NO:1是干扰素α2a的氨基酸序列(例如罗荛素或派罗欣)
>SEQIDNO:2是干扰素α2b氨基酸序列(例如甘乐能或佩乐能或派格宾)
>SEQIDNO:3是重组集成干扰素氨基酸序列(例如干复津)
>SEQIDNO:4：是培集成干扰素α-2氨基酸序列(例如派益生)
>SEQIDNO:5：是干扰素λ氨基酸序列
>SEQ ID NO:6：是鼠干扰素α4氨基酸序列
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Claims (34)

  1. 一种在对象中治疗癌症的方法，其包括给所述对象
    i)间隔地施用多个连续疗程的基于干扰素的治疗剂；和
    ii)施用额外的抗癌剂，
    其中所述额外的抗癌剂在所述多个连续疗程的首次基于干扰素的治疗剂施用之后开始施用。
  2. 权利要求1的方法，其中所述对象在所述多个连续疗程的首次基于干扰素的治疗剂施用之前的至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少六个月、至少12个月或更长时间段之内没有接受额外的抗癌剂。
  3. 权利要求1-2中任一项的方法，其中在所述连续疗程中，所述基于干扰素的治疗剂的施用使得基本上在整个疗程期间，对象体内新喋呤的浓度高于首次施用前的新喋呤浓度，例如是首次施用前新喋呤浓度的大约110％、大约120％、大约130％、大约140％、大约150％、大约200％、大约250％或更高。
  4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述连续疗程的长度为所述疗程内基于干扰素的治疗剂第一次施用至最后一次施用的时间，再加上所述基于干扰素的治疗剂的大约5个体内半衰期。
  5. 权利要求1-4中任一项的方法，所述多个连续疗程各自的长度为大约1周-大约24周，优选大约1周-大约12周，更优选大约1周-大约8周，更优选大约2周-大约6周。
  6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中每个连续疗程的长度为大约1周-大约12周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约12周。
  7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中各连续疗程之间间隔大约1周-大约24周，优选大约1周-大约12周，更优选大约1周-大约8周，更优选大约2周-大约6周。
  8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中每个连续疗程的长度为大约1周-大约8周，且其中各疗程之间间隔大约1周-大约8周。
  9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中每个连续疗程的长度为大约2周-大约6周，且其中各疗程之间间隔大约2周-大约6周。
  10. 权利要求1-9中任一项的方法，所述基于干扰素的治疗剂施用2个-25个或以上的连续疗程。
  11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中所述多个连续疗程的长度基本上相同。
  12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述各连续疗程之间具有基本上相同的时间间隔。
  13. 权利要求1-12中任一项的方法，所述额外的抗癌剂在所述多个连续疗程的首次基于干扰素的治疗剂施用后开始施用，所述额外的抗癌剂的施用与所述基于干扰素的治疗剂首次施用间隔所述基于干扰素的治疗剂大约1-大约10个体内半衰期的时间段。
  14. 权利要求1-13中任一项的方法，其中在每个连续疗程期间施用所述额外的抗癌剂，且在所述每个连续疗程期间，所述额外的抗癌剂在所述基于干扰素的治疗剂之后施用。
  15. 权利要求1-13中任一项的方法，其中在每个连续疗程之后施用所述额外的抗癌剂，且在所述每个连续疗程期间不施用所述额外的抗癌剂。
  16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素或其突变体或衍生物，或包含编码干扰素或其突变体或衍生物的核酸分子，或包含促进内源干扰素产生的物质。
  17. 权利要求1-16中任一项的方法，其中所述干扰素是I型、II型或III型干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ，优选干扰素α。
  18. 权利要求1-17中任一项的方法，其中所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素α1b、干扰素λ，或其突变体或衍生物。
  19. 权利要求1-18中任一项的方法，其中所述干扰素或其突变体或衍生物是PEG化修饰的。
  20. 权利要求1-19中任一项的方法，其中所述基于干扰素的治疗剂选自P1101、派格宾、派罗欣、佩乐能、干复津、乐复能、甘乐能、罗荛素、运德素、派益生和聚乙二醇干扰素λ。
  21. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述基于干扰素的治疗剂包括TLRs、RLRs及STINGs信号通路的激动剂。
  22. 权利要求21的方法，其中所述基于干扰素的治疗剂选自GS-9620、GS-9688、RO7020531、RO6864018、TQ-A3334、JNJ-4964、SB9200、MIW815、DMXAA、MK-1454和diABZI。
  23. 权利要求1-22中任一项的方法，其中所述癌症选自白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病、多毛细血管白血病)、肝癌、肺癌、结直肠癌、皮肤癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、喉乳头状瘤、滤泡性淋巴瘤、艾滋病相关卡波氏肉瘤和肾细胞癌，优选是肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌或黑色素瘤。
  24. 权利要求1-23中任一项的方法，其中所述抗癌剂是
    i)化疗剂，例如烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、司莫司汀；抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、卡培他滨；抗肿瘤抗生素：放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯；抗肿瘤激素类化疗药物：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬；化疗药物杂 类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、丙卡巴肼；或
    ii)免疫检查点抑制剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA4的抑制剂，例如选自以下的抗体：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab；或
    iii)小分子靶向药物，例如伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、来那度胺、舒尼替尼、达沙替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、依维莫司、凡德他尼、克唑替尼、威罗菲尼、ruxolitinib、阿西替尼、vismodegib、卡非佐米、瑞戈非尼、博舒替尼、托法替尼、卡博替尼、帕纳替尼、泊马度胺、曲美替尼、达拉菲尼、阿法替尼、埃克替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、阿帕替尼、帕布昔利布、乐伐替尼、阿西替尼、埃克替尼、阿帕替尼、sonidegib、cobimetinib、osimertinib、alectinib、ixazomib；或
    iv)肿瘤相关抗原特异性抗体类，如美罗华、赫赛丁；
    优选地，所述抗癌剂选自奥沙利铂、表柔比星、紫杉醇和吉西他滨，更优选是吉西他滨。
  25. 一种用于对象中治疗癌症的药物组合，其包含基于干扰素的治疗剂和抗癌剂。
  26. 权利要求25的药物组合，其中所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素或其突变体或衍生物，或包含编码干扰素或其突变体或衍生物的核酸分子，或包含促进内源干扰素产生的物质。
  27. 权利要求25或26的药物组合，其中所述干扰素是I型、II型或III型干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ，优选干扰素α。
  28. 权利要求25-27中任一项的药物组合，其中所述基于干扰素的治疗剂包含干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素α1b、干扰素λ，或其突变体或衍生物。
  29. 权利要求25-28中任一项的药物组合，其中所述干扰素或其突变体或衍生物是PEG化修饰的。
  30. 权利要求25-29中任一项的药物组合，其中所述基于干扰素的治疗剂选自P1101、派格宾、派罗欣、佩乐能、干复津、乐复能、甘乐能、罗荛素、运德素、派益生和聚乙二醇干扰素λ。
  31. 权利要求25-27中任一项的药物组合，其中所述基于干扰素的治疗剂包括TLRs、RLRs及STINGs信号通路的激动剂。
  32. 权利要求32的药物组合物，其中所述基于干扰素的治疗剂选自GS-9620、GS-9688、RO7020531、RO6864018、TQ-A3334、JNJ-4964、SB9200、MIW815、DMXAA、MK-1454和diABZI。
  33. 权利要求25-32中任一项的药物组合，其中所述抗癌剂是
    i)化疗剂，例如烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、司莫司汀；抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫 鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、卡培他滨；抗肿瘤抗生素：放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯；抗肿瘤激素类化疗药物：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬；化疗药物杂类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、丙卡巴肼；或
    ii)免疫检查点抑制剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA4的抑制剂，例如选自以下的抗体：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab；或
    iii)小分子靶向药物，例如伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、来那度胺、舒尼替尼、达沙替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、依维莫司、凡德他尼、克唑替尼、威罗菲尼、ruxolitinib、阿西替尼、vismodegib、卡非佐米、瑞戈非尼、博舒替尼、托法替尼、卡博替尼、帕纳替尼、泊马度胺、曲美替尼、达拉菲尼、阿法替尼、埃克替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、阿帕替尼、帕布昔利布、乐伐替尼、阿西替尼、埃克替尼、阿帕替尼、sonidegib、cobimetinib、osimertinib、alectinib、ixazomib；或
    iv)肿瘤相关抗原特异性抗体类，如美罗华、赫赛丁；
    优选地，所述抗癌剂选自奥沙利铂、表柔比星、紫杉醇和吉西他滨，更优选是吉西他滨。
  34. 权利要求25-33中任一项的药物组合，其用于通过权利要求1-24中任一项的方法在对象中治疗癌症。
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