CN117233100A - 基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及彩色成像技术领域，尤其涉及一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法。方法包括：白色通道及颜色通道的图像插值；插值后进行NCI估算，获得NCI分布；光谱分解：进行颜色解析及最大化概率颜色判断，得到像素的颜色分类图像；对样品的原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；液滴颜色分类，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像；对液滴总数计数并进行阈值判断，对每种荧光分子阳性计数，利用泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，定量分析。优点在于实现了一次激发实现多种颜色液滴成像，利用单帧图像实现多色dPCR检测，有利于多种目的基因同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及彩色成像技术领域，尤其涉及一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法。
背景技术
数字PCR(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)是一种能以更高灵敏度对低浓度核酸样本进行绝对定量的技术。基于荧光颜色的多重dPCR检测是多重dPCR检测的常用方法。通过几种不同荧光基团的组合，结合仪器通过相应荧光通道检测多种目的基因，通过提高单次检测通量，从而提高检测效率，是一种稳定且准确的荧光检测方法。
受当前成像仪器限制，多重检测只能通过切换不同滤色片(分时)，或是利用相机不同区域成像不同颜色(分光)。而这些方式往往成像光路复杂且单次检测通量低，不适用于多颜色通量的样本检测。受荧光通道数影响，基于荧光颜色的多重dPCR检测颜色通量有限，即对于多种目的基因的检测存在不足，从而限制了解决某些需要检测样品20～50种目的基因的临床应用能力。因此，荧光通道数不足的问题不可忽视，需要提高颜色检测通量。部分研究者通过组合三种荧光染料以分时的方法实现八种目的基因的检测，但需要配合控制激光开关组合，然而多次激发会导致样本的损坏。为减小成像复杂度并提高单次检测通道，需要开发一种能够同时对多种目的基因进行成像的方法。
中国专利公布号为CN111044498A，公布日为2020年4月21日，专利名称为“一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统”的发明专利申请利用弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，仅针对超分辨单分子成像信号，不针对全视场液滴PCR图像信号。因此目前还未见全视场液滴PCR图像信号的检测方法。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法。
本发明第一目的在于提供一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，具体包括如下步骤：
S1、白色通道及颜色通道的图像插值：使用基于梯度的无阈值插值算法对白色通道和颜色通道进行内插，得到插值结果；
S2、插值后进行NCI估算：根据插值后获得的各个像素上的颜色通道及白色通道强度值进行NCI估算，获得NCI分布；
S3、光谱分解：基于每个像素在白色通道或颜色通道图像中的像素值，评估各像素在所有荧光染料强度比例下的似然概率，通过似然函数获得最大似然解，最后获取各像素在每种颜色通道中的强度比例，每个像素的颜色判断为强度占比最大的荧光颜色，根据判断结果得到像素的颜色分类图像；
S4、图像分割：对样品的原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；
S5、液滴颜色分类：利用图像分割中得到的原始图像中每个液滴的位置信息，在光谱分解后的颜色分类图像中获取同样位置，通过比较获取位置处的颜色像素比例，通过对每一个液滴进行遍历判断，比较颜色比例，取比例最大的颜色信息Cmax为该液滴颜色，最后得到所有液滴的颜色信息，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像；
S6、定量分析：对液滴总数进行计数，得到各荧光颜色的液滴后，通过阈值判断得到各阳性液滴总数，通过泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，通过获取的液滴总数及各颜色通道阳性液滴数量实现定量分析。
优选的，颜色通道包括红色通道R、绿色通道G、蓝色通道B和近红外通道NIR。
优选的，步骤S1具体包括如下子步骤：
S101、使用基于梯度的无阈值插值算法对白色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在颜色通道处的白色通道像素值，利用引导滤波器对白色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将颜色通道处的真实值与估计色差值相加得到白色通道的插值结果；
S102、利用白色通道作为引导图像，使用基于梯度的无阈值插值算法对颜色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在白色通道处的颜色通道像素值，利用引导滤波器对颜色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将白色通道处的真实值与估计色差值相加得到颜色通道的插值结果。
优选的，步骤S3中似然概率的公式如下：
其中，U指每种荧光分子有U个NCI分布，ru为第u个颜色通道的NCI，t为t种荧光信号，u∈[1,4]。
优选的，步骤S4采用霍夫圆变换对原始图像进行图像分割；所述位置信息包括圆心及半径信息。
优选的，步骤S6中的始拷贝浓度的计算公式如下：
式中，N为液滴总数、M为稀释倍数、F为阳性液滴数目；
所述泊松分布公式为：式中，λ为每个液滴中所含目标DNA的平均拷贝数，x为拷贝数。
优选的，步骤S6采用大津阈值法进行阈值判断。
本发明第二个目的在于提供一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测装置，包括：
图像插值模块，用于对白色通道和颜色通道进行内插，得到插值结果；
NCI估算模块，用于根据插值后获得的各像素处颜色通道与白色通道强度值进行NCI估算，获得NCI分布；
光谱分解模块，用于进行颜色解析及最大化概率颜色判断，得到像素的颜色分类图像；
图像分割模块，用于对样品的原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；
液滴颜色分类模块，用于根据原始图像中每个液滴的位置信息获取光谱分解后的颜色分类图像的同样位置，比较获取位置处的颜色像素比例后得到液滴的颜色信息，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像；
定量分析模块，用于对液滴总数及各目的基因阳性液滴计数，再通过泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，最终获取的各颜色通道定量分析结果。
与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：
针对现有多色dPCR检测颜色通量低的问题，利用色度sCMOS相机对单帧图像进行编码，通过颜色解析及单个液滴的最大化概率颜色判断，精确获取各液滴颜色信息；基于引导图像进行去马赛克、极大似然估计以及图像分割的方法，结合dPCR液滴图像特征实现了通过一次激发实现多种颜色液滴成像，利用单帧图像实现多色dPCR检测，有利于珍贵样本的多种目的基因同时检测。
附图说明
图1是色度sCMOS相机的颜色阵面分布图。
图2是根据本发明实施例提供的多色荧光数字PCR定量检测方法流程图。
图3是根据本发明实施例提供的液滴颜色分类示意图；circleFrame为图像分割中得到的符合dPCR特征的液滴总数。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
参见图1，本发明利用的色度sCMOS相机是一款阵列重复排布为W-R-G-B-NIR的彩色相机，利用相机特殊的阵列排布进行多色dPCR检测；W-R-G-B-NIR阵列相机包含白色通道(W)以及颜色通道(红色通道(R)、绿色通道(G)、蓝色通道(B)以及近红外通道(NIR))，如图1为一个阵列单元，其中白色通道占50％，用于对液滴位置进行编码；颜色通道用于对液滴颜色信息编码。阵列具体排布为：第一行：R-W-G-W，第二行：W-NIR-W-NIR，第三行：G-W-B-W，第四行：W-NIR-W-NIR。另外颜色通道对不同波长响应不同，其相对响应(即颜色通道和白色通道量子效率之比)也不同，因此不同颜色的荧光液滴经过光学检测系统后，会有不同的颜色编码，从而通过颜色解析可以将不同颜色液滴分类，最后通过对每种颜色液滴进行泊松分布定量分析。
参见图1-3，本发明提供一种基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，具体包括如下步骤：
S1、白色通道及颜色通道的图像插值；具体包括如下子步骤：
S101、使用基于梯度的无阈值插值算法(GBTF)对白色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在颜色通道处的白色通道像素值，利用引导滤波器对白色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将颜色通道处的真实值与估计色差值相加得到白色通道的插值结果；
S102、利用白色通道作为引导图像，使用基于梯度的无阈值插值算法(GBTF)对颜色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在白色通道处的颜色通道像素值，利用引导滤波器对颜色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将白色通道处的真实值与估计色差值相加得到颜色通道的插值结果；
所述颜色通道包括红色通道(R)、绿色通道(G)、蓝色通道(B)和近红外通道(NIR)；所述平滑化处理用于降噪；
原理：使用的色度sCMOS相机每个像素对应一个通道，因此每个像素点仅包括了光谱的一部分，为得到每个像素处的所有颜色信息，需要利用周围像素对图像进行插值，将不完整的颜色样本重建成全色图像。
S2、插值后进行NCI估算：插值后获得的各像素处颜色通道与白色通道强度值，进行NCI估算，获得NCI分布；NCI计算公式如下：
NCI＝各颜色通道强度值/颜色通道强度值；
原理：NCI为颜色通道与白色通道强度比值，由荧光分子的发光光谱以及相机的rQE(颜色通道和黑白通道量子效率之比)曲线决定，NCI估算是通过提取图像插值后获得的像素处各颜色通道强度值(NCI_R,NCI_G,NCI_B,和NCI_NIR)计算。
S3、光谱分解：基于每个像素在白色或颜色通道图像中的像素值，评估各像素在所有荧光染料强度比例下的似然概率，通过似然函数获得最大似然解，最后获取各像素在每种颜色通道中的强度比例，每个像素的颜色判断为强度占比最大的荧光颜色，根据判断结果得到像素的颜色分类图像；所述似然概率的公式如下：
其中，U指每种荧光分子有U个NCI分布，ru指第u个颜色通道的NCI(u∈[1,4])，t为t种荧光信号；本发明每种荧光分子有4个NCI分布，针对四种荧光信号(t∈[1,4])，而每个荧光分子对应的NCI分布是相互独立的，因此该像素信号强度的某种荧光分子的概率是各个颜色通道的概率之积；通过概率最大化Cmax判定荧光分子占不同通道的比例。
S4、图像分割：采用霍夫圆变换对原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；所述位置信息包括圆心及半径信息；
原理：为实现在以像素点颜色分类后的图像中恢复对应颜色的液滴，本方案先对原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息，以后续处理。因为图像分割是决定dPCR液滴能准确定位和颜色分类的关键步骤，为准确分割图像中密集的液滴，采用特征提取技术Hough圆变换，通过将在空间中具有一定半径的圆曲线映射到参数空间，通过设置累加器进行累加形成峰值，从而检测到圆的中心及半径信息，为定位到标准液滴，通常会排除过大过小或形状异常液滴。
S5、液滴颜色分类：利用图像分割中得到的原始图像中n个液滴圆心及半径信息，在光谱分解后的颜色分类图像中获取同样位置，通过比较获取位置处的颜色像素比例通过对每一个液滴进行遍历判断，比较四种荧光颜色的颜色比例C1、C2、C3、C4，取比例最大的颜色信息Cmax为该液滴颜色，最后得到所有液滴的颜色信息，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像。
S6、定量分析：首先对液滴总数计数，得到各荧光颜色的液滴后，通过Otsu大津阈值法进行阈值判断，得到各阳性液滴总数，通过泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，通过获取的液滴总数及各颜色通道阳性液滴数量实现定量分析；起始拷贝浓度的计算公式如下：
式中，N为液滴总数、M为稀释倍数、F为阳性液滴数目；
泊松分布公式为：式中，λ为每个液滴中所含目标DNA的平均拷贝数，x为拷贝数。
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发明公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本发明公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、白色通道及颜色通道的图像插值：使用基于梯度的无阈值插值算法对白色通道和颜色通道进行内插，得到插值结果；
S2、插值后进行NCI估算：根据插值后获得的各个像素上的颜色通道及白色通道强度值进行NCI估算，获得NCI分布；
S3、光谱分解：基于每个像素在白色通道或颜色通道图像中的像素值，评估各像素在所有荧光染料强度比例下的似然概率，通过似然函数获得最大似然解，最后获取各像素在每种颜色通道中的强度比例，每个像素的颜色判断为强度占比最大的荧光颜色，根据判断结果得到像素的颜色分类图像；
S4、图像分割：对样品的原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；
S5、液滴颜色分类：利用图像分割中得到的原始图像中每个液滴的位置信息，在光谱分解后的颜色分类图像中获取同样位置，通过比较获取位置处的颜色像素比例，通过对每一个液滴进行遍历判断，比较颜色比例，取比例最大的颜色信息Cmax为该液滴颜色，最后得到所有液滴的颜色信息，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像；
S6、定量分析：对液滴总数进行计数，得到各荧光颜色的液滴后，通过阈值判断得到各阳性液滴总数，通过泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，通过获取的液滴总数及各颜色通道阳性液滴数量实现定量分析。
2.根据权利要求1所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述颜色通道包括红色通道R、绿色通道G、蓝色通道B和近红外通道NIR。
3.根据权利要求2所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下子步骤：
S101、使用基于梯度的无阈值插值算法对白色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在颜色通道处的白色通道像素值，利用引导滤波器对白色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将颜色通道处的真实值与估计色差值相加得到白色通道的插值结果；
S102、利用白色通道作为引导图像，使用基于梯度的无阈值插值算法对颜色通道进行内插，在水平和垂直方向上应用Hamilton&Adams插值，估计在白色通道处的颜色通道像素值，利用引导滤波器对颜色通道进行上采样生成估计值，然后计算每个像素处的水平色差和垂直色差，进行平滑化处理，组成最后的估计色差值，再通过将白色通道处的真实值与估计色差值相加得到颜色通道的插值结果。
4.根据权利要求3所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S3中似然概率的公式如下：
其中，U指每种荧光分子有U个NCI分布，ru为第u个颜色通道的NCI，t为t种荧光信号，u∈[1,4]。
5.根据权利要求4所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S4采用霍夫圆变换对原始图像进行图像分割；所述位置信息包括圆心及半径信息。
6.根据权利要求5所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S6中的始拷贝浓度的计算公式如下：
式中，N为液滴总数、M为稀释倍数、F为阳性液滴数目；
所述泊松分布公式为：式中，λ为每个液滴中所含目标DNA的平均拷贝数，x为拷贝数。
7.根据权利要求6所述的基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S6采用大津阈值法进行阈值判断。
8.基于色度sCMOS的多色荧光数字PCR定量检测装置，其特征在于，包括：
图像插值模块，用于对白色通道和颜色通道进行内插，得到插值结果；
NCI估算模块，用于根据插值后获得的像素处各个颜色通道强度值进行NCI估算，获得NCI分布；
光谱分解模块，用于进行颜色解析及液滴处最大化概率颜色判断，得到像素的颜色分类图像；
图像分割模块，用于对样品的原始图像进行图像分割，获得每个液滴的位置信息；
液滴颜色分类模块，用于根据原始图像中每个液滴的位置信息获取光谱分解后颜色分类图像的同样位置，比较获取位置处的颜色像素比例后得到液滴的颜色信息，提取每个液滴位置在原始图像中像素信息于对应颜色重建图中，得到最终液滴颜色分类重建图像；
定量分析模块，用于对液滴总数及各目的基因阳性液滴计数，再通过泊松分布得到样品中DNA模板分子的起始拷贝浓度，最终获取的各颜色通道定量分析结果。
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