CN117224501A - 一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物及其制备方法 - Google Patents
一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物及其制备方法，本发明涉及纳米药物制备技术领域。该方法包括以下步骤：将小分子药物溶于有机溶剂中，滴加于模拟体液中，进行磷酸钙生物矿化，透析，制得CaP@iBEFT；将乳铁蛋白溶解于4‑吗啉乙磺酸水溶液中，然后加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，再加入聚乙二醇的4‑吗啉乙磺酸溶液，制得LP，将LP和CaP@iBEFT溶于水中，透析，制得LP‑CaP@iBEFT。本发明制得的产物为核壳结构，具有水溶性好、生物利用度高和安全性好的特点。本发明解决了现有技术中铁死亡药物水溶性差和生物利用度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物制备技术领域，具体涉及一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物及其制备方法。
背景技术
近年来，乳腺癌已经成为威胁人类生命的主要因素之一。目前，对于乳腺癌的治疗方法主要是传统的化学治疗，但仍然存在不足之处，如生物利用度低、药物毒副作用大、对免疫系统有一定的破坏。因此，发展高效、低副作用的肿瘤治疗新药物刻不容缓，研究人员致力于研发多功能纳米药物载体，研究如何提高化疗药物的靶向性和控制释放效率，以保证化疗药物准确有效地输送到肿瘤组织。
铁死亡诱导剂是一种新型有望用于乳腺癌治疗的化学小分子，可通过铁积累诱发肿瘤细胞内过表达活性氧，从而破环肿瘤细胞的氧化还原平衡，诱导细胞死亡。但是铁死亡诱导剂产生的活性氧浓度往往不足以导致肿瘤细胞死亡，并且从分子性能上来讲不具有生物相容性，在体内无法发挥其良好的抗肿瘤效果。因此，可采用多种铁死亡诱导剂协同以提高其在体内的抗肿瘤效应，但是如何将多种铁死亡诱导剂组合以提高抗肿瘤效果是目前急需解决的难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物及其制备方法，以解决现有技术中铁死亡药物水溶性差和生物利用度低的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将小分子药物溶于有机溶剂中，搅拌均匀，得到反应液一，将反应液一滴加于模拟体液中，进行生物矿化，然后透析，制得CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的无载体纳米药物；
(2)将乳铁蛋白溶解于4-吗啉乙磺酸水溶液中，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1-3h，再加入聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液，继续搅拌反应12-24h，然后透析，制得LP，即聚乙二醇化的乳铁蛋白；
(3)将步骤(1)制得的磷酸钙沉积的无载体纳米药物和步骤(2)制得的聚乙二醇化的乳铁蛋白溶于水中，搅拌反应12-24h，然后透析，制得LP-CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
本发明的有益效果为：无载体药物能通过自组装和生物矿化等手段，通过利用小分子药物的理化性质或者在其表面覆盖上亲水性物质，而使之聚合成稳定性高、生物相容性好以及肿瘤微环境响应的纳米药物。磷酸钙(CaP)作为一个良好生物矿化剂，能够形成稳定的纳米制剂，同时，CaP能在酸性环境下释放，具有pH响应性。肿瘤微环境(TME)呈微酸性，无载体纳米药物进入肿瘤环境中能够释放药物，发挥抗肿瘤疗效。此外，该纳米制剂表面的乳铁蛋白能主动识别肿瘤细胞膜过表达的乳铁蛋白受体，从而增加肿瘤细胞对无载体纳米药物的摄取能力，增强了其肿瘤治疗效果。
本发明将小分子药物经模拟体液“生物矿化”，制得CaP@iBEFT，然后将聚乙二醇修饰的乳铁蛋白包裹在CaP@iBEFT表面，制得核壳结构的LP-CaP@iBEFT，该磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物具有水容性好、生物利用度高和安全性好的特点，可用于三阴性乳腺癌的靶向治疗。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤(1)中，小分子药物为铁死亡抑制蛋白1抑制剂、布喹那、阿拉斯汀、铁离子和单宁酸。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：这5种小分子药物中，抑制蛋白1抑制剂(iFSP1)是FSP1通路抑制剂，布喹那(Brequinar)是DHODH通路的抑制剂，阿拉斯汀(erastin)是GPX4通路的抑制剂，以上3个抑制剂能抑制负调控铁死亡的通路，从而间接促进铁死亡，铁离子和单宁酸能促进芬顿反应，直接诱导铁死亡发生。
进一步，步骤(1)中，有机溶剂中为二甲基亚砜。
进一步，铁死亡抑制蛋白1抑制剂、布喹那、阿拉斯汀、铁离子、单宁酸和有机溶剂的质量体积比为0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：200μL。
进一步，步骤(1)中，有机溶剂和模拟体液的体积比为1：15-20。
进一步，铁离子为三氯化铁。
进一步，步骤(2)中，乳铁蛋白、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总量、4-吗啉乙磺酸水溶液的质量体积比为4-6mg：10-11mg：1-2mL。
进一步，步骤(2)中，4-吗啉乙磺酸水溶液的浓度为45-55mmol/L。
进一步，步骤(2)中，乳铁蛋白和聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液的质量体积比为4-6mg：1-2mL。
进一步，步骤(2)中，聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液通过以下方法制得：将10mg聚乙二醇溶于1-2mL的4-吗啉乙磺酸中，制得聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液。
进一步，步骤(2)中，聚乙二醇为NH2-PEG2000-NH2。
进一步，步骤(3)中，磷酸钙沉积的无载体纳米药物、聚乙二醇化的乳铁蛋白和水的质量体积比为1mg：1-5mg：4-6mL。
本发明还提供上述方法制得的无载体纳米药物。
进一步，磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物中，铁死亡抑制蛋白1抑制剂负载量为5-10wt％，布喹那负载量为5-10wt％，阿拉斯汀负载量为5-10wt％，铁离子负载量为7-15wt％，乳铁蛋白负载量为25-35wt％。
进一步，磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物为核壳结构，磷酸钙沉积的无载体纳米药物为内核，聚乙二醇化乳铁蛋白为外壳。
进一步，磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的粒径为100-110nm，外壳厚度为30-35nm。
进一步，磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的粒径为106nm，外壳厚度为33nm。
本发明还提供上述磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物在制备靶向肿瘤药物方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明制得的LP-CaP@iBEFT中，纳米药物以铁死亡抑制蛋白1抑制剂(iFSP1)、布喹那(Brequinar)、阿拉斯汀(Erastin)、铁离子(Fe3+)和还原剂单宁酸(TA)共组装；聚乙二醇化乳铁蛋白(LP)能识别肿瘤细胞膜上的乳铁蛋白受体而发挥主动靶向作用；CaP对酸性环境响应后，释放小分子铁死亡药物Eratin，Brequinar，iFSP1，Fe3+和TA，从而导致铁相关活性氧增多及过氧化脂类的累积，引发铁死亡的发生，从而诱导细胞死亡，具有抗乳腺癌的效果。
2、本发明制得的无载体纳米药物中，CaP具有生物相容性良好、无毒害作用和具有pH响应等优点。
3、本发明制得的无载体纳米药物中，乳铁蛋白(Lf)的主动靶向和CaP的被动靶向肿瘤细胞，增大了药物在肿瘤组织的积累量，提高药物吸收及药效。与其它靶向途径(如单克隆抗体靶向治疗)相比，Lf靶向途径具有成本低、免疫原性低和性质稳定的肿瘤渗入性等优点。
4、本发明通过磷酸钙沉积法提供了一个结构稳定和粒径可控的纳米药物的制备方法。新制备的纳米药物改善小分子铁死亡药物水溶性差的缺点，提高其生物利用度，避免高量低效。
附图说明
图1为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的TEM图；
图2为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT和标准乳铁蛋白的银染图；
图3为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的XRD图；
图4为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT中CaP@iBEFT的红外光谱图；
图5为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT中药物的HPLC图；
图6为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT中iFSP1释放率；
图7为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT中Brequinar释放率；
图8为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT中Erastin释放率；
图9为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的粒径；
图10为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的在不同溶液中水合粒径图；
图11为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的生物安全性效果图；
图12为实施例1制得的LP-CaP@iBEFT的体外抗肿瘤效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
iFSP1(铁死亡抑制蛋白1抑制剂)、Brequinar(布喹那)、Erastin(阿拉斯汀)、FeCl3(铁离子)、TA(单宁酸)
模拟体液生产厂家为索莱宝。
实施例1：
一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将小分子药物iFSP1、Brequinar、Erastin、FeCl3、TA各0.5mg溶于200μL有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，超声搅拌均匀，得到反应液一，将反应液一滴加于4mL模拟体液(SBF)中，进行生物矿化，然后1000kDa透析，制得CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的无载体纳米药物；
(2)取烧杯，将5mg乳铁蛋白(Lf)溶解于1.5mL的4-吗啉乙磺酸(MES)水溶液(浓度为50mmol/L，pH为9)中，然后加入总量为10.75mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温磁力搅拌反应2h，将10mg聚乙二醇(PEG)溶于1.5mL的4-吗啉乙磺酸(MES)中，制得聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液，将其加入烧杯中，继续磁力搅拌反应24h，然后1000kDa透析，制得LP，即聚乙二醇化的乳铁蛋白；
(3)将步骤(1)制得的磷酸钙沉积的无载体纳米药物(CaP@iBEFT)1mg和步骤(2)制得的聚乙二醇化的乳铁蛋白(LP)2.5mg溶于5mL水中，磁力搅拌反应24h，然后1000kDa透析，制得LP-CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
实施例2：
一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将小分子药物iFSP1、Brequinar、Erastin、FeCl3、TA各2mg溶于200μL有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，超声搅拌均匀，得到反应液一，将反应液一滴加于4mL模拟体液(SBF)中，进行生物矿化，然后1000kDa透析，制得CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的无载体纳米药物；
(2)取烧杯，将4mg乳铁蛋白(Lf)溶解于1mL的4-吗啉乙磺酸(MES)水溶液(浓度为45mmol/L，pH为9)中，然后加入总量为10mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温磁力搅拌反应1h，将10mg聚乙二醇(PEG)溶于1mL的4-吗啉乙磺酸(MES)中，制得聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液，将其加入烧杯中，继续磁力搅拌反应12h，然后1000kDa透析，制得LP，即聚乙二醇化的乳铁蛋白；
(3)将步骤(1)制得的磷酸钙沉积的无载体纳米药物(CaP@iBEFT)1mg和步骤(2)制得的聚乙二醇化的乳铁蛋白(LP)1mg溶于4mL水中，磁力搅拌反应12h，然后1000kDa透析，制得LP-CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
实施例3：
一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将小分子药物iFSP1、Brequinar、Erastin、FeCl3、TA各1mg溶于200μL有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，超声搅拌均匀，得到反应液一，将反应液一滴加于3mL模拟体液(SBF)中，进行生物矿化，然后1000kDa透析，制得CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的无载体纳米药物；
(2)取烧杯，将6mg乳铁蛋白(Lf)溶解于2mL的4-吗啉乙磺酸(MES)水溶液(浓度为55mmol/L，pH为9)中，然后加入总量为11mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温磁力搅拌反应3h，将10mg聚乙二醇(PEG)溶于2mL的4-吗啉乙磺酸(MES)中，制得聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液，将其加入烧杯中，继续磁力搅拌反应20h，然后1000kDa透析，制得LP，即聚乙二醇化的乳铁蛋白；
(3)将步骤(1)制得的磷酸钙沉积的无载体纳米药物(CaP@iBEFT)1mg和步骤(2)制得的聚乙二醇化的乳铁蛋白(LP)5mg溶于6mL水中，磁力搅拌反应20h，然后1000kDa透析，制得LP-CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
对比例1：
一种米药物，其制备方法包括以下步骤：小分子药物不含TA，其余同实施例1。
最终不能制得磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
试验例
下面以实施例1制得的LP-CaP@iBEFT进行如下检测。
一、将实施例1制得的LP-CaP@iBEFT进行TEM、银染和X射线衍射检测，结果见图1-3。
由图1可知，本发明制得的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物具有明显的核壳结构，酸钙沉积的无载体纳米药物(CaP@iBEFT)为内核，PEG修饰的乳铁蛋白(LP)为外壳，纳米药物粒径为106nm左右，其中蛋白层厚度为33nm左右；
由图2可知(1为Lf，2为LP-CaP@iBEFT)，LP-CaP@iBEFT与标准Lf出现同样位置的蛋白条带，说明LP的成功负载；
由图3可知，LP-CaP@iBEFT具有CaP的的晶型角度，说明CaP的成功矿化。
二、将实施例1制得的LP-CaP@iBEFT进行红外光谱检测，结果见图4。由图4可知，本发明制得的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物(LP-CaP@iBEFT)具有iFSP1、Brequinar、Erastin、FeCl3和TA的特征官能团的吸收峰，表明上述各药物的成功负载。同时，通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定铁的含量，可以证明铁元素的存在，进一步表明FeCl3的成功加载。
三、取实施例1制得的LP-CaP@iBEFT冻干成粉末，甲醇复溶，在同一色谱分析条件下(见表1)对无载体纳米药物中iFSP1、Brequinar和Erastin的含量进行测定，结果见图5。由图5可知，iFSP1、Brequinar和Erastin的成功加载；
表1HPLC条件
另取实施例1制得的LP-CaP@iBEFT于70℃消解过夜后，用一级水稀释，ICP-OES测定无载体纳米药物中铁的含量，证明了FeCl3的成功加载。无载体纳米药物中iFSP1、Brequinar、Erastin和FeCl3的包封率和载药量见表2。
表2包封率和载药量
四、CaP的pH响应的释放特性
将实施例1制得的LP-CaP@iBEFT配制成水溶液，分别将1mL样品装于3500Mw的透析袋中，然后，将透析袋浸入不同pH环境中(pH＝7.4，模拟正常生理环境；pH＝6.5，模拟肿瘤微环境；pH＝5.0，模拟溶酶体环境)，并在37℃下摇动。用HPLC测量不同时间间隔内透析袋外1mL缓冲液中iFSP1、Brequinar和Erastin的含量，结果见图6-8。
由图6-8可知，在同一时间间隔内，随着pH值减小，iFSP1、Brequinar和Erastin的释放量增加。
同时使用马尔文激光粒度仪测定在不同pH条件下的无载体纳米药物的粒径变化，结果见图9。
由图9可知，随着pH的减小，CaP的矿化骨架逐渐崩解，水和粒径减小，材料逐渐不均一。
五、无载体纳米药物的稳定性
将实施例1制得的LP-CaP@iBEFT分别用一级水溶液、PBS溶液和DMEM溶液配置成无载体纳米药物溶液，分别于1、3、5、7、9、11、13和15天连续测定水和粒径，结果见图10。
由图10可知，本发明制得的无载体纳米药物在不同缓冲液中的水和粒径在15天内没有显著变化，说明本发明制得的无载体纳米药物的稳定性较好。
六、无载体纳米药物的生物安全性
将HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)接于96孔板，使每孔约含4×103个细胞，培养24h，按0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL浓度给药LP-CaP@iBEFT，培养24h，用PBS洗涤，加入不含胎牛血清(FBS)的CCK-8检测液(v/v：10％)，在37℃下再培养2.5h后检测，用酶标分析仪于450nm处测定细胞活力，结果见图11。
由图11可知，LP-CaP@iBEFT对HUVEC细胞没有明显的杀伤作用，说明本发明制得的无载体纳米药物对正常细胞没有毒性，具有生物安全性。
七、无载体纳米药物的抗肿瘤效应
将4T1细胞(鼠乳腺癌细胞)接板于96孔板，使每孔约含4×103个细胞，培养24h，按0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL浓度给药LP-CaP@iBEFT，培养24h，用PBS洗涤，加入不含胎牛血清(FBS)的CCK-8检测液(v/v：10％)，在37℃下再培养2.5h后检测，用酶标分析仪于450nm处测定细胞活力，结果见图12。
由图12可知，LP-CaP@iBEFT对4T1细胞有明显的杀伤作用，说明本发明制得的无载体纳米药物对肿瘤细胞有毒性，具有抗肿瘤效应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将小分子药物溶于有机溶剂中，搅拌均匀，得到反应液一，将反应液一滴加于模拟体液中，进行生物矿化，然后透析，制得CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的无载体纳米药物；
(2)将乳铁蛋白溶解于4-吗啉乙磺酸水溶液中，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1-3h，再加入聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液，继续搅拌反应12-24h，然后透析，制得LP，即聚乙二醇化的乳铁蛋白；
(3)将步骤(1)制得的磷酸钙沉积的无载体纳米药物和步骤(2)制得的聚乙二醇化的乳铁蛋白溶于水中，搅拌反应12-24h，然后透析，制得LP-CaP@iBEFT，即磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
2.根据权利要求1所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，小分子药物为铁死亡抑制蛋白1抑制剂、布喹那、阿拉斯汀、铁离子和单宁酸。
3.根据权利要求2所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，铁死亡抑制蛋白1抑制剂、布喹那、阿拉斯汀、铁离子、单宁酸和有机溶剂的质量体积比为0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：0.5-2mg：200μL。
4.根据权利要求1所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，有机溶剂和模拟体液的体积比为1：15-20。
5.根据权利要求1所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乳铁蛋白、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总量、4-吗啉乙磺酸水溶液的质量体积比为4-6mg：10-11mg：1-2mL。
6.根据权利要求1所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乳铁蛋白和聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液的质量体积比为4-6mg：1-2mL。
7.根据权利要求1或6所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液通过以下方法制得：将10mg聚乙二醇溶于1-2mL的4-吗啉乙磺酸中，制得聚乙二醇的4-吗啉乙磺酸溶液。
8.根据权利要求1所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，磷酸钙沉积的无载体纳米药物、聚乙二醇化的乳铁蛋白和水的质量体积比为1mg：1-5mg：4-6mL。
9.根据权利要求1-8任一项所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物的制备方法制得的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物。
10.权利要求9所述的磷酸钙沉积的靶向肿瘤无载体纳米药物在制备靶向肿瘤药物方面的应用。
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