CN117222659A - 修饰的梭菌神经毒素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的修饰梭菌神经毒素，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，和其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，修饰提高了修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性。还提供了(特别是)相应的用于生产所述梭菌神经毒素的方法，用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法、编码所述梭菌神经毒素的核酸和所述修饰的梭菌神经毒素的治疗用途。
Description
发明领域
本发明涉及修饰的梭菌神经毒素，特别是抗氧化性增加的修饰梭菌神经毒素。
背景技术
梭菌属(genus Clostridia)中的细菌产生高毒力和特定的蛋白质毒素，这种毒素毒害其被运送到的神经元和其他细胞。此类梭菌神经毒素的实例包括破伤风梭菌(C.Tetani，TeNT)和肉毒杆菌(C.botulinum，BoNT)血清型A-G和X产生的神经毒素(参见WO2018/009903 A2)，以及巴拉特梭菌(C.Baratii)和丁酸梭菌(C.Butyricum)产生的神经毒素。
在梭菌神经毒素当中有一些已知最强效的毒素。例如，取决于血清型，肉毒神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的中位致死剂量(LD50)值。破伤风和肉毒神经毒素均通过抑制受影响的神经元的功能，尤其抑制神经递质的释放来发挥作用。肉毒毒素在神经肌肉接头处发挥作用并且抑制外周神经系统中的胆碱能传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。
本质上，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，其被翻译后修饰，通过蛋白酶切割事件以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。切割过程发生在特定切割位点(常常称作活化位点)，位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。将两条链称作具有大约100kDa的分子量的重链(H-链)和具有大约50kDa的分子的轻链(L-链)。H-链包含N-末端易位(translocation)组分(HN结构域)和C-末端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合和结合的毒素借助内体内化入细胞后，HN结构域将L-链易位跨过内体膜并进入胞液中，并且L-链提供蛋白酶功能(也称作非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割被称为SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白而起作用，参见Gerald K(2002)“Cell and molecularbiology(第4版)John Wiley&Sons,Inc。首字母缩写SNARE源自术语可溶性NSF连接受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive-Factor)。SNARE蛋白对于胞内囊泡融合至关重要，且从而对于分子经由囊泡转运而从细胞分泌而言至关重要。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并且对于SNARE蛋白表现出高的底物特异性。因此，一旦被递送到期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白的普遍存在性，梭菌神经毒素(诸如肉毒神经毒素)已成功地用于各种疗法中。
例如，William J.Lipham，Cosmetic and Clinical Applications of BotulinumToxin(Slack,Inc.，2004)描述了梭菌神经毒素的用途，例如肉毒神经毒素(BoNT)，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G和破伤风神经毒素(TeNT)，用于在多种治疗和美容应用中抑制神经元传输——作为一个实例，BOTOXTM目前被批准作为以下适应症的治疗：贲门失弛缓症、成人痉挛、肛裂、背痛、眼睑痉挛、磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间纹或面部动力性皱纹(hyperkinetic facial line)、头痛、面肌痉挛、膀胱功能亢进、多汗症、青少年脑瘫、多发性硬化、肌阵挛障碍、鼻唇纹、痉挛性发音困难、斜视和第七对神经障碍。此外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉障碍(参见US 6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见US2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流疾病(参见US2004/0086531)；用于治疗肌张力障碍(参见US 6,319,505)；用于治疗眼症(参见US2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986和US 6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US 6,623,742、US 2004/0062776)；用于治疗下背部疼痛(参见US2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US 6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见US6,838,434)；用于治疗张力头痛(参见US 6,776,992)；用于治疗头痛(参见US 6,458,365)；用于减少偏头痛疼痛(参见US 5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US 6,767,544)；用于治疗神经障碍，如帕金森病(参见US 6,620,415、US 6,306,403)；用于治疗神经精神病症(参见US2004/0180061，US2003/0211121)；用于治疗内分泌失调(参见US 6,827,931)；用于治疗甲状腺病症(参见US 6,740,321)；用于治疗胆碱能影响的汗腺病症(参见US 6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US 6,337,075、US 6,416,765)；用于治疗胰腺病症(参见US 6,261,572、US6,143,306)；用于治疗癌症，如骨肿瘤(参见US 6,565,870、US 6,368,605、US6,139,845、US2005/0031648)；用于治疗耳部病症(参见US 6,358,926、US6,265,379)；用于治疗自主神经障碍，如胃肠肌肉障碍和其它平滑肌功能障碍(参见US 5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性病症相关的皮肤损伤(参见US 5,670,484)；用于控制神经性炎性病症(参见US 6,063,768)；用于减少脱发并刺激毛发生长(参见US 6,299,893)；用于治疗嘴角下垂(参见US 6,358,917)；用于减少食欲(参见US2004/40253274)；对于牙科治疗和手术(参见US2004/01135139)；用于治疗神经肌肉障碍和病症(参见US2002/0010138)；用于治疗各种障碍和病症和相关疼痛(参见US2004/0013692)；用于治疗由粘液高分泌引起的病症，如哮喘和COPD(参见WO 00/10598)；以及用于治疗非神经元病症，如炎症、内分泌病症、外分泌病症、免疫病症、心血管病症、骨病症(参见WO 01/21213)。所有上述出版物以其整体引入本文作为参考。
预期了在人和其它哺乳动物的治疗和美容治疗中使用非细胞毒性蛋白酶(如梭菌神经毒素(例如，BoNT和TeNT))，以扩展不断拓宽的可以得益于这些毒素的性质的疾病和小恙的范围。鉴于此，对大规模制造梭菌神经毒素有着日益增长的需求。
生物治疗剂以及尤其是梭菌神经毒素的大规模制造是具有挑战性的，在该方法的多个阶段具有不想要的多肽修饰和/或降解的可能性。一种此类不想要的修饰是氧化，其可以在细胞表达梭菌神经毒素、纯化、生物处理、配制和/或储存期间发生。实际上，氧化是生物治疗剂的主要降解途径之一。氧化剂(如过氧化物，溶解氧，金属离子，光和自由基)可以催化氨基酸(如甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的氧化(Torosantucci等(2014)，Pharm Res，31，541-553)。在生物处理和配制中，金属催化剂可以来自金属污染的缓冲剂和/或金属接触表面，已经证明了金属催化的组氨酸和甲硫氨酸残基的氧化导致活性丧失，例如由于氧化多肽的聚集和/或沉淀引起的。此外，氧化剂通常用于大规模制造中的去污。梭菌神经毒素是大的多肽，具有许多表面暴露的氨基酸残基，而后者是氧化的候选物。
由于至少以上提供的原因，需要对氧化有抗性的稳健的梭菌神经毒素，由此将大规模制造和/或储存期间不想要的氧化和/或降解最小化。此外，这样的梭菌神经毒素可以在室温下呈现改进的稳定性，例如，作为液体或冻干制剂的一部分。有利地，这将消除制造期间维持低温的需求。
本发明克服了一个或多个上述的问题和/或提供了一个或多个以上详述的优势。
发明概述
本发明的发明人已经发现了肉毒神经毒素A(BoNT/A)的甲硫氨酸1144(M1144)处的氧化是氧化依赖性活性丧失的主要原因。有利地，通过修饰M1144以防止其氧化(例如，经由用抗氧化氨基酸残基取代M1144和/或使其缺失)，发明人已经发现了氧化依赖性活性丧失可以被最小化/避免。令人惊讶地，M1144的修饰不仅最小化/避免了氧化依赖性活性丧失，而且可能还实际上增加了所得到的经修饰的神经毒素的活性。
M1144是存在于BoNT/A的Hc结构域的C-末端部分(HCC结构域)的氨基酸，并参与BoNT/A与靶神经元细胞上的突触囊泡糖蛋白(SV2)的结合。鉴于该残基参与SV2结合，相信包含在M1144处经合适地修饰的BoNT/A HCC结构域的任何梭菌神经毒素将呈现本文所述的改进的性质。
发明详述
在一个方面中，本发明提供了包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的修饰梭菌神经毒素，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，该修饰提高了修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性。
如本文使用的术语“修饰的梭菌神经毒素”是指自然界不存在的并且包含甲硫氨酸1144(M1144)修饰的梭菌神经毒素，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性。因此，术语“修饰的梭菌神经毒素”排除了包含肉毒神经毒素A(BoNTA)HCC结构域的天然变体梭菌神经毒素，其中HCC结构域包含在氨基酸1144处的抗氧化的氨基酸。
修饰的梭菌神经毒素可以是单链修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌毒素。优选地，修饰的梭菌神经毒素是双链修饰的梭菌毒素，包含由二硫键连接在一起的轻链和重链。
本发明的修饰的梭菌神经毒素结合梭菌神经毒素靶细胞，尤其是至少BoNT/A靶细胞。所述修饰的梭菌神经毒素结合SV2(例如，SV2c)。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素以高于缺乏所述修饰的其他相同的梭菌神经毒素的亲和力结合SV2。特别地，如本文所示的，包含M1144V或M1144L取代的修饰梭菌神经毒素以高于缺乏所述修饰的其他相同的梭菌神经毒素的亲和力结合SV2。更高的亲和力可以表述为与缺乏所述修饰的其他相同的梭菌神经毒素的相比时更低的KD值(优选统计上显著更低的值)。KD值优选使用本文的实施例6中所述的测定法来测定。
与缺乏所述修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，本发明的修饰梭菌神经毒素优选呈现出提高的活性(优选统计上显著提高的活性)。
本文提及的氨基酸位置编号由与SEQ ID NO:2的比对来限定。例如，作为1144呈现的位置可以不是给定多肽的氨基酸编号1144，而是所述多肽与SEQ ID NO:2比对时对应于SEQ ID NO:2的M1144的甲硫氨酸残基。SEQ ID NO:2是自然界存在的未修饰的BoNT/A1多肽序列。作为一个示例，BoNT/A3的M1140对应于BoNT/A1的M1144。因此，关于BoNT/A3的如本文使用的M1144的修饰表示与SEQ ID NO:2比对时位置M1144的修饰(即，BoNT/A3残基M1140的修饰)。比对可以使用本文所述的用于确定序列同源性和/或％序列同一性的任一种方法来进行。
缺乏本发明修饰的“其他相同的梭菌神经毒素”可以是本文所述的未修饰的梭菌神经毒素和/或包含本文所述的未修饰的BoNT/A HCC结构域的梭菌神经毒素。所述“其他相同的梭菌神经毒素”可以是自然界存在的毒素。
提高修饰的梭菌神经毒素对氧化抗性的任何修饰可以用于本发明中。修饰可以是M1144的取代、M1144的缺失或包含M1144位点(优选由M1144组成)处的插入缺失(indel)。优选地，修饰是用抗氧化(resistant to oxidation)的氨基酸取代M1144。
如本文使用的术语“缺失”是指除去多肽的一个或多个氨基酸残基，而没有在缺失位点替代一个或多个氨基酸残基。因此，(例如)在从具有x个数量的氨基酸残基的多肽序列缺失一个氨基酸残基的情况中，所得到的多肽具有x-1个氨基酸残基。
如本文使用的术语“插入缺失”是指缺失多肽的一个或多个氨基酸残基并在缺失位点插入与缺失的氨基酸残基数量相比不同数量的氨基酸残基(更多或更少的氨基酸残基)。因此，(例如)对于其中从具有x数量的氨基酸残基的多肽序列缺失两个氨基酸残基的插入缺失，所得到的的多肽具有x-1个氨基酸残基或x+≥1个氨基酸残基。插入和缺失可以以任何顺序进行，按序或同时进行。
如本文使用的术语“取代”是指在相同位点用相同数量的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基。因此，(例如)对于具有x数量的氨基酸残基的多肽序列的取代，所得到的多肽也具有x个氨基酸残基。优选地，取代是在单个氨基酸位置的取代。
如本文使用的术语“插入”是指添加多肽的一个或多个氨基酸残基，而在插入位点没有缺失多肽的一个或多个氨基酸残基。因此，(例如)在一个氨基酸残基已经插入具有x数量的氨基酸残基的多肽序列中的情况下，所得到的多肽具有x+1个氨基酸残基。
如之后更详细讨论的，通常通过修饰编码天然梭菌神经毒素的核酸来进行修饰，使得修饰的梭菌神经毒素由包含修饰的核酸来编码。或者，可以合成包含修饰的编码修饰梭菌神经毒素的核酸。
如本文使用的“抗氧化的氨基酸”优选表示比甲硫氨酸对氧化更有抗性的任何氨基酸。抗氧化的氨基酸可以选自：缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和脯氨酸。在一个实施方案中，抗氧化的氨基酸可以选自：缬氨酸、亮氨酸和甘氨酸。优选地，抗氧化的氨基酸选自缬氨酸和亮氨酸。在一个实施方案中，抗氧化的氨基酸不是甘氨酸。
或者，抗氧化的氨基酸可以是非天然或非标准氨基酸，如正亮氨酸、异缬氨酸、α-甲基缬氨酸、环亮氨酸或别-苏氨酸。
本发明的修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性可以比缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素高至少1％、5％、10％、20％、50％、75％、90％或100％。
可以使用强制氧化测定评估梭菌神经毒素的氧化(包括抗氧化)。优选地，使用本发明实施例中所述的强制氧化测定来评估梭菌神经毒素的氧化(例如，抗氧化)(参见“强制氧化研究”)。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素暴露于强制氧化条件时可以在对应于SEQ ID NO:2的M1144位置处实质性地抗氧化。如这个内容中使用的术语“实质性地抗氧化”可以表示在强制氧化条件下组合物中少于10％、5％或1％(优选少于0.1％)的修饰梭菌神经毒素在对应于SEQ ID NO:2的M1144的位置处被氧化。换句话说，优选地，本发明的修饰的梭菌神经毒素在强制氧化条件下在对应于SEQ ID NO:2的M1144的位置处不能被氧化。在这种情况下，对应于M1144的位置是修饰的位置。
修饰的梭菌神经毒素可以包含一个或多个表面暴露的氨基酸残基(例如，易氧化的一个或多个表面暴露的氨基酸残基)的一个或多个进一步的修饰。因此，修饰的梭菌神经毒素可以包含以下氨基酸的一个或多个进一步的修饰，所述氨基酸是易氧化的：甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸(优选甲硫氨酸)。例如，修饰的梭菌神经毒素可以包含一个或多个在HCC结构域中(优选在SV2结合结构域中)存在的氨基酸处的进一步修饰，例如，与未修饰的HCC结构域(优选未修饰的SV2结合结构域)相比时。优选地，然而，修饰的梭菌神经毒素不在HCC结构域中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的HCC结构域相比时，更优选不在SV2结合结构域中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的SV2结合结构域相比时。在一些实施方案中，修饰的梭菌神经毒素不在HC结构域中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的HC结构域相比时。在一个实施方案中，修饰的梭菌神经毒素不在重链中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的重链相比时。在一个实施方案中，修饰的梭菌神经毒素不在轻链中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的轻链相比时。在另一个实施方案中，修饰的梭菌神经毒素不在轻链中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的轻链相比时，并且不在重链中包含一个或多个进一步的修饰，例如，与未修饰的重链相比时。
在一个方面中，本发明提供了包含修饰的BoNT/A1 HCC结构域、修饰的BoNT/A3 HCC结构域或修饰的BoNT/A4 HCC结构域的修饰梭菌神经毒素，所述结构域包含RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(SEQ ID NO:102)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R。优选地，X4是S。在所示修饰的梭菌神经毒素中，M1144已经被抗氧化的氨基酸取代。
SEQ ID NO:102是包含在HCC结构域的BoNT/A1、BoNT/A3和BoNT/A4 SV2c结合结构域中的共有序列，但其中X3是抗氧化的氨基酸。在天然序列中，X3是如下表中所示的甲硫氨酸：
本文所述的任何修饰的梭菌神经毒素可以包含含有RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(SEQ ID NO:102)(优选由其组成)的修饰HCC结构域，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R。优选地，X4是S。
本文所述的修饰的梭菌神经毒素可以包含含有RGSVXTTNIYLNSSLYRGT(SEQ IDNO:107)、RGNVXTTNIYLNSSLYMGT(SEQ ID NO:108)、RGSVXTTNIYLNSTLYMGT(SEQ ID NO:109)或RDNVXTTNIYLNSSLYMGT(SEQ ID NO:110)(优选由其组成)的经修饰的HCC结构域，其中X是抗氧化的氨基酸。
在一个方面中，本发明提供了包含修饰的BoNT/A1 HCC结构域、修饰的BoNT/A3 HCC结构域或修饰的BoNT/A4 HCC结构域的修饰梭菌神经毒素，所述结构域包含RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(SEQ ID NO:111)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R。优选地，X3是S。在所述修饰的梭菌神经毒素中，M1144已缺失。
本文所述的任何修饰的梭菌神经毒素可以包含含有RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(SEQID NO:111)(优选由其组成)的修饰HCC结构域，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R。优选地，X3是S。
本文所述的修饰的梭菌神经毒素可以包含含有RGSVTTNIYLNSSLYRGT(SEQ ID NO:112)、RGNVTTNIYLNSSLYMGT(SEQ ID NO:113)、RGSVTTNIYLNSTLYMGT(SEQ ID NO:114)或RDNVTTNIYLNSSLYMGT(SEQ ID NO:115)(优选由其组成)的修饰HCC结构域。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A2 HCC结构域。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A5 HCC结构域。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A6 HCC结构域。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A7 HCC结构域。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A8 HCC结构域。在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含BoNT/A2 HCC结构域、BoNT/A5 HCC结构域、BoNT/A6 HCC结构域、BoNT/A7 HCC结构域或BoNT/A8 HCC结构域。
优选地，本发明的修饰的梭菌神经毒素不是BoNT/A2、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7或BoNT/A8。BoNT/A2可以包含与SEQ ID NO:139具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/A2可以包含与SEQ ID NO:139具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/A2包含SEQ ID NO:139(或由其组成)。BoNT/A5可以包含与SEQ ID NO:140或141具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/A5可以包含与SEQ ID NO:140或141具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/A5包含SEQID NO:140或141(或由其组成)。BoNT/A6可以包含与SEQ ID NO:142具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/A6可以包含与SEQ ID NO:142具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/A6包含SEQ ID NO:142(或由其组成)。BoNT/A7可以包含与SEQ ID NO:143具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/A7可以包含与SEQID NO:143具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/A7包含SEQ ID NO:143(或由其组成)。BoNT/A8可以包含与SEQ ID NO:144具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/A8可以包含与SEQ ID NO:144具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/A8包含SEQ ID NO:144(或由其组成)。
优选地，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含对应于以下的(或以下的)HCC结构域：UniProtKB登录号No.D3IV23(序列版本1)；UniProtKB登录号No.C7BEA8(序列版本1)；或UniProtKB登录号No.C1IPK2(序列版本1)。最优选地，本发明的修饰的梭菌神经毒素不包含对应于以下的(或以下的)多肽序列：UniProtKB登录号No.D3IV23(序列版本1)；UniProtKB登录号No.C7BEA8(序列版本1)；或UniProtKB登录号No.C1IPK2(序列版本1)。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以包含修饰的BoNT/A1 HCC结构域、修饰的BoNT/A3 HCC结构域或修饰的BoNT/A4 HCC结构域，优选修饰的BoNT/A1 HCC结构域。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A1 HCC结构域的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A1 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:62、70或78的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A1 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:62、70或78的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A1 HCC结构域包含SEQ ID NO:62、70或78的任一项(更优选由其组成)。在所示的序列中，SEQ ID NO:70是最优选的。
修饰的BoNT/A1 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:63-69、71-77或79-85的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A1 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:63-69、71-77或79-85的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A1 HCC结构域包含SEQ ID NO:63-69、71-77或79-85的任一项(更优选由其组成)。在所示的序列中，SEQ ID NO:71-77是最优选的。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A3 HCC结构域的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A3 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:86具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A3 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:86具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A3HCC结构域包含SEQ ID NO:86(更优选由其组成)。
修饰的BoNT/A3 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:87-93的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A3 HCC结构域可以包含与SEQ IDNO:87-93的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A3HCC结构域包含SEQ ID NO:87-93的任一项(更优选由其组成)。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A4 HCC结构域的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A4 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:94具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A4 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:94具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A4HCC结构域包含SEQ ID NO:94(更优选由其组成)。
修饰的BoNT/A4 HCC结构域可以包含与SEQ ID NO:95-101的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A4 HCC结构域可以包含与SEQ IDNO:95-101的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A4HCC结构域包含SEQ ID NO:95-101的任一项(更优选由其组成)。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以是修饰的BoNT/A1、修饰的BoNT/A3或修饰的BoNT/A4。优选地，本发明的修饰的梭菌神经毒素是修饰的BoNT/A1。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A1的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A1可以包含与SEQ ID NO:2、11、20、29或38的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A1可以包含与SEQ IDNO:2、11、20、29或38的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A1包含SEQ ID NO:2、11、20、29或38的任一项(更优选由其组成)。在所示的序列中，SEQ ID NO:11是最优选的。
修饰的BoNT/A1可以包含与SEQ ID NO:3-9、12-18、21-27、30-36或39-45的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A1可以包含与SEQID NO:3-9、12-18、21-27、30-36或39-45的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A1包含SEQ ID NO:3-9、12-18、21-27、30-36或39-45的任一项(更优选由其组成)。在所示的序列中，SEQ ID NO:12-18是最优选的。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A3的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A3可以包含与SEQ ID NO:46具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A3可以包含与SEQ ID NO:46具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A3包含SEQ ID NO:46(更优选由其组成)。
修饰的BoNT/A3可以包含与SEQ ID NO:47-53的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A3可以包含与SEQ ID NO:47-53的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A3包含SEQ IDNO:47-53的任一项(更优选由其组成)。
在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素可以在未修饰的BoNT/A4的M1144处包含修饰。未修饰的BoNT/A4可以包含与SEQ ID NO:54具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，未修饰的BoNT/A4可以包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，未修饰的BoNT/A3包含SEQ ID NO:54(更优选由其组成)。
修饰的BoNT/A4可以包含与SEQ ID NO:55-61的任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A4可以包含与SEQ ID NO:55-61的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，修饰的BoNT/A4包含SEQ IDNO:55-61的任一项(更优选由其组成)。
具有SEQ ID NO:70和78的未修饰的BoNT/A1 HCC结构域和相应的具有SEQ ID NO:11、20、29和38的BoNT/A1多肽自身相对于SEQ ID NO:2和62(其存在于自然界中)进行修饰。所述梭菌神经毒素在WO 2015/004461 A1中有教导，将其全部通过引用并入本文中。所述梭菌神经毒素中存在的修饰提供了增加的效力和/或作用的持续时间，由此与已知的梭菌神经毒素疗法相比允许使用降低剂量的神经毒素(或增加剂量而没有任何其他不良作用)，因此提供了更多优势。实际上，所述神经毒素证明了与使用缺乏所述一个或多个氨基酸修饰的等同梭菌神经毒素相比，减少了副作用或不存在副作用。这是经由表面暴露的氨基酸残基的修饰增加了修饰的神经毒素的等电点而实现的。不希望受理论的束缚，认为由于在施用部位的修饰的梭菌神经毒素和阴离子胞外组分(如细胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之间有利的静电相互作用，所述神经毒素在施用部位显示出较长的组织停留时间。
对于本发明的目的，将SEQ ID NO:11、20、29、38、70和78归为“未修饰的”，因为它们在位置1144包含甲硫氨酸。
WO 2015/004461 A1教导了ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER1274和THR 1277中的一个或多个的合适修饰提高了修饰的梭菌神经毒素的等电点，以提供上述优势。
因此，修饰的梭菌神经毒素可以包含修饰的BoNT/A HCC结构域(优选BoNT/A1 HCC结构域)，其包含在选自：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个氨基酸残基处的进一步修饰。
因此，修饰的梭菌神经毒素(优选修饰的BoNT/A1)可以包含选自：ASN 886、ASN905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个氨基酸处的进一步的修饰。
修饰可以是与SEQ ID NO:2比较时的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ IDNO:2的比对来确定。
指示用于修饰的更多氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。
优选修饰的梭菌神经毒素在选自：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个氨基酸处包含进一步的修饰。
在特别优选的实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素仅包含M1144处的修饰和在：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个的进一步修饰。例如，在一个实施方案中，本发明的修饰的梭菌神经毒素仅包含在M1144修饰的和在：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个进一步修饰的SEQ ID NO:2。换句话说，优选地，当与SEQID NO:2比较时，所述修饰由M1144处的修饰和在：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277的一个或多个的进一步修饰组成。
除了M1144处的修饰，修饰的梭菌神经毒素可以包含至少2、3、4、5、6或7个(优选7个)在所指氨基酸残基处的进一步修饰。修饰的梭菌神经毒素可以包含1-30、3-20或5-10个进一步的氨基酸修饰(优选由其组成)。
进一步修饰可以选自：
i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
ii.用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
iv.碱性氨基酸残基的插入；和
v.酸性表面暴露的氨基酸残基的缺失。
如上所示的进一步修饰产生与相应的未修饰的梭菌神经毒素相比具有增加的正表面电荷和提高的等电点的经修饰的梭菌神经毒素。
等电点(pI)是给定蛋白质的一种特定性质。如本领域中众所周知的，蛋白质由特定的氨基酸(在蛋白质中也称为氨基酸残基)序列制成。二十种标准组的每种氨基酸都有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每个氨基酸残基都显示出不同的化学性质，如电荷和疏水性。这些特性可能受到周围化学环境的影响，如温度和pH。蛋白质的整体化学特性将取决于这些不同因素的总和。
某些氨基酸残基(以下详述)具有可电离侧链，其根据周围的pH可以呈现出电荷。这样的侧链在给定的pH下带电或不带电取决于相关可电离部分的pKa，其中pKa是来自共轭碱的特定质子的酸离解常数(Ka)的负对数。
例如，酸性残基，如天冬氨酸和谷氨酸，具有侧链羧酸基团，具有大约4.1的pKa值(精确的pKa值可能取决于可电离基团的微环境、离子强度和温度)。因此，这些侧链在7.4的pH(常常称为“生理pH”)下呈现负电荷。在低pH值下，这些侧链将变成质子化的并失去其电荷。
相反，碱性残基，如赖氨酸和精氨酸，具有含氮侧链基团，具有大约10-12的pKa值。这些侧链因此在7.4的pH下呈现正电荷。这些测量在高的pH值下将变成区质子化的并失去其电荷。
蛋白质分子的整体(净)电荷因此取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(及其表面暴露的程度)和环境pH。改变环境pH将改变蛋白质上的整体电荷。因此，对于每种蛋白质，存在给定的pH，在该pH下，正电荷和负电荷是相等的，并且蛋白质显示出没有整体净电荷。将这个点称为等电点(pI)。等电点是本领域技术人员熟知的蛋白质生物化学中的标准概念。
等电点因此定义为蛋白质呈现零的净电荷的pH值。pI的提高表示蛋白质呈现零的净电荷需要更高的pH值。因此，pI的提高表示蛋白质在给定pH下净正电荷的增加。相反，pH的降低表示蛋白质呈现零的净电荷需要更低的pH值。因此，pI的降低表示蛋白质在给定pH下净正电荷的减少。
测定蛋白质的pI的方法是本领域已知的并且是技术人员熟知的。例如，可以从蛋白质中存在的每个氨基酸的平均pKa计算蛋白质的pI(“计算的pI”)这样的计算可以使用本领域已知的计算机程序来进行，如来自ExPASy的Compute pI/MW工具(https:// web.expasy.org/compute_pi/)，其是用于计算根据本发明的pI的优选方法。不同分子间的pI的比较可以使用相同的计算技术/程序来进行。
在合适的情况下，计算的蛋白质的pI可以使用等电聚焦的技术通过实验来证实(“观察到的pI”)。这种技术使用电泳，以根据pI来分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定化的pH梯度的凝胶来进行。施加电场时，蛋白质迁移通过pH梯度，直至到达使其具有零净电荷的pH，该点是蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果通常本质上分辨率相对低，且因此本发明的发明人认为由计算的pI(如上所述)提供的结果更适于使用。
在本发明的整个说明书中，“pI”表示“计算的pI”，除非另外指出。
可以通过改变其表面上呈现的碱性和/或酸性基团的数量来提高或降低蛋白质的pI。这可以通过改变蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，pI的提高可以通过减少酸性残基的数量或通过增加碱性残基的数量来提供。
包含进一步修饰的经修饰的梭菌神经毒素可以具有比未修饰的梭菌神经毒素(例如，SEQ ID NO:2)的pI高至少0.2、0.4、0.5或1个pI单位的pI值。优选地，修饰的梭菌神经毒素可以具有至少6.6的pI，例如，至少6.8。
下表中显示20种标准氨基酸的性质：
认为以下的氨基酸是带电的氨基酸：天冬氨酸(负电荷)、谷氨酸(负电荷)、精氨酸(正电荷)和赖氨酸(正电荷)。
在7.4的pH下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的测量具有负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。将天冬氨酸和谷氨酸称为酸性氨基酸残基。将精氨酸和赖氨酸称为碱性氨基酸残基。
认为以下的氨基酸是不带电的、极性的(表示它们可以参与氢键合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
认为以下的氨基酸是不带电的、疏水的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
优选地，进一步的修饰是取代。替代氨基酸残基可以是20种标准氨基酸之一，如上所描述。或者，氨基酸取代中的替代氨基酸可以是非标准或非天然氨基酸(不属于上述标准组20的一部分的氨基酸)。例如，替代氨基酸可以是碱性非标准或非天然氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体。将非标准或非天然氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。在一个实施方案中，取代选自：用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，用不带电的氨基酸残基替代酸性氨基酸残基，和用碱性氨基酸取代不带电的氨基残基。在一个实施方案中，其中取代是用不带电的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，用其相应的不带电的酰胺氨基酸残基替代酸性氨基酸残基(即，用天冬酰胺替代天冬氨酸，以及用谷氨酰胺替代谷氨酸)。
优选地，碱性氨基酸是赖氨酸残基或精氨酸残基。换句话说，取代优选用赖氨酸或精氨酸取代。最优选地，修饰是用赖氨酸取代。
优选地，包含一个或多个进一步修饰的经修饰的梭菌神经毒素包含位于梭菌毒素HCN结构域中的4至40个氨基酸修饰。所述经修饰的梭菌神经毒素优选也具有至少6.6的pI。除了在M1144的修饰，所述修饰的梭菌神经毒素优选包含至少4个选自以下的修饰：ASN886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026和ASN 1052，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。例如，除了在M1144的修饰，所述修饰的梭菌神经毒素可以包含至少5个选自以下的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基取代氨基酸。
在进一步的修饰后，进一步修饰的梭菌神经毒素能够结合未修饰的BoNT/A(例如，SEQ ID NO:2)所结合的靶细胞受体。
对于包含一个或多个进一步修饰的经修饰的梭菌神经毒素，可以定义这些有利性质(代表治疗指数的增加)的一种方式是根据修饰的神经毒素的安全性比率。在这点上，梭菌神经毒素的不良影响(由毒素从给药部位扩散引起)可以通过测量相关动物模型中的体重减轻百分比(例如小鼠，在给药七天内检测到体重减轻)来进行实验评估。相反，梭菌神经毒素所需的靶向作用可以通过趾外展评分(DAS)测定法(一种肌肉麻痹的测量方法)进行实验评估。DAS测定可通过将20μl配制在明胶磷酸盐缓冲液中的梭菌神经毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中进行，然后使用Aoki的方法评估趾外展评分(Aoki KR，Toxicon39:1815-1820；2001)。在DAS测定中，小鼠被尾巴短暂地悬吊，以引起一种特征性的惊吓反应，其中小鼠伸展后肢并外展后趾。梭菌神经毒素注射后，以五分制对不同程度的趾外展进行评分(0＝正常至4＝趾外展和腿部伸展的最大减少)。
然后梭菌神经毒素的安全性比率可以表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠给药后的前七天内以峰值效应测量)与DAS评分为2所需的毒性量之间的比率。因此期望得到高安全性比分数，并且其指示了能够有效地麻痹目标肌肉而几乎没有不想要的脱靶效应的毒素。包含一个或多个进一步修饰的经修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素可以具有比同等未修饰(天然)肉毒毒素(例如SEQ ID NO:2)的安全比更高的安全比，或与不包含一个或者多个进一步修饰的梭菌神经毒素相比时，具有更高的安全比。
因此，在一个实施方案中，包含一个或多个进一步修饰的经修饰的梭菌神经毒素具有至少8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比计算为：-10％体重变化所需的毒素剂量(pg/鼠)除以DAS ED50(pg/鼠)[ED50＝产生DAS评分为2所需的剂量]。
在一个实施方案中，包含一个或多个进一步修饰的修饰梭菌神经毒素具有至少10的安全比。在一个实施方案中，包含一个或多个进一步修饰的修饰梭菌神经毒素具有至少15的安全比。
本发明的修饰的梭菌神经毒素优选不含天然产生的梭菌神经毒素复合物中存在的复合蛋白。
用于通过取代、插入或缺失氨基酸残基或通过插入缺失来修饰蛋白质的方法是本领域已知的。例如，可以通过修饰编码多肽(例如，编码未修饰的BoNT/A HCC结构域)的核酸序列(例如，DNA序列)来引入氨基酸修饰。这可以使用标准分子克隆技术来实现，例如，通过定点诱变，其中使用聚合酶编码所需氨基酸的DNA短链(寡核苷酸)用于替代初始编码序列，或通过用各种酶(例如，连接酶和限制性核酸内切酶)插入/缺失基因的部分。或者，修饰的基因序列可以通过化学合成。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种生产修饰的梭菌神经毒素的方法，该方法包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码(至少)包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的修饰梭菌神经毒素的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(c)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生修饰的梭菌神经毒素；和
(d)任选分离所述修饰的梭菌神经毒素；和
(e)任选通过将(单链)经修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割(单链)经修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化经修饰的梭菌神经毒素，由此将(单链)经修饰的梭菌神经毒素转变成双链经修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
例如，一种用于生产修饰的梭菌神经毒素的方法可以包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；
(b)表达第二核酸，由此产生修饰的梭菌神经毒素；和
(c)任选分离修饰的梭菌神经毒素；和
(d)任选通过将(单链)修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割(单链)修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化修饰的梭菌神经毒素，由此将(单链)修饰的梭菌神经毒素转变成双链修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
例如，一种用于生产修饰的梭菌神经毒素的方法可以包括：
(a)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；
(b)表达合成的核酸，由此产生修饰的梭菌神经毒素；和
(c)任选分离修饰的梭菌神经毒素；和
(d)任选通过将(单链)修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割(单链)修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化修饰的梭菌神经毒素，由此将(单链)修饰的梭菌神经毒素转变成双链修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
该方法可以包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(c)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生单链经修饰的梭菌神经毒素；和
(d)分离所述单链经修饰的梭菌神经毒素。
该方法可以包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(c)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生单链经修饰的梭菌神经毒素；和
(d)通过将单链经修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割单链经修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化单链经修饰的梭菌神经毒素，由此将单链经修饰的梭菌神经毒素转变成双链经修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
优选地，随后分离双链经修饰的梭菌神经毒素。
优选地，该方法可以包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(c)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生单链经修饰的梭菌神经毒素；和
(d)分离单链修饰的梭菌神经毒素；和
(e)通过将单链经修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割单链经修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化单链经修饰的梭菌神经毒素，由此将单链经修饰的梭菌神经毒素转变成双链经修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
本发明还提供了相应的用于提高梭菌神经毒素的抗氧化性的方法。因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于提高梭菌神经毒素的抗氧化性的方法，该方法包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码(至少)包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的修饰梭菌神经毒素的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(c)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生修饰的梭菌神经毒素；和
(d)任选分离所述修饰的梭菌神经毒素；和
(e)任选通过将(单链)经修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割(单链)经修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化经修饰的梭菌神经毒素，由此将(单链)经修饰的梭菌神经毒素转变成双链经修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
优选地，分离双链经修饰的梭菌神经毒素。
第二核酸或合成的核酸优选编码包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的修饰梭菌神经毒素。因此，所述核酸可以编码梭菌神经毒素L-链和H-链，所述H-链包含易位结构域和HC结构域，其中HC结构域包含在M1144处修饰的HCC结构域。
本发明还提供了通过本发明的方法可获得的修饰的梭菌神经毒素。如本文使用的术语“可获得的”包括术语“获得的”。在一个实施方案中，“可获得的”表示“获得的”。
用于本发明的方法中的第一核酸可以包含编码本文所述的未修饰的BoNT/AHCC结构域的核酸序列。第一核酸可以包含编码在位置1144包含甲硫氨酸的梭菌神经毒素(例如，包含轻链和重链)的核酸。优选地，第一核酸包含编码本文所述的未修饰的BoNT/A的核酸序列。
在一个实施方案中，第一核酸包含与SEQ ID NO:1、10、19、28或37的任一项具有至少70％序列同一性的核酸。在一个实施方案中，第一核酸包含与SEQ ID NO:1、10、19、28或37的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核酸。优选地，第一核酸包含SEQID NO:1、10、19、28或37的任一项(更优选由其组成)。在所示序列中，SEQ ID NO:10是最优选的。
在一个实施方案中，第二核酸或合成的核酸包含与SEQ ID NO:136-138的任一项具有至少70％序列同一性的核酸。在一个实施方案中，第二核酸或合成的核酸包含与SEQID NO:136-138的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核酸。优选地，第二核酸或合成的核酸包含SEQ ID NO:136-138的任一项(更优选由其组成)。
在一个实施方案中，修饰包括用编码缬氨酸(例如，GTG)、亮氨酸(例如，CTG)或甘氨酸(例如，GGT)的密码子替代编码M1144的密码子。
在相关方面中，本发明提供了编码本发明的修饰的梭菌神经毒素的核酸(优选DNA)。在一个实施方案中，将核酸序列制成包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。
在一个实施方案中，所述核酸包含与SEQ ID NO:136-138的任一项具有至少70％序列同一性的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含与SEQ ID NO:136-138的任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核酸。优选地，所述核酸包含SEQ ID NO:136-138的任一项(更优选由其组成)。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以使用重组核酸技术来产生。因此，在一个实施方案中，(如上所述的)修饰的梭菌神经毒素是重组的修饰梭菌神经毒素。
在优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
在另一个优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
本发明的核酸分子可以使用本领域已知的任何合适的方法来制备。因此，核酸分子可以使用化学合成技术来制备。或者，本发明的核酸分子可以使用分子生物技术来制备。
例如，本发明的核酸可以在计算机中设计，且随后通过常规合成技术来合成。
上述核酸序列信息任选根据待使用的最终宿主细胞(例如，大肠杆菌)表达系统的密码子偏好来修饰。
术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。
可以使用本领域已知的任何技术表达本文所述的核酸序列来产生修饰的梭菌神经毒素。例如，核酸可以在无细胞体外系统中表达。或者，核酸优选在合适的宿主细胞中表达，如大肠杆菌宿主细胞。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于生产具有轻链和重链的单链修饰梭菌神经毒素的方法，该方法包括在合适的宿主细胞中表达本发明的核酸，裂解宿主细胞以产生含有单链修饰的梭菌神经毒素的宿主细胞匀浆，并且分离单链修饰的梭菌神经毒素。
表达后，可以分离修饰的梭菌神经毒素。分离修饰的梭菌神经毒素可以通过任何纯化方法来实现，如本领域技术人员已知的色谱或免疫亲和方法。纯化标签有助于分离。因此，本文所述的修饰的梭菌神经毒素可以包含一个或多个标签(例如，纯化标签)，如His-标签或Strep-标签。优选修饰的梭菌神经毒素不含这样的标签或在使用前除去标签。修饰的梭菌神经毒素还可以包含一个或多个切割位点，如TEV切割位点，以促进标签的去除。
修饰的梭菌神经毒素可以在生产期间的任何点从单链多肽转变成相应的双链多肽。然而，优选这在分离修饰的梭菌神经毒素后进行。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种活化修饰的梭菌神经毒素的方法，该方法包括提供通过本发明的方法可获得的单链修饰的梭菌神经毒素，
将单链修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割单链修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触，由此将单链修饰的梭菌神经毒素转变成双链修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
本发明因此提供了通过本发明的方法可获得的双链梭菌神经毒素。
活化优选通过将修饰的梭菌神经毒素与如WO 2014/080206 A1中所描述的Lys-C接触来进行。
如以上讨论的，梭菌神经毒素从两条多肽链形成，重链(H-链)，其具有大约100kDa的分子量和轻链(L-链)，其具有大约50kDa的分子量。H-链包含C-末端靶向组分(受体结合结构域或HC结构域)和N-末端易位组分(HN结构域)。
轻链参考序列的示例包括：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-448
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-440
C1型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-441
D型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-445
E型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-422
F型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-439
G型肉毒神经毒素：氨基酸残基1-441
破伤风神经毒素：氨基酸残基1-457
对于最近鉴定的BoNT/X，L-链已经报道为对应于其氨基酸1-439，L-链边界可能有大约25个氨基酸的变化(例如，1-414或1-464)。
以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可以发生轻微的改变。举例来说，US2007/0166332(通过引用以其整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：
A型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K448
B型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K440
C1型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K449
D型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-R445
E型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-R422
F型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K439
G型肉毒神经毒素：氨基酸残基M1-K446
破伤风神经毒素：氨基酸残基M1-A457
易位结构域是能够使蛋白酶易位到靶细胞中的分子，从而在靶细胞的胞质溶胶内发生蛋白酶活性的功能性表达。可以通过许多常规测定法中的任何一种来确认任何分子(例如蛋白质或肽)是否具有本发明必需的易位功能。
例如，Shone C.(1987)描述了使用脂质体的体外测定法，所述脂质体受到测试分子的攻击。通过从脂质体中释放的K+和/或标记的NAD来确认必需的易位功能的存在，所述K+和/或标记的NAD可以容易地监测[参见Shone C.(1987)Eur.J.Biochem；第167卷(1):第175-180页]。
Blaustein R.(1987)提供了另一个示例，其描述了使用平面磷脂双层膜的简单的体外测定法。用测试分子攻击膜，并通过所述膜的跨膜电导的增加来确认必需的易位功能[参见Blaustein(1987)FEBS Letts；第226卷,第1号:第115-120页]。
Methods in Enzymology Vol 220 and 221，Membrane Fusion Techniques，Parts A and B，Academic Press 1993提供了能够评估膜融合并因此鉴定适用于本发明的易位结构域的其他方法。
本发明还包括易位结构域变体，只要所述结构域变体仍显示出必需的易位活性。举例来说，变体可与参考易位结构域具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。当与易位结构域相关使用时，术语片段是指肽，其具有参考易位结构域的至少20个，优选至少40个，更优选至少80个，最优选至少100个氨基酸残基。在梭菌易位结构域的情况下，该片段优选具有参考易位结构域(例如HN结构域)的至少100个，优选至少150个，更优选至少200个，最优选至少250个氨基酸残基。本发明的易位“片段”包括基于参考序列的易位结构域变体的片段。
易位结构域优选地能够在低pH条件下在脂质膜中形成离子可渗透的孔。优选地，已经发现仅使用能够在内体膜内形成孔的蛋白质分子的那些部分。
易位结构域可获自微生物蛋白来源，特别是获自细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，易位结构域是酶的易位结构域，例如，细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域。
众所周知，细菌毒素分子的某些结构域能够形成此类孔。还已知病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域能够形成此类孔。这样的结构域可以在本发明中使用。
易位结构域可以是梭菌来源的，例如HN结构域(或其功能性组分)。HN表示梭菌神经毒素的H链的一部分或片段(大约等同于H链的氨基-末端的一半)，或与完整H链中的该片段相对应的结构域。
合适的(参考)易位结构域的示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-871)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(441-858)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-866)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(446-862)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(423-845)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(440-864)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。举例来说，US2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)
在本发明的上下文中，多种具有易位结构域的梭菌神经毒素HN区可用于本发明的方面，优选地只要这些活性片段可以促进非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌L链)从细胞内的小泡释放进入靶细胞的细胞质，从而参与执行整个细胞机制，梭菌神经毒素通过该机制蛋白水解切割底物。梭菌神经毒素重链的HN区长度约为410-430个氨基酸，并包含一个易位结构域。研究表明，来自梭菌神经毒素重链的HN区的全长对于易位结构域的易位活性不是必需的。因此，本实施方案的方面可包括包含易位结构域的梭菌神经毒素HN区，所述易位结构域具有例如至少350个氨基酸，至少375个氨基酸，至少400个氨基酸和至少425个氨基酸的长度。本实施方案的其他方面可包括包含易位结构域的梭菌神经毒素HN区，所述易位结构域具有例如至多350个氨基酸，至多375个氨基酸，至多400个氨基酸和至多425个氨基酸的长度。
有关肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(C.tetani)产生毒素的遗传基础的更多详细信息，参见Henderson等人(1997)in The lostridia:MolecularBiology and Pathogenesis，Academic press。
术语HN包括天然存在的神经毒素HN部分和修饰的HN部分，所述修饰的HN部分具有在自然界中不存在的氨基酸序列和/或合成的氨基酸残基，优选地只要该修饰的HN部分仍表现出上述易位功能。
备选地，易位结构域可以是非梭菌来源的。非梭菌(参考)易位结构域来源的示例包括但不限于白喉毒素的易位结构域[O’Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89，6202-6206；Silverman等人，J.Biol.Chem.(1993)269，22524-22532；和London，E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.，1112，pp.25-51]，A型假单胞菌外毒素的易位结构域[Prior等人Biochemistry(1992)31，3555-3559]，炭疽毒素的易位结构域[Blanke等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，8437-8442],各种具有易位功能的促融合或疏水性肽[Plank等人J.Biol.Chem.(1994)269，12918-12924；和Wagner等人(1992)PNAS，89，pp.7934-7938],和两亲性肽[Murata等人(1992)Biochem.，31,第1986-1992页]。易位结构域可以反映天然存在的蛋白质中存在的易位结构域，或者可以包含氨基酸变异，优选地只要变异不破坏易位结构域的易位能力。
适用于本发明的病毒(参考)易位结构域的具体示例包括病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域。例如，Wagner等人(1992)和Murata等人(1992)描述了源自流感病毒血凝素N-末端区域的许多促融合和两亲性肽的易位(即,膜融合和囊泡化)功能。其他已知具有所需易位活性的病毒表达的膜融合蛋白是Semliki森林病毒(SFV)促融合肽的易位结构域、水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明的上下文中具有特定的应用，例如，SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
表(下表)中列出的(参考)易位结构域的使用包括其序列变体的使用。变体可以包含一个或多个保守核酸取代和/或核酸缺失或插入，只要该变体具有必需的易位功能。变体还可以包含一个或多个氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，只要该变体具有必需的易位功能。
梭菌神经毒素HC结构域参考序列的示例包括：
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
BoNT/C1-N867-E1291
BoNT/D-S863-E1276
BoNT/E-R846-K1252
BoNT/F-K865-E1274
BoNT/G-N864-E1297
TeNT-I880-D1315
对于最近鉴定的BoNT/X，据报道HC结构域对应于其氨基酸893-1306，其中结构域边界可能相差约25个氨基酸(例如，868-1306或918-1306)。
本文所描述的梭菌神经毒素还可包含易位促进结构域。所述结构域促进将非细胞毒性蛋白酶递送至靶细胞的胞质溶胶中，并且描述在例如，WO 08/008803和WO 08/008805中，其各自通过引用并入本文。
举例来说，合适的易位促进结构域包括包膜病毒促融合肽结构域，例如，合适的融合肽结构域包括流感病毒融合肽结构域(例如23个氨基酸的甲型流感病毒融合肽结构域)、α病毒融合肽结构域(例如26个氨基酸的Semliki森林病毒融合肽结构域)、水疱病毒融合肽结构域(例如21个氨基酸的水疱性口炎病毒融合肽结构域)、呼吸道病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽结构域)、麻疹病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的犬瘟热病毒融合肽结构域)、avulavirus病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的新城病毒融合肽结构域)、henipavirus病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的亨德拉病毒融合肽结构域)、间质性肺炎病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的人间质性肺炎病毒融合肽结构域)或spumavirus病毒融合肽结构域，如猿猴泡沫病毒融合肽结构域；或其片段或变体。
作为进一步的示例，易位促进结构域可包含梭菌神经毒素HCN结构域或其片段或变体。更详细地，梭菌神经毒素HCN易位促进结构域可以具有至少200个氨基酸，至少225个氨基酸，至少250个氨基酸，至少275个氨基酸的长度。在这方面，梭菌神经毒素HCN易位促进结构域优选具有至多200个氨基酸，至多225个氨基酸，至多250个氨基酸或至多275个氨基酸的长度。具体(参考)示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)
上述序列位置可能会根据血清型/亚型略有差别，合适的(参考)梭菌神经毒素HCN结构域的其他示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)
任何上述促进结构域可与任何适用于本发明的前述易位结构域肽组合。因此，举例来说，非梭菌促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽或与梭菌易位结构域肽组合。或者，可将梭菌神经毒素HCN易位促进结构域与非梭菌易位结构域肽组合。或者，可将梭菌神经毒素HCN促进结构域与梭菌易位结构域肽组合，其示例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
天然梭菌神经毒素的HC肽包含约400-440个氨基酸残基，并由两个功能不同的结构域组成，每个结构域约25kDa，即，N-末端区域(通常称为HCN肽或结构域)和C-末端区域(通常称为HCC肽或结构域)。以下出版物已证实了这一事实，在此通过引用将其整体并入本文：Umland TC(1997)Nat.Struct.Biol.4:788-792；Herreros J(2000)Biochem.J.347:199-204；Halpern J(1993)J.Biol.Chem.268:15,pp.11188-11192；Rummel A(2007)PNAS104:359-364；Lacey DB(1998)Nat.Struct.Biol.5:898-902；Knapp(1998)Am.Cryst.Assoc.Abstract Papers 25:90；Swaminathan and Eswaramoorthy(2000)Nat.Struct.Biol.7:1751-1759；and Rummel A(2004)Mol.Microbiol.51(3),631-643。此外，已经有充分的文献证明，构成C-末端160-200个氨基酸残基的C-末端区域(HCC)负责梭菌神经毒素与其天然细胞受体(即神经肌接头处的神经末梢)的结合，-上述出版物也证实了这一事实。
以下呈现了实例梭菌HCC参照序列：
A型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
B型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
C型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
D型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
E型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
F型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
G型肉毒神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)
以上鉴定的参照序列应认为是一种指导，因为，根据亚血清型，轻微变异可能会出现。
修饰的梭菌神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个进一步修饰，例如，在底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰经修饰的L-链的SNARE蛋白质特异性。这样的修饰的梭菌神经毒素的实例描述于WO 2010/120766和US2011/0318385中，将两篇都按引用以其整体并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可以包含一个或多个增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性的进一步修饰。例如，修饰的梭菌神经毒素可以包含基于亮氨酸或基于酪氨酸的基序，其中所述基序增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL(SEQ ID NO:117)、xExxxLL(SEQ ID NO:118)、xExxxIL(SEQ ID NO:119)和xExxxLM(SEQ ID NO:120)(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(SEQ ID NO:121)(其中Hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和基于酪氨酸基序的修饰梭菌神经毒素的实例描述于WO 2002/08268中，将其按引用以其整体并入本文。
尽管优选本发明的修饰梭菌神经毒素是修饰的BoNT/A，但本发明适于应用于许多不同种类的梭菌神经毒素，附带条件是所述梭菌神经毒素包含本发明的修饰的BoNT/AHCC结构域(然而，如以下所讨论的，对于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，这个条件不是必需的)。因此，在本发明的背景下，术语“梭菌神经毒素”包括由肉毒梭菌(肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H和X)、破伤风梭菌(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(肉毒神经毒素血清型E)和巴拉特梭菌(肉毒神经毒素血清型F)产生的毒素，以及源自上述任一种的修饰的梭菌神经毒素或衍生物，附带条件是所述梭菌神经毒素包含本发明的修饰的BoNT/AHCC结构域(然而，如以下所讨论的，对于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，这个条件不是必需的)。术语“梭菌神经毒素”还包括肉毒神经毒素血清型H，附带条件是所述梭菌神经毒素包含本发明的修饰的BoNT/AHCC结构域(然而，如以下所讨论的，对于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，这个条件不是必需的)。
因此，术语“梭菌神经毒素”旨在包括杂合和嵌合梭菌神经毒素。在一个实施方案中，修饰的梭菌神经毒素可以是杂合或嵌合梭菌神经毒素，附带条件是所述梭菌神经毒素包含本发明的修饰的BoNT/A HCC结构域(然而，如以下所讨论的，对于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，这个条件不是必需的)。杂合梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分，以及来自另一种梭菌神经毒素或梭菌神经毒素亚型的重链的至少一部分。在一个实施方案中，杂合梭菌神经毒素可包含来自一种梭菌神经毒素亚型的轻链的整个轻链和来自另一种梭菌神经毒素亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合的梭菌神经毒素可以包含一种梭菌神经毒素亚型的重链的一部分(例如结合结构域)，其中重链的另一部分来自另一种梭菌神经毒素亚型。类似地或可替代地，治疗元件可包含来自不同梭菌神经毒素的轻链部分。此类杂合或嵌合的梭菌神经毒素可用作，例如，向对给定梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的患者、向对给定梭菌神经毒素重链结合结构域可能具有低于平均受体浓度的患者、或向可能具有膜或囊泡毒素底物(例如SNAP-25，VAMP和突触融合蛋白)的蛋白酶抗性变体的患者递送此类梭菌神经毒素的治疗益处的手段。杂合和嵌合的梭菌神经毒素描述于US 8,071,110，其公开内容在此整体引用作为参考。
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒杆菌产生的一种大蛋白复合物形式，由BoNT本身与许多辅助蛋白复合组成。目前有九种不同类别的肉毒杆菌神经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H和X，其均具有相似的结构和作用方式。可以基于通过特异性中和抗血清的失活来区分不同的BoNT血清型，其中通过血清型的这种分类与氨基酸水平的序列同一性百分比相关。根据氨基酸序列同一性百分比，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分为不同的亚型。
未修饰的BoNT/A多肽序列(包括未修饰的BoNT/A1、BoNT/A3和BoNT/A4)如上所述。
BoNT/B可以包含与SEQ ID NO:128具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/B可以包含与SEQ ID NO:128具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/B包含SEQ ID NO:128(或由其组成)。
BoNT/C可以包含与SEQ ID NO:129具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/C可以包含与SEQ ID NO:129具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/C包含SEQ ID NO:129(或由其组成)。
BoNT/D可以包含与SEQ ID NO:130具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/D可以包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/D包含SEQ ID NO:130(或由其组成)。
BoNT/E可以包含与SEQ ID NO:131具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/E可以包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/E包含SEQ ID NO:131(或由其组成)。
BoNT/F可以包含与SEQ ID NO:132具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/F可以包含与SEQ ID NO:132具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/F包含SEQ ID NO:132(或由其组成)。
BoNT/G可以包含与SEQ ID NO:133具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/G可以包含与SEQ ID NO:133具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/G包含SEQ ID NO:133(或由其组成)。
TeNT可以包含与SEQ ID NO:134具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，TeNT可以包含与SEQ ID NO:134具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，TeNT包含SEQ ID NO:134(或由其组成)。
BoNT/X可以包含与SEQ ID NO:135具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，BoNT/X可以包含与SEQ ID NO:135具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，BoNT/X包含SEQ ID NO:135(或由其组成)。
BoNT在胃肠道中被吸收，并且在进入体循环后，结合胆碱能神经末梢的前突触膜并防止其神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割小突触泡蛋白/囊泡相关的膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)；以及BoNT/C1切割突触融合蛋白。已经发现了BoNT/X切割SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAPM6、Ykt6和突触融合蛋白1。
破伤风毒素是由破伤风梭菌以单血清型产生的。丁酸梭菌产生BoNT/E，而巴拉特梭菌产生BoNT/E。
术语“梭菌神经毒素”还可以包括新发现的由非梭菌微生物表达的肉毒神经毒素蛋白家族成员，如肠球菌(Enterococcus)编码的毒素，其与BoNT/X具有最接近的序列同一性，大米魏斯氏菌(Weissella oryzae)编码的称为BoNT/Wo的毒素(NCBI Ref Seq:WP_027699549.1)，其在W89-W90切割VAMP2，屎肠球菌(Enterococcus faecium)编码的毒素(GenBank：OTO22244.1)，其切割VAMP2和SNAP25，以及Chryseobacterium pipero编码的毒素(NCBI Ref.Seq:WP_034687872.1)，附带条件是所述梭菌神经毒素包含本发明的BoNT/AHCC结构域(再次，如以下所讨论的，对于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，这个条件不是必需的)。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以包含如本文所描述的经修饰的BoNT/A HCC结构域和：
(i)BoNT/AL-链和/或BoNT/AHN结构域(优选BoNT/AL-链和BoNT/AHN结构域)；
(ii)BoNT/B L-链和/或BoNT/B HN结构域(优选BoNT/B L-链和BoNT/B HN结构域)；
(iii)BoNT/C1 L-链和/或BoNT/C1 HN结构域(优选BoNT/C1 L-链和BoNT/C1 HN结构域)；
(iv)BoNT/D L-链和/或BoNT/D HN结构域(优选BoNT/D L-链和BoNT/D HN结构域)；
(v)BoNT/E L-链和/或BoNT/E HN结构域(优选BoNT/E L-链和BoNT/E HN结构域)；
(vi)BoNT/F L-链和/或BoNT/F HN结构域(优选BoNT/F L-链和BoNT/F HN结构域)；
(iv)BoNT/G L-链和/或BoNT/G HN结构域(优选BoNT/G L-链和BoNT/G HN结构域)；
(iv)BoNT/X L-链和/或BoNT/X HN结构域(优选BoNT/X L-链和BoNT/X HN结构域)；或
(vi)TeNT L-链和/或TeNT HN结构域(优选TeNT L-链和TeNT HN结构域)。
修饰的梭菌神经毒素优选包含BoNT/AHC结构域，其包含如本文所述修饰的BoNT/AHCC结构域。如本文所述修饰的BoNT/AHCC结构域可以替代天然BoNT/AHC结构域。BoNT/AHC结构域可以来自相同或不同(优选相同)的BoNT/A亚血清型(例如，BoNT/A1、BoNT/A3或BoNT/A4)作为HCC结构域。如上所述，修饰的梭菌神经毒素包含BoNT/AL-链和/或HN结构域时，这是优选的。
或者，修饰的梭菌神经毒素可以包含其中HCC结构域已经被如本文所述修饰的BoNT/AHCC结构域替代的BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X或TeNTHC结构域。修饰的梭菌神经毒素包含如上所述的BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X或TeNT L-链和/或HN结构域时，这是优选的。
本发明还包括具有非天然蛋白酶切割位点的梭菌神经毒素。在这样的梭菌神经毒素中，天然蛋白酶切割位点(也称为活化位点，如上所述)被用对于梭菌神经毒素而言不是天然的蛋白酶切割位点(即，外源性切割位点)替代或被修饰。这样的位点需要外源性蛋白酶用于切割，而这允许改进的对于切割事件的定时和位置的控制。可以用于梭菌神经毒素中的非天然蛋白酶切割位点包括：
其他蛋白酶切割位点包括被非细胞毒性蛋白酶(例如，梭菌神经毒素的轻链)切割的识别序列。这些包括被非细胞毒性蛋白酶(如，梭菌神经毒素的轻链)切割的SNARE(例如，SNAP-25，突触融合蛋白，VAMP)蛋白识别序列。包含非天然蛋白酶切割位点的梭菌神经毒素描述于US 7,132,259、EP 1206554-B2和US2007/0166332中，所有以其全部按引用并入本文。这些蛋白酶切割位点还包括内含肽(intein)，其是自我切割序列。自我剪切反应是可控制的，例如，可以通过改变存在的还原剂的浓度来控制。
替换地/另外地，修饰的梭菌神经毒素可以包含如WO 2020/065336 A1中所述的(外源性)活化环。
本发明还包括包含“破坏性切割位点”的梭菌神经毒素。在所述梭菌神经毒素中，将非天然蛋白酶切割位点在选定的位置引入梭菌神经毒素中，使得在所述位点的切割将降低梭菌神经毒素的活性或使梭菌神经毒素灭活。在梭菌神经毒素施用后迁移至非靶向位置的情况中，破坏性蛋白酶切割位点可以易于被局部蛋白酶切割。合适的非天然蛋白酶切割位点包括上述那些。包含破坏性切割位点的梭菌神经毒素描述于WO 2010/094905和WO2002/044199中，两篇均按引用以其整体并入本文。
本发明的修饰的梭菌神经毒素，尤其是其轻链组分，可以是PEG化的-这可能有助于提高稳定性，例如在轻链组分作用期间。轻链包含BoNT/A、B或C1蛋白酶时，PEG化是特别优选的。PEG化优选包括将PEG添加至轻链组分的N-末端。例如，轻链的N-末端可以用一个或多个氨基酸(例如，半胱氨酸)残基来延伸，所述氨基酸残基可以是相同或不同的。所述氨基酸残基的一个或多个可以具有自身与其连接(例如，共价连接)的PEG分子。这种技术的一个实例描述于WO2007/104567，将其按引用以其整体并入。
本发明的修饰的梭菌神经毒素合适地发现了在医学或化妆品中的实用性。在使用中，修饰的梭菌神经毒素优选是双链形式的。因此，在一个方面中，本发明提供了根据本发明的修饰的梭菌神经毒素或根据本发明的双链修饰的梭菌神经毒用于药物中。类似地，本发明涉及一种治疗方法，包括将本发明的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素施用于需要的受试者。
如本文所用，“受试者”可以是哺乳动物，如人或其他哺乳动物。优选地，“受试者”表示人类受试者。
如本文所用，术语“障碍”还涵盖“疾病”。在一个实施方案中，障碍是疾病。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括预防性治疗(例如，防止障碍的发作)以及矫正治疗(治疗已经患有障碍的受试者)。优选地，如本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指矫正治疗。如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指障碍和/或其症状。
因此，本发明的多肽可以以治疗有效量或预防有效量施用于受试者。优选地，本发明的多肽以治疗有效量施用于受试者。
“治疗有效量”是单独或联合施用于受试者以治疗所述障碍(或其症状)时足以实现对该障碍或其症状的此类治疗的多肽的任何量。
“预防有效量”是单独或联合施用于受试者以抑制或延迟障碍(或其症状)的发作或复发时的多肽的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止障碍的发作或复发。“抑制”发作意味着减少障碍发作(或其症状)的可能性，或完全防止障碍发作。
本发明多肽的给药剂量范围是产生所需治疗、美容或预防效果的剂量范围。将认识到所需的剂量范围取决于修饰的梭菌神经毒素或组合物的确切性质、给药途径、制剂的性质、患者的年龄、患者病症的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有的话)，以及主治医师的判断。这些剂量水平的变化可以使用标准经验程序进行调整以进行优化。
合适的日剂量(患者的每kg体重)在范围0.0001-1ng/kg中，优选0.0001-0.5ng/kg，更优选0.002-0.5ng/kg，且特别优选0.004-0.5ng/kg。单位剂量可以从小于1皮克变化至30ng，但通常将在0.01至1ng/剂的区域中，这可以每日给药或优选频率更低，如每周或每六个月。
特别优选的给药方案是基于0.05ng修饰的梭菌神经毒素作为1X剂量。在这点上，优选的剂量在1X-100X范围中(即，0.05-5ng)。
在一个方面中，本发明提供了如上所述的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素，用于治疗选自以下的病症：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍，局灶性肌张力异常、迟发性肌张力不良、喉部肌张力障碍和肢体肌张力障碍以及颈颈肌张力障碍)、斜颈(例如痉挛型斜颈)、受益于细胞/肌肉丧失能力(经由SNARE下调或失活)的美容治疗(美容)应用、眼运动的神经肌肉紊乱或病况(如伴行斜视、垂直斜视、侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺功能异常肌病)、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvic syndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛(如肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(如紧张性头痛)、眉沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
在相关方面中，本发明提供了一种治疗障碍的方法，该方法包括将如上所述的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素施用于受试者，其中所述病症选自：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍，局灶性肌张力异常、迟发性肌张力不良、喉部肌张力障碍和肢体肌张力障碍以及颈颈肌张力障碍)、斜颈(例如痉挛型斜颈)、受益于细胞/肌肉丧失能力(经由SNARE下调或失活)的美容治疗(美容)应用、眼运动的神经肌肉紊乱或病况(如伴行斜视、垂直斜视、侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺功能异常肌病)、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvic syndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛(如肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(如紧张性头痛)、眉沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
在相关方面中，本发明提供了如上所述的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素在制造用于治疗障碍的药物中的用途，所述病症选自：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍，局灶性肌张力异常、迟发性肌张力不良、喉部肌张力障碍和肢体肌张力障碍以及颈颈肌张力障碍)、斜颈(例如痉挛型斜颈)、受益于细胞/肌肉丧失能力(经由SNARE下调或失活)的美容治疗(美容)应用、眼运动的神经肌肉紊乱或病况(如伴行斜视、垂直斜视、侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺功能异常肌病)、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvicsyndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛(如肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(如紧张性头痛)、眉沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
在一个方面中，提供了一种美容处理方法，该方法包括将根据本发明的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素施用于受试者。该方法可以针对得益于细胞/肌肉丧失功能(经由SNARE下调或失活)的美容处理应用。所述美容处理可以处理：面部皱纹、眉间皱纹、眉沟、皮肤皱纹、鞘内皱纹(intrathecal line)、前额皱纹、“兔子”纹、微笑不规则、下巴不规则、颈阔肌条索、“木偶”纹、唇纹、鱼尾纹、眉毛不规则、皱眉纹、忧虑纹、妊娠纹、伤口、事故、咬伤、手术和/或如眼睛、脸颊、鼻子、嘴唇、前额，和/或颈部等区域的轮廓缺陷。
在一个方面中，本发明提供了包含本发明的修饰的梭菌神经毒素或双链修饰的梭菌神经毒素和药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的药物组合物。用于本文所述的治疗或美容应用中时，修饰的梭菌神经毒素可以是药物组合物的一部分。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以配制用于口服、肠胃外、连续输注、吸入或局部应用。适用于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液，或干粉形式，干粉在使用前溶解或悬浮于合适的载体中。
在口服递送修饰的梭菌神经毒素的情况中，修饰的梭菌神经毒素可以配制成霜剂(例如，用于局部施用)，或用于皮下注射。
局部递送方式可以包括气溶胶或其他喷雾(例如，喷雾器)。在这点上，修饰的梭菌神经毒素的气溶胶制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。
本发明的修饰的梭菌神经毒素可以通过鞘内或硬膜外注射在涉及受影响器官的神经支配的脊柱节段水平的脊柱中施用于患者。
优选的给药途径可以是通过腹腔镜和/或局部(特别是肌内)注射。
流体剂型通常利用修饰的梭菌神经毒素和无热原无菌溶媒制备。根据使用的溶媒和浓度，修饰的梭菌神经毒素可以溶解或悬浮在溶媒中。在制备溶液时，修饰的梭菌神经毒素可以溶解在溶媒中，必要时通过添加氯化钠使溶液等渗，并使用无菌技术通过无菌过滤器过滤进行灭菌，之后装入合适的无菌小瓶或安瓿并密封。或者，如果溶液稳定性足够，则密封容器中的溶液可以通过高压灭菌来进行消毒。有利地，添加剂，如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和或局部麻醉剂可以溶解在溶媒中。
在使用前溶解或悬浮于合适溶媒中的干粉可以通过在无菌区域中使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。或者，可以在无菌区域中使用无菌技术将成分溶解到合适的容器中。然后将产品冷冻干燥并将容器无菌密封。
适用于肌内、皮下或皮内注射的肠胃外悬浮液以基本相同的方式制备，除了将无菌组分悬浮在无菌溶媒中，而不是溶解并且不能通过过滤实现灭菌。组分可以在无菌状态下被分离，或者，可以在分离后灭菌，例如通过伽马辐照。
有利地，在组合物中包括悬浮剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)以促进组分的均匀分布。
根据本发明的施用可以利用各种递送技术，包括微粒包封、病毒递送系统或高压气溶胶撞击。
本发明还提供了用于选择呈现抗氧化性的梭菌神经毒素的筛选方法。因此，在一个方面中，提供了一种用于选择抗氧化的梭菌神经毒素的方法，该方法包括：
(a)鉴定梭菌神经毒素重链或其部分的可氧化氨基酸；
(b)产生其中所述的可氧化氨基酸残基已被修饰的经修饰的梭菌神经毒素；
(c)向修饰的梭菌神经毒素施加氧化条件；
(d)确定修饰的梭菌神经毒素的活性水平；
(e)将步骤(d)中确定的活性水平与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平进行比较，其中缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素已被施加氧化条件；和
(f)活性水平高于缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平时，选择该修饰的梭菌神经毒素；或
(g)活性水平与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平相同或低于缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平时，丢弃/不选择该修饰的梭菌神经毒素。
梭菌神经毒素重链的一部分可以包含易位结构域(HN结构域)或其部分或受体结合结构域(HC结构域)或其部分(优选由其组成)。受体结合结构域的一部分可以包含易位促进结构域(HCN结构域)或HC结构域的C-末端部分(HCC结构域)，优选HCC结构域(优选由其组成)。
该方法的步骤(a)可以通过分析重链或其部分中存在的一个或多个氨基酸的性质及其对氧化的易感性在计算机中进行。这样的分析可以包括确定一个或多个氨基酸的表面暴露的程度。对氧化易感的氨基酸可以包括甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。因此，在方法的步骤(a)中可以鉴定甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸中的一个或多个为可氧化氨基酸。
修饰合适地是本文所述的任何修饰，如取代、插入、缺失或插入缺失，优选取代。优选地，修饰是用比鉴定的氨基酸更抗氧化的氨基酸取代。修饰可以是用以下氨基酸取代：缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸或脯氨酸。在一个实施方案中，修饰可以使用以下氨基酸取代：缬氨酸、亮氨酸或甘氨酸。优选地，用缬氨酸或亮氨酸取代。或者，修饰可以是用非天然或非标准氨基酸取代，如正亮氨酸、异缬氨酸、α-甲基缬氨酸、环亮氨酸或别-苏氨酸。
本发明还提供了通过本发明的方法选择的修饰的梭菌神经毒素，优选其中修饰的梭菌神经毒素是抗氧化的(例如，比缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素更抗氧化)。
本领域技术人员将认识到用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法可以利用任何梭菌神经毒素，如本文所述的。例如，梭菌神经毒素可以是选自BoNT/A(如BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7或BoNT/A8)、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X和TeNT肉毒神经毒素或破伤风神经毒素。例如，所述方法中使用的梭菌神经毒素可以包含与SEQ ID NO:2、11、20、29、38、46、54或128-135任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，所述方法中使用的梭菌神经毒素可以包含与SEQ ID NO:2、11、20、29、38、46、54或128-135任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选地，所述方法中使用的梭菌神经毒素包含SEQ ID NO:2、11、20、29、38、46、54或128-135的任一项(更优选由其组成)。
其中所述可氧化氨基酸残基已被修饰的经修饰的梭菌神经毒素可以使用本领域已知的任何技术来生产。例如，如上所述，编码(未修饰的)梭菌神经毒素的核酸可以使用标准分子克隆技术来修饰，例如通过定点诱变。或者，修饰的基因序列可以化学合成。在一个实施方案中，修饰的梭菌神经毒素通过包括以下步骤的方法来产生：
(i)提供编码梭菌神经毒素的第一核酸并修饰第一核酸以在步骤(a)中鉴定的可氧化氨基酸处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性；或
(ii)合成编码修饰的梭菌神经毒素的核酸，所述修饰的梭菌神经毒素在步骤(a)鉴定的可氧化氨基酸处包含修饰，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性，由此提供合成的核酸；和
(iii)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生修饰的梭菌神经毒素；和
(iv)分离修饰的梭菌神经毒素；和
(v)通过将(单链)修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割所述(单链)修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触来活化修饰的梭菌神经毒素，由此将(单链)修饰的梭菌神经毒素转变成双链修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
优选地，进行筛选方法时，梭菌神经毒素接受强制氧化条件，例如，如本发明实施例中所述的(参见“强制氧化研究”)。尽管如此，所用的特定氧化技术不是必需的，只要修饰的梭菌神经毒素和缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素接受相同条件下的相同氧化技术以确保可比性。
任何合适的活性测定可以用于定量梭菌神经毒素活性，如本文所述的DAS测定。然而，优选的是如本发明实施例中所述的进行基于细胞的活性测定。尽管如此，所用的特定测定不是必需的，只要在相同条件下使用相同的测定来确定修饰的梭菌神经毒素和缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性，以确保可比性。
如用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法内容中使用的术语“活性水平更高”表示活性水平是统计上显著的更高。
如用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法内容中使用的术语“活性水平相同”表示活性水平不是统计上显著不同的或是相同的。
如用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法内容中使用的术语“活性水平更低”表示活性水平是统计上显著的更低。
统计显著性可以使用任何合适的技术来测定，如单因素ANOVA。
在一个实施方案中，其中初始甲硫氨酸残基或相应的初始密码子由本文以下的任一项SEQ ID NO来表示，所述残基/密码子是任选的。
涉及本发明各种修饰的梭菌神经毒素的实施方案旨在同样适用于本发明的核酸、方法、用途或药物组合物，且反之亦然。
序列同源性
多种序列比对方法中的任何都可以用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加各个残基对的分数和通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如JulieD.Thompson等人，CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代改进，参见例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments，264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如火柴盒(Match-box)，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans，Match-Box:AFundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABIOS 501 -509(1992)；Gibbs采样，参见例如C.E.Lawrence等人，Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van WaIIe等人，Align-M-ANewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等人，Bull.Math.Bio.48:603-16，1986and Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19，1992。简而言之，如下所示，使用空位开放罚分10，空位延伸罚分1，以及Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)对两个氨基酸序列进行比对，以优化比对得分(氨基酸由标准的单字母代码表示)；优选将这种方法用于比对序列与SEQ ID NO:2以限定如本文所述的氨基酸位置编号。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是该序列共有的相同位置数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列比对的空位的数目，以及每个空位的长度。可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(例如BLAST)进行序列比较和确定两个或多个序列之间的同一性百分比。
用于确定序列同一性的比对得分
然后，百分比同一性计算为：
相同匹配的总数
_____________________________________________________________×100
[较长序列的长度加上为了比对两个序列而引入较长序列的空位数目]
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选是不重要的，即，保守的氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常缺失1至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲醇基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质中的几种方法是本领域已知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在无细胞系统中进行的，该系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购的酶和其他试剂。蛋白质通过色谱法纯化。参见，例如，Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113:2722，1991；Ellman等人，Methods Enzymol.202:301，1991；Chung等人，Science 259:806-9，1993；和Chung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271:19991-8，1996)。在第三种方法中，在不存在待替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入多肽，代替其天然对应物。参见，Koide等人，Biochem.33:7470-6，1994。可通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的物质。化学修饰可以与定点诱变组合使用，以进一步扩大取代范围(Wynn andRichards，Protein Sci.2:395-403，1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
可以根据本领域已知的程序来鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells，Science 244:1081-5，1989)。也可以通过结构的物理分析来确定生物相互作用的位点，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸突变来确定。参见，例如，de Vos等人，Science 255:306-12，1992；Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309:59-64，1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出必需氨基酸的鉴定。
可以使用诱变和筛选的已知方法进行多种氨基酸取代，并进行测试，例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-6，1989)中公开的那些方法。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许取代的光谱的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人，Biochem.30:10832-7，1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，Gene46:145，1986；Ner等人，DNA7:127，1988)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THEHARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)，为熟练的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列都以5′至3′的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。
在本文中，使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸的3个字母密码子。还应理解，由于遗传密码子的简并性，多肽可以被一个以上的核苷酸序列编码。
术语的其他定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间、每个居中值至下限单位的十分之一，具体包括在本公开内。在指定范围内的任何指定值或居中值与该指定范围内的任何其他指定值或居中值之间的每个较小范围都包括在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且每个范围也包括在本公开内，其中包括在较小范围内的上下限之一、均不包括、或包括二者，以所述范围内的任何明确排除的限为准。在所述范围包括一个或两个限的情况下，排除这些限中所包括的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“梭菌神经毒素”包括多种这样的候选试剂，并且提及“梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
在本文使用术语“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的情况中，在一个实施方案中，所述术语可以被“基本上由……组成(consists essentially of)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”替代。在另一个实施方案中，所述术语可以被“由……组成(consists of)”或“由……组成(consisting of)”替代。
本文所讨论的出版物仅在本申请的提交日期之前提供其公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成了所附权利要求的现有技术。
附图说明
现在将参考以下附图和实施例仅以举例的方式描述本发明的实施方案。
图1显示了用过氧化氢进行氧化后，对照BoNT/A活性随着时间的％变化(“活性”)，以及与包含甲硫氨酸残基1144的肽相关的氧化水平的％变化。
图2显示了用过氧化氢进行氧化后，对照BoNT/A活性随着时间的％变化(“活性”)，以及与包含甲硫氨酸残基1144的肽相关的氧化水平的％变化。
图3显示了Lys-C活化前(-)和Lys-C活化后(+)纯化的修饰BoNT/A(M1144V)的SDS-PAGE凝胶。单链未切割的修饰BoNT/A与双链修饰的BoNT/A的重链(H-链)和轻链(L-链)一起显示。M＝标记。
图4显示了用过氧化氢氧化后，修饰的BoNT/A活性随着时间的％变化(“活性”)，以及与包含V1144的肽相关的氧化水平的％变化。
图5显示了：(A)野生型BoNT/A CLD1040以及BoNT/A M1144V和BoNT/A M1144L的SV2c结合“on”速率(单因素ANOVA：P＝0.0005(***)，P<0.0001(****))；和(B)野生型BoNT/ACLD1040以及BoNT/A M1144V和BoNT/A M1144L的SV2c结合“off”速率(单因素ANOVA：P<0.0001(****))。
序列表
SEQ ID NO:1-(BoNT/A1核酸序列)
SEQ ID NO:2-(BoNT/A1多肽序列)
SEQ ID NO:3-(修饰的BoNT/A1(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:4-(修饰的BoNT/A1(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:5-(修饰的BoNT/A1(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:6-(修饰的BoNT/A1(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:7-(修饰的BoNT/A1(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:8-(修饰的BoNT/A1(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:9-(修饰的BoNT/A1(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:10-(BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸序列)
SEQ ID NO:11-(BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)多肽序列)
SEQ ID NO:12-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:13-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:14-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:15-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:16-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:17-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:18-(修饰的BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144 Deletion)多肽序列)
SEQ ID NO:19-(BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸序列)
SEQ ID NO:20-(BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)多肽序列)
SEQ ID NO:21-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:22-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:23-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:24-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:25-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:26-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:27-(修饰的BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:28-(BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)核酸序列)
SEQ ID NO:29-(BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)多肽序列)
SEQ ID NO:30-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:31-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:32-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:33-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:34-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:35-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:36-(修饰的BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:37-(BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)核酸序列)
SEQ ID NO:38-(BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)多肽序列)
SEQ ID NO:39-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:40-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:41-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:42-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:43-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:44-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:45-(修饰的BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:46-(BoNT/A3多肽序列)
SEQ ID NO:47-(修饰的BoNT/A3(M1140V)多肽序列)
SEQ ID NO:48-(修饰的BoNT/A3(M1140G)多肽序列)
SEQ ID NO:49-(修饰的BoNT/A3(M1140L)多肽序列)
SEQ ID NO:50-(修饰的BoNT/A3(M1140T)多肽序列)
SEQ ID NO:51-(修饰的BoNT/A3(M1140A)多肽序列)
SEQ ID NO:52-(修饰的BoNT/A3(M1140I)多肽序列)
SEQ ID NO:53-(修饰的BoNT/A3(M1140缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:54-(BoNT/A4多肽序列)
SEQ ID NO:55-(修饰的BoNT/A4(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:56-(修饰的BoNT/A4(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:57-(修饰的BoNT/A4(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:58-(修饰的BoNT/A4(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:59-(修饰的BoNT/A4(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:60-(修饰的BoNT/A4(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:61-(修饰的BoNT/A4(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:62-(BoNT/A1 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:63-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:64-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:65-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:66-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:67-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:68-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:69-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144 Deletion)多肽序列)
SEQ ID NO:70-(BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K)多肽序列)
SEQ ID NO:71-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:72-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:73-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:74-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:75-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:76-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:77-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K、M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:78-(BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)多肽序列)
SEQ ID NO:79-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)多肽
SEQ ID NO:80-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:81-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:82-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:83-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:84-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:85-(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:86-(BoNT/A3 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:87-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:88-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:89-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:90-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:91-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:92-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:93-(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:94-(BoNT/A4 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:95-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:96-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:97-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:98-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:99-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:100-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:101-(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:102-(修饰的SV2结合结构域共有序列1)
SEQ ID NO:103-(BoNT/A1 Hall Str(参照)SV2结合结构域)
SEQ ID NO:104-(BoNT/A1 CDC297 SV2结合结构域)
SEQ ID NO:105-(BoNT/A3 Loch Maree SV2结合结构域)
SEQ ID NO:106-(BoNT/A4 SV2结合结构域)
SEQ ID NO:107-(修饰的SV2结合结构域共有序列2)
SEQ ID NO:108-(修饰的SV2结合结构域共有序列3)
SEQ ID NO:109-(修饰的SV2结合结构域共有序列4)
SEQ ID NO:110-(修饰的SV2结合结构域共有序列5)
SEQ ID NO:111-(修饰的SV2结合结构域共有序列6)
SEQ ID NO:112-(修饰的SV2结合结构域A)
SEQ ID NO:113-(修饰的SV2结合结构域B)
SEQ ID NO:114-(修饰的SV2结合结构域C)
SEQ ID NO:115-(修饰的SV2结合结构域D)
SEQ ID NO:116-(流感病毒血凝素)
SEQ ID NO:117-(基于亮氨酸的基序1)
SEQ ID NO:118-(基于亮氨酸的基序2)
SEQ ID NO:119-(基于亮氨酸的基序3)
SEQ ID NO:120-(基于亮氨酸的基序4)
SEQ ID NO:121-(基于酪氨酸的基序)
SEQ ID NO:122-(TEV切割位点)
SEQ ID NO:123-(凝血酶切割位点)
SEQ ID NO:124-(PreScission切割位点)
SEQ ID NO:125-(肠激酶切割位点)
SEQ ID NO:126-(因子Xa切割位点1)
SEQ ID NO:127-(因子Xa切割位点2)
SEQ ID NO:128-(BoNT/B的多肽序列-UniProt P10844)
SEQ ID NO:129-(BoNT/C的多肽序列-UniProt P18640)
SEQ ID NO:130-(BoNT/D的多肽序列-UniProt P19321)
SEQ ID NO:131-(BoNT/E的多肽序列-UniProt Q00496)
SEQ ID NO:132-(BoNT/F的多肽序列-UniProt A7GBG3)
SEQ ID NO:133-(BoNT/G的多肽序列-UniProt Q60393)
SEQ ID NO:134-(TeNT的多肽序列-UniProt P04958)
SEQ ID NO:135-(BoNT/X的多肽序列)
SEQ ID NO:136-(修饰的BoNT/A1(M1144V)核酸序列)
SEQ ID NO:137-(修饰的BoNT/A1(M1144G)核酸序列)
SEQ ID NO:138-(修饰的BoNT/A1(M1144L)核酸序列)
SEQ ID NO:139-(BoNT/A2的多肽序列-UniProt D3IV23)
SEQ ID NO:140-(BoNT/A5 v.1的多肽序列-UniProt C7BEA8)
SEQ ID NO:141-(BoNT/A5 v.2的多肽序列-UniProt C1IPK2)
SEQ ID NO:142-(BoNT/A6-ACW83608.1的多肽序列，登录#FJ981696)
SEQ ID NO:143-(BoNT/A7的多肽序列-GenBank：AFV13854.1，登录#Q954969.1)SEQ ID NO:144-(BoNT/A8的多肽序列-GenBank：AJA05787.1，登录#KM233166)
SEQ ID NO:1(BoNT/A1核酸序列)
/>
SEQ ID NO:2(BoNT/A1多肽序列)
/>
SEQ ID NO:3(修饰的BoNT/A1(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:4(修饰的BoNT/A1(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:5(修饰的BoNT/A1(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:6(修饰的BoNT/A1(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:7(修饰的BoNT/A1(M1144A)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:8(修饰的BoNT/A1(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:9(修饰的BoNT/A1(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:10(BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K)核
酸序列)
SEQ ID NO:11(BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K)多
肽序列)
SEQ ID NO:12(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:13(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:14(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:15(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:16(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:17(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144I)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:18(修饰的BoNT/A1(N886K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:19(BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K)核
酸序列)
/>
SEQ ID NO:20(BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K)多
肽序列)
/>
SEQ ID NO:21(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:22(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:23(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:24(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:25(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144A)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:26(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:27(修饰的BoNT/A1(N954K,N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,
Q1229K,M1144缺失)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:28(BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N1025K)核
酸序列)
SEQ ID NO:29(BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N1025K)多
肽序列)
SEQ ID NO:30(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:31(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:32(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:33(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:34(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:35(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144I)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:36(修饰的BoNT/A1(N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,
N1025K,M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:37(BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R)核酸序列)
/>
SEQ ID NO:38(BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R)多肽序列)
SEQ ID NO:39(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:40(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144G)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:41(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:42(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:43(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:44(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:45(修饰的BoNT/A1(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,
S1274R,T1277R,M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:46(BoNT/A3多肽序列)
SEQ ID NO:47(修饰的BoNT/A3(M1140V)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:48(修饰的BoNT/A3(M1140G)多肽序列)
SEQ ID NO:49(修饰的BoNT/A3(M1140L)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:50(修饰的BoNT/A3(M1140T)多肽序列)
SEQ ID NO:51(修饰的BoNT/A3(M1140A)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:52(修饰的BoNT/A3(M1140I)多肽序列)
SEQ ID NO:53(修饰的BoNT/A3(M1140缺失)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:54(BoNT/A4多肽序列)
SEQ ID NO:55(修饰的BoNT/A4(M1144V)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:56(修饰的BoNT/A4(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:57(修饰的BoNT/A4(M1144L)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:58(修饰的BoNT/A4(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:59(修饰的BoNT/A4(M1144A)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:60(修饰的BoNT/A4(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:61(修饰的BoNT/A4(M1144缺失)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:62(BoNT/A1 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:63(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:64(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:65(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:66(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:67(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:68(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:69(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:70(BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K)多肽序列)
SEQ ID NO:71(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:72(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:73(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:74(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:75(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:76(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:77(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(Q1229K,M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:78(BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,
N1243R,S1274R,T1277R)多肽序列)
SEQ ID NO:79(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144V)Polypeptide
SEQ ID NO:80(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:81(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:82(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:83(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:84(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:85(修饰的BoNT/A1 HCC结构域(N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,
N1242R,N1243R,S1274R,T1277R,M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:86(BoNT/A3 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:87(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:88(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:89(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:90(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:91(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:92(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:93(修饰的BoNT/A3 HCC结构域(M1144缺失)多肽序列)
SEQ ID NO:94(BoNT/A4 HCC结构域多肽序列)
SEQ ID NO:95(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144V)多肽序列)
SEQ ID NO:96(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144G)多肽序列)
SEQ ID NO:97(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144L)多肽序列)
SEQ ID NO:98(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144T)多肽序列)
SEQ ID NO:99(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144A)多肽序列)
SEQ ID NO:100(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144I)多肽序列)
SEQ ID NO:101(修饰的BoNT/A4 HCC结构域(M1144缺失)多肽序列)
/>
SEQ ID NO:102(修饰的SV2 Binding结构域共有序列1)
RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT,其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R。
SEQ ID NO:103(BoNT/A1 Hall Str(参照)SV2结合结构域)
RGSVMTTNIYLNSSLYRGT
SEQ ID NO:104(BoNT/A1 CDC297 SV2结合结构域)
RGNVMTTNIYLNSSLYMGT
SEQ ID NO:105(BoNT/A3 Loch Maree SV2结合结构域)
RGSVMTTNIYLNSTLYMGT
SEQ ID NO:106(BoNT/A4 SV2结合结构域)
RDNVMTTNIYLNSSLYMGT
SEQ ID NO:107(修饰的SV2结合结构域共有序列2)
RGSVXTTNIYLNSSLYRGT,其中X是抗氧化的氨基酸。
SEQ ID NO:108(修饰的SV2结合结构域共有序列3)
RGNVXTTNIYLNSSLYMGT,其中X是抗氧化的氨基酸。
SEQ ID NO:109(修饰的SV2结合结构域共有序列4)
RGSVXTTNIYLNSTLYMGT,其中X是抗氧化的氨基酸。
SEQ ID NO:110(修饰的SV2结合结构域共有序列5)
RDNVXTTNIYLNSSLYMGT,其中X是抗氧化的氨基酸。
SEQ ID NO:111(修饰的SV2结合结构域共有序列6)
RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT,wherein:X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R。
SEQ ID NO:112(修饰的SV2结合结构域A)
RGSVTTNIYLNSSLYRGT
SEQ ID NO:113(修饰的SV2结合结构域B)
RGNVTTNIYLNSSLYMGT
SEQ ID NO:114(修饰的SV2结合结构域C)
RGSVTTNIYLNSTLYMGT
SEQ ID NO:115(修饰的SV2结合结构域D)
RDNVTTNIYLNSSLYMGT
SEQ ID NO:116(流感病毒凝血素)
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG
SEQ ID NO:117(基于亮氨酸的基序1)
xDxxxLL,其中x是任何氨基酸。
SEQ ID NO:118(基于亮氨酸的基序2)
xExxxLL,其中x是任何氨基酸。
SEQ ID NO:119(基于亮氨酸的基序3)
xExxxIL,其中x是任何氨基酸。
SEQ ID NO:120(基于亮氨酸的基序4)
xExxxLM,其中x是任何氨基酸。
SEQ ID NO:121(基于酪氨酸的基序)
Y-x-x-Hy,其中Hy是疏水性氨基酸和其中x是任何氨基酸。
SEQ ID NO:122(TEV切割位点)
ENLYFQG
SEQ ID NO:123(凝血酶切割位点)
LVPRGS
SEQ ID NO:124(PreScission切割位点)
LEVLFQGP
SEQ ID NO:125(肠激酶切割位点)
DDDDK
SEQ ID NO:126(因子Xa切割位点1)
IEGR
SEQ ID NO:127(因子Xa切割位点2)
IDGR
SEQ ID NO:128(BoNT/B的多肽序列-UniProt P10844)
SEQ ID NO:129(BoNT/C的多肽序列-UniProt P18640)
SEQ ID NO:130(BoNT/D的多肽序列-UniProt P19321)
SEQ ID NO:131(BoNT/E的多肽序列-UniProt Q00496)
SEQ ID NO:132(BoNT/F的多肽序列-UniProt A7GBG3)
SEQ ID NO:133(BoNT/G的多肽序列-UniProt Q60393)
SEQ ID NO:134(TeNT的多肽序列-UniProt P04958)
SEQ ID NO:135(BoNT/X的多肽序列)
SEQ ID NO:136(修饰的BoNT/A1(M1144V)核酸序列)
/>
SEQ ID NO:137(修饰的BoNT/A1(M1144G)核酸序列)
/>
SEQ ID NO:138(修饰的BoNT/A1(M1144L)核酸序列)
/>
SEQ ID NO:139(BoNT/A2的多肽序列-UniProt D3IV23)
SEQ ID NO:140(BoNT/A5 v.1的多肽序列-UniProt C7BEA8)
SEQ ID NO:141(BoNT/A5 v.2的多肽序列-UniProt C1IPK2)
SEQ ID NO:142(BoNT/A6的多肽序列-ACW83608.1，登录#FJ981696)
SEQ ID NO:143(BoNT/A7的多肽序列-GenBank:AFV13854.1，登录#JQ954969.1)
/>
SEQ ID NO:144(BoNT/A8的多肽序列-GenBank:AJA05787.1，登录#KM233166)
实施例
材料&方法
强制氧化研究
通过使用0.5mL Amicon旋转柱交换缓冲液向BoNT分子施加强制氧化。用于氧化的缓冲液是20mM柠檬酸盐缓冲液pH5.0中的0.001％过氧化氢。缓冲液交换后，将样品在黑暗中孵育所需时间段长达72小时，然后通过添加过量的甲硫氨酸来淬灭氧化反应。使用LC MS肽作图来计算测试分子的氧化。通过添加100mM Tris pH7.6中的1M脲，使样品变性，然后分别通过添加DTT和碘乙酰胺来还原和乙酰化，然后将它们在黑暗中孵育30分钟。然后使用0.5mL Amicon旋转柱将样品缓冲液交换至100mM Tris pH7.6中的1M脲中用于消化。加入胰蛋白酶，然后将样品在37℃下孵育4小时来消化蛋白质。在偶联到acquity H-Class BioUPLC的Waters SYNAP G2-Si(Tof)质谱仪上进行LC MS。将10微升的等份试样注射至Acquity BEH C18柱1.7μm，2.1×150mm上并通过以0.2ml/min的流速的93分钟UPLC梯度进行分析。UPLC梯度显示于下表中，移动相A由水中的0.02％ TFA组成，而移动相B由乙腈中的0.02％ TFA组成。
| 时间 | ％A | ％B |
| 初始 | 100 | 0 |
| 2 | 100 | 0 |
| 5 | 95 | 5 |
| 29 | 80 | 20 |
| 34.5 | 79 | 21 |
| 38.5 | 76 | 24 |
| 73.5 | 65 | 35 |
| 77.5 | 10 | 90 |
| 78.5 | 5 | 95 |
| 80 | 95 | 5 |
| 82 | 5 | 95 |
| 83 | 100 | 0 |
| 93 | 100 | 0 |
使用MSE方法获取数据，所述方法包括在UNIFI软件上运行的低能量和高碰撞能量扫描。
基于细胞的活性测定
基于细胞的活性测定使用工程化的啮齿动物神经元克隆细胞系。添加毒素导致毒素靶标经由受体结合的内化、易位和蛋白水解切割。细胞系表达全长SNAP-25(BoNT/A的天然蛋白水解靶标)，在该测定中测量其切割。通过平行曲线测试，并通过比较测试样品的EC50与参照标准的EC50，测定了毒素样品相对于参照标准的效力。在第一天，将细胞分配到3个组织培养板的内孔中，并使其沉淀15-25分钟，然后在37℃下用5％CO2孵育1-1.5小时。然后将培养基从生长培养基更换成测定培养基并将细胞在37℃下用5％CO2孵育过夜。在第二天，将用于研究的样品在测定培养基中稀释并以所需浓度加入孔中，然后将平板在37℃下用5％CO2孵育72小时。在第五天，使用Tecan INFINITE M1000 PRO读板仪测量荧光。
计算机建模
使用Molecular Operating Environment可视化软件(MOE–Chemical ComputingGroup ULC)对BoNT/A晶体结构(3BTA.pdb)进行计算分析，以优先考虑M1144取代。突变体的平均结构性质由残基扫描模块产生的系综进行评估。评估了与野生型分子相比的表面积和亲水/疏水斑块的变化以及对3D确认和分子内相互作用的预测影响。优先考虑对野生型M1144的蛋白质结构和相互作用网络的破坏最小化的突变。
BoNT/A的突变
使用来自NEB的Q5试剂盒(E0554S)通过表达载体中M1144密码子的定点诱变来进行BoNT/A基因序列的突变(针对在大肠杆菌中表达对密码子进行了优化)。使用NEBaseChanger软件设计引物以将ATG(甲硫氨酸)密码子改变成GTG(缬氨酸)或CTG(亮氨酸)。使用所得引物通过PCR扩增质粒。然后用激酶/连接酶/DpnI混合物处理所得DNA，以连接扩增的DNA并消化质粒DNA模板。然后将反应混合物与化学感受态大肠杆菌混合并使用热休克在42℃下转化。使用LB琼脂平板上的抗生素选择选出了转化子。挑取克隆以接种过夜培养物。通过离心收集培养物并使用Wizard Plus SV Miniprep试剂盒(Promega)制备质粒DNA用于测序分析。通过Sanger测序证实了突变。所用的所有质粒含有启动子区域，其用于在lac操纵子控制下的目的基因，且这样的表达可以通过添加IPTG来诱导。
修饰的BoNT/A的表达、活化和纯化
用来自选定的细胞库接种并使用改良的terrific broth在选择抗生素的存在下在37℃下生长过夜的100mL培养物启动表达。然后将过夜培养物用于接种1L主培养物，随后在37℃下孵育直至达到0.5-1.0AU的OD600nm。达到所需OD600nm时，将温度降至16℃一小时。温度下降后，使用1mM IPTG诱导表达并使培养物生长20hr，然后通过离心收集。
将细胞以3mL/g湿细胞重重悬于50mM Tris pH8.0，200mM NaCl中并通过超声波处理(Misonix 3000超声波仪)在冰上裂解。通过添加硫酸铵(NH4)2SO4调节样品以加载捕获柱，且随后通过离心澄清，然后进行色谱步骤。使用疏水相互作用色谱(HIC)捕获靶蛋白，并通过硫酸铵梯度(1M-0M(NH4)2SO4)洗脱。通过SDS-PAGE分析级分并将含有BoNT的那些合并并调节，以用于使用阴离子交换色谱(AIEX)来立即纯化。将调节的样品加载至离子交换柱并通过从25mM至1M的递增氯化钠(NaCl)梯度洗脱。SDS-PAGE分析后，将含有BoNT的级分合并并使用Lys-C活化。添加0.5μg Lys-C/mg总蛋白并在2-8℃下进行活化18小时。然后通过添加NaCl调节样品，随后使用HIC进行最终的精制色谱步骤。将蛋白质通过递减NaCl梯度(3M-0M)进行洗脱。将含有活化的BoNT的级分合并并浓缩至0.5-1.0mg/mL，然后通过大小排阻色谱缓冲液交换至PBS pH7.2中，然后储存在-80℃。
实施例1肉毒神经毒素A(BoNT/A)的氧化
如上所述，通过暴露于氧化剂过氧化氢，向肉毒神经毒素A(BoNT/A)施加强制氧化。然后利用质谱来评估BoNT/A分子内的肽氧化水平和出于质量变化鉴定/评估的特定氧化位点。基于分析，鉴定了多个氧化的BoNT/A肽。
如上所描述，还在基于细胞的活性测定中测试了氧化的BoNT/A。发现了在对应于BoNT/A的1144位的甲硫氨酸(M1144)处氧化的肽的数量(图1和图2，“氧化”)和活性(图1和图2，“活性”)之间存在关联。换句话说，发现M1144处的氧化是BoNT/A活性的氧化依赖性丧失的主要原因。
M1144是存在于SV2c靶结合区的BoNT/A的HC结构域的C-末端部分(HCC结构域)的氨基酸。
实施例2 BoNT/A的建模改变
鉴于将M1144鉴定为氧化敏感性的候选者，在防止在该残基的氧化的尝试中在这个位点引入突变。使用现有的BoNT/A晶体结构进行了计算机建模以预测各种修饰的结构影响并对其进行评分。
基于建模，考虑了以下取代：M1144V(缬氨酸)、M1144G(甘氨酸)、M1144L(亮氨酸)、M1144T(苏氨酸)、M1144A(丙氨酸)和M1144I(异亮氨酸)。M1144V、M1144G和M1144L被列入决选，分别由于其较低的能量值以及对疏水性和亲水性表面的影响降低(相对于M1144T)，由于不存在大的侧链，由此确保了对相邻侧链的干扰较小(相对于M1144A)，且由于侧链位置破坏性较小(相对于M1144I)。
实施例3用缬氨酸取代M1144
如上所述进行了M1144突变成缬氨酸，以产生修饰的BoNT/A。将单链修饰的BoNT/A在大肠杆菌中表达并使用柱色谱纯化，然后使用Lys-C进行蛋白水解活化。图3显示了单链修饰的BoNT/A是高纯度水平(～100％，图3“-”)和Lys-C将BoNT/A切割成相应的双链形式(活化为～100％，图3“+”)。
将修饰的双链BoNT/A接受强制氧化(如上所述)并且经由基于细胞的测定来评估活性。图4显示了M1144V取代防止了1144位的氧化(参见“氧化”)。然而，令人惊讶地，修饰不仅防止了BoNT/A活性的氧化依赖性损失，而且还显著提高了BoNT/A的活性(参见图4，“活性”)。
实施例4用亮氨酸取代M1144
如上所述进行了将M1144突变成亮氨酸，以产生修饰的BoNT/A。如所述的，表达单链修饰的BoNT/A，纯化并活化。
实施例5 BoNT/A M1144V和M1144L的活性
将BoNT/A M1144L和M1144V与未修饰的BoNT/A在基于细胞活性的测定中进行比较。
测定了EC50(半最大有效浓度)并如下计算相对活性：
(未修饰的BoNT/A EC50/修饰的BoNT/A EC50)×100＝相对活性
将未修饰的BoNT/A的活性设定为100％。
表1.BoNT/A M1144V、M1144L和未修饰的BoNT/A的相对活性
| 分子 | 相对活性 |
| 未修饰的BoNT/A | 100％ |
| BoNT/A M1144V | 317％ |
| BoNT/A M1144L | 225％ |
上表显示了BoNT/A M1144V和M1144L基本上比未修饰的BoNT/A更有活性，即使在非氧化(或低氧化)条件下。
实施例6 BoNT/A M1144L和BoNT/A M1144V与SV2c的结合
在Biacore 8K(Cytica)上在25℃下进行了结合实验。使用的HBS-EP+(10mMHepes，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％v/v Tween20，pH7.4)作为运行缓冲液进行了固定。使用标准EDC/NHS胺偶联，将GST-SV2c与一系列S CM5传感器芯片(Cytiva)的Fc2偶联至～50谐振单位(Resonance Unit，RU)的密度。Fc1通过EDC/NHS空白固定，然后用1M乙醇胺(Cytiva)阻断。
对于动力学测量，将补充了0.1mg/ml BSA的HBS-EP+以30μl/min流速用作运行缓冲液。使用单循环方法，以包含500至7.8nM的1:1稀释系列注射肉毒毒素。在7个递增浓度下监测缔合200秒，然后是单个600秒解离。每个循环后，用60秒以10μl/min注射10mM甘氨酸pH1.5(Cytiva)将表面再生。
使用异源结合模型(Biacore Insight Evaluation软件)通过拟合双参照的结合曲线来确定结合亲和性和动力学。
将BoNT/A M1144L和BoNT/A M1144V的结合亲和力和动力学与CLD1040中表达的野生型BoNT/A(“BoNT/A CLD1040”)进行比较。结果呈现于下表中，以及图示于图5A和B中。
表2.异源结合模型KD1的缔合和解离速率(分别为ka和kd)和解离常数。
表3.异源结合模型KD2的缔合和解离速率(分别为ka和kd)和解离常数(KD)。
与野生型BoNT/A相比，在KD1和KD2中，BoNT/A M1144V对SV2c的亲和性呈现出统计学显著的增加。BoNT/A M1144L在KD1和KD2中对SV2c的亲和力呈现出甚至更大幅(统计学显著)的增加。
总之，所述增加的亲和性很可能是BoNT/A M1144V和M1144L提高的活性的基础作用机制。
实施例7用甘氨酸取代M1144
如上所述进行了M1144突变成甘氨酸，用于用缬氨酸取代M1144，以产生修饰的BoNT/A。如所述的，表达、纯化和活化单链修饰的BoNT/A。
实施例8 BoNT/A M1144L和BoNT/A M1144G在氧化和非氧化条件下的活性
如上所述，向BoNT/A M1144L和BoNT/A M1144G的制备物施加强制氧化，并在基于细胞的测定中测试其活性。与暴露于氧化条件前的BoNT/A M1144L或BoNT/A M1144G(分别地)相比，在氧化条件下72小时后的BoNT/A M1144L或BoNT/A M1144G的活性不存在统计上显著的差异。
以上说明书中提及的所有出版物按引用并入本文。所述本发明的方法和系统的没有脱离本发明的范围和精神的各种改变和变化将是本领域技术人员显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但应理解如所要求保护的本发明不应过度地限于这样的特定实施方案。实际上，是生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的所述用于进行本发明的方式的各种改变旨在包括在以下权利要求的范围内。
Claims (37)
1.包含肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的经修饰的梭菌神经毒素，其中所述HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了所述经修饰的梭菌神经毒素的抗氧化性。
2.用于生产经修饰的梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码根据权利要求1的经修饰的梭菌神经毒素的核酸，由此提供合成的核酸；或
(c)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(d)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生经修饰的梭菌神经毒素。
3.根据权利要求1的经修饰梭菌神经毒素或根据权利要求2的方法，其中氨基酸位置编号通过与SEQ ID NO:2比对来定义。
4.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中所述修饰是用抗氧化的氨基酸取代M1144。
5.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰的HCC结构域包含RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(SEQ ID NO:102)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R。
6.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰的HCC结构域包含RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(SEQ ID NO:102)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R，并且其中修饰的HCC结构域包含与SEQ ID NO:63-69、71-77、79-85、87-93或95-101任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。
7.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰是选自以下的修饰：M1144V、M1144G、M1144L、M1144T、M1144A和M1144I。
8.根据权利要求1-3任一项的修饰梭菌神经毒素或方法，其中所述修饰是M1144的缺失。
9.根据权利要求1-3或7任一项的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰的HCC结构域包含RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(SEQ ID NO:111)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R。
10.根据权利要求1-3或8-9任一项的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰的HCC结构域包含RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(SEQ ID NO:111)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R，和其中修饰的HCC结构域包含与SEQ ID NO:63-69、71-77、79-85、87-93或95-101任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。
11.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中BoNT/A HCC结构域是BoNT/A1 HCC结构域、BoNT/A3 HCC结构域或BoNT/A4 HCC结构域。
12.包含经修饰的BoNT/A1 HCC结构域、修饰的BoNT/A3 HCC结构域或修饰的BoNT/A4 HCC结构域的经修饰的梭菌神经毒素包含：
(a)RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(SEQ ID NO:102)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是抗氧化的氨基酸；X4是S或T；和X5是M或R；或
(b)RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(SEQ ID NO:111)，其中：X1是D或G；X2是S或N；X3是S或T；和X4是M或R。
13.根据权利要求1-5、7-9或11-12任一项的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中所述经修饰的梭菌神经毒素包含与SEQ ID NO:63-69、71-77、79-85、87-93或95-101任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。
14.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中经修饰的梭菌神经毒素包含与SEQ ID NO:63-69、71-77、79-85、87-93或95-101任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。
15.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中经修饰的梭菌神经毒素是修饰的BoNT/A1、修饰的BoNT/A3或修饰的BoNT/A4。
16.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中修饰的梭菌神经毒素是修饰的BoNT/A1，其进一步包含以下的一个或多个的修饰：ASN 886、ASN 905、GLN915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，优选地其中所述修饰选自：
(a)用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基；
(b)用不带电荷的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基；
(c)用碱性氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基；
(d)碱性氨基酸残基的插入；和
(e)酸性氨基酸残基的缺失。
17.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中经修饰的梭菌神经毒素包含与SEQ ID NO:3-9、12-18、21-27、30-36、39-45、47-53或55-61任一项具有至少70％序列同一性的多肽序列。
18.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中经修饰的梭菌神经毒素包含与SEQ ID NO:3-9、12-18、21-27、30-36、39-45、47-53或55-61任一项具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。
19.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中所述经修饰的梭菌神经毒素是单链经修饰的梭菌神经毒素。
20.根据权利要求1-18任一项的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中经修饰的梭菌神经毒素是包含由二硫键连接在一起的轻链和重链的双链经修饰梭菌神经毒。
21.根据之前任一项权利要求的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中所述经修饰的梭菌神经毒素未在轻链中包含一个或多个进一步的修饰(例如，与未修饰的轻链相比时)。
22.根据权利要求1-7或11-21任一项的经修饰的梭菌神经毒素或方法，其中取代是仅在M1144的取代。
23.一种用于选择抗氧化梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：
(a)鉴定梭菌神经毒素重链或其部分的可氧化氨基酸；
(b)产生其中所述的可氧化氨基酸残基已被修饰的经修饰的梭菌神经毒素；
(c)向修饰的梭菌神经毒素施加氧化条件；
(d)确定修饰的梭菌神经毒素的活性水平；
(e)将步骤(d)中确定的活性水平与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平进行比较，其中缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素已被施加氧化条件；和
(f)活性水平高于缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平时，选择该修饰的梭菌神经毒素；或
(g)活性水平与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平相同或低于缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素的活性水平时，丢弃该修饰的梭菌神经毒素。
24.根据权利要求23的方法，其中梭菌神经毒素重链的一部分包含(优选由其组成)易位结构域(HN结构域)或其部分或受体结合结构域(HC结构域)或其部分。
25.通过根据权利要求23或24的方法选择的经修饰的梭菌神经毒素，优选地其中所述经修饰的梭菌神经毒素是抗氧化的。
26.核酸，其包含编码根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素的核酸序列。
27.一种用于生产具有轻链和重链的单链经修饰的梭菌神经毒素的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达根据权利要求26的核酸，裂解宿主细胞以提供含有单链经修饰梭菌神经毒素的宿主细胞匀浆，并分离所述单链经修饰梭菌神经毒素。
28.一种活化经修饰的梭菌神经毒素的方法，所述方法包括提供通过根据权利要求27的方法可获得的单链经修饰的梭菌神经毒素，将所述单链经修饰的梭菌神经毒素与在位于轻链和重链之间的识别位点(切割位点)切割单链经修饰的梭菌神经毒素的蛋白酶接触，由此将单链经修饰的梭菌神经毒素转变成双链经修饰的梭菌神经毒素，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起。
29.一种通过根据权利要求28的方法可获得的双链经修饰的梭菌神经毒素。
30.药物组合物，其包含根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素或根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，以及药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。
31.一种根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素、根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，或根据权利要求30的药物组合物用于药物中。
32.根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素、根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，或根据权利要求30的药物组合物用于治疗选自以下的病症：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍、斜颈、眼运动的神经肌肉紊乱或病况、美容障碍、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvicsyndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛、头痛、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
33.一种治疗病症的方法，所述方法包括将根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素、根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，或根据权利要求30的药物组合物施用于受试者，其中所述病症选自：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍、斜颈、眼运动的神经肌肉紊乱或病况、美容障碍、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvic syndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛、头痛、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
34.根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素、根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，或根据权利要求30的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的病症：与不合需要的免疫分泌相关的病症、斜视(strabismus)、眼睑痉挛、斜视(squint)、肌张力障碍、斜颈、眼运动的神经肌肉紊乱或病况、美容障碍、作家痉挛、磨牙症、Wilson病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛，由于慢性多发性硬化症引起的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、男性意像(animus)、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、骨盆提肌综合征(levator pelvic syndrome)、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、盆底失弛缓综合征(anismus)、肢体痉挛、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗症、唾液过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛、头痛、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器病症、泌尿生殖神经系统疾病、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。
35.一种美容处理方法，所述方法包括将根据权利要求1、3-22或25任一项的经修饰的梭菌神经毒素、根据权利要求29的双链经修饰的梭菌神经毒素，或根据权利要求30的药物组合物施用于受试者。
36.根据权利要求32-35任一项的用于使用的经修饰的梭菌神经毒素、双链经修饰的梭菌神经毒素或药物组合物、方法或用途，其中美容障碍是选自以下的障碍：面部皱纹、眉间皱纹、眉沟、皮肤皱纹、鞘内皱纹(intrathecal line)、前额皱纹、兔子纹、微笑不规则、下巴不规则、颈阔肌条索(platysmal band)、木偶纹、唇纹、鱼尾纹、眉毛不规则、皱眉纹、忧虑纹、妊娠纹、伤口、事故、咬伤、手术，如眼睛、脸颊、鼻子、嘴唇、前额，和/或颈部等区域的轮廓缺陷，和/或受益于细胞/肌肉丧失能力的美容治疗应用。
37.一种用于提高梭菌神经毒素抗氧化性的方法，该方法包括：
(a)提供编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的第一核酸并修饰第一核酸以在被编码的HCC结构域的甲硫氨酸1144(M1144)处引入修饰，由此产生第二核酸，其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性；或
(b)合成编码根据权利要求1的经修饰的梭菌神经毒素的核酸，由此提供合成的核酸；或
(c)合成编码(至少)肉毒神经毒素A(BoNT/A)HCC结构域的核酸，其中HCC结构域包含甲硫氨酸1144(M1144)的修饰，并且其中与缺乏修饰的其他相同的梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高了经修饰的梭菌神经毒素对氧化的抗性，由此提供合成的核酸；和
(d)分别表达第二核酸或合成的核酸，由此产生经修饰的梭菌神经毒素。
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