CN117205235A - 一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂及其制备方法与应用,属于医药技术领域,阿克曼菌和F.PB1菌两种细菌的混合菌液与海藻酸钠混匀后,在挤压装置的作用下匀速滴入氯化钙溶液中形成海藻酸钙凝胶,进一步经过壳聚糖和阿拉伯胶的包裹形成三层结构的微胶囊细菌合剂,微胶囊对于小鼠强迫样行为有明显的改善作用,且有利于细菌菌液的保存和结肠释放。本发明提供了一种对于寻求益生菌对强迫症的治疗潜力方面提供了有力的理论依据和细菌菌液作为药物应用的实践方法,具有较高的社会意义及潜在的市场价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,尤其涉及一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂及其制备方法与应用。
背景技术
强迫症(Obsessive-compulsive disorder,OCD)是一种以反复出现侵入性强迫思维和强迫行为为主要临床特征的慢性、致残性的常见精神障碍,现已成为继抑郁症、酒精/药物滥用和社交恐惧症之后第四大常见的精神障碍疾病,影响了全球约1-4%的人口。强迫症的终生患病率为2-3%,不同性别、种族和社会经济阶层的患病率没有明显差异,大多数病例发病年龄在12-21岁之间,通常可持续数十年时间,每年所需的社会成本估计超过80亿美元。一旦患病程度严重,很难进行自我缓解,通常需要外界因素介入,才能缓解自身症状。
针对儿童和青少年强迫症患者,英国国家健康和保健医学研究中心(Nationalinstitute for health and care excellence,NICE)推荐心理治疗为首选的治疗方式,包括认知行为疗法(Cognitive behavior therapy,CBT)和反应预防暴露法(Exposure withresponse prevention,ERP),该治疗是将强迫症患者反复暴露在可怕的刺激下,同时要求他们避免实施强迫行为。虽然心理疗法可以有效地减少强迫思维和强迫行为,但约有50%的患者由于缺乏动力和参与而对这种治疗产生抵触,因此常需要和药物配合治疗。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Serotonin-selective reuptake inhibitors,SSRIs)和5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors,SNRIs)是强迫症的一线治疗药物,90%以上的患者都需要长期服药。常见的SSRIs药物,如西酞普兰(Citalopram)、氟西汀(Fluoxetine)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、帕罗西汀(Paroxetine)和舍曲林(Sertraline),对强迫症的急性期和维持期均有治疗效果,药物疗效之间没有显著差异。临床实践通常将SSRIs联合CBT或ERP使用,以获得更好的疗效。即使如此,依然有40-60%的患者对药物治疗不敏感,需要其他深入治疗方式。神经调节是治疗强迫症的最后手段,通常采用电流刺激大脑区域,以达到纠正大脑异常电环路的目的,临床治疗证实可以改善强迫症患者的耶鲁-布朗强迫量表(Yale-Brown obsessive-compulsivescale,Y-BOCS)评分。尽管如此,依然有部分患者在经历各种治疗后有残余症状。因此,寻找其他替代疗法显得尤为重要。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提出了一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂及其制备方法与应用。
为实现上述目的,本发明提供了一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂,其为核壳结构,外层为阿拉伯胶,中间层为壳聚糖,内层为细菌合剂和海藻酸钠混合溶液;
所述细菌合剂中的细菌为阿克曼菌和F.PB1菌。
一种所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:收集生长至平台期的阿克曼菌液和F.PB1菌液,分别离心,弃上清,用无菌PBS重悬菌体,分别离心,弃上清,重复洗涤三次后混合,然后用含25%甘油的无菌PBS重悬菌体,调节菌液OD600为1.2;
步骤2:取2~10mL步骤1所述菌液,按1:1的体积比加入海藻酸钠溶液中,磁力搅拌,得到溶液;
步骤3:将步骤2所述溶液匀速挤压进0.1M CaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶,使凝胶在4℃下硬化1h,并去除上清液,用氯化钠溶液洗涤所述海藻酸钙凝胶;
步骤4:将所述海藻酸钙凝胶浸入壳聚糖水溶液中,搅拌均匀,得到海藻酸钙/壳聚糖凝胶,用NaCl溶液洗涤所述海藻酸钙/壳聚糖凝胶,静置;
步骤5:将步骤4所述海藻酸钙/壳聚糖凝胶浸于1wt%阿拉伯胶溶液中,搅拌涂覆30min,过滤回收得到改善强迫行为的微胶囊细菌合剂。
阿克曼菌和F.PB1菌两种细菌的混合菌液(以下简称为A+F混合菌液)与海藻酸钠混匀后,在挤压装置的作用下匀速滴入氯化钙溶液中形成海藻酸钙凝胶,进一步经过壳聚糖和阿拉伯胶的包裹形成三层结构的微胶囊细菌合剂,微胶囊对于小鼠强迫样行为有明显的改善作用,且有利于细菌菌液的保存和结肠释放。
优选地,所述阿克曼菌液、F.PB1菌液和A+F混合菌液的有效剂量均为200μL,且所述阿克曼菌液、F.PB1菌液、和A+F混合菌液的混合菌液的浓度均控制在1.2×109CFU。
优选地,步骤1中,两次离心时,温度均为4℃,转速均为4000rpm,时间均为10min。
优选地,步骤2中,磁力搅拌的时间为30~60min,转速为200转/分。
优选地,所述改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,具体包括以下步骤:
步骤1:收集生长至平台期的阿克曼菌液和F.PB1菌液,分别用冷冻离心机4℃,4000rpm离心10min,弃上清,在厌氧培养箱中用无菌PBS重悬菌体,4℃,4000rpm离心10min,弃上清,重复洗涤三次后混合,然后用含25%(体积分数)甘油的无菌PBS重悬菌体,调节菌液OD600为1.2,置于-80℃保存备用;
步骤2:取2~10mL步骤1所述菌液,按1:1的体积比加入浓度为2wt%的海藻酸钠溶液中,磁力搅拌30~60min,转速为200转/分,得到溶液;
步骤3:将步骤2所述溶液通过压力泵和芯片连接并接入挤压装置,匀速挤压进0.1MCaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶,喷嘴底部与CaCl2溶液表面之间的距离为3cm,使凝胶在4℃下硬化1h,并去除上清液,用高压灭菌后的0.85wt%氯化钠(NaCl)溶液洗涤海藻酸钙凝胶两次;
步骤4:制备0.4wt%的壳聚糖水溶液:将0.4g壳聚糖溶解于90mL蒸馏水和0.4mL冰醋酸中,用NaOH将pH调节至6.0,用超纯水将总体积调节至100mL,将溶液进行高压灭菌并过滤,以除去未完全溶解的固体,得到0.4wt%的壳聚糖水溶液。将步骤3所述海藻酸钙凝胶浸入上述壳聚糖水溶液中,搅拌10min,得到海藻酸钙/壳聚糖凝胶(Al/Chi凝胶),用灭菌的0.85wt%NaCl溶液漂洗Al/Chi凝胶两次,并在4℃下静置1h;
步骤5:将步骤4所述Al/Chi凝胶浸于1wt%阿拉伯胶溶液中,搅拌涂覆30min,过滤回收得到改善强迫行为的微胶囊细菌合剂(其为细菌合剂/海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层微胶囊结构)。
所述改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在制备治疗强迫症药物中的应用。
优选地,所述强迫症包括但不限于肠道免疫功能障碍引起的强迫症。
优选地,所述药物的剂型包括药剂学上可接受的任意一种剂型。
优选地,所述药物的制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂中的任一种。
优选地,所述改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的给药方式为灌胃给药。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和技术效果:
1)本申请提供阿克曼菌和F.PB1菌的一种新用途,用于制备治疗强迫症的微胶囊细菌制剂,其通过平衡肠道微生态,调节神经递质的多巴胺(DA)的合成以及肠道屏障功能紊乱,进而大大缓解与强迫症相关的异常心理行为状态。本发明验证了阿克曼菌和F.PB1菌混合制成的微胶囊细菌合剂通过改善神经递质DA的分泌与Th的表达,进而改善强迫症的相关症状。
2)本申请选取8周龄、体重20-22g的C57BL/6J健康雄鼠采用颈背皮下注射1mg/kgQNP,每三天定时注射一次,对照组则给予等量生理盐水,共注射10次,构建亚慢性强迫行为动物模型。分别灌胃PBS、阿克曼菌、F.PB1菌和A+F混合菌液14天后,观察A+F混合菌液组其强迫样行为及焦虑行为相比其他组有最显著的改善,神经递质多巴胺的合成也明显上调,对A+F混合菌液进行微胶囊包装后,观察到以上效果有更明显的作用。根据以上实验结果,推测阿克曼菌和F.PB1菌制成的微胶囊细菌合剂可能通过调节多巴胺的合成缓解强迫症症状。本发明对于寻求益生菌对强迫症的治疗潜力方面提供了有力的理论依据,具有较高的社会意义及潜在的市场价值。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的结构示意图;
图2为本发明显微镜下图像;
图3为本发明阿克曼菌和F.PB1混合菌液干预QNP诱导模型小鼠的强迫行为学结果,A为旷场实验,B为旷场实验轨迹图,C为高架十字迷宫实验,D为高架十字迷宫实验轨迹图,E为弹珠掩埋实验,F为Y迷宫实验;
图4为本发明微胶囊阿克曼菌和F.PB1混合菌液干预QNP诱导模型小鼠的强迫行为学结果,A为旷场实验,B为旷场实验轨迹图,C为高架十字迷宫实验,D为高架十字迷宫实验轨迹图,E为弹珠掩埋实验,F为Y迷宫实验;
图5为本发明阿克曼菌和F.PB1混合菌液干预对模型小鼠皮层神经递质DA合成的影响,A为检测Th蛋白在小鼠皮层表达的Western Blot实验,B为检测Th基因在小鼠皮层表达的qPCR实验,C为检测小鼠皮层中DA含量的高效液相色谱法实验;
图6为本发明微胶囊阿克曼菌和F.PB1混合菌液干预对模型小鼠皮层神经递质DA合成的影响,A为检测Th蛋白在小鼠皮层表达的Western Blot实验,B为检测Th基因在小鼠皮层表达的qPCR实验,C为检测小鼠皮层中DA含量的高效液相色谱法实验;
图7为改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在模拟胃液中的存活率;
图8为改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在模拟肠液中的存活率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明实施例中的阿克曼菌的保藏号为ATCC BAA-835,购自美国菌种保藏中心;,F.PB1菌的保藏号为JCM 30274,购自日本理化研究所生物资源中心。
本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明实施例中Akk组和F.PB1组的菌均生长至平台期。
本发明实施例中PBS磷酸盐缓冲液(干粉)购自biosharp公司,浓度为0.01M。
实施例1
一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法:
步骤1:收集生长至平台期的阿克曼菌液和F.PB1菌液,分别用冷冻离心机4℃,4000rpm离心10min,弃上清,在厌氧培养箱中用无菌PBS重悬菌体,4℃,4000rpm离心10min,弃上清,重复洗涤三次后混合,然后用含25%(体积分数)甘油的无菌PBS重悬菌体,调节菌液OD600为1.2,置于-80℃保存备用;
步骤2:取6mL步骤1所述菌液,按1:1的体积比加入浓度为2wt%的海藻酸钠溶液中,磁力搅拌45min,转速为200转/分,得到溶液;
步骤3:将步骤2所述溶液通过压力泵和芯片连接并接入挤压装置,匀速挤压进0.1MCaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶,喷嘴底部与CaCl2溶液表面之间的距离为3cm,使凝胶在4℃下硬化1h,并去除上清液,用高压灭菌后的0.85wt%NaCl溶液洗涤海藻酸钙凝胶两次;
步骤4:制备0.4wt%的壳聚糖水溶液:将0.4g壳聚糖溶解于90mL蒸馏水和0.4mL冰醋酸中,用NaOH将pH调节至6.0,用超纯水将总体积调节至100mL,将溶液进行高压灭菌并过滤,以除去未完全溶解的固体,得到0.4wt%的壳聚糖水溶液。将步骤3所述海藻酸钙凝胶浸入上述壳聚糖水溶液中,搅拌10min,得到Al/Chi凝胶,用灭菌的0.85wt%NaCl溶液漂洗Al/Chi凝胶两次,并在4℃下静置1h;
步骤5:将步骤4所述Al/Chi凝胶浸于1wt%阿拉伯胶溶液中,搅拌涂覆30min,过滤回收得到改善强迫行为的微胶囊细菌合剂,微胶囊细菌合剂的结构示意图见图1,显微镜下图像见图2,其为细菌合剂/海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层微胶囊结构(外层为阿拉伯胶,中间层为壳聚糖,内层为细菌合剂和海藻酸钠混合溶液)。
一种改善强迫行为的微胶囊PBS的制备方法:
步骤1:取6mL含25%(体积分数)甘油的无菌PBS,按1:1的体积比加入浓度为2wt%的海藻酸钠溶液中,磁力搅拌45min,转速为200转/分,得到溶液;
步骤2:将步骤1所述溶液通过压力泵和芯片连接并接入挤压装置,匀速挤压进0.1MCaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶,喷嘴底部与CaCl2溶液表面之间的距离为3cm,使凝胶在4℃下硬化1h,并去除上清液,用高压灭菌后的0.85wt%NaCl溶液洗涤海藻酸钙凝胶两次;
步骤3:制备0.4wt%的壳聚糖水溶液:将0.4g壳聚糖溶解于90mL蒸馏水和0.4mL冰醋酸中,用NaOH将pH调节至6.0,用超纯水将总体积调节至100mL,将溶液进行高压灭菌并过滤,以除去未完全溶解的固体,得到0.4wt%的壳聚糖水溶液。将步骤2所述海藻酸钙凝胶浸入上述壳聚糖水溶液中,搅拌10min,得到Al/Chi凝胶,用灭菌的0.85wt%NaCl溶液漂洗Al/Chi凝胶两次,并在4℃下静置1h;
步骤4:将步骤3所述Al/Chi凝胶浸于1wt%阿拉伯胶溶液中,搅拌涂覆30min,过滤回收得到微胶囊PBS合剂。
实施例2改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的性能实验
所选用的实验动物为:
选取8周龄、体重20-22g的C57BL/6J健康雄鼠,室温保持在23±1℃,湿度保持在50±10%。光暗循环12小时,可随意获取清洁食物和水。
实验方法1:实验动物随机分为PBS组(PBS)、阿克曼菌组(Akk)、F.PB1菌组(F.PB1)、阿克曼菌和F.PB1菌混合菌液组(A+F)四组。其中,四组小鼠均注射10次喹匹罗(Quinpirole,QNP)用于构建强迫症模型,于建模后两周分别每天灌胃一次200μL PBS(PBS组)和浓度均为1.2×109CFU的200μL阿克曼菌液(Akk组)、200μL F.PB1菌液(F.PB1组)、200μL A+F混合菌液(A+F组)。每日给药时间为上午8:00-9:00,连续给予14d,第15天各组小鼠空腹12h,进行行为学实验;第16天,各组小鼠空腹12h,眼眶取血,3000r/min离心,保留血清备用。取脑组织(皮层)和结肠用于Western blot法、qPCR法、HPLC法等检测。所有的图表和分析都是由GraphPad Prism 8.0完成,数据用平均值±标准误差(mean±S.E.M)表示,采用普通单向方差分析(Analysis of variance,ANOVA)和最小显著差异(Least significantdifference,LSD)多重检验评估差异有否统计学意义(P<0.05),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
实验方法2:实验动物随机分为PBS组(PBS)、微胶囊PBS组(MC-PBS)、A+F混合菌液组(A+F)、微胶囊A+F混合菌液组(MC-A+F)四组。其中,四组小鼠均注射10次喹匹罗(Quinpirole,QNP)用于构建强迫症模型,于建模后两周分别每天灌胃一次200μL或等量PBS、微胶囊PBS、A+F混合菌液、微胶囊A+F混合菌液(即实施例1制备的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂)。每日给药时间为上午8:00-9:00,连续给予14d,第15天各组小鼠空腹12h,进行行为学实验;第16天,各组小鼠空腹12h,眼眶取血,3000r/min离心,保留血清备用。取脑组织(皮层)和结肠用于Western blot法、qPCR法、HPLC法等检测。所有的图表和分析都是由GraphPad Prism 8.0完成,数据用平均值±标准误差(mean±S.E.M)表示,采用普通单向方差分析(Analysis of variance,ANOVA)和最小显著差异(Least significantdifference,LSD)多重检验评估差异有否统计学意义(P<0.05),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
(1)细菌菌液和微胶囊包装对QNP诱导模型小鼠的强迫行为的影响
对上述各组小鼠进行每日给药时间为上午8:00-9:00,连续给予14d,第15d各组小鼠空腹12h,进行行为学实验,具体方法为:
①弹珠掩埋实验
弹珠掩埋(Marble burying,MB)实验已被用于评价动物的强迫样行为,实验遵循Deacon等描述的协议进行。简言之,准备一个长宽高为40×24×16cm的干净笼盒,笼盒底部铺有5cm厚的木屑垫料,垫料表面放置有18颗直径为1.5cm的玻璃弹珠,按照6行×3列等距排列。将小鼠单独放置在笼盒中央,在昏暗的灯光条件下让小鼠不受干扰的自由探索笼盒,15min后取出小鼠,并计算掩埋深度超过2/3的弹珠数量。弹珠掩埋数量越多表明强迫掩埋行为越重,结果用弹珠掩埋数量的百分比表示。
②Y迷宫
啮齿类动物自发性交替行为的减少已被提出作为强迫症患者持续性症状的动物模型,该检测是根据先前报道的程序进行的。具体而言,在一个臂长30cm、宽8cm、高15cm的Y迷宫(Y maze)中,以其中一条臂为起始臂,将小鼠面向选择臂放于起始臂末端,小鼠可以自由选择进入左侧或右侧臂,被选择的臂记为目标臂,允许小鼠在目标臂内自由活动5min。然后将小鼠重新放入起始臂末端,观察小鼠是否进入目标臂,重复20次,记录小鼠进入目标臂的次数。目标臂进入次数越多表明强迫重复行为越多,结果用目标臂进入次数的百分比表示。
③旷场实验
过度检查是强迫症患者常见的、使人衰弱的症状,可用常见的旷场设施(Openfield,OF)模拟动物的强迫检查行为。将50×50cm的旷场划分为25个虚拟矩形区域的网格,但旷场表面没有任何实际的标记线,同时将四个4×4×4cm的物体固定在旷场表面:两个位于角落,两个位于靠近中央的地方。每只小鼠被单独放置在旷场的中央,并允许自由探索15min。使用摄像机跟踪系统自动跟踪小鼠的轨迹。当小鼠过度频繁且快速地访问其中1-2个物体时,则认为它们具有强迫检查行为。
④高架十字迷宫
强迫症患者通常共患有焦虑障碍,高架十字迷宫(Elevated plus maze,EPM)用于测试啮齿动物的焦虑相关行为。将EPM装置放在离地50cm、距墙1m的位置,其中闭臂长30cm、宽5cm、高15cm。将小鼠面向开臂放入EPM装置中,自由探索5min,使用摄像机跟踪系统自动跟踪每只动物的轨迹。开臂中的运动距离和持续时间以及进入开臂次数的减少反映了焦虑样行为。
以上行为学结果见图3和图4,在图3中相较于PBS组小鼠,AKK组、F.PB1组、A+F组小鼠均表现出明显的强迫掩埋行为、强迫重复行为、强迫检查行为和焦虑样行为减轻,且A+F组小鼠表现出最显著的差异,而上述其他行为学实验指标没有明显变化。表明阿克曼菌和F.PB1菌干预可以改善QNP诱导的模型小鼠强迫行为,A+F混合菌液能达到最明显效果。在图4中相较于PBS组小鼠,A+F组和MC-A+F组均表现出明显的强迫掩埋行为、强迫重复行为、强迫检查行为和焦虑样行为减轻,且MC-A+F组表现出更明显的差异,MC-PBS组与PBS组相比未交明显差异。表明微胶囊包装可以提高A+F混合菌液干预改善QNP诱导的模型小鼠强迫行为的能力,微胶囊PBS包装与PBS组相比对小鼠行为未见明显影响。
(2)细菌菌液和微胶囊包装干预对模型小鼠皮层神经递质DA合成的影响
实验方法1:实验动物随机分为PBS组(PBS)、阿克曼菌组(Akk)、F.PB1菌组(F.PB1)、阿克曼菌和F.PB1菌混合菌液组(A+F)四组。其中,四组小鼠均注射10次喹匹罗(Quinpirole,QNP)用于构建强迫症模型,于建模后两周分别每天灌胃一次200μL PBS、200μL阿克曼菌液、200μL F.PB1菌液、200μL A+F混合菌液。取小鼠脑组织(皮层)和结肠用于Western blot法、qPCR法、HPLC法进行检测。本实例用qPCR和Western blot实验检测小鼠皮层酪氨酸羟化酶(TH)的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测小鼠皮层神经递质多巴胺(DA)的含量。结果发现,与PBS组小鼠相比,AKK组、F.PB1组、A+F组小鼠大脑皮层TH的mRNA和蛋白水平均有增加,皮层DA含量升高,且A+F组表现出最明显的差异(图5)。
实验方法2:实验动物随机分为PBS组(PBS)、微胶囊PBS组(MC-PBS)、A+F混合菌液组(A+F)、微胶囊A+F混合菌液组(MC-A+F)四组。其中,四组小鼠均注射10次喹匹罗(Quinpirole,QNP)用于构建强迫症模型,于建模后两周分别每天灌胃一次200μL或等量PBS、微胶囊PBS、A+F混合菌液、微胶囊A+F混合菌液。取小鼠脑组织(皮层)和结肠用于Western blot法、qPCR法、HPLC法进行检测。用qPCR和Western blot实验检测小鼠皮层酪氨酸羟化酶(TH)的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测小鼠皮层神经递质多巴胺(DA)的含量。结果发现,与PBS组小鼠相比,A+F组、MC-A+F组小鼠大脑皮层TH的mRNA和蛋白水平均有增加,皮层DA含量升高,且MC-A+F组表现出更明显的差异,MC-PBS组与PBS组相比未见明显差异(图6)。
实施例3改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的体外耐受实验
收集生长至平台期的阿克曼菌液和F.PB1菌液,分别用冷冻离心机4℃,4000rpm离心10min,弃上清。在厌氧培养箱中用无菌PBS重悬菌体,4℃,4000rpm离心10min,弃上清,重复洗涤三次后混合。然后用含25%(体积分数)甘油的无菌PBS重悬菌体,调节菌液OD600为1.2,置于-80℃保存备用。
①益生菌微胶囊在模拟胃液中的耐受性
模拟人工胃液(SGF):取稀盐酸16.4mL,加水800mL,调pH到2.0,胃蛋白酶10g,搅匀后加水定容至1000mL即可。取0.5g微胶囊加入到模拟胃液(4.5mL)中,充分混匀15s,在37℃条件下,以200r/min在摇床中震荡处理30min、60min、90min、120min、150min,分别离心并取样,计算活菌数。并做对照试验。
②益生菌微胶囊在模拟肠液中的释放性
模拟人工肠液(SIF):磷酸二氢钾6.8g,加水500mL蒸馏水溶解,用0.4wt%的氢氧化钠调节pH至6.8;120℃灭菌20min;胰蛋白酶10g,加无菌水适量使溶解,将两液混合后,加水定容至1000mL。取0.5g改善强迫行为的微胶囊细菌合剂加入到模拟肠液(4.5mL)中,充分混匀15s,在37℃条件下,以200r/min在摇床中震荡处理30min、60min、90min、120min、150min,分别离心并取样,计算活菌数。
改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在模拟胃液中的存活率见图7,由图7可知在模拟人工胃液(SGF)中,游离A+F混合菌液30min内完全死亡,微胶囊A+F混合菌液在90min内仍保持存活。产生以上结果的原因在于微胶囊三层包装能有效抵御胃酸侵蚀,能在胃酸环境下最大程度保护混合菌液。
改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在模拟肠液中的存活率见图8,由图8可知在模拟人工肠液(SIF)中,游离A+F混合菌液随时间增加快速死亡,微胶囊A+F混合菌液在3h内仍保持存活。产生以上结果的原因在于微胶囊三层包装能有效减缓肠液与混合菌液的接触时间,提高混合菌液在模拟人工肠液中的生存能力。
本发明通过上述实验表明阿克曼菌和F.PB1菌具有缓解强迫症相关的强迫行为和焦虑样行为,这种效应可能是通过调节肠-脑轴中肠道屏障、脑部炎症因子、神经营养因子与神经递质功能相关发挥作用的,微胶囊包装可以提高以上效果,且有利于细菌菌液在结肠的释放。本发明提供了一种对于寻求益生菌对强迫症的治疗潜力方面提供了有力的理论依据和细菌菌液作为药物应用的实践方法,具有较高的社会意义及潜在的市场价值。
以上,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种改善强迫行为的微胶囊细菌合剂,其特征在于,其为核壳结构,外层为阿拉伯胶,中间层为壳聚糖,内层为细菌合剂和海藻酸钠混合溶液;
所述细菌合剂中的细菌为阿克曼菌和F.PB1菌。
2.一种权利要求1所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:收集生长至平台期的阿克曼菌液和F.PB1菌液,分别离心,弃上清,用无菌PBS重悬菌体,分别离心,弃上清,重复洗涤三次后混合,然后用含25%甘油的无菌PBS重悬菌体,调节菌液OD600为1.2;
步骤2:取2~10mL步骤1所述菌液,按1:1的体积比加入海藻酸钠溶液中,磁力搅拌,得到溶液;
步骤3:将步骤2所述溶液匀速挤压进0.1M CaCl2溶液中形成海藻酸钙凝胶,使凝胶在4℃下硬化1h,并去除上清液,用氯化钠溶液洗涤所述海藻酸钙凝胶;
步骤4:将所述海藻酸钙凝胶浸入壳聚糖水溶液中,搅拌均匀,得到海藻酸钙/壳聚糖凝胶,用NaCl溶液洗涤所述海藻酸钙/壳聚糖凝胶,静置;
步骤5:将步骤4所述海藻酸钙/壳聚糖凝胶浸于1wt%阿拉伯胶溶液中,搅拌涂覆30min,过滤回收得到改善强迫行为的微胶囊细菌合剂。
3.根据权利要求2所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,其特征在于,所述阿克曼菌液和F.PB1菌液的有效剂量为200μL,且所述阿克曼菌液和F.PB1菌液的混合菌液的浓度为1.2×109CFU。
4.根据权利要求2所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,其特征在于,步骤1中,两次离心时,温度均为4℃,转速均为4000rpm,时间均为10min。
5.根据权利要求2所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂的制备方法,其特征在于,步骤2中,磁力搅拌的时间为30~60min,转速为200转/分。
6.权利要求1所述的改善强迫行为的微胶囊细菌合剂在制备治疗强迫症药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述强迫症包括但不限于肠道免疫功能障碍引起的强迫症。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型包括药剂学上可接受的任意一种剂型。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物的制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂中的任一种。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,给药方式为灌胃给药。
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