CN117187389A - 定量检测kcnn3、rab3b、cadps2及azgp1转录水平的成套试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了定量检测KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的成套试剂及其应用。本发明通过对初诊多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平进行了分析，结合临床病程及生存资料，首次发现上述四个基因组合高转录水平是MM患者低无进展生存的危险因素。定量检测KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的成套试剂在评估多发性骨髓瘤患者预后风险中具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及定量检测KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的成套试剂及其应用，特别涉及定量检测KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的成套试剂及其在多发性骨髓瘤患者预后评估中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)是血液系统常见的恶性肿瘤，以克隆性浆细胞异常增殖并分泌大量异常的免疫球蛋白或其片段并导致继发的高钙血症、肾功能损害、贫血、骨病等一系列并发症为主要表现。近年来，新药及自体移植技术的迅速发展使MM的临床预后得以大幅度改善，但该病目前仍无法治愈，几乎所有患者复发和死亡的结局仍不可避免。重现性细胞遗传学及分子异常是MM发生发展的重要因素，探索新的异常分子转录水平谱对早期的复发预警及精准评估MM患者危险分层具有重要价值。然而，目前仍缺乏可简便、灵敏检测、复发预警及预后评估的分子靶标。
KCNN3(PotassiumCalcium-ActivatedChannelSubfamilyNMember3)位于染色体1q21.3，编码产物为离子通道蛋白，属于钾钙激活通道亚家族成员。
RAB3B是RAS癌基因家族成员(MemberRASoncogenefamily)，是介导哺乳动物细胞囊泡与靶膜融合及胞内囊泡运输的GTP酶，是囊泡运输的中枢调节因子。
CADPS2(CalciumDependentSecretionActivator2)基因编码钙依赖性分泌激活蛋白家族中的一个成员，作为钙结合蛋白具有调节神经元和神经内分泌细胞中突触和致密核心囊泡的胞外分泌的作用。
AZGP1(Alpha-2-Glycoprotein1)定位于人染色体7q22.1上，其编码的锌-α2-糖蛋白分泌在各种体液中，主要在乳腺、前列腺、肝脏和各种胃肠器官的上皮细胞中转录水平，积极参与许多人体的重要功能，包括受精、免疫调节和脂质动员等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种成套试剂。
本发明提供的成套试剂包括引物对A与探针A、引物对B与探针B、引物对C与探针C、引物对D与探针D；
所述引物对A由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对B由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对C由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对D由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述探针A为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
所述探针B为序列表中序列10所示的单链DNA分子；
所述探针C为序列表中序列11所示的单链DNA分子；
所述探针D为序列表中序列12所示的单链DNA分子。
进一步的，所述成套试剂还包括引物对E和探针E；所述引物对E由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；所述探针E为序列表中序列15所示的单链DNA分子。
更进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团。
在本发明的一个具体实施例中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ。
本发明的另一个目的是提供上述成套试剂的新用途。
本发明提供了上述成套试剂在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下K1)或K2)：
K1)评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险；
K2)评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间。
本发明还有一个目的是提供检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质的新用途。
本发明提供了检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品中的应用。
本发明还提供了检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品中的应用。
本发明最后一个目的是提供一种用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存时间的产品。
本发明提供的用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存时间的产品包括检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质。
进一步的，所述检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质可为检测骨髓单个核细胞中KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1基因编码的mRNA的转录水平的试剂和/或仪器。
再进一步的，所述转录水平为KCNN3、RAB3B、CADPS2或AZGP1基因参比内参基因的相对转录水平，具体可为KCNN3、RAB3B、CADPS2或AZGP1基因的转录水平与内参基因的转录水平之比。所述基因的转录水平和所述内参基因的转录水平均为根据CT值和标准曲线得到的拷贝数。
更进一步的，所述检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质可为上述成套试剂。
上述产品还可包含数据处理装置A；所述数据处理装置A内设模块；所述模块具有如下功能：根据多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1的相对转录水平评估多发性骨髓瘤患者的预后风险：低危组的多发性骨髓瘤患者的预后风险低于或候选低于中危组的多发性骨髓瘤患者；中危组的多发性骨髓瘤患者的预后风险低于或候选低于高危组的多发性骨髓瘤患者。
上述产品还可包含数据处理装置B；所述数据处理装置B内设模块；所述模块具有如下功能：根据多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1的相对转录水平评估多发性骨髓瘤患者的无进展生存时间：低危组的多发性骨髓瘤患者的无进展生存时间长于或候选长于中危组的多发性骨髓瘤患者；中危组的多发性骨髓瘤患者的无进展生存时间长于或候选长于高危组的多发性骨髓瘤患者。
上述低危组、中危组和高危组可按照如下方法判定：四个基因KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1的相对转录水平均为低转录组的多发性骨髓瘤患者为低危组的多发性骨髓瘤患者，四个基因KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1中存在任意1-2个基因的相对转录水平为高转录组的多发性骨髓瘤患者为中危组的多发性骨髓瘤患者，四个基因KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1中存在任意3-4个基因的相对转录水平为高转录组的多发性骨髓瘤患者为高危组的多发性骨髓瘤患者。
根据KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1相对转录水平确定其属于低转录组还是高转录组的方法如下：以由若干名未采取任何治疗措施的多发性骨髓瘤患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1的相对转录水平，然后按照所述相对转录水平由低到高的顺序将所述待测群体进行排列，对于KCNN3及RAB3B，将相对转录水平低的1/2所述待测群体作为低转录组，将其余1/2所述待测群体作为高转录组；对于AZGP1，将相对转录水平低的1/3所述待测群体作为低转录组，其余2/3所述待测群体作为高转录组；对于CADPS2，将相对转录水平低的3/4所述待测群体作为低转录组，将其余1/4所述待测群体作为高转录组。
上述产品还可包含数据处理装置C；所述数据处理装置C内设模块；所述模块具有如下功能：根据待测者骨髓单个核细胞中KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1的相对转录水平诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者：如果待测者骨髓单个核细胞中KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1的相对转录水平均大于健康对照者，则该待测者为或疑似为多发性骨髓瘤患者；否则该待测者不为或疑似不为多发性骨髓瘤患者。
上述任一所述应用或试剂盒中，所述KCNN3基因的核苷酸序列如序列表中序列16所示。
所述RAB3B基因的核苷酸序列如序列表中序列17所示。
所述CADPS2基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示。
所述AZGP1基因的核苷酸序列如序列表中序列19所示。
在本发明中，所述预后风险为初诊为多发性骨髓瘤患者预后风险。所述预后风险的高低具体可通过无进展生存时间长短体现。无进展生存时间越长，则预后风险越低。
上述任一所述应用或试剂盒中，所述多发性骨髓瘤为成人多发性骨髓瘤。
本发明通过对初诊多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平进行了分析，结合临床病程及生存资料，首次发现上述四个基因组合高转录水平是MM患者低无进展生存的危险因素。定量检测KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的成套试剂在评估多发性骨髓瘤患者预后风险中具有重要价值。
附图说明
图1为KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平与MM预后无进展生存率的关系。
图2为KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1四个基因联合对MM患者疾病进展判断效能的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的KCNN3基因的核苷酸序列如序列表中序列16所示。
本发明中的RAB3B基因的核苷酸序列如序列表中序列17所示。
本发明中的CADPS2基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示。
本发明中的AZGP1基因的核苷酸序列如序列表中序列19所示。
实施例1、KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1作为标记物在多发性骨髓瘤患者预后评估中的应用
一、研究对象与方法
1、研究对象
以于2014年1月至2016年12月期间收集自北京大学人民医院血液病研究所的145例初诊为多发性骨髓瘤患者的骨髓标本作为研究对象，145例多发性骨髓瘤患者包括男性92例，女性53例，中位年龄为60岁，年龄范围为36岁～87岁，对其随访直至死亡、失访或2019年8月。多发性骨髓瘤的诊断标准参考美国国立综合癌症网络(NCCN)的指南，分期按照Durie-Salmon(D-S)分期体系、国际分期体系(ISS)和修订的国际分期体系(R-ISS)进行。多发性骨髓瘤患者的治疗和疗效评判参照上述指南进行。无进展生存定义为从初次治疗开始至第一次发生疾病进展的时间，疾病进展为事件。
正常对照骨髓标本取自成人健康志愿者，共45份。
本研究方案经过北京大学人民医院伦理委员会批准。所有健康志愿者和患者均签署知情同意书。
2、骨髓单个核细胞提取与RT-qPCR
使用Ficoll淋巴细胞分离液与密度梯度离心法将骨髓标本中的单个核细胞分离出来，提取其中的RNA并将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，分别采用KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1引物对和相应探针进行RT-qPCR。以cDNA为模板，采用ABL1引物对和ABL1探针进行RT-qPCR。使用PCRMasterMix试剂盒配置如下10μLPCR反应体系：5μL1×UniversalPCRMasterMix；上游引物0.9μM，下游引物0.9μM，探针0.25μM；150-500ngcDNA，引物序列和荧光探针序列如表1所示。qPCR利用ABI7500FASTPCR扩增仪完成，反应条件如下：50℃2min，95℃10min，然后95℃15s，60℃1min进行40个循环。以ABL1为内参，以标准曲线法计算KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1与ABL1的拷贝数。系列稀释的转录水平ABL1的质粒(参见“GabertJ，BeillardE，vanderVeldenVH，BiW，GrimwadeD，PallisgaardN，etal.Standardizationandqualitycontrolstudiesof“real-time”quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionoffusiongenetranscriptsforresidualdiseasedetectioninleukemia—aEuro peAgainstCancerprogram.Leukemia.2003；17：2318-2357”一文中的“ABL1plasmid”)(106、105、104、103、102、101和100拷贝/μL)和KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1阳性的骨髓标本用来构建标准定量曲线。曲线阈值设置为0.082。通过样本内参基因ABL1及上述四个基因的扩增曲线及设定的阈值(0.082)得到其ABL1及相应目的基因的Ct值，再根据ABL1标准曲线(由于目的基因与ABL1扩增效率相近，为减少实验误差，均参照ABL1标准曲线计算)，得到样本ABL1及目的基因的拷贝数，以目的基因的拷贝数除以ABL1的拷贝数为样本相应目的基因的转录水平，为了与临床常规所发报告的形式一致，结果再乘以百分之百，以KCNN3为例，最终以KCNN3的拷贝数/ABL1的拷贝数×百分数＝样本KCNN3转录水平的形式呈现。
表1、KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1和ABL1引物与探针序列
| 序列号 | 序列名称 | 序列组成(5'-3') |
| 序列1 | KCNN3上游引物 | 5'-CAGCTCACCAAGCGGATCA-3’ |
| 序列2 | KCNN3下游引物 | 5'-TCACTTTGGCATGGTCAATCTT-3’ |
| 序列3 | RAB3B上游引物 | 5'-AGTCTACCGTCACGAGAAGCG-3’ |
| 序列4 | RAB3B下游引物 | 5'-CCACGGTAATAGGCTGTTGTGAT-3’ |
| 序列5 | CADPS2上游引物 | 5'-ACCCTACCCTGCTCCATTACAG-3’ |
| 序列6 | CADPS2下游引物 | 5'-CTCCTCAAATCTTTCTTTTTCTTCCA-3’ |
| 序列7 | AZGP1上游引物 | 5'-AGACCCTGAAAGACATCGTGGA-3’ |
| 序列8 | AZGP1下游引物 | 5'-GCTTCTGTTATTCTCGATCTCACAAC-3’ |
| 序列9 | KCNN3探针 | FAM-TGCTGCAGCCAATGTCCTTCGG-BHQ |
| 序列10 | RAB3B探针 | 5'-FAM-CCAGCTGTGTCCCAGATCTGCAGTTTC-BHQ-3’ |
| 序列11 | CADPS2探针 | 5'-FAM-CTCATGTGCACGGCAACAGGCC-3’ |
| 序列12 | AZGP1探针 | 5'-FAM-CAACGACAGTAACGGGTCTCACGTATTGC-BHQ-3’ |
| 序列13 | ABL1上游引物 | 5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’ |
| 序列14 | ABL1下游引物 | 5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’ |
| 序列15 | ABL1探针 | 5'-FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ-3’ |
3、统计分析
应用SPSS26.0、R软件4.2.1、GraphpadPrism8.0.2进行统计学分析。两组数据差异性的比较，分类变量数据采用卡方检验，连续变量数据采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。生存分析用Kaplan-Meier进行分析，应用log-rank检验，P＜0.05为具有统计学意义。受试者工作(receiver operating characteristic，ROC)曲线用来评价诊断指标的特异性和敏感性。
二、研究结果
1、KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1在多发性骨髓瘤中的转录水平
KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1在初诊多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的转录水平的中位数及范围分别为：301.06％(6.13％～15624.14％)、17.54％(0.01％～574.38％)、278.82％(0～3731.2％)、1.91％(0～3305.45％)，均显著高于健康供者对照[3.49％(0.44-14.37％)、0.50％(0.02～1.33％)、3.00％(0.27～17.33％)、0.08％(0～0.47％)；P均小于0.0001]。
2、KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平与多发性骨髓瘤患者预后的关系
1)先根据具有预后信息的118例多发性骨髓瘤患者的KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平按照如下方法确定其KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平的高低：分别将每个基因转录水平按照由低到高的顺序排列，对于KCNN3及RAB3B，将表达水平低的1/2所述待测群体作为低转录组，将其余1/2所述待测群体作为高转录组；对于AZGP1，将转录水平低的1/3所述待测群体作为低转录组，其余2/3所述待测群体作为高转录组；对于CADPS2，将转录水平低的3/4所述待测群体作为低转录组，将其余1/4所述待测群体作为高转录组。然后再根据每例患者KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1转录水平高低按照如下方法确定其属于低危组、中危组还是高危组：将四个基因转录水平均为低转录组的多发性骨髓瘤患者作为低危组，将四个基因中存在任意1-2个基因为高转录组的多发性骨髓瘤患者作为中危组，将四个基因中存在任意3-4个基因为高转录组的多发性骨髓瘤患者作为高危组。
最终根据KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1四个基因组合将患者分为不同的危险分层组：低危组(N＝12)、中危组(N＝64)及高危组(N＝42)。
2)通过Kaplan-Meier法对不同危险分层组患者进行生存分析，发现低危组(N＝12)、中危组(N＝64)及高危组(N＝42)患者的中位无进展生存时间分别为38.6、24.7和19.5个月，差异具有统计学意义(P＝0.042；图1)。
3、KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1联合预后效能分析
通过ROC曲线分析四个基因KCNN3、RAB3B、CADPS2及AZGP1的联合预后效能，相应ROC的曲线下面积为0.656(P＝0.011；图2)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.成套试剂，其包括引物对A与探针A、引物对B与探针B、引物对C与探针C、引物对D与探针D；
所述引物对A由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对B由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对C由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对D由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述探针A为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
所述探针B为序列表中序列10所示的单链DNA分子；
所述探针C为序列表中序列11所示的单链DNA分子；
所述探针D为序列表中序列12所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括引物对E和探针E；所述引物对E由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；所述探针E为序列表中序列15所示的单链DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光猝灭基团。
4.权利要求1-3任一所述的成套试剂在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品中的应用。
5.权利要求1-3任一所述的成套试剂在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品中的应用。
6.检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品中的应用。
7.检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品中的应用。
8.一种用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存时间的产品，其包括检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述检测KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1转录水平的物质为权利要求1-3任一所述的成套试剂。
10.KCNN3、RAB3B、CADPS2和AZGP1作为标记物在制备评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存时间的产品中的应用。
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