CN117180448A - 载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种载siRNA/NTCP‑Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，先将SIRT1‑siRNA加入液态氟碳制得载siRNA液态氟碳纳米粒；再与NTCP抗体结合，研制出一种新型、高效、靶向性强的载siRNA/NTCP‑Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒，该纳米粒与Huh7人肝癌细胞具有靶向结合能力，进一步通过RNA干扰作用于HBV复制中的mRNA环节，干扰和抑制感染HBV的Huh7人肝癌细胞内HBV复制。本发明的药物应用提供一种主动靶向的基因治疗方式，为彻底清除HBV的研究提供新的思路和方法，可为更高效、安全的抗HBV治疗手段提供新的策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是全球面临的重要公共卫生问题。
文献报道HBV病毒复制与肝癌等严重肝病的发生密切相关，抑制病毒滴度会延缓疾病进展，因此，治疗的关键措施是抗HBV治疗。
目前抗HBV治疗的药物主要有干扰素和核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues,NAs)两大类，干扰素仅对不到30％的患者有显著效果，且部分患者副反应明显，失代偿期肝病、严重心血管疾病、甲状腺疾病等患者禁用。自拉米夫定1999年上市以来，阿德福韦(adefovir)、恩替卡韦(entecavir)及替比夫定(telbivudine)相继在我国上市，NAs以其抑制病毒复制效果好，可选择的种类较多，毒副作用相对小及患者耐受性好，已广泛应用于慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化和HBV感染相关的肝癌患者的治疗中，通过持续的抗病毒治疗可维持HBV复制被抑制的状态，从而减轻肝细胞炎症坏死及纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化及肝癌的发生，使大部分接受治疗的患者获益。然而，NAs在抗病毒治疗过程中可能出现的病毒耐药问题明显降低了抗病毒治疗的疗效、使患者对治疗失去信心，影响患者的依从性，对患者的预后和病情转归产生不良影响。NAs在抗病毒治疗过程中可能出现的病毒耐药问题是目前临床面临的难题，且NAs的服药时间长，患者的经济负担较重，cccDNA的存在使得患者停药后易出现病毒学反跳、生化学突破，能实现临床或功能性治愈的患者极少，目前对于何时能停药尚无定论，长期的用药可能带来不良反应等，使抗HBV治疗的发展处于瓶颈阶段。
尽管目前已有多种治疗药物可以用于治疗乙肝，但仅有极少数能实现临床治愈。靶向纳米粒是指将药物或基因以纳米粒为载体的形式进行递送，逐渐被应用于临床多个领域，因纳米粒具有靶向性、可控性等特点，其治疗乙肝具有增强治疗效果、降低毒副作用等优势，在一定程度上可以实现精准给药、减少药物浪费、提高药物利用率和疗效等，从而降低治疗成本、减轻患者经济负担。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法。还提供一种载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制药用途。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)将磷脂聚乙二醇氨基、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、泊洛沙姆PF68和胆固醇混合并溶于氯仿，搅拌至生成透明溶液，去除有机溶剂，形成均一脂质薄膜，加入水水合得到半透明的乳光混悬液，再加入SIRT1-siRNA混合，用均质机分散，同时将液态氟碳按体积比1：8逐滴加入上述溶液中，之后用细胞破碎仪乳化，最后得到乳白色的乳剂；
(2)将乳剂置于冰浴条件下进行探针超声振荡，制得载siRNA液态氟碳纳米粒；
(3)通过链霉亲和素-生物素法链接：以碳化二亚胺作为偶联剂将链霉亲和素和载siRNA液态氟碳纳米粒结合，再加入生物素化的NTCP-Ab，使其与连接链霉亲和素的载siRNA液态氟碳纳米粒结合，得到载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，所述液态氟碳为全氟己烷和全氟戊烷体积比1：1比例的混合物。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，在步骤(1)中，按每5mg磷脂聚乙二醇氨基计，加入二棕榈酰磷脂酰胆碱5mg，二棕榈酰磷脂酰甘油50μl，泊洛沙姆PF682mg，胆固醇5mg，SIRT1-siRNA 10μl。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，均质机分散为8000r/min，5min-10min。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，去除有机溶剂为真空旋转蒸发去除有机溶剂。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，探针超声振荡以70W-100W的功率，时间10-30秒进行探针超声振荡，得到80-500nm左右粒径大小的载siRNA液态氟碳纳米粒。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，步骤(2)中每5mg碳化二亚胺加链霉亲和素10mg，载siRNA液态氟碳纳米粒2ml，再加入生物素化的NTCP-Ab20ug。
进一步，所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法中，所述SIRT1-siRNA的所述第一条链如SEQ ID No.1所示，第二条链如SEQ ID No.2所示。
进一步，以上序列的3’端垂悬有两个胸腺嘧啶残基(dTdT)。
2.上述任意项所述制备方法得到的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒也在本发明的保护范围中。
3.上述任意项所述制备方法、以及所制备得到的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒在制备乙型肝炎病毒药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明将NTCP抗体与载siRNA氟碳脂质纳米粒结合，研制出一种新型、高效、靶向性强的载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒，该纳米粒与Huh7人肝癌细胞具有靶向结合能力，进一步通过RNA干扰作用于HBV复制中的mRNA环节，干扰和抑制感染HBV的Huh7人肝癌细胞内HBV复制。同时，siRNA的靶向释放，可避免引起其他组织器官的不良反应，纳米粒上NTCP抗体与NTCP特异性结合，通过竞争抑制HBV与肝细胞膜的结合，也可发挥抑制HBV复制的作用。所制备得到的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒在制备乙型肝炎病毒药物中的应用，提供一种主动靶向的基因治疗方式，为彻底清除HBV的研究提供新的思路和方法，可为更高效、安全的抗HBV治疗手段提供新的策略。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为载siRNA液态氟碳纳米粒电镜图(10000倍)；
图2为载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒与Huh7-NTCP细胞结合光镜图(600倍)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、载siRNA液态氟碳纳米粒制备：将带氨基的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-NH2，磷脂聚乙二醇氨基)5mg、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)5mg、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)50μl、泊洛沙姆PF682mg(美国Avanti公司)、胆固醇5mg(CH,美国Sigma公司)混合并溶于氯仿(10-20ml)，磁力搅拌至生成透明溶液，再移液至50ml的圆底烧瓶，用旋转蒸发仪在50℃真空旋转蒸发去除有机溶剂，形成均一脂质薄膜，加入脱气水水合得到半透明的乳光混悬液，加入10μl SIRT1-siRNA(2μM)混合，然后在高速分散均质机上分散(8000r/min，5min)，同时将液态氟碳按体积比1：8逐滴加入上述溶液中，液态氟碳为全氟己烷(PFH)和全氟戊烷(PFP)体积比1：1比例的混合物，之后用细胞破碎仪乳化(80％Power，90s)，最后得到乳白色的乳剂。将乳剂置于冰浴条件下进行探针超声振荡，制得载siRNA液态氟碳纳米粒，以70W-100W的功率，时间10-30秒进行探针超声振荡，得到80-500nm左右粒径大小的载siRNA液态氟碳纳米粒。想进一步使纳米粒更均一，可通过脂质体挤压仪使纳米粒再挤压通过一定纳米孔径(100-400nm)的微孔滤膜，最后可得到100-300nm粒径均一的载siRNA液态氟碳纳米粒(高压均质)。图1为载siRNA液态氟碳纳米粒电镜图(10000倍)。
SIRT1-siRNA的序列如下：
正义链：5'-GGAUAGAGCCUCACAUGCA-3'，SEQ ID No.1；
反义链：5'-UGCAUGUGAGGCUCUAUCC-3'，SEQ ID No.2。
在以上序列的3’端垂悬有两个胸腺嘧啶(thymidine)残基(dTdT)，用于提高基因沉默效率(重庆莱博斯生物技术有限公司设计及合成)。
纳米粒理化性质的检测：采用光镜、电镜观察纳米粒外观形态、结构；通过马尔文粒径测量仪、电位测量仪及库尔特计数仪测定纳米粒平均粒径、表面电位及浓度；LBN6B型椎板式血流流变学测量仪测定其粘度；将纳米粒分别置于4℃、室温及37℃条件下，在12h、24h、48h、1周观察其基本特性变化，考察其稳定性。本发明不断根据检测所得的参数，优化纳米粒制作的配方和流程，最终得到上述可获得性质最佳的纳米粒的配方和制备参数。
2、载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒的制备：通过链霉亲和素-生物素法链接：以碳化二亚胺(EDC-NHS)5mg作为偶联剂将链霉亲和素10mg和载siRNA液态氟碳纳米粒2ml结合，再加入生物素化的NTCP-Ab 20ug，使其与连接链霉亲和素的载siRNA液态氟碳纳米粒结合，得到载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒。
实施例2
体外靶向研究：选择Huh7人肝癌细胞进行培养，加入制备非靶向和载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒，光镜下观察纳米粒与细胞靶向结合的情况，观察了靶向纳米粒与细胞的结合情况。图2显示为载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒与Huh7人肝癌细胞结合光镜图，结果显示靶向氟碳脂质纳米粒与细胞具有较好的结合。
载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒与Huh7人肝癌细胞结合后，进一步通过RNA干扰作用于HBV复制中的mRNA环节，通过RNA干扰、基因沉默，从而达到抑制HBV复制的目的。同时，siRNA的靶向释放，可避免引起其他组织器官的不良反应，纳米粒上NTCP抗体与NTCP特异性结合，通过竞争抑制HBV与肝细胞膜的结合，也可发挥抑制HBV复制的作用。所制备得到的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒在制备乙型肝炎病毒药物中的应用，提供一种主动靶向的基因治疗方式，本发明所提供的靶向载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒可成为一种传统抗HBV治疗的有力补充，提高临床治愈率，具有较好的经济效益和社会效益。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)将磷脂聚乙二醇氨基、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、泊洛沙姆PF68和胆固醇混合并溶于氯仿，搅拌至生成透明溶液，去除有机溶剂，形成均一脂质薄膜，加入水水合得到半透明的乳光混悬液，再加入SIRT1-siRNA混合，用均质机分散，同时将液态氟碳按体积比1：8逐滴加入上述溶液中，之后用细胞破碎仪乳化，最后得到乳白色的乳剂；
(2)将乳剂置于冰浴条件下进行探针超声振荡，制得载siRNA液态氟碳纳米粒；
(3)通过链霉亲和素-生物素法链接：以碳化二亚胺作为偶联剂将链霉亲和素和载siRNA液态氟碳纳米粒结合，再加入生物素化的NTCP-Ab，使其与连接链霉亲和素的载siRNA液态氟碳纳米粒结合，得到载siRNA/NTCP-Ab主动靶向氟碳脂质纳米粒。
2.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述液态氟碳为全氟己烷和全氟戊烷体积比1：1比例的混合物。
3.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，按每5mg磷脂聚乙二醇氨基计，加入二棕榈酰磷脂酰胆碱5mg，二棕榈酰磷脂酰甘油50μl，泊洛沙姆PF682mg，胆固醇5mg，SIRT1-siRNA10μl。
4.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，均质机分散为8000r/min，5min-10min。
5.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，去除有机溶剂为真空旋转蒸发去除有机溶剂。
6.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，探针超声振荡以70W-100W的功率，时间10-30秒进行探针超声振荡，得到80-500nm左右粒径大小的载siRNA液态氟碳纳米粒。
7.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中每5mg碳化二亚胺加链霉亲和素10mg，载siRNA液态氟碳纳米粒2ml，再加入生物素化的NTCP-Ab20ug。
8.根据权利要求1所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述SIRT1-siRNA的第一条链如SEQ ID No.1所示，第二条链如SEQ ID No.2所示。
9.由权利要求1-8任意项所述制备方法得到的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒。
10.权利要求1-8任意项所述的制备方法、权利要求9所述的载siRNA/NTCP-Ab氟碳脂质纳米粒在制备乙型肝炎病毒药物中的应用。
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