CN117159211A - 一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，选择大鼠后，使用与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管作为脱细胞血管移植物，将脱细胞血管移植物的一端修剪成第一斜面与大鼠颈动脉做端侧吻合，第一斜面与血管轴向之间的夹角为40°～50°，脱细胞血管移植物的另一端修剪成第二斜面与大鼠颈静脉做端侧吻合，第二斜面与血管轴向之间的夹角为25°～35°，使得脱细胞血管移植物形成拱形的血管桥。采用本发明的方法能获得开发可用性高、与临床特征相似性好、方便用于基础科研研究的脱细胞血管大鼠颈动脉‑颈静脉移植模型，有望被广泛应用于脱细胞血管移植物体内适应性过程的机制研究。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法。
背景技术
脱细胞血管应用于血透通路已有一定时间，目前的研究结果表明，脱细胞血管移植物面临着排斥反应、内膜增生、血管再通效果不理想的挑战。有限的证据表明，包括巨噬细胞在内的免疫细胞参与了移植物在体内的适应过程。脱细胞血管移植物具有独特的组织结构，其移植后内膜增生(或其他现象)的分子机制是否与动静脉瘘(AVF)、内膜损伤和动脉粥样硬化等其他病理情况下的分子机制一致，目前仍是未知数。
目前的研究主要集中在体外材料表征和使用大型动物的体内实验，当前使用脱细胞血管构建血透通路的动物模型主要是牛羊等大动物模型，这些大动物模型造模成本高，由于缺少足够多的适应种属的抗体和试剂，导致无法利用这些大动物模型进行机制方面的基础研究，也导致目前对于脱细胞血管构建血透通路后的再适应过程缺少机制方面的阐述，影响脱细胞血管移植物体内适应过程的潜在因素无法得到研究。
由于小动物的内部血管纤细、肌肉及神经复杂，因此构建小动物模型的难度较大。目前构建的小动物模型通常为脱细胞血管大鼠腹主动脉-下腔静脉移植模型，该模型分别在大鼠肾下腹主动脉腹侧和相邻平行处的下腔静脉做端侧吻合。但由于腹主动脉和下腔静脉紧紧相邻，之间仅隔膜性结缔组织，因腹主动脉和下腔动脉的血流干扰，该模型无法使用超声检测脱细胞血管移植物内部的血流特征，也就还是会影响到对脱细胞血管应用的研究。
因此，需要设计一种新的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，以解决背景技术中提出的当前使用脱细胞血管构建血透通路的动物模型主要是牛羊等大动物模型，这些大动物模型造模成本高，由于缺少足够多的适应种属的抗体和试剂，导致无法利用这些大动物模型进行机制方面的基础研究，也导致目前对于脱细胞血管构建血透通路后的再适应过程缺少机制方面的阐述，影响脱细胞血管移植物体内适应过程的潜在因素无法得到研究的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，选择大鼠后，使用与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管作为脱细胞血管移植物，
将脱细胞血管移植物的一端修剪成第一斜面与大鼠颈动脉做端侧吻合，第一斜面与血管轴向之间的夹角为40°～50°，脱细胞血管移植物的另一端修剪成第二斜面与大鼠颈静脉做端侧吻合，第二斜面与血管轴向之间的夹角为25°～35°，使得脱细胞血管移植物形成拱形的血管桥。
在一种具体的实施方式中，选择的大鼠为不小于9周龄的雄性SD大鼠。
在一种具体的实施方式中，所述与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管是指具备管腔结构且直径为大鼠的颈动脉直径的0.5～1.5倍的脱细胞生物组织。
在一种具体的实施方式中，所述与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管是指大鼠的脱细胞颈动脉或者大鼠的脱细胞颈静脉。
在一种具体的实施方式中，所述第一斜面与血管轴向之间的夹角为45°，第二斜面与血管轴向之间的夹角为30°。
在一种具体的实施方式中，包括以下步骤：
S1、麻醉大鼠；
S2、对大鼠颈部剃毛备皮；
S3、对备皮部位消毒；
S4、在颈部开一正中切口，并用显微解剖镊钝性逐层解剖皮下组织和脂肪组织；
S5、沿颈侧的搏动点继续使用显微解剖镊钝性逐层分离结缔组织，看到颈静脉后，再使用显微解剖镊将颈静脉周围的结缔组织游离开；
S6、结扎胸锁乳突肌两端，两侧结扎点之间的距离大于1.0cm，去除结扎后的胸锁乳突肌；
S7、去除胸锁乳突肌后，再使用显微解剖镊分离覆盖的肌肉与筋膜组织后，找到血管鞘，继续用显微解剖镊游离出一段颈动脉；
S8、结扎颈动脉远心端；
S9、先阻断颈动脉近心端血流，然后在颈动脉开纵行切口，采用间断缝合的方法将颈动脉与脱细胞血管移植物做端侧吻合；
S10、阻断颈静脉近心端和远心端血流，然后在颈静脉开纵行切口，采用间断缝合的方法将颈静脉与脱细胞血管移植物做端侧吻合；
S11、松开颈静脉两端的阻断，确认静脉血流通畅，且有血流逆向返流进入脱细胞血管移植物内，松开颈动脉近心端阻断，确认血流进入脱细胞血管移植物和颈静脉；
S12、放开所有阻断，确认血管搏动良好，颈静脉近心端膨大明显，吻合口无渗血，逐层缝合手术切口。
在一种具体的实施方式中，在步骤S4中，在颈部开的正中切口的尺寸为1.5～2.0cm；在步骤S9中，在颈动脉开的纵行切口的长度为1.5mm，缝合时间小于20分钟；在步骤S10中，在颈静脉开的纵行切口的长度为2mm，缝合时间小于25分钟。
在一种具体的实施方式中，在步骤S6中，使用3-0丝线结扎胸锁乳突肌两端；在步骤S8中，使用8-0无菌显微缝合线结扎颈动脉远端；在步骤S9和S10中，间断缝合时采用11-0无菌尼龙缝合线进行间断缝合，阻断血流时采用显微血管阻断钳阻断。
在一种具体的实施方式中，在步骤S4中，使用尖端直径为0.30mm的显微解剖镊钝性逐层解剖皮下组织和脂肪组织；在步骤S5中，先使用尖端直径为0.30mm的显微解剖镊钝性逐层分离结缔组织，再使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊将颈静脉周围的结缔组织游离开；在步骤S7中，使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊分离覆盖的肌肉、筋膜组织以及游离出一段颈动脉，游离出的颈动脉的长度在1.0cm以上。
在一种具体的实施方式中，在步骤S7中，找到血管鞘，游离颈动脉时，不能牵拉或损伤到与颈动脉相邻的迷走神经；在步骤S11中，松开颈动脉近心端阻断后，若动脉吻合口出血，则用显微血管阻断钳阻断颈动脉近心端2分钟用于止血。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，通过采用本发明的方法能获得开发可用性高、与临床特征相似性好、方便用于基础科研研究的脱细胞血管大鼠颈动脉-颈静脉移植模型，有望被广泛应用于脱细胞血管移植物体内适应性过程的机制研究。
本发明构建的脱细胞血管大鼠移植模型，具有造模成本低、有足够多的适应种属的抗体和试剂，方便进行机制方面的基础研究。
本发明构建的脱细胞血管大鼠移植模型利用脱细胞血管连接颈动脉和颈静脉，避免了将脱细胞血管设置在腹主动脉和下腔静脉之间导致的因血流干扰而无法使用超声检测脱细胞血管移植物内部的血流特征的情况。
本发明构建的脱细胞血管大鼠移植模型通过将脱细胞血管的一端修剪成第一斜面，使得端侧吻合时有利于术后动脉吻合口处血管形态的演变，且避免导致脱细胞血管移植物对原有颈动脉过度牵拉，也避免了造成缝合难度提高而影响缝合后的稳定性；通过将脱细胞血管的另一端修剪成第二斜面，避免导致脱细胞血管移植物对原有颈静脉的过度牵拉，使得血管吻合口及流出道静脉闭塞进而影响血液通过造成血栓，也避免造成缝合难度提高而不利于静脉吻合口远心端血管的血液回流；最合适斜面的修剪有利于造模成功率的提高，还有利于提高术后血管移植物的通畅率。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明一种实施例的拱形的血管桥的结构示意图。
其中，1、脱细胞血管移植物；2、颈动脉；3、颈静脉；箭头表示血流方向。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
1、研究对象
所有的实验都得到了中南大学湘雅二医院动物护理和使用委员会的批准。所有的实验都是按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行的。选择9周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠进行建模。由于年轻的SD大鼠的颈动脉和颈静脉的直径较小，手术时间不能过长。
2、仪器和试剂
手术显微镜(Leica Microsystems,cat.no.M125)，医用胶带(3M)，带齿镊子(FineScience Tools)，微型剪刀(Fine Science Tools)，微型弯钳(Fine Science Tools)，微型直钳(Fine Science Tools)，显微外科钳(上海金中、W40080)，异氟烷(RWD china)，小动物气体麻醉机(RWD china)，3-0丝线(Surgical Specialties)、8-0无菌显微缝合线(Surgical Specialties)，11-0无菌尼龙缝合线，黑色聚酰胺单丝不吸收针(ArosSurgical Instruments)，小动物超声仪，脱毛膏(Ardell Surgi-Cream)，Iodophor棉球，生理盐水。
3、手术过程步骤如下：
S1、SD大鼠使用异氟烷维持麻醉，并且持续监测生命体征
S2、使用电动剃毛刀和脱毛膏脱去大鼠颈部毛发，然后使用生理盐水清洗干净。
S3、使用碘伏棉球消毒脱毛部位后铺孔巾。
S4、先观察大鼠颈部脱毛部位，在气管两侧，胸乳突肌及锁骨斜方肌的交界处找到对称分布的两处搏动点，该部位深处即为颈静脉所在位置。在颈部开一1.5-2.0cm的正中切口，使用尖端直径为0.30mm的显微解剖镊钝性逐层解剖皮下组织和脂肪组织。
S5、找到颈右侧的搏动点，继续使用显微解剖镊钝性逐层分离结缔组织，直至看到深紫色血管的颈静脉3。再使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊将颈静脉3周围的结缔组织游离开。
S6、使用3-0丝线结扎一侧胸锁乳突肌两端，两端结扎点之间的距离尽可能长且至少1.0cm以上，以留出足够手术操作的区域。大鼠颈动脉位于胸锁乳突肌深处，去除一侧胸锁乳突肌更利于脱细胞血管移植物1的移植。结扎的目的是防止切断胸锁乳突肌后，肌肉内的微小血管渗血。
S7、去除胸锁乳突肌后，可见一处搏动强烈的血管。使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊稍分离该搏动点上覆盖的肌肉与筋膜组织后，可见一明显的血管鞘结构。血管鞘内有一粉红色且搏动强烈的血管，即为颈动脉2。与颈动脉2相邻分布有一根稍细的白色组织，为迷走神经。游离颈动脉2时不能牵拉或损伤到迷走神经，以防导致动物的死亡。继续用显微解剖镊游离出一段长度在1.0cm以上的颈动脉2。
S8、使用8-0无菌显微缝合线结扎颈动脉2远心端。
S9、使用显微血管阻断钳阻断颈动脉2近心端血流。颈动脉2做1.5mm纵行切口，脱细胞血管移植物1的一端修剪成第一斜面，第一斜面与血管轴向之间的夹角为45°，用11-0无菌尼龙缝合线采用间断缝合的方法将颈动脉2与脱细胞血管移植物1做端侧吻合，缝合8针，缝合时间为15分钟。
经过对比，脱细胞血管移植物1修剪成45°斜面后缝合有利于术后动脉吻合口处血管形态的演变。修剪角度过小，如与动脉端趋向于呈直角做端侧吻合，会导致脱细胞血管移植物对原有颈动脉的过度牵拉；修剪角度过大，会导致移植物断端斜面过大，缝合难度大大提高，且缝合后稳定性变差。因此，经过对比，修剪成45°角后缝合效率较高，模型成功率高，且不会对原有动脉形成过度牵拉，有利于提高术后血管移植物的通畅率。
S10、使用显微血管阻断钳阻断颈静脉3近心端和远心端血流。颈静脉3做2mm纵行切口，脱细胞血管移植物1的端部修剪成第二斜面，第二斜面与血管轴向之间的夹角为30°，用11-0无菌尼龙缝合线采用间断缝合的方法将颈静脉3与脱细胞血管移植物1做端侧吻合，缝合12针，缝合时间为20分钟。
模型构建后由于静脉流出道的扩张，静脉吻合口处血管解剖形态改变较大，如脱细胞血管修剪角度过小，如与静脉端趋向于呈直角做端侧吻合，移植物容易对血管造成牵拉，使得血管吻合口及流出道静脉闭塞，影响血液通过造成血栓；如脱细胞血管修剪角度过大，缝合难度大大提高，且不利于静脉吻合口远心端血管的血液回流。
S11、松开颈静脉3两端的血流，确认静脉血流通畅，且有少量血流逆向返流进入脱细胞血管内。松开颈动脉2近心端阻断，确认血流迅速充盈脱细胞血管和颈静脉。动脉吻合口通常有少许出血，再用显微血管阻断钳阻断颈动脉2近心端2分钟用于止血。
S12、最终放开所有阻断，确认血管搏动良好，颈静脉3近心端膨大明显，吻合口无渗血，逐层缝合手术切口。
采用本发明成功构建的脱细胞血管大鼠移植模型，经过实际验证，有的大鼠已经正常存活一年多了，且与正常大鼠的状态无区别。
并且经过实际验证，采用鸡身上合适直径的血管在脱细胞后也能适用于作为本发明的脱细胞血管移植物1，最终能成功构建脱细胞血管大鼠移植模型。
本发明中第一斜面和第二斜面的角度对模型构建成功率的影响相对更大。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，选择大鼠后，使用与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管作为脱细胞血管移植物，
将脱细胞血管移植物的一端修剪成第一斜面与大鼠颈动脉做端侧吻合，第一斜面与血管轴向之间的夹角为40°～50°，脱细胞血管移植物的另一端修剪成第二斜面与大鼠颈静脉做端侧吻合，第二斜面与血管轴向之间的夹角为25°～35°，使得脱细胞血管移植物形成拱形的血管桥。
2.根据权利要求1所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，选择的大鼠为不小于9周龄的雄性SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，所述与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管是指具备管腔结构且直径为大鼠的颈动脉直径的0.5～1.5倍的脱细胞生物组织。
4.根据权利要求3所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，所述与大鼠的颈动脉直径相近的脱细胞血管是指大鼠的脱细胞颈动脉或者大鼠的脱细胞颈静脉。
5.根据权利要求1所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，所述第一斜面与血管轴向之间的夹角为45°，第二斜面与血管轴向之间的夹角为30°。
6.根据权利要求1所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、麻醉大鼠；
S2、对大鼠颈部剃毛备皮；
S3、对备皮部位消毒；
S4、在颈部开一正中切口，并用显微解剖镊钝性逐层解剖皮下组织和脂肪组织；
S5、沿颈侧的搏动点继续使用显微解剖镊钝性逐层分离结缔组织，看到颈静脉后，再使用显微解剖镊将颈静脉周围的结缔组织游离开；
S6、结扎胸锁乳突肌两端，两侧结扎点之间的距离大于1.0cm，去除结扎后的胸锁乳突肌；
S7、去除胸锁乳突肌后，再使用显微解剖镊分离覆盖的肌肉与筋膜组织后，找到血管鞘，继续用显微解剖镊游离出一段颈动脉；
S8、结扎颈动脉远心端；
S9、先阻断颈动脉近心端血流，然后在颈动脉开纵行切口，采用间断缝合的方法将颈动脉与脱细胞血管移植物做端侧吻合；
S10、阻断颈静脉近心端和远心端血流，然后在颈静脉开纵行切口，采用间断缝合的方法将颈静脉与脱细胞血管移植物做端侧吻合；
S11、松开颈静脉两端的阻断，确认静脉血流通畅，且有血流逆向返流进入脱细胞血管移植物内，松开颈动脉近心端阻断，确认血流进入脱细胞血管移植物和颈静脉；
S12、放开所有阻断，确认血管搏动良好，颈静脉近心端膨大明显，吻合口无渗血，逐层缝合手术切口。
7.根据权利要求6所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，在颈部开的正中切口的尺寸为1.5～2.0cm；在步骤S9中，在颈动脉开的纵行切口的长度为1.5mm，缝合时间小于20分钟；在步骤S10中，在颈静脉开的纵行切口的长度为2mm，缝合时间小于25分钟。
8.根据权利要求6所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，在步骤S6中，使用3-0丝线结扎胸锁乳突肌两端；在步骤S8中，使用8-0无菌显微缝合线结扎颈动脉远端；在步骤S9和S10中，间断缝合时采用11-0无菌尼龙缝合线进行间断缝合，阻断血流时采用显微血管阻断钳阻断。
9.根据权利要求6所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，使用尖端直径为0.30mm的显微解剖镊钝性逐层解剖皮下组织和脂肪组织；在步骤S5中，先使用尖端直径为0.30mm的显微解剖镊钝性逐层分离结缔组织，再使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊将颈静脉周围的结缔组织游离开；在步骤S7中，使用尖端直径为0.15mm的显微解剖镊分离覆盖的肌肉、筋膜组织以及游离出一段颈动脉，游离出的颈动脉的长度在1.0cm以上。
10.根据权利要求6所述的脱细胞血管大鼠移植模型的构建方法，其特征在于，在步骤S7中，找到血管鞘，游离颈动脉时，不能牵拉或损伤到与颈动脉相邻的迷走神经；在步骤S11中，松开颈动脉近心端阻断后，若动脉吻合口出血，则用显微血管阻断钳阻断颈动脉近心端2分钟用于止血。
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