CN117120043A - 用于调控宿主防御机制稳态的标准化的生物类黄酮组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于建立和调控宿主防御机制的稳态的生物类黄酮组合物，并且其包含富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物。所考虑的组合物对于呼吸系统疾病和状况是有效的。

Description

用于调控宿主防御机制稳态的标准化的生物类黄酮组合物
本PCT专利申请要求于2020年7月30日提交且名称为“用于调控宿主防御机制稳态的标准化的生物类黄酮组合物(Standardized Bioflavonoid Compositions forRegulation of Homeostasis of Host Defense Mechanism)”的美国临时专利申请序列号：63/058698的优先权，所述美国临时专利申请为共同拥有的且通过引用以其整体并入本文。
背景技术
衰老，一种自然现象，是一种复杂的衰退过程，其随时间推移影响身体和精神功能两者，并且差的宿主防御应答是老年人中观察到最多的变化之一。理解老年人中出现的宿主防御应答下降的潜在机制是其减轻中关键的第一步。化学诱导的加速衰老模型，如D-半乳糖诱导的胸腺损伤和免疫衰老小鼠模型，是研究衰老对免疫系统的影响的优选选项之一。在化学诱导的动物衰老模型中，动物显示出模拟在老年人中频繁观察到的宿主防御应答下降的免疫衰老(Azman 2019)。D-半乳糖诱导的衰老模型是抗衰老研究中常用且充分验证的动物模型之一。虽然它在体内的正常浓度下转换为葡萄糖，但高浓度的D-半乳糖可以容易地转换为醛糖和氢过氧化物，导致氧衍生自由基的产生。它还可以与蛋白质和肽的游离胺反应，以通过非酶促糖基化产生晚期糖基化终产物(AGE)。该模型中的这些活性氧簇(ROS)的累积和增加的AGE将导致正常器官和宿主防御稳态的不平衡，其随后可以引起氧化应激、全身炎症、免疫应答降低、线粒体功能障碍和(例如胸腺细胞的)细胞凋亡，其最终加速衰老过程。这些变化为衰老和老化的天然存在的病理特性之一。
脓毒症代表危及生命的器官功能障碍，其由对于感染的宿主防御应答的失调引起，伴随器官衰竭的潜力。它是主要由巨噬细胞/单核细胞介导归因于几种早期细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6和γ干扰素以及晚期介质如HMGB1的过度产生的状态。高迁移率族框蛋白1(HMGB1)是核或胞质内源性损伤相关分子模式(DAMP)蛋白，其可以由于损伤性刺激或细胞因子而从细胞中释放或分泌。虽然核HMGB1是负责维持基因组完整性的结构性染色质结合因子，但从活化或损伤细胞中释放的细胞外HMGB1是响应诸如氧化性损伤和病原体感染等各种应激的炎症和免疫功能障碍的介质。HMGB1是脓毒症的关键介质，因为它响应内源性和外源性炎症信号而从激活的巨噬细胞和单核细胞中释放(Wang等人，1999)，这可以加剧宿主防御机制的不平衡并导致多器官衰竭和最终的死亡。存活的患者可以具有很可能由HMGB1延迟且持续的释放所驱动的持续的炎症应答(Gentile和Moldawer，2014)。
一旦从受刺激的单核细胞中主动释放以及从坏死细胞中被动释放，HMGB1就充当向邻近细胞提出细胞内稳态平衡丧失的警报素(alarmin)(危险信号)，作用于激活宿主免疫应答。它通过以下在先天免疫应答的激活中起关键作用：充当促进免疫细胞移动到感染部位的趋化因子，并充当DAMP，激活其它免疫细胞以分泌促炎细胞因子(Yang等人，2001)。当促炎细胞因子以低(最佳)水平产生时，它们将产生针对病毒或微生物入侵的保护功能；然而，如果它们如在‘细胞因子风暴’的情况下过度产生，则它们可能通过介导有害的炎症应答而变得对宿主有害。在大多数情况下，对于具有潜在状况例如免疫缺陷或免疫力低下的宿主以及在老年人中，这些炎症细胞因子风暴似乎引起急性全身炎症综合征；如果患者存活，则随后可能为延迟的炎症介导，其可以导致持续的炎症、免疫遏制和分解代谢应答。除了充当包括所有炎症细胞在内的多种细胞类型的化学引诱物外，HMGB1还引起炎症细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬细胞炎症蛋白(MIP)，提示了其通过激活NFκB信号传导来参与‘细胞因子风暴’(Bianchi和Manfredi，2007)。重要研究还已报告了，细胞外HMGB1可以触发促进脓毒症和急性肺损害进展的破坏性炎症应答(Entezari等人，2014)。与在内毒素刺激的数分钟内分泌的TNF-α和IL-1β形成对比，HMGB1在体外和体内均在几小时后分泌，指示了其晚期炎症介导。事实上，当HMGB1中和抗体在脓毒症发作后24小时进行施用时，它们提供了针对致死性内毒素血症的保护，指示了HMGB1作为致死性脓毒症的晚期介质的关键作用(Wang等人，1999)。在临床上，在持续高水平的HMGB1与处于脓毒症的晚期或死于脓毒症的受试者之间也已建立了强相关(Angus等人，2007)。最近，一些临床研究已显示了，氯喹及其类似物(羟氯喹)有益于COVID-19的临床功效和病毒清除(Andersson等人2020；Gao等人，2020；Gautret等人，2020)。在小鼠脓毒症模型中测试的抗疟疾药物氯喹预防致死性，其中保护效应通过抑制HMGB1从巨噬细胞、单核细胞和内皮细胞释放来介导，从而防止HMGB1细胞因子样活性和NF-κB活化的抑制(Yang等人，2013)。已报告了饮食抗氧化剂通过经由减少气道HMGB1的累积来增强巨噬细胞功能而具有高氧诱导的急性炎症性肺损害的显著减弱(Patel等人，2020)。因此，在本主题的主体中描述的含有游离B环类黄酮类和黄烷类(flavans)的天然生物类黄酮组合物具有确认的HMGB1和NF-κB抑制、脓毒症致死性的预防、AGE形成的抑制、内源性抗氧化酶的诱导、巨噬细胞吞噬作用的促进、增加细菌清除、急性肺损害的保护以及应用于维持和保护呼吸系统和肺健康的安全历史使用、病理状况的预防和治疗，所述病理状况例如由病毒、微生物感染(例如COVID-19)和PM2.5空气污染物、空气中的PM10颗粒、空气污染物、氧化性烟尘、来自烟草的烟雾、电子烟引起的肺损害。
通常被称为儿茶树(cutch tree)、Khair、Khadira的儿茶(Acacia catechuWilld)(豆科(Farbaceae))在印度和亚洲的其它地区被用作传统草药(Hazral等人，2017)。它是一种中等大小(至高15m)的落叶树。树皮为深灰褐色，以狭长条状剥落；叶羽状，在叶轴的基部具一对皮刺，花淡黄色，呈圆柱形穗状花序；豆荚无毛，扁平且长圆形。印度阿育吠陀药典(Ayurvedic Pharmacopoeia of India)将儿茶的心材描述为浅红色，随着年龄增长从棕红色变为近乎黑色；附接发白的边材；断面硬；无味，涩。收获约8年或更老的中等大小的树用于提取儿茶提取物。植物材料供应和植物鉴别是最初供应商资格认证的主要重点，因为儿茶(一种木材)、儿茶钩藤(Uncaria gambir)(一种藤本植物)和腰果种皮(坚果皮)的物理外观是非常不同的。儿茶在阿育吠陀医学中已被用于咽喉、口和牙龈，还被用于咳嗽和腹泻。外用时，它被用作止血剂以及作为对皮肤上的溃疡、疖和凹陷(reception)的冷却应用。粉末被用于伤口愈合治疗中。已发现儿茶增加动物脾中的抗体生产细胞的数目，指示了免疫系统的提高，巨噬细胞的吞噬作用增加，并且抑制促炎细胞因子的释放(Sunil等人，2019)。
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)(唇形科(Lamiaceae))，俗名中国黄苓(Chinese Skullcap)(黄芩(Huang Qin))，是如中国药典(Chinese Pharmacopeia)中指示的在亚洲几个国家中使用的传统草药。该植物是灌木状多年生植物，具有倾斜至直立的略带紫色的茎。叶长在短柄上，并且具有披针形、被毛、中等绿色的叶。具有深蓝色上唇和淡蓝色下唇的被毛花的总状花序从初夏到初秋开花。在春季或夏季期间，收集两岁龄的根且将其风干用于商业用途。基于中国药典，根外观为长8～25cm，直径1～3cm。它呈棕黄色或深黄色，外部具有稀疏根迹。上部粗糙，具有扭曲的纵向皱纹或不规则的网纹，下部具有纵纹和细皱纹。质地是硬而脆的，易折断，断面黄色，中央红棕色；老根的中央部分暗褐色或棕黑色，枯萎或空心。它具有轻微气味且味苦。干燥的根通常含有少于10％的生物类黄酮，如黄芩苷。被用于黄芩属(Scutellaria)提取物的根基于中国药典的鉴定和定量方法通过TLC和HPLC方法进行检查。
黄芩记载于来自东汉(大约公元200年或2200年前)的古典中医文献<神农本草(Shen Nong Ben Cao)>中。基于两个TCM数据库(世界传统医学专利数据库(WorldTraditional Medicine Patent Database)(WTM)和Saphron TCM数据库)的分析，用于治疗呼吸道感染的中药(TCM)中的前30名中草药的最近列表将黄芩(Radix Scutellaria)列为第二最常用中草药，具有在用于治疗呼吸道感染的所有TCM组合物中38％的频率(Ge等人，2010)。
在2003年SARS流行期间，黄芩被包括在由中国政府推荐的TCM组合物中。黄芩苷(Yuan等人，2009)和来自黄芩属植物的类黄酮(Zhong等人，2006)的使用后来获得了用于SARS和COVID-19治疗的专利(Song等人，2020)。黄芩的现代科学研究将生物类黄酮尤其是黄芩苷和黄芩素鉴定为这种中草药的生物活性组分(Béjar等人，2004)，具有与抗氧化、抗炎、过敏应答减少和抗菌活性有关的生物学功能(Shen等人，2021)。黄芩苷和黄芩素还显示出通过抑制病毒需要其来结合宿主细胞且从宿主细胞出芽的蛋白质的有力的抗病毒活性，所述活性对于感染是必需的(Yu等人，2011)。在感染甲型H1N1流感病毒(猪流感)的小鼠中，来自黄芩的提取物调节了其炎症应答以减少疾病严重程度，降低了肺组织损伤并最终增加了其存活率(Zhi等人，2019)。
类黄酮是一组广泛分布的天然产物。类黄酮的摄入已被证实与偶发性痴呆的风险呈负相关。作用机制虽然未知，但已被推测为是由于类黄酮的抗氧化效应(Commenges等人，2000)。多酚黄酮通过在mRNA水平下作用于包括cox-2、核因子κB(NFκB)和bcl-X(L)在内的基因而在转化的结肠细胞中诱导程序性细胞死亡、分化和生长抑制(Wenzel等人，2000)。已报告了B环上的羟基数目对于cox-2转录活性的遏制是重要的(Mutoh等人，2000)。
游离B环类黄酮是相对罕见的。在合成或从天然来源分离的总共9,396种类黄酮中，仅231种游离B环类黄酮是已知的。(The Combined Chemical Dictionary，Chapman和Hall/CRC，版本5:1，2001年6月)。已报告游离B环类黄酮具有多种生物活性。例如，高良姜素(3,5,7-三羟基黄酮)充当抗氧化剂和自由基清除剂，并且被认为是用于抗基因毒性和癌症化学预防的有希望的候选物(Heo等人，2001)。它是酪氨酸酶单酚酶的抑制剂(Kubo等人，2000)，兔心羰基还原酶的抑制剂(Imamura等人，2000)，具有抗微生物活性(Afolayan和Meyer 1997)和抗病毒活性(Meyer等人，1997)。黄芩素和其它两种游离B环类黄酮具有针对人乳腺癌细胞的抗增殖活性(So等人，1997)。
通常，类黄酮已基于其可用性随机测试了活性。偶尔地，要求已对于特异性生物活性强调在B环上的取代，例如与p-糖蛋白的高亲和力结合所需的B环取代(Boumendjel等人，2001)；强心效应(Itoigawa等人，1999)，针对亚油酸氢过氧化物诱导的毒性对内皮细胞的保护作用(Kaneko和Baba，1999)，COX-1抑制活性(Wang，2000)和前列腺素内过氧化物合酶(Kalkbrenner等人，1992)。仅少数出版物已提到了游离B环类黄酮的未取代B环的重要性。一个例子是抑制NADPH醌受体氧化还原酶的2-苯基黄酮作为潜在的抗凝血剂的用途(Chen等人，2001)。
所报告的与各种游离B环类黄酮的抗炎活性有关的作用机制一直存在争议。报告了黄芩的主要生物活性游离B环类黄酮减轻炎症细胞因子(Liao等人，2021)。已将游离B环类黄酮、白杨素(Liang等人，2001)、汉黄芩素(Chi等人，2001)和高良姜素(halangin)(Raso等人，2001)的抗炎活性与经由过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激活的诱导型环氧合酶和一氧化氮合酶的遏制以及对脱颗粒和AA释放的影响相关联(Tordera等人，1994)。已报告了千层纸素(oroxylin)、黄芩素和汉黄芩素抑制12-脂氧合酶活性而不影响环氧合酶(You等人1999)。更近些时候，汉黄芩素、黄芩苷和黄芩素的抗炎活性已被报告为通过抑制由一氧化氮抑制剂和脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和cox-2基因表达而发生(Chen等人，2001)。还已报告了，千层纸素经由NFκB激活的遏制而起作用(Chen等人，2001)。最后，据报告汉黄芩素抑制巨噬细胞中的诱导型PGE2产生(Wakabayashi和Yasui，2000)。
儿茶素是充分记录的生物活性类黄酮之一(Bae等人，2020)。儿茶素及其异构体表儿茶素抑制前列腺素内过氧化物合酶，具有40μmol/L的IC50值(Kalkbrenner等人，1992)。从以下四个植物物种中分离的五种黄烷-3-醇衍生物：萨摩亚油树(Atuna racemosa)、Syzygiumcarynocarpum、马六甲蒲桃(Syzygium malaccense)和Vantanea peruviana，包括(+)-儿茶素和没食子儿茶素，显示出相对于COX-1针对COX-2相等或更弱的抑制活性，具有范围为3.3μM至138μM的IC50值(Noreen等人，1998)。从吉贝(Ceiba pentandra)的树皮中分离的(+)-儿茶素抑制COX-1，具有80μM的IC50值(Noreen等人，1998)。商购可得的纯(+)-儿茶素抑制COX-1，取决于实验条件具有约183至279μM的IC50值，没有对于COX-2的选择性。(Noreen等人，1998)。
迄今为止，已从各种金合欢属(Acacia)物种中分离了大约330种化合物。黄烷，一类水溶性植物色素，是从金合欢属中分离的主要类别的化合物。已鉴定了大约180种不同的类黄酮，其中111种是黄烷。萜类化合物是从金合欢属物种中分离的第二大类化合物，其中已鉴定了48种化合物。从金合欢属中分离的其它类别的化合物包括生物碱(28)、氨基酸/肽(20)、单宁(16)、碳水化合物(15)、氧杂环(15)和脂肪族化合物(10)。(Buckingham，TheCombined Chemical Dictionary，Chapman和Hall CRC，版本5:2，2001年12月)。
绿茶儿茶素在被补充到Sprague Dawley雄性大鼠的饮食内时降低血小板磷脂酶A2的活性水平，并且显著减少血小板环氧合酶水平(Yang等人，1999)。据报告儿茶素和表儿茶素微弱遏制人结肠癌DLD-1细胞中的cox-2基因转录(IC50＝415.3μM)(Mutoh等人，2000)。来自红酒的(+)-儿茶素的神经保护能力起因于儿茶素的抗氧化性质，而不是对细胞内酶比如环氧合酶、脂氧合酶或一氧化氮合酶的抑制作用(Bastianetto等人，2000)。从绿茶和红茶中纯化的儿茶素衍生物，比如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)和茶黄素，显示了在人结肠粘膜和结肠肿瘤组织中的环氧合酶和脂氧合酶依赖性花生四烯酸代谢的抑制(Hong等人，2001)，并且诱导COX-2表达和PGE2产生(Park等人，2001)。
最近公开了儿茶(Acacia catechu(L.f.)Willd)和黄芩提取物在肺泡上皮II型细胞中通过NF-кB、MAPK和PI3K-Akt信号传导途径遏制LPS诱导的促炎应答的研究(Feng等人，2019)。用于含有游离B环类黄酮或黄烷的组合物的分离、纯化和使用的方法分别在以下中进行描述：名称为"Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2Inhibitors"的美国授权的专利9,061,039；8,535,735；7,972,632；和7,192,611；以及名称为“Isolation of a Dual COX-2and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia”的美国授权的专利9,168,242；8,568,799；8,124,134；7,108,868。游离b环类黄酮和黄烷组合的物质组合物，以及其基于COX/LOX双重抑制而用于关节护理、精神敏锐度、口腔护理和皮肤护理等的使用在以下中进行描述：名称为“Formulation of amixture of Free-B-Ringflavonoids and flavans as a therapeutic agent”的美国授权的专利9,849,152；9,655,940；9,061,039；8,535,735；7,674,830；7,514,469；名称为“Formulation of amixture of Free-B-Ring flavonoids and flavans for use in the prevention andtreatment of cognitive decline and age-related memory impairments”的美国授权的专利8,652,535；8,034,387；7,695,743；名称为“Formulation of dual cyclooxygenase(COX)and lipoxygenase(LOX)inhibitors for skin care”的美国授权的专利9,622,964；8,790,724；名称为“Formulation of Dual Eicosanoid System and Cytokine SystemInhibitors for the Use in the Prevention and Treatment of Oral Diseases”的美国授权的专利8,945,518；以及名称为“Formulation for prevention and treatment ofcarbohydrate induced diseases and conditions”的美国授权的专利7,531,521，所述专利通过引用以其整体并入本文。
发明内容
公开了用于建立和调控宿主防御机制的稳态的生物类黄酮组合物，并且其包含富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物。所考虑的组合物对于呼吸系统疾病和状况是有效的。
附图说明
图1显示了使用HMGB1作为关于转折点的杠杆的宿主防御稳态概念。
图2显示了标准化组合物维持宿主防御机制的稳态的新颖性。
图3显示了门(⊥)的示意性表示，其中生物类黄酮组合物可能干扰HMGB1和NFκB的途径。
图4显示了伴随UP894-II的存在，在24小时高氧暴露下的细胞活力。与室内空气对照(0小时)相比，*p<0.05。与媒介物对照相比，#，P<0.05，####，P<0.001。
图5显示了UP894-II减弱高氧损害的巨噬细胞吞噬功能。每个值代表关于每组一式两份的2个独立实验的平均值±SEM。将显著性与95％O2(0μg/ml)对照组进行比较。
图6.UP894-II降低了RAW 264.7细胞中的高氧诱导的HMGB1释放。每个值代表一式两份的2个独立实验的平均值±SEM。与室内空气对照(RA)相比，***p<0.001。与媒介物对照相比，#p<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
图7显示了来自LPS诱导的大鼠的肺组织的H&E染色，所述大鼠用UP446以250mg/kg进行治疗。A＝正常对照，B＝媒介物对照，C＝丁酸钠，D＝UP446(250mg/kg)。放大率100x。
图8显示了感染SARS-CoV-2的hACE2转基因小鼠的肺HMGB1表达倍数变化。
具体实施方式
公开了用于调控宿主防御机制的稳态的组合物和方法，其包括来自黄芩的一种或多种游离B环类黄酮与来自儿茶的一种或多种黄烷的组合。用于通过调控HMGB1、减少氧化应激且诱导粘膜免疫特别是免疫系统和呼吸系统的免疫球蛋白和T细胞的产生来维持宿主防御机制的稳态的组合物。公开了用于在哺乳动物中治疗、管理、促进、保护作为先天免疫防御细胞的第一线的巨噬细胞的吞噬活性并且提供重要的宿主防御机制的方法，所述机制提供给越来越多地经受通过空气污染、病毒例如SARS-CoV-2和微生物感染而产生的病原性和氧化应激的群体，尤其是给伴随衰老和慢性炎性病症包括呼吸系统中/的慢性炎性病症生活的那些宿主，所述方法包括施用0.01mg/kg至500mg/kg哺乳动物的体重的有效量的组合物。
本主题确定了宿主防御稳态协同调控，其由含有游离B环类黄酮和黄烷的标准化生物类黄酮组合物通过调节细胞外蛋白质HMGB1、减少氧化应激和诱导粘膜免疫特别是免疫球蛋白和T细胞的产生来导致宿主的免疫功能、呼吸健康和肺功能改善。血清中第二常见的抗体IgA是通过抑制微生物和病毒粘附到上皮细胞以及通过中和细菌、空气污染物和病毒对抗肺部和全身感染的第一道防线。应当理解，所考虑的组合物并不通过直接抑制微生物感染或病毒来起作用或执行以实现预计的益处。所考虑的实施方案调控宿主的自我防御机制的稳态，以通过宿主的防御功能来减少微生物或病毒感染。
宿主防御机制的稳态在当前主题中已被视为肺部和全身的。虽然当前主题预计维持在胃肠道和泌尿生殖道处的全身粘膜稳态，但在主题的主体中描绘的数据确认了其在主要通过调节HMGB1和诱导呼吸道防御粘膜免疫的第一线如免疫球蛋白A(IgA)来保护呼吸系统的结构完整性和功能方面的首要功能。使用脂多糖(LPS)诱导的急性肺损害；高氧和微生物感染模型在体内；和高氧受损的巨噬细胞在体外对活宿主评价了当前主题的肺保护效应。含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物在高氧受损的巨噬细胞中进行测试，其通过抑制HMGB1的释放来产生增加的巨噬细胞(先天免疫防御)吞噬活性。证实这些发现，在体内，生物类黄酮组合物显示出气道和肺的增加的细菌清除、显著减少的气道HMGB1累积以及暴露于高氧和微生物感染的小鼠肺中减少的总蛋白，指示了其在呼吸和肺保护方面的用途。在LPS诱导的急性肺损害模型中观察到当前主题的类似的呼吸和肺保护活性，其中生物类黄酮组合物的补充导致炎症的主要体征减轻、生物标记物和肺损害减少。还在伴随和不伴随流感疫苗免疫的脂多糖(LPS)诱导的脓毒症和D-半乳糖诱导的加速衰老模型中评价了当前主题的全身性宿主防御稳态效应。在测试的所有模型中，含有游离B环类黄酮和黄烷的当前主题显示了统计学上显著改善的宿主防御机制，验证了其在局部或全身性地恢复宿主防御稳态方面的用途。
公开了用于建立和调控宿主防御机制的稳态的生物类黄酮组合物，并且其包含富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物。所考虑的组合物对于呼吸道疾病和状况是有效的。如本文将讨论的，组合物中富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物在按每种提取物的重量计1％-98％的范围内，具有80:20的优化重量比。所考虑的实施方案还包括这样的实施方案，其中富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从黄芩的根中富集且标准化的；而富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从儿茶的心材中富集且标准化的。
所考虑的主题包括组合游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物，其显示出分别在暴露于高氧和微生物感染的宿主以及D-半乳糖诱导的加速衰老模型中抑制细胞外HMGB1从肺灌洗液的局部分泌和从脾匀浆的全身性分泌。基于关键的免疫或炎症应答生物标记物，如HMGB1和NFκB，以及体内与免疫衰老相关的变化，进行了本发明组合物的客观评价。通过调节HMGB1和NFκB，含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物证实了在体外巨噬细胞吞噬作用的显著增加，以及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP和CINC3的减轻，同时在体内增加了存活率，指示了其恢复、调节且维持宿主防御机制的稳态的用途。类似地，还发现所公开的含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物显示免疫衰老的逆转，如通过以下证明的：对先天性和适应性免疫应答的刺激(增加的补体C3，增加的CD3+T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD3-CD49b+自然杀伤细胞、NKp46+自然杀伤细胞和CD4+TCRγδ+γδT细胞)，抗氧化能力的加强(降低的晚期糖基化终末产物、增加的谷胱甘肽过氧化物酶)，以及对诸如胸腺等关键免疫器官免于衰老相关的功能障碍和结构损伤的保护。
所考虑的组合物通过优化或平衡免疫应答来维持免疫稳态；改善衰老和免疫器官衰老损伤的免疫；预防慢性炎症和炎症损伤的免疫；帮助维持对流感疫苗接种和COVID-19疫苗接种的健康免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康免疫功能；或保护免疫系统免于哺乳动物的空气污染诱导的氧化应激损伤。另外，所考虑的实施方案包括这样的组合物，其调控作为内源性或外源性应答攻击触发器的HMGB1，并且转变宿主防御应答以恢复稳态，所述HMGB1通过免疫衰老，或通过炎症，或通过氧化应激损伤的免疫细胞；通过病毒或微生物、空气污染物感染的免疫细胞、宿主呼吸系统细胞或心血管细胞释放。
最重要的是，所公开的含有游离B环类黄酮和黄烷的新型生物类黄酮组合物的补充导致在人体临床研究中得到证明的关键的粘膜防御相关免疫球蛋白IgA的诱导。IgA，存在于呼吸道的粘膜表面处的最重要的抗体类别，负责防护粘膜表面免于微生物和外来抗原的渗透。作为补充当前主题中公开的生物类黄酮组合物的结果，在随机化双盲安慰剂对照的人体临床试验中发现当前主题的生物类黄酮组合物在统计学上增加免疫球蛋白IgA。在每天补充当前主题中说明的含有游离B环类黄酮和黄烷的标准化生物类黄酮组合物UP446的56天后的受试者中，以及在服用补充剂总共56天伴随在第28天的流感疫苗接种免疫攻击的那些受试者中，IgA增加。增加的IgA指示了在胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的进入口处增强的粘膜保护。
还在体内于LPS诱导的脓毒症模型中测试了当前主题中组合来自两种药用植物——黄芩和儿茶的这些标准化生物类黄酮提取物的优点，并且如主题的主体中所述发现了出乎意料的协同效应。一般而言，将宿主防御机制表示为杠杆，并且将含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物表示为支点，宿主防御稳态或肺保护通过在杠杆的一侧下调分解代谢HMGB1并在另一侧上促进诱导粘膜免疫特别是(IgA)产生来实现。
在所考虑的实施方案中，组合物中的标准化生物类黄酮提取物用任何合适的溶剂进行提取，所述溶剂包括CO2的超临界流体、水、酸性水、碱性水、丙酮、甲醇、乙醇、丙烯醇、丁醇、与水混合的醇、混合有机溶剂或其组合。
游离B环黄酮和黄酮醇是一类特殊的类黄酮，其在芳香族B环上不含取代基，如通过以下一般结构所示的：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地包含以下，并且在一些实施方案中选自以下：-H、-OH、-SH、OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3 +X-、碳、氧、氮或硫、单一糖或多重糖的组合的糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基-戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；和
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
在所考虑的实施方案中，富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物包含0.5％至99.5％的一种或多种游离B环类黄酮。在其它实施方案中，富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物包含0.5％至99.5％的儿茶素。
在所考虑的实施方案中，游离B环类黄酮包含以下中的至少一种：黄芩苷、黄芩素、黄芩素糖苷、汉黄芩素、汉黄芩素葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素糖苷、千层纸素、千层纸素糖苷、千层纸素葡萄糖醛酸苷、白杨素、白杨素糖苷、白杨素葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷和野黄芩苷糖苷、去甲汉黄芩素、去甲汉黄芩素糖苷、高良姜素或其组合。
如实施例1中证实的，使用有机溶剂或水性溶剂从植物中提取游离B环类黄酮。提取产率取决于待提取植物的特定物种和部位而不同，具有从生物量总量的低个位数到约25％的范围。提取物中的游离B环类黄酮可以用分析方法进行分离，鉴定和定量，所述分析方法例如与高压柱层析(HPLC)结合的UV光谱仪或PDA检测器。溶剂提取物中的游离B环类黄酮的含量低至小于1％到至高>35％(实施例1中的表2)。实施例2中证实了游离B环类黄酮的进一步富集和标准化，其中靶向的游离B环类黄酮含量从来自黄芩根的有机溶剂提取物的约35％增加到在优化提取溶剂和提取条件、中和提取溶液、沉淀和过滤后的60–90％。实施例2中产生了RM405，其含有来自黄芩根的不少于75％的黄芩苷作为主要游离B环类黄酮。来自黄芩属的根或茎或整株植物的标准化生物类黄酮提取物可以通过以下实现：在用酸性溶液中和后沉淀碱性水性提取物溶液，或在水中的重结晶，或用不同类型树脂的柱层析以实现生物类黄酮的2-3倍富集达游离B环类黄酮介于20％–99％的纯度。
黄烷包括通过以下一般结构说明的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地包含以下，并且在一些实施方案中选自以下：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3 +X-、上文提到的取代基的酯，所述酯包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯；其碳、氧、氮或硫、单一糖或多重糖的组合的糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化学衍生物；二聚体、三聚体及其它聚合黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；和
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子和碳酸根等。
在一些所考虑的实施方案中，富含至少一种黄烷至少一种标准化生物类黄酮提取物包含以下中的至少一种：儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表茶黄素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素没食子酸酯或其组合。
儿茶素是主要在儿茶、儿茶钩藤、腰果种皮、绿茶中发现的黄烷，其具有下述结构。
在实施例3中证实，用有机溶剂、水溶剂和醇溶剂提取从不同植物中产生黄烷提取物。关于这些植物提取物中的总黄烷的儿茶素、表儿茶素的含量通过HPLC方法进行定量，结果在表4中列出。来自儿茶心材的标准化黄烷提取物(RM406)由水提取产生，随后为浓缩、沉淀和重结晶，以将黄烷含量从约10％富集且标准化到65％。来自儿茶或儿茶钩藤的心材或树皮或整株植物或腰果种皮的标准化生物类黄酮提取物可以通过以下实现：植物提取物溶液的浓缩，然后沉淀或在乙醇/水溶剂中的重结晶，或用不同类型树脂的柱层析，以实现生物类黄酮的2–8倍富集达黄烷介于10％–99％的纯度。
实施例4证实了通过将两种标准化提取物与赋形剂——麦芽糖糊精组合来制备编码为UP446的生物类黄酮组合物的方法，所述两种标准化提取物如含有>65％关于儿茶素和表儿茶素的总黄烷的金合欢属提取物(实施例3中的RM406)，与含有>75％关于黄芩苷、黄芩素及其它的游离B环类黄酮的黄芩属提取物(实施例2中的RM405)。对关于个别游离B环类黄酮和黄烷的主要和次要生物类黄酮含量进行定量，并且将其列于表5中，其中总生物类黄酮含量为86％。表6列出了四种不同的生物类黄酮组合物，其来自游离B环类黄酮的不同来源，例如黄芩的根(UP446)或茎(UP223)；以及黄烷的不同来源，例如儿茶的心材(UP894-II)或儿茶钩藤的整株植物(UG0408)。这些组合物的共混比率根据每种标准化提取物中的生物类黄酮含量而不同，其通过预期用途和生物功能性进行调整。UP446和UP894-II在本主题中被用于公开关于组合两种不同类型的生物类黄酮的优点的出乎意料的协同作用，以及在宿主防御稳态的调控方面的出乎意料的功能性，其导致改善的免疫功能、受保护的呼吸系统健康和肺功能。
维持紧密的宿主防御稳态对于人类的生理功能防御外部入侵微生物、病毒、真菌、污染物以及清除死细胞和启动重建和更新功能是必需的。过度刺激的免疫功能可以引起过敏反应和自身免疫破坏性疾病。衰老、氧化应激、心理应激、全身炎症以及许多慢性疾病如糖尿病、肥胖、代谢综合征可以转变宿主防御稳态的转折点，导致损害宿主防御功能。众所周知的健康生活方式，比如每日均衡营养，锻炼，压力管理以及补充抗氧化、抗炎和免疫调控(免疫遏制或免疫刺激，取决于失衡的宿主防御功能的状态)天然化合物和用于抗病毒的处方药、抗生素、类固醇和DTHE可以提供有益的平衡力，以使宿主防御机制回到有利的方向。由于所报告的对细胞因子生产的遏制，包括生物类黄酮在内的许多多酚被分类为免疫抑制剂，所述细胞因子生产对于启动针对感染或疫苗接种的宿主防御应答是必需的。因此，多酚支持宿主防御机制的现实世界用途仍未在临床研究中得到证明。
不幸的是，对于理解什么是对维持宿主防御机制的稳态必需的转折点给予的关注和知识要少得多。是否存在发挥作为转折点因素的作用的关键的生物学、生理学和病理学途径和生物标记物，所述转折点因素可以加速针对病理因子的宿主防御机制应答朝向螺旋式下降过程的转变。找到此种转折点是重要的。更必需的是我们是否可以找到活性化合物来制备成可以移动转折点远离破坏性方向并恢复宿主防御机制的稳态的组合物。我们认为HMGB1是此类生物标记物，其可以充当关于细胞内稳态平衡丧失的警报素，并且促进处于导致受损和破坏性的宿主防御功能的诸如冠状病毒SARS-CoV-2等病毒和微生物感染以及PM2.5污染物下的压倒性生物应答。
核蛋白HMGB1的水平在暴露于延长的氧化应激的动物和人的气道中压倒性地高(与健康对照比较为100倍)。HMGB1最初被鉴定为通过稳定核小体的结构并介导DNA中的构象变化来调控转录的核蛋白。与其在核中的作用形成对比，细胞外HMGB1诱导显著的炎症应答。有趣的是，它们的研究显示了汇编的证据，指示了在肺部感染的几种动物模型中，气道中的细胞外HMGB1高水平累积可以经由损害巨噬细胞功能来直接损害针对细菌和病毒感染的宿主防御机制。
因此，含有70-80％游离B环类黄酮和15-20％黄烷的生物类黄酮组合物UP894-II(表6)被用于评估其在高氧应激下对巨噬细胞的作用。如实施例5中所示，介于8–128μg/mL的UP894-II在24小时高氧暴露中并未改变巨噬细胞活力(图4)。在实施例6的图5中证实了，UP894-II剂量在低至3.7μg/mL的浓度下关联且在统计学上显著增加巨噬细胞的吞噬活性。令人惊讶的是，来自UP894-II的在氧化应激下对巨噬细胞的吞噬活性的此类保护与在UP894-II治疗下在巨噬细胞中高氧诱导的HMGB1释放的降低密切相关，具有确切相同的剂量相关性(实施例7中的图6)。
因此，由所公开的生物类黄酮组合物UP894-II减少气道中的HMGB1水平或阻断其活性保护了作为先天免疫防御细胞的第一线的巨噬细胞的吞噬活性并且提供了重要的宿主防御机制，所述机制提供给越来越多地经受通过空气污染、病毒例如SARS-CoV-2和细菌感染而产生的病原性和氧化应激的群体，尤其是给伴随慢性炎性病症生活的那些宿主。
如主题的主体中所述的，在多项体内研究(例如实施例9-12中的LPS诱导的脓毒症模型、实施例13–21中的LPS诱导的急性肺损害模型以及实施例35–39中高氧暴露的微生物感染的急性肺损害模型)中评价了所公开的含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物的客观治疗和应答效应。本主题的那些实施例中描绘的数据显示了当在脓毒症或急性肺损害研究受试者中经口施用时，标准化组合物的显著的宿主防御稳态效应。
组合来自黄芩属的游离B环类黄酮和来自金合欢属提取物的黄烷的显著价值，基于从实施例10和11中证实的LPS诱导的存活研究中获得的数据，使用常用的Colby氏方程对协同作用进行评估和确认。使用Colby氏方法，当所观察的值大于预计的时，假定具有两种或更多种材料的标准化制剂具有出乎意料的协同作用。在当前主题中，预期确认生物类黄酮组合物对于降低死亡率和增加存活率具有出乎意料的协同作用。如实施例12中说明的，由游离B环类黄酮和黄烷提取物的组合观察到在降低死亡率或增加存活率方面的出乎意料的协同作用。用组合物治疗可见的有益效应超过了基于将对于其各组成成分观察到的效应以给定比率简单相加的预测效应(表13)。与正常对照相比，只有含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物在LPS攻击的144小时后实现了统计学上显著的存活率(SR％)增加(表10)。事实上，在治疗后24小时，对于生物类黄酮组合物没有观察到动物死亡(100％存活率)，而对于单独施用的黄芩属(RM405)和金合欢属(RM406)治疗的组分别观察到15.4％和30.8％的死亡率(实施例11中的表10)。虽然存在关于这些药用植物的有益用途的报告，然而，据我们所知，这是用来自这些药用植物的标准化提取物的组合的首次治疗，其导致在LPS诱导的脓毒症中降低死亡率和增加存活率方面的出乎意料的结果。这些出乎意料的结果连同其它有利的先天性和适应性免疫应答，特别是人体临床研究中观察到的IgA增加以及本主题中记录的细胞外HMGB1降低，为含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物提供了独特特性，其引导宿主免疫应答朝向平衡活性的方向，导致整体宿主防御稳态。
实施例13证实了含有游离B环类黄酮和黄烷的标准化生物类黄酮组合物对减轻大鼠中的脂多糖(LPS)诱导的急性炎症性肺损害的功效。生物标记物TNF-α(实施例14)；来自血清的IL-1β(实施例15)，支气管肺泡灌洗液(BAL)中的IL-6(实施例16)、CRP(实施例19)、IL-10(实施例20)和总蛋白(实施例18)以及肺匀浆中的CINC-3(实施例17)水平的这些显著变化作为通过平衡HMGB1来改善宿主防御稳态的结果，后来通过肺组织的组织学检查得到确认。对于用所公开的组合物治疗的动物，在实施例21中观察到肺损伤总体严重程度在统计学上显著的减少。当在LPS诱导的脓毒症模型中评估与单独施用的每种药用植物相比配制来自黄芩属的游离B环类黄酮和来自金合欢属提取物的黄烷的优点时，在实施例11和12中也观察到出乎意料的协同效应。来自该当前主题的数据提示了，含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物通过平衡和破坏涉及上游细胞外HMGB1和后续NFκB信号传导及细胞因子风暴的恶性循环来帮助维持宿主防御机制的稳态。结果，组合物的这些关键特征可以导致这样的新型应用，其需要平衡的宿主防御机制来保护呼吸功能免于脓毒症或者急性或慢性损害，包括但不限于在空气污染、季节性流感或病毒(例如COVID-19)和细菌感染时。
已知LPS直接滴注到肺内通过释放大量HMGB1的肺泡巨噬细胞激活驻留先天免疫应答，导致部分经由NFκB激活的主要细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6以及炎性蛋白CRP的产生增加。这些细胞因子可以单独地或协同触发对疾病病理状况有害的细胞因子和趋化因子级联的激活来引起显著的肺部病理状况。例如，在急性炎症应答时，趋化性细胞因子诱导嗜中性粒细胞化学引诱物(CINC-3)，其在LPS诱导的急性肺损害中的嗜中性粒细胞向肺的募集方面起重要作用。HMGB1的遏制是免疫稳态的关键转折点，以便控制涉及肺中的急性炎症应答的这些主要细胞因子和趋化性因子。平衡HMGB1是肺病理状况中的关键现象，具有在细胞因子风暴干预和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的严重程度减轻中的显著临床相关性。
蛋白质或纤维蛋白渗漏到间质空间内是肺水肿的关键组分，其中渗出物增加是疾病严重程度的指示。在LPS诱导的急性肺损害以及高氧暴露和PA感染的小鼠急性肺损害两者中，用该组合物治疗减少了来自支气管肺泡灌洗液的总蛋白，指示了其减轻肺部病理状况的重要性。来自血清、BAL和匀浆的生物标记物的这些显著变化已证实了施用组合物的策略导致肺损伤总体严重程度在统计学上显著的减少，其后来已通过组织病理学评估得到确认。基于此处描绘的减少的HMGB1水平和NFκB、增加的气道和肺细菌清除、降低的肺总蛋白、降低的细胞因子、改善的组织病理学数据和诱导的IgA，生物类黄酮组合物实际上调控免疫稳态的转折点，并且指示细胞因子风暴遏制和急性炎症性肺损害严重程度的减轻。
像这样，在当前主题中，与作为阳性对照的白藜芦醇相比，在高氧攻击和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(PA)感染的小鼠中评估了所公开的含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物(实施例35)。在该模型中，含有不少于60％游离B环类黄酮和不少于10％黄烷的生物类黄酮组合物UP446(表6)首先就其在7天施用之后增加小鼠存活率的能力进行了测试。与留在室内空气(RA)中的小鼠中的9％死亡率相比，在PA接种之前用高氧处理2天的小鼠中观察到64.29％的死亡率(表36)。另一方面，在暴露于高氧2天之前用白藜芦醇(RES)和UP446预防性治疗7天并且其后接种PA的小鼠分别具有27.27％和28.57％的死亡率(表36)。随后，使用氧化应激/肺部感染诱导的急性肺损害的小鼠模型，伴随PA诱导的肺部感染和高氧诱导的氧化应激，对生物类黄酮组合物测试并确定了UP446在减少由肺部感染诱导的氧化应激加重的急性肺损害方面的效应(实施例36)。含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物引起在统计学上显著的a)气道HMGB1累积的减少(实施例39中的表40)；b)气道和肺细菌清除的增加(实施例37和38中的表38和39)；以及c)肺损害的改善，如通过暴露于高氧和PA感染的小鼠中的BAL总蛋白减少(实施例36中的表37)所反映的。这与UP446在改善针对涉及肺的微生物感染的宿主防御方面显著增强的能力相关联。另外，UP446改善了针对肺和气道中的细菌感染的宿主防御。这些效应在预防脓毒性休克和全身炎症应答中起关键作用。来自这项研究的数据突出显示了游离B环类黄酮和黄烷组合物——UP446对于逐渐增加的经受通过氧化应激和病毒或微生物感染而受损的宿主防御功能的群体的益处。
在实施例22中证实的，在加速衰老模型中，用D-半乳糖处理小鼠以诱导衰老表型。在D-半乳糖诱导4周后，小鼠用所公开的游离B环类黄酮和黄烷组合物——UP446以两个浓度治疗4周，然后引入流感疫苗作为免疫攻击，并且在多重测定中测量宿主防御机制，以确定UP446是否促成与对照小鼠相似的平衡的宿主防御表型。重要结果突出显示为：
A)在实施例23和表23中，正常对照组和两个UP446+D-Gal治疗组的胸腺指数显著高于D-Gal组，指示了UP446促成逆转胸腺退化，即胸腺大小随年龄减少，其可能影响身体产生免疫应答的能力。
B)在实施例24和表24中，我们发现了在免疫组中的体液免疫的显著变化。与单独的D-Gal相比，在D-Gal+UP446(200mg/kg)组中存在补体C3的显著增加，其指示了与D-Gal组相比，在UP446治疗中在免疫后的体液免疫应答延长。
C)在实施例28中，测量来自不同组的全血中的白血细胞，我们发现了在免疫的小鼠组中的重要差异。与免疫的仅D-Gal组相比，CD49b+(表28)和NKp46+自然杀伤细胞(表29)在免疫的UP446+D-Gal组中增加。这些数据指示了UP446有助于自然杀伤细胞群体的扩增，导致更高百分比的先天和免疫细胞。
D)我们还发现了在未免疫的小鼠组中的重要差异。与仅D-gal组相比，D-Gal+UP446组具有朝向增加的CD3+T细胞的强烈趋势(表25中的P＝0.055)，伴随CD8+细胞毒性T细胞(表27)、NKp46+自然杀伤细胞(表28)、CD4+TCRγδ+γδT细胞(表30)和IL12p70(表31)的显著增加。实施例25-30中证实的这些数据暗示了所公开的生物类黄酮组合物UP446启动失活的免疫系统并引起免疫细胞群体的扩增，增加了未免疫的小鼠中的免疫“准备就绪”。
E)我们检查了抗氧化酶和生物标记物，以便监测抗氧化途径。通过D-Gal模型诱导的衰老表型基于晚期糖基化终末产物(AGE)的增加，引起与老年动物中将会存在的水平类似的氧化应激和损伤(Azman KF，2019)。增加抗氧化途径将减少氧化应激的效应。我们首先在实施例31中测量了免疫和未免疫的小鼠血清样品中的AGE水平。我们发现与单独的D-gal相比，来自未免疫的D-Gal+UP446组(两个浓度)的小鼠血清中的AGE降低(表32)。这指示了UP446治疗的动物具有较低水平的自由基，特别是促成D-Gal模型的衰老表型的那些。接下来，我们察看实施例32中来自免疫的动物的小鼠血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。我们发现与免疫的D-Gal组相比，两个免疫的UP446+D-Gal组均具有显著更高的GSH-Px活性(表33)，指示了中和UP446治疗的动物中的自由基的能力增加。
F)还分析了来自免疫组的动物的脾中的蛋白质水平。脾是免疫系统的主要器官之一。它含有高水平的白血细胞并控制血液中的免疫细胞类型的水平。在实施例33中测量了响应炎症而激活的促炎转录因子NFκB，并且发现NFκB在Gal+UP446高剂量治疗组中降低(表34)。这指示了减少NFκB的水平是UP446在宿主防御稳态时调节炎症应答的一种机制。HMGB1，警报素蛋白，其为在非炎性条件下的转录因子和核蛋白，并且其从核输出并被分泌到细胞外空间，以进一步放大炎症信号。如实施例34中证实的，发现与D-gal组相比，在未免疫的D-Gal+UP446高剂量组中存在HMGB1水平的明显降低(表35中P＝0.053)。这些发现都指示了UP446治疗减少未免疫的小鼠脾中的氧化应激和炎症。
部分反映为抗氧化防御系统功能障碍和免疫系统损害的组织和器官的进行性退化是衰老的标志。基于衰老的自由基理论，氧化性损伤(自由基和抗氧化剂之间的失衡)是组织和器官的衰老以及衰老相关的退行性结构和功能病症的主要促成因素(Azman和Zakaria，2019)。升高的晚期糖基化终末产物(AGE)已知加速衰老过程，并且被认为是D-半乳糖诱导的加速衰老模型中的衰老机制的主要途径，所述模型的特征在于弱免疫应答和扰乱的抗氧化防御系统。使用D-半乳糖诱导的动物模型在当前主题中复制了这些自然事件，其中在D-Gal+媒介物治疗的小鼠中观察到氧化应激的增加、抗氧化酶活性的降低和免疫应答的缩减。相比之下，补充含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物逆转了衰老相关的结构和功能变化。生物类黄酮组合物UP446的补充导致血清AGE在统计学上显著的剂量相关的减少，其中最高减少是高剂量组中的58％减少(实施例31中的表32)。此外，细胞针对氧化性损伤的最有效防御机制主要涉及内源性酶促抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的作用。实际上，生物类黄酮组合物发挥了有力的抗氧化加强作用，对于所有施用的剂量均具有统计学上显著的GSH-Px增加(实施例31中的实施例33)。考虑到粘膜免疫的诱导、免疫器官的保存、AGE的减少和增加的内源性抗氧化酶，含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物预防衰老相关的免疫失调和抗氧化防御系统功能障碍。
向化学老化的小鼠补充生物类黄酮组合物增强了先天免疫。自然杀伤细胞的激活和扩增是保持宿主防御稳态的关键免疫调节模式。自然杀伤细胞是先天免疫系统的重要组分，其已知快速响应广泛多种的病理攻击；空气污染物；病毒、微生物和真菌感染；以及细胞氧化和激素窘迫(distress)，而无需任何引发或先前激活。自然杀伤细胞执行细胞完整性的监测来检测细胞表面分子的变化，以部署其细胞毒性效应机制。自然杀伤(NK)细胞作为细胞毒性淋巴细胞和作为免疫调节细胞因子的生产者发挥作用。在刺激之后，NK细胞产生大量细胞因子，主要是γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。由NK细胞产生的这些细胞因子以及其它细胞因子在早期免疫应答期间具有直接效应，并且是通过T细胞和B细胞介导的后续适应性免疫应答的显著调节剂。作为生物类黄酮组合物的经口施用的结果，当前主题中的NK细胞的明显增加是该主题对先天免疫调节具有显著影响的明确指示，提示了其涉及奠定免疫稳态基础的直接和有效的免疫触发活性。呈自然杀伤细胞的形式的这种先天免疫激活是生物类黄酮组合物诱导保护呼吸道且维持粘膜稳态的应答的另一种方式。
当前主题的粘膜免疫调控和宿主防御稳态活性已通过在CD4+TCRγδ+γδT细胞中观察到的诱导水平而得到确认，所述T细胞已知用于免疫调控、促进免疫监视和免疫稳态。γδT细胞是独特的T细胞亚群，在很大程度上存在于身体的许多进入口处，包括肺和肠，在其中它们于它们的发育早期迁移并作为驻留细胞持续存在。由于其战略性的解剖学定位(呼吸系统和胃肠系统的粘膜衬里)，γδT细胞基于其在直接杀死受感染细胞、募集其它免疫细胞、激活吞噬作用且限制病原体或污染物易位到全身性区室方面的先天样应答而提供了第一道防线。已知这些细胞经历快速的群体扩增，并且在二次攻击时提供病原体特异性保护。它们在呼吸道和肠道中理想的定位也帮助维持呼吸和肠上皮的完整性。一般地，γδT细胞的生理作用包括针对细胞外和细胞内病原体或污染物的保护性免疫、监视、先天性和适应性免疫应答的调节、组织愈合和上皮细胞维持以及生理器官功能的调控。γδT细胞与自然杀伤(NK)细胞共享一些特性，因为两者：通常均被认为是先天免疫的组成成分，识别转化/受损的细胞，在抗病毒保护中起显著的作用，促进下游适应性免疫应答，并且是有力的细胞溶解性淋巴细胞。另外，γδT细胞承担抗原呈递细胞的作用(Ribot等人，2021；Bonneville等人，2010)。这些快速响应的免疫细胞(γδT细胞和NK细胞)已被当前主题中的生物类黄酮组合物UP446诱导，导致粘膜免疫调控和宿主防御稳态。
总的来说，与单独的D-Gal相比，观察到游离B环类黄酮和黄烷组合物——UP446治疗的D-Gal小鼠中的显著变化，其指示了衰老动物的宿主防御机制的逆转，更接近于正常对照小鼠的表型，或至少增加的宿主防御系统引发和激活。免疫的D-Gal+UP446组中的胸腺指数、血清补体、自然杀伤细胞和谷胱甘肽过氧化物酶活性高于单独的D-Gal，指示了与单独的D-Gal诱导的衰老组相比，UP446治疗的组中的宿主防御系统能够更好地响应疫苗接种。未免疫的D-Gal+UP446组中的CD8+细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和CD4+TCRγδ+γδT细胞高于单独的D-Gal，而AGE水平和NFkB与D-Gal组相比是减少的，指示了先天性和适应性免疫应答两者的引发，伴随降低的氧化应激和炎症。这些发现显示了，游离B环类黄酮和黄烷组合物UP446可用于在主动疫苗接种或感染期间和作为引发针对感染的宿主防御系统的预防来帮助激活宿主防御系统。
SARS-CoV-2是引起COVID-19的RNA病毒，所述疾病具有范围为无症状感染、肺损害、炎症、呼吸性窘迫、多器官衰竭和死亡的不同临床结果。在SARS-CoV-2感染的肺中分泌的细胞外HMGB1已被考虑为COVID-19的严重肺部炎症中的治疗靶标(Andersson等人，2020)。草药已被考虑用于通过抑制HMGB1释放治疗SARS-CoV-2病毒附着、急性呼吸衰竭和脓毒症(Wyganowska-Swiatkowska等人，2020)。考虑SARS-CoV-2刺突蛋白与人血管紧张素I转换酶2(hACE2)的结合为主要的病毒进入口，将表达人ACE2的转基因小鼠模型用SARS-CoV-2进行攻击，用于模型诱导和干预功效。如实施例40中说明的，与未感染的正常转基因对照小鼠相比，媒介物治疗的感染SARS-CoV-2病毒的转基因小鼠显示了肺HMGB1蛋白表达在统计学上显著的2倍增加。相比之下，用含有70-80％游离B环类黄酮和15-20％黄烷的生物类黄酮组合物UP894-II补充感染SARS-CoV-2病毒的转基因小鼠导致肺组织中的HMGB1蛋白表达减少到未感染的正常对照转基因小鼠的水平(图8)。与媒介物治疗的感染SARS-CoV-2的转基因小鼠相比，作为生物类黄酮组合物治疗结果的这种肺HMGB1表达水平减少在统计学上显著。HMGB1是已知激活一系列复杂的宿主免疫应答的关键的晚期警报素，如果不加以控制，则导致如在住院的COVID-19患者中观察到的细胞因子风暴、扰乱的宿主防御稳态平衡和后续有害的临床表现。在感染SRS-Cov2的这种转基因小鼠中，肺组织中HMGB1表达的明显和统计学上显著的减少指示了通过含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物的改善的宿主防御机制和驱动的稳态平衡，其导致由SARS-CoV-2冠状病毒感染引起的细胞因子风暴致死率以及相关的肺及其它器官损伤的减少。
可能，对于由含有不少于60％游离B环类黄酮和不少于10％黄烷的独特生物类黄酮组合物UP446调控宿主防御机制的最引人注目的主要结果是在实施例41中证实的来自人体临床试验的在健康志愿者中的血清IgA变化。在双盲、安慰剂对照的临床试验中，给予健康和中年受试者(表42)用每天两次的UP446 250mg或安慰剂的每天补充28天，然后用流感疫苗攻击其免疫系统(表41)。他们继续服用UP446或安慰剂另外28天，其中抽取血液样品用于在基线时、在治疗28天后以及在治疗56天后(疫苗接种后28天)进行的宿主防御生物标记物测量。发现了在8周治疗的结束时，在接受生物类黄酮组合物UP446的受试者中，在流感疫苗接种之前和之后，粘膜免疫指标如免疫球蛋白A比安慰剂组显著增加。根据其自身的组间比较，对于UP446治疗的组，从第0天到第56天以及从第28天到第56天的IgA变化显著更高。在整个补充过程中，与安慰剂相比，给予了生物类黄酮组合物UP446的受试者显示了在流感疫苗接种后IgA水平的明显增加。这些数据明确地显示了，健康呼吸系统的主要免疫球蛋白且被视为对于粘膜防御最重要的免疫球蛋白的IgA是人类中宿主防御机制的稳态改善的主要指标之一。
呼吸系统(即肺和上呼吸道)富含粘膜表面积(400–500m2)，其是在呼吸过程中向各种吸入的病原体和污染物频繁暴露的常见部位和进入口。通过大量空气传播的微生物、微粒、污染物和环境抗原的这种持续攻击需要呼吸道的粘膜表面参与稳固的非特异性和特异性防御机制，以保护免于呼吸道感染和损害。除了机械防御(咳嗽、打喷嚏和粘膜纤毛清除)以及通过肺泡巨噬细胞的颗粒和微生物去除外，粘膜体液免疫应答的诱导，更具体而言，呼吸道中的IgA产生是保护呼吸系统的关键点。与非特异性先天免疫因子合作的IgA被认为是针对外部因子的有效的第一道呼吸/肺防线，而不诱导潜在有害的炎症应答。事实上，含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物涵盖了通过增加巨噬细胞吞噬活性的先天应答以及通过粘膜免疫特别是IgA的产生的刺激来促进适应性应答两者。IgA，呼吸道的粘膜中的免疫球蛋白的主要类别，是用于呼吸系统和肺防御的最重要的免疫球蛋白，其已知a)防护粘膜表面免于被微生物和外来抗原渗透；b)中和细菌产物；c)通过IgA介导的排泄途径来消除已突破粘膜表面的病原体或抗原；d)使微生物凝集并干扰细菌运动，以及e)在转胞吞作用(transcytosis)过程中与病毒抗原相互作用并干扰病毒合成或组装，从而在细胞内中和病毒(Pilette等人，2001)。如本主题的主体中所述的，尤其是在实施例41中说明的人体临床试验中证明的，用含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物的补充在人体临床试验中诱导了粘膜免疫特别是增加的IgA产生以及增加高氧巨噬细胞的吞噬活性，提示了当前主题的主要作用是保护肺和维持粘膜免疫稳态。
总之，使用细胞培养和动物模型两者，显示了在被常规用于治疗患有COVID-19的患者的氧疗法期间对氧化应激的延长暴露可以引起HMGB1的急剧释放，其使免疫反应的平衡倾覆且诱导先天免疫的损害，伴随受损的巨噬细胞功能，导致清除呼吸道和肺中的入侵病原体的宿主防御受损，并且引起呼吸道的急性炎症和肺损害，甚至死亡。使用这些模型系统，HMGB1被证实为氧化应激诱导的对肺部感染的易感性的发病机制潜在的新型细胞和分子机制，并且含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物被证实通过转变这些宿主中的HMGB1来改善先天免疫并减轻受损的呼吸功能，如图1和图2中证实的。含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物的施用实例已经由改善宿主防御机制的稳态来减弱细胞外HMGB1的累积，改善呼吸功能，增强针对细菌和病毒感染的先天免疫，并且抑制炎症应答。
通过游离B环类黄酮和黄烷用于调节HMGB1的当前主题可以是由于以下，但不限于如图3中说明的：a)通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放来靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制核中的分子内二硫键形成，b)在释放后直接靶向HMGB1并中和其效应，c)阻断HMGB1模式识别受体如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体，或抑制信号转导。在感染、炎症和细胞死亡中抑制氧化应激介导的HMGB1释放可能靶向1)在活化免疫细胞中CRM1介导的HMGB1的核输出；2)在坏死中PARP1介导的HMGB1释放；3)在细胞凋亡中半胱天冬酶3/7介导的HMGB1释放；4)在自噬中ATG5介导的HMGB1释放；5)在细胞焦亡中PKR介导的HMGB1释放；以及6)在netosis中的PAD4介导的HMGB1释放。含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物的效应也可能起于防止HMGB1的簇形成或自结合，其可以通过靶向特异性物理化学因素来实现，所述物理化学因素例如离子强度(增加离子强度减少HMGB1四聚体的强度)、pH(最高的自结合率在pH 4.8下)、金属离子尤其是锌(包括低剂量Zn2+促进HMGB1四聚体形成)以及氧化还原环境(在模拟细胞外环境的更氧化的条件下，HMGB1主要作为四聚体存在，而在更还原的条件下，例如在细胞内环境中，存在更多的二聚体种类)。通过改变物理化学微环境，生物类黄酮组合物可以防止HMGB1四聚体的形成，并且干扰HMGB1与TLR和RAGE的结合亲和力。
在上文和以下描述中，阐述了某些具体细节，以便提供对本公开的各个实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可实践主题而无需这些细节和限制。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围将被理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时，其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。另外，除非另有说明，否则本文所述的涉及诸如聚合物亚基、大小或厚度等任何物理特征的任何数目范围将被理解为包括在所述范围内的任何整数。如本文使用的，除非另有说明，否则术语“约”、“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”意指所指示范围、值或结构的±20％。应该理解，如本文使用的，术语“一个(a)”和“一种(an)”指所列举的组分中的“一个或多个/一种或多种”。替代项(例如“或”或“和/或”)的使用应被理解为意指替代项中的任一、两者或其任何组合。除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和权利要求，词语“包含(comprise)”及其变体，例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，以及同义术语如“包括”和“具有”及其变体，将被解释为开放、包含在内的意义；即解释为“包括但不限于”。
贯穿本说明书对“一个实施方案(one embodiment)”或“一个实施方案(anembodiment)”的提及意指与该实施方案结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本主题的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书各处出现的短语“在一个实施方案中(in oneembodiment)”或“在一个实施方案中(in an embodiment)”不一定都指的是相同的实施方案。
术语“前药”还意欲包括任何共价键合的载体，当将此类前药被施用于哺乳动物受试者时，其在体内释放本公开内容的活性化合物。本公开内容的化合物的前药可以通过以这样的方式修饰本公开内容的化合物中存在的官能团来制备，使得修饰在常规操作中或在体内被切割为本公开内容的母体化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基与任何基团键合的本公开内容的化合物，所述基团在将本公开内容的化合物的前药被施用于哺乳动物受试者时切割以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括本公开内容的化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或者胺官能团的酰胺衍生物等等。
“稳定的化合物”和“稳定的结构”意欲指示这样的化合物，其足够稳固，以经受住从反应混合物分离至有用的纯度程度、以及配制成具有合理贮存期限的有效治疗剂。
“(一种或多种)生物标记物”或“(一种或多种)标记物”(一种或多种)组分或(一种或多种)化合物意欲指示所公开的(一种或多种)植物、(一种或多种)植物提取物或(一种或多种)具有2-3种植物提取物的组合的组合物中的一种或多种固有化学组分或化合物，其被用于控制本发明的组合物的质量、一致性、完整性、稳定性或生物学功能。
“哺乳动物”包括人以及诸如实验室动物或家养宠物(例如猫、犬、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)等家畜和诸如野生动物等等非家畜两者。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的元素、组分、事件或情况可能发生或可能不发生，并且描述包括其中元素、组分、事件或情况发生的情形以及其中它们并不发生的情形。例如，“任选取代的芳基”意指芳基基团可以被取代或可以不被取代，并且该描述包括取代的芳基基团以及不含取代的芳基基团两者。
“药学或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括已被美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准为对于人或家畜中的使用是可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在所考虑的实施方案中，组合物进一步包含药学或营养学上可接受的活性物、佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含在至少一种标准化生物类黄酮提取物中的约0.1重量百分比(重量％)至约99.9重量％的活性化合物。
“药学或营养学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。“药学或营养学上可接受的酸加成盐”指这样的盐，其保留游离碱的生物有效性和性质，并非生物学或其它方面不期望的，并且由以下形成：无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，以及有机酸例如乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等等。
“药学或营养学上可接受的碱加成盐”指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，所述盐并非生物学或其它方面不期望的。这些盐通过将无机碱或有机碱加入游离酸中进行制备。衍生自无机碱的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等等。在某些实施方案中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。衍生自有机碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺，环胺和碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、二苄基乙二胺、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等等。特别有用的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
通常结晶产生本公开内容化合物的溶剂化物。如本文使用的，术语“溶剂化物”指包含本公开内容的化合物的一个或多个分子与一个或多个溶剂分子的聚集物。溶剂可以是水，在所述情况下，溶剂化物可以是水合物。可替代地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本主题的化合物可以作为水合物，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等等，以及相应的溶剂化形式存在。本公开内容的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本公开内容的化合物可以仅仅保留外在水，或者是水加上一些外在溶剂的混合物。
“药物组合物”或“营养组合物”指本公开内容的化合物和本领域普遍接受用于将生物活性化合物递送至哺乳动物例如人的介质的制剂。例如，本公开内容的药物组合物可被配制为或用作独立的组合物，或者作为处方药、非处方药(OTC)、植物药、草药、天然药物、顺势疗法药剂或由政府机构审查且批准的卫生保健产品的任何其它形式中的组分或活性药物成分(API)。本公开内容的示例性营养组合物可被配制为或用作独立的组合物，或者作为食物、功能性食物、饮料、棒、食用香料、医疗食物、饮食补充剂或草药产品中的营养或生物活性组分。本领域普遍接受的介质包括用于其的所有药学或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
如本文使用的，“富集”指与提取或其它制备前的植物材料或其它来源的重量中发现的一种或多种活性化合物的量相比，具有一种或多种活性化合物的至少两倍直到约1000倍增加的植物提取物或其它制剂。在某些实施方案中，在提取或其它制备前的植物材料或其它来源的重量可以是干重、湿重或其组合。在所考虑的实施方案中，通过溶剂沉淀，中和，溶剂分配，超滤，酶消化，用硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、离子交换、CG161树脂的柱层析或其组合个别地或组合地富集标准化生物类黄酮提取物。
如本文使用的，“主要活性成分”或“主要活性组分”指在植物提取物或其它制剂中发现或者在植物提取物或其它制剂中富集的一种或多种活性化合物，其能够具有至少一种生物活性。在某些实施方案中，富集的提取物的主要活性成分将是在该提取物中富集的一种或多种活性生物类黄酮化合物。一般而言，与其它提取物组分相比，生物类黄酮组合物中的一种或多种主要活性组分将直接或间接赋予大部分(即大于60％，或50％，或20％或10％)的一种或多种可测量的生物活性或效应。在某些实施方案中，主要的活性生物类黄酮可以是按提取物的重量百分比计的次要组分(例如提取物中包含的生物类黄酮的小于50％、25％、或10％或5％或1％)，但仍提供大部分所期望的生物活性。含有主要活性物如黄芩苷作为游离B环类黄酮之一的本公开内容的任何生物类黄酮组合物也可能含有次要活性黄烷表儿茶素，其可能促成或可能不促成富集的组合物的药物或营养活性，但不达到主要活性组分的水平，并且单独的次要活性组分在主要活性成分不存在的情况下可能是无效的。
“有效量”或“治疗有效量”指本公开内容的生物类黄酮化合物或组合物的量，当施用于哺乳动物例如人时，所述量足以转变宿主防御机制稳态的转折点，其导致改善的免疫功能，包括以下中的任何一种或多种：(1)刺激先天免疫；(2)增强适应性免疫，尤其是CD4+和CD8+，补体C3，增加CD3+T细胞，CD8+细胞毒性T细胞，CD3-CD49b+自然杀伤细胞，NKp46+自然杀伤细胞和CD4+TCRγδ+γδT细胞；(3)遏制慢性全身炎症和氧化应激；(4)保护免疫、呼吸和肺细胞免于HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤；(5)提供作为有力的抗氧化剂的功能，以减少氧化应激且降低NF-kb；降低晚期糖基化终末产物，增加谷胱甘肽过氧化物酶；中和活性氧簇并预防氧化应激，其引起呼吸、肺和免疫系统的结构完整性的损伤和功能丧失；(6)维持先天和适应性免疫应答的稳态；(7)在体液和细胞介导的免疫应答中增强巨噬细胞的吞噬指数；(8)抑制转录因子例如NF-kB、NFAT和STAT3的激活；(9)抑制淋巴细胞活化和促炎细胞因子基因表达(IL-2、iNOS、TNF-α、COX-2和IFN-γ)；(10)减少促炎细胞因子例如IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；(11)下调COX-2、NOS-2和NF-κB的表达；(12)通过抑制磷脂酶A2和TXA2合酶活性来抑制类花生酸(eicosanoide)生成；(13)降低Th1和Th17细胞的应答；(14)降低ICAM和VCAM的表达，导致降低嗜中性粒细胞趋化性；(15)抑制MAPK磷酸化、粘附分子表达、信号转导及转录激活因子3(STAT-3)，以及(16)激活转录因子NRF2并诱导血红素氧合酶-1。
由以2至3种植物提取物的各种组合用于调控宿主防御机制的稳态的组合物(例如但不限于本公开内容中的含有游离B环类黄酮和黄烷的UP446或UP894-2)调控的与宿主防御功能以及肺结构完整性和功能相关的“生物标记物”，包括但不限于对特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度、IgA、IgG、IgM、CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、TCRγδ+、CD3-CD16+56+、GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1β；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-α；TNF-β/LTA 150、G-CSF、CCL2/3/5、IP-10、CXCL10、CRP、HMGB1、Nrf-2、INF-α/β/γ、NF-κB、PDGF-BB、MIP-1α、D-二聚体、血管紧张素II、心肌肌钙蛋白、VEGF、PDGF、白蛋白、SOD、MDA、8-异前列腺素F2α、过氧化氢酶(CAT)、晚期糖基化终末产物(AGEP)、谷胱甘肽过氧化物酶、iNOS、COX1、COX2、LO5、LO12、LO13。
如本文使用的，“病毒”包括但不限于高致病性禽流感(H5N1病毒株A)，甲型流感(H1N1、H3N2、H5N1)，乙型流感/Washington/02/2019样病毒；乙型流感/Phuket/3073/2013样病毒，甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒；冠状病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2(COVID-19)、MERS-CoV(MERS)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒A71(EV71)，副流感病毒和腺病毒。
如本文使用的，“微生物”包括但不限于感染呼吸道系统的致病性细菌，作为最常见的细菌性病原体的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)；作为主要的肺部真菌性病原体的曲霉菌属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、肺孢子菌属(Pneumocystis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、芽生菌属(Blastomyces)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci)、念珠菌属(Candida)物种(spp.)和地方性真菌；在上呼吸道和下呼吸道感染中；作为咽炎和扁桃体炎中优势性细菌性病原体的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。在患有病毒性疾病如感冒或流感后可能发展细菌感染。
如本文使用的，“呼吸系统和肺部”包括但不限于将空气输送到肺并将氧从肺输送到宿主中的所有其它器官的气道，例如：口和鼻：将空气从宿主体外吸入宿主呼吸系统内的开口；鼻窦：在宿主头部的骨骼之间的中空区域，其帮助调控宿主吸入的空气的温度和湿度；咽(喉)：将空气从宿主的口和鼻输送到气管(trachea)(气管(windpipe))的管；气管：连接宿主的喉和肺的通道；支气管：在宿主的气管(windpipe)底部处连接到每个肺内的管；肺：从空气中取出氧并将其传递到宿主血液内的两个器官；血流将二氧化碳输送到肺，并且将氧从肺输送到宿主的所有器官和其它组织；肌肉和骨骼帮助将宿主吸入的空气移动进入和离开宿主的肺。
“呼吸道感染”包括普通感冒、鼻塞、流鼻涕、打喷嚏、低烧、头痛、咽喉痛、胸闷、喘息、干且刺耳的咳嗽、疲劳、呼吸短促、充血、声音嘶哑、疼痛和吞咽困难、淋巴结肿大、面部压痛(特别是在眼下方或鼻梁处)的症状。普通感冒已从病毒感染进展到细菌感染的一些警告信号包括但不限于症状持续长于10–14天、发烧高于100.4度、患病几天后恶化而不是好转的发烧、扁桃体上充满白色脓液的斑点、鼻窦炎伴鼻后滴漏、鼻塞/充血、牙痛、咳嗽、呈绿色的鼻涕、面部压痛(特别是在眼下方或鼻梁处)、口臭、疲劳、发烧。
“肺感染”或“肺炎”是最常见的细菌或病毒性下呼吸道感染。它也可以由空气污染物，吸食烟草或电子烟引起。它是使一个或两个肺中的肺泡发炎的感染——这些肺泡可能充满流体或脓。肺炎症状包括但不限于产生痰或脓的咳嗽、发烧、发冷、呼吸困难、剧烈胸痛、脱水、疲劳、食欲缺乏、皮肤湿冷或出汗、呼吸急促、呼吸浅、呼吸短促、喘息、心率加快和血氧饱和度下降。肺感染”或“肺炎”可以通过胸部X光、CT扫描、血液测试和痰的培养进行诊断。作用于保护肺免于外来病原体的驻留巨噬细胞通过病原体的炎症应答触发，并负责肺炎中所见的组织病理学和临床发现。巨噬细胞吞食这些病原体并触发信号分子或细胞因子如TNF-a、IL-6和IL-1，其将炎症细胞如嗜中性粒细胞募集到感染的部位。它们还作用于将这些抗原呈递给触发细胞和体液防御机制两者的T细胞，激活补体和形成针对这些生物的抗体。这依次又引起肺实质的炎症，并且使衬里毛细血管“渗漏”，这导致渗出性充血并且强调了肺炎的发病机制。
构成“治疗有效量”或“营养益处量”的本公开内容的化合物、提取物或组合物的量将取决于以下而变：生物活性化合物，或营养组分，或正在治疗的状况及其严重程度的生物标记物、施用方式、治疗或饮食补充剂的持续时间，或待治疗受试者的年龄，但可以由本领域普通技术人员顾及其自身知识和本公开内容而照常规进行确定。在某些实施方案中，“有效量”或“治疗有效量”或“营养益处量”可以被证实为基于哺乳动物体重的量(即0.005mg/kg，0.01mg/kg，或0.1mg/kg，或1mg/kg，或5mg/kg，或10mg/kg，或20mg/kg，或50mg/kg，或100mg/kg，或200mg/kg或500mg/kg)。考虑到动物和人的全身面积和体重的差异，可以利用FDA指南从动物研究中的“有效量”或“治疗有效量”或“营养有益量”推断出人类等效日剂量。
如本文使用的，“饮食补充剂”是这样的产品，其改善、促进、增加、管理、控制、维持、优化、缓和、减少、抑制、建立或防止稳态，平衡，与自然状态或生物过程相关的特定状况，或者结构和功能完整性，不平衡或妥协或遏制或过度刺激的生物功能或表型状况，或者防御机制(即并不用于诊断、治疗、减轻、治愈或预防疾病)。例如，关于宿主防御机制，“饮食补充剂”可以被用于调节、维持、管理、平衡、遏制或刺激适应性或先天免疫的任何组分，作为增强疫苗功效的免疫刺激物特异性的免疫佐剂，增强巨噬细胞的吞噬活性，改善NK细胞的自然杀伤活性，调控促炎细胞因子的产生水平，减轻炎症和组织损伤，诱导抗体的应答和产生，增强抗体依赖性细胞的细胞毒性，刺激T细胞增殖，促进免疫抑制性调节性t细胞的生成，以及保护免疫细胞和肺细胞免于HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤，检查不受控制的NFκB激活，以及保护器官或组织免于氧化应激。在某些实施方案中，饮食补充剂是特殊类别的饮食补充剂、天然营养素、食物、功能性食物、医疗食物，并且不是药物。
如本文使用的，“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”指患有感兴趣的疾病或状况的哺乳动物例如人中对感兴趣的疾病或状况的治疗，并且包括：(i)预防疾病或状况在哺乳动物中发生，特别是当此类哺乳动物易患该状况但尚未被诊断为患有该状况时；(ii)抑制疾病或状况，即阻止其发展；(iii)缓解或缓和疾病或状况，即引起疾病或状况的消退；或者(iv)缓解起因于疾病或状况的症状(例如缓解咳嗽和发烧、缓解疼痛、减少炎症、减少肺水肿、减轻肺炎)，而不是解决潜在的疾病或状况；(v)平衡免疫稳态的调控或者改变疾病或状况的表型。
如本文使用的，术语“疾病”和“状况”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定病或状况可能没有已知的致病因子(使得病因学尚未得出)，并且它因此尚未被识别为疾病而仅是不期望的状况或综合征，其中临床医生已鉴定了一组或多或少的特定症状。疾病或状况可能是急性的，例如病毒感染(SARS、COVID-19、MERS、肝炎、流感)或微生物感染；并且可能是慢性的，例如通过暴露于空气污染和吸烟引起的肺损伤。来自稳态失衡的受损的免疫功能可以引起疾病或状况，或者可以使得哺乳动物更易患传染病，或者可以导致与来自病毒或微生物的感染或空气污染物直接或间接相关的更多的继发性器官和组织损伤。
如本文使用的，“统计显著性”指当使用学生t检验进行计算时0.050或更小的p值，并且指示了所测量的特定事件或结果不太可能是偶然出现的。
为了施用的目的，本主题的化合物可以作为原料化学品进行施用，或者可以配制为药物或营养或食物组合物。本主题的药物或营养组合物包含具有本主题中描述的结构的化合物以及药学或营养学上或常规食物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。具有此处所述的结构的化合物以有效治疗感兴趣的特定疾病或状况或者补充天然营养素的量——即足以建立宿主防御机制的稳态或者促进一般而言的先天或适应性免疫或免疫稳态或本文所述的任何其它相关适应症的量存在于组合物中，并且一般对宿主没有毒性或具有可接受的毒性。
本公开内容的化合物或组合物或者其药学或营养学上可接受的盐以纯的形式或者在适当的药物或营养组合物中的施用可以经由用于发挥类似效用的任何可接受的药剂施用模式来进行。本公开内容的药物或营养组合物可以通过将本公开内容的化合物与适当的药学或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以被配制成呈固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、饮料、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、乳膏、洗剂、酊剂、sashay、即饮剂、面膜、微球体和气溶胶。所公开的生物类黄酮组合物还可以在其它食物成分内被配制成常规食物、功能性食物、营养食物、医疗食物。施用此类药物或营养组合物的典型途径包括经口、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、颊、直肠、阴道或鼻内。如本文使用的，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。
配制本公开内容的药物或营养组合物，以便允许其中包含的活性成分在组合物施用于患者时是生物可利用的。将会施用于受试者或患者或哺乳动物的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单一剂量单位，并且呈气溶胶形式的本公开内容的化合物或提取物或2-3种植物提取物的组合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法对本领域技术人员是已知的或将为显而易见的；例如参见Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia College of Pharmacy andScience，2000)。在任何情况下，待施用的组合物将会含有治疗有效量的本公开内容的化合物或者其药学或营养学上可接受的盐，用于按照本主题的教导治疗感兴趣的疾病或状况。
本公开内容的药物或营养组合物可以呈固体或液体的形式。在一个方面，(一种或多种)载体是颗粒状的，使得组合物例如呈片剂或粉末形式。(一种或多种)载体可以是液体，其中组合物是例如经口糖浆剂、可注射液体或气溶胶，其可用于例如吸入施用中。
当预期用于经口施用时，药物或营养组合物呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式内。
作为用于经口施用的固体组合物，药物或营养组合物可以被配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶、sashay、糯米纸囊剂(wafer)、棒或类似形式。此类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可以存在以下中的一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、环糊精、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味料；以及着色试剂。
当药物或营养组合物呈胶囊(例如明胶胶囊)的形式时，除上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体，例如聚乙二醇或油。
药物或营养组合物可以呈液体形式，例如酏剂、酊剂、糖浆剂、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个例子，液体可以用于经口施用或用于通过注射递送。当预期用于经口施用时，除本化合物之外，有用的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂中的一种或多种。在预期通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
本公开内容的液体药物或营养组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其它类似形式，均可以包括以下佐剂中的一种或多种：无菌稀释剂例如注射用水；盐水溶液例如生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；不挥发性油，例如合成甘油单酯或甘油二酯，其可以充当用作溶剂或悬浮介质，聚乙二醇，丙三醇，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是普遍有用的佐剂。可注射药物或营养组合物是无菌的。
预期用于肠胃外或经口施用的本公开内容的液体药物或营养组合物应该含有一定量的本公开内容的化合物，使得将会获得合适的剂量。
本公开内容的药物或营养组合物可以预期用于局部施用，在所述情况下，载体可以适当地包含溶液、乳剂、乳膏、洗剂、软膏或凝胶基质。基质例如可以包含以下的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂例如水和醇以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物或营养组合物中。如果预期用于经皮施用，则组合物可以包括经皮贴剂或离子电渗装置。
本公开内容的药物或营养组合物可以预期呈例如栓剂的形式用于直肠施用，所述栓剂将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有油性基质作为合适的非刺激性赋形剂。此类基质包括羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
本公开内容的药物或营养组合物可以包括各种材料，其修饰固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包括在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，活性成分可以包裹在明胶胶囊中。
呈固体或液体形式的本公开内容的药物或营养组合物可以包括结合本公开内容的化合物并从而有助于化合物递送的试剂。可以以这种能力起作用的合适试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。
呈固体或液体形式的本公开内容的药物或营养组合物可以包括减小颗粒大小以例如改善生物利用度。含有或不含赋形剂的组合物中的粉末、颗粒、粒子、微球体等等的大小可以是宏观的(例如肉眼可见的或大小至少100μm)、微观的(例如大小范围可以为约100μm至约100nm)、纳米的(例如大小可以不多于100nm)以及其之间的任何大小或其任何组合，以改善大小和松密度。
本公开内容的药物或营养组合物可以由剂量单位组成，所述剂量单位可以作为气溶胶进行施用。术语气溶胶被用于表示范围从胶体性质的系统到包含加压包装的系统的各种系统。递送可以通过液化或压缩气体或者通过分配活性成分的合适泵系统。本公开内容的化合物的气溶胶可以在单相、双相或三相系统中进行递送，以便递送(一种或多种)活性成分。气溶胶的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等等，其一起可以形成试剂盒。无需过度实验，本领域的技术人员可以确定最适当的(一种或多种)气溶胶。
本公开内容的药物或营养组合物可以通过药物或营养领域众所周知的方法进行制备。例如，可以通过将本公开内容的化合物与无菌水、蒸馏水、去离子水组合以便形成溶液来制备预期通过注射进行施用的药物或营养组合物。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与本公开内容的化合物非共价相互作用以便促进化合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
本公开内容的化合物或者其药学或营养学上可接受的盐以治疗有效量进行施用，所述治疗有效量将取决于各种因素而变，所述因素包括所采用的具体化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用持续时间；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用模式和时间；排泄率；药物组合；特定病症或状况的严重程度；以及经历疗法的受试者。
本公开内容的化合物或者其药学或营养学上可接受的衍生物也可以与食物、水和一种或多种其它治疗剂的施用同时、在其之前或之后进行施用。此类组合疗法包括施用含有本公开内容的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和一种或多种另外的活性剂的单个药物或营养剂量制剂，以及施用在其自身分开的药物或营养剂量制剂中的本公开内容的化合物或提取物或具有来自2-3种植物提取物的游离B环类黄酮和黄烷的组合物以及每种活性剂。例如，本公开内容的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和另一种活性剂可以在单个经口剂量组合物如片剂或胶囊中一起施用于患者，或者每种药剂可以以分开的经口剂量制剂进行施用。在使用分开的剂量制剂的情况下，本公开内容的化合物和一种或多种另外的活性剂可以在基本上相同的时间，即同时进行施用，或在分开交错的时间，即序贯进行施用；组合疗法应被理解为包括所有这些方案。
应理解，在本说明书中，所描绘的式的取代基或变量的组合仅当此类组合(contribution)导致稳定的化合物才是许可的。
本领域技术人员还将会了解，在本文所述的方法中，中间化合物的官能团可能需要被合适的保护基团保护。此类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。用于羟基的合适保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等等。用于氨基、脒基和胍基的合适保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等等。用于巯基的合适保护基团包括C(O)R”(其中R”是烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等等。用于羧酸的合适保护基团包括烷基、芳基或芳烷基酯。保护基团可以按照本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术进行添加或去除。保护基团的使用在Green，T.W.和P.G.M.Wutz，Protective Groups in OrganicSynthesis(1999)，第3版，Wiley中进行详细描述。如本领域技术人员将会了解的，保护基团也可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。
本领域技术人员还将会了解，尽管本主题的化合物的此类受保护衍生物可能像这样并不具有药理学活性，但它们可以被施用于哺乳动物，并且其后在体内代谢以形成具有药理学活性的本公开内容的化合物。因此，此类衍生物可以被描述为“前药”。本主题的化合物的所有前药都包括在本公开内容的范围内。
此外，以游离碱或酸形式存在的本公开内容的所有化合物或提取物都可以通过本领域技术人员已知的方法，通过用适当的无机或有机碱或酸处理而转换为其药学或营养学上可接受的盐。本公开内容的化合物的盐可以通过标准技术而被转换为其游离碱或酸形式。
在任何前述实施方案中，包含提取物或化合物的混合物的组合物可以以按重量计的特定比率进行混合。例如，分别含有包括但不限于黄芩苷和儿茶素的生物类黄酮的黄芩属提取物和金合欢属提取物可以分别以4:1的重量比进行共混。在某些实施方案中，本公开内容的两种提取物或化合物的比率(按重量计)范围为约0.5:5至约5:0.5。当使用多于两种提取物或化合物(例如三种、四种、五种)时，应用类似的范围。示例性比率包括0.5:1、0.5:2、0.5:3、0.5:4、0.5:5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5、或5:0.5。在进一步的实施方案中，已将所公开的黄芩属提取物的个别游离B环类黄酮提取物和金合欢属黄烷提取物组合成被称为UP446的组合物，例如但不限于4:1的共混比。
在进一步的实施方案中，将以这些提取物的各种组合的黄芩属和金合欢属的个别提取物的此类组合，例如但不限于UP446或UP223或UP894-II或UG0408，在体外、离体或体内模型上评估所发觉的生物学功能的优点/缺点和出乎意料的协同作用/拮抗作用，以及宿主防御机制的稳态的有效调整，并且减轻由细胞因子风暴、氧化应激和脓毒症引起的器官损伤。由于每种提取物中的化学组分的多样性以及来自每种提取物中的不同类型的生物活性类黄酮化合物的不同作用机制，以及组合物中使生物和营养输出达到最大的生物类黄酮化合物的ADME的潜在增强，基于在体外、离体或体内模型上测量的出乎意料的协同作用，选择具有黄烷或游离B环类黄酮的个别提取物的特定共混比率的最佳组合物。
在任何前述实施方案中，包含用关于生物类黄酮化合物的游离B环类黄酮和黄烷标准化的提取物的混合物的组合物可以以某些百分比水平或比率存在。在某些实施方案中，包含黄芩属根提取物粉末或金合欢属心材提取物的组合物可以包括0.1％至99.9％或约10％至约40％或约60％至约80％的游离B环类黄酮，0.1％至99.9％或约1％至约10％或约5％至约50％的黄烷，或其组合。在某些实施方案中，包含黄芩属游离B环类黄酮提取物粉末或金合欢属黄烷提取物的组合物可以包括约0.01％至约99.9％的黄芩苷或儿茶素，或者包括至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％、95％的黄芩苷或儿茶素。
在某些实例中，本公开内容的组合物可以被配制为进一步包含药学或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量％)，或0.5重量百分比(重量％)，或5％，或25％，或50％或80％至约99重量％的提取物混合物的活性成分或主要活性成分。在进一步的实施方案中，药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量％)至约90重量％的生物类黄酮，约0.5重量％至约80重量％的黄芩苷，约0.5重量％至约86重量％的总生物类黄酮，约0.5重量％至约90重量％、约0.5重量％至约70重量％、约1.0重量％至约60重量％、约1.0重量％至约20重量％、约1.0重量％至约10重量％、约3.0重量％至约9.0重量％、约5.0重量％至约10重量％、约3.0重量％至约6重量％的提取物混合物中的主要活性成分等等。在任何上述制剂中，本公开内容的组合物被配制为片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒。
本文还考虑的是所公开化合物的药剂。此类产物可以起因于例如所施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等等，主要由于酶促过程。相应地，所考虑的化合物是通过包括将所考虑的化合物或组合物施用于哺乳动物持续足以产生其代谢产物的时间段的方法而产生的那些化合物。此类产物通常通过以下进行鉴定：将本公开内容的放射性标记或未放射性标记的化合物以可检测的剂量施用于动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、犬、猫、猪、绵羊、马、猴或人，允许足够新陈代谢发生的时间，并然后从尿、血液或其它生物样品中分离其转换产物。
所考虑的化合物、医学组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学或营养学或美容学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或由其组成。如本文使用的，短语“药学或营养学或美容学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括已被美国食品和药物管理局批准为对于人或家畜中的使用是可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。所考虑的化合物、医学组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学或营养学或美容学上可接受的盐或由其组成。如本文使用的，短语“药学或营养学或美容学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。
所考虑的游离B环类黄酮加黄烷组合物可以包含或另外包含至少一种另外的活性物、佐剂、赋形剂或载体或由其组成，所述选自以下中的一种或多种：姜黄提取物或姜黄素、榄仁属(terminalia)提取物、柳树皮提取物、芦荟(Aloe vera)叶凝胶粉末、茯苓(Poriacoca)提取物、迷迭香提取物、迷迭香酸、魔爪根提取物、卡宴辣椒提取物或辣椒素、花椒皮提取物、喜林芋属(philodendra)树皮提取物、啤酒花提取物、乳香属(Boswellia)提取物、玫瑰果提取物、槐属(Sophora)提取物、睡茄(Withania somnifera)、三岛柴胡(Bupleurumfalcatum)、柴胡(Radix Bupleuri)、甘草(Radix Glycyrrhiza)、连翘(FructusForsythiae)、西洋参(Panax quinquefolium)、人参(Panax ginseng C.A.Meyer)、高丽红参(Korea red ginseng)、香菇(Lentinula edodes)(香菇(shiitake))、白桦茸(Inonotusobliquus)(白桦茸(Chaga mushroom))、香菇、枸杞(Lycium barbarum)、裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)(子实体)、变色栓菌(Trametes versicolor)(子实体)、瓜尔豆(Cyamopsis tetragonolobus)、瓜尔豆(瓜尔胶)、变色栓菌、冈村枝管藻(Cladosiphonokamuranus Tokida)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、薄荷属(Mentha)或薄荷提取物、姜或黑姜提取物、葡萄籽多酚、ω-3或ω-6脂肪酸、磷虾油、γ-亚麻酸、柑橘生物类黄酮、针叶樱桃浓缩物、虾青素、碧萝芷、白藜芦醇、抗坏血酸、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、(一种或多种)矿物质氨基酸螯合物、(一种或多种)氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡萄糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、UCII、鲨鱼和牛软骨、蘑菇、海藻、酵母、褐藻、龙舌兰糖浆、褐海藻、可发酵纤维、谷物、海参、龙舌兰、朝鲜蓟、芦笋、韭菜、大蒜、洋葱、黑麦、大麦仁、小麦、梨、苹果、番石榴、榅桲、李、醋栗、橙和其它柑橘类水果。
所考虑的游离B环类黄酮加黄烷组合物可以包含或另外包含至少一种另外的天然酚类活性成分或由其组成。在一些实施方案中，至少一种生物活性成分可以包含植物粉末或植物提取物等等或者由其组成。含有上述免疫抑制性天然酚类化合物的植物物种包括但不限于荜拨(Piper longum Linn)、黄连(Coptis chinensis Franch)、当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、光果甘草(Glycyrrhizaglabra)、姜黄(Curcuma longa)、迷迭香(Salvia Rosmarinus)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、生姜(Zingiber officinalis)、远志(Polygala tenuifolia)、白桑(Morusalba)、啤酒花(Humulus lupulus)、忍冬(Lonicera Japonica)、鼠尾草(Salviaofficinalis L.)、积雪草(Centella asiatica)、乳香(Boswellia carteri)、欧薄荷(Mentha longifolia)、青海云杉(Picea crassifolia)、柑(Citrus nobilis Lour)、酸橙(Citrus aurantium L.)、茶树(Camellia sinensis L.)、野葛根(Pueraria mirifica)、葛根(Pueraria lobata)、大豆(Glycine max)、辣椒属物种(Capsicum species)、虎杖(Fallopia japonica)。许多酚类化合物也在各种水果和蔬菜中发现，所述水果和蔬菜例如番茄、十字花科蔬菜、葡萄、蓝莓、覆盆子、桑葚、苹果、辣椒等。
游离B环黄酮由以下中的一种或多种构成：黄芩苷、黄芩素、黄芩素糖苷、汉黄芩素、汉黄芩素葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素糖苷、千层纸素、千层纸素糖苷、千层纸素葡萄糖醛酸苷、白杨素、白杨素糖苷、白杨素葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷和野黄芩苷糖苷、去甲汉黄芩素和去甲汉黄芩素糖苷、高良姜素或其任何组合。可以按照本主题的方法使用的游离B环类黄酮包括通过上文阐述的一般结构说明的化合物。组合物中的标准化游离B环生物类黄酮是通过转基因微生物、通过P450酶、通过糖转移酶或酶的组合、通过微生物合成、代谢、生物降解、生物转换、生物转化、由小碳单元生物合成的。
一种或多种游离B环类黄酮是从高等植物的属中富集且标准化的，所述高等植物的属包含以下中的至少一种或其组合：假鹰爪属(Desmos)、多头金绒草属(Achyrocline)、木蝴蝶属(Oroxylum)、榄桐属(Buchenavia)、香青属(Anaphalis)、山芫荽属(Cotula)、湿鼠曲草属(Gnaphalium)、蜡菊属(Helichrysum)、矢车菊属(Centaurea)、泽兰属(Eupatorium)、酒神菊属(Baccharis)、乌桕属(Sapium)、黄芩属、石荠苎属(Molsa)、羽萼木属(Colebrookea)、水苏属(Stachys)、牛至属(Origanum)、新塔花属(Ziziphora)、山胡椒属(Lindera)、黄肉楠属(Actinodaphne)、金合欢属、鱼藤属(Derris)、甘草属(Glycyrrhiza)、崖豆藤属(Millettia)、水黄皮属(Pongamia)、灰毛豆属(Tephrosia)、菠萝蜜属(Artocarpus)、榕属(Ficus)、粉叶蕨属(Pityrogramma)、隐囊蕨属(Notholaena)、松属(Pinus)、榆属(Ulmus)、山姜属(Alpinia)或其组合。
一种或多种游离B环类黄酮是从包含以下中的至少一种的植物物种中富集且标准化的：黄芩、半枝莲(Scutellaria barbata)、直萼黄芩(Scutellaria orthocalyx)、北美黄芩(Scutellaria lateriflora)、盔状黄芩(Scutellaria galericulata)、粘毛黄芩(Scutellaria viscidula)、滇黄芩(Scutellaria amoena)、甘肃黄芩(Scutellariarehderiana)、丽江黄芩(Scutellaria likiangensis)、盔状黄芩、韩信草(Scutellariaindica)、石娱蚣草(Scutellaria sessilifolia)、粘毛黄芩、滇黄芩、甘肃黄芩、丽江黄芩、Scutellaria orientalis、木蝴蝶(Oroxylumindicum)、西番莲(Passiflora caerulea)、粉色西番莲(Passiflora incarnata)、平菇(Pleurotus ostreatus)、松乳菇(Lactariusdeliciosus)、Suillus bellinii、洋甘菊、胡萝卜、蘑菇、蜂蜜、蜂胶、西番莲花和木蝴蝶花或其组合。
黄烷由以下中的一种或多种构成：儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表茶黄素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素没食子酸酯或其任何组合。可以按照本主题的方法使用的黄烷包括通过上文阐述的一般结构说明的化合物。组合物中的标准化黄烷生物类黄酮是通过转基因微生物、通过P450酶、通过糖转移酶或酶的组合、通过微生物合成、代谢、生物降解、生物转换、生物转化、由小碳单元生物合成的。
本主题的黄烷分离自选自金合欢属植物的一种或多种植物。在优选的实施方案中，植物包含以下，或在一些实施方案中选自以下或其组合：儿茶(黑儿茶)、儿茶(Senegalia catechu)、皱荚藤儿茶(Acacia concinna)、金合欢(Acacia farnesiana)、阿拉伯胶树(Acacia Senegal)、Acacia speciosa、阿拉伯金合欢(Acacia arabica)、尖叶藤儿茶(Acacia caesia)、羽叶金合欢(Acacia pennata)、藤金合欢(Acacia sinuata)、黑荆(Acacia mearnsii)、密花相思树(Acacia picnantha)、银荆(Acacia dealbata)、大叶相思(Acacia auriculiformis)、绢毛相思(Acacia holoserecia)、马占相思(Acaciamangium)、腰果(Anacardium occidentale)(腰果种皮)、儿茶钩藤(白儿茶)、钩藤(Uncariarhynchophylla)、茶树(Camellia sinensis)、普洱茶(Camellia assumica)、巴西莓(Euterpe oleracea)(阿萨伊果)、云实(Caesalpinia decapetala)、凤凰木(Delonixregia)、银杏(Ginkgo biloba)、红花槭(Acer rubrum)、椰子(Cocos nucifera)、巴西补血草(Limonium Brasiliense)、Acerola bagasse、乳油木(Vitellaria paradoxa)、葡萄(Vitis vinifera)、散沫花(Lawsonia inermis)、波罗蜜(Artocarpus heterophyllus)、紫苜蓿(Medicago sativa)、光叶百脉根(Lotus japonicus)、湿地百脉根(Lotusuliginosus)、Eisenia bicyclis、Hedysarum sulfurescens、刺槐(Robiniapseudoacacia)；苹果、杏、李子、樱桃、葡萄叶、草莓、豆类、柠檬、茶、红茶、绿茶、南非博士茶、大麦粒、绿藻(琉球伞藻(Acetabularia ryukyuensis))、美羽软粒藻(Chondrococcushornemannii)、巧克力(可可)、生咖啡豆或其组合。
在一些实施方案中，本公开内容的游离B环类黄酮或黄烷化合物或提取物可以分离自植物或海洋来源，例如来自实施例和贯穿本申请的其它地方包括的那些植物。用于分离化合物的合适的植物部分包括叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、细枝、块茎、根、根状茎、根皮、树皮表面、嫩枝、种子、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花、干细胞或其任何组合。在一些相关的实施方案中，化合物或提取物从植物来源中进行分离，并且进行合成修饰以含有所述取代基中的任一种。在这方面，从植物中分离的化合物的合成修饰可以使用多种技术来完成，所述技术包括但不限于通过转基因微生物、通过P450酶、通过糖转移酶或酶的组合、通过微生物总有机合成、代谢、生物降解、生物转换、生物转化、由小碳单元生物合成的，所述技术是本领域已知的并且完全在本领域普通技术人员的知识内。
本主题的其它实施方案涉及以2至3种植物提取物的各种组合的标准化游离B环类黄酮加黄烷生物类黄酮组合物，例如但不限于本公开内容的实施例中说明的UP446或UP894-II，用于调控宿主防御机制的稳态的用途的方法，包括但不限于优化或平衡免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康免疫功能；保护免疫系统免于通过空气污染诱导的氧化应激损伤；保护正常健康的肺功能免于病毒感染、细菌感染和空气污染；支持健康的炎症应答；维持针对感染的细胞因子和细胞因子应答的健康水平；升高且维持抗炎细胞因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-β/LTA、CRP和CINC3；控制氧化应答并减轻氧化应激；通过增加SOD和NRf2来加强抗氧化能力；降低晚期糖基化终末产物，增加谷胱甘肽过氧化物酶；中和活性氧簇，并且预防氧化应激引起的呼吸、肺和免疫系统的结构完整性损伤和功能丧失，维持肺清洁和排毒能力；保护肺结构完整性和氧交换能力；维持呼吸道并增强肺泡的氧吸收力；减轻氧化应激引起的肺部损伤；促进肺的微循环并保护正常凝血功能；增加白血细胞的活性和计数，增强自然杀伤(NK)细胞功能；增加T和B淋巴细胞的计数；增加CD4+和CD8+细胞计数；增加CD3+、CD4+NKp46+自然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+γδT细胞和CD8+细胞计数；保护且促进巨噬细胞的吞噬活性；支持或促进正常的抗体产生；维持呼吸器官中健康的肺部微生物群或共生系统；缓解或减轻感冒/流感样症状，包括但不限于身体疼痛、咽喉痛、咳嗽、轻微咽喉和支气管刺激、鼻充血、鼻窦充血、鼻窦压力、流鼻涕、打喷嚏、嗅觉丧失、味觉丧失、肌肉酸痛、头痛、发烧和发冷；帮助咳出痰(粘液)和稀薄支气管分泌物以使咳嗽更有效；减少支气管刺激的严重程度；减少由病毒感染、微生物感染和空气污染引起的肺损伤或水肿或炎性细胞浸润的严重程度；在整个感冒/流感或污染季节支持支气管系统和舒适的呼吸；预防或治疗肺纤维化；减少普通感冒/流感的持续时间或严重程度；减少呼吸系统的病毒和细菌感染的严重程度或持续时间；预防或治疗或治愈由病毒、微生物和空气污染物引起的呼吸道感染；管理或治疗或预防呼吸道感染或逆转其进展；促进和加强和恢复肺和整个呼吸系统的修复和更新其功能等等。
实施例
实施例1.来自植物的游离B环类黄酮的制备和定量
将来自直萼黄芩根，或黄芩根或北美黄芩整株植物的植物材料研磨至不大于2mm的粒径。然后将干燥的研磨的植物材料(60g)转移到锥形瓶中，并且加入甲醇:二氯甲烷(1:1)(600mL)。将混合物摇动一小时，过滤并且用甲醇:二氯甲烷(1:1)(600mL)再次提取生物量。将有机提取物合并并在真空下蒸发，以提供有机提取物(参见下表1)。在有机提取后，使生物量风干并且用超纯水(600mL)提取一次。将水溶液过滤并冷冻干燥，以提供水性提取物(参见下表1)。
表1.各种黄芩属物种的有机提取物和水性提取物的产率
植物来源 量 有机提取物 水性提取物
直萼黄芩根 60g 4.04g 8.95g
黄芩根 60g 9.18g 7.18g
北美黄芩(整株植物) 60g 6.54g 4.08g
来自不同植物物种的有机提取物和水性提取物中的游离B环类黄酮的存在和量已得到确认，并且在表5中阐述。游离B环类黄酮通过HPLC使用Luna C-18柱(250x 4.5mm，5μm)使用0.1％磷酸和在22分钟内从80％到20％的乙腈梯度来进行定量分析。游离B环类黄酮使用UV检测器在254nm处进行检测，并且通过与游离B环类黄酮标准的比较基于保留时间进行鉴定。
表2.活性植物提取物中的游离B环类黄酮含量
*AE：水性提取物；*OE：有机提取物
实施例2.植物的标准化提取物中的游离B环类黄酮的生成
将黄芩根用水清洁且切成小片。将清洁且切片的根装入提取器内，并且在90–95℃的温度下用热水提取两次。对于每1kg根，加入约8L水并且在90–95℃下提取约1小时。在收集提取溶液后，将根在90–95℃下用6L/kg的水再次提取另外一小时。收集提取溶液并且将其与第一次提取溶液合并。将提取溶液过滤并然后用盐酸或硫酸的水溶液将溶液的pH调整至约2。使酸性水溶液静置约2小时并然后将沉淀物过滤并且用纯净水洗涤。使沉淀的提取物在80–90℃下干燥。将干燥的粉末研磨并共混。提取产率为来自介于10-15kg根的1千克富集的生物类黄酮提取物。如上文实施例1中通过HPLC方法定量生物类黄酮的含量，以产生被编码为RM405的标准化提取物，其含有不少于75％的黄芩苷，具有小于5％的干燥损失。RM405的粒径被控制为80％通过80网目。用ICP-MS分析了关于铅、砷、Pb、Cd和Hg的重金属的潜在污染。还测量了大肠菌群、霉菌、酵母和总需氧菌平板计数的潜在污染，以满足USP/AOAC/KFDA的要求。
来自黄芩属的根或茎或整株植物的标准化生物类黄酮提取物可以通过以下实现：在用酸性溶液中和后沉淀碱性水性提取物溶液，或在水中的重结晶，或用不同类型树脂的柱层析，以实现生物类黄酮的2-10倍富集达介于20％–99％的纯度。
实施例3.来自儿茶和腰果种皮的标准化生物类黄酮提取物的开发。
用下述溶剂系统提取儿茶(500mg研磨的树皮)。(1)100％水，(2)80:20水:甲醇，(3)60:40水:甲醇，(4)40:60水:甲醇，(5)20:80水:甲醇，(6)100％甲醇，(7)80:20甲醇:THF，(8)60:40甲醇:THF。使提取物浓缩并且在低真空下干燥。这些干提取物中的黄烷含量通过以下中的HPLC方法进行定量，其结果列于表4中。
将干燥的研磨的腰果种皮粉末(腰果)(60g)装入三个100ml不锈钢管内，并且使用ASE 350自动提取器在80℃和1500psi的压力下用溶剂70％乙醇的DI水溶液提取两次。将提取溶液自动过滤且收集。将合并的有机提取溶液用旋转蒸发器在真空下进行蒸发，以得到粗制的70％乙醇提取物(R00883-70E，23.78g，39.63％提取产率)。
使用以下分析方法来通过C18反相柱(Phenomenex，USA，Luna 5μm，250mm x4.6mm)用Hitachi HPLC/PDA系统确定来自儿茶心材或腰果种皮的生物类黄酮提取物中的游离儿茶素的量。流动相A：0.1％磷酸水溶液，以及流动相B：乙腈被用于洗脱(表2)，其流速为1.0ml/分钟，伴随在275nm下的UV吸光度和35℃的柱温。儿茶素参考标准品购自Sigma-Aldrich Co。使参考标准品溶解于甲醇:0.1％H3PO4(1:1)中，其中儿茶素(C1251)浓度为0.5mg/ml且表儿茶素(E1753)浓度为0.1mg/ml。测试样品在容量瓶中于50％甲醇的0.1％H3PO4溶液中以2mg/ml进行制备，并且进行超声处理直至溶解(大约10分钟)，并且然后将其冷却至室温，充分混合并通过0.45μm尼龙注射器式过滤器进行过滤。通过将20μL样品注入HPLC内来执行HPLC分析。
表3.HPLC分析方法的梯度表
时间(分钟) 流动相A 流动相B
0.0 85.0 15.0
7.0 85.0 15.0
12.0 10.0 90.0
16.5 10.0 90.0
16.6 85.0 15.0
24.0 85.0 15.0
使用儿茶素和表儿茶素作为标准品，基于保留时间和PDA数据来定量化学组分。来自金合欢属提取物的儿茶素定量结果在表4中进行阐述。如表4中所示的，由用80％甲醇/水的溶剂提取生成的黄烷提取物提供了黄烷组分的最佳浓度。腰果种皮的70％乙醇提取物中的生物类黄酮含量为9.4％儿茶素和6.1％表儿茶素。
表4.用于生成来自儿茶的标准化黄烷提取物的溶剂
将儿茶心材去皮，用水清洁且切成小片。将清洁且切片的心材装入提取器内，并且在约115℃的温度下用热水提取两次。对于每1kg儿茶心材，加入约4L水并且在105-115℃下提取约5小时。将提取溶液过滤并然后在真空下在50-60℃之间进行浓缩。将浓缩溶液在约5℃的温度下保持冷却7-10天，并且然后将沉淀物过滤，并且将湿滤饼在约-20℃下冷冻并干燥一天。在90℃下干燥10小时后，将干燥的粉末研磨，过筛并共混。最终提取物与心材的提取比率为来自20kg儿茶心材的约1kg生物类黄酮提取物。生物类黄酮的含量通过HPLC方法如下进行定量，以产生被编码为RM406的标准化提取物，其含有不少于65％的儿茶素和表儿茶素总量，具有小于5％的干燥损失。RM406的粒径被控制为80％通过80网目。用ICP-MS分析了关于铅、砷、Pb、Cd和Hg的重金属的潜在污染。还测量了大肠菌群、霉菌、酵母和总需氧菌平板计数的潜在污染，以满足USP/AOAC/KFDA的要求。
来自儿茶或儿茶钩藤的心材或树皮或整株植物或者腰果种皮的标准化生物类黄酮提取物可以通过以下实现：浓缩植物提取物溶液，然后沉淀或在乙醇/水溶剂中重结晶，或用不同类型树脂柱层析，以实现生物类黄酮的2–10倍富集达介于10％–99％的纯度。
实施例4.标准化生物类黄酮组合物的制剂
被编码为UP446的生物类黄酮组合物用三种成分进行配制：两种标准化提取物如含有>65％关于儿茶素和表儿茶素的总黄烷的金合欢属提取物(实施例3中的RM406)，含有>75％关于黄芩苷、黄芩素及其它的游离B环类黄酮的黄芩属提取物(实施例2中的RM405)；以及赋形剂——麦芽糖糊精。黄烷和游离B环类黄酮的比率可以基于指示和功能性进行调整。(一种或多种)赋形剂的量将基于每种成分中的实际活性含量进行调整。关于每个个别产品分批的共混表必须基于关于每个个别成分分批的产品规格和QC结果生成。推荐在2-5％的范围内的过量的活性成分以满足产品规格。此处呈现的是关于UP446的一个分批(批次#G1702)的共混表，其中关于游离B环类黄酮的提取物:黄烷提取物:麦芽糖糊精的共混比率为80:17:3。
表5.UP446组合物中的游离B环类黄酮和黄烷含量
被编码为UP223的生物类黄酮组合物用以下进行配制：含有>65％作为儿茶素和表儿茶素的总黄烷来自金合欢属心材提取物的标准化提取物，以及含有>75％关于黄芩苷、黄芩苷及其它的游离B环类黄酮来自黄芩属茎提取物的标准化提取物。游离B环类黄酮提取物:黄烷提取物的共混比率为90:10。
被编码为UP894-II的生物类黄酮组合物用以下进行配制：含有>90％作为儿茶素和表儿茶素的总黄烷来自金合欢属心材提取物的标准化提取物，以及含有>90％关于黄芩苷、黄芩素及其它的游离B环类黄酮来自黄芩属根提取物的标准化提取物。游离B环类黄酮提取物:黄烷提取物的共混比率为4:1，其中黄芩苷含量在70-80％之间且总儿茶素在15-20％之间(表6)。
表6.三种生物类黄酮组合物的说明
实施例5：MTT测定被用于确定用UP894-II在24小时高氧暴露条件下的细胞活力
将RAW 264.7细胞或留在室内空气中(21％氧O2)，或在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP894-II(0–256μg/ml)或其媒介物的存在下暴露于95％O2 24小时。如通过制造商描述通过MTT测定来确定细胞活力。
与其为接种时获取的读数的T0对照相比，在T24室内空气对照组中见到显著更多的活细胞。与室内空气对照组相比，O2对照组(95％O2)中的细胞活力显著降低。用浓度在0.16％和0.32％的媒介物DMSO的处理对O2中的细胞活力没有作用。为了确定产物UP894-II是否可以改善通过氧化应激而受损的巨噬细胞功能，首先在正常培养条件或高氧条件下进行了该产物对细胞活力的剂量曲线。下图(图4)是3次独立实验的代表性结果。与DMSO对照组相比，剂量低于128μg/ml的UP894-II并未显著改变细胞活力。因此，在低于128μg/ml的剂量下测试了UP894-II在增强巨噬细胞功能方面的功效。
实施例6：UP894-II增加巨噬细胞的吞噬活性
将RAW 264.7细胞或留在室内空气中(21％O2)，或在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP894-II(0–100μg/ml)的存在下暴露于95％O2 24小时。然后使细胞与FITC标记的乳胶微珠一起温育一小时，并且用鬼笔环肽和DAPI进行染色以分别显现肌动蛋白细胞骨架和核。为了定量吞噬活性，计数至少200个细胞/组，并且将珠数目/细胞表示为21％O2(0μg/ml)对照组的百分比。将UP894-II以3.7、11.1、33.3和100μg/ml进行测试。这些剂量基于细胞活力测定进行确定。
如图5中所示，使培养的巨噬细胞在不同浓度的UP894-II或单独的媒介物的存在下经受高氧24小时。如图像中所指示的，高氧暴露显著损害了巨噬细胞的吞噬活性。UP894-II在低至3.7μg/ml的剂量下显著增强了巨噬细胞功能。这些结果提示了UP894-II可以是用于在氧化应激下增强肺功能的良好候选物。
实施例7：UP894-II降低巨噬细胞中的高氧诱导的HMGB1释放
将RAW 264.7细胞或留在室内空气中(21％O2)，或在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP894-II(0–33.3μg/ml)的存在下暴露于95％O2 24小时。通过蛋白质印迹分析来分析培养基中的HMGB1水平。印迹是每组中的HMGB1水平的代表性图像，其中每对泳道对应于其正下方的条形图。
与室内空气对照组(21％O2)相比，高氧对照组(95％O2)中的HMGB1释放显著增加。与高氧对照组相比，媒介物DMSO并未显著改变HMGB1释放。相比之下，当以3.7μg/ml、11.1μg/ml和33.3μg/ml进行测试时，用UP894-II治疗导致剂量相关的、统计学上显著的HMGB1水平减少(75.9％-89.7％)(图6)。
已知由环境空气污染生成的微粒通过生成活性氧簇(ROS)对生物系统施加外源性氧化应激，其可以导致受损的宿主防御和炎症，经受肺损害。与HMGB1相关的ROS在肺损害病理状况中起关键作用，部分通过激活NF-kB引起肺泡巨噬细胞的细胞凋亡且降低肺泡巨噬细胞的吞噬作用，导致促炎细胞因子和趋化因子的上调，从而引起细胞因子风暴。这些因素联合起来可以导致在污染诱导的肺损害、病毒或细菌感染时在肺中的有害病理变化。为了呈现该二重组合(duo)的实际例子，事实上，在被常规用于治疗患有COVID-19的患者的氧疗法期间对氧化应激的延长暴露，可以引起先天免疫的损害，伴随减少的巨噬细胞功能，导致清除肺中的入侵病原体的能力受损和急性炎症性肺损害。因此，减少气道中的HMGB1水平或阻断其活性，可能为渐增群体提供重要的治疗和预防策略，所述群体经受由细胞因子风暴产生的氧化应激，包括COVID-19患者和患有炎症性病症的那些患者。因此，基于此处描绘的数据，除通过这些确定的机制的先前报告的重要用途之外，标准化生物类黄酮组合物UP894-II还可以被用于此类新的适应症。在本主题中，我们证实了这一概念，并且记录了标准化组合物在多重疾病模型中的效应，如后续实施例中所述的。
实施例8.动物和饲养
CD-1小鼠和Sprague Dawley大鼠购自USDA批准的供应商。八周龄雄性CD-1小鼠和SD大鼠购自Charles River Laboratories，Inc.(Wilmington，MA)。动物在到达后适应环境并被用于研究。它们被饲养在温度受控的房间(71-72℉)中于12小时光照-黑暗周期上，并且随意提供饲料和水。
每个聚丙烯笼饲养3-5只动物，并且将其通过在其尾部上特征性地编号来个别标识。每个笼均覆盖有小鼠或大鼠的钢丝条盖和过滤的顶部(Allentown，NJ)。用指示项目编号、测试物品、剂量水平、组、动物编号和性别的笼卡标识单个笼。使用Harlan T7087软玉米芯垫层，并且至少两次/周地更换其。向动物随意提供淡水和来自Harlan(Harlan Teklad，370W，Kent，WA)的啮齿类动物饮食#T2018。
实施例9：脂多糖(LPS)诱导的脓毒症模型
该模型使用动物的存活率作为终点测量(Wang等人，1999)。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的外膜的集成组分和可能导致内毒素性休克的普遍的炎症性过程启动的主要促成因素。它是主要由巨噬细胞/单核细胞介导的状态，并且归于过度产生几种早期细胞因子例如TNF-α、IL-1、IL-6和γ干扰素(IFN-γ)以及晚期介质HMGB1。在溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Lifeline，批号#07641)中的半数致死剂量的LPS(25mg/kg)施用之后，动物发展内毒素血症，并且HMGB1将在LPS后8小时在血清中检测到，且在16至32小时达到峰值和平台水平。如果未进行治疗，则小鼠将在24小时内开始死亡。在目前的研究中，我们在LPS注射后监测小鼠4天。存活率比较了LPS+丁酸钠(SB；Aldrich，St.Louis，MO；批次#MKCG7272)，LPS+媒介物(0.5％CMC；Spectrum，New Brunswick，NJ；批次#1IJ0127)和LPS+实施例4及表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446。在研究中包括以下组：
表7.治疗组的细节
组 治疗 剂量(mg/kg) N
G1 正常对照 0 8
G2 媒介物对照(0.5％CMC) 0 8
G3 丁酸钠(SB) 500 8
G4 UP446 250 8
在该模型中，在具有10mL/kg PBS体积以25mg/kg的LPS(大肠杆菌，055:B5；Sigma，St.Louis，MO；批号#081275)的致死剂量的腹膜内注射之前，将小鼠用实施例4中说明的生物类黄酮组合物——UP446预治疗一周(7天)。每小时观察一次动物。鉴于丁酸钠通过遏制HMGB1释放来改善小鼠中LPS诱导的损害的事实，我们选择该化合物作为用于我们研究的阳性对照(Li等人，2018)。
实施例10：标准化生物类黄酮组合物改善了在内毒素的致死剂量下的动物存活率
在LPS的腹膜内注射之后三小时，小鼠开始显示内毒素血症的早期体征。小鼠的探索行为进行性地减少，并且伴有竖毛(立毛)、活动降低、嗜睡和腹泻。虽然这些体征和症状似乎存在于所有治疗组中，但严重的程度在媒介物治疗的组中更为明显。
发现来自媒介物治疗的组的两只小鼠和来自阳性对照丁酸钠(SB)组的一只小鼠在LPS注射后24小时死亡。对于这些组确定了存活率，并且发现其分别为62.5％和75％(表8)。用实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446治疗的小鼠在LPS注射的24小时后具有100％的存活率。在LPS注射后34小时，对于用UP446、SB和媒介物治疗的小鼠分别观察到87.5％、62.5％和50％的存活率。可能对于UP446治疗的小鼠最显著的观察是在LPS注射后48小时观察到的。在这个时间点，对于媒介物治疗的小鼠仅存在12.5％的存活率，而UP446治疗的小鼠显示了75％的存活率。即使对于阳性对照丁酸钠组，一半的动物在这个时间点死亡。在第三天(LPS注射后72小时)，对于UP446、SB和媒介物组的存活率分别为62.5％、50％和12.5％。媒介物组中的所有小鼠在LPS注射的82小时后都死亡了，留下该组0％的存活率。
另一方面，用UP446和SB治疗的小鼠显示了50％的存活率，并且对LPS注射后96小时和120小时保持相同。当与媒介物治疗的动物相比时，这些存活率对于UP446(p＝0.001)和SB(p＝0.01)两者均为统计学上显著的(表8)。这些组中的存活动物显示了其健康状况的进行性改善。小鼠看起来身体更好，并且逐渐恢复为显示正常行为。
表8：UP446提供了来自LPS诱导的内毒素血症和脓毒症的50％存活率
存活率被计算为：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)x 100]％。
实施例11：标准化生物类黄酮组合物及其组成成分在LPS诱导的脓毒症模型中的比较
在脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症中，评估了实施例4中证实的将来自黄芩属提取物的游离B环类黄酮与来自金合欢属提取物的黄烷组合以产生处于特定比率的UP894-II的优点。将雄性CD-1小鼠(n＝13)在LPS注射前用以下治疗7天：分别在200mg/kg和50mg/kg的实施例3中说明的含有不少于60％黄芩苷的黄芩属提取物RM405以及实施例4中说明的含有不少于10％儿茶素的金合欢属提取物RM406。在第8天时，将小鼠用25mg/kg溶解于的PBS中的LPS以10mL/kg进行腹膜内(i.p.)注射。UP894-II治疗的组中的小鼠接受以250mg/kg的UP894-II的日剂量。所有小鼠继续每天接受治疗，持续研究的期间，所述研究在LPS注射后的第6天时完成。在通过i.p.施用半数致死剂量的LPS(25mg/kg)之后，预计动物在数小时内发展脓毒症。如果未进行治疗，则小鼠将在24小时内开始死亡。每小时观察一次动物。在目前的研究中，我们在LPS注射后监测小鼠6天。
表9：治疗组的细节
组 治疗 剂量(mg/kg) N
G1 正常对照 0 13
G2 媒介物对照(0.5％CMC) 0 13
G3 丁酸钠(SB) 500 13
G4 UP894-II(RM405+RM406) 250 13
G5 黄芩提取物(RM405) 200 13
G6 儿茶提取物(RM406) 50 13
存活率比较了LPS+丁酸钠(SB)、LPS+媒介物(0.5％CMC)、LPS+UP894-II、LPS+黄芩属提取物(RM405)和LPS+金合欢属提取物(RM406)。正常对照动物仅接受PBS i.p.，并且仅用载体媒介物0.5％CMC进行管饲。鉴于丁酸钠(SB)通过遏制HMGB1释放来改善小鼠中LPS诱导的损害的事实，我们选择该化合物作为用于我们研究的阳性对照(Li等人，2018)。
将组合物(UP894-II)的存活率和死亡率与个别提取物如它们出现在制剂中的那些剂量进行比较，以使用Colby氏方程(Colby，1967)找出组合物中潜在的累加、拮抗或协同效应。为了使这些植物提取物的共混具有出乎意料的协同作用，所观察到的抑制需要大于计算的值。
在LPS的腹膜内注射后数小时，小鼠开始显示脓毒症的早期体征。小鼠的探索行为进行性地减少，并且伴有竖毛(立毛)、活动降低、嗜睡、腹泻和颤抖，一些小鼠伴有眼睑闭合。虽然这些体征和症状存在于所有治疗组中，但严重的程度在媒介物和金合欢属提取物(RM406)治疗组中更为明显。
发现来自媒介物治疗的组和金合欢属提取物(实施例4中说明的RM406)组的四只小鼠；以及来自阳性对照SB组和黄芩属提取物(实施例3中说明的RM405)组的两只小鼠在LPS注射后24小时死亡。在这个时间点对于这些组确定了存活率，并且发现对于媒介物和金合欢属提取物(RM406)为69.2％，且对于黄芩属提取物(RM405)和SB为84.6％(表10)。用UP894-II治疗的小鼠在LPS注射的24小时后具有100％的存活率。在LPS注射后36小时，对于用UP894-II、黄芩属提取物(RM405)、媒介物、SB和金合欢属提取物(RM406)治疗的小鼠分别观察到84.6％、61.5％、53.9％、53.9％和53.9％的存活率。对于UP894-II治疗的小鼠最显著的观察是在LPS注射后48小时注意到的，其中对于媒介物治疗的小鼠仅存在15.4％的存活率，而UP894-II治疗的小鼠显示了69.2％的存活率。用黄芩属提取物(RM405)、金合欢属提取物(RM406)和SB治疗的小鼠在LPS后48小时分别显示了46.2％、38.5％和46.2％的存活率。
在第三天时(在LPS注射后72小时)，治疗组的存活率对于UP894-2、黄芩属提取物(RM405)、金合欢属提取物(RM406)和SB分别为53.9％、30.8％、15.4％和46.2％。
表10：LPS诱导的脓毒症中的存活和死亡的时间过程
存活率被计算为：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)x 100]％。*p≤0.05
表11：LPS诱导的脓毒症小鼠的存活率
存活率被计算为：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)x 100]％。
表12：LPS诱导的脓毒症小鼠的死亡率
死亡率被计算为：100-存活率。
对于自LPS注射后48小时起的研究期的剩余部分，媒介物治疗的小鼠的存活率保持在15.4％。相比之下，金合欢属提取物(RM406)治疗的小鼠持续死亡，直到LPS注射后96小时。到7天观察期结束时，金合欢属提取物(RM406)组仅存在7.7％的存活率。另一方面，自LPS注射后的第3天起并且对于观察期的剩余部分，用UP894-II和黄芩属提取物(RM405)治疗的小鼠分别维持53.9％和30.8％的存活率。阳性对照丁酸钠(SB)组以30.8％的存活率完成了研究。当与媒介物对照相比时，仅UP894-II组存活率是统计学上显著的(p＝0.01)。各组中的存活动物显示了其健康状况的进行性改善。小鼠看起来身体更好，并且逐渐恢复为显示正常的探索行为。
实施例12：对标准化生物类黄酮组合物观察到出乎意料的协同作用
使用Colby氏方法，LPS诱导的存活研究被用于评估当以特定比率配制在一起时，来自黄芩属和金合欢属的提取物的可能的协同作用或出乎意料的效应。当以250mg/kg的剂量向小鼠给予实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP894-II时，存活率在所分析的每个时间点均大于理论计算的预计值(表13)。例如，虽然在LPS注射后24小时和144小时的预计存活率分别为95.3％和36.1％，但对UP894-II实际观察到的存活率分别为100％和53.9％。这些发现提示了，在脓毒症时延长所研究受试者的寿命方面，以特定比率组合两种标准化的来自黄芩属和金合欢属的游离B环类黄酮和黄烷提取物具有比使用单独的金合欢属或黄芩属提取物大得多的益处。使用相同的Colby氏方法，我们还确定了那些时间点预计的死亡率，并且我们发现UP894-II治疗的小鼠的所观察到的死亡率远低于预测的，确认了作为组合疗法的结果这些受试者的更佳存活预后(表13)。
例如，在LPS注射后24小时，预计的死亡率为41.4％，事实上，对于UP894-II治疗的小鼠不存在死亡。还预计97.6％的研究受试者将在观察期结束时死亡，而UP894-II的实际死亡率仅为46.2％。像这样，在这项存活研究中，使用Colby氏方程评估了组合黄芩属和金合欢属提取物的优点。在此方法中，如果某个终点测量的观察值大于假设计算的预计值，则假定具有两种生物类黄酮提取物的制剂具有出乎意料的协同作用。
表13：对生物类黄酮组合物UP894-II观察到出乎意料的协同作用
X＝RM405，Y＝RM406；关于预计的存活率的Colby氏方程：(X+Y)–(XY/100)
在LPS注射后24、36、48、60、72、96、120和144小时，黄芩属提取物(实施例3中说明的RM405)(200mg/kg)和金合欢属提取物(实施例4中说明的RM406)(50mg/kg)的存活率和死亡率值被用于确定计算的存活率和死亡率，并且与在指定的时间点观察到的复合物UP894-II(250mg/kg)的存活率值进行比较。在本研究中，我们发现黄芩属提取物(RM405)与金合欢属提取物(RM406)的组合的出乎意料的协同作用。对于所检查的所有时间点，UP894-II治疗的有益效应超过了其组成成分的效应总和。在观察期结束时(即在LPS注射后7天以及在提取物和组合物的经口施用后14天)，对于UP894-II、黄芩属提取物(RM405)和金合欢属提取物(RM406)治疗组分别存在53.9％、30.8％和7.7％的存活率，提示了这些植物提取物在保护宿主免于细胞因子风暴并因此增加患者在脓毒症时的存活率方面的出乎意料的协同活性。
实施例13：标准化生物类黄酮组合物对减轻大鼠中的脂多糖(LPS)诱导的急性炎症性肺损害的功效——研究设计
该研究被设计为评估以250mg/kg(高剂量)和125mg/kg(低剂量)经口施用的实施例4中说明的含有游离B环类黄酮和黄烷的生物类黄酮组合物UP446在减轻LPS诱导的急性肺损害方面的直接影响。急性肺损害是由肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤引起的临床综合征，导致如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中可见的弥漫性肺损害。在这项研究中，在用LPS的模型诱导之前，我们用测试材料经口治疗Sprague Dawley大鼠共7天。在第8天在经口治疗后1小时，将溶解于0.1mL/100g PBS中的LPS以10mg/kg气管内(i.t.)滴注到每只大鼠。正常对照大鼠接受相同体积的仅PBS的i.t.。
表14.研究组
组 治疗 剂量(mg/kg) N
G1 正常对照 0 7
G2 媒介物对照 0 10
G3 丁酸钠 500 10
G4 UP446-高剂量 250 10
G5 UP446-低剂量 125 10
已知LPS诱导全身和肺部应答，导致包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞在内的促炎免疫细胞以及诸如IL-1、IL-8、IL-6、MIP-2/CINC-3和TNF-α等促炎细胞因子的累积，引起肺间质、肺泡水肿和上皮细胞损伤，其中HMGB1由巨噬细胞和单核细胞主动分泌或从坏死细胞中被动释放。
我们在气管内LPS施用后24小时处死存活动物。在尸检时，通过将1.5mL PBS气管内注射到肺的右叶内随后轻轻抽吸至少3次来收集支气管肺泡灌洗液(BAL)。将合并的回收流体在4℃下以1,500rpm离心10分钟，并且用于测量细胞因子(例如IL-6)和肺部蛋白质水平。从每只大鼠中收集该相同的右叶组织匀浆化，用于MIP-2/CINC-3活性分析。将左叶用中性缓冲福尔马林进行固定，并且提交给Nationwide Histology用于组织病理学评估，用于通过认证的病理学家的分析。在尸检时收集的血清用于测量细胞因子，如TNF-α和IL-1β。在LPS以10mg/kg的气管内滴注之后，所有动物都存活过攻击后的24小时。在以下实施例中，我们已汇集了被认为涉及急性肺部感染的病理状况的关键细胞因子和化学引诱物的测量以及来自组织病理学分析的数据。
实施例14：生物类黄酮组合物显示了剂量相关的、统计学上显著的血清TNF-α减少
使用来自RandD Systems的大鼠TNF-αQuantikine ELISA试剂盒(产品#：RTA00)如下测量未稀释的大鼠血清中的TNF-α存在：将未稀释的血清加入包被有TNF-α抗体的微板中。在室温下2小时后，血清中的TNF-α与板结合，并且板被彻底洗涤。将酶缀合的TNF-α抗体加入板中，并且允许其在室温下结合2小时。重复洗涤，并且将酶底物加入板中。在室温下显影30分钟后，加入终止液，并且在450nm处读取吸光度。基于TNF-α标准曲线的吸光度读数来计算TNF-α的浓度。
如表15中所见的，对于用LPS气管内攻击的媒介物治疗的大鼠，观察到统计学上显著的血清TNF-α激增。当用UP446(实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物)治疗大鼠时，这种增加显著减少。对于用UP446以250mg/kg和125mg/kg经口治疗的大鼠，观察到统计学上显著和剂量相关的减少。血清TNF-α水平的这些减少针对媒介物对照进行计算，并且对于以250mg/kg和125mg/kg的UP446治疗组发现分别为90.7％和69.8％的减少。阳性对照丁酸钠(SB)显示了统计学上显著的(67.9％)血清TNF-α水平减少。
表15：组合物对血清TNF-α水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -1.27±0.93 0.000001
媒介物对照 0 10 10.43±2.48 -
丁酸钠 500 10 3.35±1.73 0.000001
UP446高剂量 250 10 0.97±1.06 0.000001
UP446低剂量 125 10 3.15±0.86 0.000001
实施例15：标准化生物类黄酮组合物显示了剂量相关的、统计学上显著的血清IL-1β减少
使用来自RandD Systems的大鼠IL-1βQuantikine ELISA试剂盒(产品#：RLB00)如下测量未稀释的大鼠血清中的IL-1β存在：将未稀释的血清加入包被有IL-1β抗体的微板中。在室温下2小时后，血清中的IL-1β与板结合，并且板被彻底洗涤。将酶缀合的IL-1β抗体加入板中，并且允许其在室温下结合2小时。重复洗涤，并且将酶底物加入板中。在室温下显影30分钟后，加入终止液，并且在450nm处读取吸光度。基于IL-1β标准曲线的吸光度读数来计算IL-1β的浓度。
此处再次，对用实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446治疗的大鼠观察到剂量相关且统计学上显著的IL-1β减少。对用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠观察到统计学上显著的IL-1β血清水平增加。当以250mg/kg和125mg/kg的经口剂量进行施用时，用UP446治疗的大鼠分别显示了IL-1β水平的81.2％和61.8％减少(表16)。丁酸钠(SB)组显示了血清IL-1β水平的65.3％减少。这些减少对于UP446和丁酸钠(SB)组均为统计学上显著的。
表16：组合物对血清IL-1β水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -0.14±4.20 0.000001
媒介物对照 0 10 65.09±13.24 -
丁酸钠 500 10 22.58±9.46 0.000001
UP446高剂量 250 10 12.23±3.55 0.000001
UP446低剂量 125 10 24.85±10.10 0.000001
实施例16：标准化生物类黄酮组合物显示了支气管肺泡灌洗液(BAL)中的剂量相关且统计学上显著的IL-6水平减少
使用来自RandD Systems的大鼠IL-6Quantikine ELISA试剂盒(产品#：R6000B)如下测量未稀释的大鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)中的IL-6存在：将未稀释的BAL加入包被有IL-6抗体的微板中。在室温下2小时后，BAL中的IL-6与板结合，并且板被彻底洗涤。将酶缀合的IL-6抗体加入板中，并且允许其在室温下结合2小时。重复洗涤，并且将酶底物加入板中。在室温下显影30分钟后，加入终止液，并且在450nm处读取吸光度。基于IL-6标准曲线的吸光度读数来计算IL-6的浓度。
与上文的TNF-α和IL-1β数据一致，实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446显示了剂量相关且统计学上显著的BAL IL-6水平减少。虽然高剂量(250mg/kg)的UP446导致BAL IL-6水平的74.6％减少，但较低剂量的生物类黄酮组合物显示BAL IL-6水平的58.3％减少(表17)。当与媒介物治疗的急性肺损害大鼠相比时，减少对于以高剂量和低剂量的两种UP446均为统计学上显著的。相对于媒介物治疗的疾病模型，丁酸钠(SB)组显示了BAL IL-6的统计学上不显著的37.7％减少。
表17：组合物对BAL IL-6水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 66.41±4.86 0.000001
媒介物对照 0 10 3103.95±3057.13 -
丁酸钠 500 10 1933.30±1744.23 0.27
UP446高剂量 250 10 787.65±751.17 0.002
UP446低剂量 125 10 1293.29±794.09 0.043
实施例17：标准化生物类黄酮组合物治疗产生统计学上显著的CINC-3减少
CINC-3/巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)属于被称为趋化因子的趋化性细胞因子家族。MIP-2属于CXC趋化因子家族，被命名为CXCL2，并且通过CXCR1和CXCR2的结合起作用。它主要由巨噬细胞、单核细胞和上皮细胞产生，并且负责对炎症来源的趋化性和嗜中性粒细胞的活化。
将50μL每个大鼠肺匀浆样品(对于媒介物、丁酸钠(SB)、UP446低剂量、UP446高剂量10个/组，对于对照7个/组)和50μL测定稀释剂缓冲液加入用单克隆CINC-3抗体包被的96孔微板的孔中，并且允许结合2小时。使板经受5次洗涤，然后添加酶联多克隆CINC-3并允许其结合2小时。将孔再洗涤5次，然后将底物溶液加入孔中，并且允许酶促反应在室温下避光开始30分钟。酶促反应产生蓝色染料，其随着终止液的加入变为黄色。在450nm处读取每个孔的吸光度(伴随580nm校正)，并且将其与CINC-3的标准曲线进行比较，以便近似估计每个大鼠肺匀浆样品中的CINC-3量。
UP446持续一周以250mg/kg的每天经口治疗引起LPS诱导的急性肺损害中的细胞因子诱导嗜中性粒细胞化学引诱物3(CINC-3)在统计学上显著的减少(表18)。气管内接受仅PBS的正常对照大鼠中的CINC-3水平接近于零。相比之下，用载体媒介物治疗的气管内LPS诱导的急性肺损害大鼠显示了在563.7±172.9pg/mL的CINC-3的平均肺匀浆水平。这种水平对于250mg/kg UP446治疗的大鼠减少至360.8±110.7pg/mL的平均值。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，对于用250mg/kg的UP446治疗的大鼠，CINC-3水平的这种36％减少是统计学上显著的。与媒介物治疗的大鼠相比，较低剂量的UP446和丁酸钠(SB)组导致肺匀浆CINC-3水平分别仅略微地减少10.5％和17.7％。
表18：组合物对肺匀浆MIP-2/CINC-3活性水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -4.21±2.38 0.0000
媒介物对照 0 10 563.71±194.81 -
丁酸钠 500 10 464.00±220.32 0.2980
UP446高剂量 250 10 360.78±150.74 0.002
UP446低剂量 125 10 504.46±155.20 0.1028
实施例18：标准化生物类黄酮组合物减少了支气管肺泡灌洗液(BAL)中的总蛋白
使用来自ThermoFisher Scientific的Pierce BCA蛋白测定试剂盒(产品#：23225)如下测量支气管肺泡灌洗液(BAL)中的总蛋白的量：将BAL以1:5进行稀释，在微板中与二辛可宁酸(BCA)试剂混合，并且在37℃下温育30分钟。在580nm处读取吸光度，并且基于牛血清白蛋白标准曲线的吸光度读数来计算BAL中的蛋白质浓度。
与正常对照大鼠相比，在用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠中发现来自BAL的总蛋白水平的3倍增加。当与媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠相比时，用UP446以250mg/kg和125mg/kg每天经口治疗大鼠一周分别导致BAL总蛋白含量的45.1％(相对于媒介物，p＝0.06)和36.6％(p＝0.21)的减少(表19)。相对于媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠，阳性对照丁酸钠(SB)组引起了BAL总蛋白水平的30.2％的减少(p＝0.27)。
表19：组合物对BAL蛋白水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(μg/mL) p值
正常对照 0 7 1488.88±322.01 0.0037
媒介物对照 0 10 4214.86±3311.32 -
丁酸钠 500 10 2940.14±2092.32 0.2657
UP446高剂量 250 10 2314.64±857.27 0.0629
UP446低剂量 125 10 2673.11±550.77 0.2138
实施例19：标准化生物类黄酮组合物显示了支气管肺泡灌洗液(BAL)中统计学上显著的CRP减少
使用来自Abcam的C反应蛋白(PTX1)大鼠ELISA试剂盒(产品#：ab108827)如下测量1:1,000稀释的大鼠BAL中的CRP存在：将1:1,000稀释的BAL加入包被有CRP抗体的微板中。在室温下在板振荡器上2小时后，BAL中的CRP与板结合，并且板被彻底洗涤。将生物素化的C反应蛋白抗体加入板中，并且允许其在室温下在板振荡器上结合1小时。重复洗涤，并且将链霉亲和素蛋白-过氧化物酶缀合物加入板中。在室温下温育30分钟后，重复洗涤，并且加入发色团底物。在室温下显影10分钟后，加入终止液，并且在450nm处读取吸光度。基于CRP标准曲线的吸光度读数来计算CRP的浓度。
与正常对照大鼠相比，在用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠中观察到BALCRP水平在统计学上显著的5.6倍的增加。相对于媒介物治疗的疾病模型，用实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446以250mg/kg经口治疗大鼠一周使BAL CRP的水平减少了42.4％(表20)。这种减少是统计学上显著的(p≤0.05)。与媒介物治疗的患病大鼠相比，阳性对照丁酸钠(SB)和低剂量的UP446组导致CRP水平的适度减少，而无统计学显著性。
表20：组合物对BAL CRP水平的作用
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 4344.5±3321.6 0.0002
媒介物对照 0 10 24302.8±8826.1 -
丁酸钠 500 10 20093.5±8826.1 0.35
UP446高剂量 250 10 13987.8±8673.5 0.03
UP446低剂量 125 10 22223.2±6606.5 0.61
实施例20：标准化生物类黄酮组合物显示了支气管肺泡灌洗液(BAL)中统计学上显著的IL-10减少
使用来自RandD Systems的大鼠IL-10Quantikine ELISA试剂盒(产品#：R1000)如下测量未稀释的BAL中的IL-10存在：将未稀释的BAL加入包被有IL-10抗体的微板中。在室温下2小时后，血清中的IL-10与板结合，并且板被彻底洗涤。将酶缀合的IL-10抗体加入板中，并且允许其在室温下结合2小时。重复洗涤，并且将酶底物加入板中。在室温下显影30分钟后，加入终止液，并且在450nm处读取吸光度。基于IL-10标准曲线的吸光度读数来计算IL-10的浓度。
在UP446于诱导前持续7天以250mg/kg和125mg/kg的每天经口治疗之后，在LPS的气管内滴注后24小时处死的患病大鼠的BAL中测量了抗炎细胞因子IL-10的水平。通常，IL-10的水平对应于感染的严重程度和宿主在感染或损害时所需的炎症应答。如表21中所见的，对于媒介物治疗的大鼠，与正常对照大鼠相比，发现IL-10水平显著增加80倍，指示了急性肺损害的高严重程度。相比之下，UP446组中的大鼠显示了BAL中的IL-10的剂量相关性减少。计算了这些减少，并且对于以250mg/kg和125mg/kg的UP446分别确定其为73.6％和49.2％的减少。在p≤0.05下，减少对于高剂量(250mg/kg)的UP446是统计学上显著的。至少对于这个具体模型，作为实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446的结果的抗炎细胞因子的减少可以通过以下事实进行解释：由于疾病严重程度的减轻以及因此的通过上游机制(很可能通过HMGB1分泌)的炎症的减轻，可能已存在通过宿主的炎症应答的抑制效应。强化这一假设，UP446引起诸如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子在统计学上显著的减少，导致显著减少的炎症应答，致使关于诸如IL-10等抗炎细胞因子的需求对于宿主较不重要。事实上，IL-10水平对于正常对照组接近于零，提示了抗炎细胞因子的诱导是基于急性肺损害的存在或严重程度的。IL-10通过游离B环类黄酮和黄烷组合物的显著减少证实了宿主防御机制的建立。
表21：组合物对BAL IL-10水平的作用
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 2.63±8.35 0.004
媒介物对照 0 10 207.77±171.33 -
丁酸钠 500 10 154.84±159.63 0.48
UP446高剂量 250 10 54.93±47.70 0.02
UP446低剂量 125 10 105.55±71.71 0.11
实施例21：标准化生物类黄酮组合物减少了整体的肺损伤的严重程度
使用HandE染色的肺组织来评价作为气管内LPS的结果的肺损伤的严重程度。肺的左叶被用于组织病理学分析。如表22和图7中所见的，媒介物治疗的组中的大鼠显示了在由气管内LPS引起的肺损伤的严重程度(3.5倍增加)、肺水肿(2.5倍增加)和多形核(PMN)细胞浸润(2.4倍增加)方面的统计学上显著的增加。当与媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损害大鼠相比时，用以250mg/kg的高剂量的UP446每天经口治疗大鼠一周导致整体的肺损伤严重程度在统计学上显著的20.8％的减少。类似地，当与媒介物治疗的大鼠相比时，对于高剂量的UP446观察到肺水肿减少的强烈趋势(23.3％减少，p＝0.08)。相对于媒介物治疗的患病大鼠，阳性对照、丁酸钠(SB)和低剂量的UP446组引起组织病理学评估中的最低限度变化。
表22：来自大鼠中的ALI的组织病理学数据
*P≤0.05；**P≤0.001；***P≤0.00001；dP＝0.08；SB-丁酸钠；PMN-多形核
a总体严重程度：正常，最低限度-轻度，中度，重度，极重度。病灶，m-病灶，区域，区域扩展性合并(reg.ext coalesing)，扩散，评分0-4。
b急性渗出性变化：肺泡、导管和支气管、肺泡壁和间质水肿、充血、血管周出血、肺泡囊、水肿、纤维渗出、肺泡囊出血、肺泡导管增厚dt I型透明膜缺失、凋亡细胞，特定参数评分0-4
c炎症浸润期：嗜中性粒细胞，其它多形性MNC主要是组织细胞和巨噬细胞。BALT肺泡、间质、肺泡-导管、弥漫性细支气管、贴片细胞合并，特定参数评分0-4
实施例22：D-半乳糖诱导的免疫衰老模型作为内源性和外源性攻击触发应答
D-半乳糖的全身施用诱导加速的免疫细胞衰老，影响在攻击时的免疫应答，类似于老年小鼠。推测这些现象模拟老年人的免疫应答概况。新型主题UP446，实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物，在该实验性衰老的小鼠模型中进行了测试，以证实其免疫刺激效应。购买专门饲育的CD-1小鼠(12周龄)，并且在适应2周后将其用于加速衰老研究。小鼠被随机分配到4个免疫组和4个未免疫组。免疫组包括G1＝正常对照+媒介物(0.5％CMC)，G2＝D-半乳糖+媒介物，G3＝D-半乳糖+UP446 200mg/kg和G4＝D-半乳糖+UP446100mg/kg。未免疫治疗组包括G1＝正常对照+媒介物(0.5％CMC)，G2＝D-半乳糖+媒介物，G3＝D-半乳糖+UP446 200mg/kg和G4＝D-半乳糖+UP446 100mg/kg。每个治疗组中分派十只动物。
将小鼠用D-半乳糖以500mg/kg每天皮下注射10周以诱导衰老。在诱导后4周，对于免疫组和未免疫组两者，开始用悬浮于0.5％CMC中的2个UP446剂量(100mg/kg-低剂量和200mg/kg-高剂量)的经口治疗。在第8周时，将除了未免疫组中的那些小鼠之外的每只小鼠都用3μg Fluarix四价IM(来自GSK的2020-2021流感季节疫苗)进行注射。它含有每0.5mL单人剂量中60μg血凝素——HA。该疫苗被配制为含有4种流感毒株(例如H1N1、H3N2、B-Victoria谱系和B-Yamagata谱系)各15μg用于以单一剂量进行免疫。
进行了从第5周到第10周持续6周期间的UP446以两个剂量的每天经口管饲。在尸检时(即在免疫后14天)，收集全血(1mL)并且进行等分——110μL，用于流式细胞术免疫小组(在冰上递送至Flow Contract Site Laboratory，Bothell，WA)，从剩余的血液中分离血清(约400μL血清产率)，用于抗体ELISA和酶促测定(Unigen，Tacoma WA)，并且将60μL在两个管中运送用于细胞因子分析(经由Fedex过夜运送至Sirona DX，Portland，OR)。测量每只动物的胸腺和脾的重量，以确定胸腺和脾指数。从每组中获取胸腺和脾的代表性图像。在尸检时将脾保持在干冰上，并且转移至-80℃用于未来使用。多聚甲醛和蔗糖固定的胸腺被运送到Nationwide histology，用于衰老相关的β-半乳糖苷酶染色和分析。
实施例23：UP446产生了统计学上显著的胸腺指数增加
D-半乳糖向小鼠体内的重复皮下施用产生受损的免疫应答，类似于正常衰老过程中出现的变化。胸腺是最重要的免疫器官之一，并且它会受到长期暴露于D-Gal的影响。胸腺指数是身体的免疫功能强度的良好指标。较高的胸腺指数对应于正常且较强的非特异性免疫应答。在免疫的小鼠中，与正常对照小鼠相比，用媒介物治疗的D-Gal小鼠显示了胸腺指数的显著减少(30.3％)。胸腺指数的这种减少由实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446的两个剂量逆转。当与媒介物治疗的D-Gal组相比时，用UP446以200mg/kg和100mg/kg经口治疗的小鼠分别显示了胸腺指数的47.4％和49.4％的增加。与媒介物治疗的D-Gal小鼠相比，这种逆转对于UP446的两个剂量都是统计学上显著的。类似地，用UP446以200mg/kg和100mg/kg治疗的未免疫小鼠也显示了统计学上显著的胸腺指数增加。当与媒介物治疗的D-Gal小鼠相比时，发现这些增加分别为27.4％和31.6％。在这项研究中观察到，无论免疫状态如何，UP446补充保护小鼠免于通过D-半乳糖的注射的年龄相关的胸腺退化。
表23：用于胸腺保护的体内治疗组
实施例24：生物类黄酮组合物增加补体C3
在研究结束时收集血清并且评价体液免疫的标记物，例如补体系统的C3组分。如表24中所见的，与未免疫的对照组相比，在免疫的正常对照组中存在补体C3的显著降低。两个免疫的D-Gal+UP446组均具有显著高于免疫的对照组的补体C3。与未免疫的D-Gal组相比，在未免疫的D-Gal+UP446治疗中存在朝向补体C3增加的趋势，并且与免疫的D-Gal组相比，免疫的D-Gal+200mg/kg实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446组具有补体C3的显著增加，其证实了对于免疫衰老动物响应疫苗接种通过UP446增强的体液免疫。
表24：来自所示组的小鼠血清中的补体C3。n＝10/组。
实施例25：生物类黄酮组合物对全血中的CD3+T细胞(淋巴细胞群体的％)的作用
CD3+CD45+细胞是T细胞群体。表示为所有白血细胞(CD45+细胞)的百分比，我们发现了用200mg/kg UP446+D-Gal治疗的未免疫动物具有朝向比D-Gal组更高百分比的循环T细胞的趋势，指示了实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446增加未免疫动物中的CD3+T细胞扩增或分化。
表25：小鼠全血中的CD3+T细胞
实施例26：生物类黄酮组合物对全血中的CD4+辅助性T细胞(淋巴细胞群体的％)的作用
CD45+CD3+CD4+细胞是辅助性T细胞，该细胞识别抗原呈递细胞上的抗原并响应细胞分裂和细胞因子分泌。表示为所有白血细胞(CD45+细胞)的百分比，我们发现了在流感疫苗接种后两周，D-Gal治疗的免疫动物具有显著低于对照组的循环辅助T细胞百分比。与未免疫组相比，免疫的D-Gal和D-Gal+UP446(200mg/kg)组具有CD4+辅助性T细胞的显著减少。
表26：小鼠全血中的CD3+CD4+辅助性T细胞
实施例27：生物类黄酮组合物对全血中的CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞群体的％)的作用
CD45+CD3+CD8+细胞是细胞毒性T细胞，该细胞以细胞分裂和细胞凋亡促进酶的分泌以杀死受感染的细胞来响应病原体。表示为所有白血细胞(CD45+细胞)的百分比，与未免疫的对照和D-Gal组两者相比，用D-Gal+UP446(200mg/kg)治疗的未免疫动物具有CD8+细胞毒性T细胞的显著增加。免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)组具有显著低于未免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)组的细胞毒性T细胞数目。
表27：小鼠全血中的CD3+CD8+细胞毒性T细胞
实施例28：生物类黄酮组合物对全血中的自然杀伤细胞(淋巴细胞群体的％)的作用
我们利用两种不同的自然杀伤细胞标记物，小鼠CD49b和NKp46，来鉴定白血细胞群体中的自然杀伤细胞的百分比。自然杀伤细胞涉及先天免疫系统。当被激活时，它们分泌细胞因子和颗粒来募集免疫细胞，并且对感染病原体的细胞直接引起细胞死亡，因此它们对于针对病原体的立即免疫应答是重要的，并且在全身感染的早期是活跃的。CD49b是特异性地存在于大多数自然杀伤细胞和可能是自然杀伤T(NKT)细胞的T细胞亚群上的整联蛋白。NKp46是排他地存在于自然杀伤细胞上且并不标记NKT细胞的天然细胞毒性受体。NKT和NK样T细胞也基于其CD3表达而被排除，因为NK一般是CD45+CD3-CD49b+NKp46+的(Goh W)(Narni-Mancinelli E)。表示为所有白血细胞(CD45+细胞)的百分比，我们发现了在流感疫苗接种后两周，免疫的D-Gal组具有显著低于免疫的对照或任一UP446治疗的CD3-CD49b+NK细胞(表28)。这指示了D-Gal减少NK细胞的群体并且阻碍先天免疫系统对病原体作出反应的能力，并且这种效应由实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446逆转。
当我们观察CD3-NKp46+群体时，用D-Gal+UP446(100mg/kg)治疗的未免疫动物具有显著高于未免疫的D-gal组的自然杀伤细胞百分比，并且免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)组具有显著高于免疫的D-Gal组的CD3-NKp46+细胞百分比(表29)。免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)组也具有显著高于未免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)组的NK细胞。
这些结果指示了，一般在未免疫和免疫动物两者中，与单独的D-Gal治疗相比，D-Gal+UP446治疗增加了自然杀伤细胞的群体。这一发现指示了UP446通过增加涉及立即先天免疫应答的细胞群体来帮助启动免疫系统对抗病原体。
表28：小鼠全血中的CD3-CD49b+自然杀伤细胞
表29：小鼠全血中的CD3-NKp46+自然杀伤细胞
实施例29：生物类黄酮组合物对全血中的TCRγδ+γδT细胞(淋巴细胞群体的％)的作用
当我们将CD4+γδT细胞群体表示为CD4+TCRγδ+细胞总数/μL血液时，与未免疫的D-Gal组相比，在未免疫的D-Gal+UP446(200mg/kg)中存在显著更高的细胞数目。D-Gal+UP446(200mg/kg)组中的CD4+TCRγδ+细胞的增加可能已指示了增加的免疫准备或启动。
表30：小鼠全血中的CD3+CD4+TCRγδ+γδT细胞
实施例30：生物类黄酮组合物对血清细胞因子GM-CSF-和II-12p70的作用
我们运送在流感疫苗接种后两周从免疫的小鼠中分离的血清，用于使用Luminex技术的细胞因子概况分析。IL-12p70，GM-CSF细胞因子在每组的所有十次重复中都具有可检测的水平。虽然与D-Gal组相比，D-Gal+UP446(100mg/kg)组中的GM-CSF减少接近显著性(p＝0.058)，但与正常对照组相比，D-Gal+UP446(200mg/kg)组中的IL-12p70减少达到统计显著性(p＝0.010)，其中在D-Gal和D-Gal+UP446(200mg/kg)组之间没有差异，可能是由于D-Gal组本身内的变化。
表31：小鼠血清样品中的细胞因子水平
实施例31：生物类黄酮组合物对晚期糖基化终末产物(AGE)的作用D-Gal通过其引起衰老表型的机制是通过自由基尤其是晚期糖基化终末产物的生成。我们试图测量抗氧化酶浓度和自由基水平，以确定实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446是否影响小鼠模型(Azman KF)的这个方面。
我们测量了未免疫和免疫的血清样品中的晚期糖基化终末产物(AGE)。我们发现了未免疫的D-Gal+UP446组具有显著低于未免疫的D-Gal的AGE，指示了UP446治疗减少在正常生理条件下的活性氧簇。
表32：小鼠血清的晚期糖基化终末产物
实施例32：生物类黄酮组合物对谷胱甘肽过氧化物酶的作用
谷胱甘肽过氧化物酶中和氧自由基，以防止对细胞结构、蛋白质和核酸的氧化性损伤。活性氧簇被用作免疫信号传导的第二信使(Ighodaro OM)。抗氧化酶的表达增加指示中和过量活性氧簇的能力。
我们测量了免疫的小鼠血清样品中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。我们发现了与免疫的D-gal组相比，在两个免疫的D-gal+UP446组中存在显著更高的谷胱甘肽过氧化物酶活性。这指示了在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446治疗后，中和活性氧簇的能力增加。
表33：小鼠血清的谷胱甘肽过氧化物酶含量
实施例33：生物类黄酮组合物对NFκB的蛋白质表达的作用
对于在未免疫的组中用200mg/kg的UP44治疗的小鼠，观察到统计学上显著的NFκB表达的遏制。NFκB是涉及激活免疫细胞的转录因子。它通常通过蛋白质-蛋白质相互作用失活，但在活跃的宿主防御应答期间，它被稳定、易位到核且上调。将脾匀浆在SDS-PAGE上运行，转移，并且对于所提到的蛋白质进行印迹。条带强度通过测密度术进行测量，并且将其关于每种感兴趣的蛋白质归一化至β-肌动蛋白加载对照。每种感兴趣的蛋白质的半定量对每组进行比较，并且发现未免疫的200mg/kg UP446+D-Gal具有显著低于单独的D-Gal的NFκB水平。同时对于流感疫苗免疫的组，生物类黄酮组合物UP446+D-Gal组显示了统计学上显著高于正常对照组的NFκB蛋白表达，指示了诱导的宿主防御机制。
表34：归一化至β-肌动蛋白且相对于对照组的免疫小鼠脾匀浆的NFκB蛋白水平
实施例34：生物类黄酮组合物对HMGB1的蛋白质表达的作用
细胞外HMGB1是由核分泌，通过细胞质进入循环的涉及扩大免疫应答的警报素蛋白。将脾匀浆在SDS-PAGE上运行，转移，并且对于所提到的蛋白质进行印迹。条带强度通过测密度术进行测量，并且将其关于每种感兴趣的蛋白质归一化至β-肌动蛋白加载对照。每种感兴趣的蛋白质的半定量对每组进行比较，并且发现未免疫的200mg/kg UP446+D-Gal组具有显著更低的HMGB1水平。
表35：归一化至β-肌动蛋白且相对于对照组的免疫小鼠脾匀浆的HMGB1蛋白水平
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实施例35：生物类黄酮组合物对铜绿假单胞菌感染的小鼠中的高氧诱导的死亡率的作用。
在这项研究中，小鼠在诱导前适应环境一周。为了调查主题公开的生物类黄酮组合物UP446是否可以减少动物死亡率并增加其存活，在用实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446以250mg/kg的经口剂量治疗7天之后，使小鼠暴露于高氧(>90％氧，持续72小时)，并且在小鼠用铜绿假单胞菌(PA)接种前的这3天继续治疗。在细菌接种后观察小鼠48小时。与留在室内空气(RA，表36)中的小鼠相比，预暴露于高氧引起显著更高的死亡率(O2)。出乎意料地，我们发现了在暴露于高氧48小时的小鼠中，在PA接种后24小时的大量死亡率。与留在室内空气(RA)中并接受相同量PA的小鼠中的9％死亡率相比，在PA接种之前在高氧下2天的用媒介物治疗的小鼠中观察到64％的死亡率。另一方面，用白藜芦醇(RES)和UP446预防性治疗7天，然后暴露于高氧2天，随后为PA接种的小鼠在接种后24小时分别具有27.3％和28.6％的死亡率。这些结果提示了UP446保护宿主免于氧化应激和微生物感染，其导致减少的死亡率。对于UP446观察到的这些存活数据与实施例10-12中对LPS诱导的动物脓毒症研究记录的数据一致，其中UP446补充产生了统计学上显著的死亡率减少。
表36：UP446对PA感染的小鼠中的高氧诱导的死亡率的作用
实施例36：生物类黄酮组合物对氧化应激加重的由细菌感染诱导的急性肺损害的作用
为了调查调控天然宿主防御稳态的效应，将小鼠用生物类黄酮组合物UP446以250mg/kg经口治疗7天，然后暴露于>90％的氧48小时(伴随持续的UP446治疗)，然后用微生物铜绿假单胞菌(PA)接种。将小鼠在细菌接种24小时后安乐死，将肺灌洗，并且从肺灌洗液中确定总蛋白含量。与留在室内空气(RA)中的小鼠相比，在微生物感染前预暴露于高氧引起由这些小鼠(O2)中的蛋白质水肿指示的明显更严重的急性肺损害。众所周知的抗氧化剂——白藜芦醇(RES)显著减少这种效应。与在高氧和媒介物对照(O2)下的感染微生物的小鼠相比，UP446治疗的组中的小鼠的肺灌洗液中的总蛋白含量的减少是统计学上显著的。这些结果提示了UP446可以减少氧化应激加重的由继发性细菌感染诱导的急性肺损害。
表37：UP446对来自BAL的总蛋白的作用
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统计分析：Dunnett多重比较检验
实施例37：生物类黄酮组合物对肺组织中的细菌清除的作用
Patel等人，2013先前已显示了暴露于高氧可以损害针对细菌感染的宿主防御，导致在微生物感染后在肺组织中更高的细菌负荷。表38中的结果指示了，与留在室内空气(RA)中的小鼠相比，细菌负荷确实通过预暴露于高氧(O2)而升高。对应于在用白藜芦醇和实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446治疗的小鼠中显著减少的肺损害，细菌负荷在这些小鼠中也是显著减少的。数据指示了与用高氧和媒介物对照(O2)治疗的微生物感染的小鼠相比，肺组织中的细菌负荷的差异是统计学上显著的。这些结果提示了UP446可以调控天然宿主防御稳态，其导致肺组织中减少的细菌负荷。
表38：UP446对肺匀浆中的细菌清除的作用
统计分析：Dunnett多重比较检验
实施例38：生物类黄酮组合物对气道中的细菌清除的作用
在上文实施例中，我们已显示了暴露于高氧可以损害针对细菌感染的宿主防御，导致肺匀浆中更高的细菌负荷。表39中的结果指示了，与留在室内空气(RA)中的小鼠相比，气道中的细菌负荷通过小鼠预暴露于高氧(O2)而显著升高。对应于在用白藜芦醇(RES)治疗的小鼠中显著减少的肺损害，气道细菌负荷也是显著更低的。类似地，与暴露于高氧并用单独的媒介物治疗的细菌感染的小鼠相比，用UP446治疗的小鼠具有在其气道中显著更低的细菌负荷。与用高氧和媒介物对照(O2)治疗的小鼠相比，气道中的细菌负荷的这些差异是统计学上显著的。这些结果提示了实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446可以调控天然宿主防御稳态，其导致气道中减少的细菌负荷。
表39：UP446对气道中的细菌清除的作用
统计分析：Dunnett多重比较检验
实施例39：生物类黄酮组合物对气道中细胞外HMGB1累积的作用
气道中的细胞外HMGB1累积可以损害先天免疫，导致清除入侵病原体和细胞凋亡性嗜中性粒细胞的能力受损。这随后可以引起急性呼吸道感染、肺损害和甚至死亡(Entezari等人，2012；Patel等人，2013)。为了确定暴露于高氧的细菌感染的小鼠中UP446减弱的急性肺损害是否是由于其对气道中的细胞外HMGB1累积的影响，测量了肺灌洗液中的HMGB1水平。如先前显示的，这些小鼠延长暴露于高氧，随后为微生物感染，增加了气道中的HMGB1累积。当小鼠暴露于高氧和微生物感染时，存在HMGB1水平的4.8倍增加。这种升高可以通过用白藜芦醇(RES)或UP446的预治疗而减少。与暴露于高氧和细菌感染的媒介物治疗的小鼠相比，用RES和UP446预治疗动物分别显示了HMGB1表达水平的74.9％和71.6％减少。这些数据提示了，所公开的生物类黄酮组合物UP446可以减少暴露于高氧和细菌感染的小鼠中气道HMGB1的累积。这与UP446显著增强的改善针对呼吸系统中的微生物感染的宿主防御机制的能力相关联。
表40：UP446对气道中HMGB1表达的作用
AU：测密度术任意单位
实施例40：生物类黄酮组合物对SARS-CoV-2感染的hACE2转基因小鼠中的肺组织HMGB1的作用
通过经由鼻内喷雾用SARS-CoV-2病毒以105TCID50/50μL感染hACE2转基因小鼠来诱导疾病模型(Bao等人，2020)。在SARS-CoV-2病毒鼻喷雾的两小时内，小鼠用实施例4和表6中说明的生物类黄酮组合物UP894-II以400和200mg/kg进行经口施用。治疗维持总共5个每日剂量(即0dpi–4dpi)。没有病毒的正常转基因对照小鼠和疾病模型(感染病毒)仅接受以10mL/kg体积的媒介物(0.5％CMC)。尸检在5dpi时执行。将整个右肺匀浆化用于监测组织HMGB1蛋白表达。
将肺组织切除，在液氮中速冻，并且贮存于-80℃下直至匀浆化。将组织以每1mL裂解缓冲液50mg组织的浓度悬浮于裂解缓冲液中并且匀浆化。将样品置于冰上30分钟，每五分钟涡旋一次。将样品离心30分钟并且弃去团块。用BCA测定来定量蛋白质。简言之，制备了0-10μg标准曲线和BCA工作溶液(50:1试剂A:B)。将20μL样品体积与200μL BCA工作溶液在微板中混合，并在37℃下温育30分钟。在562nm处读取板吸光度，并且基于标准曲线的吸光度来计算蛋白质的量。将每个样品的40μg蛋白质与十二烷基硫酸钠加载缓冲液混合，并且在95-100℃下煮沸5分钟，以产生变性且还原的蛋白质样品。
制备聚丙烯酰胺凝胶，并且加载并用Tris-甘氨酸运行缓冲液(25mM Tris碱、190mM甘氨酸，0.1％SDS，pH 8.3)运行制备的蛋白质样品。在转移缓冲液(25mM Tris碱、190mM甘氨酸、20％甲醇)中经由湿转移法来转移凝胶。将膜用丽春红进行染色以显现蛋白质，并且确保充分转移。简言之，将膜在具有0.1％吐温20的Tris缓冲盐水(TBST)中进行洗涤。将丽春红储备液1:10稀释且加入。使膜在搅拌器上温育5分钟，然后在水中充分洗涤直至条带清晰可辨。
将膜封闭并且与一抗(1:100-1:3000稀释度)一起在TBST中在4℃下温育过夜。将膜洗涤3次，每次洗涤5分钟，以去除未结合的一抗。使它们在TBST中的缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(1:2000)中于室温下伴随搅动温育1小时。使用用于化学发光检测的ECL蛋白质印迹检测试剂盒(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)分析免疫印迹。使用ImageJ(版本1.41，NIH，Baltimore，MD，USA)执行图像数据的定量。
如图8中所见的，与无病毒感染的正常转基因对照小鼠相比，媒介物治疗的感染SARS-CoV-2病毒的转基因小鼠显示了肺HMGB1蛋白表达的2倍增加。与未感染的正常对照相比，关于媒介物治疗组的肺HMGB1水平中的这种增加是统计学上显著的。相比之下，当感染SARS-CoV-2病毒的转基因小鼠用生物类黄酮组合物UP894-II以两个剂量进行治疗时，发现肺组织中的HMGB1蛋白的表达减少至未感染的正常对照转基因小鼠的水平。与媒介物治疗的感染SARS-CoV-2的转基因小鼠相比，作为以高剂量和低剂量两者的生物类黄酮组合物治疗的结果，肺HMGB1表达水平的这些减少是统计学上显著的。肺组织中的HMGB1减少指示了通过所公开的生物类黄酮组合物改善的宿主防御机制，减少了SARS-Cov-2冠状病毒感染后的致死性细胞因子风暴以及相关的肺和其它器官损伤的可能性。
实施例41：生物类黄酮组合物UP446在人体临床试验中的评估
方案：随机化、三盲、安慰剂对照、平行临床试验，以关于在健康成人中支持免疫功能调查产品。本研究的目的是关于在健康成人中支持免疫功能调查试验用药品(investigational product，IP)UP446的功效，所述UP446包含实施例4以及表5和表6中产生的不少于60％的游离B环类黄酮和不少于10％的黄烷且在一些实施方案中由其组成。
在随机化、三盲、安慰剂对照、平行研究中，评估了试验用药品关于在流感疫苗接种前28天和后28天健康成人群体中支持免疫功能的功效。该研究包括40至80岁(含)的男性和女性，其尚未但愿意接受流感疫苗，同意提供流感疫苗接种口头史，同意贯穿研究期间尽可能维持目前的生活习惯，取决于其维持下述的能力：饮食、用药、补充剂、锻炼和睡眠，并且避免服用新的补充剂，健康的，如通过医疗史和实验室结果确定的，如通过合格调查者(QI)评价的，愿意完成与研究相关的问卷和日记，并且完成所有诊所就诊，并且提供对参与研究的自愿的书面知情同意。
QUAD，药物识别号(DIN)02494248，是被设计用于成人和9岁以上的儿童的免疫来预防来自A和B亚型的流感的QIV。
表41.流感疫苗中的病毒株
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排除以下受试者：1.怀孕、哺乳或计划在研究期间怀孕的女性。2.具有对UP446、安慰剂或流感疫苗中的活性成分或非活性成分的已知过敏症的参与者。3.自2020年9月起基线之前或在第28天疫苗接种之前患有流感的未接种疫苗的参与者。4.在基线之前或在第28天疫苗接种之前自我报告COVID-19的诊断的参与者。5.接受COVID-19疫苗的参与者。6.在基线的4周内，处方免疫调节剂(包括皮质类固醇)，例如免疫抑制剂或免疫刺激剂的目前使用。7.与加强或调节免疫系统相关的饮食补充剂或草药的目前使用，除非愿意冲洗掉。
表42.按治疗组的研究受试者的人口统计学特性
预计研究受试者参与长达最多56天的研究。受试者在就诊1(筛选，第-45天至-4天)时为知情同意以及在就诊2(基线，第0天)为合格的确认和随机化而参加研究。
在就诊2(第0天)、就诊3(第28天)和就诊4(第56天)时，评价了关于该研究的主要和次要功效及安全性终点。在筛选性就诊时记录人口统计信息和医疗史。研究受试者每天早晚两次随餐服用生物类黄酮组合物UP446 250mg，一直到流感疫苗接种(在第28天)，然后继续每天服用UP446 250250mg b.i.d.，持续另外4周(直至第56天)。
主要研究结果是如通过血液中的淋巴细胞群体(CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、TCRγδ+、CD3-CD16+56+)和免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)评价的，自基线起在第28天和第56天时，在UP446和安慰剂之间在免疫参数的变化中的差异。
进行统计分析，并且对于总体样品且按研究组获得概括性统计数据，包括关于人口统计学特性和结果测量的平均值、中值、标准差、最小值、最大值、比例(如果是分类的话)。当满足正态性假设时，使用方差分析(ANOVA)来检查两个治疗组(UP446和安慰剂)之间的连续变量的平均值中的差异，以及当不满足正态性假设时，使用Kruskal-Wallis检验。适当时，使用卡方和费希尔精确检验(当细胞具有小于5的计数时)来调查分类变量的差异。使用重复测量方差分析(线性混合模型)来检查在治疗组之间在一段时间内结果的平均值中的差异。基线值作为协变量被包括在每个模型中。重复测量方差分析(线性混合模型)也被用于检查在两个治疗组之间在一段时间内(自基线起在第28天、在第56天以及自第28天起在第56天)结果变化的平均值中的差异，基线值作为协变量被包括在每个模型中。来自LMM的成对统计显著性(在组间和组内)。Bonferroni调整被用于成对比较。统计显著性被定义为p值≤0.05。使用统计分析系统软件版本9.4(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)来执行分析。
在初步临床数据报告中，对于主要终点如免疫球蛋白A(IgA)观察到来自实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物的经口施用的统计学上显著的结果。如表43中所见的，在8周治疗结束时，与接受安慰剂的受试者相比，接受生物类黄酮组合物UP446的受试者显示了从第28天到第56天，粘膜免疫指标免疫球蛋白A(IgA)的统计学上显著的增加(P＝0.0260)。对于接受UP446的参与者，在疫苗接种之前和之后IgA的变化与接受安慰剂的参与者相比高0.08755g/L(p＝0.0260)。在组内，补充有UP446的受试者显示了IgA在统计学上和显著地增加，从第0天到第56天平均值为0.05720g/L(p＝0.0412)，而从第28天到第56天为0.06280g/L(p＝0.0252)。这些数据明确地显示了，健康呼吸系统的主要免疫球蛋白且被视为对于粘膜防御最重要的免疫球蛋白的IgA是生物类黄酮组合物在人类中的宿主防御机制的调控方面的重要活性。
表43：UP446相对于安慰剂的IgA变化
次要结果是在第28天和第56天在UP446与安慰剂之间关于以下的差异：1.确诊的COVID-19感染数；2.确诊的流感病例数；3.通过COVID-19对QoL的影响问卷评价的COVID-19对生活质量的影响；4.非处方感冒和流感用药使用。在第56天在UP446与安慰剂之间在以下中的差异：1.由于COVID-19的住院治疗数目；2.由于流感的住院治疗数目。
另外的结果是从基线到第28天和第56天的测量，在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物UP446与安慰剂之间在以下方面中的变化差异：1.红细胞沉降率(ESR)和C反应蛋白(CRP)；2.血液学参数：白血细胞(WBC)分类计数(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、网织红细胞计数、红血细胞(RBC)计数、血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、RBC指数(平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和红细胞分布宽度(RDW))；3.补体C3和C4蛋白；4.平均总体严重程度指数，如通过关于改良威斯康星上呼吸道症状调查(Modified Wisconsin UpperRespiratory Symptom Survey)(WURSS)-24每日症状评分的曲线下面积(AUC)测量的。5.平均症状严重程度评分，如通过关于WURSS-24每日严重程度症状评分的AUC测量的；6.健康天数(定义为对于问题“您觉得今天有多不舒服？”评分为0(未生病)的天数)，如通过改良WURSS-24问卷评价的；7.生病天数(定义为对于问题“您觉得今天有多不舒服？”评分为1到7的任何数字(生病)的天数)，如通过改良WURSS-24问卷评价的；8.常见上呼吸道感染(UTRI)症状的频率，如通过改良WURSS-24问卷评价的；9.常见UTRI症状的持续时间，如通过改良WURSS-24问卷评价的；10.常见UTRI症状的严重程度，如通过改良WURSS-24问卷评价的；11.如通过活力和生活质量(QoL)问卷评价的活力和生活质量。
从临床试验中的每个受试者收集血液样品，并且将其贮存用于未来分析，以分析自基线起在第28天和第56天，在实施例4和表6中说明的标准化生物类黄酮组合物与安慰剂之间在以下中的变化差异：
1.细胞因子(GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1β；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-α；TNF-β/LTA 150)
2.高迁移率族框1(HMGB1)蛋白、核因子κB(NF-κB)、核因子红系2相关因子2(Nrf-2)
3.如通过8-异前列腺素F2α、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和晚期糖基化终末产物(AGE)评价的氧化应激
4.特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度
除功效分析之外，还将通过对以下属性测试每个血液样品来执行安全性评估：1.临床化学参数：丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素、肌酐、电解质(Na+、K+、Cl-)、估计的肾小球滤过率(eGFR)、葡萄糖；2.在不良事件出现前和出现后的发病率；3.生命体征(血压(BP)和心率(HR)。
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Claims (33)

1.用于建立和调控宿主防御机制的稳态的生物类黄酮组合物，其包含富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物中的所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物以及所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物在按每种提取物的重量计1％-98％的范围内，具有80:20的优化重量比。
3.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从黄芩的根中富集且标准化的；并且所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从儿茶的心材中富集且标准化的。
4.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物包含0.5％至99.5％的一种或多种游离B环类黄酮。
5.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物包含0.5％至99.5％的儿茶素。
6.权利要求1的组合物，其中所述游离B环类黄酮包含以下中的至少一种：黄芩苷、黄芩素、黄芩素糖苷、汉黄芩素、汉黄芩素葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素糖苷、千层纸素、千层纸素糖苷、千层纸素葡萄糖醛酸苷、白杨素、白杨素糖苷、白杨素葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷和野黄芩苷糖苷、去甲汉黄芩素、去甲汉黄芩素糖苷、高良姜素或其组合。
7.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物包含以下中的至少一种：儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表茶黄素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素没食子酸酯或其组合。
8.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从高等植物的属中富集且标准化的，所述高等植物的属包含假鹰爪属、多头金绒草属、木蝴蝶属、榄桐属、香青属、山芫荽属、湿鼠曲草属、蜡菊属、矢车菊属、泽兰属、酒神菊属、乌桕属、黄芩属、石荠苎属、羽萼木属、水苏属、牛至属、新塔花属、山胡椒属、黄肉楠属、金合欢属、鱼藤属、甘草属、崖豆藤属、水黄皮属、灰毛豆属、菠萝蜜属、榕属、粉叶蕨属、隐囊蕨属、松属、榆属、山姜属或其组合。
9.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从包含以下的植物物种中富集且标准化的：黄芩、半枝莲、直萼黄芩、北美黄芩、盔状黄芩、粘毛黄芩、滇黄芩、甘肃黄芩、丽江黄芩、盔状黄芩、韩信草、石娱蚣草、粘毛黄芩、滇黄芩、甘肃黄芩、丽江黄芩、Scutellariaorientalis、木蝴蝶、西番莲、粉色西番莲、平菇、松乳菇、Suillusbellinii、洋甘菊、胡萝卜、蘑菇、蜂蜜、蜂胶、西番莲花和木蝴蝶花或其组合。
10.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从包含以下的植物物种中富集的：儿茶(黑儿茶)、儿茶、皱荚藤儿茶、金合欢、阿拉伯胶树、Acaciaspeciosa、阿拉伯金合欢、尖叶藤儿茶、羽叶金合欢、藤金合欢、黑荆、密花相思树、银荆、大叶相思、绢毛相思、马占相思、腰果(腰果种皮)、儿茶钩藤(白儿茶)、钩藤、茶树、普洱茶、巴西莓(阿萨伊果)、云实、凤凰木、银杏、红花槭、椰子、巴西补血草、Acerolabagasse、乳油木、葡萄、散沫花、波罗蜜、紫苜蓿、光叶百脉根、湿地百脉根、Eiseniabicyclis、Hedysarumsulfurescens、刺槐；苹果、杏、李子、樱桃、葡萄叶、草莓、豆类、柠檬、茶、红茶、绿茶、南非博士茶、大麦粒、绿藻(琉球伞藻)、红藻(美羽软粒藻)、巧克力(可可)、生咖啡豆或其组合。
11.权利要求1的组合物，其中所述富含至少一种游离B环类黄酮的至少一种标准化生物类黄酮提取物和所述富含至少一种黄烷的至少一种标准化生物类黄酮提取物是从包含以下的植物部分中提取和富集的：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、细枝、块茎、根、根状茎、根皮、树皮表面、嫩枝、种子、坚果、坚果种皮、果实、子实体、蘑菇、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花、干细胞、细胞培养组织或其任何组合。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物中的所述标准化生物类黄酮提取物用任何合适的溶剂进行提取，所述溶剂包括CO2的超临界流体、水、酸性水、碱性水、丙酮、甲醇、乙醇、丙烯醇、丁醇、与水混合的醇、混合有机溶剂或其组合。
13.权利要求1的组合物，其中所述标准化生物类黄酮提取物是通过转基因微生物、通过P450酶、通过糖转移酶或酶的组合、通过微生物或通过其组合合成、代谢、生物降解、生物转换、生物转化、由小碳单元生物合成的。
14.权利要求1的组合物，其中通过溶剂沉淀，中和，溶剂分配，超滤，酶消化，用硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、离子交换、CG161树脂或其组合的柱层析个别地或组合地富集所述标准化生物类黄酮提取物。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物进一步包含药学或营养学上可接受的活性物、佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含在所述至少一种标准化生物类黄酮提取物中的约0.1重量百分比(重量％)至约99.9重量％的活性化合物。
16.权利要求1的组合物，其中所述活性物、佐剂、赋形剂或载体包含姜黄提取物或姜黄素、榄仁属提取物、柳树皮提取物、芦荟叶凝胶粉末、茯苓提取物、迷迭香提取物、迷迭香酸、魔爪根提取物、卡宴辣椒提取物或辣椒素、花椒皮提取物、喜林芋属树皮提取物、啤酒花提取物、乳香属提取物、玫瑰果提取物、绿茶提取物、槐属提取物、睡茄、三岛柴胡、柴胡、甘草、连翘、西洋参、人参、高丽红参、香菇(Lentinulaedodes)(香菇(shiitake))、白桦茸(Inonotusobliquus)(白桦茸(Chagamushroom))、香菇、枸杞、裂蹄木层孔菌(子实体)、变色栓菌(子实体)、瓜尔豆、瓜尔豆(瓜尔胶)、变色栓菌、冈村枝管藻、裙带菜、薄荷属或薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、ω-3或ω-6脂肪酸、磷虾油、γ-亚麻酸、柑橘生物类黄酮、针叶樱桃浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、(一种或多种)矿物质氨基酸螯合物、(一种或多种)氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡萄糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨或其组合。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物被配制为片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒、压制片剂、丸剂、软糖、咀嚼胶、sashay、糯米纸囊剂、棒或液体形式、酊剂、空气扩散(aerialspread)、半固体、半液体、溶液、乳剂、乳膏、洗剂、软膏、凝胶基质或类似形式。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物对于呼吸系统疾病和状况是有效的。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物经由经口、局部、栓剂、静脉内、皮内、胃内、肌内、腹膜内或静脉内途径进行施用。
20.权利要求1的组合物，其中所述组合物通过施用0.01mg/kg至500mg/kg哺乳动物体重的有效量的组合物来治疗、管理或促进哺乳动物中宿主防御机制的稳态的调控。
21.权利要求1的组合物，其中所述组合物通过优化或平衡免疫应答来维持免疫稳态；改善衰老和免疫器官衰老损伤的免疫；预防慢性炎症和炎症损伤的免疫；帮助维持对流感疫苗接种和COVID-19疫苗接种的健康免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康免疫功能；或保护免疫系统免于哺乳动物的空气污染诱导的氧化应激损伤。
22.权利要求1的组合物，其中所述组合物调控作为内源性或外源性应答攻击触发器的HMGB1，并且转变宿主防御应答以恢复稳态，所述HMGB1通过免疫衰老，或通过炎症，或通过氧化应激损伤的免疫细胞；通过病毒或微生物、空气污染物感染的免疫细胞、宿主呼吸系统细胞或心血管细胞而释放。
23.权利要求1的组合物，其中所述组合物通过抑制HMGB1释放来调控HMGB1或抵消其作用，如通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放来靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制核中的分子内二硫键形成；在释放后直接靶向HMGB1并中和其效应；阻断HMGB1模式识别受体如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终末产物(RAGE)的受体，或抑制其信号转导；改变物理化学微环境并防止HMGB1四聚体的形成，并且干扰HMGB1与TLR和RAGE的结合亲和力；防止HMGB1的簇形成或自结合。
24.权利要求1的组合物，其中所述组合物支持健康的炎症应答；维持针对感染的细胞因子和细胞因子应答的健康水平；减轻针对感染的补体C3和C4蛋白、细胞因子和细胞因子应答的健康水平；减轻、调控且维持TNF-α，IL-1β，IL-6，GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-β/LTA、CRP和CINC3。
25.权利要求1的组合物，其中所述组合物控制氧化应答并减轻呼吸系统的氧化应激；通过增加SOD和NRF2来加强抗氧化能力；降低晚期糖基化终末产物，增加谷胱甘肽过氧化物酶；中和活性氧簇，并且预防氧化应激引起的呼吸、肺和免疫系统的结构完整性损伤和功能丧失。
26.权利要求1的组合物，其中所述组合物最小化或预防由AGE和AGE-RAGE相互作用引起的年龄相关的慢性疾病，包括在糖尿病的情况下预防糖尿病并发症和糖尿病微血管并发症；在心血管疾病的情况下预防冠状动脉粥样硬化和冠状动脉疾病的严重程度；在肾病的情况下预防肾衰竭和终末期肾病；在肥胖的情况下预防下丘脑功能障碍；减轻癌症起始、进展、迁移、侵袭和转移；在肠道微生物组相关疾病的情况下预防全身性内毒素血症、炎症和多器官损害；在神经变性疾病的情况下预防神经元死亡和变性；在阿尔茨海默病的情况下预防神经元细胞凋亡和神经变性；在帕金森病的情况下预防神经变性；在肝病的情况下预防非酒精性脂肪性肝病、炎症性肝损害、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化的起始和进展。
27.权利要求1的组合物，其中所述组合物改善先天免疫；改善适应性免疫；增加白血细胞的活性和计数，增强自然杀伤(NK)细胞功能；增加T和B淋巴细胞的计数；增加CD3+、CD4+NKp46+自然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+γδT细胞和CD8+细胞计数；以及保护且促进巨噬细胞的吞噬活性。
28.权利要求1的组合物，其中所述组合物支持或促进哺乳动物的正常抗体IgG、IgM、IgA、对于特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度的产生等等。
29.权利要求1的组合物，其中所述组合物中和、减少、防止来自病毒的恢复性感染，所述病毒包含高致病性禽流感(H5N1病毒株A)、甲型流感(H1N1、H3N2、H5N1)、乙型流感/Washington/02/2019样病毒；乙型流感/Phuket/3073/2013样病毒，甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒；冠状病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2(COVID-19)、MERS-CoV(MERS)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肠道病毒A71(EV71)、副流感病毒和腺病毒。
30.权利要求1的组合物，其中所述组合物中和、减少、防止来自微生物感染的呼吸系统的恢复性感染，所述微生物感染包含肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、曲霉菌属、隐球菌属、肺孢子菌属、荚膜组织胞浆菌、芽生菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、念珠菌属物种(spp.)和化脓性链球菌。
31.权利要求1的组合物，其中所述组合物中和、减少、防止来自以下的呼吸系统损伤恢复：空气中的PM2.5颗粒、空气中的PM10颗粒、空气污染物、氧化烟雾、烟草烟雾、电子烟。
32.权利要求1的组合物，其中所述组合物维持呼吸器官中健康的肺部微生物群或共生系统；维持肺清洁和排毒能力；保护肺结构完整性和氧交换能力；维持呼吸道并增强肺泡的氧吸收力；保护正常健康的肺功能免于病毒感染、细菌感染和空气污染；减轻氧化应激引起的肺部损伤；并且促进肺的微循环并保护哺乳动物的正常凝血功能等等。
33.权利要求1的组合物，其中所述组合物缓解或减轻感冒/流感样症状，包括但不限于身体疼痛、咽喉痛、咳嗽、轻微咽喉和支气管刺激、鼻充血、鼻窦充血、鼻窦压力、流鼻涕、打喷嚏、嗅觉丧失、味觉丧失、肌肉酸痛、头痛、发烧和发冷；帮助咳出痰(粘液)和稀薄支气管分泌物以使咳嗽更有效；减少支气管刺激的严重程度；减少由病毒感染、微生物感染和空气污染引起的肺损伤或水肿或炎症细胞浸润的严重程度；在整个感冒/流感或污染季节支持支气管系统和舒适的呼吸；预防或治疗肺纤维化；减少普通感冒/流感的持续时间或严重程度；减少呼吸系统的病毒和细菌感染的严重程度或持续时间；预防或治疗或治愈由病毒、微生物和空气污染物引起的呼吸道感染；管理或治疗或预防呼吸道感染或逆转其进展；以及促进和加强和恢复哺乳动物的肺和整个呼吸系统的修复和更新其功能等等。
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