CN117110625B - 一种dna逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于有机复合材料技术领域，具体涉及一种DNA逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用。本发明首先提供一种利用DNA逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的具体方法。所述方法包括合成DNA逻辑门纳米器件，利用该纳米器件底端识别靶蛋白并通过逻辑运算暴露出顶端触发序列，触发形成含有重复G‑四链体结构的DNA纳米纤维，进而催化诱导聚多巴胺的限域氧化沉积，从而对细胞膜表面的靶蛋白进行原位染色。本发明可实现原位对低丰度蛋白的显色。

Description

一种DNA逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用
技术领域
本发明属于有机复合材料技术领域，具体涉及一种DNA逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用。
背景技术
利用抗原抗体之间的特异性识别结合，以及酶联二抗催化显色底物沉积的免疫组织化学(IHC)技术已被广泛用于蛋白质原位染色分析。IHC技术依靠一抗对靶标蛋白的识别，引入过氧化物酶(HRP)偶联二抗，催化3,3’-二氨基联苯胺(DAB)的氧化，使其沉积在细胞膜表面，从而对目标蛋白进行显色。然而，免疫组化只能评估蛋白质的表达水平，不能反应蛋白之间的相互作用和聚集状态，不利于个性化治疗的实施。
核酸适配体是通过体外富集筛选得到的蛋白质高特异性亲和核酸序列，因其与靶标物质的结合能力可与抗体媲美，被称作“化学抗体”。基于DNA碱基之间的互补配对原则，可以设计组装复杂的二维、三维DNA结构，进而开发出具有特定功能的DNA逻辑门纳米器件。通过DNA逻辑门纳米器件整合两个或多个核酸适配体，可以将核酸适配体对不同蛋白质靶标的识别信息转换为串联或并联输出信号，从而对细胞膜表面的蛋白质相互作用进行识别(J.Am.Chem.Soc.2018,140(31),9793-9796；Chem.Rev.2021,121(22),13797-13868)。此外，在DNA逻辑门器件中引入G-四链体/Hemin，利用其HRP仿酶活性对显色底物的催化，可以将识别信号转换为显色信息(Angew.Chem.,Int.Ed.2021,60(40),21673-21678.)。然而，显色产物在溶液中的随机扩散使其输出信号只能代表靶标蛋白的表达水平，而无法对靶标进行原位分析。
G-四链体是由G-四分体平面通过π-π堆积形成的四股螺旋核酸结构，每一层的G-四分体是由4个鸟嘌呤核苷酸通过Hoogteen氢键连接而成。申请号为CN2021106103891，发明名称为“一种新型半醌自由基纳米材料及其制备方法与应用”的专利公开了一种将含有连续G序列的核酸退火复性，得到含G-四链体的水溶液，然后再在该水溶液中加入血红素得到G-四链体/Hemin复合物的方法。该专利发现部分聚多巴胺可以通过π-π堆积插入G-四分体的π平面之间，剩余的聚多巴胺则就可以将G-四链体粘附在一起。由于G-四链体之间存在静电斥力，因此G-四链体无法纵向堆叠，最终横向排列形成纳米片形貌的聚合物。如果只是将这种形貌的G-四链体/Hemin复合物引入DNA逻辑门器件中，利用聚多巴胺在G-四链体上的附着作为显色剂，则会存在催化位点少，显色程度低的问题，不利于染色结果的观察。
综上所述，有必要提出一种新的方法和策略，以弥补现有技术方案的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用DNA逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法和应用，具体技术方案如下。
：一种利用DNA逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法，包括以下步骤：
步骤1：通过DNA自组装反应合成DNA纳米三棱柱，将触发序列、靶蛋白核酸适配体序列与所述DNA纳米三棱柱共孵育，构建出DNA逻辑门纳米器件，所述触发序列的核苷酸序列如SEQID.NO.5所示；
步骤2：加入互补序列，所述互补序列与步骤1构建的DNA逻辑门纳米器件上的触发序列以及靶蛋白核酸适配体序列结合，将所述触发序列和靶蛋白核酸适配体序列暂时封闭；
步骤3：培养细胞，将细胞与步骤2中的DNA逻辑门纳米器件共孵育，当细胞膜表面存在靶蛋白时，所述靶蛋白核酸适配体序列与靶蛋白结合(释放互补序列)，触发逻辑门运算以使所述触发序列暴露；
步骤4：在步骤3的反应体系中进一步加入发夹序列孵育，所述发夹序列与所述触发序列结合，使结合在靶蛋白上的DNA逻辑门纳米器件顶端形成G4纳米线结构，所述发夹序列的核酸序列如SEQID.NO.2～4所示；
步骤5：在步骤4的反应体系中进一步加入血红素；
步骤6：在步骤5的反应体系中一步加入多巴胺(无色)和H2O2，室温孵育10-120min，形成黑色聚多巴胺纤维，从而对细胞膜表面靶蛋白显色。
进一步，所述细胞膜表面靶蛋白为蛋白质二聚体。
进一步，所述蛋白质二聚体为HER2:HER3异二聚体，其适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.6～7所示。
进一步，所述互补序列包括第1互补序列、第2互补序列、第3互补序列和第4互补序列，所述互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-11所示。
进一步，所述步骤4中加入发夹序列的孵育时间为1-2h。
进一步，所述DNA逻辑门纳米器件的摩尔浓度为10-100nM。
进一步，所述G4纳米线上包括多个交错排列的G-四链体(简称为G4)，单个G-四链体与血红素的摩尔比为1:1～1:50。
进一步，步骤1-5在自组装缓冲液中进行，所述自组装缓冲液的成分包括20mMTris、200mM NaCl、2mM MgCl2和20mM KCl；步骤6在水溶液中进行。
DNA逻辑门纳米器件在细胞膜表面蛋白原位染色中的应用，所述DNA逻辑门纳米器件底端通过靶蛋白核酸适配体序列与细胞膜表面靶蛋白结合，顶端结合具有多个聚多巴胺氧化沉积位点(每个聚多巴胺氧化沉积位点可作为一个显色剂)的G4纳米线对所述靶蛋白显色触发形成的G4纳米线沉积聚多巴。
进一步，所述G4纳米线由SEQ ID.NO.2～4所示的发夹序列通过杂交链式反应组装得到。
有益技术效果
本发明提供了一种利用DNA逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法和应用。相较于现有技术中在DNA逻辑门器件中引入G-四链体/Hemin，利用其HRP仿酶活性对显色底物的催化，将识别信号转换为显色信息的方法，本发明真正实现了对靶蛋白位点进行原位染色。由于G4纳米线上具有多个聚多巴胺氧化沉积位点，因此相当于具备了多个显色剂，显色程度更好。
为了使针对蛋白质二聚体的染色过程更加精确可控，本发明自主设计了多条功能序列去封闭靶蛋白核酸适配体和触发序列。多条互补序列将DNA逻辑门纳米器件上的触发序列和靶蛋白核酸适配体序列封闭，实现并联信号的输入输出控制过程，防止适配体与蛋白质单体的结合即可实现触发序列对HCR反应的触发，从而实现蛋白质二聚体特异性检测。
最后，本发明自主合成的DNA逻辑门纳米器件通过逻辑门运算及HCR反应，可以在逻辑门器件顶端形成含有重复G-四链体结构的G4纳米线，进一步催化诱导聚多巴胺的氧化沉积。G-四链体单元不仅作为聚多巴胺的催化活性位点，而且其与聚多巴胺的π-π堆积作用可以使聚多巴胺沉积在G4纳米线上，形成黑色的聚多巴胺纳米纤维。该纤维不仅能实现对靶蛋白显色，由于其具有多个聚多巴胺氧化沉积位点，因此还能提高低丰度靶蛋白显色程度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明聚多巴胺限域氧化沉积方法的模拟示意图；
图2为本发明其中一个实施例中富含鸟嘌呤的发卡核酸通过自组装反应得到G-四链体纳米线的凝胶电泳图片；
图3为本发明其中一个实施例中利用对2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)作为检测探针检测G纳米线/Hemin复合物的HRP仿酶活性的光谱图；
图4为本发明制备得到的聚多巴胺纳米纤维的透射电子显微镜(TEM)照片；
图5为本发明制备得到的聚多巴胺纳米纤维的原子力显微镜(AFM)照片；
图6为本发明DNA逻辑门纳米器件的合成及逻辑运算原理示意图(a为DNA纳米三棱柱合成示意图，b为DNA逻辑门纳米器件组装及识别运算示意图)；
图7为本发明DNA逻辑门纳米器件联合聚多巴胺限域氧化沉积方法对细胞膜表面蛋白质二聚体染色原理示意图；
图8为本发明其中一个实施例中使用蛋白质印迹法检测不同细胞模型的HER2:HER3异二聚体表达结果照片；
图9为本发明聚多巴胺限域氧化沉积方法对不同细胞染色的光学显微镜照片；
图10为本发明聚多巴胺限域氧化沉积方法与免疫组化方法对细胞膜表面蛋白质靶标染色原理图及染色强度对比(a为两种方法原理对比，b为IHC方法的染色结果，c为本发明限域氧化沉积方法的染色结果)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
名词解释
本发明所述的“DNA逻辑门纳米器件”是指在DNA自组装反应合成DNA纳米三棱柱上连接各种功能序列和互补序列以作为基本计算组件，利用链置换反应来行使特定功能的一种生物工具。
本发明所述的“逻辑门运算”是指本发明自主合成的DNA逻辑门纳米器件上的底端和顶端的功能序列，与本发明自主合成的互补序列结合，当底部功能序列结合靶蛋白时，互补序列之间的竞争释放和互补配对推动顶部功能序列的暴露，以触发后续反应的过程。
本发明所述的“聚多巴胺纳米纤维”是指利用本发明方法先合成得到一种G4纳米线结构，该结构进一步与血红素反应得到一种G4纳米线/Hemin复合物，该复合物具有过氧化物酶活性将多巴胺催化氧化为聚多巴胺，最后聚多巴胺在G4纳米线上的单个G-四链体上特异性氧化沉积，形成一种特殊形貌的聚多巴胺纳米纤维。
本发明所述的G4纳米线结构，是指本发明自主合成得到的发卡核酸序列通过HCR反应组装得到的DNA纳米纤维，该DNA纳米纤维上包括多个交错排列的G-四链体。
实施例1
本实施例提供一种控制聚多巴胺限域氧化沉积来制备聚多巴胺纤维的方法示例
步骤1：杂交链式反应(HCR)是由目标分子或触发序列引发若干自身稳定的DNA发卡结构发生级联自组装反应形成具有切口的长链DNA结构。根据杂交链式反应原理，在发卡序列两端引入触发序列和功能序列，可以通过HCR形成具有多个G-四链体的DNA纳米线，又称为G4纳米线。反应原理如图1所示，第1触发序列(SEQ ID NO.1)与第1发夹序列(SEQ IDNO.2)的部分序列互补配对，导致第1发夹序列的发卡结构被打开；随后第1发夹序列的未配对区域序列继续与第2发夹序列(SEQ ID NO.3)的部分组装序列互补配对，从而导致第2发夹序列的发卡结构被打开；随后第2发夹序列的部分未配对组装序列继续与第3发夹序列(SEQ ID NO.4)的组装序列互补配对，从而导致第3发夹序列的发卡结构被打开；随后第3发夹序列的部分未配对组装序列继续与第2发夹序列的部分组装序列互补配对，从而导致第2发夹序列的发卡结构被打开；进而第2发夹序列和第3发夹序列交替配对和重复延伸，最终得到DNA纳米线结构。该DNA纳米线结构中含有重复的第2发夹序列和第3发夹序列，每两个相邻发卡序列的尾端的多G序列部分可以组装成一个G-四链体结构，因此DNA纳米线上可以包含多个交错排列的G-四链体，称为G4纳米线。
步骤2：G-四链体进一步结合血红素(Hemin)，形成具有过氧化物酶活性的G4纳米线/Hemin复合物。在H2O2存在的条件下，多巴胺可以被G4纳米线/Hemin复合物催化氧化形成聚多巴胺。多巴胺聚合过程中形成的寡聚体可以与G-四链体结构中的G-四分体发生强烈的π-π堆积相互作用，从而G4纳米线的每个G-四链体作为聚多巴胺的氧化沉积位点，通过方法调控聚多巴胺的限域氧化沉积，最终得到复合的聚多巴胺纳米纤维。合成原理图如图1所示。
实施例2
本实施例提供一种具体的制备方法示例
.1)将第1触发序列与发夹序列(包括第1发夹序列、第2发夹序列和第3发夹序列)加入自组装缓冲液中，并于室温孵育1-2h，使所有序列发生HCR反应。第1触发序列与发卡序列的摩尔比为1:1～1:200。使用核酸纯化试剂盒处理上述溶液，脱去自组装缓冲液中的盐离子得到G4纳米线水溶液。使用凝胶电泳分析该核酸自组装过程，如图2所示，随着自组装步骤的增多，G4纳米线由于分子量越大，在凝胶电泳中发生滞孔现象。
2)往步骤1)的G4纳米线水溶液中加入血红素，并于室温孵育20-40min得到G4纳米线/Hemin复合物，所述G4纳米线中单个G-四链体与所述血红素的摩尔比为1:1～1:50。使用ABTS作为检测探针，验证G4纳米线/Hemin复合物的辣根过氧化物酶(HRP)仿酶活性，如图3所示，随着第1触发序列与发卡序列核酸的摩尔比不断增加(1:0、1:10、1:20、1:40、1:80、1:120、1:200)，自组装形成的G4纳米线长度越长，对ABTS的催化速度越快(G4纳米线越长，在500-900nm处的纵坐标表征的吸光值上越高)。
3)将步骤2)得到的G4纳米线/Hemin复合物与多巴胺水溶液搅拌混匀，并加入H2O2，所述G4纳米线与所述多巴胺的质量比为0.1:1～1:1，所述H2O2的浓度为0.1-1M。
4)将步骤3)得到的混合物进一步搅拌，搅拌时间为0.5-10小时，然后离心得到聚多巴胺纳米纤维材料；离心参数为10000-15000rpm，离心10-30min。
对该复合的聚多巴胺纳米纤维进行形貌表征(TEM，AFM)，如图4、图5所示，长度0.2～50μm，宽度10～200nm。
实施例3
本实施例提供一种利用聚多巴胺限域氧化沉积对细胞表面蛋白质靶标染色的方法示例
步骤1：受文献(J.Am.Chem.Soc.2018,140(31),9793-9796)启发，通过DNA自组装反应合成DNA纳米三棱柱，合成原理6a所示，其上下面为单链区域，可以作为功能序列的结合位点。
步骤2：利用DNA纳米三棱柱的单链区域分别结合带有连接序列的第2触发序列(SEQ ID NO.5)、HER2适配体序列(SEQ ID NO.6)和HER3适配体序列(SEQ ID NO.7)。之后，HER2适配体的部分序列与第1互补序列(SEQ ID NO.8)、HER3适配体的部分序列与第2互补序列(SEQ ID NO.9)、第2触发序列的部分序列与第3互补序列(SEQ ID NO.10)以及第3互补序列的部分序列与第4互补序列(SEQ ID NO.11)分别连接并形成DNA逻辑门纳米器件，合成原理如图6b所示。其中，第2触发序列、HER2适配体序列和HER3适配体序列的3’端或5’端为连接序列，可分别与DNA纳米三棱柱上下面的单链区域互补结合；而第1-4互补序列的作用则是与特定的靶序列竞争性结合，从而暴露出目标序列片段以推动逻辑门运算。这其中，当细胞膜表面存在HER2:HER3蛋白质二聚体时，HER2适配体序列、HER3适配体序列可以与该蛋白质二聚体结合，使原本结合在适配体上的第1互补序列和第2互补序列释放，从而与第3互补序列和第4互补序列配对，最终导致第2触发序列的暴露，该暴露出的第2触发序列则可以按照实施例2所述，触发HCR反应，并进一步催化诱导聚多巴胺的限域氧化沉积，最终实现细胞上染色。本发明涉及的核酸序列信息如表1所示。所述序列均为相同摩尔浓度，其中序列1-3为文献资料公开的工具序列。
可以理解的是，本发明所述的蛋白质二聚体不限于本实施例所示例的HER2:HER3蛋白质二聚体。
表1
实施例4
本实施例提供一种具体的染色方法示例
本实施例的过程原理如图7所示。
1)将序列1、序列2、序列3、第2触发序列、HER2适配体序列、HER3适配体序列、第1～4互补序列等比例加入退火缓冲液中，室温孵育形成DNA逻辑门纳米器件。
2)本实施例以SK-BR-3细胞为目标模型，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞为对照组模型，以细胞膜表面HER2:HER3异二聚体的表达和相互作用情况为检测对象。如图8所示，SK-BR-3细胞表达HER2蛋白和HER3蛋白，而对照组MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞没有HER2和HER3的表达。hNRG-1细胞因子刺激后，SK-BR-3中的磷酸化HER2(p-HER2)和磷酸化HER3(p-HER3)表达升高，表明HER2:HER3异二聚体的形成。而对照组细胞没有HER2:HER3异源二聚体现象的发生。
3)培养细胞。可选地培养SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231细胞并接种于24孔板，待细胞生长至70-80％融合度时，使用4％多聚甲醛固定细胞，并使用3％ H2O2消除细胞本身的HRP酶活性。
4)使用牛血清白蛋白和鲱鱼精DNA封闭细胞表面全部蛋白质位点，所述牛血清白蛋白浓度为1-10％，所述鲱鱼精DNA浓度为0.1-1mg ml-1。
5)洗去多余牛血清白蛋白和鲱鱼精DNA后，将DNA逻辑门器件与细胞共孵育，所述DNA逻辑门器件浓度为10-100nM。
6)用PBS缓冲液洗去未结合的DNA逻辑门纳米器件后，加入第1～第3发夹序列，室温孵育1-2h。所述发卡核酸的浓度为：发卡1，10-100nM；发卡2，1-10μM；发卡3，1-10μM。
7)使用PBS缓冲液洗去未组装的发卡核酸后，加入血红素，并室温孵育10-60min，形成G4纳米线/Hemin复合物。每个G-四链体与血红素的摩尔比为1:1～1:50。
8)加入多巴胺和H2O2，室温孵育0.5-10h，利用G4纳米线/Hemin复合物对多巴胺的氧化催化，使多巴胺氧化为聚多巴胺并沉积在G4纳米线上。所述G4纳米线与所述多巴胺的质量比为0.1:1～1:1，所述H2O2的浓度为0.1-1M。
结果如图9所示，SK-BR-3细胞由于含有HER2:HER3异二聚体，可以与DNA逻辑门器件结合，并通过一系列逻辑门运算以及催化氧化，将聚多巴胺沉积在细胞膜上。而MCF-7和MDA-MB-231细胞不含有HER2:HER3异二聚体，无法触发后续的反应，所以无聚多巴胺染色信号。
传统的IHC技术中每个二抗上只有一个HRP催化位点，对低丰度靶标的染色往往较浅，不利于结果观察与分析。为了与本发明的染色效果对比，本实施例以HER2蛋白为靶标，以连接了触发序列的HER2适配体作为识别元件，进行单靶标识别染色。如图10所示，IHC方法对细胞的染色程度较浅，而本发明中G4纳米线含有大量重复的G-四链体不仅可以对多巴胺进行氧化催化，还作为聚多巴胺的沉积位点，故染色程度较深。上述结果说明本发明方法有利于低丰度靶标的染色分析。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (8)

1.一种利用DNA逻辑门纳米器件对细胞膜表面蛋白进行原位染色的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
步骤1：将DNA序列1、DNA序列2和DNA序列3通过DNA自组装反应合成DNA纳米三棱柱，所述DNA序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述DNA序列2的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述DNA序列3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；将触发序列、靶蛋白核酸适配体序列与所述DNA纳米三棱柱共孵育，构建出DNA逻辑门纳米器件，所述触发序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤2：加入互补序列，所述互补序列与步骤1构建的DNA逻辑门纳米器件上的触发序列以及靶蛋白核酸适配体序列结合，将所述触发序列和靶蛋白核酸适配体序列暂时封闭；
步骤3：培养细胞，将细胞与步骤2中的DNA逻辑门纳米器件共孵育，当细胞膜表面存在靶蛋白时，所述靶蛋白核酸适配体序列与靶蛋白结合，触发逻辑门运算以使所述触发序列暴露；
步骤4：在步骤3的反应体系中进一步加入发夹序列孵育，所述发夹序列由第1发夹序列、第2发夹序列和第3发夹序列组成，所述第1发夹序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第2发夹序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第3发夹序列的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述发夹序列与所述触发序列结合，使结合在靶蛋白上的DNA逻辑门纳米器件顶端形成G4纳米线结构；
步骤5：在步骤4的反应体系中进一步加入血红素；
步骤6：在步骤5的反应体系中进一步加入多巴胺和H2O2，室温孵育10-120 min，形成黑色聚多巴胺纤维，从而对细胞膜表面靶蛋白显色。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞膜表面靶蛋白为蛋白质二聚体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质二聚体为HER2:HER3异二聚体，其适配体由HER2适配体和HER3适配体组成，所述HER2适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述HER3适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述互补序列包括第1互补序列、第2互补序列、第3互补序列和第4互补序列，所述第1互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第2互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述第3互补序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述第4互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中加入发夹序列的孵育时间为1-2h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA逻辑门纳米器件的摩尔浓度为10-100 nM。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述G4纳米线上包括多个交错排列的G-四链体，单个G-四链体与血红素的摩尔比为1:1~1:50。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在进行细胞膜表面蛋白原位染色中的应用，其特征在于，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的；所述方法先构建出DNA逻辑门纳米器件，所述DNA逻辑门纳米器件底端通过靶蛋白核酸适配体序列与细胞膜表面靶蛋白结合，所述DNA逻辑门纳米器件顶端结合具有多个聚多巴胺氧化沉积位点的G4纳米线对所述靶蛋白显色。
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