CN117085038A - 金属离子增强砷的治疗作用的用途 - Google Patents

金属离子增强砷的治疗作用的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及砷化合物和金属离子的组合，该组合用作药物，其中该金属离子增强砷的治疗作用。

Description

金属离子增强砷的治疗作用的用途
本申请是申请号为202080040613.1(PCT/EP2020/064189)、申请日为2020年5月20日、发明名称为“金属离子增强砷的治疗作用的用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医学领域并且基于以下出乎意料的发现：通过施用二价金属离子、尤其是Cu2+离子可以增强砷的治疗作用。
背景技术
砷的治疗用途和可能的作用机制
两千多年来，砷化合物作为传统药物在世界多地广泛用于治疗各种疾病，如银屑病、梅毒、或风湿性关节炎。在这些药剂的悠久历史中，已经开发并使用了许多不同的砷制剂。例如，含有1％亚砷酸钾(KAsO2)的福勒氏溶液多年来一直被指定为治疗白血病的药物，甚至被指定为滋补品。
一些砷化合物具有明显的毒性和致癌性，具有如肝硬化、特发性门静脉高压、膀胱癌、和皮肤癌的副作用。然而，最近人们重新发现并配制了几种砷化合物用以治疗不同的疾病，如癌症。
特别地，三氧化二砷(As2O3，在本文中也称为“ATO”)是最有效的新型抗癌(“抗肿瘤”或“细胞毒性”)药剂之一。ATO已被美国FDA批准用于治疗对“一线”药剂(即全反式视黄酸(ATRA))具有抗性的急性早幼粒细胞白血病(APL)。已经发现三氧化二砷诱导癌细胞发生细胞凋亡。
三氧化二砷也是已知的或目前正在研究的作为针对其他疾病(如自身免疫性疾病)的药剂。
Bobé等人(Blood[血液],108,13,p3967-3975,2006)研究了三氧化二砷在系统性红斑狼疮小鼠模型中的作用。As2O3通过预防幼鼠发展出综合征和近完全逆转老年动物已形成的疾病，显著延长了MRL/lpr小鼠的存活。作者们提出，这种化合物可用于治疗自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮。
在US 8,394,422中，Chelbi-Alix和Bobé提出三氧化二砷可用于治疗自身免疫性疾病和/或炎症性疾病。
Kavian等人(J Immunol[免疫学杂志].2012；188(10):5142-9)报道了ATO在鼠类硬皮病GvHD中的成功使用。
最近，Maier等人(J.Immunol[免疫学杂志].2014年1月15日；192(2):763-70)表明，砷化合物(包括FDA批准的抗癌治疗剂三氧化二砷)是半胱天冬酶-1和先天性免疫响应(即白细胞介素1-β)的强效抑制剂，并因此具有治疗自身免疫性障碍的炎症性组分的潜力。此外，Li等人示出了三氧化二砷改善类风湿性关节炎患者的Treg和T17平衡，因此是一种潜在的有用的免疫调节剂(Int.Immunopharmacology[国际免疫药理学],2019,Arsenictrioxide improves Treg and Th17 balance by modulating STAT3 in treatment-rheumatoid arthritis patients[三氧化二砷通过调节STAT3改善初治类风湿性关节炎患者的Treg和Th17平衡])。
先前报道了As2O3诱导的APL细胞分化是由于As2O3与PML-RARα融合蛋白RING指-B盒-卷曲螺旋(RBCC)结构域中的锌指的半胱氨酸残基直接结合而发生的，从而导致SUMO化/泛素化增强，并且接着导致PML-RARα融合蛋白的降解增强，促进细胞分化而导致临床缓解(Zhang等人,Science[自然].2010；328(5975):240-3；Chen等人,Blood[血液].2011年6月16日；117(24):6425-37)。然而，尽管解释了砷在这种罕见癌症中的有益作用，但这并不是明确的普遍现象，不可用来解释As在其他癌症性病症中的作用，在这些其他癌症性病症中，对As的功效进行了检测(并且现在仍在进行检测)(如clinicaltrials.gov所报告，到2019年，正在或已经进行的砷化合物的临床试验超过100个)，也不可用来解释As在自身免疫性疾病或移植物抗宿主病中的作用。
为了解释最近观察到的、As对免疫系统的有益作用，提出了一种新的作用机制。实际上，越来越清楚的是，许多细胞类型体外(细胞系或原代培养物，正常的或患病的)和体内(自身免疫性疾病的动物模型)暴露于As的主要后果之一是诱导特定细胞死亡，这种死亡通常是通过各种促凋亡程序的刺激(虽然通常是假设)，预期导致细胞亚群的变化，通常伴有细胞因子水平减少和修饰的细胞间通讯。
其中一个主要假设是一些氧化应激途径被激活，产生ROS(有时有趣的是观察到不受常见抗氧化剂(如N-乙酰半胱氨酸-NAC)的抑制)，导致谷胱甘肽消耗和其他细胞应激诱导过程，从而导致细胞死亡，尤其是在病理性免疫激活的细胞中导致细胞死亡(例如，参见Bobé等人2006,同上，和Kavian等人,同上，表明浆细胞样树突状细胞死亡)。
为了进一步了解砷的抗肿瘤机制，Zhang等人(PNAS[美国科学院院报]2015；第112卷,第49期)利用人类蛋白组微阵列鉴定了砷结合蛋白。他们鉴定出360种砷结合蛋白，并发现糖酵解的蛋白高度富集。他们提出，一般的糖酵解、特别是糖酵解途径的限速酶己糖激酶-2在介导砷的抗癌活性中起关键作用。
此外，已报道砷靶向Pin1，Pin1被描述为癌症和其他疾病的关键“驱动者”和独特的药物靶标。Kozono等人提出，通过Pin1的直接可逆抑制，临床安全剂量的ATO和ATRA共同阻断多种癌症驱动途径，因此它们的组合为对抗乳腺癌和其他癌症提供了有吸引力的方法(Nat Commun[自然通讯].2018年8月9日；9(1):3069)。
然而，As的一种或多种详细作用机制远未完全阐明。
砷的常见不良作用
As2O3是药理活性化合物，在高浓度或长期暴露时具有高度毒性特性。
有趣的是，急性早幼粒细胞白血病(获得FDA和EMA授权)和SLE(2a期；已终止)或GvHDc(2期，正在进行)的治疗仅对通常采用的静脉内(IV)剂量(在一到两个(有时长达五个)月的IV治疗时间段内，0.15mg/kg/天)产生可逆的不良作用(AE)。
这些AE是对患者健康状况的潜在重要威胁，最不受欢迎的是心脏QT增宽的短暂增加，可能与血液电解质水平的变化和肝脏肝酶释放增加一起出现。这些AE受到仔细监测，基本上是可逆的——但需要暂停治疗几天——发生在很大比例的患者中。典型地，即使在严格的纳入/排除规则下招募患者，仍有约三分之一的患者会发生AE。
因此，仍然需要减少向用三氧化二砷或其他砷剂治疗的患者施用的砷的量，以减少药理活性成分(API；三氧化二砷或任何其他砷化合物)的负面作用，同时保持相同水平的有利的生物活性。
然而，一方面，砷剂的积极作用是剂量依赖性的，已经计算出通常采用的剂量以减少相关的不良作用。另一方面，如上所解释，砷剂的作用机制仅部分得到确定，并且到目前为止，仅少数观察到的生化作用和生理作用对理解治疗的预期疗效具有较高价值。在癌症学和免疫病理学领域最重要的一个作用是它能够激活导致细胞因子释放和特定细胞死亡的细胞应激过程，以及对与某些疾病相关的特定免疫机制的积极干扰。
因此，目前需要找到能够增强用作药物的砷的积极作用而不展现出砷的毒性特征的药物。实际上，这将允许相应地减少给定治疗给予的一种或多种砷盐的量，或在不增加施用的一种或多种砷盐的量的情况下提高治疗的功效。
ROS的产生和相关的调节性抗氧化剂
在此上下文中，发明人研究了通过平行使用能够增加细胞应激的药物或分子来增强给定剂量的API的作用的可能性。
细胞应激主要是通过增加自由基氧簇(ROS)来介导的。主要的细胞应激氧化途径及其级联步骤是熟知的，包括：
i.超氧自由基的生成：O2+1e-→O2 ·-
ii.过氧化氢的生成：O2 ·-+O2 ·-+2H+→H2O2+O2
iii.羟基自由基的生成：H2O2+Fe2+→·OH+Fe3++OH-
过氧化氢的量受加速其歧化的血红素过氧化物酶和催化其被谷胱甘肽(GSH)还原的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的调节。
存在其他ROS，如过氧自由基RO2 ·、氢过氧化物RO2H和烷氧基自由基RO·。
H2O2降解的芬顿反应(上述反应(iii))典型地由游离二价铁离子催化，并导致·OH的生成。不可否认，芬顿反应局限于内质网处或在核周位置中，而不存在于线粒体或其他细胞区室中(Liu Q,等人Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]2004；101:4302-7)。H2O2的来源可以是线粒体(超氧化物歧化酶反应)、过氧化物酶体(酰基辅酶A氧化酶反应)和老年斑的β淀粉样蛋白(超氧化物歧化酶样反应)。从细胞抗氧化机制(如谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶)逃逸的H2O2可能会在定位于核周的芬顿反应中以非酶促方式转化，并充当RNA或DNA损伤剂。
发明内容
发明人研究了通过平行使用能够增加细胞应激的药物或分子通过芬顿反应的激活来增强给定剂量的砷化合物的作用的可能性。为了达到这个目的，他们测试了已知能增加这种反应的几种元素，从熟知的铁盐开始，然后是其他元素，如Zn、Mn、Mg、Cu、Au等。
如下文实验部分所述，他们发现，在使用不同遗传背景的小鼠细胞开发的免疫系统功能(混合淋巴细胞反应(MLR))的基本且高度显著的测试中，Cu2+离子以一种完全出乎意料并且不能仅仅通过芬顿反应的激活来解释的方式，特别地与砷显示出强烈的协同作用特征，包括所有能搜索到的特征，即，细胞中H2O2产生、细胞凋亡诱导增加和生理作用。
因此，本发明涉及包含砷化合物和金属离子的药物，该金属离子选自由以下组成的组：Cu2+，更经典的芬顿试剂如Au2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+以及它们的混合物。
本发明还涉及Cu2+盐和砷化合物的组合在治疗各种疾病，包括肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病和神经退行性疾病中的用途，其中同时或依序向患者施用砷化合物和Cu2+盐。在这样的组合治疗中，Cu2+离子能增强砷的治疗作用。
附图说明
图1：浓度递增的As2O3对HL60细胞中H2O2、GSH产生和细胞活力的影响。
图2：浓度递增的FeSO4单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图3：浓度递增的HAuCl2单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图4：浓度递增的ZnSO4单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图5：浓度递增的ZnCl2单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图6：浓度递增的MnSO4单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图7：浓度递增的MnCl2单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图8：浓度递增的CuSO4单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图9：浓度递增的CuCl2单独或与1μM的As2O3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图10：与CuCl2(1或4μM)组合的As2O3(1μM)对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图11：与浓度递增的CuCl2(0.5至4μM)组合的As2O3(1μM)对HL60细胞中GSH产生和细胞活力的影响。
图12：As2O3对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。纵坐标：DO UptiBlue，其测量细胞代谢活性(并视为直接生长指标)。
图13：浓度递增的FeSO4单独或与1μM的As2O3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图14：浓度递增的HAuCl2单独或与1μM的As2O3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图15：浓度递增的ZnSO4和ZnCl2单独或与1μM的As2O3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图16：浓度递增的MnSO4和MnCl2单独或与1μM的As2O3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图17：浓度递增的CuSO4和CuCl2单独或与1μM的As2O3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图18：浓度递增的CuCl2单独或与1μM的As2O3组合时对A20细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图19：与浓度递增的CuCl2(0.5至4μM)组合的As2O3(1μM)对A20细胞中GSH产生和细胞活力的影响。
图20：浓度递增的AsI3对HL60细胞中H2O2、GSH产生和细胞活力的影响。
图21：浓度递增的CuCl2单独或与1μM的AsI3组合时对HL60细胞中H2O2产生和细胞活力的影响。
图22：As2O3和AsI3对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图23：浓度递增的CuCl2单独或与1μM的AsI3组合时对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的增殖的影响。
图24：治疗对慢性GvHD中皮肤异常(毛发脱落)发作的影响。图片代表不同实验组中毛发脱落的发展。A：同基因(8只小鼠)。B：同种异基因(9只小鼠-7只毛发脱落)。C：同种异基因+As2O3 2.5μg/g(9只小鼠-3只毛发脱落)。D：同种异基因+As2O3 2.5μg/g+CuCl2 2.5μg/g(3只小鼠-无毛发脱落)。E：同种异基因+CuCl2 2.5μg/g(2只小鼠-1只毛发脱落)。F：同种异基因+As2O3 2.5μg/g+CuCl2 10μg/g(2只小鼠-无毛发脱落)。G：同种异基因+CuCl2 10μg/g(5只小鼠-无毛发脱落)。H：同种异基因+As2O3 5μg/g(5只小鼠-1只毛发脱落)。
图25：GVHD进展期间治疗对小鼠体重的影响。A.用或不用As2O3(2.5μg/g或5μg/g，如所指示的)治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组。B.用或不用(As2O32.5μg/g和CuCl22.5μg/g)治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组。C.用或不用(As2O3 2.5μg/g和CuCl210μg/g)治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组。
图26：GVHD进展期间治疗对血管炎(临床评分：耳部厚度)的影响。A.用或不用2.5μg/g或5μg/g的As2O3治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组中小鼠耳部的厚度。B.用或不用2.5μg/g的As2O3和2.5μg/g的CuCl2治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组中小鼠耳部的厚度。C.用或不用2.5μg/g的As2O3和10μg/g的CuCl2治疗的同基因小鼠组和同种异基因小鼠组中小鼠耳部的厚度。
图27：治疗对肝脏的影响：每只小鼠血液中的转氨酶水平。A.根据治疗的同基因小鼠和同种异基因小鼠血清中的ALAT。B.根据治疗的同基因小鼠和同种异基因小鼠血清中的ASAT。
图28：GVHD进展期间治疗对小鼠体重的影响。小鼠用0/0.2μg/g和0.5μg/g的铜治疗。
具体实施方式
如本文所使用的，术语“治疗(treat、treatment、和treating)”是指与疾病相关的一种或多种症状的任何减轻，如例如，自身免疫性疾病中症状的发生和/或严重程度的降低、和/或向癌症患者施用根据本发明的组合物所导致的存活率的提高。本文所使用的这些术语通常意指获得所需的药理学作用和/或生理学作用。该作用在完全或部分预防疾病方面可以是预防性的、和/或在部分或完全治愈疾病和/或疾病所致的不良作用方面可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”涵盖哺乳动物疾病的任何治疗，并且包括：预防可能易患疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者发生该疾病；抑制疾病，即，阻止其发展；或缓解疾病，即，引起病情的消退。治疗剂可在疾病或损伤发生之前、期间或之后施用。特别关注正在发生的疾病的治疗，其中治疗稳定或减轻患者的不良临床症状。
如本文所使用的，短语“缓解至少一种症状”是指减少受试者正在接受治疗的疾病或病症的一种或多种症状。在特定的实施方式中，正在接受治疗的疾病或病症是血液恶性肿瘤，其中缓解的一个或多个症状包括但不限于虚弱、疲乏、呼吸短促、容易瘀伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部膨胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨或关节痛、骨折、非计划的体重减轻、食欲不振、盗汗、持续轻度发热、和排尿减少(由于肾功能受损)。
如本文所使用的，“预防”和类似词语如“防止”等指示预防、抑制、或降低疾病或病症发生或复发的可能性的方法。它也指延缓疾病或病症的发作或复发、或延缓疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低疾病或病症的强度、作用、症状和/或负担。
如本文所使用的，术语“量”是指足以达到有益或所需预防或治疗结果(包括临床结果)的砷+金属离子的“有效的量”或“有效量”。在一个实施方式中，有效量是指足以预防、缓解疾病的一种症状或治疗疾病(例如本文中预期的血液恶性肿瘤或自身免疫性疾病)的含砷化合物和金属离子的量。
“预防有效量”是指有效达到所需的预防结果的含砷化合物+金属离子的量。典型地但不是必须的，由于受试者在疾病之前或早期使用预防剂量，预防有效量低于治疗有效量。
含砷化合物+金属离子的“治疗有效量”可以根据多种因素如疾病状态、年龄、性别、和个体重量、以及药剂(砷化合物)和共药剂(金属离子)的性质而变化，以在个体内引起所需的响应。治疗有效量也是其中治疗有益作用超过药剂的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。
如本文所使用的，术语“包含”或“包括”旨在意指组合物和方法包括所引用的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他元素。例如，如本文所定义的基本上由多个要素组成的组合物不排除不会对所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖的特征产生实质性影响的其他要素。“由......组成”应意指排除引用超过痕量的其他成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的任一个定义的实施方式均在本发明的范围内。
在数值之前使用的术语“约”指示该值可以在合理范围内变化，如±10％、±5％和±1％。表达“约x”包括值“x”。
单数形式“一个/一种(a)”和“该(The)”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“金属离子”包括多种金属离子。
必要时，其他定义将在下文说明。
根据第一方面，本发明涉及包含砷化合物和金属离子的药物，该金属离子选自Cu2 +、Au2+、Fe2、Zn2+、Mn2+、Mg2+以及它们的混合物。
在根据本发明的组合物中可以用作活性成分的砷化合物(通常为盐)的实例包括As2O3、AsI3、As2O5、As4O6、As2S2、As2S3、As2S5、As4S4以及它们的混合物。
根据本发明的药物优选地包含三氧化二砷或三碘化砷连同如上文所列出的金属离子(如Cu2+)，该金属离子是单独的或与选自Au2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+和Mg2+的任何其他金属离子组合。
根据下文实例中所展示的特定的实施方式，Cu2+离子呈盐的形式，如硫酸铜(CuSO4)或氯化铜(II)(CuCl2)。
当用于治疗血液癌症时，ATO的实际剂量为0.15mg/kg/天。下文实验部分中披露的结果表明，当ATO与Cu2+组合使用时，其作用增强。因此，在Cu2+存在下用较低剂量的ATO应获得与目前使用的ATO配制品相同的治疗功效。根据情况，医师也可以选择与Cu2+离子组合，ATO的浓度与目前在组合中批准的浓度相同，以增强ATO的治疗作用。
根据本发明的特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含0.01至0.15mg/kg/天的三氧化二砷(对应0.1至1.6μmol/kg的砷原子)。
根据本发明的另一特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含0.01至0.05mg/kg/天的三氧化二砷。
根据本发明的另一特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含0.05至0.10mg/kg/天的三氧化二砷。
根据本发明的另一特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含0.10至0.15mg/kg/天的三氧化二砷。
当在本发明框架中使用不同于三氧化二砷的砷化合物时，可以选择其剂量，向患者施用的砷原子的量与上文指示的三氧化二砷的剂量相同。
根据本发明的另一特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含0.05μmol/kg至10μmol/kg的Cu2+、优选地0.06μmol/kg至2μmol/kg的Cu2+、例如0.3μmol/kg至1.1μmol/kg的Cu2+。根据特定的实施方式，根据本发明的组合物经配制，每日剂量包含约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10μmol/kg的Cu2+。
当然，技术人员可以选择任何其他的铜施用方案，如每隔一天一次、每三天一次或甚至每周一次，以达到与上述每日剂量相当的剂量。
ATO或任何其他砷化合物已成功治疗的任何疾病都可以从用如上所述的组合物进行的治疗中获益，因为砷和金属离子(如Cu2+)的组合增强了砷的有益作用。此外，可以预料，与砷已成功治疗的疾病和障碍具有相同病理生理机制、但直到现在还不能从砷的作用中获益(因为需要较高剂量的活性有效成分，难以与安全性相协调)的疾病现在可以用砷和金属离子如Cu2+的协同组合来治疗。
因此，本发明还涉及如上所述的组合物在治疗选自以下的疾病中的用途：
-肿瘤性疾病，
-自身免疫性疾病，和
-炎症性疾病。
本发明还涉及Cu2+盐(例如，Cu2SO4或CuCl2)和砷化合物(如上所述)的组合在治疗选自由肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病组成的组的疾病中的用途，其中同时或依序向患者施用砷化合物和Cu2+盐。
因此，本发明还涉及包含砷化合物的组合物用于治疗选自由肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病组成的组的疾病的用途，其中将砷化合物与Cu2+盐或具有类似特性的任何其他金属离子组合向患者施用。根据特定的实施方式，在包含Cu2+盐的组合物之前施用包含砷化合物的组合物。根据另一特定的实施方式，在包含Cu2+盐的组合物之后施用包含砷化合物的组合物。在这两种情况下，以优选地不超过12小时的时间间隔施用砷化合物和Cu2+盐。根据另一特定的实施方式，同时施用包含砷化合物的组合物和包含Cu2+盐的组合物。无论施用顺序如何，均经由相同途径或不同途径施用砷化合物和Cu2+盐。
根据其另一方面，本发明涉及金属离子的盐(例如Cu2+盐)用于增强/增加如上所述的砷化合物的治疗作用的用途。例如，Cu2+离子等可用于增强疾病(如肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、或更普遍的炎症性疾病)治疗中使用的ATO或任何其他砷化合物的治疗作用。“增强”在本文中意指使用相同量的砷化合物(例如，ATO)的情况下，当患者也接受Cu2+离子时，砷的治疗作用显著增加，尽管单独施用Cu2+离子没有任何可测量的作用。这种增强或协同至少在体外得到证实，如下文实例1至9中所展示(这些实例示出了细胞中H2O2产生和细胞凋亡诱导显著增加，以及在混合淋巴细胞反应(MLR)(这是一种对免疫系统功能非常显著的测定)中生理作用显著增强)。实例10中示出的结果展示了在动物模型中的这种体内协同作用。
根据另一方面，本发明还涉及用于在有需要的患者中治疗选自由肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、或更普遍的炎症性疾病组成的组的疾病的方法，该方法包括向患者施用有效剂量的砷化合物(如上所定义)和选自Cu2+、Au2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+以及它们的混合物的金属离子的步骤。根据特定的实施方式，向患者施用Cu2+盐。
根据背景(砷化合物的性质、相关疾病、这种疾病的分期和患者的一般参数)，临床医师将调整砷化合物和Cu2+盐等的施用剂量和方案。
根据特定的实施方式，砷化合物是三氧化二砷。在这种情况下，治疗有效量最高为0.30mg/kg/天的ATO，例如0.30、0.25、0.20或0.15mg/kg/天的ATO，预防有效量最高为0.15mg/kg/天的ATO，例如0.15、0.10或0.05mg/kg/天的ATO或甚至更低，直至0.01mg/kg/天。
根据特定的实施方式，在1至80天期间，向患者施用每日剂量包含0.01至0.15mg/kg/天的三氧化二砷。
根据另一特定的实施方式，在1至80天期间，向患者施用每日剂量包含0.01至0.05mg/kg/天的三氧化二砷，如果需要，可以重复治疗，以达到令人满意的临床功效的水平。
根据另一特定的实施方式，在1至80天期间，向患者施用每日剂量包含0.05至0.10mg/kg/天的三氧化二砷。
根据另一特定的实施方式，在1至80天期间，向患者施用每日剂量包含0.10至0.15mg/kg/天的三氧化二砷。
根据本发明的另一特定的实施方式，只要患者接受砷化合物，就向他/她施用每日剂量包含0.05μmol/kg至10μmol/kg的Cu2+、优选地0.06μmol/kg至2μmol/kg的Cu2+、例如0.3μmol/kg至1.1μmol/kg的Cu2+。根据特定的实施方式，只要患者接受砷化合物，他/她就每天接受约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10μmol/kg的Cu2+。
例如，Cu2+离子可以以硫酸铜或氯化铜(II)的形式。
如已经提到的，通过相同或不同的施用途径同时或依序向患者施用砷化合物和Cu2+盐。可以每天、每隔一天、每周两次或三次、或甚至每周向患者施用Cu2+盐。
根据特定的实施方式，静脉内施用砷化合物。
根据另一特定的实施方式，经口施用砷化合物。
根据另一特定的实施方式，局部施用砷化合物。
根据另一特定的实施方式，将砷化合物作为气雾剂施用。
根据另一特定的实施方式，砷化合物和Cu2+盐在同一药物组合物中。因此，本发明涉及向受试者施用包含砷化合物和Cu2+盐的药物组合物的方法，该方法包括提供药物组合物、以及向受试者施用药物组合物的步骤。本发明还涉及在有需要的患者中治疗自身免疫性疾病、以及更普遍的炎症性疾病或肿瘤性疾病(如癌症或肿瘤)的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的包含砷化合物和Cu2+盐的药物组合物的步骤。
肿瘤性疾病
本文使用的术语“肿瘤性疾病”是指与相同类型组织中的正常增殖相比，受试者组织中细胞的病理性增殖。肿瘤包括侵袭性或非侵袭性的良性肿瘤和恶性肿瘤(例如，白血病或结肠肿瘤或前列腺癌)。恶性肿瘤与良性肿瘤的区别在于前者示出更大程度的间变、或细胞分化和定向的丧失，并具有侵袭和转移的特性
根据本发明可以治疗的癌症包括实体癌和非实体癌。根据特定的实施方式，癌症是血液恶性肿瘤。根据本发明可以治疗的血液恶性肿瘤的实例包括急性髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、成髓细胞白血病，早幼粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、急性中性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、急性早幼粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、骨髓增生性肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、巨细胞骨髓瘤、惰性骨髓瘤、局限性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、硬化性骨髓瘤、孤立性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤。
在另一实施方式中，血液恶性肿瘤是急性早幼粒细胞白血病(APL)。在一个实施方式中，APL是新诊断的APL。在另一实施方式中，APL是复发性或难治性APL。
根据本发明可以治疗的其他癌症包括但不限于癌(例如，鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌、和肾细胞癌)，特别是膀胱、肠、乳腺、子宫颈、结肠、食管、头、肾、肝、肺、颈、卵巢、胰腺、前列腺和胃的那些癌；良性和恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、周围神经上皮瘤、和滑膜肉瘤；中枢神经系统的肿瘤(例如，胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤、神经节胶质瘤、成神经管细胞瘤、松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤、和神经鞘瘤)；种系肿瘤(例如，肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、和黑色素瘤)；混合型肿瘤，特别是癌肉瘤和霍奇金病；以及混合来源的肿瘤，如肾母细胞瘤和畸胎瘤。
自身免疫性疾病和炎症性疾病
自身免疫性疾病是以产生与来源于患者组织的抗原(称为自身抗原)反应的抗体(称为自身抗体)为特征的免疫系统疾病，或以产生或不产生抗体的免疫细胞(例如细胞毒性细胞)的激活为特征的疾病。
炎症性疾病包括以继发性或原发性或甚至独特(比其他免疫机制更普遍)的炎症过程为特征的大量障碍和病症。
根据本发明可以用砷化合物和金属离子(如Cu2+)的组合进行治疗的自身免疫性疾病和炎症性疾病包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)；急性播散性红斑狼疮；白塞病；幼年型关节炎；菲-勒-赖三氏综合征(Fiessinger-Leroy-Reiter syndrome)；痛风；骨关节病；多发性肌炎；心肌炎；自身免疫性类风湿性关节炎(RA)；系统性血管炎；胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；I型糖尿病；炎症性肠病(IBD)；乳糜泻；自身免疫性甲状腺疾病；干燥综合征；自身免疫性胃炎；溃疡性结肠炎；克罗恩病；自身免疫性肝炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；皮肤自身免疫性疾病；自身免疫性扩张型心肌病；多发性硬化(MS)和其他脱髓鞘疾病；重症肌无力(MG)；血管炎(例如，大动脉炎和韦格纳肉芽肿)；再生障碍性贫血；与非肿瘤淋巴增生相关的任何疾病；B淋巴细胞淋巴瘤；西蒙德综合征(Simmonds'syndrome)；亚急性甲状腺炎和桥本病；艾迪生病；肌肉的自身免疫性疾病，自身免疫性神经肌肉障碍，如强直性脊柱炎、多发性硬化、其多种形式(包括儿科综合征和急性播散性脑炎)；免疫介导的神经病；自身免疫性睾丸疾病、自身免疫性卵巢疾病、自身免疫性葡萄膜炎、格雷夫斯病、银屑病、强直性脊柱炎、艾迪生病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肺病如韦格纳病和许尔许斯特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)；免疫性肺病如哮喘、浸润性肺病、过敏性肺病和结节病；皮肌炎，包括硬皮病和多发性肌炎；以及白癜风。
本发明的产物还可作为预防性或治愈性治疗，用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)。
多发性硬化
已经报告了砷化合物(尤其是三氧化二砷)对多发性硬化的有益作用(US 2018/325944)。因此，多发性硬化和相关的综合征可以根据本发明用砷化合物和金属离子(如Cu2 +)的组合进行治疗。
可以根据本发明治疗的特定疾病是ATO已成功治疗的人类疾病或其动物对应疾病，如急性早幼粒细胞白血病、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性移植物抗宿主病(GvHD)、多发性硬化(MS)、干燥综合征、类风湿性关节炎、克罗恩病、髓细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性胶质瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和肝癌。如上所解释，本发明提供了用于治疗这些疾病时增强砷的作用的手段，从而能够使用较低的ATO每日剂量或用与当前使用的相同剂量获得更好的治疗结果。
在生物测定后的描述过程中，本发明的其他特征也将变得明显，这些生物测定在本发明框架内进行并且为其提供所需的实验支持，而不限制其范围。
实例
没有任何相反指示的情况下，已使用以下材料和方法获得了实例1至9中所示出的实验结果。
a-细胞、动物和化学品
HL60细胞培养物：HL-60细胞系是人高加索早幼粒细胞白血病细胞系(ATCC noCCL-240)。在整个实验过程中维持这个细胞系，通过烧瓶(Falcon 250mL 75cm2，参考：353135)在含有10％胎牛血清(Gibco公司，美国)、1％青霉素-链霉素(Gibco公司，美国)、1％环丙沙星和1％二性霉素B(Gibco公司，美国)的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣屈昂坦法拉维耶(Saint-Quentin Fallavier)，法国)的RPMI 1640+GlutaMax培养基中保持2x105个细胞/ml。
A20细胞培养物：A20细胞系是小鼠细胞系(ATCC编号TIB-208)。在整个实验过程中维持这个细胞系，通过烧瓶(Falcon 250mL 75cm2，参考：353135)在含有10％胎牛血清(Gibco公司，美国)、1％青霉素-链霉素(Gibco公司，美国)、1％环丙沙星、1％二性霉素B(Gibco公司，美国)和1％2-巯基乙醇(Gibco公司，美国)的西格玛奥德里奇公司(圣屈昂坦法拉维耶(Saint-Quentin Fallavier)，法国)的RPMI 1640+GlutaMax培养基中保持2x105个细胞/ml。
动物：八周龄雌性BALB/c和雌性C57Bl6小鼠购自Janvier实验室(勒热内圣里勒(Le Genest-Saint-Isle)，法国)，并通过自由进食和饮水饲养。根据国家指南，对小鼠进行人道护理。将每种类型的小鼠的脾细胞用于淋巴细胞混合培养(模型MLR)。
化学品：
-测试的前五种二价阳离子购自西格玛奥德里奇公司(圣屈昂坦法拉维耶，法国)：CuSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4和HAuCl2(实验室等级)。
-测试的另外三种二价阳离子购自ChemCon公司(弗莱堡(Freiburg)，德国)：CuCl2、MnCl2和ZnCl2(GMP等级)。
-三氧化二砷(Arscimed，质量临床批次，1mg/ml储备溶液)来自梅德塞宁医学公司(MEDSENIC)(斯特拉斯堡(Strasbourg)，法国)。
b-统计学分析
用GraphPad Prism5、使用单因素方差分析和事后(Tukey)分析所有定量数据。认为p值<0.05具有统计学显著性。
c-与或不与二价阳离子一起的As2O3对HL-60培养细胞中H2O2产生和GSH产生的作用
培养条件和治疗条件
将细胞(5x105/孔)接种于96孔圆底平板(Falcon，康宁公司(Corning)，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中于不同实验条件下孵育48小时。平行制备两个平板以分别测量H2O2产生和HL-60细胞活力。
H 2 O 2 产生的测量
48小时后，去除上清液，并向相同治疗条件(培养基、或者与或不与阳离子一起的As2O3)下的细胞中添加50μL/孔的在PBS中的50μg/mL 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(西格玛奥德里奇公司，圣屈昂坦法拉维耶，法国)。
使用融合荧光分光光度计(帕卡德公司(Packard))，通过荧光分光光度法评估H2O2产生。实验初始(T0小时)和孵育6小时后(T6小时)记录荧光强度。2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯的最大荧光激发/发射为485/530nm。
GSH产生的测量
48小时后，去除上清液，并向相同治疗条件(培养基、或者与或不与阳离子一起的As2O3)下的细胞中添加50μL/孔的在PBS中的50μg/mL单氯二胺(西格玛奥德里奇公司，圣屈昂坦法拉维耶，法国)。
使用融合荧光分光光度计(帕卡德公司)，通过荧光分光光度法评估GSH产生。实验初始(T0小时)和孵育6小时后(T6小时)记录荧光强度。单氯二胺的最大荧光激发/发射为380/461nm。
HL-60细胞活力
去除培养基，并在室温下用在PBS中的0.5％结晶紫和30％乙醇将细胞染色30分钟。在PBS中洗涤两次后，将染色的细胞悬浮在甲醇中，并通过融合荧光分光光度计在550nm处测量吸光度(如在等人,Reactive Oxygen Species Controls EndometriosisProgression[活性氧簇控制子宫内膜异位进展]；The American journal of pathology[美国病理学杂志]；2009,175(1):225-34中)。
6小时期间产生的H2O2或GSH的计算：
每种治疗条件下细胞产生的H2O2或GSH计算如下：
T6h时的荧光强度[任意单位]-T0时的荧光强度[任意单位]
由膜完整性活细胞产生的DO
治疗条件和相关实验(2个测试)
-H2O2或GSH产生和细胞存活：As2O3的范围：0.5、1、5和10μM
-H2O2产生：比较与或不与AS2O3(1μM)一起的4个浓度的5种二价阳离子：
ο西格玛公司(Sigma)：
CuSO4：0.5、1、2和4μM
FeSO4：0.5、1、2和4μM
ZnSO4：6、12.5、25和50μM
HAuCl2：0.125、0.25、0.5、1μM
MnSO4：0.125、0.25、0.5、1μM
οChemcon公司：
CuCl2：0.5、1、2和4μM
ZnCl2：6、12.5、25和50μM
MnCl2：125、0.25、0.5、1μM
额外的结果
-H2O2或GSH产生和细胞存活：As2O3浓度范围：0.5、1、5和10μM，CuCl2为1和4μM(1个测试)
-GSH产生和细胞存活：As2O3(1μM)，CuCl2为0.5、1、2和4μM(2个测试)
d-与或不与二价阳离子一起的As2O3对A20培养细胞中H2O2产生和GSH产生的作用
培养条件和治疗条件
将细胞(1x105/孔)接种于96孔圆底平板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中于不同实验条件下孵育48小时。平行制备两个平板以分别测量H2O2产生和A20细胞活力。
H2O2产生、GSH产生和细胞活力使用与如上所述H60细胞相同的方案测量。
治疗条件和相关实验：1个测试H2O2-1个测试GSH
-H2O2或GSH产生和细胞存活：As2O3(1μM)，CuCl2为0.5、1、2和4μM。
e-与或不与二价阳离子一起的As2O3对C57Bl6 CD4 T细胞体外增殖(混合淋巴细胞培养物中的细胞增殖)。
模型基于源自30Gy辐照的雌性C57Bl6小鼠和雌性BALB/C小鼠脾细胞悬浮液的淋巴细胞的混合培养物。将脾细胞机械分离，并通过低渗裂解(ACK-NH4Cl 0.15M+KHCO3 1mM+Na2EDTA 0.1mM)消除红细胞。
使用UptiBlue活细胞计数测定来定量测量体外细胞增殖。将C57Bl6细胞(响应细胞)与经辐照的BALB/C细胞(刺激细胞)以6x105/孔/行接种于96孔圆底平板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中。将混合细胞培养物在不同实验条件下于37℃、5％CO2培养箱中孵育48小时。
48h后，将10μl UptiBlue活细胞计数测定(Interchim公司，参考：UP669413)直接添加到培养基中，在37℃和5％CO2下用UptiBlue孵育24h后，使用荧光分光光度计(融合酶标仪荧光计，帕卡德公司)测量C57细胞增殖。
治疗条件：进行了2个测试(除了ZnCl2和MnCl2以外)
ο西格玛公司(Sigma)：
CuSO4：0.5、1、2和4μM
FeSO4：0.5、1、2和4μM
ZnSO4：6、12.5、25和50μM
HAuCl2：0.125、0.25、0.5、1μM
MnSO4：0.125、0.25、0.5、1μM
οChemcon公司：
CuCl2：0.5、1、2和4μM
ZnCl2：6、12.5、25和50μM
MnCl2：125、0.25、0.5、1μM
实例1：As2O3对HL60细胞的H2O2和GSH的产生以及细胞存活的作用
HL60细胞系是人白血病细胞系。当患者患有白血病时，会经历化疗以消除白血病细胞，然后接受来自健康患者的骨髓移植。在一些情况下，造血干细胞移植诱导慢性移植物抗宿主病(GvHD)。慢性GVHD的一线疗法基于免疫抑制剂(具有或不具有环孢素的皮质类固醇)，在约30％的患者中获得了令人满意的响应。梅德塞宁医学公司(Medsenic)目前正在进行II期研究以评价在标准疗法的基础上添加三氧化二砷是否能有效控制慢性GvHD，并减少皮质类固醇疗法的持续时间。在这项研究中，以0.15mg/kg/天向患者施用三氧化二砷。这项研究的一个方面是观察除了对慢性GvHD的自身免疫特征的作用外，三氧化二砷是否还能够通过涉及细胞上细胞应激的诱导的过程，作用于可能存活的对化疗具有抗性的白血病细胞。
细胞能够通过诱导活性氧簇的产生而对细胞应激产生响应。在这项研究中，研究者观察了在二价阳离子存在下，As化合物/As2O3诱导的细胞应激对过氧化氢(H2O2)产生、谷胱甘肽产生(GSH)、和细胞活力的作用。
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有以下几种浓度的三氧化二砷的完全培养基中孵育48小时：0.1、0.5、1、5和10μM(As2O3)。
As2O3的作用：
图1示出了浓度递增的As2O3对H2O2、GSH产生和细胞活力的作用(4个独立测试)。
在As2O3存在下，H2O2产生不显著，但在5μM时增加(图1A)。
在0.5、1和5μM的As2O3存在下，GSH产生显著增加，但在10μM时消失(图1C)。
在1、5和10μM的As2O3存在下，HL-60细胞活力显著降低(分别为p<0.05、p<0.001和p<0.001；图1B和1D)。
在5和10μM时的细胞死亡解释了在这些As2O3浓度下H2O2和GSH的产生减少的原因。
结论
选择1μM As2O3的剂量来测试As2O3和金属离子的组合对HL60细胞的H2O2产生和细胞存活的作用。
在此浓度下，H2O2产生的生物学作用仍被GSH的产生所补偿，细胞活力得以保留。因此，金属离子可以调节As2O3作用。
实例2：As2O3和金属离子的组合对HL60细胞的H2O2产生和细胞存活的作用
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有1μM三氧化二砷(As2O3)、具有或不具有不同阳离子的完全培养基或在单独的培养基中孵育48小时。呈现的结果来自2个独立实验(除MnCl2和ZnCl2外)，阳离子具有不同的质量水平：实验室等级的CuSO4(0.5、1、2和4μM)、FeSO4(0.5、1、2和4μM)、ZnSO4(6、12.5、25和50μM)、HAuCl2(0.125、0.25、0.5、1μM)、MnSO4(0.125、0.25、0.5、1μM)，和GMP等级的CuCl2(0.5、1、2和4μM)、ZnCl2(6、12.5、25和50μM)、MnCl2(125、0.25、0.5、1μM)。
As2O3和金属离子的组合的作用：
用FeSO4、HAuCl2、ZnSO4、ZnCl2、MnSO4、MnCl2、CuSO4和CuCl2对HL60细胞进行H2O2产生和细胞活力的这些实验的结果分别在图2至9中展示。
图中统计学显著性差异表示如下：
-对照细胞相对于用As2O3治疗的细胞
-对照细胞相对于仅用阳离子治疗的细胞
-用As2O3治疗的细胞相对于用As2O3+阳离子治疗的细胞。
单独的FeSO4仅在4μM(测试1)下、或与As2O3(1μM)一起时在4μM(测试1，p<0.001)以及2和4μM(测试2，分别为p<0.01和0.001)下对H2O2产生具有显著的影响(图2，上分图)。单独的FeSO4以及与As2O3(1μM)一起时对HL60活力无显著影响(图2，下分图)。
单独的HAuCl2对H2O2产生无显著影响；这种影响限于在1μM下与As2O3一起时(p<0.01，测试1)以及在0.5μM下与As2O3一起时(p<0.01，测试2；图3，上分图)。单独的HAuCl2以及与As2O3(1μM)一起时对HL60活力无显著影响(图3，下分图)。
单独的ZnSO4和ZnCl2对H2O2产生无可重现的影响(图4和5，上分图)。与As2O3(1μM)一起时，ZnSO4在12.5、25和50μM时显著增加H2O2产生(p<0.001，仅测试2；图4，右上分图)。与As2O3一起时，ZnSO4和ZnCl2对细胞活力无显著和可重现的影响(图4和5，下分图)。
MnSO4在0.25、0.5和1μM下对H2O2产生具有显著的剂量依赖性影响(测试1和2，图6，上分图)，并且在0.5和1μM下与As2O3一起具有额外的作用(p<0.001；测试1和2；图6，上分图)，甚至在0.25μM下与As2O3一起也具有额外的作用(p<0.001；测试2；图6，左上分图)。与或不与As2O3一起时，MnSO4对细胞活力均无实际影响(图6，下分图)。
与或不与As2O3一起时，MnCl2均对H2O2产生具有剂量依赖性影响，但仅在1μM时增加显著(p<0.001，测试1，图7，上分图)。与或不与As2O3一起时，MnSO4对细胞活力均无实际作用(图7，下分图)。
单独的CuSO4和CuCl2对H2O2产生无显著影响(图8和9，上分图)。在测试2中，CuSO4对H2O2产生的明显作用可以通过异常低的对照值来解释。在所有测试浓度下，CuSO4和CuCl2都增强了As2O3的作用(p<0.001，图8和9，上分图)。与或不与As2O3一起时，CuSO4和CuCl2似乎对细胞活力无实际影响(图8和9，下分图)。
表1总结了获得的HL60中H2O2产生的结果。
表1
注：已经进行了几项测试来检查依次沉积As2O3、随后是金属离子(或相反：金属离子+As2O3)或两种活性成分的混合物的影响。在一系列测试之间未发现显著差异(数据未示出)。
结论
铜离子单独或在As2O3存在下对HL60活力无影响，但以剂量依赖性方式显著增强As2O3对H2O2产生的作用。选择CuCl2作进一步分析是因为其具有(并且可以立即以工业数量获得)GMP质量等级。
实例3：As2O3和CuCl2的组合对HL60细胞的H2O2和GSH的产生以及细胞存活的作用。
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有几种浓度(0.1、0.5、1、5和10μM)的三氧化二砷以及具有或不具有1和4μM的CuCl2的完全培养基中孵育48小时。
As2O3和CuCl2的组合的作用：
1和4μM的CuCl2显著增加所有浓度的As2O3诱导的H2O2产生(图10，左上分图)。
1和4μM的CuCl2主要是在1和5μM的As2O3下减少As2O3诱导的GSH产生(图10，左下分图)。
在As2O3存在下，1和4μM的CuCl2对HL60存活无额外影响也没有保护作用(图10，右分图)。
结论
在1和4μM下与大范围的As2O3浓度一起测试的CuCl2对HL60存活无额外作用也没有保护作用，但对H2O2产生具有额外作用并对GSH产生具有负面作用。
实例4：As2O3和CuCl2的组合对HL60细胞的GSH产生和细胞存活的作用。
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有1μM的三氧化二砷以及具有或不具有0.5、1、2和4μM的CuCl2的完全培养基中孵育48小时。
As2O3(1μM)和CuCl2(0.5、1、2和4μM)的组合的作用
1μM的As2O3显著增加GSH产生。在测试1中，CuCl2减少了As2O3诱导的GSH增加，但这种作用仅在较高浓度下观察到(图11，上分图)。
在4个测试浓度的任一浓度下，单独的CuCl2对GSH产生无显著影响(图11，上分图)。
在4个测试浓度的任一浓度下，CuCl2单独或与As2O3一起时对细胞活力无显著影响(图11，下分图)。
表2显示了对GSH产生的显著结果。
表2
结论
这些结果证实了铜对As2O3诱导的HL60细胞氧化应激的强烈增强作用。
实例5：As2O3和金属离子的组合对混合淋巴细胞反应(MLR)中C57BL6小鼠脾细胞的 增殖的作用
混合淋巴细胞反应(MLR)是发生在两个同种异基因淋巴细胞群(相同物种，但基因不同)之间的离体细胞免疫测定。将两个淋巴细胞群一起孵育，并测量发生的反应。
此处，MLR用作自身免疫反应的模型，其对应于暴露于BalbC小鼠经辐照脾细胞并经其刺激的C57BL6小鼠脾细胞的体外增殖。这种体外技术模拟了同种异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GvHD)中体内发生的淋巴细胞反应。
对与先前经体外辐照(30戈瑞)的BALB/C脾细胞共培养的C57BL6小鼠的脾细胞进行体外细胞增殖测定。
对于增殖测定，将细胞(6x105个细胞/孔/株)接种于96孔板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有1μM三氧化二砷(As2O3)、具有或不具有不同阳离子的完全培养基或在单独的培养基中孵育48小时。呈现的结果来自2个独立实验，阳离子具有不同的质量水平，如上文在关于材料和方法的部分中所述。
对照、FeSO4、HAuCl2、Zn2+盐(ZnSO4和ZnCl2)、Mn2+盐(MnSO4和MnCl2)和Cu2+盐(CuSO4和CuCl2)对脾细胞的这些实验的结果分别展示在图12至17中。图中统计学显著性差异表示如下：
-对照细胞相对于用As2O3治疗的细胞
-对照细胞相对于仅用阳离子治疗的细胞，以及
-用As2O3治疗的细胞相对于用As2O3+阳离子治疗的细胞。
培养条件的验证：图12示出了增殖测量的对照(4个独立测试)：单独的C57BL6小鼠脾细胞和单独的BALB/c小鼠脾细胞不增殖。相比之下，混合细胞示出了与在促分裂原(CD35μg/ml/CD28 2μg/ml)存在下获得的淋巴细胞反应和增殖相当的淋巴细胞反应和增殖。在促分裂原存在下，三氧化二砷(1μM)完全抑制细胞增殖。
注：已经进行了几项测试来检查依次沉积As2O3、随后是金属离子(或相反：金属离子+As2O3)或两种药剂的溶液的作用。在一系列测试之间未发现显著差异(数据未示出)。
As2O3和金属离子的组合的作用
FeSO4单独或与As2O3一起时对细胞增殖无显著影响(图13)。
单独的HAuCl2降低细胞增殖，但与As2O3一起时这种作用限于在1μM下，并且仅在测试1中(p<0.001，图14)。
单独的ZnSO4和ZnCl2降低细胞增殖，但与As2O3一起时这种影响限于在50μM下，并且仅在测试1中(分别为p<0.01和p<0.001，图15)。
单独的MnSO4和MnCl2显著降低细胞增殖，但与As2O3一起时这种影响限于在1μM下，并且仅在测试1中(图16)。
单独的CuSO4和CuCl2显著降低细胞增殖，并且与As2O3一起时这种影响在4μM或2和4μM下是显著的(p<0.001，图17)。
表3显示了对细胞增殖降低的显著结果。
表3
结论
Cu2+是减少混合淋巴细胞反应最高效的金属离子；改变盐的组成(CuSO4或CuCl2)或质量等级对目标作用没有任何影响。
实例6：As2O3和CuCl2的组合对A20细胞的H2O2和GSH的产生以及细胞存活的作用。
A20是源自Balb/C AnN小鼠的自发性网状细胞肿瘤的鼠淋巴瘤细胞系。在这项研究中，在癌细胞的鼠细胞系上对砷进行了测试，以与HL60细胞相同的方式研究其作用。实际上，未来体内模型将是在小鼠中进行的，有必要在体外检查As2O3对这些鼠细胞的作用。
为了诱导细胞应激，将A20细胞(1x105个细胞/孔/株)接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有1μM的三氧化二砷以及具有或不具有4种浓度(0.5、1、2和4μM)的CuCl2的完全培养基中孵育48小时。
图中统计学显著性差异表示如下：
-对照细胞相对于用As2O3治疗的细胞
-对照细胞相对于仅用阳离子治疗的细胞
-用As2O3治疗的细胞相对于用As2O3+阳离子治疗的细胞。
As2O3和CuCl2的组合的作用
1μM的As2O3显著增加H2O2产生并降低A20活力(p<0.001，测试1，图18A)，但在测试2中，As2O3仅显著降低A20活力(p<0.001，图18B)，
在测试的4个浓度中的任一浓度(测试1，p<0.001)和在3个较高浓度(测试2，p<0.001)下，单独的CuCl2增加了H2O2产生。在测试的3个或2个较高浓度下，单独的CuCl2明显增加了A20活力(图18)。
在4个测试浓度的任一个浓度中，CuCl2均增强了As2O3诱导的对H2O2产生的作用(测试1和2，图18，左分图)。在As2O3存在下，CuCl2在较高浓度下轻微但显著增加了A20活力(测试1：2和4μM以及试验2：4μM；图18，右分图)。
1μM的As2O3显著增加GSH产生，显著降低A20细胞活力(p<0.001，测试1，图19)。
在2和4μM下，单独的CuCl2显著降低了GSH产生并增加了A20细胞活力(测试1；图19)。在As2O3存在下，CuCl2在较高浓度下显著降低砷诱导的GSH产生，仅在4μM下增加A20细胞活力(测试1；图19)。
表4和表5显示了H2O2和GSH的产生以及A20活力的显著结果。
表4
表5
结论
在As2O3存在下，CuCl2显著增加H2O2产生并降低GSH产生，对A20细胞存活无任何显著影响。
实例7：AsI3对HL60细胞的H2O2和GSH的产生以及细胞存活的作用
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有以下几种浓度的AsI3的完全培养基中孵育48小时：0.1、0.5、1、5和10μM。
AsI3对HL60细胞的作用：
图20至23示出了浓度递增的AsI3对H2O2和GSH的产生、以及细胞活力的作用(1个测试)。
在所有测试浓度下，AsI3均显著降低了H2O2产生(p<0.001，图20A)。
在0.1、1和5μM下，AsI3显著增加GSH产生(分别为p<0.01、p<0.001和p<0.001，图20B)。
在10μM下，AsI3显著降低了HL60细胞活力(p<0.001，图20C)。
结论
选择1μM的AsI3剂量来测试与CuCl2的组合对H2O2产生和HL60存活的作用。
实例8：AsI3和CuCl2的组合对HL60细胞的H2O2产生和细胞存活的作用
为了诱导细胞应激，将HL60细胞(5x105个细胞/孔/株)接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中在具有或不具有1μM的AsI3以及具有或不具有0.5、1、2和4μM的CuCl2的完全培养基中孵育48小时。
AsI3和CuCl2的组合的作用：
1μM的AsI3对H2O2产生和细胞存活无作用(图21)。
无论测试浓度如何，CuCl2均显著增强了AsI3(1μM)对H2O2产生的作用(图21，左分图)。在AsI3存在下，CuCl2对细胞存活无影响(图21，右分图)。
结论：
在AsI3(1μM)存在下，CuCl2对H2O2产生已经具有显著的增强作用，尽管其似乎低于在As2O3存在下测量的结果。
实例9：AsI3对混合淋巴细胞反应(MLR)期间C57Bl6脾细胞的增殖特性的作用
对与先前经辐照(30戈瑞)的BALB/C小鼠的所谓“刺激”脾细胞共培养的C57BL6小鼠的脾细胞进行体外细胞增殖测定。
对于增殖测试，将细胞(6x105个细胞/孔/株)接种于96孔板(Falcon，康宁公司，参考：353077)中，在完全培养基中孵育48小时，该完全培养基补充有或未补充在促分裂原存在下的1μM三氧化二砷(As2O3)或1μM三碘化砷(AsI3)、或浓度递增的铜(从0.5至4μM的CuCl2)。
用10％UptiBlue(20μL，在200μL的培养基中)孵育细胞24小时后，通过荧光分光光度计测定法确定细胞增殖。
在促分裂原存在下，1μM的三氧化二砷(As2O3)或1μM的三碘化砷(AsI3)对细胞增殖的影响结果展示在图22中。AsI3仅在测试2中具有显著活性(图22和23，右分图)。
CuCl2与或多或少的三碘化砷(AsI3)对脾细胞的这些实验的结果展示在图23中。
在AsI3存在下，CuCl2在1、2和4μM(测试1)下以及在4μM(测试2)下显著降低了C57BL6脾细胞的增殖。
结论：
AsI3是有活性的，但略低于As2O3，并且与CuCl2的协同似乎降低，可能表明重要特征是As离子的浓度。
实例10：As2O3和CuCl2在移植物抗宿主病(GvHD)的小鼠模型中的作用
然后在慢性硬皮病移植物抗宿主病的完善的鼠模型(Arsenic TrioxidePrevents Murine Sclerodermatous Graft-versus-Host Disease[三氧化二砷预防鼠硬皮病移植物抗宿主病],Kavian等人,2012)中评价三氧化二砷(As2O3)和铜分子(CuCl2)的结合。在这个模型中，将来自呈现出自低免疫相容性的小鼠(雄性B10.D2小鼠-H-2b)的骨髓(1x106个细胞)和脾细胞(2x106个细胞)移植至先前用Gammacel来源的7.5戈瑞亚致死辐照的小鼠(雌性BALB/c小鼠-H-2d)中。
移植后7天，小鼠接受与或不与氯化铜(“铜”)结合的三氧化二砷的腹腔内注射，每周5次，持续5周。进行辐照对照组以验证辐照功效，验证受体小鼠的移植是否成功。同基因小鼠组用相同遗传背景的小鼠的脾细胞和骨髓进行移植。这个对照组不应发展出慢性GvHD。每周进行一次临床评估，对体征如毛发脱落、体重减轻、腹泻、血管炎进行评分，以允许评价疾病的进展。
表6：实验组，具有供体和受体小鼠品系以及每组的小鼠数目
初始方案：5周后，应将小鼠安乐死，以评价铜与三氧化二砷的结合对受慢性GvHD影响的器官(皮肤、肺、肝脏……)的影响。
方案调整：铜治疗组中的小鼠大量死亡后，在第4天结束时停止注射。在第8天(下一周)以不同的速率恢复治疗，直至5周的治疗结束。然后对接受铜的小鼠每周只注射两次铜而不是5次，而用单独的砷或与铜组合的砷治疗的小鼠仍然每周接受5次ATO注射。在这些新的治疗条件下，没有更多的铜治疗的小鼠死亡。
由于小鼠的数目大大减少，我们决定仅采集小鼠的血液以进行转氨酶测试，但未获取器官。这些实验示出了，需要减少铜以消除其对小鼠的毒性作用，至少经由腹腔内途径施用药物时需减少铜。
表7：与初始小鼠数目相比，实验结束时活小鼠的数目
这个实验的结果在下表8和图24至27中示出。
表8：实验(毛发脱落)结果
尽管每组的小鼠数目不足以进行显著性统计，但我们仍可观察到接受As2O3 2.5μg/g和CuCl2(2.5或10μg/g)组合治疗的小鼠均未发生毛发脱落，这优于仅接受As2O3 2.5μg/g(33％毛发脱落)的小鼠，甚至优于接受As2O3 5μg/g(20％毛发脱落)的小鼠(图24)。这证实了当与铜共同施用时，砷的作用增强。
关于小鼠的体重，在治疗结束时，组间无明显差异，即使同基因小鼠组小鼠的体重似乎高于其他组的小鼠(图25)。
与同基因小鼠组的小鼠相比，同种异基因小鼠组的小鼠示出了耳部厚度增加(血管炎)。我们还观察到，在同种异基因小鼠组+As2O3 2.5μg/g中，血管炎发生率降低，在同种异基因小鼠组+5μg/g中，血管炎发生率更低，达到与同基因小鼠组的相同的值。(图26)
关于动物的肝脏平衡，所得的血清转氨酶结果不一致。这可能是由于我们反复在腹腔内注射三氧化二砷和铜导致的毒性变化，根据每次注射的特定部位不同，肝脏暴露于不同的剂量，因此产生的有害影响也不同(图27)。
实例11：As2O3和CuCl2在移植物抗宿主病(GvHD)的小鼠模型中的作用(CuCl2的剂 量较低)
根据这些结果，我们决定进行铜细胞毒性评估。为此，我们对一系列新BALB/c小鼠注射较低剂量的铜(0.2和0.5μg/g)，每周5次，持续5周。我们每天观察小鼠，监测其体重并跟踪其存活率，以评价铜毒性。
5周后，小鼠无死亡，接受PBS的对照组与接受0.2和0.5μg/g铜的组具有类似的平均重量。因此，选择0.5μg/g的剂量用于一组新实验，使用与实例10中所述相同的方案，条件如下表9所述。
表9：实验组，具有供体和受体小鼠品系以及每组的小鼠数目
遗憾的是，由于2020年3月11日COVID-19危机导致实验室关闭，这一系列的实验中断了。实验室重新开放后将重新启动这些实验。

Claims (10)

1.一种组合物在制备药物中的用途，所述组合物包含砷化合物和Cu2+离子，其中所述药物用于治疗选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病和各种形式的多发性硬化(MS)以及相关的综合征组成的组的疾病，其中该砷化合物选自由以下组成的组：As2O3、AsI3、As2O5、As4O6、As2S2、As2S3、As2S5、As4S4以及它们的混合物。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述砷化合物是三氧化二砷或三碘化砷。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述药物经配制以使得每日剂量包含0.01至0.10mg/kg/天的三氧化二砷。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述Cu2+离子呈盐的形式，所述盐选自由硫酸铜和氯化铜(II)组成的组。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制成每日剂量包含0.05μmol/kg至10μmol/kg的Cu2+的形式。
6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗选自由以下组成的组的疾病：系统性红斑狼疮(SLE)；急性播散性红斑狼疮；白塞病；幼年型关节炎；菲-勒-赖三氏综合征(Fiessinger-Leroy-Reiter syndrome)；痛风；骨关节病；多发性肌炎；心肌炎；自身免疫性类风湿性关节炎(RA)；系统性血管炎；胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；I型糖尿病；炎症性肠病(IBD)；乳糜泻；自身免疫性甲状腺疾病；氏综合征；自身免疫性胃炎；溃疡性结肠炎；克罗恩病；自身免疫性肝炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；皮肤自身免疫性疾病；自身免疫性扩张型心肌病；各种形式的多发性硬化(MS)和其他脱髓鞘疾病；干燥综合征；重症肌无力(MG)；血管炎；大动脉炎；韦格纳肉芽肿；再生障碍性贫血；与非肿瘤淋巴增生相关的任何疾病；B淋巴细胞淋巴瘤；西蒙德综合征(Simmonds'syndrome)；亚急性甲状腺炎和桥本病；Addison氏病；肌肉的自身免疫性疾病，自身免疫性神经肌肉障碍，如强直性脊柱炎、多发性硬化、其多种形式包括儿科综合征和急性播散性脑炎；免疫介导的神经病；自身免疫性睾丸疾病、自身免疫性卵巢疾病、自身免疫性葡萄膜炎、格雷夫斯病、银屑病、强直性脊柱炎、艾迪生病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肺病如韦格纳病和许尔许斯特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)；免疫性肺病如哮喘、浸润性肺病、过敏性肺病和结节病；皮肌炎，包括硬皮病和多发性肌炎；以及白癜风。
7.Cu2+盐和砷化合物相组合在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病和各种形式的多发性硬化(MS)以及相关的综合征组成的组的疾病，其中所述砷化合物选自由以下组成的组：As2O3、AsI3、As2O5、As4O6、As2S2、As2S3、As2S5、As4S4以及它们的混合物。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述砷化合物是三氧化二砷或三碘化砷。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述Cu2+盐是硫酸铜或氯化铜(II)。
10.如权利要求7至9中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗选自由以下组成的组的疾病：系统性红斑狼疮(SLE)；急性播散性红斑狼疮；白塞病；幼年型关节炎；菲-勒-赖三氏综合征(Fiessinger-Leroy-Reiter syndrome)；痛风；骨关节病；多发性肌炎；心肌炎；自身免疫性类风湿性关节炎(RA)；系统性血管炎；胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；I型糖尿病；炎症性肠病(IBD)；乳糜泻；自身免疫性甲状腺疾病；氏综合征；自身免疫性胃炎；溃疡性结肠炎；克罗恩病；自身免疫性肝炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；皮肤自身免疫性疾病；自身免疫性扩张型心肌病；各种形式的多发性硬化(MS)和其他脱髓鞘疾病；干燥综合征；重症肌无力(MG)；血管炎；大动脉炎；韦格纳肉芽肿；再生障碍性贫血；与非肿瘤淋巴增生相关的任何疾病；B淋巴细胞淋巴瘤；西蒙德综合征(Simmonds'syndrome)；亚急性甲状腺炎和桥本病；Addison氏病；肌肉的自身免疫性疾病，自身免疫性神经肌肉障碍，如强直性脊柱炎、多发性硬化、其多种形式包括儿科综合征和急性播散性脑炎；免疫介导的神经病；自身免疫性睾丸疾病、自身免疫性卵巢疾病、自身免疫性葡萄膜炎、格雷夫斯病、银屑病、强直性脊柱炎、艾迪生病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肺病如韦格纳病和许尔许斯特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)；免疫性肺病如哮喘、浸润性肺病、过敏性肺病和结节病；皮肌炎，包括硬皮病和多发性肌炎；以及白癜风。
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