CN117070402A - 一种诱导cd176抗体产生的细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱导CD176抗体产生的细菌及其应用，其16S rRNA序列与克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏种16S rRNA序列至少有97％的一致性，能表达CD176抗原并可免疫诱导产生CD176抗体，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.27474。该细菌可作为抗原用于制备CD176抗体，具有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导CD176抗体产生的细菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
CD176糖抗原(也名Thomsen-Friedenreich antigen，TF；Galb1-3GalNAca1-R)是一种多糖结构。研究表明，CD176是一种恶性肿瘤相关糖抗原，表达于多种恶性肿瘤细胞表面，如乳房癌、肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤、白血病等。CD176抗原和抗体在肿瘤基础研究和临床实践方面有实际应用。但化学合成和生物提取CD176糖抗原，技术要求高，生产成本高和产量少，价格很昂贵。
一些特殊变异细菌具有某些特定的多糖大分子结构，这些大分子结构与人和动物的某些多糖大分子结构相似或相同，并且这些特定细菌多糖大分子有抗原性，其作为抗原能诱导人和动物产生相应免疫反应，如抗体产生。例如，某些细菌表面具有人类血型抗原A，这些携带血型抗原A的细菌存在人肠道或感染人体，可诱导人体产生抗血型抗原A的抗体；某些细菌表面具有人类血型抗原B，这些携带血型抗原B的细菌存在人肠道或感染人体，可诱导人体产生抗血型抗原B的抗体。少数特殊变异细菌表面具有CD176糖抗原，这些携带CD176抗原的细菌，可诱导人体和动物产生CD176抗体。如果获得具有或能产生CD176糖抗原的特殊细菌，作为CD176抗原，可用于制备CD176抗体，用于肿瘤的研究、诊断和治疗等，将有广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种诱导CD176抗体产生的细菌及应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种细菌，其16S rRNA序列与克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏种16S rRNA序列至少有97％的一致性，能表达CD176抗原并可免疫诱导产生CD176抗体。
作为进一步改进的，所述细菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.27474。
一种细菌成分，其为上述的细菌的全细菌、细菌裂解液、裂解后沉淀物、培养后的培养基中的一种或多种。
一种组合物，包括上述的细菌成分。
一种CD176抗体的制备方法，用上述的细菌或上述的细菌成分中的一种或多种免疫实验动物，诱导产生CD176抗体。
一种CD176抗体，采用上述的方法制备的CD176抗体。
一种CD176抗原制备方法，培养上述的细菌，从所述的细菌、细菌的裂解液、裂解后沉淀物、培养后的培养基中提取CD176抗原。
一种CD176抗原，采用上述的方法制备的CD176抗原。
本发明的有益效果是：
本发明的细菌能反复传代培养40代以上，仍能稳定高表达CD176抗原，该抗原可免疫诱导产生CD176抗体，可用于制备CD176抗体，用于肿瘤的研究、诊断和治疗，在广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1提供的细菌株JH013的菌落形态图。
图2是本发明实施例1提供的菌株JH013反复传代培养40代后CD176抗原表达情况。其中，P2-P40，表示传代培养代数。对照组为不加第一抗体的空白对照，E coli(标准大肠杆菌细菌株)为不表达CD176抗原的细菌株的实验结果。
图3是本发明实施例2提供的细菌株JH013的16S rRNA基因序列BLAST比对结果(部分)。
图4是本发明实施例3提供的细菌株JH013的随机扩增多态性DNA指纹图谱。其中，泳道M代表DNA Mark(标记物)；泳道1：细菌株JH013。
图5是本发明实施例6提供的注射热灭活菌JH013后小鼠体重变化趋势图。注：1-5，实验小鼠编号。
图6是本发明实施例6提供的口服热灭活菌JH013后小鼠体重变化趋势图。注：1-4，实验小鼠编号。
图7是本发明实施例6提供的无细菌处理小鼠体重变化趋势图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种细菌，其16S rRNA序列与克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏种16S rRNA序列至少有97％的一致性，能表达CD176抗原并可免疫诱导产生CD176抗体。
作为进一步改进的，所述细菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.27474。该菌分离于自健康成人皮肤。
本发明实施例提供一种细菌成分，其为上述的细菌的全细菌、细菌裂解液、裂解后沉淀物、培养后的培养基中的一种或多种。这些细菌成分中均含有CD176抗原，也可以用于免疫诱导产生CD176抗体。所述全细菌包括上述细菌的活细菌或/和灭活细菌。所述灭活细菌为上述细菌经常规的灭活方法灭活得到。
本发明实施例提供一种组合物，包括上述的细菌成分。该组合物中的细菌成分含有CD176抗原，能诱导产生CD176抗体，具有广阔的用途。
本发明实施例提供一种CD176抗体的制备方法，用上述的细菌或上述的细菌成分中的一种或多种免疫实验动物，诱导产生CD176抗体。
本发明实施例提供一种CD176抗体，采用上述的方法制备的CD176抗体。
本发明实施例提供一种CD176抗原制备方法，培养上述的细菌，从所述的细菌、细菌的裂解液、裂解后沉淀物、培养后的培养基中提取CD176抗原。
本发明实施例提供一种CD176抗原，采用上述的方法制备的CD176抗原。
一种鉴定上述细菌的方法，选取3组引物，进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳成像分析，如果得到独特且具专一性的随机扩增多态性DNA指纹图谱(DNA指纹图)，即为所述细菌。
作为进一步改进的，所述3组引物分别为：Rep1R-I序列(SEQ ID NO:4)，Rep2R-I序列(SEQ ID NO:5)；ERIC1序列(SEQ ID NO:6)，ERIC2序列(SEQ ID NO:7)；BOXA1R序列(SEQID NO:8)。
实施例1
1、细菌株JH013分离、纯化、鉴定
1)细菌株分离和纯化
细菌株JH013分离自健康成人皮肤，分离细菌在固态肉膏蛋白胨培养基(固态LB培养基)纯化为单克隆菌株。单克隆细菌株在液体肉膏蛋白胨培养基(液体LB培养基)扩增培养。
1)细菌用4％甲醛固定，细胞-酶联免疫吸附测定法(Cell enzyme-linkedimmunosorbent assay，Cell-ELISA)检测全细菌表达CD176抗原情况。
2)单克隆细菌株在液体LB培养基扩增培养，用细菌裂解液裂解细菌成分，固相酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细菌裂解液的CD176抗原表达情况。
细胞-酶联免疫吸附测定法和固相酶联免疫吸附测定法使用的生物试剂包括:抗CD176单克隆抗体(克隆株A78-G/A7，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA),过氧化氢酶标记的羊抗小鼠IgM(EMD Millipore Corporation，Temecula，CA，USA)；过氧化氢酶标记的花生凝聚素(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)。结果见表1。通过以上2个实验检测，证实所选择菌株JH013表达CD176抗原。
表1.CD176抗原在JH013细菌和对照细菌表达情况
注：+++，酶联免疫吸附测定法检测CD176抗原，光密度(OD)值>0.2；+,OD值0.05—0.1；-,OD值<0.05。
2)细菌株JH013菌落特征
如图1A所示，细菌株JH013在固态肉膏蛋白胨培养基培养18小时后，呈现圆形微凸、呈白色或淡黄色，菌落直径在1-3毫米。
如图1B所示，细菌株JH013在麦康凯培养基培养18小时后，呈现圆形微凸、呈红或粉红色，菌落直径在1-3毫米。
3)细菌株JH013显微镜下形态
JH013细菌涂片，进行革兰氏染色，在显微镜下观察，为革兰氏阴性杆菌，呈现典型的杆状。
4)细菌株JH013生物化学鉴定
培养的JH013细菌用肠道杆菌生物化学鉴定试剂盒进行鉴定，其结果如表2所示。
表2.细菌株JH013生物化学鉴定结果
| 测定反应底物 | 结果(+为阳性，-为阴性) |
| 靛基质 | - |
| 柠檬酸盐 | + |
| MR(甲基红) | + |
| VP | - |
由表2可知，菌株JH013在葡萄糖蛋白胨水培养基中培养后，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下，加入甲基红指示剂溶液呈现红色。菌株JH013能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，可以在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性，从而使培养基有淡绿色变为深蓝色。菌株JH013在靛基质(吲哚)试验和VP试验中没引起现象变化，因此生物化学鉴定不能分解蛋白质中的色氨酸，且不是产气菌。
5)细菌株JH013稳定表达CD176抗原鉴定
对高表达CD176抗原细菌株JH013进行反复传代培养，每10代用革兰氏染色检测菌株JH013的形态，并用细胞-酶联免疫吸附测定法检测细菌表达CD176抗原情况。如图2所示，反复传代培养40代，菌株JH013仍能稳定高表达CD176抗原。细胞-酶联免疫吸附测定法是半定量实验，不同批次实验光密度(OD)值有一定误差，为减少实验误差对最终结果的影响，进行半定量检测时，每组实验重复3次，取平均值。尽管半定量分析时不同批次实验光密度(OD)值有一定误差，但在定性分析时3次重复实验均表现相同的阳性(JH013)和阴性(E.coli，阴性对照)结果。对照组为不加第一抗体的空白对照。
6)细菌株JH013各组成成分CD176抗原比较
单克隆细菌株JH013在液体LB培养基扩增培养，获取完整全细菌，取部分完整细菌用细菌裂解液裂解，取细菌裂解后裂解液(离心后的上清液)、细菌裂解后沉淀(离心后沉淀)，取细菌培养后培养基(离心弃细菌后取上清培养液)。用细胞-酶联免疫吸附测定法和固相酶联免疫吸附测定法检测细菌株JH013各组成成分CD176抗原表达情况。用不表达CD176细菌株(大肠杆菌)的完整全细菌、细菌裂解后裂解液、细菌裂解后沉淀、细菌培养后培养基和细菌培养前培养基作为阴性对照。细胞-酶联免疫吸附测定法和固相酶联免疫吸附测定法使用的生物试剂包括:抗CD176抗原的单克隆抗体(克隆株A78-G/A7，Santa CruzBiotechnology，Inc.Santa Cruz，CA，USA),过氧化氢酶标记的羊抗小鼠IgM(EMDMillipore Corporation，Temecula，CA，USA)，过氧化氢酶标记的花生凝聚素(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)。实验结果见表3。
表3.CD176抗原在JH013细菌各组分对比情况
注：+++酶联免疫吸附测定法检测CD176抗原，光密度(OD)值>0.2；++,OD值0.1—0.2；+,OD值0.05—0.1；(-),OD值0.04—0.05。
结果表明：完整全细菌、细菌裂解后裂解液、细菌裂解后沉淀物和细菌培养后培养基中含有CD176抗原。完整全细菌包括细菌所有组成成分，具体地包括细菌细胞质、细胞壁、细胞膜、菌毛、鞭毛、脂多糖(LPS)等；细菌裂解后裂解液中包括细菌蛋白质和多肽、多糖、糖蛋白、细菌代谢物等；细菌裂解后沉淀包括细菌大部分组成成分，具体包括细胞壁、细胞膜、菌毛、鞭毛、脂多糖(LPS)等；细菌培养后培养基包括细菌胞外囊泡、细菌相关外泌体、细菌代谢物等，即这些成分都可能含有CD176抗原。
实施例2
1、细菌株JH013分子生物学鉴定
菌株JH013接种于固态LB培养基上，37℃培养10-30小时。取单一菌接种于液体LB培养基中，37℃培养10-30小时。提取培养细菌的脱氧核糖核酸(DNA)，用聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rRNA基因。PCR引物序列：正向引物27F序列：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3’(SEQ ID NO:1)；反向引物1492R序列：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’(SEQ IDNO:2)。PCR产物进行核苷酸序列测定，核苷酸序列如下：
CAAGGCCGGAATCCCAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCTATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCATCGACGAGTTATTAAACCTTTATCGCTTCCTCCCCCGCTGAAGTGCTTTACAACCCGAAGCTTCTTCACACACGCGCATGCTGCATCAGCTGCGCCCATGTGCAATATCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGAGTCTGGACCGTGTCCTCAGTTCCAGTGGTGCCTGG(SEQ ID NO:3)。
该细菌16S rRNA基序列测定结果在NCBI(美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库)进行BLAST比对(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。结果表明，细菌株JH013系统分类为：细菌界；变形菌门；变形菌纲；肠杆菌目；肠杆菌科；克雷伯氏菌属；肺炎克雷伯氏种(Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacterales；Enterobacteriaceae；Klebsiella；Klebsiella pneumoniae)，见图3。
2、细菌株JH013全基因组测序分析
菌株JH013接种于固态LB培养基上，37℃培养10-30小时。取单一菌接种于液体LB培养基中，37℃培养10-30小时。用细菌DNA提取试剂盒，提取培养细菌基因组DNA。细菌基因组DNA经凝胶电泳成像检测，质量和数量达到要求的细菌基因组DNA，送第三方进行全基因组测序分析。细菌株JH013全基因组测序结果经过系统分析，并与国际公认权威DNA库数据比对。
1)细菌株JH013全基因组测序分析确定JH013菌株种系。经过细菌株JH013全基因组测序平均核酸相似度分析，细菌株JH013系统分类为：肺炎克雷伯氏种(Klebsiellapneumoniae)，见表4。
表4.细菌株JH013全基因组测序平均核酸相似度分析结果统计
注：Reference ID：参考基因组编号；Mapped_fragment：同源片段个数；Query_fragment：比对片段总数；ANI：ANI值。
2)细菌株JH013全基因组测序结果进行致病毒力因子和耐药性相关基因分析。致病毒力因子检测用VFDB数据库(http：//www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)，比对后检测出其包含26种，共459个致病因子，24个致病岛，2505个与毒力因子相关的基因。耐药基因检测用CARD数据库(https：//card.mcmaster.ca/)，通过该数据库的注释，发现有耐药性相关基因，确定耐药性相关基因的名称，并获得所耐受的抗生素种类等信息。
实施例3
建立细菌株JH013随机扩增多态性DNA指纹图谱(randomly amplifiedpolymorphic DNA fingerprinting，RAPD fingerprinting)
细菌DNA指纹图谱是利用特定的引物，随机扩增细菌基因组非编码区重复序列的多态性DNA(这些序列在进化过程中高度保守)，得到不同的DNA片段，扩增产物经凝胶电泳后获得多条DNA条带，这些条带构成有特征信息的多态性图谱(类似条形码图谱)。特定细菌株表现特定凝胶电泳成像图谱，即DNA指纹图谱。分析特定细菌株的DNA指纹图谱，可建立一种识别和鉴定特定细菌株的方法。本发明实施例用3个PCR检测方法，建立细菌株JH013的DNA指纹图谱。
(1)REP(Repetitive sequence，重复序列)-PCR指纹图谱分析技术。该方法根据细菌的38bp重复的基因外回文结构元件设计引物。设计的扩增引物为：Rep1R-I序列：5’-IIIICG ICG ICA TCI GGC-3’(SEQ ID NO:4)；Rep2R-I序列：5’-ICG ICT TAT CIG GCCTAC-3’(SEQ ID NO:5)。REP-PCR反应条件为：94℃预变性7分钟；94℃变性1分钟，40℃退火1分钟，72℃延伸5分钟，35个循环；最后72℃末端延伸15分钟。
(2)ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，肠杆菌基因间重复一致序列)-PCR指纹图谱分析技术。根据126bp肠杆菌非编码区域重复性基因间共有序列设计引物。设计的扩增引物为：ERIC1序列：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’(SEQID NO:6)；ERIC2序列：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’(SEQ ID NO:7)。ERIC-PCR反应条件为：94℃预变性7分钟；94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸5分钟，35个循环；最后72℃末端延伸15分钟。
(3)BOX-PCR指纹图谱分析技术。根据BOX插入因子(大小为154bp，由保守性不同的box A(57bp)、box B(43bp)和boxC(50bp)等亚单位组成)设计引物，BOX-PCR只需要一条单引物就能够完成大量菌株DNA多态性分析。设计引物为：BOXA1R序列：5’-CTA CGG CAA GGCGAC GCT GAC G-3’(SEQ ID NO:8)。BOX-PCR反应条件为：94℃预变性7分钟；94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸5分钟，35个循环；最后72℃末端延伸15分钟。
菌株JH013接种于固态LB培养基上，37℃培养18小时。取单一菌接种于液体培养基中，37℃培养18小时。提取培养细菌的脱氧核糖核酸(DNA)，用上述3组引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳成像分析，可以得到独特且具专一性的DNA片段，即JH013菌株特有片段，获得细菌株JH013特有DNA指纹图。
结果参见图4。REP-PCR结果，在1000～2500bp之间有JH013特有条带图谱出现；ERIC-PCR结果，在250～1000bp之间有JH013特有条带图谱；BOX-PCR结果，在250～1000bp之间有JH013特有条带图谱。
将该菌株JH013保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27474，保藏日期为2023年06月07日，分类命名：肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae。
实施例4
热灭活细菌JH013注射免疫
1)热灭活菌JH013制备
细菌JH013经37℃摇床过夜培养后，沸水中隔水煮沸20分钟后离心(转速8000，15分钟)获取热灭活菌株。比浊法进行细菌定量。
2)热灭活菌JH013注射免疫小鼠
准备5只昆明小鼠，雌性，大小15-20g。腹腔注射热灭活细菌JH013，每周一次，连续注射三周，每只每次菌量为1×1011cfu。第三次免疫后1周，尾巴取血，制备血清。以后每10至14天尾巴取血，制备血清。第三次免疫后6周，麻醉后心脏取血，制备血清。通过酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清CD176抗体水平。使用的生物试剂包括:Asialoglycophorin(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)，TFa-PAA(GlycoNZ，Auckland，New Zealand)，唾液酸酶处理人O型血红细胞蛋白裂解液，过氧化氢酶标记的羊抗小鼠IgM(m-chain specific，EMDMillipore Corporation，Temecula，CA，USA)，过氧化氢酶标记的羊抗小鼠IgG(g-chainspecific，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)。结果参见表5，可以看到小鼠经过三次注射免疫高表达CD176细菌珠JH013后成功诱导机体产生CD176抗体。
表5.热灭活菌JH013注射免疫小鼠后CD176抗体表达情况
注：血清样本分别采集于首次注射前(第1天)、连续三次注射后第8天、18天、32天、43天。计算相对CD176抗体水平，并确定每个时间点相对于免疫前CD176抗体水平值的变化百分比。增幅在10％到30％之间用(+)表示，在30％到50％之间用(++)表示，超过50％用(+++)表示。变化百分比值低于10％被认为是阴性(-)，没有实验结果用(n)表示。
实施例5
热灭活细菌JH013口服免疫
1)热灭活菌JH013制备
细菌JH013经37℃摇床过夜培养后，沸水中隔水煮沸20分钟后离心(转速8000，15分钟)获取热灭活菌株。比浊法进行细菌定量。
2)口服热灭活细菌JH013免疫小鼠
准备4只昆明小鼠，雌性，体重15-20g。按成年小鼠每天每只食4克小鼠饲料计算，每4克小鼠饲料加入1×1013cfu灭活细菌作为特殊喂养饲料，连续喂养10周(70天)。喂养后每2周尾巴取血制备血清，通过固相酶联免疫吸附测定法(ELISA)实验检测小鼠CD176抗体水平，方法及使用试剂同实施例4。结果参见表6。由表6可知，可以得出口服热灭活的菌JH013可以诱导小鼠机体产生CD176抗体，明显的提高了机体CD176抗体的表达水平。
表6.热灭活菌JH013口服免疫小鼠后CD176抗体表达情况
注：血清样本分别采集于首次喂养前(第1天)、第一次摄入后14天、28天、42天、56天、70天。计算相对CD176抗体水平，并确定每个时间点相对于免疫前CD176抗体水平值的变化百分比。增幅在10％到30％之间用(+)表示，在30％到50％之间用(++)表示，超过50％用(+++)表示。变化百分比值低于10％被认为是阴性(-)。
实施例6
注射和口服热灭活细菌JH013的初步安全评价实验：
1.注射热灭活菌JH013小鼠
取5只昆明小鼠，雌性，体重15-20g。腹腔注射热灭活细菌JH013，每周一次，连续注射三周，每只每次菌量为1×1011cfu。每天观察注射小鼠的精神状态、饮食、毛发及大小便，发现注射的小鼠除部分腹部注射位置有轻微炎症外，其余的全正常。每隔2-3天称量小鼠体重，每次注射后小鼠体重有轻微下滑外，其余小鼠的体重一切正常。见图5。最后一次注射灭活细菌JH013后第43天解剖小鼠，取小鼠重要脏器，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、大肠、小肠、脑以及卵巢，对各脏器经初步观察，无病理性改变。小鼠重要脏器HE染色切片病理检测，各器官脏器也一切正常。尽管细菌株JH013是条件致病菌肺炎克雷伯氏，但腹腔注射的热灭活细菌JH013(死细菌)对实验小鼠无感染和致病作用。
2.口服热灭活菌JH013小鼠
取4只昆明小鼠，雌性，体重15-20g，每只每天口服1×1013cfu热灭活细菌JH013。每天观察口服免疫小鼠的精神状态、饮食、毛发及大小便。发现口服热灭活菌JH013的小鼠，其状态不受影响，一切正常。每隔2-3天称量小鼠体重，小鼠的体重一切正常。在实验后期，小鼠进入成年和老年期(鼠龄230天以后)，不同个体小鼠，体重有不同程度波动。见图6。从开始口服灭活菌JH013后第220天至290天分别解剖小鼠，解剖小鼠各脏器经初步观察，无病理性改变。小鼠重要脏器HE染色切片病理检测，各器官脏器也一切正常。肺炎克雷伯氏菌是人类肠道正常细菌群之一，大约10％健康人群肠道和皮肤有这细菌。肺炎克雷伯氏菌是条件致病菌，在特殊情况下在肠道外可导致感染。尽管细菌株JH013是条件致病菌肺炎克雷伯氏菌，含有一般的肺炎克雷伯氏致病因子，但口服热灭活细菌JH013(死细菌)对实验小鼠无损伤，是完全安全的。
3.无细菌处理对照小鼠
取2只昆明小鼠，雌性，体重15-20g，不做任何处理(不注射和口服细菌)作为空白对照。与细菌处理小鼠相同，每天观察口服免疫小鼠的精神状态、饮食、毛发及大小便。其生长一切正常。每隔2-3天称量小鼠体重，小鼠的体重一切正常。见图7。在实验开始后第220天至290天天分别解剖小鼠，对各脏器经初步观察，无病理性改变。小鼠重要脏器HE染色病理检测各器官脏器也一切正常。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种细菌，其特征在于，其16S rRNA序列与克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏种16S rRNA序列至少有97％的一致性，能表达CD176抗原并可免疫诱导产生CD176抗体。
2.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.27474。
3.一种细菌成分，其特征在于，其为权利要求1或2所述的细菌的全细菌、细菌裂解液、裂解后沉淀物、培养后的培养基中的一种或多种。
4.一种组合物，其特征在于，包括权利要求3所述的细菌成分。
5.一种CD176抗体的制备方法，其特征在于，用权利要求1或2所述的细菌、或权利要求3所述的细菌成分中的一种或多种免疫实验动物，诱导产生CD176抗体。
6.一种CD176抗体，其特征在于，采用权利要求5所述的方法制备的CD176抗体。
7.一种CD176抗原制备方法，其特征在于，培养权利要求1或2所述的细菌，从所述的全细菌、细菌的裂解液、裂解后沉淀物或培养后的培养基中提取CD176抗原。
8.一种CD176抗原，其特征在于，采用权利要求7所述的方法制备的CD176抗原。
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| CN202310882868.8A CN117070402A (zh) | 2023-07-18 | 2023-07-18 | 一种诱导cd176抗体产生的细菌及其应用 |
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