CN117070338A - 气动控制的镶嵌琼脂糖-pdms-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种气动控制的镶嵌琼脂糖‑PDMS‑玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，包括芯片以及与芯片配合使用实现自动化气动控制的实验系统。本发明通过在玻璃上打孔并镶嵌琼脂糖，辅之以PDMS气动控制层，结合多层复合芯片的键合技术制作了一种气动控制的镶嵌琼脂糖‑PDMS‑玻璃复合微流控微生物培养芯片，适应于对高通量复杂通道的微流控芯片进行精确控制的微生物培养，同时具有牢固键合、芯片强度高的优势。另外，该芯片通过配合自动化气动控制系统，能够通过电脑编程对镶嵌琼脂糖液路层中的特定流体通路进行开关，有计划地控制在高通量复杂微流控芯片上进行大规模互不干扰差异性实验，实现自动化多方案组合给药和微生物培养的功能。
Description
技术领域
本发明涉及微流控器件设计，具体涉及一种自动化气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统及其使用方法。
背景技术
复杂通道的微流控芯片具有广泛的应用背景，包括生物医学和分析化学领域的药物筛选、液体混合、结晶实验以及细胞培养等多种用途。合适的微流控芯片制作技术能够开发高效的微流控芯片，仅仅利用少量反应物就能进行高通量的生物化学实验。
目前，微流控芯片已经能够广泛应用于细菌、真菌或者细胞等微生物培养生命科学实验。然而，这种实验目前也存在一些技术难点。常用的玻璃、PMMA或者聚二甲基硅氧烷(PDMS)等制作成的微流控器件具有良好的键合强度，能够进行复杂通道的流体流动实验。但是，这种材质对于微生物培养却存在难以附着、营养物质配置困难等缺点，尤其是在不断流动的环境中进行实验时极容易造成对微生物的生存环境的破坏。琼脂培养基作为生物医学中常用的微生物培养基材料，能够在细菌、真菌等微生物的培养过程中，提供细胞生长所需的营养物质，让微生物在其中生长繁殖。琼脂糖凝胶制作成的能够用于微生物或者细胞培养的生物芯片，能够快速捕获、固定和培养微生物。但是，纯琼脂糖凝胶芯片具有芯片强度低、不易键合等缺点，琼脂糖凝胶无法保证复杂稳定的微流道结构，流体其中的扩散无法进行精确控制，而且琼脂糖凝胶与玻璃和PDMS无法高强度键合。另外，微生物培养需要的时间长，现有的技术往往需要一次又一次地单次改变量的迭代对比实验，通过自动化控制进行高通量大规模的差异化多方案实验是本领域的迫切需求和技术难点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种自动化气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统。自动化精确操控在复杂通道内进行长周期的微生物培养是生化工程中的迫切需求，然而现有的琼脂糖芯片存在键合不牢固、药物自动扩散、不易控制等缺点，而纯PDMS或者玻璃芯片又无法进行长周期的微生物培养。本发明通过在玻璃片上打孔并镶嵌琼脂糖，同时配合以高效牢固的微流控芯片键合技术，并通过气动控制层和弹性薄膜，对镶嵌琼脂糖液路层中的特定流体通路进行开关，进而实现自动化控制多方案组合微生物培养的功能。本发明设计镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片，能够根据预设的多种液体培养微生物的方案，精确控制实现大规模的不同液体依赖性微生物培养实验。提供了一种能够在复杂流动微通道条件下进行微生物培养的复合芯片，该芯片兼具了PDMS、玻璃等传统微流控芯片化学性能稳定、通道结构稳定以及键合强度高的优势和琼脂糖对于微生物培养的独特优势。另外，该芯片通过配合使用实现自动化气动控制的实验系统，实现自动化控制高通量复杂通道微流控芯片内的多方案组合给药和微生物培养的功能。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
根据本说明书的第一方面，提供一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，包括镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片，以及与所述芯片配合使用实现自动化气动控制的实验系统；
所述镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片自上而下包括气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层和底板层；所述气动控制层、弹性薄膜与镶嵌琼脂糖液路层内反应室具有匹配关系；所述气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层之间通过等离子处理法进行键合；所述镶嵌琼脂糖液路层和底板层通过贴合对齐法进行键合；所述气动控制层、弹性薄膜和底板层为PDMS材质；
所述实验系统包括显微镜、高速摄像机、电脑、微流体注射泵、阀门控制器、气动控制阀、空气压缩机以及相关的管路和接口，通过编程控制进行有计划地调整气动控制层开关阀，能够实现自动化控制的多方案组合微生物培养实验；
所述镶嵌琼脂糖液路层作为所设计复杂流动通道微流控芯片的载体，控制流体的流动方式，该层通过在玻璃片的上表面刻蚀非贯穿的微流体通道作为液路，在微生物培养反应室部分进行激光贯穿打孔以及镶嵌琼脂糖制成，反应室呈圆形，排布呈现密布的阵列结构，镶嵌琼脂糖液路层上反应室位置不相切或者重叠，对应镶嵌琼脂糖液路层的打孔位置不相切或者重叠，且不同反应室之间保留0.1mm以上的间距供气路设计，并且能保证流动过程中相邻孔之间不会发生液体扩散；
所述气动控制层为互不连通的多气路结构，每条气路包括入口、开关阀和气路连通通道，气路入口在反应室阵列之外，每条气路通过气路连通通道连接一个或多个开关阀，气路连通通道为宽度小于1mm的矩形截面直通道或折线形通道，开关阀布置于密布的反应室阵列结构之上，并且每个开关阀与镶嵌琼脂糖液路层中的微生物培养反应室位置相匹配；气路连通通道在反应室阵列外的结构呈现放射状，不同气路结构的长度不同以保证气路入口错落分布互不干扰；当每条气路布置一个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的直通道，当气路连通通道连接多个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的折线通道，在反应室阵列内同一条气路上的开关阀连成一条直线，其中的多条气路开关阀直线相互平行且开关阀数量相等，这样布置能够形成定量对比；气动控制层开关阀呈圆形或者方形但是面积要等于或略大于微生物培养反应室，开关阀必须全部覆盖微生物培养反应室；
所述气动控制层和镶嵌琼脂糖液路层之间通过弹性薄膜进行连接，所述弹性薄膜能够根据气动控制层注入/吸出气体产生的正负压而对相应的开关阀进行关闭/开启，气动控制阀的关闭/开启决定镶嵌琼脂糖微生物培养反应室与液路结构的连通性；
所述底板层用于承载芯片并且在镶嵌琼脂糖液路层的玻璃片层和底板层之间涂覆微生物，还可以涂覆对微生物起增强或抑制作用的培养物；
所述实验系统的连接方式为：镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的镶嵌琼脂糖液路层入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与电脑(含有编程控制软件)连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和电脑(含有图像采集软件)。
进一步地，在镶嵌琼脂糖液路层上设计复杂微流体通道用于高通量流体输送，尤其适合于高通量多反应室联合培养的微生物培养芯片，该通道结构需要包括通道入口、通道出口和用于微生物培养的反应室，该层基质材质使用玻璃片，在用于微生物培养反应室的对应位置对玻璃片贯穿打孔，并且孔径与反应室直径相等或者略小于反应室直径，其他微流体通道部分采用激光法或者化学溶蚀法刻蚀而成，但不贯穿玻璃片。
进一步地，所述镶嵌琼脂糖液路层的微生物培养反应室的对应位置对玻璃片贯穿打孔后，贯穿孔内镶嵌琼脂糖水凝胶，其他微流体通道部分不添加琼脂糖水凝胶。
进一步地，所述底板层是一层均匀干净的PDMS薄平板，不布置任何流动通道，将需要培养的微生物涂覆于镶嵌琼脂糖液路层的没有刻蚀微流体通道的玻璃片下表面，底板层轻轻贴合于其上。
进一步地，所述气动控制层与镶嵌琼脂糖液路层之前紧密贴合弹性薄膜，表面不设置任何通道。
进一步地，所述气动控制层、弹性薄膜与镶嵌琼脂糖液路层牢固键合，所述底板层轻轻贴于镶嵌琼脂糖液路层。
进一步地，所述微流体注射泵、阀门控制器与电脑(含有编程控制软件)相连，所述显微镜分别与高速摄像机和电脑(含有图像采集软件)相连，两者配合能够实现自动化实时控制以及实验数据的实时采集。
进一步地，定时相继开启和关闭其中多条与镶嵌琼脂糖液路层相匹配的气动控制层开关阀，能够实现部分同样数量的反应室在不同给药环境中的对比实验。
根据本说明书的第二方面，提供一种镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的制作方法，包括以下步骤：
(1)设计能够用于流体混合或药物筛选等的复杂微流体通道结构，镶嵌琼脂糖液路层上需要布置有能够进行微生物培养的反应室，在用于微生物培养反应室的对应位置对玻璃片进行激光贯穿打孔，并且孔径与反应室直径相等或者略小于反应室直径，其他微流体通道部分采用激光法或者化学溶蚀法刻蚀而成，但不贯穿玻璃片；利用软光刻法制备气动控制层，通过PDMS浇筑、加热、倒模和凝固等步骤制作PDMS气路连通通道，利用旋涂法制备PDMS弹性薄膜；在镶嵌琼脂糖液路层和气动控制层的无流体通道对应位置添加键合对齐标记便于反应室和贯穿孔对齐；
(2)称取琼脂糖，再加入蒸馏水，加热溶解，配制成质量分数1％琼脂糖凝胶；将打孔完成的玻璃片放置于干净培养皿中并倒入溶解后的琼脂糖，轻轻震荡使气泡排净；将培养皿放置在室温下自然冷却，等琼脂糖凝固后，用手术刀将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖同时切下取出(注意此时不要将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖分离)；选用薄刀片沿玻璃片与贴合于其上的琼脂糖凝胶交界处切入，将琼脂糖凝胶与玻璃片分开，与此同时，孔内的琼脂糖即镶嵌于玻璃片内；
(3)将制作完成的气动控制层打孔并进行等离子处理后与弹性薄膜键合，再将键合后的两层再次进行等离子处理并且与镶嵌琼脂糖液路层对齐键合；由于键合时PDMS接触位置是玻璃片表面，因此PDMS与镶嵌琼脂糖液路层玻璃片能够牢固键合；
(4)将需要培养的微生物涂覆于镶嵌琼脂糖液路层玻璃片层未与PDMS键合的一面，将PDMS底板层轻轻贴合于其上，气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片制作完成。
根据本说明书的第三方面，提供一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统的使用方法，包括以下步骤：
(1)将制作好的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与电脑(含有编程控制软件)连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和电脑(含有图像采集软件)；
(2)连接完成后，依次开启空气压缩机、阀门控制器、高速摄影机、电脑编程控制软件、电脑图像采集软件，并对芯片位置进行校准；
(3)在电脑编程控制软件中设定每个气动阀门开启的顺序和开启/关闭的时间；
(4)开启微流体注射泵，设定合适的流速进行给药对微生物进行培养；
(5)开启电脑图像采集软件对培养过程的图像进行实时采集；
(6)实验结束，依次关闭电脑软件、高速摄影机、阀门控制器和空气压缩机。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1.本发明提供了一种自动化气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片，能够在高通量复杂流动微通道中进行大规模互不干扰差异性实验条件下的自动化控制微生物培养；
2.本发明通过在玻璃片内镶嵌琼脂糖，能够在复杂微通道结构下对微生物培养的位置进行精确控制、快速捕获固定和培养微生物；
3.本发明通过采用PDMS、玻璃片、琼脂糖三种材料制成复合芯片，能够有效发挥三种材料各自的优势，具有较高的化学稳定性和流体控制能力的同时，具有良好的微生物培养能力；
4.本发明结构中利用激光打孔技术，对玻璃片进行打孔并镶嵌琼脂糖，其余未打孔的部分还是保持了玻璃的表面性质，键合过程中能够与等离子处理后的PDMS通道部分进行大面积接触并高强度键合，保证了芯片的强度和牢固性，克服了琼脂糖材质与玻璃和PDMS无法高强度键合的缺点；
5.本发明通过在微生物培养反应室的位置进行精确开孔镶嵌琼脂糖，能够精确地控制流体中的溶质投放，巧妙利用了琼脂糖的扩散性和玻璃的隔离性；
6.本发明通过设计特定匹配方式的气动控制层和镶嵌琼脂糖液路层，通过有计划地调整气动控制层开关阀与镶嵌琼脂糖液路层内反应室的匹配关系，便于开展并精确控制大规模的差异化微量实验，同时能够连接阀门和控制器进行程序化控制作业；
7.本发明利用镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合材质芯片，能够进行互不影响的大规模集成微生物培养实验，在高通量的细胞培养和药物筛选等实际应用中具有显著优势；
8.本发明通过配合自动化气动控制系统，能够通过电脑编程对镶嵌琼脂糖液路层中的特定流体通路进行开关，实现自动化控制高通量复杂通道微流控芯片内的多方案组合给药和微生物培养的功能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片结构示意图；
图2为本发明实施例提供的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片反应室局部结构示意图；
图3为本发明实施例提供的镶嵌琼脂糖反应室气动控制示意图；
图4为本发明实施例提供的四边形阵列气动控制层结构与镶嵌琼脂糖反应室匹配示意图；
图5为本发明实施例提供的六边形阵列气动控制层结构与镶嵌琼脂糖反应室匹配示意图；
图6为本发明实施例提供的气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片制备示意图；
图7为本发明实施例提供的与芯片配合使用实现自动化气动控制的实验系统结构图；
图8为本发明实施例提供气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片气动控制示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。显然，所描述的实施方式仅仅是本申请一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本申请中的实施方式，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本申请保护的范围。
图1所示的是一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片实施例结构示意图。该实施例中，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片自上而下包括气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层和底板层。所述气动控制层、弹性薄膜与镶嵌琼脂糖液路层内反应室具有匹配关系；所述气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层之间通过等离子处理法进行键合；所述镶嵌琼脂糖液路层和底板层通过贴合对齐法进行键合；所述气动控制层、弹性薄膜和底板层为PDMS材质。
所述镶嵌琼脂糖液路层作为所设计复杂流动通道微流控芯片的载体，控制流体的流动方式，该层通过在玻璃片的上表面刻蚀非贯穿的微流体通道作为液路，在微生物培养反应室部分进行激光贯穿打孔以及镶嵌琼脂糖制成，反应室呈圆形，排布呈现密布的阵列结构，镶嵌琼脂糖液路层上反应室位置不相切或者重叠，对应镶嵌琼脂糖液路层的打孔位置不相切或者重叠，且不同反应室之间保留0.1mm以上的间距供气路设计，并且能保证流动过程中相邻孔之间不会发生液体扩散。
所述气动控制层为互不连通的多气路结构，每条气路包括入口、开关阀和气路连通通道，气路入口在反应室阵列之外，每条气路通过气路连通通道连接一个或多个开关阀，气路连通通道为宽度小于1mm的矩形截面直通道或折线形通道，开关阀布置于密布的反应室阵列结构之上，并且每个开关阀与镶嵌琼脂糖液路层中的微生物培养反应室位置相匹配；气路连通通道在反应室阵列外的结构呈现放射状，不同气路结构的长度不同以保证气路入口错落分布互不干扰；当每条气路布置一个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的直通道，当气路连通通道连接多个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的折线通道，在反应室阵列内同一条气路上的开关阀连成一条直线，其中的多条气路开关阀直线相互平行且开关阀数量相等，这样布置能够形成定量对比；气动控制层开关阀呈圆形或者方形但是面积要等于或略大于微生物培养反应室，开关阀必须全部覆盖微生物培养反应室。
所述气动控制层和镶嵌琼脂糖液路层之间通过弹性薄膜进行连接，所述弹性薄膜能够根据气动控制层注入/吸出气体产生的正负压而对相应的开关阀进行关闭/开启，气动控制阀的关闭/开启决定镶嵌琼脂糖微生物培养反应室与液路结构的连通性。
所述底板层用于承载芯片并且在镶嵌琼脂糖液路层的玻璃片层和底板层之间涂覆微生物，还可以涂覆对微生物起增强或抑制作用的培养物。
图2所示的是镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片反应室局部结构示意图，图3所示的是镶嵌琼脂糖反应室气动控制示意图，通过气动控制阀的开关控制弹性薄膜的弹起/压下，进而控制对镶嵌琼脂糖反应室内微生物的给药与否，开启的时候能够进行有效给药，且配合琼脂糖的渗吸功能，能够维持较长时间的稳定培养。
图4所示的是一种四边形阵列气动控制层结构与镶嵌琼脂糖反应室匹配示意图，气路入口在反应室阵列之外，每条气路通过气路连通通道连接一个开关阀，气路连通通道为宽度小于1mm的矩形截面直通道，开关阀布置于密布的反应室阵列结构之上，并且每个开关阀与镶嵌琼脂糖液路层中的微生物培养反应室位置相匹配。气路连通通道在反应室阵列外的结构呈现放射状。每条气路布置一个开关阀，气路连通通道为截面为四边形的直通道。图5所示的是一种六边形阵列气动控制层结构与镶嵌琼脂糖反应室匹配示意图，气路入口在反应室阵列之外，每条气路通过气路连通通道连接多个开关阀，气路连通通道为宽度小于1mm的矩形截面折线形通道，开关阀布置于密布的反应室阵列结构之上，并且每个开关阀与镶嵌琼脂糖液路层中的微生物培养反应室位置相匹配。气路连通通道在反应室阵列外的结构呈现放射状，不同气路结构的长度不同以保证气路入口错落分布互不干扰。气路连通通道连接多个开关阀，在反应室阵列内同一条气路上的开关阀连成一条直线，其中的多条气路开关阀直线相互平行且开关阀数量相等，这样布置能够形成定量对比。相继开启/关闭其中两条与镶嵌琼脂糖反应室相匹配的气动控制层开关阀，能够实现同样数量的反应室在多个给定环境中的对比实验，通过有计划地编程控制调整气动控制层开关阀，该气动控制结构能够实现多方案组合自动化微生物培养实验的有益效果。
图6所示的是一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片制备示意图。将打孔完成的玻璃片放置于干净培养皿中并倒入溶解后的琼脂糖，轻轻震荡使气泡排净；将培养皿放置在室温下自然冷却，等琼脂糖凝固后，用手术刀将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖同时切下取出(注意此时不要将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖分离)；选用薄刀片沿玻璃片与贴合于其上的琼脂糖凝胶交界处切入，将琼脂糖凝胶与玻璃片分开，与此同时，孔内的琼脂糖即镶嵌于玻璃片内。
图7所示的是与气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片配合使用实现自动化气动控制的实验系统结构图。该实验系统包括显微镜、高速摄像机、电脑、微流体注射泵、阀门控制器、气动控制阀、空气压缩机以及相关的管路和接口，通过编程控制进行有计划地调整气动控制层开关阀，能够实现自动化控制的多方案组合微生物培养实验；实验系统的连接方式为：镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的镶嵌琼脂糖液路层入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与电脑(含有编程控制软件)连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和电脑(含有图像采集软件)。
图8所示的是一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片实施例气动控制示意图。根据预设的方案，通过气动控制层和弹性薄膜，对镶嵌琼脂糖液路层中的特定流体通路进行开关，进而实现控制多方案组合微生物培养的功能，能够精确控制实现大规模的不同液体依赖性微生物培养实验。
在一个实施例中，提供一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的制作方法，包括以下步骤：
(1)设计能够用于流体混合或药物筛选等的复杂微流体通道结构，镶嵌琼脂糖液路层上需要布置有能够进行微生物培养的反应室，在用于微生物培养反应室的对应位置对玻璃片进行激光贯穿打孔，并且孔径与反应室直径相等或者略小于反应室直径，其他微流体通道部分采用激光法或者化学溶蚀法刻蚀而成，但不贯穿玻璃片；利用软光刻法制备气动控制层，通过PDMS浇筑、加热、倒模和凝固等步骤制作PDMS气路连通通道，利用旋涂法制备PDMS弹性薄膜；在镶嵌琼脂糖液路层和气动控制层的无流体通道对应位置添加键合对齐标记便于反应室和贯穿孔对齐；
(2)称取琼脂糖，再加入蒸馏水，加热溶解，配制成质量分数1％琼脂糖凝胶；将打孔完成的玻璃片放置于干净培养皿中并倒入溶解后的琼脂糖，轻轻震荡使气泡排净；将培养皿放置在室温下自然冷却，等琼脂糖凝固后，用手术刀将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖同时切下取出(注意此时不要将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖分离)；选用薄刀片沿玻璃片与贴合于其上的琼脂糖凝胶交界处切入，将琼脂糖凝胶与玻璃片分开，与此同时，孔内的琼脂糖即镶嵌于玻璃片内；
(3)将制作完成的气动控制层打孔并进行等离子处理后与弹性薄膜键合，再将键合后的两层再次进行等离子处理并且与镶嵌琼脂糖液路层对齐键合；由于键合时PDMS接触位置是玻璃片表面，因此PDMS与镶嵌琼脂糖液路层玻璃片能够牢固键合；
(4)将需要培养的微生物涂覆于镶嵌琼脂糖液路层玻璃片层未与PDMS键合的一面，将PDMS底板层轻轻贴合于其上，气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片制作完成。
在一个实施例中，提供一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统的使用方法，包括以下步骤：
(1)将制作好的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与电脑(含有编程控制软件)连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和电脑(含有图像采集软件)；
(2)连接完成后，依次开启空气压缩机、阀门控制器、高速摄影机、电脑编程控制软件、电脑图像采集软件，并对芯片位置进行校准；
(3)在电脑编程控制软件中设定每个气动阀门开启的顺序和开启/关闭的时间；
(4)开启微流体注射泵，设定合适的流速进行给药对微生物进行培养；
(5)开启电脑图像采集软件对培养过程的图像进行实时采集；
(6)实验结束，依次关闭电脑软件、高速摄影机、阀门控制器和空气压缩机。
以上详细描述了本发明的基本原理、主要特征和有益效果，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用来限制本发明，凡在不脱离本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于，包括镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片，以及与所述芯片配合使用实现自动化气动控制的实验系统；
所述镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片自上而下包括气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层和底板层；所述气动控制层、弹性薄膜与镶嵌琼脂糖液路层内反应室具有匹配关系；所述气动控制层、弹性薄膜、镶嵌琼脂糖液路层之间通过等离子处理法进行键合；所述镶嵌琼脂糖液路层和底板层通过贴合对齐法进行键合；所述气动控制层、弹性薄膜和底板层为PDMS材质；
所述实验系统包括显微镜、高速摄像机、电脑、微流体注射泵、阀门控制器、气动控制阀和空气压缩机，通过有计划地调整气动控制层开关阀，能够实现自动化控制的多方案组合微生物培养实验；
所述镶嵌琼脂糖液路层控制流体的流动方式，该层通过在玻璃片的上表面刻蚀非贯穿的微流体通道作为液路，在微生物培养反应室部分进行激光贯穿打孔以及镶嵌琼脂糖制成，反应室呈圆形，排布呈现密布的阵列结构，镶嵌琼脂糖液路层上反应室位置不相切或者重叠，对应镶嵌琼脂糖液路层的打孔位置不相切或者重叠，且不同反应室之间保留0.1mm以上的间距供气路设计，并且能保证流动过程中相邻孔之间不会发生液体扩散；
所述气动控制层为互不连通的多气路结构，每条气路包括入口、开关阀和气路连通通道，气路入口在反应室阵列之外，每条气路通过气路连通通道连接一个或多个开关阀，气路连通通道为宽度小于1mm的矩形截面直通道或折线形通道，开关阀布置于密布的反应室阵列结构之上，并且每个开关阀与镶嵌琼脂糖液路层中的微生物培养反应室位置相匹配；气路连通通道在反应室阵列外的结构呈现放射状，不同气路结构的长度不同以保证气路入口错落分布互不干扰；当每条气路布置一个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的直通道，当气路连通通道连接多个开关阀时，气路连通通道为截面为四边形的折线通道，在反应室阵列内同一条气路上的开关阀连成一条直线，其中的多条气路开关阀直线相互平行且开关阀数量相等，这样布置能够形成定量对比；控制层开关阀呈圆形或者方形但是面积要等于或略大于微生物培养反应室，开关阀必须全部覆盖微生物培养反应室；
所述气动控制层和镶嵌琼脂糖液路层之间通过弹性薄膜进行连接，所述弹性薄膜能够根据气动控制层注入/吸出气体产生的正负压而对相应的开关阀进行关闭/开启，气动控制阀的关闭/开启决定镶嵌琼脂糖微生物培养反应室与液路结构的连通性；
所述底板层用于承载芯片并且在镶嵌琼脂糖液路层的玻璃片层和底板层之间涂覆微生物；
所述实验系统的连接方式为：镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的镶嵌琼脂糖液路层入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与电脑连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和电脑。
2.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：在镶嵌琼脂糖液路层上设计复杂微流体通道用于高通量流体输送，该通道结构需要包括通道入口、通道出口和用于微生物培养的反应室，该层基质材质使用玻璃片，在用于微生物培养反应室的对应位置对玻璃片贯穿打孔，并且孔径与反应室直径相等或者略小于反应室直径，其他微流体通道部分采用激光法或者化学溶蚀法刻蚀而成，但不贯穿玻璃片。
3.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：所述镶嵌琼脂糖液路层的微生物培养反应室的对应位置对玻璃片贯穿打孔后，贯穿孔内镶嵌琼脂糖水凝胶，其他微流体通道部分不添加琼脂糖水凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：所述底板层是一层均匀干净的PDMS薄平板，不布置任何流动通道，将需要培养的微生物涂覆于镶嵌琼脂糖液路层的没有刻蚀微流体通道的玻璃片下表面，底板层轻轻贴合于其上。
5.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：所述气动控制层与镶嵌琼脂糖液路层之前紧密贴合弹性薄膜，表面不设置任何通道。
6.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：所述气动控制层、弹性薄膜与镶嵌琼脂糖液路层牢固键合，所述底板层轻轻贴于镶嵌琼脂糖液路层。
7.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：所述微流体注射泵、阀门控制器与含有编程控制软件的电脑相连，所述显微镜分别与高速摄像机和含有图像采集软件的电脑相连，两者配合能够实现自动化实时控制以及实验数据的实时采集。
8.根据权利要求1所述的一种气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统，其特征在于：定时相继开启和关闭其中多条与镶嵌琼脂糖液路层相匹配的气动控制层开关阀，能够实现部分同样数量的反应室在不同给药环境中的对比实验。
9.一种权利要求1-8中任一项所述的芯片系统中镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计能够用于流体混合或药物筛选等的复杂微流体通道结构，镶嵌琼脂糖液路层上需要布置有能够进行微生物培养的反应室，在用于微生物培养反应室的对应位置对玻璃片进行激光贯穿打孔，并且孔径与反应室直径相等或者略小于反应室直径，其他微流体通道部分采用激光法或者化学溶蚀法刻蚀而成，但不贯穿玻璃片；利用软光刻法制备气动控制层，通过PDMS浇筑、加热、倒模和凝固等步骤制作PDMS气路连通通道，利用旋涂法制备PDMS弹性薄膜；在镶嵌琼脂糖液路层和气动控制层的无流体通道对应位置添加键合对齐标记便于反应室和贯穿孔对齐；
(2)称取琼脂糖，再加入蒸馏水，加热溶解，配制成质量分数1％琼脂糖凝胶；将打孔完成的玻璃片放置于干净培养皿中并倒入溶解后的琼脂糖，轻轻震荡使气泡排净；将培养皿放置在室温下自然冷却，等琼脂糖凝固后，用手术刀将玻璃片与贴合在其上的琼脂糖同时切下取出；选用薄刀片沿玻璃片与贴合于其上的琼脂糖凝胶交界处切入，将琼脂糖凝胶与玻璃片分开，与此同时，孔内的琼脂糖即镶嵌于玻璃片内；
(3)将制作完成的气动控制层打孔并进行等离子处理后与弹性薄膜键合，再将键合后的两层再次进行等离子处理并且与镶嵌琼脂糖液路层对齐键合；
(4)将需要培养的微生物涂覆于镶嵌琼脂糖液路层玻璃片层未与PDMS键合的一面，将PDMS底板层轻轻贴合于其上，气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片制作完成。
10.一种权利要求1-8中任一项所述的气动控制的镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片入口通过四氟毛细管连接微流体注射泵，出口通过四氟毛细管连接废液池，气动控制层通过四氟管依次连接气动阀、阀门控制器、空气压缩机，同时阀门控制器与含有编程控制软件的电脑连接，镶嵌琼脂糖-PDMS-玻璃复合微流控微生物培养芯片放置于显微镜载物台上提供观察和数据采集，显微镜连接高速摄像机和含有图像采集软件的电脑；
(2)连接完成后，依次开启空气压缩机、阀门控制器、高速摄影机、电脑编程控制软件、电脑图像采集软件，并对芯片位置进行校准；
(3)在电脑编程控制软件中设定每个气动阀门开启的顺序和开启/关闭的时间；
(4)开启微流体注射泵，设定合适的流速进行给药对微生物进行培养；
(5)开启电脑图像采集软件对培养过程的图像进行实时采集；
(6)实验结束，依次关闭电脑软件、高速摄影机、阀门控制器和空气压缩机。
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