CN117069857B - 猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猫NT‑proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，包括：特异性识别和结合猫NT‑proBNP蛋白的第一功能域，VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2和3所示，VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、5和6所示；特异性识别和结合猫NT‑proBNP蛋白的第二功能域。本发明还公开了猫NT‑proBNP蛋白的双特异性抗体于制备猫心源性呼吸困难、心脏病早期的辅助诊断、心脏损伤程度评估及预后评估药物或试剂盒中的用途。本发明能够快速动态监测猫血浆NT‑proBNP浓度，对猫心脏病尽早诊断和治疗具有重要指示意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学相关技术领域。更具体地说，本发明涉及猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体及其用途。
背景技术
心脏病是宠物最常见的疾病之一，据报道，猫的心脏病患病率很高，约10-15％的宠物会患有不同程度的心脏病。猫可能因充血性心力衰竭(CHF)以及动脉血栓栓塞和猝死而出现严重的呼吸困难。猫的CHF的诊断特别具有挑战性，不仅因为猫呼吸窘迫的脆弱性限制了诊断评估，而且因为猫的体格检查和影像学表现往往是非特异性的。多达40％的CHF的猫在最初的呼吸窘迫检查时可能没有心脏杂音。此外，在患有CHF的猫中，肺水肿、左心房扩大和肺静脉扩张的影像学证据是出了名的可变的，进一步使诊断更加复杂。肥厚性心肌病(HCM)是猫最常见的心脏病，这种心肌病的特征是左心室肥大。其中如折耳猫、波斯猫，缅因猫，布偶猫，伯曼猫，美国短毛猫，喜马拉雅猫，暹罗猫，斯芬克斯猫，缅甸猫，科尼斯雷克斯猫等品种为先天性心脏病高发品种。在猫中最常见的表现是猝死或晕厥，一旦被确诊患有HCM的猫，大多数都会死于CHF、猝死或ATE。有较小一部分猫处于HCM的亚临床状态。许多受影响的猫的心脏病仍处于临床前症状，当临床医生偶然发现杂音、疾驰音或心律失常时，可能会怀疑患有心脏病。
NT-proBNP(N-terminal pro-brain natriuretic peptide)脑利尿钠肽，也称为B型利尿钠肽，是由心室中的心肌细胞所分泌的蛋白质激素。当心室血流压力增加、心室扩张、心肌肥厚或是心肌承受的压力增加时，猫NT-proBNP的前身preproBNP(由106个氨基酸组成)会由心肌细胞分泌至血中。在分泌过程中，此蛋白质会被裂解为具有生理活性的BNP(第72到106个氨基酸)和N端片段NT-proBNP(第1到第71个氨基酸)。就存在血液中的时间而言，BNP因为具有调节体内生理平衡的功能，其存在血液中的浓度需要被紧密控制，因此被身体代谢的速度较快，因为NT-proBNP在血液中相对稳定，因此在采血并加入抗凝血剂(EDTA或肝素)之后，全血可于室温储存8小时，血清则可于室温储存3天，或者在4℃环境下储存6天，都还在可以检验的时间限制内，对于送检程序而言可说是相当方便。因此在临床检测上，NT-proBNP相对于BNP而言会是较好的生物指标物。
血液样本中的心脏生物标志物可以作为临床评估的一部分进行测量，特别是在没有超声心电图的情况下。近年来NT-proBNP在兽医学上被当作是诊断心脏衰竭一个新的重要指标，也受到医师及心脏学家的高度重视。在一项旨在调查不同严重程度HCM猫的NT-proBNP浓度的研究中，品种对NT-proBNP浓度没有影响。NT-proBNP运用在猫等陪伴动物的诊断方面，主要也是用在心脏相关疾病与肺部疾病的鉴别与早期诊断上。也有研究结果显示，在评估猫肾衰竭病的心血管疾病及其预后时，猫NT-proBNP也能作为可供参考的生物指标。
在健康的猫血液中，NT-proBNP的浓度通常低于100pmol/L。然而，浓度在介于100到270pmol/L的范围之间，表示猫只有可能罹患心脏疾病但还没有出现临床病征。当猫只血液中的NT-proBNP浓度超过270pmol/L时，则往往会出现与心脏疾病相关的临床症状，极有可能出现心脏相关疾病。但须注意的是，因为猫NT-proBNP是由肾脏排出体外，当猫罹患肾脏相关疾病时，体内的猫NT-proBNP浓度也会因此升高而在检验上出现假阳性。
随着宠物老龄化，心脏生物标志物应被视为与其他任何生物标志物一样重要，例如肾和肝生物标志物。临床上，NT-proBNP检测项目稳定性高，容易被测定，同时其特异性高，可准确反映心肌功能，而大多数都生物标志物仅指示心肌细胞完整性，例如肌钙蛋白和CK-MB。与其他传统感染指标如PCT、CRP、IL-6、白细胞数量等相比，猫NT-proBNP的感染变化出现早，灵敏度、特异性、阳性和阴性检出率等综合指征显著优于其他感染指标。
在判别猫肺部疾病与心脏衰竭的诊断上，在外观病征、超音波扫描或X光检验皆无法提供足够判断信息的时候，NT-proBNP的体内浓度会是很好的生物指标，可以提供医师较多信息以做出判断。目前市面上用于检测NT-proBNP浓度的工具，主要还是利用酶联免疫分析法(ELISA)进行定量，以及半定量护理点测试(POCT)直接由数值判断是否可能罹患心脏疾病。上述监测方法的问题是耗时较长，或者测定结果不太精确。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段及其用途。
为此，本发明提供的技术方案为：
第一方面，猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，包括：
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第一功能域，所述第一功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv1，第一功能域scFv1的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所述第一功能域scFv1的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；以及
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第二功能域，所述第二功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv2区，所述第二功能域scFv2的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示，所述第二功能域scFv2的轻链可变区VLCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。
优选的是，所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第一功能域scFv1的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述第一功能域scFv1的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
优选的是，所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第二功能域scFv2的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述第二功能域scFv2的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
优选的是，所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第一功能域scFv1的重链可变区和轻链可变区通过Linker连接，所述第二功能域scFv2的重链可变区和轻链可变区也通过Linker连接，所述Linker为(G4S)n。
优选的是，所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，n为3。
第二方面，编码如任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段的基因。
第三方面，包括所述基因的重组载体。
第四方面，用于快速诊断猫慢性心力衰竭的组合物，其包含任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段。
第五方面，试剂盒，所述试剂盒包括任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，所述试剂盒是胶乳增强免疫法或化学发光免疫法体外快速检测猫NT-proBNP试剂盒。
优选的是，所述的试剂盒中，所述试剂盒用于检测猫血浆中的NT-proBNP蛋白。
第六方面，任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体于制备猫心源性呼吸困难、心脏病早期的辅助诊断、心脏损伤程度评估及预后评估药物或试剂盒中的用途。在兽医临床中猫NT-proBNP诊断试剂盒可广泛应用于区分心源性呼吸困难、心脏病早期的辅助诊断、心脏损伤程度评估及预后评估等。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明首先筛选出针对猫NT-proBNP蛋白高亲和力的两个单克隆抗体，再通过基因工程手段得到一种基因重组的猫NT-proBNP双特异性抗体，并将其用于LEIA法检测猫NT-proBNP，该方法的试剂盒灵敏度更高，检测范围更广，其可用于不同的临床诊断需求。
本发明能够快速动态监测猫血浆NT-proBNP浓度，对猫心脏病尽早诊断和治疗具有重要指示意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例中抗猫NT-proBNP双特异性抗体的结构示意图。
图2为本发明实施例中猫NT-proBNP双特异性抗体制备的猫NT-proBNP测定试剂盒的定标曲线，将猫NT-proBNP抗原用小牛血清配制成一系列校准品，浓度分别为0pmol/L，50pmol/L，150pmol/L，400pmol/L，1000pmol/L，2000pmol/L。
图3为本发明实施例中猫NT-proBNP抗原测定试剂盒免疫比浊平台样本符合率曲线图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明涉及结合猫N端脑钠肽前体(猫NT-proBNP)的双特异性抗体及其用途，一种包含所述双特异性抗体的用于兽医临床诊断的猫NT-proBNP胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，以及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，均携带所述核酸的载体，以及使用所述载体和宿主细胞制备猫NT-proBNP双特异性抗体或其抗原结合片段的方法。快速动态监测猫血浆NT-proBNP浓度，对猫心脏病尽早诊断和治疗具有重要指示意义。
本发明提供一种猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，包括：
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第一功能域，所述第一功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv1，第一功能域scFv1的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所述第一功能域scFv1的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；以及
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第二功能域，所述第二功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv2区，所述第二功能域scFv2的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示，所述第二功能域scFv2的轻链可变区VLCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。
| 序列号 | 氨基酸序列 |
| SEQ ID NO:1 | GYTFTDFV |
| SEQ ID NO:2 | IRRGGST |
| SEQ ID NO:3 | ARDGAYETWAVY |
| SEQ ID NO:4 | QSVSTSNYSF |
| SEQ ID NO:5 | KTS |
| SEQ ID NO:6 | MQHLEVPFT |
| SEQ ID NO:7 | GFTFSDYA |
| SEQ ID NO:8 | ISSGGTYT |
| SEQ ID NO:9 | SRASYDYSGGAWFVY |
| SEQ ID NO:10 | QSIGFS |
| SEQ ID NO:11 | ATS |
| SEQ ID NO:12 | QQYYRYPMT |
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述第一功能域scFv1的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述第一功能域scFv1的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
SEQ ID NO:13
EVQLQQSGGELAKPGASVKMSCKASGYTFTDFVMNWVKQRPGQGLEWIGQI
RRGGSTTYADDFRGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARDGAYET
WAVYWGHGTSVTVSS
SEQ ID NO:14
DVLMTQTPLTLPVSLGDQASISCRSSQSVSTSNYSFVAWYQQKPGQSPKLLIYK
TSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCMQHLEVPFTFGGGTK
LEIK
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述第二功能域scFv2的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述第二功能域scFv2的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
SEQ ID NO:15
EVHLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYAWSWIRQFPGNKLEWIGYISS
GGTYTIYNQKFKDKATLTVDKSSSTVYMELRSLTSEDTAVYSCSRASYDYSGG
AWFVYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:16
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSIGFSLSWYQQKPGNTPKLLIYATSTLD SGVPKRFSGSRSGSDYSLTINSLESEDFADYYCQQYYRYPMT FGGGTKLEIK
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述第一功能域scFv1的重链可变区和轻链可变区通过Linker连接，所述第二功能域scFv2的重链可变区和轻链可变区也通过Linker连接，所述Linker为(G4S)n。
在上述方案中，作为优选，n为3。
本发明还提供编码任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段的基因。
本发明还提供包括所述基因的重组载体。
本发明还提供一种用于快速诊断猫慢性心力衰竭的组合物，其包含任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，所述试剂盒是胶乳增强免疫法或化学发光免疫法体外快速检测猫NT-proBNP试剂盒。
在上述方案中，作为优选，所述试剂盒用于检测猫血浆中的NT-proBNP蛋白。
本发明还提供所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体于制备猫心源性呼吸困难、心脏病早期的辅助诊断、心脏损伤程度评估及预后评估药物或试剂盒中的用途。
一种结合猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：
a.特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第一功能域，其包括抗猫NT-proBNP特异性抗体的scFv1区；以及
b.特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第二功能域，其包括抗猫NT-proBNP特异性抗体的scFv2区
优选地，所述特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的功能域由单链抗体scFv1和单链抗体scFv2通过Fc区以及Linker串联组成
优选地，所述的抗猫NT-proBNP蛋白双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人源化抗体。
优选地，所述特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第一功能域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
优选地，所述特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第二功能域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
其第一功能域scFv1由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14经Linker连接而成，其第二功能域scFv2由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16经Linker连接而成，Linker为(G4S)n，n优选地为3。
本发明所述的双特异抗体、或其变体、或其功能性片段可以是全长抗体，或仅包含两抗原结构域结合部分，如单链抗体(scFv)，或全长抗体与抗原结合部分组成的融合蛋白。
在不实质性影响抗体亲和力的前提下，本领域研究人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
包含猫NT-proBNP双特异性抗体的猫NT-proBNP测定试剂盒的检测时间短，灵敏度高，检测线性广，其可用于不同的临床诊断需求。
猫NT-proBNP测定试剂盒可以快速诊断猫心脏病的健康状况，用于检测表现健康但疑似有心脏病风险的猫，以及任何有呼吸道疾病体征的猫，进而辅助排除严重心脏病疾病。作用如下：
1)判断呼吸困难是否由心脏问题导致
NT-proBNP的浓度在辅助诊断宠物的呼吸困难症状是否由心脏疾病造成上有很高的参考价值，NT-proBNP水平可以将心脏病患宠与呼吸系统损伤患宠准确区分，从而迅速指导医生正确处理急重症病例。
2)可适当替代超声心动图检查
作为心脏生物标志物，它与左心室的舒张容量有着较强的相关性，当没有超声心动图检查时，NT-proBNP在一定程度上可以替代超声心动图进行疾病的辅助诊断。
3)在可能导致心损的疾病上评估心脏状态
在对于某些可能引起心脏损伤的疾病中(如细小病毒感染、猫瘟热病毒感染、利什曼原虫感染等)，NT-proBNP可迅速评估感染是否对心脏造成损伤，并可根据浓度值评估预后情况。
4)评估心脏病的预后
大量研究表明，NT-proBNP浓度水平在心脏病的诊断上具有较高的预测价值。对于患有心脏病的患宠，定期且连续地进行NT-proBNP定量分析，可为预后提供十分有价值的信息。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
实施例1抗猫NT-proBNP的双特异性抗体的获得
免疫动物
将1mg/ml的猫NT-proBNP抗原1ml分别与等体积弗氏完全佐剂均匀混合后，腹部皮下多点注射到12只4-6周BALB/C小鼠体内。1周后，将1ml猫NT-proBNP蛋白与等体积弗氏不完全佐剂均匀混合后，对小鼠进行腹部皮下多点注射。第3周，重复上述步骤。第4周，重复上述步骤。第四次注射后三天，断鼠尾尖取血20μl，室温静置2.5h，以25℃、11000rpm离心15min，取上清，通过ELISA实验检测效价。若效价检测可用即眼部取全血，室温静置2h，以25℃、7000rpm离心10min，取上清，-80℃保存。
杂交瘤制备
小鼠脱臼处死，用75％酒精把小鼠整体消毒后，超净台内无菌取小鼠脾细胞并研磨制成细胞悬液，将1×108个脾细胞与4×107个骨髓瘤(SP2/0)细胞融合，以50％PEG作融合剂，以HAT选择培养基培养4-10天后，以HT培养基进行培养，培养条件为5％CO2，37℃。
阳性克隆筛选及表位鉴定
利用ELISA反应筛选单克隆杂交瘤细胞中可分泌结合猫NT-proBNP抗原的抗体的克隆2株。用夹心法对表位进行鉴定，第一个抗体被捕获固定到酶标板表面。然后进样猫NT-proBNP抗原并与第一个抗体结合。随后再进样HRP标记的第二个抗体。第二个抗体要么与猫NT-proBNP抗原结合，产生“夹心”结合，要么被第一个抗体阻断而不与猫NT-proBNP抗原结合。结果显示第二个抗体可以在第一个抗体存在的情况下与猫NT-proBNP抗原结合，则它们具有不同的表位，因此属于不同的bin。
实施例2结合猫NT-proBNP的双特异性抗体的结构设计
本发明提供了可同时特异性结合猫NT-proBNP蛋白两个不同表位的双特异性抗体的结构模型，此类抗体主要实例的结构如图1所示，抗猫NT-proBNP特异性抗体的scFv1区(VH1-Linker-VL1或VL1-Linker-VH1)-鼠IgG1的Fc区-抗猫NT-proBNP特异性抗体的scFv2区-Linker-(VH2-Linker-VL2或VL2-Linker-VH2)组成的双特异性抗体。
猫NT-proBNP双特异性抗体的变体及功能性片段包括但不限于:
①VH1-Linker-VL1-mIgG1的Fc区-Linker-VH2-Linker-VL2；
②VH1-Linker-VL1-mIgG1的Fc区-Linker-VL2-Linker-VH2；
③VL1-Linker-VH1-mIgG1的Fc区-Linker-VH2-Linker-VL2；
④VL1-Linker-VH1-mIgG1的Fc区-Linker-VL2-Linker-VH2。
实施例3抗猫NT-proBNP双特异性抗体表达载体的构建
VH1-Linker-VL1-mIgG1的Fc区-Linker-VH2-Linker-VL2编码基因通过HindIII/EcoRI克隆位点连接到质粒pEE12.4，得到表达双特异性抗体的载体pEE12.4-猫NT-proBNP-bsAb。
实施例4抗猫NT-proBNP双特异性抗体的制备
利用HEK293F宿主细胞表达猫NT-proBNP双特异性抗体
将细胞密度稀释成2.5×106个/毫升，摇瓶置于5％的CO2恒温摇床中，37℃、150rpm恒温震荡培养10min后开始转染。准备两支50ml无菌离心管，在其中一支中加入10ml OPM和200μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入10ml OPM和0.5ml PEI转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养。
转染24小时后加入1.2ml细胞蛋白表达增强剂VPA，并加入葡萄糖可提高产物的表达量，转染后第6天测定产物表达量。
抗体纯化
将细胞培养上清于8000rpm离心30min，收集上清并用0.22μm过滤器过滤。然后通过protein A亲和色谱柱进行纯化，并脱盐置换缓冲液，分装保存。
实施例5猫NT-proBNP检测试剂盒的研发
猫NT-proBNP检测试剂盒校准品配置：将猫NT-proBNP抗原用小牛血清配制成一系列校准品，浓度分别为0pmol/L，50pmol/L，150pmol/L，400pmol/L，1000pmol/L，2000pmol/L。
一种猫NT-proBNP测定试剂盒的检测原理为：
该试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法，基本原理是将猫NT-proBNP双特异性抗体交联于胶乳颗粒上，与待测样本中猫NT-proBNP发生抗原抗体结合反应，形成大的抗原-抗体复合物，浊度增加，猫NT-proBNP浓度与形成的浊度成一定比例。在570nm波长下，通过检测的浊度与标准曲线比较，即可计算出样本中猫NT-proBNP抗原含量，包含猫NT-proBNP双特异性抗体的猫NT-proBNP测定试剂盒的灵敏度高，检测线性广，其可用于不同的临床诊断需求。
一种猫NT-proBNP抗原测定试剂盒的使用方法为：
将猫NT-proBNP抗原试剂盒，用全自动生化仪7180进行测试，参数如下，先加入样本2μl，再加入140μl试剂R1，37℃孵育5min，加入45μl试剂R2，5min后读取吸光度A1，计算吸光度的差值△A＝A1-A0(起始值)；使用配套校准品进行多点定标，得到定标曲线并进行线性拟合，则样本浓度(单位pmol/L)可通过其检测的吸光度差值在定标曲线上计算得到。
实施例6猫NT-proBNP抗原检测试剂盒性能测试
检测试剂盒性能测试的方法之一是样本符合率测定。
样本符合率也可以称作临床对比分析，它体现了诊断试剂盒对临床赋值样本的测量值与临床赋值样本理论值之间的一致程度。抗体作为体外诊断试剂的核心原料，其性能直接影响到体外诊断试剂产品的质量。样本符合率作为验证抗体原料性能最重要的指标之一，是体外诊断试剂公司在筛选原料时最关注的部分。考核一个新的抗体原料的样本符合率，通常以该抗体为原料制备体外诊断试剂盒(胶体金、免疫比浊等平台)，利用试剂盒对实际临床标本进行检测并对检测结果进行统计、分析来综合考核与评价。通过规范的对比研究、分析、总结试剂盒检测结果与临床样本理论值之间的关系，可以间接推测出该抗体原料的性能。两者的结果越接近，说明一致性越好，该抗体的性能也就越好。
以实测值为纵坐标，理论值为横坐标绘制散点图，利用计算机拟合线性回归曲线，并求得R2。如图3所示猫NT-proBNP抗原检测试剂盒的样本符合率R2>99％。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (10)
1.猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第一功能域，所述第一功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv1，所述scFv1的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、2和3所示，所述scFv1的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4、5和6所示；以及
特异性识别和结合猫NT-proBNP蛋白的第二功能域，所述第二功能域包括抗猫NT-proBNP双特异性抗体的scFv2，所述scFv2的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 7、8和9所示，所述scFv2的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 10、11和12所示。
2.如权利要求1所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述scFv1的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，所述scFv1的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
3.如权利要求1所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述scFv2的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，所述scFv2的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
4.如权利要求1所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述scFv1的重链可变区和轻链可变区通过Linker连接，所述scFv2的重链可变区和轻链可变区也通过Linker连接，所述Linker为(G4S)3。
5.编码如权利要求1至4任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段的基因。
6.包括权利要求5所述基因的重组载体。
7.用于快速诊断猫慢性心力衰竭的组合物，其包含权利要求1至4任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段。
8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至4任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体或其抗原结合片段，所述试剂盒是胶乳增强免疫法或化学发光免疫法体外快速检测猫NT-proBNP试剂盒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测猫血浆中的NT-proBNP蛋白。
10.如权利要求1至4任一项所述的猫NT-proBNP蛋白的双特异性抗体于制备猫心源性呼吸困难或心脏病早期的辅助诊断，心脏损伤程度评估及预后评估的药物或试剂盒中的用途。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| AT500800A1 (de) * | 2004-09-08 | 2006-03-15 | Biomedica Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur bestimmung von probnp |
| WO2012166918A1 (en) * | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Idexx Laboratories, Inc. | DETECTION OF DEGRADATION PRODUCTS OF FELINE NT-proBNP |
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-
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| AT500800A1 (de) * | 2004-09-08 | 2006-03-15 | Biomedica Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur bestimmung von probnp |
| WO2012166918A1 (en) * | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Idexx Laboratories, Inc. | DETECTION OF DEGRADATION PRODUCTS OF FELINE NT-proBNP |
| EP4169946A1 (en) * | 2021-10-25 | 2023-04-26 | Bionote, Inc. | Antibodies binding specifically to nt-probnp and use thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Association between Survival Time and Changes in NT-proBNP in Cats Treated for Congestive Heart Failure;K V Pierce等;《J Vet Intern Med》;20170531;第31卷(第3期);第678-684页 * |
| NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定;刘鹏展等;《生物技术通报》;20160627(第06期);第154-160页 * |
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