CN117063789A - 一种芹菜种质资源耐旱性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芹菜种质资源耐旱性评价方法，包括以下步骤：培育若干芹菜品种幼苗；对不同芹菜品种幼苗进行干旱胁迫处理，获得对应的旱害指数；对干旱胁迫处理后的芹菜品种幼苗进行指标测定，获得对应的耐旱系数；对所述旱害指数和耐旱系数进行相关性分析，并获得不同芹菜品种幼苗的隶属函数值；基于所述隶属函数值对芹菜品种的抗旱性进行评价。本发明根据旱害指数可以简便直观地反应植株在干旱胁迫下的耐受能力，然后对不同品种在干旱下的生长和生理指标进行测定，并结合旱害指数，通过运用隶属函数法运算而综合评价芹菜的抗旱性，避免了利用单一指标进行抗旱性评价的片面性和不稳定性。
Description
技术领域
本发明属于植物耐旱性评价技术领域，特别是涉及一种芹菜种质资源耐旱性评价方法。
背景技术
芹菜(Apium graveolens L.)是伞形科二年生草本植物，富含丰富的营养和药用价值，作为重要的蔬菜在全世界广泛种植。目前，国内外芹菜的种质资源非常多样，为芹菜的遗传育种提供了宝贵的遗传资源。芹菜性喜冷凉湿润气候，不耐干旱，干旱胁迫成其生长发育过程中受到最主要的非生物胁迫之一。
因此，对芹菜不同种质资源进行耐旱性评价具有重要意义，能够筛选出耐旱性强的芹菜品种和种质，为耐旱品种选育和生产用种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种芹菜种质资源耐旱性评价方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种芹菜种质资源耐旱性评价方法，包括以下步骤：
培育若干芹菜品种幼苗；
对不同芹菜品种幼苗进行干旱胁迫处理，获得对应的旱害指数；
对干旱胁迫处理后的芹菜品种幼苗进行指标测定，获得对应的耐旱系数；
对所述旱害指数和耐旱系数进行相关性分析，并获得不同芹菜品种幼苗的隶属函数值；
基于所述隶属函数值对芹菜品种的抗旱性进行评价。
可选地，获得旱害指数的过程包括：基于不同的芹菜品种幼苗对干旱胁迫的响应程度，预设旱害等级数值；获取最高旱害等级数值和芹菜品种幼苗总株数的乘积，基于不同芹菜品种幼苗的旱害等级数值与所述乘积的比值，获得对应的旱害指数。
可选地，所述芹菜品种幼苗的测定指标包括生长指标和生理指标；
所述生长指标包括：株高、茎粗、展幅、地上部/地下部鲜重、地上部/地下部干重以及根冠比。
可选地，所述生理指标包括：叶绿素、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛、抗氧化酶、SOD、POD以及CAT。
可选地，获得耐旱系数的过程包括：对干旱胁迫处理后的芹菜品种幼苗进行指标测定，获得旱胁迫测定值；获取正常芹菜品种幼苗的对照测定值，基于所述旱胁迫测定值与对应的对照测定值的比值，获得耐旱系数。
可选地，隶属函数值的计算公式如下所示：
当所述旱害指数和耐旱系数呈负相关，Fij＝(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；
当所述旱害指数和耐旱系数呈正相关，Fij＝1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；
其中，Fij为不同芹菜品种性状指标的隶属函数值，Xij为i品种j指标的耐旱系数，Xmin为全部品种中各指标耐旱系数最小值，Xmax为全部品种中耐旱系数最大值；
可选地，对旱害指数和耐旱系数进行相关性分析的结果包括：旱害指数与展幅、丙二醛含量分别呈极显著正相关性；旱害指数与株高、根冠比、叶绿素含量、游离脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性呈极显著负相关性。
可选地，基于所述隶属函数值对芹菜品种的抗旱性进行评价的过程包括：对不同芹菜品种幼苗的隶属函数值求取平均值，基于所述平均隶属度值对芹菜品种的抗旱性进行评价。
可选地，对芹菜品种的抗旱性进行评价的过程还包括：基于所述旱害指数对芹菜品种的抗旱性进行直接评价。
可选地，所述旱害指数与芹菜品种的抗旱性呈负相关。
本发明的技术效果为：
本发明根据旱害指数可以简便直观地反应植株在干旱胁迫下的耐受能力，适合大量材料的初步快速筛选，然后对不同品种在干旱下的生长和生理指标进行测定，并结合旱害指数，通过运用隶属函数法运算而综合评价芹菜的抗旱性，避免了利用单一指标进行抗旱性评价的片面性和不稳定性。
本发明提出的芹菜苗期抗旱性的评价方法，可以避免传统的田间鉴定所存在的周期长、易受其他不利环境条件影响而重复性差等缺点，其所需的占地面积小，周期短，可多次重复进行鉴定，对于育种上大量种质资源及育种中间材料的抗旱性筛选具有更快更早的判断，从而减少育种盲目性，并为干旱及半干旱地区适栽品种的选择提供便利。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例中的芹菜种质资源耐旱性评价方法流程示意图；
图2为本发明实施例中的干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗各指标相关性示意图；
图3为本发明实施例中的不同芹菜品种耐旱性的聚类分析示意图；
图4为本发明实施例中的不同芹菜品种旱害指数与隶属函数值的相关性分析示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
需要说明的是，在附图的流程图示出的步骤可以在诸如一组计算机可执行指令的计算机系统中执行，并且，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于此处的顺序执行所示出或描述的步骤。
实施例一
如图1所示，本实施例中提供一种芹菜种质资源耐旱性评价方法，包括以下步骤：
试验品种与方法
试验地点与品种
本实施例于2022年8-12月在四川农业大学园艺学院设施大棚进行，包括51个芹菜品种，植物品种及来源见表1。将芹菜种子50℃热温水浸种30min，取出放在凉水中浸种24h。置于种子培养箱中催芽(温度18℃，湿度80％，保持纱布的湿润)，约7d有30％～50％的种子露白。播种到穴盘(50孔)中，置于培养箱中育苗。当幼苗长到2～3片真叶时，将长势一致的健壮幼苗移到营养钵(14cm×16cm)中(基质为营养土:珍珠岩:蛭石＝3:1:1)，在温度15～25℃，空气湿度80％，培养基质50％～60％，光照强度15,400lx的环境中进行常规管理。
表1
试验设计及方法
待品种长至苗龄60d左右将幼苗从设施大棚转移至人工气候室，以便更好地控制幼苗的生长环境条件。考虑到转移生长环境可能对幼苗产生影响，将幼苗置于人工气候室适应5d，人工气候室内的温度设置为23/15℃(16/8h，白天/黑夜)。在整个试验过程中，处理前幼苗的培育方法均同上。5d后，进行15％PEG6000溶液灌根干旱胁迫处理，正常浇水作为CK对照，每3d进行一次灌根处理，共3次，每个品种处理品种为10株。干旱胁迫处理9d后，进行生长指标的测定并统计幼苗生长状况计算旱害指数并取样保存用于生理指标的测定。
测定项目及方法
旱害指数的统计：
根据芹菜幼苗对干旱的响应程度不同，对芹菜幼苗旱害症状进行分级，旱害指数＝∑[各株级数/(最高级数×总株数)]的计算，芹菜幼苗旱害分级如表2。
表2
生长指标测定：
株高：用卷尺测量茎基部到幼苗生长点。
茎粗：用游标卡尺测定幼苗子叶下方1cm处的直径。
展幅：软尺测量叶簇展幅最宽处大小。
地上部/地下部鲜重：用去离子水冲洗植株后，拿吸水纸吸干水分，用天平称取鲜量。
地上部/地下部干重：报纸包裹鲜样试验品种置于烘箱中，60℃烘至恒重(烘干的标准是最后2次称量的质量相对误差<0.5％)，称其干重。
根冠比：植物地下部与地上部的鲜质量的比值。
生理指标测定：
按照的丙酮-乙醇混合法(体积比1：1)提取叶绿素：将待测的芹菜鲜叶片混匀，立即精确称取0.2000～1.000g(视叶绿素含量而定)，用不锈钢刀剪成约为0.1cm2的细块，放入50mL容量瓶中，迅速加入10mL丙酮-乙醇混合液，盖上瓶塞，摇匀，在暗处放置24h。取上清液在分光光度计下分别以663nm、645nm和652nm波长测出该色素液的光密度。
可溶性蛋白用考马斯亮蓝G250比色法测定：称取样品0.5g，用5mL蒸馏水混成匀浆后，10000r/min离心10min，取上清液1mL于试管中。加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液后放置2min，与蛋白质结合后可呈现蓝色，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线计算蛋白质含量。
游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法[测定：分别称取芹菜叶片0.1g，洗净并剪碎后置入大离心管中，加入5mL 3％磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min(同时摇动)；冷却后在3000r/min下离心10min，上清液即为脯氨酸提取液；取1mL提取液于大离心管中，加入1mL水、1mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色；冷却后加入4mL甲苯，涡旋振荡30s，静置片刻；吸取上层甲苯脯氨酸红色溶液于比色皿中，以甲苯为空白调零，测定OD520值。
丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法测定：取芹菜叶片1g剪成小块放置研钵中，加2mL10％TCA和少许石英砂，研磨成匀浆，加入8mL10％TCA继续研磨均匀。匀浆在3000g离心10min，上清液即为提取液，取10mL刻度试管2支，一支加入上清液3mL，另一支加水3mL作为空白，各加入0.5％TBA溶液3mL摇匀，在沸水浴中煮10min(溶液出现小气泡时开始计时)，立即在冷水中冷却，如有沉淀应离心。以空白为对照，用1cm比色杯在430nm、532nm、600nm下测定样品反应液的消光值。
抗氧化酶活性测定：称取0.3g研磨的叶片匀浆加入6ml 50mM pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴30min后，4℃12000×g离心10min，上清液可用于SOD、POD，CAT的测定。
SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定。酶反应体系为50mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液、100μmol/LEDTA二钠盐、136mmol/L甲硫氨酸、20μmol/L核黄素、750μmol/LNBT、试管中加入0.1mL酶液与0.5mL蒸馏水，对照放置黑暗中，其余试管光照30min，测定560nm的吸光度；
POD活性采用愈创木酚比色法测定；酶反应体系为680μL(50mmol·L-1pH7.8磷酸缓冲液)、100μL(250mmol·L-1愈创木酚)、20μL酶液，最后加入200μL(200mmol·L-1H2O2)启动液，立即测定470nm的吸光度，每隔15s读数一次，共测2min；
CAT活性采用紫外吸收法测定；酶反应体系为780μL(50mmol·L1pH7.0磷酸缓冲液)、20μL酶液，最后加入200μL(200mmol·L-1H2O2)启动液，立即测定240nm的吸光度，每隔10s读数一次，共测1.5min；
数据分析与计算
为了更好反映不同品种芹菜的耐旱性，在分析时将各性状指标换算成相对应的耐旱系数再进行隶属函数计算。试验中相关指标计算公式如下：
耐旱系数(X)＝旱胁迫测定值/对照测定值×100％；
隶属函数计算公式：
当测定值与耐旱性呈正相关则用Fij＝(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；
当测定值与耐旱性呈负相关则用Fij＝1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
Fij代表不同品种性状指标的隶属函数值，Xij代表i种质j指标的耐旱系数，Xmin表示26个种质中各指标耐旱系数最小值，Xmax表示26个种质耐旱系数最大值。
用Excel 2020和OriginPro 9.0软件进行作图，用SPSS21.0软件进行方差分析，采用Duncan进行差异显著性检验(P＜0.05显著水平)。
结果与分析
干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗旱害症状和旱害指数的影响：
不同品种芹菜幼苗在正常生长环境下，生长良好，无任何不良症状。在干旱胁迫后，芹菜幼苗植株表型发生严重变化，主要特征为叶柄弯曲，叶片萎焉失绿，最终萎蔫死亡。不同品种受害程度不同，呈现出明显的品种间差距，通过表型统计计算旱害指数可知(表3)，其中深绿色芹菜品种荷兰巨芹、玻璃脆芹和津耘宝芹品种耐旱性最好，旱害症状出现最晚，旱害症状较轻。而紫色芹菜津耘紫芹和紫杆1号品种最不耐旱，生长状况最差，最早出现旱害症状且在处理后期出现大量死亡。
表3
干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗各指标与旱害指数相关性分析：
耐旱系数能较好显示各指标在处理与对照条件下比较的结果，按照上述公式计算出不同品种生长和生理指标的耐旱系数，并且与旱害指数进行相关性分析，发现各指标之间与旱害指数存在一定显著或极显著相关性。如图2，旱害指数与展幅、丙二醛含量分别呈极显著正相关性，与株高、根冠比、叶绿素含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性呈极显著负相关性，由此得出，各项指标都可作为植物耐旱性评价的参考指标。
干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗各指标隶属函数值分析：
利用单一性状耐旱系数法评价各品种耐旱不够全面，不同变量常常具有不同的单位和不同的变异程度，因此为了消除量纲影响和变量自身变异大小和数值大小的影响，消除单个指标带来的片面性，用隶属函数法将各品种的各耐旱指标扩展到[0，1]，将数据标准化。为综合评价芹菜不同种质耐旱性，依据各指标的耐旱系数，计算芹菜不同材料的各个指标隶属函数值并求平均数作为隶属度，进行种质耐旱性比较。表4为干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗生长指标的隶属函数值，表5为干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗生理指标的隶属函数值，表6为干旱胁迫下不同芹菜品种幼苗各指标平均隶属函数值，通过分析可知，其中耐旱性排名前五的分别是玻璃脆芹、皇妃西芹、California emperor、津耘宝芹和美国西芹王，而排名倒数前五的分别是紫杆1号、紫芹、017-18紫芹、紫衣仙子和黄芹。
表4
表5
表6
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不同芹菜品种耐旱性的聚类分析：
基于旱害指数的直接评价，为进一步确认不同芹菜品种的耐旱性，将旱害指数与各生长、生理指标的隶属函数平均值为基础进行聚类分析。如图3所示，耐旱性极强的品种如玻璃脆芹、津耘宝芹、皇妃香芹等被聚类第1个类别，并且此类别大部分为绿杆实心芹；意大利香芹、忘特香和香芹这3种香芹被单独分到第2类，属于耐旱性较强的品种；第3类的包括如津南实芹3号、法拉利和根芹等耐旱性中等的品种；第4类属于耐旱性较弱的一类，包括白杆1号、白富美实杆芹和津耘白芹等，第4类包括了大部分白芹和空心芹品种；第5类耐旱性最弱，其中包括紫芹、精品赛雪、黄芹、紫衣仙子、紫杆1号和017-18紫芹，此类别大部分为紫色芹菜。
不同芹菜品种耐旱性鉴定的比较验证：
如图4所示，为了验证依据旱害指数的直接评价法和依据隶属函数综合评价法进行耐旱性鉴定结果的一致性和可靠性，对51份芹菜品种的旱害指数的平均值和隶属函数得分平均值进行简单相关性分析，结果表明，两者呈显著负相关(R2＝0.8139)。表明两者鉴定结果一致性高，鉴定结果准确可靠。
本实施例首次对芹菜幼苗旱害症状建立了5级旱害症状分级标准，根据旱害分级标准而计算的旱害指数可以简便直观地反应植株在干旱胁迫下的耐受能力，适合大量材料的初步快速筛选，旱害指数越低，抗旱性越强，本实施例的旱害等级划分标准明确，使统计结果相对客观和准确，后续隶属函数值法的验证证明了本实施例的准确性。
本实施例对不同品种在干旱下14个生长和生理指标进行测定，并结合旱害指数，通过运用隶属函数法运算而综合评价芹菜的抗旱性，避免了利用单一指标进行抗旱性评价的片面性和不稳定性。另外，在隶属函数值的计算公式中，采用的是各项测定指标的相对变化率，这种基于对照水平换算后的指标相对变化率用于抗旱性评价时可以排除各基因型本身固有的差异，而真正体现其内在的抗旱性。
本实施例提出的芹菜苗期抗旱性的评价方法，可以避免传统的田间鉴定所存在的周期长、易受其他不利环境条件影响而重复性差等缺点，其所需的占地面积小，周期短，可多次重复进行鉴定，对于育种上大量种质资源及育种中间材料的抗旱性筛选具有更快更早的判断，从而减少育种盲目性，并为干旱及半干旱地区适栽品种的选择提供便利。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
培育若干芹菜品种幼苗；
对不同芹菜品种幼苗进行干旱胁迫处理，获得对应的旱害指数；
对干旱胁迫处理后的芹菜品种幼苗进行指标测定，获得对应的耐旱系数；
对所述旱害指数和耐旱系数进行相关性分析，并获得不同芹菜品种幼苗的隶属函数值；
基于所述隶属函数值对芹菜品种的抗旱性进行评价。
2.根据权利要求1所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
获得旱害指数的过程包括：基于不同的芹菜品种幼苗对干旱胁迫的响应程度，预设旱害等级数值；获取最高旱害等级数值和芹菜品种幼苗总株数的乘积，基于不同芹菜品种幼苗的旱害等级数值与所述乘积的比值，获得对应的旱害指数。
3.根据权利要求1所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
所述芹菜品种幼苗的测定指标包括生长指标和生理指标；
所述生长指标包括：株高、茎粗、展幅、地上部/地下部鲜重、地上部/地下部干重以及根冠比。
4.根据权利要求3所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
所述生理指标包括：叶绿素、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛、抗氧化酶、SOD活性、POD活性以及CAT活性。
5.根据权利要求1所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
获得耐旱系数的过程包括：对干旱胁迫处理后的芹菜品种幼苗进行指标测定，获得旱胁迫测定值；获取正常芹菜品种幼苗的对照测定值，基于所述旱胁迫测定值与对应的对照测定值的比值，获得耐旱系数。
6.根据权利要求5所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
隶属函数值的计算公式如下所示：
当所述旱害指数和耐旱系数呈负相关，Fij＝(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；
当所述旱害指数和耐旱系数呈正相关，Fij＝1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；
其中，Fij为不同芹菜品种性状指标的隶属函数值，Xij为i品种j指标的耐旱系数，Xmin为全部品种中各指标耐旱系数最小值，Xmax为全部品种中耐旱系数最大值。
7.根据权利要求4所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
对旱害指数和耐旱系数进行相关性分析的结果包括：旱害指数与展幅、丙二醛含量分别呈极显著正相关性；旱害指数与株高、根冠比、叶绿素含量、游离脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性呈极显著负相关性。
8.根据权利要求1所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
基于所述隶属函数值对芹菜品种的抗旱性进行评价的过程包括：对不同芹菜品种幼苗的隶属函数值求取平均值，基于所述平均隶属度值对芹菜品种的抗旱性进行评价。
9.根据权利要求1所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
对芹菜品种的抗旱性进行评价的过程还包括：基于所述旱害指数对芹菜品种的抗旱性进行直接评价。
10.根据权利要求9所述的芹菜种质资源耐旱性评价方法，其特征在于，
所述旱害指数与芹菜品种的抗旱性呈负相关。
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