CN117062913A - 细胞外囊泡制剂 - Google Patents

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CN117062913A CN202180093716.9A CN202180093716A CN117062913A CN 117062913 A CN117062913 A CN 117062913A CN 202180093716 A CN202180093716 A CN 202180093716A CN 117062913 A CN117062913 A CN 117062913A
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K·黄
L·杰克逊
M·西佐娃
D·多尔曼
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Abstract

本文提供了可用作治疗剂的细胞外囊泡(EV)的溶液和干燥形式及其治疗性组合物。

Description

细胞外囊泡制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月14日提交的美国临时申请号63/125,177以及2021年6月4日提交的美国临时申请号63/196,992的权益，将其各自的全部内容通过引用并入本文。
发明内容
包含细胞外囊泡(EV)(例如从细菌获得的EV)的治疗性组合物具有治疗效果并且可用于治疗和/或预防疾病和/或健康障碍。如本文所述，来自细菌的EV被制备为溶液和干燥形式。在一些实施例中，溶液和干燥形式用于制备包含EV的治疗性组合物。在一些实施例中，包含本文所述的EV的干燥形式(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)在完成干燥后具有低于约6％的水分含量。在一些实施例中，水分含量低于约6％的干燥形式更适合下游加工。在一些实施例中，水分含量低于约6％的干燥形式具有改进的稳定性。在一些实施例中，包含EV的溶液还包含赋形剂，该赋形剂含有填充剂，并且任选地包含一种或多种另外成分，例如冻干保护剂。在一些实施例中，包含EV的溶液还包含赋形剂，该赋形剂含有冻干保护剂，并且任选地包含一种或多种另外成分，例如填充剂。在一些实施例中，包含EV的干燥形式还包含赋形剂，该赋形剂含有填充剂，并且任选地包含一种或多种另外成分，例如冻干保护剂。在一些实施例中，包含EV的干燥形式还包含赋形剂，该赋形剂含有冻干保护剂，并且任选地包含一种或多种另外成分，例如填充剂。
在制备细胞外囊泡(EV)进行干燥，例如冷冻干燥和喷雾干燥时使用填充剂和/或冻干保护剂。在一些实施例中，填充剂，包括但不限于蔗糖、甘露醇、聚乙二醇(PEG，例如PEG6000)、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖(例如葡聚糖40k)，使得干燥形式(例如粉末和/或冻干物)干燥后更易于处理。在一些实施例中，填充剂改善了干燥形式的特性。在一些实施例中，冻干保护剂，包括但不限于海藻糖、蔗糖和乳糖，在干燥例如冷冻干燥或喷雾干燥期间保护EV。在一些实施例中，赋形剂起到减少干燥循环时间的作用。在一些实施例中，赋形剂用于维持EV的治疗功效。
在一些实施例中，细胞外囊泡(EV)(例如从细菌获得的EV)具有治疗效果并且可用于治疗和/或预防疾病和/或健康障碍。在一些实施例中，制备溶液和干燥形式的含有EV的治疗性组合物。
在一些方面，本披露内容提供了一种包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中该冻干物具有低于约6％的水分含量(例如，如通过卡尔费休(Karl Fischer)法(本文也称为“卡尔费休(Karl Fischer)”)测定)。
在一些实施例中，冻干物具有低于约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，冻干物具有低于约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，冻干物具有约1％至约4％之间的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，冻干物具有约2％至约3％之间的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中该冻干物具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg冻干物的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中该冻干物具有约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg冻干物的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中颗粒具有约-29.2至约+2.67mV的电荷，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中颗粒具有约-0.929至约-24.80mV的电荷，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中颗粒具有约101nm至约752nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物，其中颗粒具有约25.55nm至约458.9nm或约25.55nm至约157.40nm的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的冻干物，其中赋形剂占冻干物总质量的约95％至约99％。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的冻干物，其中EV占冻干物总质量的约2％至约6％。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包括冻干粉末。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包括冻干饼。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自与小肠粘液相关的细菌菌株的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自厌氧细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，厌氧细菌是专性厌氧菌。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，厌氧菌是兼性厌氧菌。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，厌氧菌是耐氧厌氧菌。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自单层细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自双层细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自革兰氏阴性细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自以下科的细菌的EV：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科(Tannerellaceae)；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自革兰氏阳性细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自以下科的细菌的EV：颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自普雷沃菌属的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自韦荣氏球菌属的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自副拟杆菌属的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自颤螺旋菌科的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自坦纳菌科的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自雷沃菌科的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自韦荣氏球菌科的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自物种小韦荣氏球菌的细菌的EV。
在本文提供的冻干物的一些实施例中，冻干物包含来自物种Fournierellamassiliensis的细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中粉末具有低于约6％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，粉末具有低于约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，粉末具有低于约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，粉末具有约1％至约4％之间的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，粉末具有约2％至约3％之间的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中粉末具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg粉末的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中粉末具有约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg粉末的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中颗粒具有约-29.2至约+2.67mV的电荷，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中颗粒具有约-0.929至约-24.80mV的电荷，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中颗粒具有约101nm至约752nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末，其中颗粒具有约25.55nm至约458.9nm或约25.55nm至约157.40nm的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的粉末，其中赋形剂占粉末总质量的约95％至约99％。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的粉末，其中EV占粉末总质量的约2％至约6％。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包括冻干粉末。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包括喷雾干燥粉末。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自与小肠粘液相关的细菌菌株的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自厌氧细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，厌氧细菌是专性厌氧菌。
在本文提供的粉末的一些实施例中，厌氧菌是兼性厌氧菌。
在本文提供的粉末的一些实施例中，厌氧菌是耐氧厌氧菌。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自单层细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自双层细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自革兰氏阴性细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自以下科的细菌的EV：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；克里斯滕森菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自革兰氏阳性细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自以下科的细菌的EV：颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自普雷沃菌属的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自韦荣氏球菌属的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自副拟杆菌属的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自颤螺旋菌科的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自坦纳菌科的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自雷沃菌科的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自韦荣氏球菌科的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自物种小韦荣氏球菌的细菌的EV。
在本文提供的粉末的一些实施例中，粉末包含来自物种Fournierellamassiliensis的细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中干燥形式具有低于约6％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，本文提供的干燥形式具有低于约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，本文提供的干燥形式具有低于约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，本文提供的干燥形式具有约1％至约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些实施例中，本文提供的干燥形式具有约2％至约3％的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中干燥形式具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg干燥形式的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中干燥形式具有约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg干燥形式的颗粒数。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中颗粒具有约-29.2至约+2.67mV的电荷，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中颗粒具有约-0.929至约-24.80mV的电荷，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中颗粒具有约101nm至约752nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中颗粒具有约25.55nm至约458.9nm或约25.55nm至约157.40nm的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的干燥形式，其中赋形剂占干燥形式总质量的约95％至约99％。
在一些方面，本披露内容提供了包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和赋形剂的干燥形式，其中EV占干燥形式总质量的约2％至约6％。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含粉末。在一些实施例中，粉末包含冻干粉末。在一些实施例中，粉末包含喷雾干燥粉末。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含冻干物。在一些实施例中，冻干物包含冻干粉末。在一些实施例中，冻干物包含冻干饼。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自与小肠粘液相关的细菌菌株的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自厌氧细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，厌氧细菌是专性厌氧菌。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，厌氧菌是兼性厌氧菌。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，厌氧菌是耐氧厌氧菌。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自单层细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自双层细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自革兰氏阴性细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自以下科的细菌的EV：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；克里斯滕森菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自革兰氏阳性细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自以下科的细菌的EV：颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自普雷沃菌属的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自韦荣氏球菌属的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自副拟杆菌属的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自颤螺旋菌科的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自坦纳菌科的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自普雷沃菌科的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自韦荣氏球菌科的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自物种小韦荣氏球菌的细菌的EV。
在本文提供的干燥形式的一些实施例中，干燥形式包含来自物种Fournierellamassiliensis的细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含溶液的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含干燥形式的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含喷雾干燥粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含冻干物的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了包含冻干粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。
在一些方面，本披露内容提供了治疗性组合物，该治疗性组合物基本上由来自细菌的细胞外囊泡(EV)和包含冷冻保护剂的赋形剂组成。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了溶液，该溶液基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的溶液的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了干燥形式，该干燥形式基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的干燥形式的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了粉末，该粉末基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了喷雾干燥粉末，该喷雾干燥粉末基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的喷雾干燥粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了冻干物，该冻干物基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的冻干物的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了冻干粉末，该冻干粉末基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的冻干粉末的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼包含细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了冻干饼，该冻干饼基本上由细胞外囊泡(EV)和包含一种或多种赋形剂的原液的赋形剂组成，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。在一些实施例中，EV是来自细菌的EV。
在一些方面，本披露内容提供了包含这样的冻干饼的治疗性组合物，其中组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些方面，本披露内容提供了治疗受试者(例如人)(例如需要治疗的受试者)的方法，该方法包括：
向受试者施用本文所述的溶液、干燥形式或治疗性组合物。
在一些实施例中，本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物用于治疗受试者(例如，人)(例如，需要治疗的受试者)。
在一些方面，本披露内容提供了本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物在制备用于治疗受试者(例如人)(例如需要治疗的受试者)的药物中的用途。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物是口服施用的(例如，用于口服施用)。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，受试者需要治疗(和/或预防)癌症。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，受试者需要治疗(和/或预防)自身免疫性疾病。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，受试者需要治疗(和/或预防)炎性疾病。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，受试者需要治疗(和/或预防)代谢疾病。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，受试者需要治疗(和/或预防)菌群失调。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物与另外的治疗剂组合施用。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，干燥形式是粉末。在一些实施例中，粉末是冻干粉末。在一些实施例中，粉末是喷雾干燥粉末。
在本文提供的方法、溶液、干燥形式、治疗性组合物或用途的一些实施例中，干燥形式是冻干物。在一些实施例中，冻干物是冻干粉末。在一些实施例中，冻干物是冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，干燥包括冻干。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将干燥形式与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，干燥包括冻干。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在本文提供的制备喷雾干燥粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将喷雾干燥粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备喷雾干燥粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在本文提供的制备冻干物的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将冻干物与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备冻干物的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在本文提供的制备冻干粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将冻干粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备冻干粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在本文提供的制备冻干饼的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的溶液的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，EV来自细菌。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，干燥包括冻干。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将干燥形式与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备干燥形式的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，EV来自细菌。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，干燥包括冻干。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在本文提供的制备喷雾干燥粉末的方法的一些实施例中，EV来自细菌。
在本文提供的制备喷雾干燥粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将喷雾干燥粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备喷雾干燥粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在本文提供的制备冻干物的方法的一些实施例中，EV来自细菌。
在本文提供的制备冻干物的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将冻干物与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备冻干物的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在本文提供的制备冻干粉末的方法的一些实施例中，EV来自细菌。
在本文提供的制备冻干粉末的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将冻干粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在本文提供的制备冻干粉末的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在本文提供的制备冻干饼的方法的一些实施例中，本披露内容提供了通过本文描述的方法制备的冻干饼。
在包括冷冻干燥步骤的方法的一些实施例中，冷冻干燥包括一级干燥和二级干燥。在一些实施例中，一级干燥在约-35℃至约-20℃之间的温度进行。例如，一级干燥在约-20℃、约-25℃、约-30℃或约-35℃的温度进行。在一些实施例中，二级干燥在约+20℃至约+30℃之间的温度进行。例如，二级干燥在约+25℃的温度进行。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，填充剂包含甘露醇、蔗糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll、聚乙二醇(PEG，例如PEG 6000)、环糊精或PVP-K30。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，填充剂包含甘露醇。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂包含另外成分。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，另外成分包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、Ficoll、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂包含甘露醇和海藻糖。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂包含甘露醇、海藻糖和山梨糖醇。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂基本上由甘露醇、海藻糖和山梨糖醇组成。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂包含海藻糖。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂基本上由海藻糖组成。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂来自包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式是粉末。在一些实施例中，粉末是冻干粉末。在一些实施例中，粉末是喷雾干燥粉末。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式是冻干物。在一些实施例中，冻干物是冻干粉末。在一些实施例中，冻干物是冻干饼。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含甘露醇和海藻糖，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂溶液含有比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂溶液含有比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇和海藻糖均不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中海藻糖不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇和海藻糖均不以9mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇不以9mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中海藻糖不以9mg/ml的量存在。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，赋形剂包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，并且不包含甲硫氨酸。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式或治疗性组合物包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，并且甘露醇和海藻糖在干燥形式或治疗性组合物中不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在，例如，基于重量或基于重量百分比)。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，溶液或干燥形式的至少约10％(按重量计)是赋形剂原液。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，溶液或干燥形式的约10％至约80％(按重量计)是赋形剂原液。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，其中溶液或干燥形式的约20％至约70％(按重量计)是赋形剂原液。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，溶液或干燥形式的约30％至约60％(按重量计)是赋形剂原液。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约1％。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约1％至约99％。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约5％至约90％。在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约1％至约60％。在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按粉末或饼的重量计，EV占总固体的约1％至约20％。在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约2％至约10％。在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，按干燥形式的重量计，EV占总固体的约2％至约6％。在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含低于约6％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含低于约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约0.5％至约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约1％至约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约1％至约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约2％至约5％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约2％至约4％的水分含量(例如，如通过卡尔费休滴定法测定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含至少1e10个颗粒/mg干燥形式(例如，由颗粒/mg测定，例如通过NTA)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约3e10至约8e10个颗粒/mg干燥形式(例如，由颗粒/mg测定，例如通过NTA)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约6e10至约8e10个颗粒/mg干燥形式(例如，由颗粒/mg测定，例如通过NTA)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg干燥形式。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，干燥形式包含约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg干燥形式。
在一些实施例中，通过NTA对干燥形式确定颗粒数。在一些实施例中，通过NTA使用Zetaview相机对干燥形式上确定颗粒数。
在一些实施例中，通过NTA并使用Zetaview照相机，对重悬浮在水中的干燥形式确定颗粒数。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，在从干燥形式重悬浮(例如，在去离子水中重悬浮)后，颗粒具有约200nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)(例如，由动态光散射确定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，在从干燥形式重悬浮(例如，在去离子水中重悬浮)后，颗粒具有约200nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)(例如，由动态光散射确定)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，颗粒具有约101nm至约752nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)。在一些实施例中，动态光散射(DLS)用于获得在将冻干物重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)后存在的颗粒的流体动力学直径(Z平均，Zave)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，颗粒具有在约25.55nm至约458.9nm之间的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，颗粒具有在约25.55nm至约157.40nm之间的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，颗粒具有约-29.2至约+2.67mV的电荷(通过ζ电位(mV)测量，例如，通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量)。
在本文提供的干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，颗粒具有约-0.929至约-24.80mV的电荷(通过ζ电位(mV)测量，例如，通过总颗粒的DLS测量)。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自革兰氏阳性细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自革兰氏阴性细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自需氧细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧细菌包含专性厌氧菌。在一些实施例中，厌氧细菌包含兼性厌氧菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自耐氧细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自单层细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自双层细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自以下科的细菌：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；或克里斯滕森菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自以下科的细菌：颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自普雷沃菌属的细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌属的细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自副拟杆菌属的细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌菌株。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自坦纳菌科的细菌菌株。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自普雷沃菌科的细菌菌株。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌菌株。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自嗜酸细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自嗜碱细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自嗜中性细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自难养细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自非难养细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自表1、表2、表3、和/或表4中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自表1、表2、表3和/或表4中列出的细菌菌株。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自表J中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的细菌。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自表J中列出的细菌物种。
在本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物的一些实施例中，EV来自表J中列出的细菌菌株。
在一些实施例中，本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自一种或多种细菌菌株的EV。在一些实施例中，本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自一种细菌菌株的EV。在一些实施例中，用作EV来源的细菌菌株是基于细菌的特性(例如，生长特征、产量、在测定或受试者中调节免疫应答的能力)来选择的。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物用于治疗或预防例如受试者(例如人)中的疾病和/或健康障碍。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的干燥形式(或其治疗性组合物)被制备为固体剂型，例如片剂、微型片剂、胶囊或粉末；或这些形式的组合(例如，胶囊中的微型片剂)。在一些实施例中，固体剂型包含包衣(例如，肠溶包衣)。
在一些实施例中，重构本文提供的包含来自细菌的EV的干燥形式(或其治疗性组合物)。在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液(或其治疗性组合物)用作悬浮液，例如，稀释成悬浮液或以未稀释的形式使用。
在一些实施例中，如本文所提供的，制备包含溶液和/或干燥形式的治疗性组合物，该溶液和/或干燥形式包含来自细菌的EV。在一些实施例中，将包含干燥形式的治疗性组合物配制成固体剂型，例如片剂、微型片剂、胶囊或粉末。在一些实施例中，包含干燥形式的治疗性组合物在悬浮液中重构。
在一些实施例中，将包含粉末的治疗性组合物配制成固体剂型，例如片剂、微型片剂、胶囊或粉末。在一些实施例中，包含粉末的治疗性组合物在悬浮液中重构。
在一些实施例中，本文提供的溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自细菌的经γ辐照的EV。在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制成治疗性组合物。在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制成固体剂型，例如片剂、微型片剂、胶囊或粉末。在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制为在悬浮液中重构。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物被口服施用。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物经鼻内施用。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物通过吸入施用。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物被静脉内施用。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物通过注射，例如，肿瘤内或肿瘤下，例如施用给患有肿瘤的受试者。
在一些实施例中，本文提供的包含来自细菌的EV的溶液、干燥形式或治疗性组合物被局部施用。
在某些方面，本文提供了包含含有来自细菌的EV的溶液和/或干燥形式的治疗性组合物，用于治疗和/或预防疾病或健康障碍(例如，不利的健康障碍)(例如，癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)，以及制备和/或鉴定这样的溶液和/或干燥形式和/或治疗性组合物的方法，以及使用这样的溶液和/或干燥形式和/或其治疗性组合物的方法(例如，单独或与其他治疗剂组合用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)。
在一些实施例中，治疗性组合物包含来自细菌的EV和完整的细菌，例如，从其获得EV的细菌，例如活细菌、死细菌、减毒细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自不存在获得它们的细菌的细菌的EV，使得超过约85％、超过约90％或超过约95％(或超过约99％)的溶液和/或粉末的细菌来源内容物包含EV。在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制为EV是分离的EV，例如，通过本文描述的方法分离。
在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种或多种细菌的EV。在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的一种或多种细菌菌株或物种的EV。
在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含分离的EV(例如，来自一种或多种细菌菌株。例如，其中溶液和/或干燥形式的含量(例如，不排除赋形剂含量)的至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％是从细菌(例如，目的细菌)中分离的EV。
在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含分离的EV(例如，来自一种细菌菌株(例如，目的细菌)。例如，其中溶液和/或干燥形式的含量(例如，不排除赋形剂含量)的至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％是细菌(例如，目的细菌，例如本文披露的细菌)的分离的EV。
在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自一种细菌菌株的EV。
在一些实施例中，溶液、干燥形式或治疗性组合物包含来自多于一种细菌菌株的EV。
在一些实施例中，EV是冻干的。
在一些实施例中，EV被γ辐照。
在一些实施例中，EV被UV辐照。
在一些实施例中，EV是热灭活的(例如，在50℃保持两小时或在90℃保持两小时)。
在一些实施例中，EV被酸处理。
在一些实施例中，EV被喷射氧气(例如，以0.1vvm持续两小时)。
在一些实施例中，EV来自革兰氏阳性细菌。
在一些实施例中，EV来自革兰氏阴性细菌。
在一些实施例中，EV来自实例10中评估的细菌物种。
在一些实施例中，EV来自需氧细菌。
在一些实施例中，EV来自厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧细菌包含专性厌氧菌。在一些实施例中，厌氧细菌包含兼性厌氧菌。
在一些实施例中，EV来自嗜酸细菌。
在一些实施例中，EV来自嗜碱细菌。
在一些实施例中，EV来自嗜中性细菌。
在一些实施例中，EV来自难养细菌。
在一些实施例中，EV来自非难养细菌。
在一些实施例中，EV来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的细菌。
在一些实施例中，EV来自本文提供的细菌菌株(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)。
在一些实施例中，EV来自耐氧细菌。
在一些实施例中，EV选自与粘液相关的细菌菌株。在一些实施例中，粘液与肠腔相关。在一些实施例中，粘液与小肠相关。在一些实施例中，粘液与呼吸道有关。
在一些实施例中，EV选自与上皮组织相关的细菌菌株，例如口腔、肺、鼻或阴道。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌，其源自人小肠。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌，其源自人小肠并且在那里与外粘液层相关联。
在一些实施例中，EV来自单层细菌。
在一些实施例中，EV来自双层细菌。
在一些中，EV来自以下科的细菌：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在一些实施例中，EV来自以下科的细菌：颤螺旋菌科；梭菌科；毛螺菌科；或克里斯滕森菌科。
在一些实施例中，EV来自普雷沃菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自副拟杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自坦纳菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自普雷沃菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌。
在一些实施例中，革兰氏阴性细菌属于Negativicutes纲。
在一些实施例中，革兰氏阴性细菌属于韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、月形单胞菌科(Selenomonadaceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)或Sporomusaceae科。
在一些实施例中，EV来自以下属的细菌：巨型球菌属(Megasphaera)、月形单胞菌属(Selenomonas)、Propionospora、或氨基酸球菌属(Acidaminococcus)。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属物种(Megasphaera sp.)、菲利克斯新月形单胞菌(Selenomonas felix)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、或Propionospora属物种细菌。
在一些实施例中，EV来自乳球菌属、普雷沃菌属、双歧杆菌属、或韦荣氏球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自乳酸乳球菌乳脂亚种细菌。
在一些实施例中，EV来自栖组织普雷沃菌(Prevotella histicola)细菌。
在一些实施例中，EV来自动物双歧杆菌细菌。
在一些实施例中，EV来自小韦荣氏球菌细菌。
在一些实施例中，EV来自乳酸乳球菌乳脂亚种细菌。在一些实施例中，乳酸乳球菌乳脂亚种细菌来自与乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A(ATCC指定编号PTA-125368)的核苷酸序列具有至少90％或至少97％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，乳球菌属细菌来自与乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A(ATCC指定编号PTA-125368)的核苷酸序列具有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，乳球菌属细菌来自乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A(ATCC指定编号PTA-125368)。
在一些实施例中，EV来自普雷沃菌属细菌。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌来自包含与该普雷沃菌菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌来自包含与该普雷沃菌菌株B 50329(NRRL登录号B50329)的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌来自普雷沃菌菌株B50329(NRRL登录号B 50329)。
在一些实施例中，EV来自双歧杆菌属细菌。在一些实施例中，双歧杆菌属细菌来自与双歧杆菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125097)的核苷酸序列具有至少90％或至少97％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，双歧杆菌属细菌来自与双歧杆菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125097)的核苷酸序列具有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，双歧杆菌属细菌来自双歧杆菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125097)。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌属细菌。在一些实施例中，韦荣氏球菌属细菌来自与韦荣氏球菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125691)的核苷酸序列具有至少90％或至少97％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，韦荣氏球菌属细菌来自与韦荣氏球菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125691)的核苷酸序列具有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，韦荣氏球菌属细菌来自韦荣氏球菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125691)。
在一些实施例中，EV来自活泼瘤胃球菌细菌。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌来自与活泼瘤胃球菌细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-126695)的核苷酸序列具有至少90％或至少97％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌来自与活泼瘤胃球菌细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-126695)的核苷酸序列具有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌来自活泼瘤胃球菌细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-126695)。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属物种细菌。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌来自与以ATCC指定编号PTA-126770保藏的巨型球菌属物种细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌来自与巨型球菌属物种细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-126770)的核苷酸序列具有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌来自巨型球菌属物种细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-126770)。
在一些实施例中，EV来自Fournierella massiliensis细菌。在一些实施例中，Fournierella massiliensis细菌来自与以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierellamassiliensis细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Fournierella massiliensis细菌来自与以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierella massiliensis细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Fournierella massiliensis细菌来自以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierella massiliensis细菌。
在一些实施例中，EV来自Harryflintia acetispora细菌。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌来自与以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintiaacetispora细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌来自与以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintia acetispora细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌来自以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintia acetispora细菌。
在一些实施例中，EV来自氨基酸球菌科、产碱杆菌科、阿克曼氏菌科、拟杆菌科、双歧杆菌科、伯克霍尔德菌科、Catabacteriaceae科、梭菌科、红蝽菌科、肠杆菌科、肠球菌科、梭杆菌科、毛螺菌科、李斯特菌科、分枝杆菌科、奈瑟菌科、臭杆菌科、颤螺旋菌科、消化球菌科、消化链球菌科、卟啉单胞菌科、普雷沃菌科、丙酸杆菌科、理研菌科、瘤胃球菌科、月形单胞菌科、Sporomusaceae科、链球菌科、链霉菌科、萨特氏菌科、互养菌科、或韦荣氏球菌科。
在一些实施例中，EV来自阿克曼氏菌属、克里斯滕森菌属、布劳特氏菌属、肠球菌属、真杆菌属、罗斯氏菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属、或丹毒丝梭菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自产氢营养型布劳特氏菌、排泄物布劳特氏菌、韦氏布劳特氏菌、粪真杆菌、扭曲真杆菌、直肠真杆菌、粪肠球菌、耐久肠球菌、Enterococcusvillorum、鹑鸡肠球菌；乳酸双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌或短双歧杆菌细菌。
在一些实施例中，EV来自BCG(卡介苗)，副拟杆菌属、布劳特氏菌属、韦荣氏球菌属、唾液乳杆菌、阿加萨杆菌属(Agathobaculum)、活泼瘤胃球菌、解苯副梭菌、Turicibacter sanguinus、伯克霍尔德菌属、类肺炎克雷白氏菌拟肺炎亚种、催产克雷白氏菌、纳西利斯泰泽菌(Tyzzerella nexilis)或奈瑟菌属细菌。
在一些实施例中，EV来自产氢营养型布劳特氏菌(Blautia hydrogenotrophica)细菌。
在一些实施例中，EV来自排泄物布劳特氏菌(Blautia stercoris)细菌。
在一些实施例中，EV来自韦氏布劳特氏菌(Blautia wexlerae)细菌。
在一些实施例中，EV来自鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)细菌。
在一些实施例中，EV来自屎肠球菌(Enterococcus faecium)细菌。
在一些实施例中，EV来自两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)细菌。
在一些实施例中，EV来自短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)细菌。
在一些实施例中，EV来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)细菌。
在一些实施例中，EV来自人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)细菌。
在一些实施例中，EV来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)细菌。
在一些实施例中，EV来自粪居拟杆菌(Bacteroides coprocola)细菌。
在一些实施例中，EV来自Erysipelatoclostridium ramosum细菌。
在一些实施例中，EV来自马赛巨型球菌(Megasphera massiliensis)细菌。
在一些实施例中，EV来自真杆菌属(Eubacterium)细菌。
在一些实施例中，EV来自狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)细菌。
在一些实施例中，EV来自植物乳杆菌细菌。
在一些实施例中，EV来自Negativicutes纲的细菌。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自月形单胞菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自氨基酸球菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自Sporomusaceae科的细菌。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自月形单胞菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Propionospora属的细菌。
在一些实施例中，EV来自氨基酸球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属物种细菌。
在一些实施例中，EV来自菲利克斯月形单胞菌细菌。
在一些实施例中，EV来自肠氨基酸球菌细菌。
在一些实施例中，EV来自Propionospora属物种细菌。
在一些实施例中，EV来自梭菌纲的细菌。
在一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自粪杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Fournierella属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Harryflintia属的细菌。
在一些实施例中，EV来自阿加萨杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自普氏栖粪杆菌(例如，普氏栖粪杆菌菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自Fournierella massiliensis(例如，Fournierellamassiliensis菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自Harryflintia acetispora(例如，Harryflintiaacetispora菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自阿加萨杆菌属物种(例如，阿加萨杆菌属物种菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自阿加萨杆菌属物种的菌株。在一些实施例中，阿加萨杆菌属物种菌株是与阿加萨杆菌属物种菌株A(ATCC保藏号PTA-125892)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、CRISPR序列)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，阿加萨杆菌属物种菌株是阿加萨杆菌属物种菌株A(ATCC保藏号PTA-125892)细菌。
在一些实施例中，EV来自拟杆菌纲[拟杆菌门]的细菌。在一些实施例中，EV来自拟杆菌目的细菌。在一些实施例中，EV来自紫单胞菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自普雷沃菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自拟杆菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，EV来自革兰氏染色阴性的拟杆菌纲细菌。在一些实施例中，EV来自拟杆菌纲的细菌，其中细菌是双层的并且所述细菌是革兰氏染色阴性。
在一些实施例中，EV来自梭菌纲[厚壁菌门]的细菌。在一些实施例中，EV来自真细菌目的细菌。在一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自毛螺菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自消化链球菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自梭菌目XIII科/地位未定41的细菌。在一些实施例中，EV来自梭菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是单层的。在一些实施例中，EV来自革兰氏染色阴性的梭菌纲细菌。在一些实施例中，EV来自梭菌纲、革兰氏阳性染色的细菌。在一些实施例中，EV来自梭菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是单层的并且所述细菌是革兰氏染色阴性。在一些实施例中，EV来自梭菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是单层的并且所述细菌是革兰氏阳性染色。
在一些实施例中，EV来自Negativicutes纲[厚壁菌门]的细菌。在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌目的细菌。在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自月形单孢菌目(Selenomonadales)的细菌。在一些实施例中，EV来自月形单胞菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自Sporomusaceae科的细菌。在一些实施例中，EV来自Negativicutes纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，EV来自革兰氏染色阴性的Negativicutes纲细菌。在一些实施例中，EV来自Negativicutes纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的并且所述细菌是革兰氏染色阴性。
在一些实施例中，EV来自互养菌纲[互养菌门]的细菌。在一些实施例中，EV来自互养菌目的细菌。在一些实施例中，EV来自互养菌科的细菌。在一些实施例中，EV来自互养菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，EV来自革兰氏染色阴性的互养菌纲细菌。在一些实施例中，EV来自互养菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的并且所述细菌是革兰氏染色阴性。
在一些实施例中，EV来自产生代谢产物的细菌，例如，细菌产生丁酸、肌苷、丙酸、或色氨酸代谢产物。
在一些实施例中，EV来自产生丁酸盐的细菌。在一些实施例中，细菌来自布劳特氏菌属；克里斯滕森菌属；粪球菌属；真杆菌属；Lachnosperacea；巨型球菌属；或罗斯氏菌属。
在一些实施例中，EV来自产生肌苷的细菌。在一些实施例中，细菌来自双歧杆菌属；乳杆菌属；或欧陆森氏菌属(Olsenella)。
在一些实施例中，EV来自产生丙酸盐的细菌。在一些实施例中，细菌来自阿克曼氏菌属；拟杆菌属；戴阿利斯特菌属(Dialister)；真杆菌属；巨型球菌属；副拟杆菌属；普雷沃菌属；瘤胃球菌属；或韦荣氏球菌属。
在一些实施例中，EV来自产生色氨酸代谢物的细菌。在一些实施例中，细菌来自乳杆菌属或消化链球菌属。
在一些实施例中，EV来自产生组蛋白脱乙酰基酶3(HDAC3)的抑制剂的细菌。在一些实施例中，细菌来自物种Bariatricus massiliensis、普氏栖粪杆菌、马赛巨型球菌(Megasphaera massiliensis)或肠罗斯氏菌。
在一些实施例中，EV来自以下属的细菌：差异球菌属；芽孢杆菌属；链型杆菌属；棒状杆菌属；贪铜菌属；水栖菌属；微小杆菌属；粪杆菌属；土芽孢杆菌属；甲基杆菌属；微球菌属；摩根氏菌属；变形杆菌属；假单胞菌属；根瘤菌属；或鞘氨醇单胞菌属。
在一些实施例中，EV来自Cutibacterium属的细菌。
在一些实施例中，EV来自物种Cutibacterium avidum的细菌。
在一些实施例中，EV来自乳杆菌属属的细菌。
在一些实施例中，EV来自物种加氏乳杆菌的细菌。
在一些实施例中，EV来自Dysosmobacter属的细菌。
在一些实施例中，EV来自物种Dysosmobacter welbionis的细菌。
在一些实施例中，EV来自明串珠菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自乳杆菌属属的细菌。
在一些实施例中，EV来自以下的细菌：嗜黏蛋白阿克曼氏菌；芽孢杆菌属；布劳特氏菌属；贪铜菌属；水栖菌属；粪杆菌属；乳杆菌属；乳球菌属；微球菌属；摩根氏菌属；丙酸杆菌属；变形杆菌属；根瘤菌属；或链球菌属。
在一些实施例中，EV来自贺氏明串珠菌细菌。
在一些实施例中，EV来自黏蛋白阿克曼氏菌；耐金属贪铜菌；普氏粪杆菌；干酪乳杆菌；植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；植物乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；清酒乳杆菌；或酿脓链球菌细菌。
在一些实施例中，EV来自干酪乳杆菌；植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；植物乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；或清酒乳杆菌细菌。
在一些实施例中，本文所述的EV获自选自下组的属，该组由以下组成：不动杆菌属；异常球菌属；螺杆菌属；红球菌属；食窦魏斯氏菌；差异球菌属；奇异菌属；链型杆菌属；棒状杆菌属；微小杆菌属；土芽孢杆菌属；甲基杆菌属；微球菌属；摩根氏菌属；变形杆菌属；根瘤菌属；罗氏菌属；鞘氨醇单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；和明串珠菌属。
在一些实施例中，本文所述的EV获自选自下组的物种，该组由以下组成：鲍曼不动杆菌；耐辐射异常球菌；幽门螺杆菌；马红球菌；食窦魏斯氏菌；耳炎差异球菌；阴道奇异菌；三井链型杆菌(Catenibacterium mituokai)；谷氨酸棒状杆菌；金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)；嗜热脂肪地杆菌；Methylobacterium jeotgali；藤黄微球菌；摩根摩根氏菌；奇异变形杆菌；豌豆根瘤菌；污水沟罗斯氏菌(Rothia amarae)；少动鞘氨醇单胞菌；和朝鲜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas koreens)。
在一些实施例中，EV来自贺氏明串珠菌细菌。在一些实施例中，EV来自贺氏明串珠菌Ceb-kc-003(KCCM11830P)细菌。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属物种细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株)。
在一些实施例中，EV来自马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 42787、NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株)。
在一些实施例中，EV来自马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为DSM26228的菌株)。
在一些实施例中，EV来自狄氏副拟杆菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 42382的菌株)。
在一些实施例中，EV来自马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株)或其衍生物。参见，例如，WO 2020/120714。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与来自保藏号为NCIMB 43388或NCIMB43389的菌株的马赛巨型球菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是保藏号为NCIMB43388或NCIMB43389的菌株。
在一些实施例中，EV来自保藏号为NCIMB 42787的马赛巨型球菌细菌菌株，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与以保藏号NCIMB 42787保藏的马赛巨型球菌细菌菌株的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是以保藏号NCIMB 42787保藏的菌株。
在一些实施例中，EV来自保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株的巨型球菌属物种细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2020/120714。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是与来自保藏号为NCIMB 43385，NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株的巨型球菌属物种的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株。
在一些实施例中，EV来自保藏号为NCIMB 42382的狄氏副拟杆菌细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，狄氏副拟杆菌细菌是与以保藏号NCIMB42382保藏的狄氏副拟杆菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，狄氏副拟杆菌细菌是以保藏号NCIMB 42382保藏的菌株。
在一些实施例中，EV来自保藏号为DSM 26228的马赛巨型球菌细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与以保藏号DSM 26228保藏的马赛巨型球菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是以保藏号DSM 26228保藏的菌株。
在某些方面，EV是从已经基于某些所需特性选择的细菌中获得的，这些特性是例如降低的毒性和不利影响(例如，通过去除或缺失脂多糖(LPS))，增强的口服递送(例如通过改善酸抗性、粘膜黏附性和/或渗透性和/或针对胆汁酸的抗性、针对抗细菌肽和/或抗体中和的抗性)，靶向所希望的细胞类型(例如M细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、树突细胞、巨噬细胞)，全身性的或在适当生态位中的改善的生物利用度(例如肠系膜淋巴结、派伊尔结、固有层、肿瘤引流淋巴结和/或血液)，增强的免疫调节和/或治疗作用(例如，单独或与另一种治疗剂组合)，增强的免疫活化和/或制造属性(例如，生长特征、产率、更高的稳定性、改善的冻融耐受性、更短的生成时间)。
在某些方面中，EV来自工程改造的细菌，这些工程改造的细菌经修饰以增强某些所需特性。在一些实施例中，对工程改造的细菌进行修饰，使得由其产生的EV将具有降低的毒性和不利影响(例如，通过去除或缺失脂多糖(LPS))，增强的口服递送(例如通过改善酸抗性、粘膜黏附性和/或渗透性和/或针对胆汁酸的抗性、针对抗微生物肽和/或抗体中和的抗性)，靶向所希望的细胞类型(例如M细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、树突细胞、巨噬细胞)，全身性的或在适当生态位中的改善的生物利用度(例如肠系膜淋巴结、派伊尔结、固有层、肿瘤引流淋巴结和/或血液)，增强的免疫调节和/或治疗作用(例如，单独或与另一种治疗剂组合)，增强的免疫活化和/或制造属性(例如，生长特征、产率、更高的稳定性、改善的冻融耐受性、更短的生成时间)。在一些实施例中，本文提供制造此EV的方法。
在某些方面，本文提供了包含来自细菌的EV的溶液和/或干燥形式(或其治疗性组合物)，其用于治疗和/或预防疾病或健康障碍(例如，癌症，自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)，以及制备和/或鉴定这样的溶液和/或干燥形式(或其治疗性组合物)的方法，以及使用这样的溶液和/或干燥形式的方法(例如，单独或与一种或多种其他治疗剂组合用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)。
在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV是经配制的含有溶液和/或干燥形式(例如，冻干物)的治疗性组合物，并且提供与含有从其获得EV的完整细菌的治疗性组合物相当或更高的效力。例如，在相同剂量的EV下(例如，基于颗粒计数或蛋白质含量)，含有溶液和/或粉末的治疗性组合物提供与含有从其获得EV的相同细菌菌株的完整细菌的比较性治疗性组合物相比相当或更高的效力。在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制为含有这样的溶液和/或干燥形式(例如，冻干物)的治疗性组合物，允许施用更高剂量并引发与用含有与获得EV的相同细菌菌株的完整细菌的可比较治疗组合物观察到的相比相当或更大(例如，更有效)的应答。
作为进一步的示例，在一些实施例中，来自细菌的经γ辐照的EV被配制为相同剂量(例如，基于颗粒计数或蛋白质含量)，含有溶液和/或干燥形式(例如，冻干物)的治疗性组合物与含有获得EV的相同菌株的完整细菌的治疗性组合物相比，含有较少的微生物衍生材料(基于颗粒计数或蛋白质含量)，同时为接受这种治疗性组合物的受试者提供同等或更大的治疗益处。
作为另一个实例，在一些实施例中，来自细菌的EV以例如约1x107至约1x1015个颗粒的剂量施用，例如，如通过NTA测量的。在一些实施例中，EV的剂量为约1x105至约7x1013个颗粒(例如，其中通过NTA(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)。在一些实施例中，来自细菌的EV的剂量为约1x1010至约7x1013个颗粒(例如，其中通过NTA(纳米颗粒跟踪分析)确定颗粒计数)。
作为另一个示例，在一些实施例中，来自细菌的EV以例如约5mg至约900mg总蛋白的剂量施用，例如，通过Bradford测定法测量。作为另一个示例，在一些实施例中，来自细菌的EV以例如约5mg至约900mg总蛋白的剂量施用，例如，通过BCA测定法测量。
在某些实施例中，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，这些方法包括向受试者施用本文所述的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在某些实施例中，本文提供治疗患有免疫失调症(例如，自身免疫性疾病、炎症性疾病、变态反应)的受试者，这些方法包括向受试者施用本文所述的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在某些实施例中，本文提供治疗患有代谢疾病的受试者的方法，这些方法包括向受试者施用本文所述的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在某些实施例中，本文提供了治疗患有菌群失调的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在某些实施例中，本文提供了治疗患有神经疾病的受试者的方法，这些方法包括向受试者施用本文所述的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。
在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用抗生素。在一些实施例中，该方法还包括向该受试者施用一种或多种其他癌症治疗(例如，手术移除肿瘤、施用化学治疗剂、施用放射疗法和/或施用癌症免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂、癌症特异性抗体、癌症疫苗、经引发的抗原呈递细胞(primed antigen presenting cell)、癌症特异性T细胞、癌症特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞、免疫活化蛋白和/或佐剂)。在一些实施例中，该方法还包括施用另一种治疗性细菌和/或来自一种或多种其他细菌菌株(例如，治疗性细菌)的细菌的EV。在一些实施例中，所述方法还包括施用免疫抑制剂和/或抗炎剂。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与一种或多种其他免疫效应调节剂组合使用。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用代谢疾病治疗剂。
在某些方面，本文提供了用于单独地或与一种或多种其他(例如，另外的)治疗剂组合地治疗和/或预防疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)或健康障碍的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。
在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的癌症的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用以治疗癌症。在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的免疫障碍(例如，自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏症)的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用以治疗免疫障碍。在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的菌群失调的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与治疗剂组合使用以治疗菌群失调。在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的代谢疾病的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与治疗剂组合使用以治疗代谢疾病。在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的菌群失调的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与治疗剂组合使用以治疗菌群失调。在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的神经疾病的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用以治疗神经障碍。
在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式与抗生素组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与一种或多种其他癌症疗法(例如，手术移除肿瘤、使用化学治疗剂、使用放射疗法和/或使用癌症免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂、癌症特异性抗体、癌症疫苗、经引发的抗原呈递细胞、癌症特异性T细胞、癌症特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞、免疫活化蛋白和/或佐剂)组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与另一种治疗性细菌和/或从一种或多种其他细菌菌株(例如，治疗性细菌)获得的EV组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与一种或多种免疫抑制剂和/或一种或多种抗炎剂组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与一种或多种其他代谢疾病治疗剂组合使用。
在某些方面，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该药物用于单独地或与另一种治疗剂组合地治疗和/或预防疾病(例如癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、生态失调或代谢疾病)。在一些实施例中，所述用途与另一种治疗性细菌和/或从一种或多种其他细菌菌株(例如，治疗性细菌)获得的EV组合使用。
在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该要去用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的癌症。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与另一种癌症治疗剂组合使用。在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于制备药物的用途，该药物用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的免疫障碍(例如，自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏症)。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式可单独使用或与另一种免疫障碍治疗剂组合使用。在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该要去用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的菌群失调。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与另一种菌群失调治疗剂组合使用。在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该要去用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的代谢疾病。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式可单独使用或与另一种代谢疾病治疗剂组合使用。在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该要去用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的菌群失调。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式单独使用或与另一种菌群失调治疗剂组合使用。在某些实施例中，本文提供了治疗性组合物或溶液和/或干燥形式在制备药物中的用途，该要去用于治疗和/或预防受试者(例如，人)的神经疾病。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式可单独使用或与另一种神经障碍治疗剂组合使用。
在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式与抗生素组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式与一种或多种其他癌症疗法(例如，手术移除肿瘤、使用化学治疗剂、使用放射疗法和/或使用癌症免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂、癌症特异性抗体、癌症疫苗、经引发的抗原呈递细胞、癌症特异性T细胞、癌症特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞、免疫活化蛋白和/或佐剂)组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与另一种治疗性细菌和/或从一种或多种其他细菌菌株(例如，治疗性细菌)获得的EV组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与其他一种或多种免疫抑制剂和/或一种或多种抗炎剂组合使用。在一些实施例中，治疗性组合物或溶液和/或干燥形式用于与一种或多种其他代谢疾病治疗剂组合使用。
在一些实施例中，例如如本文所述的包含来自细菌的EV的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式向受试者例如人提供治疗有效量的EV。
在一些实施例中，例如如本文所述的包含来自细菌的EV的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式向受试者(例如人)提供非天然量的治疗有效组分(例如，存在于EV中)。
在一些实施例中，例如如本文所述的包含来自细菌的EV的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式向受试者(例如人)提供非天然数量的治疗有效组分(例如，存在于EV中)。
在一些实施例中，例如如本文所述的包含来自细菌的EV的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式给受试者(例如人)带来一种或多种改变，以例如治疗或预防疾病或健康障碍。
在一些实施例中，例如本文所述的包含来自细菌的EV的治疗性组合物或溶液和/或干燥形式具有显著效用的潜力，例如，影响受试者，例如人，例如，治疗或预防疾病或健康障碍。
在某些方面，本文提供了包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含填充剂，其中该原液用于与来自细菌的细胞外囊泡(EV)(来自本文提供的来源的EV)(例如，其液体制剂)组合使用。
在某些方面，本文提供了包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含填充剂和冻干保护剂，其中该原液用于与来自细菌的细胞外囊泡(EV)(来自本文提供的来源的EV)(例如，其液体制剂)组合使用。
在某些方面，本文提供了包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含冻干保护剂，其中该原液用于与来自细菌的细胞外囊泡(EV)(来自本文提供的来源的EV)(例如，其液体制剂)组合使用。
在一些实施例中，填充剂包含甘露醇、蔗糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll或PVP-K30。
在一些实施例中，填充剂包含甘露醇。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含另外成分。
在一些实施例中，另外成分包含海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、聚蔗糖、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖。
在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇、海藻糖和山梨糖醇。
在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇、海藻糖和山梨糖醇组成。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含海藻糖。
在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由海藻糖组成。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液包含比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含甘露醇和海藻糖，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂包含比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。
在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中甘露醇和海藻糖不以等量存在(例如，甘露醇和海藻糖以非等量存在；例如，基于重量或重量百分比)。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂溶液包含比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂溶液含有比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，赋形剂溶液基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中赋形剂溶液含有比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖更多的甘露醇，例如，基于重量或重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖多至少两倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。在一些实施例中，溶液或干燥形式的赋形剂基本上由甘露醇和海藻糖组成，其中溶液或干燥形式的赋形剂含有比海藻糖多至少三倍的甘露醇，例如，基于重量或基于重量百分比。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇和海藻糖均不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中海藻糖不以5mg/ml至15mg/ml的量存在。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇和海藻糖均不以9mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中甘露醇不以9mg/ml的量存在。在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，其中海藻糖不以9mg/ml的量存在。
在一些实施例中，赋形剂溶液包含甘露醇和海藻糖或基本上由其组成，并且不包含甲硫氨酸。
在某些方面，本文提供了包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方。
在某些方面，本文提供了包含一种或多种赋形剂的原液，其中该原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，其中该原液用于与细胞外囊泡(EV)(例如，其液体制剂)，例如细菌EV(例如来自本文提供的来源的EV)组合使用。
在本文所述的溶液和干燥形式和方法的一些实施例中，液体制剂包含细胞培养上清液，例如细菌细胞培养上清液，例如如本文所述。在本文所述的溶液和干燥形式及方法的一些实施例中，液体制剂包含渗余物，例如浓缩的渗余物，例如如本文所述。
在本文提供的方法的一些实施例中，赋形剂存在于(例如，提供于)赋形剂溶液中。赋形剂溶液的示例包括包含表A、B、C、D、K和P中提供的一种或多种赋形剂的原液。例如，一旦水分已被去除(例如通过干燥)，本文提供的干燥形式含有来自赋形剂溶液(例如原液)的赋形剂。例如，将包含EV的液体制剂与来自表A的配方7a的原液(其包含赋形剂甘露醇和海藻糖)组合以制备溶液。将该溶液干燥以制备干燥形式。该干燥形式包含EV、甘露醇和海藻糖。
附图说明
图1是显示口服施用的在配方7a中制备的普雷沃菌属EV粉末在延迟型超敏反应(DTH)炎症模型中的作用的图。炎症被评估为耳厚度(mm)的变化。
图2是显示颤螺旋菌科的粉末浓度(颗粒数/mg)的图。
图3是显示韦荣氏球菌科的粉末浓度(颗粒数/mg)的图表。
图4是显示普雷沃菌科的粉末浓度(颗粒数/mg)的图表。
图5是显示坦纳菌科的粉末浓度(颗粒数/mg)的图。
图6是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的粉末浓度(颗粒数/mg)的图。
图7是显示颤螺旋菌科的根据DLS的尺寸的图。
图8是显示坦纳菌科的根据DLS的尺寸的图。
图9是显示韦荣氏球菌科的根据DLS的尺寸的图。
图10是显示普雷沃菌科的根据DLS的尺寸的图。
图11是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的根据DLS的尺寸的图。
图12是显示颤螺旋菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图13是显示坦纳菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图14是显示韦荣氏球菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图15是显示普雷沃菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图
图16是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图17是显示颤螺旋菌科的Zave尺寸的图。
图18是显示普雷沃菌科的Zave尺寸的图。
图19是显示坦纳菌科的Zave尺寸的图。
图20是显示韦荣氏球菌科的Zave尺寸的图。
图21是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的Zave尺寸的图。
图22是显示颤螺旋菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图23是显示韦荣氏球菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图24是显示普雷沃菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图25是显示坦纳菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图26是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的根据DLS的电荷(ζ电位)的图。
图27是显示普雷沃菌科粉末的卡尔费休水含量的图。
图28是显示坦纳菌科粉末的卡尔费休水含量的图。
图29是显示颤螺旋菌科粉末的卡尔费休水含量的图。
图30是显示韦荣氏球菌科粉末的卡尔费休水含量的图。
图31是显示梭菌科、毛螺菌科、理研菌科、Sporomusaceae、克里斯滕森菌科、月形单胞菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科粉末的卡尔费休水含量的图。
图32是显示普雷沃菌科的标准化为LPS的IL-10水平的图。对于图32-61，y轴表示相对于10ng/mL LPS板对照的倍数变化。颗粒浓度在x轴上以颗粒数/孔报告(106、107、108和109)。柱代表来自单个实验的一式三份孔的均值和标准偏差。
图33是显示坦纳菌科的标准化为LPS的IL-10水平的图。
图34是显示颤螺旋菌科的标准化为LPS的IL-10水平的图。
图35：韦荣氏球菌科的标准化为LPS的IL-10。
图36是显示梭菌科、毛螺菌科和Sporomuscae的标准化为LPS的IL-10水平的图。
图37是显示理研菌科、月形单胞菌科、克里斯滕森菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的标准化为LPS的IL-10水平的图。
图38是显示坦纳菌科的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图39是显示普雷沃菌科的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图40是显示颤螺旋菌科的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图41是显示韦荣氏球菌科的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图42是显示梭菌科、毛螺菌科和Sporomuscae的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图43是显示理研菌科、月形单胞菌科、克里斯滕森菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的标准化为LPS的IP-10水平的图。
图44是显示坦纳菌科的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图45是显示普雷沃菌科的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图46是显示韦荣氏球菌科的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图47是显示颤螺旋菌科的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图48是显示理研菌科、月形单胞菌科、克里斯滕森菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图49是显示梭菌科、毛螺菌科和Sporomuscae的标准化为LPS的IL-1β水平的图。
图50是显示坦纳菌科的标准化为LPS的TNFα水平的图。
图51是显示普雷沃菌科的标准化为LPS的TNFα水平的图。
图52：颤螺旋菌科的标准化为LPS的TNFα。
图53是显示韦荣氏球菌科的标准化为LPS的TNFα水平的图。
图54是显示梭菌科、毛螺菌科和Sporomuscae的标准化为LPS的TNFα水平的图。
图55：理研菌科、月形单胞菌科、克里斯滕森菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的标准化为LPS的TNFα。
图56是显示颤螺旋菌科的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图57是显示韦荣氏球菌科的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图58是显示坦纳菌科的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图59是显示普雷沃菌科的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图60是显示理研菌科、月形单胞菌科、克里斯滕森菌科、互养菌科、和阿克曼氏菌科的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图61是显示梭菌科、毛螺菌科和Sporomuscae的标准化为LPS的IL-6水平的图。
图62是显示冻干EV粉末的水分含量的图。
图63是显示冻干EV粉末的颗粒计数的图。
图64是显示冻干EV粉末的根据DLS的平均粒径的图。
图65是显示冻干EV粉末的优势亚群的根据DLS的电动电位的图。
图66是显示冻干EV粉末的优势亚群的粒度的图。
具体实施方式
本披露内容提供了含有来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液和干燥形式，以及制备和使用它们的方法。本披露内容还提供了含有这些溶液和/或这些干燥形式的治疗性组合物。在一些实施例中，EV由培养中的细菌细胞分泌(例如，产生)。这样的分泌的细胞外囊泡可称为分泌的微生物细胞外囊泡(smEV)。在一些实施例中，通过处理细菌细胞，例如通过破坏细菌膜的方法，例如超声处理来制备(例如，人工制备)EV。这样的人工制备的可称为加工的微生物细胞外囊泡(pmEV)。
如本文所用，含有细胞外囊泡(EV)(例如，来自细菌)的“干燥形式”是指通过干燥含有EV的溶液而产生的产物。在一些实施例中，干燥例如通过冷冻干燥(冻干)或喷雾干燥进行。在一些实施例中，干燥形式是粉末。如本文所用，粉末是指一种干燥形式并且包括冻干粉末和通过例如喷雾干燥的方法获得的喷雾干燥粉末。
当进行冷冻干燥(冻干)时，所得干燥形式是冻干物。在一些实施例中，干燥形式是冻干物。例如，在一些实施例中，冻干物是冻干粉末或冻干饼。在一些实施例中，将冻干饼碾磨以产生冻干粉末。
在一些实施例中，含有来自细菌的EV的溶液和干燥形式还包含一种或多种赋形剂，例如填充剂和/或冻干保护剂。
在一些实施例中，在制备用于冷冻干燥的细胞外囊泡(EV)时使用填充剂和冻干保护剂。在一些实施例中，将填充剂(包括但不限于蔗糖、甘露醇、聚乙二醇(PEG，例如PEG6000)、环糊精、麦芽糖糊精和葡聚糖(例如葡聚糖40k)添加(例如，作为含有其的原液))至EV(例如，通过从细菌培养物中分离EV获得)的液体制剂以制备作为冻干物的干燥形式，使其干燥后更易于处理(并且可选地，进一步配制为例如治疗性组合物)。在一些实施例中，将冻干保护剂(包括但不限于海藻糖、蔗糖和乳糖)添加(例如，作为含有其的原液)至EV(例如，通过从细菌培养物中分离EV获得)的液体制剂以在冻干或喷雾干燥时保护EV。在一些实施例中，填充剂和/或冻干保护剂包含在赋形剂原液中，该赋形剂原液被添加至EV(例如，纯化和/或浓缩的EV)中以产生溶液，和/或在随后干燥后产生例如该溶液的干燥形式。在一些实施例中，诸如冻干物的干燥形式包含按重量计约5％至约100％的EV固体。在一些实施例中，在干燥(例如通过冻干)之前，总固体，包括EV和赋形剂，为约2重量％至约20重量％。
如本文所述，在一些实施例中，在含有EV的冻干物中，赋形剂占粉末或饼的总质量的约95％至约99％。
如本文所述，在一些实施例中，在含有EV的冻干物中，EV占冻干物总质量的约2％至约6％(例如，约2％至约5％、约2％至约3％、或约3％至约5％)。
在一些实施例中，赋形剂起到维持EV功效和/或减少干燥(例如，冻干)循环时间的作用。在一些实施例中，冻干保护剂在冷冻干燥过程中保护EV(例如，其蛋白质组分)。在一些实施例中，填充剂改善冻干物的特性，例如，用于进一步的下游加工(例如碾磨、混合和/或制备治疗性组合物)的特性。
冻干循环的长度对于成本考虑很重要。临界温度调节剂(例如填充剂和/或冻干保护剂)可以显著缩短干燥时间。在一些实施例中，将含有一种或多种赋形剂(例如，含有填充剂和/或冻干保护剂)的赋形剂原液添加到浓缩的EV(例如，其液体制剂)中以使总固体在约2％至约20％。在一些实施例中，将EV浓缩至5至100倍或体积浓缩因子(VCF)。本文提供的实例以约10％的总固体为目标，实际溶解的固体为约6％至约8％。在一些实施例中，含有一种或多种赋形剂(例如，含有填充剂和/或冻干保护剂)的赋形剂原液(例如，包含表A、B、C、D、K和P之一中提供的配方的赋形剂的原液)在去离子水中制备为原液溶液，并在使用前用0.2mm过滤器进行无菌过滤。在一些实施例中，将原液溶液添加到浓缩的EV中，例如，基于重量高达80％。在一些实施例中，要添加的百分比基于EV的估计固体贡献加上赋形剂原液的溶解固体，以在冻干之前实现所期望的总固体含量。
在冷冻干燥EV后(例如，与包含填充剂的赋形剂，例如如本文所述)，在一些实施例中，所得冻干物(例如，冻干饼)具有均匀的外观，并且是白色至灰白色。在一些实施例中，冷冻干燥后得到的冻干物(例如，冻干饼)是白色至灰白色、细而光滑的颗粒粉末(例如，在碾磨(例如，研磨)冻干饼之后)。在一些实施例中，动态光散射(DLS)用于获得在将冻干物(例如，冻干粉末)重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)后存在的颗粒的流体动力学直径(Z平均，Zave)。在一些实施例中，Zave用于量化稳定剂的有效性。例如，如果理想化的Zave粒径为200nm；因此，具有最接近该粒径的最低Zave的重悬浮EV被认为是足够稳定的。在一些实施例中，粒度范围为例如130nm至300nm。在一些实施例中，动态光散射(DLS)用于获得在将冻干物(例如，冻干粉末)重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)后存在的颗粒的最优势DLS积分峰的均值尺寸。值得注意的是，颗粒的均值尺寸，无论是通过Z平均还是通过最优势DLS积分峰的均值尺寸测量，不一定与冻干前EV的均值尺寸相同。例如，在一些实施例中，在冻干后(例如，在将冻干物重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)中之后)颗粒的平均尺寸大于或小于冻干前的均值EV尺寸，或从细菌培养物中分离或制备EV后的平均尺寸(例如，从细菌培养物中梯度纯化EV后的平均尺寸)。冻干物中的颗粒(在含有EV的溶液被冻干后)含有EV，还可能包括来自培养基的其他组分，例如细胞碎片、LPS和/或蛋白质。
用本文提供的赋形剂和/或条件冷冻干燥后获得的冻干物不具有多孔海绵形状。在一些实施例中，在碾磨后，在用本文提供的赋形剂和/或条件冷冻干燥后获得的冻干物是白色至灰白色、细而光滑的颗粒冻干物粉末。
同样如本文所述，使用本文提供的赋形剂允许包含EV的溶液在更高的温度和更短的干燥时间下冷冻干燥。例如，本文提供的赋形剂和方法允许EV在少于4000分钟内冷冻干燥，例如在约2800至约3200分钟内冷冻干燥。作为另一个例子，在一些实施例中，冷冻步骤在少于225分钟内进行，而不是10至15小时(600至900分钟)。作为另一个示例，在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，一级干燥在约-35℃至约-20℃之间的温度进行，例如约-20℃、约-25℃、约-30℃或约-35℃，而不是-50℃。作为另一个示例，在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，一级干燥进行约42小时或更短时间(例如，2500分钟或更短时间)，而不是例如50-60小时(3000至3600分钟)。在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，总干燥时间为例如约72小时或更短，例如约48至约72小时，例如小于约48小时。在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，一级干燥进行约65小时或更短时间(例如，约60小时或更短时间)。在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，二级干燥进行约12小时或更短(例如，约10至约12小时、约5至约10小时、约10小时或更短、或约5小时或更短)。作为另一个实例，在一些实施例中，使用本文提供的赋形剂和方法，二级干燥在约+20℃至约+30℃之间的温度进行，例如室温，例如约+25℃，而不是例如-20℃。在一些实施例中，使用更短的干燥时间和/或更高的干燥温度使得用于EV的冻干工艺在商业上更可行。
如本文的实例所示，在一些实施例中，EV的冻干物从革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌制备。例如，EV冻干物从以下革兰氏阴性细菌科制备：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；和阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。例如，EV冻干物从以下革兰氏阳性细菌科制备：颤螺旋菌科；梭菌科；毛螺菌科；和克里斯滕森菌科。
在一些实施例中，含有本文所述的EV的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成冷冻干燥完成后具有低于约10％(例如，低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％、低于约5％或低于约4％，例如约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约3％)的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。在一些实施例中，含有本文所述的EV的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成冷冻干燥完成后具有低于约6％(例如，低于约5％或低于约4％，例如约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约3％)的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。在一些实施例中，通过将冻干物制备成具有低于约6％的水分含量，冻干物更适合下游加工，例如用于治疗性组合物。在一些实施例中，通过将冻干物制备成具有低于约6％的水分含量，冻干物例如在储存后具有改进的稳定性。
如本文提供的实例中所述，含有各种细菌科的EV的冻干物的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约2.32％至约5.18％的水分含量。如本文提供的实例中所述，含有颤螺旋菌科的EV的冻干物的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约4.22％至约4.98％的水分含量。如本文提供的实例中所述，含有坦纳菌科的EV的冻干物的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约3.61％至约5.09％的水分含量。如本文提供的实例中所述，含有普雷沃菌科的EV的冻干物的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约3.72％至约5.23％的水分含量。如本文提供的实例中所述，含有韦荣氏球菌科的EV的冻干物的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约2.9％至约4.35％的水分含量。还提供了含有其他细菌科的EV的水分含量在约2.32％至约5.18％之间的冻干物的其他示例。含有本文示例的小韦荣氏球菌菌株的EV的冻干物具有约1.24％至约6.35％的水分含量(通过卡尔费休法测定)。含有本文示例的Fournierellamassiliensis菌株的EV的冻干物具有约1.51％至约7.01％的水分含量(通过卡尔费休法测定)。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的水分含量。可以选择干燥条件以获得所期望的水分含量。
在一些实施例中，含有本文所述的EV的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg冻干物的颗粒数。在一些实施例中，含有本文所述的EV的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成具有约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg冻干物的颗粒数。在一些实施例中，例如，通过NTA和使用Zetaview相机对重悬浮在水中的冻干物确定颗粒数。
如本文提供的实例中所述，含有各种细菌科的EV的冻干物具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg冻干物的颗粒数。如本文提供的实例中所述，含有颤螺旋菌科的EV的冻干物具有约7e8至约2.55e10之间的颗粒数。如本文提供的实例中所述，含有坦纳菌科的EV的冻干物具有约6.7e8至约3.05e8之间的颗粒数。如本文提供的实例中所述，含有普雷沃菌科的EV的冻干物具有约1.65e9至约1.6e10之间的颗粒数。如本文提供的实例中所述，含有韦荣氏球菌科的EV的冻干物具有约7.15e8至约8.5e9之间的颗粒数。含有本文示例的小韦荣氏球菌菌株的EV的冻干物具有约5e9至约1.55e10之间的颗粒数。含有Fournierellamassiliensis菌株的EV的冻干物具有约6.24e9至约2.89e10之间的颗粒数。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的颗粒数。可以选择干燥条件以获得所期望的颗粒数。
在一些实施例中，DLS用于测量颗粒的最优势DLS积分峰的电荷。在一些实施例中，DLS用于测量存在于冻干物中的总颗粒的电荷。值得注意的是，无论是针对总颗粒还是针对最优势DLS积分峰测量的颗粒的电荷，不一定与冻干前EV的电荷相同。例如，在一些实施例中，在冻干后(例如，在将冻干物(例如，冻干粉末)重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)中之后)颗粒的电荷的负性大于或小于冻干前EV的电荷，或从细菌培养物中分离或制备EV后的电荷(例如，从细菌培养物中梯度纯化EV后的电荷)。
如本文提供的实例中所述，各种细菌科的冻干物的颗粒的电荷具有约-29.2至约+2.67mV的电荷(如通过ζ电位(mV)测量，例如，通过使用动态光散射(DLS)来测量冻干物中存在的总颗粒的电荷)。
在一些实施例中，本文所述的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)中的颗粒被制备成具有约-29.2至约+2.67mV的电荷(如通过ζ电位(mV)测量，例如，通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量)。
如本文提供的实例中所述，颤螺旋菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-15.5至约-24.2mV之间，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，坦纳菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-4.5至约-20.7mV之间，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，普雷沃菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-17.4至约+2.67mV之间，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，韦荣氏球菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-7.45至约-29.2mV之间，如通过颗粒的最优势DLS积分峰的电荷的DLS测量。本文示例的小韦荣氏球菌菌株的冻干物的颗粒的电荷在约-7.54至约-13.5mV之间。示例的Fournierella massiliensis菌株的冻干物的颗粒的电荷在约-25.3至约-32mV之间。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的电荷。可以选择干燥条件以获得所期望的电荷。
在一些实施例中，本文所述的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)中的颗粒被制备成具有约-0.929至约-24.80mV的电荷(如通过ζ电位(mV)测量，例如，如通过总颗粒的DLS测量)。
如本文提供的实例中所述，颤螺旋菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-13.3至约-24.80mV之间，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，坦纳菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-0.929至约-20.60mV之间，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，普雷沃菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-1.49至约-11.70mV之间，如通过总颗粒的电荷的DLS测量。如本文提供的实例中所述，韦荣氏球菌科的冻干物的颗粒的电荷在约-1.88至约-19.30mV之间，如通过总颗粒的DLS测量。本文示例的小韦荣氏球菌菌株的冻干物的颗粒的电荷与针对颗粒的最优势DLS积分峰计算的值相似。示例的Fournierellamassiliensis菌株的冻干物的颗粒的电荷与针对颗粒的最优势DLS积分峰计算的值相似。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的电荷。可以选择干燥条件以获得所期望的电荷。
在一些实施例中，本文所述的(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备的)冻干物(例如，冻干粉末)中的颗粒被制备成具有约101nm至约752nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)。在一些实施例中，动态光散射(DLS)用于获得在将冻干物重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)后存在的颗粒的流体动力学直径(Z平均，Zave)。
如本文提供的实例中所述，各种细菌科的冻干物的颗粒的Zave为约101nm至约752nm(将冻干物重悬浮于0.1X PBS后，通过DLS测量，通过DLS测量)。如本文提供的实例中所述，颤螺旋菌科的冻干物的颗粒的Zave在约101nm至约752nm之间。如本文提供的实例中所述，坦纳菌科的冻干物的颗粒的Zave在约133nm至约291nm之间。如本文提供的实例中所述，普雷沃菌科的冻干物的颗粒的Zave在约192nm至约530nm之间。如本文提供的实例中所述，韦荣氏球菌科的冻干物的颗粒的Zave在约106nm至约178nm之间。本文示例的小韦荣氏球菌菌株的冻干物的颗粒的Zave在约130.4nm至约323.5nm之间。示例的Fournierellamassiliensis菌株的冻干物的颗粒的Zave在约132nm至约315.2nm之间。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的Zave。可以选择干燥条件以获得所期望的Zave。
在一些实施例中，本文所述的冻干物(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)中的颗粒被制备为约25.55nm至约458.9nm之间或约25.55nm至约157.40nm之间的最优势DLS积分峰的均值尺寸。在一些实施例中，动态光散射(DLS)用于获得在将冻干物重悬浮于去离子水或缓冲液如PBS(例如，0.1X PBS)后存在的颗粒的最优势DLS积分峰的均值尺寸。
如本文提供的实例中所述，各种细菌科的冻干物的颗粒的最优势DLS积分峰的均值尺寸在约25.55nm至约458.9nm之间或约25.55nm至约157.40nm之间(将冻干物重悬浮于0.1X PBS后，通过DLS测量)。如本文提供的实例中所述，颤螺旋菌科的冻干物的颗粒的均值尺寸在约25.55nm至约134.8nm之间。如本文提供的实例中所述，坦纳菌科的冻干物的颗粒的均值尺寸在约34.81nm至约80.44nm之间。如本文提供的实例中所述，普雷沃菌科的冻干物的颗粒的均值尺寸在约47.38nm至约458.9nm之间。如本文提供的实例中所述，例如，如果排除聚集体，普雷沃氏菌科的冻干物的颗粒的均值尺寸在约47.58nm至约157.40nm之间。如本文提供的实例中所述，韦荣氏球菌科的冻干物的颗粒的均值尺寸在约39.86至约71.30nm之间。本文示例的小韦荣氏球菌菌株的冻干物的颗粒的均值尺寸在约40nm至约78.8nm之间。示例的Fournierella massiliensis菌株的冻干物的颗粒的均值尺寸在约43.72nm至约79.18nm之间。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的均值尺寸。可以选择干燥条件以获得所期望的均值尺寸。
如本文提供的实例中所述，在一些实施例中，含有EV的冻干物例如在U937细胞因子分泌测定中具有生物活性。例如，在一些实施例中，与对照水平相比，如本文所述制备的EV的冻干物影响U937细胞分泌的IL-10、IP-10、IL-1β、TNF-α和IL-6水平。
在一些实施例中，含有本文所述的EV的喷雾干燥粉末(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成喷雾干燥完成后具有低于约10％(例如，低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％、低于约5％或低于约4％，例如约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约3％)的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。在一些实施例中，含有本文所述的EV的喷雾干燥粉末(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成喷雾干燥完成后具有低于约6％(例如，低于约5％或低于约4％，例如约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约3％)的水分含量(例如，如通过卡尔费休法测定)。在一些实施例中，通过将喷雾干燥粉末制备成具有低于约6％的水分含量，喷雾干燥粉末更适合下游加工，例如用于治疗性组合物。在一些实施例中，通过将喷雾干燥粉末制备成具有低于约6％的水分含量，喷雾干燥粉末例如在储存后具有改进的稳定性。
如本文提供的实例中所述，含有栖组织普雷沃菌EV的喷雾干燥粉末的水分含量(通过卡尔费休法测定)具有约2.54％至约8.38％的水分含量。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的水分含量。可以选择干燥条件以获得所期望的水分含量。
在一些实施例中，含有本文所述的EV的喷雾干燥粉末(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成具有约6.7e8至约2.55e10个颗粒/mg喷雾干燥粉末的颗粒数。在一些实施例中，含有本文所述的EV的喷雾干燥粉末(例如，使用本文所述的赋形剂和/或方法制备)被制备成具有约6.7e8至约2.89e10个颗粒/mg喷雾干燥粉末的颗粒数。在一些实施例中，颗粒数例如通过NTA例如使用Zetaview确定。
如本文提供的实例中所述，含有栖组织普雷沃菌EV的喷雾干燥粉末具有约8.05e9至约2.e10个颗粒/mg喷雾干燥粉末的颗粒数。可以选择赋形剂的组分以获得所期望的颗粒数。可以选择干燥条件以获得所期望的颗粒数。
定义
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”应理解为单数或复数。
“佐剂”或“辅助疗法”在广义上是指影响患者或受试者(例如人)中的免疫学或生理学应答的药剂。例如，佐剂可增加抗原随时间或在目的区域(如肿瘤)中的存在，帮助吸收抗原呈递细胞抗原，活化巨噬细胞及淋巴细胞并且支持细胞因子的产生。通过改变免疫应答，佐剂可允许使用较小剂量的免疫相互作用剂以增加特定剂量的免疫相互作用剂的有效性或安全性。例如，佐剂可预防T细胞耗竭且由此增加特定免疫相互作用剂的有效性或安全性。
“施用”在广义上是指组合物(例如药物组合物)在受试者中的施用途径。施用途径的实例包含口服施用、直肠施用、局部施用、吸入(经鼻)或注射。注射施用包括静脉内(IV)、肌内(IM)、肿瘤内(IT)及皮下(SC)施用。在一些实施例中，本文所述的治疗性组合物以任何形式通过任何有效途径施用，包括但不限于瘤内、口服、非经肠、肠内、静脉内、腹膜内、局部、经皮(例如，使用任何标准贴剂)、皮内、经眼、经鼻(鼻内)、局部、非经口(如气溶胶)、吸入、皮下、肌内、颊、舌下、(经)直肠、阴道、动脉内及鞘内、经黏膜(例如，舌下、经舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道及阴道周围)、植入、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内及支气管内。在优选的实施例中，通过以下形式施用本文所述的治疗性组合物：口服、经直肠、肿瘤内、局部、膀胱内、通过注射至引流淋巴结中或毗邻引流淋巴结处、静脉内、通过吸入或气溶胶或经皮下。在另一个优选的实施例中，本文所述的治疗性组合物经口服、肿瘤内或静脉内施用。在另一个优选的实施例中，本文描述的治疗性组合物经口服施用。
“癌症”在广义上是指宿主自有细胞的不受控、异常生长，其会侵袭宿主中的环绕组织及潜在地远离异常细胞生长初始位点的组织。主要种类包含是上皮组织(例如皮肤、鳞状细胞)癌症的癌瘤；是结缔组织(例如骨、软骨、脂肪、肌肉、血管等)癌症的肉瘤；是血液形成组织(例如骨髓组织)癌症的白血病；是免疫细胞癌症的淋巴瘤及骨髓瘤；及包括脑及脊柱组织癌症的中枢神经系统癌症。“一种或多种癌症”和“一种或多种赘瘤”在本文中可互换使用。如本文中所使用，“癌症”是指所有类型的新或复发癌症或赘瘤或恶性肿瘤，包含白血病、上皮癌及肉瘤。癌症的具体实例是：上皮癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型肿瘤。癌症的非限制性实例是以下新或复发癌症：脑癌、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌及髓母细胞瘤。在一些实施例中，癌症包含实体瘤。在一些实施例中，癌症包含转移。
“碳水化合物”是指糖或糖聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”及“寡糖”可互换使用。大部分碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常在分子的每一碳原子上具有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式CnH2nOn。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖及果糖。二糖是两个接合的单糖。示例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖及乳糖。通常，寡糖包含三至六个单糖单元(例如棉子糖、水苏糖)，且多糖包含六个或更多个单糖单元。示例性多糖包含淀粉、糖原及纤维素。碳水化合物可含有经修饰糖单元，例如2’-脱氧核糖，其中去除羟基，2’-氟核糖，其中羟基经氟代替；或N-乙酰基葡萄糖胺，其为葡萄糖的含氮形式(例如2’-氟核糖、脱氧核糖及己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体、端基差向异构体及异构体。
术语“癌”是指上皮细胞的恶性生长，这些上皮细胞往往浸润环绕组织和/或抑制生理学及非生理学细胞死亡信号并产生转移。
“细胞增强”泛指环境中细胞的流入或细胞的扩增，这些细胞在施用组合物之前基本上不存在于环境中并且不存在于组合物本身中。增强环境的细胞包括免疫细胞、基质细胞、细菌及真菌细胞。特别受关注的环境是其中癌细胞驻留或定位的微环境。在一些实例中，该微环境是肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结。在其他实例中，该微环境是癌前组织位点或组合物的局部施用位点或其中该组合物在远程施用后将积聚的位点。
“进化枝”指系统发育树的OTU或成员，它们是系统发育树中的统计有效节点的下游。进化枝包含系统发育树中的一组末端叶，其是不同的单系进化单元且在某种程度上共享序列相似性。
“组合”可以指来自一种来源菌株的EV与另一种药剂，例如，另一种EV(例如，来自另一种菌株)，与细菌(例如，与获得EV的菌株相同或不同的菌株)，或与另一种治疗剂。这种组合可以是物理共存的，既可以在相同的材料或产品中，也可以在物理连接的产品中，以及EV和其他药剂的时间共施用或共定位。
如本文所用，术语“基本上由……组成”(或“基本上地由……组成”)意指限于所列举的要素和/或步骤以及实质上不影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。
“菌群失调”是指肠道或其它身体区域的微生物群或微生物组的状态，包括，例如，黏膜或皮肤表面(或任何其它微生物组生态位)，在该状态下宿主肠道微生物组生态网络(“微生物组”)的正常的多样性和/或功能被破坏。菌群失调可能导致疾病状态，或者仅在某些条件下或仅长期存在时可能是不健康的。菌群失调可能是由于多种因素引起的，包括环境因素、传染原、宿主基因型、宿主饮食和/或压力。菌群失调可能导致：一个或多个细菌类型(例如，厌氧菌)、物种和/或菌株的普遍度发生变化(例如，增加或减少)，宿主微生物组群体组成的多样性发生变化(例如，增加或减少)；导致一个或多个有益效应减少或丧失的一个或多个共生生物群体的变化(例如，增加或减少)；一个或多个病原体(例如，病原细菌)群体的过度生长；和/或仅在某些情况下引起疾病的共生生物的存在、和/或过度生长。
术语“降低”或“消耗”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或不可检测。可降低的性质包含免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或另一物理参数(如耳厚度(例如，在DTH动物模型中)或肿瘤的大小(例如，在动物肿瘤模型中))。
术语“有效剂量”是治疗性组合物的量，其对于特定受试者、组合物和施用方式有效实现所期望的治疗应答且对受试者的毒性最小。
如本文所用，“工程改造的细菌”是通过人类活动已在遗传上自天然状态改变的任何细菌及任何这类细菌的子代。工程改造的细菌包括例如靶向遗传修饰的产物、随机诱变筛选的产物及定向演化的产物。
术语“表位”意指可特异性结合至抗体或T细胞受体的蛋白质决定子。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面分组组成。某些表位可通过抗体能够结合的氨基酸的特定序列来定义。
“细胞外囊泡”(EV)可能是源自细菌的天然产生的囊泡，例如smEV。EV由细菌脂质和/或细菌蛋白质和/或细菌核酸和/或细菌碳水化合物部分构成，并从培养上清液中分离。这些囊泡的自然产生可以通过操纵细菌细胞正在培养的环境(例如，通过培养基或温度改变)来人为地增强(例如，增加)或减少。此外，EV组合物可以被修饰以减少，增加，添加或去除细菌成分或外来物质，以改变功效、免疫刺激、稳定性、免疫刺激能力、稳定性、器官靶向性(例如，淋巴结)、吸收(例如，胃肠道)和/或产率(例如，由此改变功效)。如本文中所使用，术语“经纯化的EV组合物”或“EV组合物”是指EV的制剂，该EV已与源材料或在用以产生该制剂的任何方法中与EV相关的任何材料中发现的至少一种相关物质分离(例如，与至少一种其他细菌组分分离)。也可指针对特定组分已显著富集的组合物。细胞外囊泡也可以从哺乳动物细胞中获得，并且可以从微生物例如古细菌、真菌、显微藻类、原生动物和寄生虫中获得。来自任何这些来源的细胞外囊泡可以制备成如本文所述的溶液和/或干燥形式。细胞外囊泡可以是由细菌制备的人工产生的囊泡，例如pmEV，例如通过化学破坏(例如，通过溶菌酶和/或溶葡萄球菌素)和/或物理破坏(例如，通过机械力)细菌细胞和通过离心和/或超速离心或其他方法将细菌膜组分与细胞内组分分离，也可以制备成如本文所述的溶液和/或干燥形式。
术语“基因”在广义上用于指与生物功能有关的任一核酸。术语“基因”适用于特定基因组序列以及由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。
两种核酸分子的核酸序列间“同一性”可使用已知计算机算法(诸如“FASTA”程序)使用(例如)如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444中的预设参数测定为同一性百分比(其他程序包含GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA Atschul,S.F.等人,J Molec Biol[分子生物学杂志]215:403(1990)；Guide to Huge Computers[巨型计算机指南],Martin J.Bishop编辑，Academic Press[学术出版社],San Diego[圣地亚哥],1994及Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math[工业和应用数学学会应用数学杂志]48:1073)。例如，可使用国家生物技术信息中心数据库(National Center forBiotechnology Information database)的BLAST功能来测定同一性。其他可商业或公开获得的程序包含DNAStar“MegAlign”程序(威斯康星州麦迪逊市(Madison,Wis.))及威斯康星大学遗传学计算机集团(University of Wisconsin Genetics Computer Group)(UWG)“Gap”程序(威斯康星州麦迪逊市(Madison,Wis.))。
如本文中所使用，术语“免疫障碍”是指由免疫系统的活动引起的任何疾病、障碍或疾病症状，包括自身免疫性疾病、炎性疾病及过敏。免疫障碍包括(但不限于)自身免疫性疾病(例如，银屑病、特应性皮炎、狼疮、硬皮病、溶血性贫血、血管炎、一型糖尿病、格雷夫病(Grave’s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、古德帕斯雷综合征(Goodpasture’ssyndrome)、恶性贫血和/或肌病)、炎性疾病(例如，寻常型痤疮、哮喘、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、炎性肠病、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉状瘤病、移植排斥、血管炎和/或间质性膀胱炎)，和/或过敏(例如，食物过敏、药物过敏和/或环境过敏)。
“免疫疗法”是使用受试者的免疫系统以治疗疾病(例如，免疫疾病、炎性疾病、代谢疾病、癌症)的治疗且包括例如检查点抑制剂、癌症疫苗、细胞因子、细胞疗法、CAR-T细胞及树突细胞疗法。
术语“增加”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、4倍、10倍、100倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍、10^6倍和/或10^7倍。可增加的性质包括免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或另一物理参数(如耳厚度(例如，在DTH动物模型中)或肿瘤的大小(例如，在动物肿瘤模型中))。
“先天免疫激动剂”或“免疫佐剂”是特异性靶向先天免疫受体(包括Toll样受体(TLR)、NOD受体、RLR、C型凝集素受体、STING-cGAS通路组分、发炎体复合物)的小分子、蛋白质或其他药剂。例如，LPS是细菌源的或合成的TLR-4激动剂且可使用铝作为免疫刺激佐剂。免疫佐剂是特定种类的较宽泛佐剂或辅助疗法。STING激动剂的实例包括(但不限于)2'3'-cGAMP、3'3'-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、2'2'-cGAMP及2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp)(2'3'-cGAMP的双硫代磷酸酯类似物的Rp、Sp异构物)。TLR激动剂的实例包括但不限于TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLRl0和TLR1l。NOD激动剂的实例包括(但不限于)：N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺(胞壁酰二肽(MDP))、γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)及去胞壁酰肽(desmuramylpeptide(DMP))。
“内转录间隔区”或“ITS”是位于通常用于识别真核物种(特别地，真菌)的共同前体转录本上的结构核糖体RNA(rRNA)之间的一段非功能性RNA。形成核糖体的核的真菌的rRNA经转录为信号基因且由8S、5.8S及28S区域及分别在8S与5.8S之间及5.8S与28S区域之间的ITS4及5组成。如先前描述，在18S与5.8S之间及5.8S与28S区域之间的这类两个双译基因嵌段(intercistronic segment)通过剪接移除且出于条形码的目的在物种之间含有显著变化(Schoch等人,Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS)region asa universal DNAbarcode marker for Fungi[核糖体内转录间隔区(ITS)是真菌的通用DNA条形码标记].PNAS109:6241-6246.2012)。18S rDNA传统上用于系统发育重建，然而ITS可发挥此功能，因为其通常是高度保守的，但含有高变区，这些高变区具有足够的核苷酸多样性来区分大多数真菌的属及物种。
术语“经分离”或“经富集”包含微生物、EV(例如细菌EV)或其他实体或物质已经(1)与最初产生(无论在自然中或在实验环境中)时与的相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工产生、制备、纯化和/或制造。分离的细菌或EV可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其最初关联的其他组分分离。在一些实施例中，分离的细菌或EV是大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯的，例如基本上不含其他组分。
术语“白血病”在广义上包括造血器官/系统的进展性、恶性疾病且其特征通常在于白血球及其前体在血液及骨髓中的异常增殖及发育。
如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、三酸甘油酯、胆固醇、磷脂质、任何形式的脂肪酸(包括游离脂肪酸)。脂肪、油及脂肪酸可为饱和、不饱和(顺式或反式)或部分不饱和(顺式或反式)。
术语“黑色素瘤”意指源自皮肤及其他器官的黑色素细胞系统的肿瘤。
如本文所用的“代谢物”是指在任何细胞或细菌代谢反应中用作底物或作为产物化合物、组合物、分子、离子、辅助因子、催化剂或营养素产生自任何细胞或细菌代谢反应的任何及所有分子化合物、组合物、分子、离子、辅助因子、催化剂或营养素。
“微生物组”广泛地指栖居于受试者或患者的身体部位上或中的微生物。微生物组中的微生物可包括细菌、病毒、真核微生物和/或病毒。微生物组中的个别微生物可以是代谢活性、休眠、潜伏或作为孢子存在，可以浮游形式存在或存在于生物膜中，或可以可持续或短暂的方式存在于该微生物组中。该微生物组可以是共生或健康状态微生物组或疾病状态或菌群失调微生物组。微生物组对受试者或患者而言可以是天然的，或所述微生物组的组分可因健康状态(例如，癌前状态或癌状态)或处理条件(例如，抗生素治疗、暴露于不同微生物)的变化而经调整、引入或消耗。在一些方面中，微生物组出现于黏膜表面。在一些方面中，微生物组是肠道微生物组。在一些方面中，微生物组是肿瘤微生物组。
组织或样品的“微生物组谱(microbiome profile)”或“微生物组签名(microbiome signature)”是指微生物组的细菌组成的至少部分表征。在一些实施例中，微生物组谱指示是否至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个细菌菌株存在于微生物组中或不存在于微生物组中。在一些实施例中，微生物组谱指示是否至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个癌症相关细菌菌株存在于样品中。在一些实施例中，微生物组谱指示样品中检测的各细菌菌株的相对量或绝对量。在一些实施例中，微生物组谱是癌症相关微生物组谱。癌症相关微生物组谱是以比一般群体更大的频率出现于患有癌症的受试者中的微生物组谱。在一些实施例中，相较于正常存在于取自未患癌症的个体的在其他方面当量的组织或样品的微生物组中的细菌，所述癌症相关微生物组谱包含更大数量或量的癌症相关细菌。
关于细菌的“经修饰的”广泛地指自野生型形式已经变化的细菌。细菌修饰可以产生自工程菌。细菌修饰的实例包括遗传修饰、基因表达修饰、表型修饰、配制修饰、化学修饰及剂量或浓度。经改善的性质的实例描述于整个说明书中且包括(例如)减毒、营养缺陷、归巢或抗原性。表型修饰可包括(以实例说明的)细菌于修饰细菌的表型的培养基中生长使得其增加或降低毒力。
如本文中所使用的“肿瘤生物群系(oncobiome)”包含致瘤和/或癌症相关微生物群，其中该微生物群包含病毒、细菌、真菌、原生生物、寄生虫或其他微生物中的一种或多种。
“肿瘤营养性(Oncotrophic)”或“嗜肿瘤(oncophilic)”微生物及细菌是与癌症微环境高度相关联的微生物或存在于癌症微环境中的微生物。它们可被优先选择用于该环境中，优先在癌症微环境中生长或适应该环境。
“运算分类单元”及“OTU”是指系统发生树中的末端叶且通过核酸序列(例如整个基因组或特定基因序列及所有与此核酸序列在物种层面共享序列同一性的序列)来定义。在一些实施例中，特定基因序列可为16S序列或16S序列的一部分。在一些实施例中，对两种实体的整个基因组进行测序并进行比较。在一些实施例中，可以基因方式比较所选区域(例如多基因座序列标签(MLST)、特定基因或基因集)。对于16S而言，整个16S或一些16S可变区中共有≥97％平均核苷酸同一性的OTU可视为相同OTU。参见，例如Claesson MJ,Wang Q,O’Sullivan O,Greene-Diniz R,Cole JR,Ross RP,和O’Toole PW.2010.Comparison of twonext-generation sequencing technologies for resolving highly complexmicrobiota composition using tandem variable16S rRNAgene regions[使用串联可变16S rRNA基因区解析高度复杂的微生物群组成的两种下一代测序技术的比较].NucleicAcids Res[核酸研究]38:e200.Konstantinidis KT,Ramette A及Tiedje JM.2006.Thebacterial species definition in the genomic era[基因组时代的细菌物种类定义].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci[伦敦皇家学会B辑：生物科学哲学学报]361:1929-1940。对于完整基因组、MLST、特定基因(除16S外)或基因集而言，共有≥95％平均核苷酸同一性的OTU可视为相同OTU。例如参见Achtman M及Wagner M.2008.Microbialdiversity and the genetic nature of microbial species[微生物多样性和微生物物种的遗传性质].Nat.Rev.Microbiol.[微生物自然评论]6:431–440.Konstantinidis KT,Ramette A及Tiedje JM.2006.The bacterial species definition in the genomic era[基因组时代的细菌物种类定义].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci[伦敦皇家学会B辑：生物科学哲学学报]361:1929-1940。通常通过比较生物体之间的序列来定义OTU。通常，具有小于95％序列同一性的序列并不视为形成相同OTU的一部分。还可通过核苷酸标志或基因、尤其高度保守基因(例如“管家”基因)或其组合的任一组合来表征OTU。本文提供可分配(例如)属、物种及系统发育进化枝的运算分类单元(OTU)。
如本文所用，如果基因在至少一些条件下在工程改造的细菌中的表达水平高于相同物种的野生型细菌在相同条件下的表达水平，则该基因在细菌中“过度表达”。类似地，如果基因在至少一些条件下在工程改造的细菌中的表达水平低于相同物种的野生型细菌在相同条件下的表达水平，则该基因在细菌中“表达不足”。
术语“多核苷酸”及“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可实施任何功能。多核苷酸的非限制性实例如下：基因或基因片段的编码或非编码区域、定义自连锁分析的多个基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、沉默RNA(siRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离的DNA、任何序列的经分离的RNA、核酸探针及引子。多核苷酸可包括经修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。如果存在，则可在组装聚合物之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。多核苷酸可通过如与标记组分缀合而经进一步修饰。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸可与T核苷酸互换。
如本文所用，物质基本上不含其他组分时是“纯的”。术语“纯化(purify)”或“进行纯化(purifying)”及“纯化的(purified)”是指EV(例如来自细菌的EV)制剂或其他材料已与最初产生或形成(例如，无论在自然中或在实验环境中)时或在初始产生后的任何时间期间与的相关联的至少一些组分分离。若EV制剂或组合物在产生时或产生后与(诸如)一种或多种其他细菌组分分离，则该EV制剂或组合物可被视为经纯化，并且经纯化的微生物或细菌群体可含有其他材料多达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或超过约90％且仍被视为“经纯化”。在一些实施例中，经纯化的EV超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。EV组合物(或制剂)是例如从残余生境产物中纯化的。
如本文中所使用，术语“经纯化的EV组合物”或“EV组合物”是指包括来自细菌的EV的制剂，该EV已与源材料或在用以产生该制剂的任何方法中与EV相关的任何材料中发现的至少一种相关物质分离(例如，与至少一种其他细菌组分分离)。它还指已经显著富集或浓缩的组合物。在一些实施例中，这些EV经浓缩2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或超过10,000倍。
“残余生境产物”是指自受试者内或受试者上的微生物群生境衍生的材料。例如，微生物的发酵培养物可以含有污染物，例如其他微生物菌株或形式(例如细菌、病毒、支原体和/或真菌)。例如，微生物生存于胃肠道的粪便中、皮肤本身上、唾液中、呼吸道的黏液中或泌尿生殖道的分泌物中(即，与微生物群落相关联的生物物质)。基本上不含残余生境产物意指该微生物组合物不再含有与人或动物受试者上或培养物中或人或动物受试者中的微生物环境相关联的生物物质且是100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含或95％不含与该微生物群落相关联的任何污染生物物质。残余生境产物可包括非生物材料(包括未经消化的食物)或其可包括非所需的微生物。基本上不含残余生境产物亦可意指该微生物组合物不含有来自培养物污染物或人或动物的可检测细胞且意指仅微生物细胞是可检测的。在一项实施例中，大体上不含残余生境产物亦可意指所述微生物组合物不含有可检测的病毒(包括细菌、病毒(例如，噬菌体))、真菌、支原体污染物。在一些实施例中，这意味着与微生物细胞相比，该微生物组合物中少于1x10-2％、1x10-3％、1x10-4％、1x10-5％、1x10-6％、1x10-7％、1x10-8％的有活力细胞是人或动物细胞。达到此纯度的方法有很多，这些方法中无任何一者是限制性的。因此，污染物可经由通过在固体培养基上对单菌落进行多个画线步骤，直至来自系列性单菌落的复制(诸如但不限于两个)画线已显示仅单一菌落形态来分离所需成分而减少。可替代地，污染物的减少可通过多轮连续稀释至单一所需细胞(例如，10-8或10-9的稀释)，诸如通过多个10倍连续稀释完成。此可通过显示多个经分离的菌落具有相似细胞形状及革兰氏染色行为进一步证实。用于证实足够的纯度的其他方法包括遗传分析(例如，PCR、DNA测序)、血清学及抗原分析、酶及代谢分析及使用仪器的方法，诸如使用自污染物区分所需成分的试剂的流式细胞术。
术语“肉瘤”通常是指如胚胎结缔组织等物质组成的肿瘤且通常由包埋于原纤维、异质或均质物质中的紧密堆积细胞构成。
如本文所用，“特异性结合”是指抗体能够结合至预定抗原或多肽能够结合至其预定结合配偶体。通常，抗体或多肽以对应于约10-7M或更小KD的亲和力特异性结合至其预定抗原或结合配偶体，且以相对于结合至非特异性及不相关抗原/结合配偶体(例如BSA、酪蛋白)小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍的其亲和力的亲和力(如通过KD所表示)结合至预定抗原/结合配偶体。可替代地，特异性结合更广泛地适用于二组分系统，其中一种组分是蛋白质、脂质或碳水化合物或其组合且与是蛋白质、脂质、碳水化合物或其组合的第二组分以特定方式接合。
如本文所用，“原液”是指包含一种或多种赋形剂但不含活性成分(例如细胞外囊泡)的溶液。在一些实施例中，原液用于将一种或多种赋形剂引入包含EV的制剂(例如液体制剂)中。在一些实施例中，原液是包含已知量的一种或多种赋形剂的浓缩溶液。在一些实施例中，将原液与包含EV的制剂(例如液体制剂)组合以制备本文提供的溶液或干燥形式。
“菌株”是指具有基因签名的细菌物种的成员，从而其可与相同细菌物种的密切相关成员区分开来。基因特征可为不存在至少一种基因的全部或一部分、不存在至少一个调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)的全部或一部分、不存在(“消除”)至少一种天然质粒、存在至少一种重组基因、存在至少一种突变基因、存在至少一种外来基因(衍生自另一物种的基因)、存在至少一种突变调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)、存在至少一种非天然质粒、存在至少一种抗生素抗性盒或其组合。可通过PCR扩增且任选地随后进行一个或多个目的基因组区域或全基因组的DNA测序来鉴别不同菌株之间的基因签名。如果一种菌株(与相同物种的另一种菌株相比)已获得或失去抗生素抗性或获得或失去生物合成能力(例如营养缺陷型菌株)，则可通过选择或反选择分别使用抗生素或营养物/代谢物来区分菌株。
术语“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物。描述为“有需要”的受试者或患者是指需要治疗(或预防)疾病的人。哺乳动物(即哺乳类动物)包括人、实验室动物(例如灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪)及家庭宠物(例如狗、猫、啮齿类动物)。受试者可以是人。受试者可为非人哺乳动物，包括但不限于：狗、猫、牛、马、猪、驴、山羊、骆驼、小鼠、大鼠、天竺鼠、绵羊、骆马、猴、大猩猩或黑猩猩。受试者可为健康的，或可患有任一发展阶段的癌症，其中任一阶段由癌症相关或致病病原体引起或伺机性地支持所述病原体，或受试者可处于发生癌症或向其他受试者传播癌症相关或癌症致病病原体的风险中。在一些实施例中，受试者患有肺癌、膀胱癌、前列腺癌、浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌、默克尔细胞癌、唾液腺癌、卵巢癌和/或黑色素瘤。受试者可以具有肿瘤。受试者可以具有展示增强的大型胞饮作用的肿瘤，其中此过程的潜在基因组学包含Ras活化。在一些实施例中，受试者患有另一种癌症。在一些实施例中，受试者已经接受癌症疗法。
如本文所用，术语“治疗剂”是指用于治疗用途的药剂。在一些实施例中，治疗剂是包含可用于治疗和/或预防疾病和/或病症的EV的组合物(“EV组合物”)。在一些实施例中，治疗剂是药物制剂。在一些实施例中，医药产品、医疗食品、食物产品或膳食补充剂包含治疗剂。在一些实施例中，治疗剂在溶液中，并且在一些实施例中，为干燥形式。干燥形式的实施例可以例如通过冻干或喷雾干燥来生产。在一些实施例中，治疗剂的干燥形式是冻干饼或粉末。在一些实施例中，治疗剂的干燥形式是喷雾干燥粉末。
如本文所用，术语“治疗性组合物”或“药物组合物”是指包含治疗有效量的治疗剂的组合物(例如本文所述的EV组合物)。在一些实施例中，治疗性组合物是(或存在于)医药产品、医疗食品、食物产品或膳食补充剂。
如本文中所使用，术语“治疗”受试者疾病或“治疗”患有或怀疑患有疾病的受试者是指对受试者施用医药治疗(例如，施用一种或多种药剂)，从而降低至少一种疾病症状或预防其恶化。因此，在一个实施例中，“治疗”尤其是指延迟进展、促进缓解、诱导缓解、增大缓解、加速恢复、增加功效或降低替代治疗的抗性，或其组合。如本文所用，术语“预防”受试者中的疾病是指对受试者施用药物治疗，例如，施用一种或多种药剂，使得疾病的至少一个症状的发作被延迟或预防。
细菌细胞外囊泡
在某些方面，本文提供了包含细胞外囊泡(EV)的溶液和/或干燥形式以及治疗性组合物。在某些方面，本文提供了溶液和/或干燥形式以及治疗性组合物，其包含从细菌获得的EV。
可以基于本领域中鉴定具有目的特性的细菌的测定来选择作为EV来源繁殖的细菌。例如，在一些实施例中，选择具有调节宿主免疫应答和/或影响细胞因子水平的能力的细菌。例如，如本文所述，选择在U937测定中影响细胞因子水平(例如TNFα、IL10、IL-6、IL-1β和/或IP-10水平)的细菌菌株。
在一些实施例中，EV选自与粘液相关的细菌菌株。在一些实施例中，粘液与肠腔相关。在一些实施例中，粘液与小肠相关。在一些实施例中，粘液与呼吸道有关。
在一些实施例中，EV选自与上皮组织相关的细菌菌株，例如口腔、肺、鼻或阴道。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌，其源自人小肠。
在一些实施例中，EV来自人共生细菌，其源自人小肠并且在那里与外粘液层相关联。
表1、表2、表3和/或表4和/或整个说明书的其他地方(例如，表J或实例10)中提供了可用作本文所述EV来源的细菌的分类群(例如纲、目、科、属、种和/或菌株)的示例。在一些实施例中，细菌菌株是具有与本文提供(例如说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出)的菌株有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的基因组的细菌菌株。在一些实施例中，这些EV来自肿瘤营养性细菌。在一些实施例中，这些EV来自免疫刺激细菌。在一些实施例中，这些EV来自免疫抑制细菌。在一些实施例中，这些EV来自免疫调节性细菌。在某些实施例中，EV产生自本文提供的细菌菌株的组合。在一些实施例中，所述组合是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50个细菌菌株的组合。在一些实施例中，该组合包括EV，其来自本文提供(例如说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出)的细菌菌株和/或具有与本文提供(例如说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出)的菌株具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的基因组的细菌菌株。在一些实施例中，来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的细菌可用作EV的来源。
在一些实施例中，EV从革兰氏阴性细菌获得。
在一些实施例中，革兰氏阴性细菌属于Negativicutes纲。Negativicutes代表微生物的一个独特纲，因为它们是厚壁菌门中唯一的双层成员。这些厌氧生物可以在环境中发现，并且是人口腔和胃肠道的正常共生体。由于这些生物体具有外膜，因此对该纲的EV产率进行了研究。发现在以每个细胞为基础，这些细菌产生大量的囊泡(10-150EV/细胞)。来自这些生物的EV在体外测定中具有广泛的刺激性和高效力。对其在几种肿瘤学和炎症体内模型中治疗性应用的研究显示了其治疗性潜力。Negativicutes纲包括以下科：韦荣氏球菌科、月形单胞菌科、氨基酸球菌科和Sporomusaceae科。Negativicutes纲包括巨型球菌属、月形单胞菌科属、Propionospora属和氨基酸球菌属。示例性Negativicutes物种包括但不限于巨型球菌属物种、菲利克斯月形单胞菌、肠氨基酸球菌、和Propionospora属物种。
在一些实施例中，EV从革兰氏阳性细菌获得。
在一些实施例中，EV来自耐氧细菌。
在一些实施例中，EV来自单层细菌。
在一些实施例中，EV来自双层细菌。
在一些中，EV来自以下科的细菌：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在一些实施例中，EV来自以下科的细菌：颤螺旋菌科；梭菌科；毛螺菌科；或克里斯滕森菌科。
在一些实施例中，EV来自普雷沃菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自副拟杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌菌株。
在一些实施例中，EV来自坦纳菌科的细菌菌株。
在一些实施例中，EV来自普雷沃菌科的细菌菌株。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌菌株。
在一些实施例中，EV来自实例10中评估的细菌科。在一些实施例中，EV来自实例10中评估的细菌属。在一些实施例中，EV来自实例10中评估的细菌物种。
在一些实施例中，EV从需氧细菌获得。
在一些实施例中，EV从厌氧细菌获得。在一些实施例中，厌氧细菌包含专性厌氧菌。在一些实施例中，厌氧细菌包含兼性厌氧菌。
在一些实施例中，EV从嗜酸细菌获得。
在一些实施例中，EV从嗜碱细菌获得。
在一些实施例中，EV从嗜中性细菌获得。
在一些实施例中，EV从难养细菌获得。
在一些实施例中，EV从非难养细菌获得。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是冻干的。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌被γ辐照(例如，以17.5或25kGy)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌被UV辐照。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌被热灭活(例如，在50℃下两小时或在90℃下两小时)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌被酸处理。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌被喷射氧气(例如，在0.1vvm下持续两小时)。
在一些实施例中，EV是冻干的。
在一些实施例中，EV被γ辐照(例如，以17.5或25kGy)。
在一些实施例中，EV被UV辐照。
在一些实施例中，EV是热灭活的(例如，在50℃保持两小时或在90℃保持两小时)。
在一些实施例中，EV被酸处理。
在一些实施例中，EV被喷射氧气(例如，以0.1vvm持续两小时)。
生长阶段可影响细菌和/或细菌产生的EV的数量或性质。例如，在本文提供的EV制备方法中，可以例如在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时从培养物中分离EV。
在某些实施例中，本文所述的EV是从专性厌氧细菌中获得的。专性厌氧细菌的实例包括革兰氏阴性杆菌(包括拟杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属、嗜胆菌属及萨特氏菌属物种)、革兰氏阳性球菌(主要为消化链球菌属)、革兰氏阳性孢子形成菌(梭菌属)、非孢子形成杆菌(放线菌属、丙酸杆菌属、真杆菌属、乳杆菌属及双歧杆菌属)及革兰氏阴性球菌(主要为韦荣氏球菌属)。在一些实施例中，专性厌氧细菌是选自由以下组成的组的属的细菌：阿加萨杆菌属、奇异菌属(Atopobium)、布劳特氏菌属(Blautia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、迪尔莫菌属(Dielma)、长链菌属(Longicatena)、副梭菌属(Paraclostridium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)及泰泽菌属(Tyzzerella)。
Negativicutes纲包括以下科：韦荣氏球菌科、月形单胞菌科、氨基酸球菌科和Sporomusaceae科。Negativicutes纲包括巨型球菌属、月形单胞菌科属、Propionospora属和氨基酸球菌属。示例性Negativicutes物种包括但不限于巨型球菌属物种、菲利克斯月形单胞菌、肠氨基酸球菌、和Propionospora属物种。
在一些实施例中，EV来自Negativicutes纲的细菌。
在一些实施例中，EV来自韦荣氏球菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自月形单胞菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自氨基酸球菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自Sporomusaceae科的细菌。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自月形单胞菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Propionospora属的细菌。
在一些实施例中，EV来自氨基酸球菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自巨型球菌属物种细菌。
在一些实施例中，EV来自菲利克斯月形单胞菌细菌。
在一些实施例中，EV来自肠氨基酸球菌细菌。
在一些实施例中，EV来自Propionospora属物种细菌。
微生物梭菌纲中的颤螺旋菌科是脊椎动物的常见共生生物。
在一些实施例中，EV来自梭菌纲的细菌。
在一些实施例中，EV来自颤螺旋菌科的细菌。
在一些实施例中，EV来自粪杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Fournierella属的细菌。
在一些实施例中，EV来自Harryflintia属的细菌。
在一些实施例中，EV来自阿加萨杆菌属的细菌。
在一些实施例中，EV来自普氏栖粪杆菌(例如，普氏栖粪杆菌菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自Fournierella massiliensis(例如，Fournierellamassiliensis菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自Harryflintia acetispora(例如，Harryflintiaacetispora菌株A)细菌。
在一些实施例中，EV来自阿加萨杆菌属物种(例如，阿加萨杆菌属物种菌株A)细菌。
在一些实施例中，本文描述的EV获得自选自由以下组成的组的属的细菌：埃希氏杆菌属、克雷白氏菌属、乳杆菌属、志贺氏菌属及葡萄球菌属。
在一些实施例中，本文所述的EV获自选自由以下组成的组的物种：马赛布劳特氏菌(Blautia massiliensis)、解苯副梭菌(Paraclostridium benzoelyticum)、Dielmafastidiosa、Longicatena caecimuris、乳酸乳球菌乳脂亚种、纳西利斯泰泽菌、Hungatella effluvia、类肺炎克雷伯氏菌拟肺炎亚种(Klebsiella quasipneumoniaesubsp.Similipneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、和当别町韦荣氏球菌(Veillonella tobetsuensis)。
在一些实施例中，本文描述的EV获得自普雷沃菌属细菌，所述普雷沃菌属细菌选自由以下组成的组：阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌和真空腔普雷沃菌。
在一些实施例中，本文描述的EV获得自细菌菌株，所述细菌菌株包含基因组序列，所述基因组序列与表3中提供的以ATCC保藏号保藏的细菌菌株的基因组序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)。在一些实施例中，本文描述的EV获得自细菌菌株，所述细菌菌株包含16S序列，所述基因组序列与表3中提供的以ATCC保藏号保藏的细菌菌株的16S序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)。
Negativicutes纲包括以下科：韦荣氏球菌科、月形单胞菌科、氨基酸球菌科和Sporomusaceae科。Negativicutes纲包括巨型球菌属、月形单胞菌科属、Propionospora属和氨基酸球菌属。示例性Negativicutes物种包括但不限于巨型球菌属物种、菲利克斯月形单胞菌、肠氨基酸球菌、和Propionospora属物种。
Negativicutes纲包括以下科：韦荣氏球菌科、月形单胞菌科、氨基酸球菌科和Sporomusaceae科。Negativicutes纲包括巨型球菌属、月形单胞菌科属、Propionospora属和氨基酸球菌属。示例性Negativicutes物种包括但不限于巨型球菌属物种、菲利克斯月形单胞菌、肠氨基酸球菌、和Propionospora属物种。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Negativicutes纲。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于韦荣氏球菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于月形单胞菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于氨基酸球菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Sporomusaceae科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于巨球形菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于月形单胞菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Propionospora属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于氨基酸球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是巨型球菌属物种细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是菲利克斯月形单胞菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是肠氨基酸球菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Propionospora属物种细菌。
微生物梭菌纲中的颤螺旋菌科是脊椎动物的常见共生生物。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌纲。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于颤螺旋菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于粪杆菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Fournierella属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Harryflintia属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于阿加萨杆菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌普氏栖粪杆菌(普氏栖粪杆菌菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Fournierella massiliensis(例如，Fournierella massiliensis菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Harryflintia acetispora(例如，Harryflintia acetispora菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是阿加萨杆菌属物种(例如，阿加萨杆菌属物种菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是选自由以下组成的组的属的细菌：埃希氏杆菌属、克雷白氏菌属、乳杆菌属、志贺氏菌属及葡萄球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是选自由以下组成的组的物种：马赛布劳特氏菌(Blautia massiliensis)、解苯副梭菌(Paraclostridium benzoelyticum)、Dielmafastidiosa、Longicatena caecimuris、乳酸乳球菌乳脂亚种、纳西利斯泰泽菌、Hungatella effluvia、类肺炎克雷伯氏菌拟肺炎亚种(Klebsiella quasipneumoniaesubsp.Similipneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、和当别町韦荣氏球菌(Veillonella tobetsuensis)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是普雷沃菌属细菌，所述普雷沃菌属细菌选自由以下组成的组：阿尔伯普雷沃菌、羊水普雷沃菌、卑尔根普雷沃菌、二路普雷沃菌、短普雷沃菌、布氏普雷沃菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、牙普雷沃菌、栖牙普雷沃菌、解糖胨普雷沃菌、栖组织普雷沃菌、中间普雷沃菌、小斑点普雷沃菌、马斯普雷沃菌、产黑普雷沃菌、彩虹普雷沃菌、多形普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口腔普雷沃菌、口普雷沃菌、龈炎普雷沃菌、苍白普雷沃菌、唾液普雷沃菌、斯特塞拉普雷沃菌、坦纳普雷沃菌、蒂莫普雷沃菌、空肠普雷沃菌、橙色普雷沃菌、保氏普雷沃菌、着色普雷沃菌、人体普雷沃菌、丹塔普雷沃菌、栖居普雷沃菌、斐氏普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、解肝素普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、嗜糖普雷沃菌、南锡普雷沃菌、稻普雷沃菌、沼泽普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、解糖普雷沃菌、靶心普雷沃菌、赛赫普雷沃菌、动胶普雷沃菌和真空腔普雷沃菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是以下细菌菌株，所述细菌菌株包含基因组序列，所述基因组序列与表3中提供的以ATCC保藏号保藏的细菌菌株的基因组序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是如下细菌菌株，所述细菌菌株包含如下16S序列，所述16S序列与表3中提供的以ATCC保藏号保藏的细菌菌株的16S序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)。
Negativicutes纲包括以下科：韦荣氏球菌科、月形单胞菌科、氨基酸球菌科和Sporomusaceae科。Negativicutes纲包括巨型球菌属、月形单胞菌科属、Propionospora属和氨基酸球菌属。示例性Negativicutes物种包括但不限于巨型球菌属物种、菲利克斯月形单胞菌、肠氨基酸球菌、和Propionospora属物种。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Negativicutes纲。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于韦荣氏球菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于月形单胞菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于氨基酸球菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Sporomusaceae科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；克里斯滕森菌科；或阿克曼氏菌科(Akkermaniaceae)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于巨球形菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于月形单胞菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Propionospora属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于氨基酸球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是巨型球菌属物种细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是菲利克斯月形单胞菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是肠氨基酸球菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Propionospora属物种细菌。
微生物梭菌纲中的颤螺旋菌科是脊椎动物的常见共生生物。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌纲。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于颤螺旋菌科。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于粪杆菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Fournierella属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Harryflintia属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于阿加萨杆菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌普氏栖粪杆菌(普氏栖粪杆菌菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Fournierella massiliensis(例如，Fournierella massiliensis菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Harryflintia acetispora(例如，Harryflintia acetispora菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是阿加萨杆菌属物种(例如，阿加萨杆菌属物种菌株A)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是阿加萨杆菌属物种菌株。在一些实施例中，阿加萨杆菌属物种菌株是与阿加萨杆菌属物种菌株A(ATCC保藏号PTA-125892)的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、CRISPR序列)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，阿加萨杆菌属物种菌株是阿加萨杆菌属物种菌株A(ATCC保藏号PTA-125892)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于拟杆菌纲[拟杆菌门]。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于拟杆菌目的细菌。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于紫单胞菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于普雷沃菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是拟杆菌纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是革兰氏染色阴性的拟杆菌纲细菌。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是拟杆菌纲的细菌，其中细菌是双层的并且所述细菌是革兰氏染色阴性。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是梭菌纲[厚壁菌门]的细菌。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于真细菌目。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于颤螺旋菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于毛螺菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于消化链球菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌目XIII科/地位未定41。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌纲，其中细菌的细胞被膜结构是单层的。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于革兰氏染色阴性的梭菌纲。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于革兰氏染色阳性的梭菌纲。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌纲，其中细菌的细胞被膜结构是单层的并且细菌染色革兰氏阴性。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于梭菌纲，其中细菌的细胞被膜结构是单层的并且细菌染色革兰氏阳性。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Negativicutes纲[厚壁菌门]。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于韦荣氏球菌目。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于韦荣氏球菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是月形单孢菌目。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是月形单胞菌科的细菌。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Sporomusaceae科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Negativicutes纲，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是从其获得EV的细菌是EV来自Negativicutes纲的细菌，其中细菌的细胞被膜结构是双层的并且该细菌是革兰氏染色阴性。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于互养菌纲[互养菌门]。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是互养菌目。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于互养菌科。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于互养菌纲，其中细菌的细胞被膜结构是双层的。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于革兰氏染色阴性的互养菌纲。在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于互养菌纲，其中细菌的细胞被膜结构是双层的并且细菌染色革兰氏阴性。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌来自一种细菌菌株，例如本文提供的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌来自一种细菌菌株(例如，本文提供的菌株)或来自多于一种本文提供的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是乳酸乳球菌乳脂亚种细菌，例如来自与乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A(ATCC指定编号PTA-125368)的核苷酸序列具有至少90％或至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是乳球菌属细菌，例如乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A(ATCC指定编号PTA-125368)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是普雷沃菌属细菌，例如包含与普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)的核苷酸序列具有至少90％或至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是普雷沃菌属细菌，例如普雷沃菌属菌株B 50329(NRRL登录号B 50329)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是双歧杆菌属细菌，例如来自与双歧杆菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125097)的核苷酸序列具有至少90％或至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是双歧杆菌属细菌，例如以ATCC指定编号PTA-125097保藏的双歧杆菌属细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是韦荣球氏菌属细菌，例如来自与韦荣球氏菌属细菌(保藏为ATCC指定编号PTA-125691)的核苷酸序列具有至少90％或至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是韦荣球氏菌属细菌，例如以ATCC指定编号PTA-125691保藏的韦荣球氏菌属细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是活泼瘤胃球菌细菌。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌是与以ATCC指定编号PTA-126695保藏的活泼瘤胃球菌细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌是与以ATCC指定编号PTA-126695保藏的活泼瘤胃球菌细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，活泼瘤胃球菌细菌是以ATCC指定编号PTA-126695保藏的活泼瘤胃球菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是巨型球菌属物种细菌。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是与以ATCC指定编号PTA-126770保藏的巨型球菌属物种细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是与以ATCC指定编号PTA-126770保藏的巨型球菌属物种细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是以ATCC指定编号PTA-126770保藏的巨型球菌属物种细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Fournierella massiliensis细菌。在一些实施例中，Fournierella massiliensis细菌是与以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierella massiliensis细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Fournierella massiliensis细菌是与以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierella massiliensis细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Fournierellamassiliensis细菌是以ATCC指定编号PTA-126696保藏的Fournierella massiliensis细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Harryflintia acetispora细菌。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌是与以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintia acetispora细菌的核苷酸序列有至少90％(或至少97％)基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌是与以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintia acetispora细菌的核苷酸序列有至少99％基因组、16S和/或CRISPR序列同一性的菌株。在一些实施例中，Harryflintia acetispora细菌是以ATCC指定编号PTA-126694保藏的Harryflintia acetispora细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生代谢产物的细菌，例如，细菌产生丁酸、肌苷、丙酸、或色氨酸代谢产物。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生丁酸盐的细菌。在一些实施例中，细菌来自布劳特氏菌属；克里斯滕森菌属；粪球菌属；真杆菌属；Lachnosperacea；巨型球菌属；或罗斯氏菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生肌苷的细菌。在一些实施例中，细菌来自双歧杆菌属；乳杆菌属；或欧陆森氏菌属(Olsenella)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生丙酸盐的细菌。在一些实施例中，细菌来自阿克曼氏菌属；拟杆菌属；戴阿利斯特菌属(Dialister)；真杆菌属；巨型球菌属；副拟杆菌属；普雷沃菌属；瘤胃球菌属；或韦荣氏球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生色氨酸代谢物的细菌。在一些实施例中，细菌来自乳杆菌属或消化链球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是产生组蛋白脱乙酰基酶3(HDAC3)的抑制剂的细菌。在一些实施例中，细菌来自物种Bariatricus massiliensis、普氏栖粪杆菌、马赛巨型球菌或肠罗斯氏菌。
在一些实施例中，细菌来自差异球菌属；芽孢杆菌属；链型杆菌属；棒状杆菌属；贪铜菌属；水栖菌属；微小杆菌属；粪杆菌属；土芽孢杆菌属；甲基杆菌属；微球菌属；摩根氏菌属；变形杆菌属；假单胞菌属；根瘤菌属；或鞘氨醇单胞菌属。在一些实施例中，细菌来自Cutibacterium属。在一些实施例中，细菌来自物种Cutibacterium avidum。在一些实施例中，细菌来自乳杆菌属。在一些实施例中，细菌来自物种加氏乳杆菌。在一些实施例中，细菌来自Dysosmobacter属。在一些实施例中，细菌来自物种Dysosmobacter welbionis。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于差异球菌属；芽孢杆菌属；链型杆菌属；棒状杆菌属；贪铜菌属；水栖菌属；微小杆菌属；粪杆菌属；土芽孢杆菌属；甲基杆菌属；微球菌属；摩根氏菌属；变形杆菌属；假单胞菌属；根瘤菌属；或鞘氨醇单胞菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于Cutibacterium属。在一些实施例中，从其获得EV的细菌是Cutibacterium avidum细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于明串珠菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于乳杆菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌属于阿克曼氏菌属；芽孢杆菌属；布劳特氏菌属；贪铜菌属；水栖菌属；粪杆菌属；乳杆菌属；乳球菌属；微球菌属；摩根氏菌属；丙酸杆菌属；变形杆菌属；根瘤菌属；或链球菌属。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是贺氏明串珠菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是黏蛋白阿克曼氏菌；耐金属贪铜菌；普氏粪杆菌；干酪乳杆菌；植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；植物乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；清酒乳杆菌；或酿脓链球菌细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是干酪乳杆菌；植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；植物乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；或清酒乳杆菌细菌。
在一些实施例中，本文所述的EV获自选自下组的属，该组由以下组成：不动杆菌属；异常球菌属；螺杆菌属；红球菌属；食窦魏斯氏菌；差异球菌属；奇异菌属；链型杆菌属；棒状杆菌属；微小杆菌属；土芽孢杆菌属；甲基杆菌属；微球菌属；摩根氏菌属；变形杆菌属；根瘤菌属；罗氏菌属；鞘氨醇单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；和明串珠菌属。
在一些实施例中，本文所述的EV获自选自下组的物种，该组由以下组成：鲍曼不动杆菌；耐辐射异常球菌；幽门螺杆菌；马红球菌；食窦魏斯氏菌；耳炎差异球菌；阴道奇异菌；三井链型杆菌(Catenibacterium mituokai)；谷氨酸棒状杆菌；金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)；嗜热脂肪地杆菌；Methylobacterium jeotgali；藤黄微球菌；摩根摩根氏菌；奇异变形杆菌；豌豆根瘤菌；污水沟罗斯氏菌(Rothia amarae)；少动鞘氨醇单胞菌；和朝鲜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas koreens)。
在一些实施例中，EV来自贺氏明串珠菌细菌。在一些实施例中，EV来自贺氏明串珠菌Ceb-kc-003(KCCM11830P)细菌。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是巨型球菌属物种细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 42787、NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为DSM 26228的菌株)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是狄氏副拟杆菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 42382的菌株)。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是马赛巨型球菌细菌(例如，来自保藏号为NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株)，或其衍生物。参见，例如，WO 2020/120714。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与来自保藏号为NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株的马赛巨型球菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是保藏号为NCIMB 43388或NCIMB 43389的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是以保藏号NCIMB 42787保藏的马赛巨型球菌细菌菌株，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与以保藏号NCIMB 42787保藏的马赛巨型球菌细菌菌株的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是以保藏号NCIMB 42787保藏的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是来自保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株的巨型球菌属物种细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2020/120714。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是与来自保藏号为NCIMB 43385，NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株的巨型球菌属物种的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，巨型球菌属物种细菌是保藏号为NCIMB 43385、NCIMB 43386或NCIMB 43387的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是以保藏号NCIMB 42382保藏的狄氏副拟杆菌细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，狄氏副拟杆菌细菌是与以保藏号NCIMB 42382保藏的狄氏副拟杆菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，狄氏副拟杆菌细菌是以保藏号NCIMB 42382保藏的菌株。
在一些实施例中，从其获得EV的细菌是以保藏号DSM 26228保藏的马赛巨型球菌细菌，或其衍生物。参见，例如，WO 2018/229216。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是与以保藏号DSM 26228保藏的马赛巨型球菌细菌的核苷酸序列(例如，基因组序列、16S序列、和/或CRISPR序列)包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如，至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。在一些实施例中，马赛巨型球菌细菌是以保藏号DSM 26228保藏的菌株。
在一些实施例中，对获得EV的细菌进行修饰(例如，工程化)以降低毒性或其他不利影响；提高EV的递送(例如口服递送)(例如，通过改良耐酸性、黏液黏着性和/或渗透性和/或对胆汁酸、消化酶的抗性、对抗微生物肽的抗性和/或抗体中和)；靶向所需细胞类型(例如，M细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞)；增强EV的免疫调节和/或治疗效果(例如单独或与另一治疗剂组合)；和/或通过EV(例如经由多糖、纤毛、伞毛、黏附素的经修饰制造)增强免疫活化或抑制。在一些实施例中，本文描述的工程改造的细菌经修饰以改善EV制造(例如，更高的耐氧性、稳定性、经改善的冻融耐受性、较短的产生时间)。例如，在一些实施例中，本文描述的工程改造的细菌包括具有一种或多种遗传改变的细菌，此改变包含于细菌染色体或内源性质粒和/或一或多个外源性质粒上的一或多个核苷酸的插入、删除、易位或取代，或其任何组合，其中该遗传改变可导致一或多个基因的过表达和/或低表达。工程改造的细菌可使用本领域中已知的任何技术产生，包括(但不限于)定点诱变、转座子诱变、敲除、敲入、聚合酶链反应诱变、化学诱变、紫外线诱变、转形(化学或通过电穿孔)、噬菌体转导、定向演化或其任何组合。
表1.细菌，按纲分
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*括号中给出的缩写是针对其所在行中的物种。
表2：示例性细菌菌株
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表3示例性细菌菌株
菌株 保藏号
古氏副拟杆菌 PTA-126574
动物双歧杆菌乳酸亚种菌株A PTA-125097
马赛布劳特氏菌菌株A PTA-125134
普雷沃菌属菌株B NRRL登录号B 50329
栖组织普雷沃菌 PTA-126140
布劳特氏菌菌株A PTA-125346
乳酸乳球菌乳脂亚种菌株A PTA-125368
唾液乳杆菌 PTA-125893
活泼瘤胃球菌菌株 PTA-125706
纳西利斯泰泽菌菌株 PTA-125707
解苯副梭菌 PTA-125894
活泼瘤胃球菌(又称Mediterraneibacter gnavus) PTA-126695
小韦荣氏球菌 PTA-125710
非典型韦荣氏球菌菌株A PTA-125709
非典型韦荣氏球菌菌株B PTA-125711
小韦荣氏球菌菌株A PTA-125691
当别町韦荣氏球菌菌株A PTA-125708
阿加萨杆菌属物种 PTA-125892
Turicibacter sanguinis PTA-125889
类肺炎克雷白氏菌拟肺炎亚种 PTA-125891
催产克雷白氏菌 PTA-125890
巨型球菌属物种菌株A PTA-126770
巨型球菌属物种 PTA-126837
Harryflintia acetispora PTA-126694
Fournierella massiliensis PTA-126696
表4.示例性细菌菌株
经修饰的EV
在一些方面，本文所述的EV经修饰使得它们包含、连接至和/或结合治疗部分。
在一些实施例中，治疗性部分是癌症特异性部分。在一些实施例中，癌症特异性部分对癌细胞具有结合特异性(例如对癌症特异性抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，癌症特异性部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，癌症特异性部分包含T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，癌症特异性部分包含表达于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在一些实施例中，癌症特异性部分是二分(bipartite)融合蛋白，其具有两个部分：结合至和/或连接至细菌的第一部分及可结合至癌细胞(例如通过对癌症特异性抗原具有结合特异性)的第二部分。在一些实施例中，第一部分是全长肽聚糖识别蛋白(诸如PGRP)的片段或全长肽聚糖识别蛋白。在一些实施例中，第一部分对EV具有结合特异性(例如通过对细菌抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，第一和/或第二部分包含表达于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在某些实施例中，癌症特异性部分及EV的共施用(组合施用或分开施用)增加EV靶向癌细胞。
在一些实施例中，本文描述的EV经工程化使得它们包含、连接至和/或结合磁性和/或顺磁性部分(例如磁珠)。在一些实施例中，磁性和/或顺磁性部分包含细菌和/或直接连接至细菌。在一些实施例中，该磁性和/或顺磁性部分连接至结合至EV的EV结合部分的一部分和/或为结合至EV的EV结合部分的一部分。在一些实施例中，该EV结合部分是全长肽聚醣识别蛋白(诸如PGRP)的片段或全长肽聚醣识别蛋白。在一些实施例中，该EV结合部分具有对EV的结合特异性(例如通过对细菌抗原具有结合特异性)。在一些实施例中，该EV结合部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该EV结合部分包含T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，该EV结合部分包含表现于癌细胞表面上受体的配体或其受体结合片段。在某些实施例中，磁性和/或顺磁性部分及EV的共施用(一起施用或分开施用)可用以增加EV靶向(例如靶向癌症细胞和/或受试者存在癌细胞的一部分)。
细菌细胞外囊泡(EV)的生产
分泌的EV在某些方面，使用本领域已知的任何方法制备来自本文所述细菌的EV(例如分泌的EV(smEV))。
在一些实施例中，EV(例如分泌的EV(smEV)是在没有EV纯化步骤的情况下制备的。例如，在一些实施例中，本文描述的细菌通过使用让EV保持完整的方法被杀死且将所得的细菌组分(包括EV)用于本文描述的方法及组合物中。在一些实施例中，细菌通过使用抗生素(例如，使用本文描述的抗生素)被杀死。在一些实施例中，细菌通过使用UV辐照被杀死。在一些实施例中，细菌被热杀死。
在一些实施例中，本文所述的EV纯化自一种或多种其他细菌组分。用于自细菌纯化EV的方法为本领域中已知。在一些实施例中，EV通过使用S.Bin Park等人.PLoS ONE[公共科学图书馆·综合].6(3):e17629(2011)或G.Norheim,等人.PLoS ONE[公共科学图书馆·综合].10(9):e0134353(2015)或Jeppesen,等人.Cell[细胞]177:428(2019)中所述的方法从细菌培养物制备，这些文献中的每一个通过引用以其全文特此并入。在一些实施例中，这些细菌经培养至高光密度及然后经离心以使细菌沉淀(例如，在4℃下以10,000x g离心30min，在4℃下以15,500x g离心15min)。在一些实施例中，然后使培养上清液通过过滤器以排除完整细菌细胞(例如，0.22μm过滤器)。在一些实施例中，然后对上清液进行切向流过滤，在此过程中，将上清液浓缩，除去小于100kDa的物质，并用PBS对培养基进行部分交换。在一些实施例中，经过滤的上清液经离心以使细菌EV沉淀(例如，在4℃下以100,000至150,000x g离心1至3小时，在4℃下以200,000x g离心1至3小时)。在一些实施例中，这些EV通过重悬浮所得EV沉淀物(例如，于PBS中)，并将重悬浮的EV施用至Optiprep(碘克沙醇)梯度或梯度(例如30％至60％不连续的梯度、0-45％不连续的梯度)，接着离心(例如，在4℃下以200,000x g离心4至20小时)加以进一步纯化。可以收集EV带，用PBS稀释并离心以使EV沉淀(例如，在4℃下以150,000x g离心3小时，在4℃下以200,000x g离心1小时)。经纯化的EV可经储存(例如，在-80℃或-20℃下)直至使用。在一些实施例中，这些EV通过用DNA酶和/或蛋白酶K处理加以进一步纯化。
例如，在一些实施例中，细菌的培养物可在4℃下以11,000x g离心20-40分钟以使细菌沉淀。可使培养上清液通过0.22μm过滤器以排除完整细菌细胞。然后可使用可包括但不限于硫酸铵沉淀、超离心或过滤的方法浓缩经过滤的上清液。例如，就硫酸铵沉淀而言，可将1.5-3M硫酸铵缓慢添加至经过滤的上清液，同时在4℃下搅拌。可在4℃下将沉淀培养8至48小时及然后在4℃下以11,000x g离心20-40分钟。所得集结粒含有细菌EV及其他碎片。可使用超离心，经过滤的上清液在4℃下以100,000至200,000x g离心1-16小时。此离心的沉淀物含有细菌EV和其他碎片(例如大蛋白复合物)。在一些实施例中，使用过滤技术，如通过使用Amicon超自旋过滤器或通过切向流过滤，上清液可经过滤以便于保留分子量>50或100kDa的物质。
可替代地，例如通过将生物反应器连接至细胞培养交替切向流(ATF)系统(例如来自Repligen的XCell ATF)，可在生长期间或在生长期间的选定时间点，从细菌培养物连续获得EV。该ATF系统保留完整细胞(>0.22μm)于生物反应器中，及容许较小组分(例如，EV、游离蛋白质)通过过滤器以供收集。例如，所述系统可经结构设计使得<0.22μm滤液然后通过100kDa的第二过滤器，容许收集如在0.22μm与100kDa之间的EV的物质，并将小于100kDa的种类泵送回生物反应器中。可替代地，该系统可经结构设计以容许生物反应器中的培养基在培养物的生长期间得到补充和/或修饰。通过此方法收集的EV可通过如上文描述用于经过滤的上清液的超离心或过滤进行进一步纯化和/或浓缩。
通过本文提供的方法获得的EV可通过基于尺寸的柱色谱法、通过亲和色谱法、通过离子交换色谱法及通过梯度超离心，使用可包括但不限于使用蔗糖梯度或Optiprep梯度的方法加以进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，将沉淀物重悬浮于60％蔗糖、30mM pH8.0Tris中。如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用Amicon Ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mM pH 8.0Tris中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。简而言之，在使用Optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，则将沉淀物重悬于PBS中并向样品中添加3体积的60％Optiprep。在一些实施例中，如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用60％Optiprep将浓缩物稀释至最终浓度为35％Optiprep。将样品施加至0-45％不连续的Optiprep梯度，并在4℃下以200,000x g离心3至24小时，例如，在4℃下离心4至24小时。
在一些实施例中，为证实EV制剂的无菌性及分离，将EV连续稀释至琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行培养。使未经灭菌的制剂通过0.22um过滤器以去除完整细胞。为进一步增加纯度，经分离的EV可用DNA酶或蛋白酶K处理。
在一些实施例中，为制备用于活体内注射的EV，经纯化的EV如先前描述进行处理(G.Norheim等人,PLoS ONE.[公共科学图书馆·综合]10(9):e0134353(2015))。简而言之，在蔗糖梯度离心后，将含有EV的带于含有3％蔗糖的溶液中或本领域技术人员已知的适用于活体内注射的其他溶液中重悬浮至50μg/mL的终浓度。此溶液还可含有浓度为0-0.5％(w/v)的佐剂(例如氢氧化铝)。在一些实施例中，为了制备用于体内注射的EV，将PBS中的EV无菌过滤至<0.22μm。
在某些实施例中，为制备与其他测试(例如用以在TEM成像或活体外分析之前去除蔗糖)兼容的样本，使用过滤(例如Amicon Ultra柱)将样本缓冲液交换至PBS或30mM pH8.0Tris中，透析，或超离心(200,000×g，≥3小时，4℃)并重悬浮。
在一些实施例中，EV制剂的无菌性可通过将一部分EV接种至琼脂培养基(其用于用以产生EV的细菌的标准培养)上及使用标准条件进行培养加以证实。
在一些实施例中，所选EV通过色谱法分离及富集并结合EV的表面部分。在一些实施例中，所选EV通过荧光细胞分选通过使用亲和试剂、化学染料、重组蛋白的方法或本领域技术人员已知的其他方法分离和/或富集。
在一些实施例中，EV被分析，例如，如Jeppesen等人Cell[细胞]177:428(2019)所述。
在一些实施例中，EV被冻干。
在一些实施例中，EV被γ辐照(例如，以17.5或25kGy)。
在一些实施例中，EV被UV辐照。
在一些实施例中，EV被热灭活(例如，在50℃下两小时或在90℃下两小时)。
在一些实施例中，EV被酸处理。
在一些实施例中，EV被喷射氧气(例如，以0.1vvm持续两小时)。
生长阶段可影响细菌和/或细菌产生的EV的数量或性质。例如，在本文提供的EV制备方法中，可以例如在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时从培养物中分离EV。
生长环境(如培养条件)可影响细菌产生EV的量。例如，EV诱导因子可以增加EV的产率，如表5所示。
表5：增加EV产率的培养技术
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在本文提供的制备EV的方法中，该方法可任选地包括在从细菌培养物中分离EV之前，将细菌培养物暴露于EV诱导因子。细菌培养物可以在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时暴露于EV诱导因子。
经加工的EV在某些方面，使用本领域已知的任何方法制备(例如，人工制备)本文所述的EV(例如经加工的EV(pmEV))。
在一些实施例中，在没有pmEV纯化步骤的情况下制备pmEV。例如，在一些实施例中，本文描述的pmEV自其释放的细菌通过使用让细菌pmEV保持完整的方法被杀死且将所得的细菌组分(包括pmEV)用于本文描述的方法及组合物中。在一些实施例中，细菌通过使用抗生素(例如，使用本文描述的抗生素)被杀死。在一些实施例中，细菌通过使用UV辐照被杀死。
在一些实施例中，本文描述的pmEV纯化自一种或多种其他细菌组分。从细菌(和任选的其他细菌组分)纯化pmEV的方法是本领域已知的。在一些实施例中，pmEV通过使用Thein,等人.(J.Proteome Res.[蛋白质组学研究杂志]9(12):6135-6147(2010))或Sandrini,等人.(Bio-protocol[生物方案]4(21):e1287(2014))中描述的方法从细菌培养物制备，这些文献中的每一个通过援引以其全文特此并入。在一些实施例中，这些细菌经培养至高光密度及然后经离心以使细菌沉淀(例如，在室温或4℃下10,000-15,000x g 10-15分钟)。在一些实施例中，丢弃上清液，并将细胞沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，将细胞沉淀物在冰上解冻，并重悬于补充有1mg/mL DNA酶I的100mM Tris-HCl(pH 7.5)中。在一些实施例中，在制造商建议的条件下使用Emulsiflex C-3(奥维斯丁公司(Avestin,Inc.))裂解细胞。在一些实施例中，通过在4℃下以10,000x g离心15分钟来沉淀碎片和未裂解的细胞。在一些实施例中，然后将上清液在4℃下以120,000x g离心1小时。在一些实施例中，将沉淀物重悬于冰冷的pH 11的100mM碳酸钠中，在4℃下搅拌孵育1小时，然后在4℃下以120,000x g离心1小时。在一些实施例中，将沉淀重悬于pH 7.5的100mM Tris-HCl中，在4℃下以120,000x g再离心20分钟，然后重悬于0.1M Tris-HCl(pH 7.5)中或于PBS中。在一些实施例中，样品被存储在-20℃。
在某些方面，pmEV是通过改编自Sandrini等人(2014年)的方法获得的。在一些实施例中，细菌培养物在室温或4℃下以10,000-15,500x g离心10-15分钟。在一些实施例中，将细胞沉淀物在-80℃冷冻，并丢弃上清液。在一些实施例中，将细胞沉淀物在冰上解冻，并重悬于10mM Tris-HCl(pH 8.0)、补充有0.1mg/mL溶菌酶的1mM EDTA中。在一些实施例中，将样品在室温或37℃下混合孵育30分钟。在一些实施例中，将样品在-80℃下重新冷冻，然后再次在冰上解冻。在一些实施例中，添加DNA酶I至终浓度为1.6mg/mL，并添加MgCl2至终浓度为100mM。在一些实施例中，使用QSonica Q500超声仪以30秒开启和30秒关闭的7个循环对样品进行超声处理。在一些实施例中，通过在4℃下以10,000x g离心15分钟来沉淀碎片和未裂解的细胞。在一些实施例中，然后将上清液在4℃下以110,000x g离心15分钟。在一些实施例中，将沉淀重悬于10mM Tris-HCl(pH 8.0)、2％Triton X-100中，并在室温下混合孵育30-60min。在一些实施例中，将样品在4℃下以110,000x g离心15分钟。在一些实施例中，将沉淀物重悬于PBS中并储存在-20℃。
在某些方面，本文描述的形成(例如，制备)分离的细菌pmEV的方法包括以下步骤：(a)离心细菌培养物，从而形成第一沉淀物和第一上清液，其中该第一沉淀物包含细胞；(b)丢弃该第一上清液；(c)将该第一沉淀物重悬于溶液中；(d)裂解细胞；(e)离心裂解的细胞，从而形成第二沉淀物和第二上清液；(f)丢弃该第二沉淀物并离心该第二上清液，从而形成第三沉淀物和第三上清液；(g)丢弃该第三上清液并将该第三沉淀物重悬于第二溶液中，从而形成分离的细菌pmEV。
在一些实施例中，该方法还包括以下步骤：(h)离心步骤(g)的溶液，从而形成第四沉淀物和第四上清液；(i)丢弃该第四上清液，并将该第四沉淀物重悬于第三溶液中。在一些实施例中，该方法还包括以下步骤：(j)离心步骤(i)的溶液，从而形成第五沉淀物和第五上清液；和(k)丢弃该第五上清液，并将该第五沉淀物重悬于第四溶液中。
在一些实施例中，步骤(a)的离心是以10,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(a)的离心进行10-15分钟。在一些实施例中，步骤(a)的离心是在4℃或室温下。在一些实施例中，步骤(b)还包括将第一沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，步骤(c)中的溶液是补充有1mg/ml DNA酶I的100mM Tris-HCl(pH 7.5)。在一些实施例中，步骤(c)中的溶液是10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA，补充有0.1mg/ml溶菌酶。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括在37℃或室温下孵育30分钟。在一些实施例中，步骤(c)还包括将第一沉淀物在-80℃冷冻。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括将DNA酶I添加至1.6mg/ml的终浓度。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括添加MgCl2至100mM的终浓度。在一些实施例中，在步骤(d)中通过匀浆裂解细胞。在一些实施例中，在步骤(d)中通过emulsiflex C3裂解细胞。在一些实施例中，在步骤(d)中通过超声裂解细胞。在一些实施例中，将细胞超声处理7个循环，其中每个循环包括30秒的超声处理和30秒的不超声处理。在一些实施例中，步骤(e)的离心是以10,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(e)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(e)的离心是在4℃或室温下。
在一些实施例中，步骤(f)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(f)的离心是以110,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(f)的离心进行1小时。在一些实施例中，步骤(f)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(f)的离心是在4℃或室温下。在一些实施例中，步骤(g)中的第二溶液是pH 11的100mM碳酸钠。在一些实施例中，步骤(g)中的第二溶液是10mM Tris-HCl pH8.0、2％triton X-100。在一些实施例中，步骤(g)还包括将溶液在4℃下孵育1小时。在一些实施例中，步骤(g)进一步包括将溶液在室温下孵育30-60分钟。在一些实施例中，步骤(h)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(h)的离心是以110,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(h)的离心进行1小时。在一些实施例中，步骤(h)的离心进行15分钟。在一些实施例中，步骤(h)的离心是在4℃或室温下。在一些实施例中，步骤(i)中的第三溶液是100mM Tris-HCl(pH 7.5)。在一些实施例中，步骤(i)中的第三溶液是PBS。在一些实施例中，步骤(j)的离心是以120,000x g进行的。在一些实施例中，步骤(j)的离心进行20分钟。在一些实施例中，步骤(j)的离心是在4℃或室温下进行的。在一些实施例中，步骤(k)中的第四溶液是100mM Tris-HCl(pH 7.5)或PBS。
通过本文提供的方法获得的pmEV可通过基于尺寸的柱色谱法、通过亲和色谱法及通过梯度超离心，使用可包括但不限于使用蔗糖梯度或Optiprep梯度的方法加以进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，将沉淀物重悬浮于60％蔗糖、30mM pH 8.0Tris中。如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用Amicon Ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mM pH 8.0Tris中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。简言之，在使用Optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，则将集结粒重悬于PBS中的35％Optiprep中。在一些实施例中，如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用60％Optiprep将浓缩物稀释至最终浓度为35％Optiprep。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。
在一些实施例中，为证实pmEV制剂的无菌性及分离，将pmEV连续稀释至琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行培养。使未经灭菌的制剂通过0.22μm过滤器以去除完整细胞。为进一步增加纯度，分离的pmEV可用DNA酶或蛋白酶K处理。
在一些实施例中，pmEV制剂的无菌性可通过将一部分pmEV接种至琼脂培养基(其用于用以产生pmEV的细菌的标准培养)上及使用标准条件进行培养加以证实。
在一些实施例中，通过色谱法及pmEV上的结合表面部分来分离所选pmEV并富集。在一些实施例中，所选pmEV通过荧光细胞分选通过使用亲和试剂、化学染料、重组蛋白的方法或本领域技术人员已知的其他方法分离和/或富集。
在一些实施例中，分析pmEV，例如，如Jeppesen等人Cell[细胞]177:428(2019)所述。
在一些实施例中，冻干pmEV。
在一些实施例中，pmEV被γ辐照(例如，以17.5或25kGy)。
在一些实施例中，pmEV被UV辐照。
在一些实施例中，pmEV被热灭活(例如，在50℃下两小时或在90℃下两小时)。
在一些实施例中，pmEV被酸处理。
在一些实施例中，pmEV被喷射氧气(例如，以0.1vvm持续两小时)。
生长阶段可影响细菌的数量或性质。例如，在本文提供的pmEV制备方法中，可以例如在对数生长期开始时、在对数生长期的中间时、和/或一旦达到稳定生长期时从培养物中分离pmEV。
溶液和干燥形式
本披露内容提供了包含EV(例如，本文所述的EV和/或EV的组合)的溶液(例如，液体混合物)。例如，在一些实施例中，溶液包括EV和包含填充剂的赋形剂。作为另一个示例，在一些实施例中，溶液包括EV和包含填充剂和冻干保护剂的赋形剂。作为另一个示例，在一些实施例中，溶液包括EV和包含冻干保护剂的赋形剂。
本披露内容提供的溶液包括。例如，在一些实施例中，填充剂包括甘露醇、蔗糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll或PVP-K30。在一些实施例中，赋形剂任选地包括另外的组分，例如海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖糊精、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、Ficoll、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。例如，在一些实施例中，溶液包括EV的液体制剂和包含填充剂的赋形剂，例如来自表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的原液的赋形剂。例如，在一些实施例中，溶液包括含有EV(例如，通过从细菌培养物(例如上清液)或渗余物中分离EV获得)的液体制剂和包含填充剂的赋形剂，例如，将含有EV的液体制剂与包含填充剂的赋形剂原液(例如表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的赋形剂原液)组合以制备溶液。
包含细胞外囊泡(EV)(例如，来自细菌)的“干燥形式”是指通过干燥包含EV的溶液而产生的产物。在一些实施例中，干燥通过冷冻干燥(冻干)或喷雾干燥进行。在一些实施例中，干燥形式是粉末。如本文所用，粉末是指一种干燥形式并且包括冻干粉末，但包括粉末，例如通过例如喷雾干燥的方法获得的喷雾干燥粉末。
当进行冷冻干燥(冻干)时，所得产物是冻干物。在一些实施例中，干燥形式是冻干物。如本文所用，冻干物是指一种干燥形式并且包括冻干粉末和冻干饼。在一些实施例中，将冻干饼碾磨(例如，研磨)以产生冻干粉末。碾磨是指固体的机械尺寸减小。例如，研磨是一种可以对干燥形式进行的碾磨。例如，参见Seibert等人,“MILLING OPERATIONS IN THEPHARMACEUTICAL INDUSTRY[制药行业的碾磨操作]”在Chemical Engineering in the Pharmaceutical Industry:R&D to Manufacturing[制药行业的化学工程：从研发到制造]中,由David J.am Ende编辑(2011年)。
在一些实施例中，本披露内容还提供了干燥形式，例如冻干物，其包含EV(例如，本文所述的EV和/或EV的组合)和赋形剂。例如，干燥形式可以包括EV和包含填充剂的赋形剂。作为另一个示例，干燥形式可以包括EV和包含填充剂和冻干保护剂的赋形剂。作为另一个示例，干燥形式可以包括EV和包含冻干保护剂的赋形剂。例如，如本文所述，在一些实施例中，将EV与包含填充剂和/或冻干保护剂的赋形剂组合，例如以制备溶液。在一些实施例中，溶液是干燥的。所得干燥形式(例如，冻干物)包含EV和赋形剂的一种或多种组分，例如填充剂和/或冻干保护剂(例如，以干燥形式)。
本披露内容还提供EV和赋形剂的干燥形式。在一些实施例中，干燥形式是冻干物，例如冻干饼或冻干粉末。在一些实施例中，干燥形式是粉末，例如喷雾干燥粉末或冻干粉末。例如，在一些实施例中，填充剂包括甘露醇、蔗糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll或PVP-K30。在一些实施例中，赋形剂包括另外的组分，例如海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、Ficoll、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。例如，在一些实施例中，干燥形式包含EV和赋形剂，例如包含填充剂的赋形剂，例如来自表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的原液的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式的水分含量低于约6％(或低于约5％)(例如，通过卡尔费休滴定法测定)。在一些实施例中，干燥形式具有约10％至约80％(按重量计)的赋形剂，例如包含填充剂的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式具有约10％至约80％(按重量计)的赋形剂，例如来自表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的原液的赋形剂。在一些实施例中，按干燥形式的总重量计，EV占固体的约1％至约99％。在一些实施例中，干燥形式具有至少约1e10个颗粒/mg干燥形式(例如，由颗粒/mg确定，例如通过NTA)。在一些实施例中，干燥形式的颗粒在从干燥形式重悬浮(例如，在去离子水中重悬浮)后具有约130nm至约300nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)(例如，由动态光散射确定)。
在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含基本上或完全不含完整细菌(例如，活细菌、被杀死的细菌和/或减毒细菌)的EV。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含EV和完整细菌(例如，活细菌、被杀死的细菌和/或减毒细菌)。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌的EV。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中提供的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌菌株或物种的EV。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种细菌的EV。在一些实施例中，干燥形式的溶液包含来自本文提供(例如，列于表1、表2、表3和/或表4和/或说明书其他地方(例如表J或实例10))的一种细菌菌株或物种的EV。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式包含被γ辐照的EV。在一些实施例中，在EV被分离(例如，制备)之后，EV被γ辐照。
在一些实施例中，为了量化来自细菌样品的EV和/或细菌样品中存在的细菌的数量，使用电子显微术(例如，超薄冷冻切片的EM)以观测EV和/或细菌并计数它们的相对数量。可替代地，使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)、库尔特计数或动态光散射(DLS)或这类技术的组合。NTA及库尔特计数器计数颗粒并显示它们的尺寸。DLS给出颗粒的粒度分布，而非浓度。细菌通常具有1至2um(微米)的直径。完整范围是0.2-20um。来自库尔特计数及NTA的组合结果可揭示给定样品中的细菌数量和/或来自细菌的EV。库尔特计数揭示具有0.7-10μm直径的颗粒的数量。就大多数细菌和/或EV样品而言，库尔特计数器单独可揭示样品中的细菌和/或EV数量。对于NTA，可以从马尔文泛分析公司(Malvern Pananlytical)获得Nanosight仪器。例如，NS300可以观测并测量尺寸在10-2000nm范围内的悬浮颗粒。NTA允许对例如直径为50-1000nm的颗粒的数量进行计数。DLS揭示具有于1nm-3um的近似范围内的不同直径的颗粒的分布。
在一些实施例中，EV可以通过本领域已知的分析方法(例如Jeppesen等人Cell[细胞]177:428(2019))来表征。
在一些实施例中，基于颗粒计数来量化EV。例如，可以使用NTA测量EV制剂的颗粒计数。例如，可以使用NTA使用Zetaview测量EV制剂的颗粒计数。
在一些实施例中，基于蛋白质、脂质或碳水化合物的量来定量EV。例如，在一些实施例中，EV制剂的总蛋白含量可以使用布拉德福德测定或BCA进行测量。
在一些实施例中，EV与源细菌的一种或多种其他细菌组分分离。在一些实施例中，溶液和/或干燥形式进一步包含其他细菌组分。
在某些实施例中，从源细菌获得的EV液体制剂可基于亚群的物理特性(例如，大小、密度、蛋白含量和/或结合亲和力)被分级成亚群。然后可以将一个或多个EV亚群(例如，作为液体制剂)掺入本发明的溶液、粉末和/或冻干物中。
在某些方面，本文提供了溶液和/或干燥形式(及其治疗性组合物)，其包含来自可用于治疗和/或预防疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调、或代谢疾病)的细菌的EV，以及制造和/或鉴定这样的EV的方法，以及使用这样的溶液和/或干燥形式(及其治疗性组合物)的方法(例如，单独地或与其他疗法组合地用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)。在一些实施例中，治疗性组合物包含EV和完整细菌(例如，活细菌、被杀死的细菌和/或减毒细菌)。在一些实施例中，治疗性组合物包含EV并且不存在细菌(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％地不含细菌)。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的一种或多种细菌菌株或物种的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种细菌的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的一种细菌菌株或物种的EV和/或细菌。
在一些实施例中，将溶液和/或干燥形式添加或掺入食物产品(例如,食物或饮料)，例如健康食物或饮料、婴儿用食物或饮料、用于孕妇、运动员、老年人或其他特定人群的食物或饮料、功能食物、饮料、用于指定健康应用的食物或饮料、膳食补充剂、患者用食物或饮料或动物饲料。食物及饮料的具体实例包含多种饮料，例如果汁、清凉饮料、茶饮料、饮料制剂、果冻饮料及功能饮料；酒精性饮料，例如啤酒；含有碳水化合物的食物，例如大米食物产品、面条、面包及面团；膏产品，例如鱼火腿、香肠、海鲜膏产品；蒸煮袋产品，例如咖喱、敷有厚淀粉酱的食品及汤；乳制产品，例如乳液、乳制饮料、冰激凌、奶酪及酸乳；发酵产品，例如发酵豆瓣酱膏、酸乳、发酵饮料及泡菜；豆产品；多种糖果产品，包含饼干、曲奇等；冰糖、口香糖、软糖；冷甜点，包含果胶、焦糖布丁及速冻点心；速熟食物，例如速溶汤料及速溶大豆汤料；可微波食物；等等。另外，实例还包含以粉剂、粒剂、锭剂、胶囊、液体、膏及果胶的形式制得的健康食物及饮料。
在一些实施例中，将溶液和/或干燥形式添加到用于动物(包括人)的食物产品或食品补充剂中。除人类外的动物无特定限制，且该组合物可用于各种牲畜、家禽、宠物、实验动物，及类似物。动物的具体实例包括猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、鸭、鸵鸟、火鸡、狗、猫、兔、仓鼠、小鼠、大鼠、猴，及类似物，但这些动物不限于此。
治疗性组合物
在一些实施例中，本文提供的溶液和/或干燥形式被配制成治疗性组合物。
在某些实施例中，本文提供了包含本文所述的溶液和/或干燥形式的治疗性组合物。在一些实施例中，治疗性组合物包含本文提供的溶液和/或干燥形式以及药学上可接受的载剂。在一些实施例中，治疗性组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在某些方面，本文提供了治疗性组合物，其包含来自可用于治疗和/或预防疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调、或代谢疾病)的细菌的EV，以及制造和/或鉴定这样的EV的方法，以及使用这样的治疗性组合物的方法(例如，单独地或与其他疗法组合地用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、菌群失调或代谢疾病)。在一些实施例中，治疗性组合物包含EV和完整细菌(例如，活细菌、被杀死的细菌、减毒细菌)。在一些实施例中，治疗性组合物包含EV并且不存在细菌(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％地不含细菌)。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的一种或多种细菌菌株或物种的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如，表J或实例10)中列出的分类群(例如，纲、目、科、属、种或菌株)的一种细菌的EV和/或细菌。在一些实施例中，治疗性组合物包含来自本文提供(例如，说明书中的表1、表2、表3和/或表4和/或其他地方(例如表J或实例10)中列出)的一种细菌菌株或物种的EV和/或细菌。
在某些方面中，本文提供用于向受试者(例如人受试者)施用的治疗性组合物。在一些实施例中，将这些治疗性组合物与另外的活性和/或惰性材料组合以产生最终产物，该最终产物可呈单一剂量单位或多剂量形式。在一些实施例中，治疗性组合物与佐剂如免疫佐剂(例如STING激动剂、TLR激动剂或NOD激动剂)组合。
在一些实施例中，治疗性组合物包括至少一种碳水化合物。
在一些实施例中，治疗性组合物包括至少一种脂质。在一些实施例中，脂质包括至少一种选自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、珍珠酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(EPA)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(DHA)及二十四烷酸(24:0)。
在一些实施例中，治疗性组合物包括至少一种补充矿物质或矿物质源。矿物质的实例包括但不限于：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾及硒。任一前述矿物质的合适形式包含可溶性矿物质盐、微溶性矿物质盐、不溶性矿物质盐、螯合矿物质、矿物质复合物、非反应性矿物质(例如羰基矿物质及经还原矿物质)及其组合。
在一些实施例中，治疗性组合物包括至少一种补充维生素。至少一种维生素可为脂肪可溶性或水可溶性维生素。合适维生素包括但不限于维生素C、维生素A、维生素E、维生素B12、维生素K、核黄素、烟酸(niacin)、维生素D、维生素B6、叶酸、吡哆醇(pyridoxine)、硫胺素、泛酸及生物素。任一前述物质的合适形式是维生素盐、维生素衍生物、与维生素具有相同或类似活性的化合物及维生素代谢物。
在一些实施例中，治疗性组合物包含赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂。合适赋形剂的非限制性实例包含缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、矫味剂、甜味剂及着色剂。
在一些实施例中，赋形剂是缓冲剂。合适缓冲剂的非限制性实例包含柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙及碳酸氢钙。
在一些实施例中，赋形剂包括防腐剂。合适防腐剂的非限制性实例包含抗氧化剂(例如α-生育酚及抗坏血酸盐)及抗微生物剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇及苯酚)。
在一些实施例中，治疗性组合物包含作为赋形剂的黏合剂。合适粘合剂的非限制性实例包含淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。
在一些实施例中，治疗性组合物包含作为赋形剂的润滑剂。合适润滑剂的非限制性实例包含硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex(氢化蓖麻油)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁及轻质矿物油。
在一些实施例中，治疗性组合物包括分散增强剂作为赋形剂。合适分散剂的非限制性实例包含淀粉、海藻酸、聚乙烯基吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、经纯化木质纤维素、羟乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐及微晶纤维素(作为高HLB乳化剂表面活性剂)。
在一些实施例中，治疗性组合物包含作为赋形剂的崩解剂。在一些实施例中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适非泡腾崩解剂的非限制性实例包含淀粉(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶凝及改性淀粉)、甜味剂、黏土(例如膨润土)、微晶纤维素、海藻酸盐、羟乙酸淀粉钠、树胶(例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶及黄蓍胶)。在一些实施例中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适泡腾崩解剂的非限制性实例包含碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施例中，治疗性组合物是食物产品(例如,食物或饮料)，例如健康食物或饮料、婴儿用食物或饮料、用于孕妇、运动员、老年人或其他特定人群的食物或饮料、功能食物、饮料、用于指定健康应用的食物或饮料、膳食补充剂、患者用食物或饮料或动物饲料。食物及饮料的具体实例包含多种饮料，例如果汁、清凉饮料、茶饮料、饮料制剂、果冻饮料及功能饮料；酒精性饮料，例如啤酒；含有碳水化合物的食物，例如大米食物产品、面条、面包及面团；膏产品，例如鱼火腿、香肠、海鲜膏产品；蒸煮袋产品，例如咖喱、敷有厚淀粉酱的食品及中国炖汤；汤；乳制产品，例如乳液、乳制饮料、冰激凌、奶酪及酸乳；发酵产品，例如发酵豆瓣酱膏、酸乳、发酵饮料及泡菜；豆产品；多种糖果产品，包含饼干、曲奇等；冰糖、口香糖、软糖；冷甜点，包含果胶、焦糖布丁及速冻点心；速熟食物，例如速溶汤料及速溶大豆汤料；可微波食物；等等。另外，实例还包含以粉剂、粒剂、锭剂、胶囊、液体、膏及果胶的形式制得的健康食物及饮料。
在一些实施例中，治疗性组合物是用于动物(包括人类)的食物产品。除人类外的动物无特定限制，且该组合物可用于各种牲畜、家禽、宠物、实验动物，及类似物。动物的具体实例包括猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、野鸭、鸵鸟、家鸭、狗、猫、兔、仓鼠、小鼠、大鼠、猴，及类似物，但这些动物不限于此。
剂型
在一些实施例中，包含干燥形式的治疗性组合物被配制成固体剂型(也称为“固体剂量形式”)，例如用于口服施用。在一些实施例中，除了干燥形式之外，固体剂型还包含一种或多种赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂。固体剂型中的干燥形式包含分离的EV。可选地，固体剂型中的EV被γ辐照。在一些实施例中，固体剂型包含片剂、微型片剂、胶囊或粉末；或这些形式的组合(例如，胶囊中的微型片剂)。
在一些实施例中，本文所述的固体剂型是胶囊。在一些实施例中，本文所述的固体剂型是片剂或微型片剂。此外，在一些实施例中，多个微型片剂在(例如，装载到)胶囊中。
在一些实施例中，固体剂型包括胶囊。在一些实施例中，胶囊是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。在一些实施例中，胶囊是0号胶囊。如本文所用，胶囊的尺寸是指在应用肠溶包衣之前的片剂的尺寸。在一些实施例中，在装入之后(并且在肠溶包衣胶囊之前)将胶囊封口。在一些实施例中，将胶囊用基于HPMC的封口溶液(banding solution)封口。
在一些实施例中，固体剂型包含片剂(>4mm)(例如5mm-17mm)。例如，片剂是5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm或18mm片剂。如本领域中已知的，尺寸是指片剂的直径。如本文所用，片剂的尺寸是指在应用肠溶包衣之前的片剂的尺寸。
在一些实施例中，固体剂型包含微型片剂。在一些实施例中，微型片剂的尺寸范围为1mm-4mm。在一些实施例中，微型片剂是1mm微型片剂、1.5mm微型片剂、2mm微型片剂、3mm微型片剂或4mm微型片剂。如本领域中已知的，尺寸是指微型片剂的直径。如本文所用，微型片剂的尺寸是指在应用肠溶衣之前的微型片剂的尺寸。
在一些实施例中，微型片剂在胶囊中。在一些实施例中，胶囊是00号、0号、1号、2号、3号、4号或5号胶囊。在一些实施例中，包含微型片剂的胶囊包含HPMC(羟丙基甲基纤维素)或明胶。在一些实施例中，微型片剂在胶囊中：胶囊内的微型片剂的数量将取决于胶囊的尺寸和微型片剂的尺寸。例如，0号胶囊可容纳31-35(平均33)个3mm的微型片剂。在一些实施例中，胶囊在装入后封口。在一些实施例中，将胶囊用基于HPMC的封口溶液封口。
在一些实施例中，将包含溶液和/或干燥的治疗性组合物配制成悬浮液，例如，将干燥形式重构或将溶液稀释)，例如用于口服施用或注射。注射施用包括静脉内(IV)、肌内(IM)、肿瘤内(IT)及皮下(SC)施用。对于悬浮液，在一些实施例中，EV处于缓冲液中，例如药学上可接受的缓冲液，例如生理盐水或PBS。在一些实施例中，将包含溶液和/或干燥形式(例如，其包含EV和填充剂)的治疗性组合物配制成悬浮液，例如，将干燥形式重构；将溶液稀释)，例如，用于局部施用。在一些实施例中，悬浮液包含一种或多种赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，悬浮液包含蔗糖或葡萄糖。在一些实施例中，溶液或干燥形式中的EV是分离的EV。可选地，悬浮液中的EV被γ辐照。
包衣
在一些实施例中，本文所述的固体剂型(例如胶囊剂、片剂或微型片剂)用例如一层肠溶包衣或两层肠溶包衣(例如，内部肠溶包衣和外部肠溶包衣)进行肠溶包衣。内部肠溶包衣和外部肠溶包衣不相同(例如，内部肠溶包衣和外部肠溶包衣不包含相同量的相同组分)。肠溶包衣允许例如在小肠中释放治疗剂(例如细菌EV、其干燥形式和/或固体剂型)。
治疗剂在小肠中的释放允许治疗剂靶向并影响位于这些特定位置的细胞(例如，上皮细胞和/或免疫细胞)，例如，这可能在胃肠道中引起局部作用和/或引起系统作用(例如，胃肠道外的作用)。
EUDRAGIT是各种各样聚甲基丙烯酸酯基共聚物的品牌名称。它包括基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸/丙烯酸酯或其衍生物的阴离子、阳离子和中性共聚物。
可用于肠溶衣(例如，一层肠溶衣或内部肠溶衣和/或外部肠溶衣)的其他材料的实例包括邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、偏苯三酸乙酸纤维素(CAT)、聚(醋酸乙烯邻苯二甲酸酯)(PVAP)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料、植物纤维、玉米醇溶蛋白、Aqua-(不含醇的水性玉米醇溶蛋白配制品)、直链淀粉、淀粉衍生物、糊精、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基醋酸琥珀酸纤维素(醋酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、和/或海藻酸钠。
在一些实施例中，肠溶衣(例如，一层肠溶衣或内部肠溶衣和/或外部肠溶衣)包含甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(MAE)共聚物(1:1)。
在一些实施例中，一层肠溶包衣包括甲基丙烯酸丙烯酸乙酯(MAE)共聚物(1:1)(例如Kollicoat MAE 100P)。
在一些实施例中，层肠溶衣包括尤特奇(Eudragit)共聚物，例如尤特奇L(例如尤特奇L 100-55；尤特奇L 30D-55)、尤特奇S、尤特奇RL、尤特奇RS、尤特奇E、或尤特奇FS(例如尤特奇FS 30D)。
可以在肠溶衣中使用的材料的其他实例(例如，一层肠溶衣或内部肠溶衣和/或外部肠溶衣)包括在如下中描述的那些，例如U.S.6312728；U.S.6623759；U.S.4775536；U.S.5047258；U.S.5292522；U.S.6555124；U.S.6638534；U.S.2006/0210631；U.S.2008/200482；U.S.2005/0271778；U.S.2004/0028737；WO 2005/044240。
还参见，例如，美国9233074，其提供了可与本文提供的固体剂型一起使用的pH依赖性肠溶聚合物，包括甲基丙烯酸共聚物、聚(醋酸乙烯邻苯二甲酸酯)、琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和邻苯二甲酸乙酸纤维素；合适的甲基丙烯酸共聚物包括：聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:1固体，例如以尤特奇L100商品名出售；聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1:1固体，例如以尤特奇L100-55商品名出售；部分中和的聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1:1固体，例如以Kollicoat MAE-100P商品名出售；以及聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1:2固体，例如以尤特奇S100商品名出售。
在一些实施例中，固体剂型(例如胶囊)可以包括单层包衣，例如非肠溶包衣，例如HPMC(羟基丙基甲基纤维素)或明胶。
制备溶液和干燥形式的方法
本披露内容还提供了制备EV和赋形剂(其包含填充剂)的溶液的方法。例如，在一些实施例中，填充剂包含甘露醇、蔗糖、聚乙二醇(PEG，例如PEG 6000)、环糊精、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll或PVP-K30。在一些实施例中，赋形剂包含冻干保护剂。在一些实施例中，赋形剂任选地包括另外组分，例如海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、Ficoll、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。例如，在一些实施例中，将EV的液体制剂和包含填充剂的赋形剂组合以制备溶液。例如，在一些实施例中，EV(例如，通过从细菌培养物(例如上清液或渗余物)分离EV获得)的液体制剂和包含填充剂的赋形剂(例如，将表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的赋形剂原液)组合以制备溶液。例如，在一些实施例中，将含有EV(例如，通过从细菌培养物(例如上清液或渗余物)分离EV获得)的液体制剂和包含填充剂的赋形剂组合，例如，将含有EV(例如，通过从细菌培养物(例如上清液或渗余物)或渗余物分离EV获得)的液体制剂与包含填充剂的赋形剂(例如，甘露醇)或表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的赋形剂原液的赋形剂组合，以制备溶液。
本披露内容还提供了制备EV的干燥形式的方法。例如，在一些实施例中，该方法用于制备冻干物，例如冻干粉末和/或冻干饼。例如，在一些实施例中，该方法用于制备粉末，例如冻干粉末和/或喷雾干燥粉末。在一些实施例中，赋形剂包含填充剂。例如，在一些实施例中，填充剂包含甘露醇、蔗糖、聚乙二醇(PEG，例如PEG 6000)、环糊精、麦芽糖糊精、葡聚糖、Ficoll或PVP-K30。在一些实施例中，赋形剂包含冻干保护剂。在一些实施例中，赋形剂任选地包括另外组分，例如海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、葡聚糖、泊洛沙姆188、麦芽糖糊精、PVP-K30、Ficoll、柠檬酸盐、精氨酸和/或羟丙基-B-环糊精。例如，在一些实施例中，将含有EV(例如，通过从细菌培养物(如上清液或渗余物)分离EV获得)的液体制剂与包含填充剂(例如甘露醇)的赋形剂或表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的赋形剂原液的赋形剂组合；并干燥(例如，通过冷冻干燥或喷雾干燥)，从而制备干燥形式。在一些实施例中，干燥形式具有低于约6％、低于约5％、低于约4％、约0.5％至约5％、约1％至约5％、约1％至约4％、约1.5％至约4％，或约2％至约3％的水分含量(例如，通过卡尔费休滴定法测定)。在一些实施例中，干燥形式具有约10％至约80％(按重量计)的赋形剂，例如包含填充剂的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式具有约10％至约80％(按重量计)的赋形剂，例如来自表A、B、C、D、K或P之一中提供的配方的原液的赋形剂。在一些实施例中，按干燥形式的总重量计，EV占固体的约1％至约99％。在一些实施例中，干燥形式具有至少约1e10个颗粒/mg干燥形式(例如，由颗粒/mg确定，例如通过NTA)。在一些实施例中，干燥形式的颗粒在从干燥形式重悬浮(例如，在去离子水中重悬浮)后具有约130nm至约300nm的流体动力学直径(Z平均，Zave)(例如，由动态光散射确定)。
在一些实施例中，干燥形式是冻干物。在一些实施例中，冻干物是冻干粉末或冻干饼。在一些实施例中，干燥形式是粉末。在一些实施例中，粉末是冻干粉末或喷雾干燥粉末。
在一些实施例中，制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些实施例中，制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些实施例中，制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂的赋形剂组合，从而制备该溶液。
在一些实施例中，制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的溶液的方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些实施例中，干燥包括冻干。
在一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在一些实施例中，该方法进一步包括将干燥形式与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些实施例中，干燥包括冻干。
在一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在一些实施例中，该方法进一步包括将粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些实施例中，该方法还包括将喷雾干燥粉末与另外成分混合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些实施例中，该方法进一步包括将冻干物与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些实施例中，该方法进一步包括将冻干粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含填充剂和冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含来自细菌的EV的液体制剂与包含冻干保护剂(或基本上由其组成)的赋形剂组合以制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干饼。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的溶液的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的溶液。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的干燥形式的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该干燥形式。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，干燥包括冻干。
在一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在一些实施例中，该方法进一步包括将干燥形式与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的干燥形式。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
干燥该溶液，从而制备该粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
干燥该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该粉末。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，干燥包括冻干。
在一些实施例中，干燥包括喷雾干燥。
在一些实施例中，该方法进一步包括将粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的喷雾干燥粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
喷雾干燥该溶液，从而制备该喷雾干燥粉末。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，该方法还包括将喷雾干燥粉末与另外成分混合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的喷雾干燥粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干物的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干物。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，该方法进一步包括将冻干物与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干物。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干粉末的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；
冷冻干燥(冻干)该溶液以制备饼，并且
碾磨(例如，研磨)该饼，从而制备该冻干粉末。
在一些实施例中，EV来自细菌。
在一些实施例中，该方法进一步包括将冻干粉末与另外成分组合。在一些实施例中，另外成分包括赋形剂，例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干粉末。
在一些方面，本披露内容提供了一种制备包含细胞外囊泡(EV)的冻干饼的方法，该方法包括：
将包含EV的液体制剂与包含一种或多种赋形剂的原液组合，其中原液包含表A、B、C、D、K或P中提供的配方，从而制备溶液；并且
冷冻干燥(冻干)该溶液，从而制备该冻干饼。
在一些实施例中，本披露内容提供了通过本文所述的方法制备的冻干饼。
制备治疗性组合物的方法
本披露内容还提供了制备治疗性组合物的方法。在一些实施例中，该方法包括将本文所述的溶液或干燥形式与药学上可接受的赋形剂例如助流剂、润滑剂和/或稀释剂组合，从而制备治疗性组合物。
本披露内容还提供了制备含有本文所述的干燥形式的治疗性组合物例如固体剂型的方法。在一些实施例中，固体剂型是胶囊、片剂或微型片剂。
本披露内容还提供了制备包含干燥形式的固体剂型(例如，用于口服施用)(例如，用于制药用途)的方法。在一些实施例中，干燥形式包含细胞外囊泡(EV)和包含填充剂的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式包含细胞外囊泡(EV)和包含冻干保护剂的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式包含细胞外囊泡(EV)和包含填充剂和冻干保护剂的赋形剂。在一些实施例中，干燥形式还包含一种或多种另外组分。在一些实施例中，干燥形式与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。在一些实施例中，固体剂型被肠溶包衣，例如，用本文所述的包衣。
在一些方面，制备固体剂型的方法包括：
将干燥形式装入胶囊，从而制备胶囊，从而制备固体剂型；
任选地在装入胶囊之前将干燥形式与药学上可接受的赋形剂组合；和/或
在装入胶囊之后任选地对胶囊进行封口(例如，在装入胶囊之后任选地对胶囊进行封口)。
在一些方面，制备固体剂型的方法包括：
将本文所述的干燥形式压制成微型片剂，从而制备微型片剂并由此制备固体剂型；
任选地在压制之前将干燥形式与药学上可接受的赋形剂混合；
任选地用多个肠溶包衣的微型片剂填充胶囊。
在一些方面，制备固体剂型的方法包括：
将本文所述的粉末压制成片剂，从而制备片剂，并且从而制备固体剂型；
任选地在压制之前将干燥形式与药学上可接受的赋形剂混合。
在某些实施例中，该方法包括在将粉末和一种或多种(例如，一种、两种或三种)赋形剂组合成治疗性组合物例如固体剂型之前对粉末进行湿法制粒。在一些实施例中，湿法制粒包含(i)将粉末与制粒流体(例如，单独或组合的水、乙醇或异丙醇)混合。在一些实施例中，湿法制粒包含将粉末与水混合。在一些实施例中，湿法制粒包括(ii)干燥混合的粉末和制粒流体(例如，在流化床干燥器上干燥)。在一些实施例中，湿法制粒包括(iii)碾磨(例如研磨)干燥的粉末和制粒流体。然后将碾磨的(例如，研磨的)粉末和制粒流体与一种或多种(例如，一种、两种或三种)赋形剂组合以制备治疗性组合物，例如固体剂型。在一些实施例中，粉末是冻干粉末。在一些实施例中，粉末是喷雾干燥粉末。
在一些实施例中，本文所述的干燥形式在液体(例如，缓冲液、汁液或水)中重构以制备治疗性组合物。
在一些实施例中，将溶液重悬浮(例如，稀释)在液体(例如，缓冲液、汁液或水)中以制备治疗性组合物。
在一些实施例中，包含本文所述的干燥形式的治疗性组合物在液体(例如，缓冲液、汁液或水)中重构以制备悬浮液。
在一些实施例中，将包含溶液的治疗性组合物重悬浮(例如，稀释)在液体(例如，缓冲液、汁液或水)中以制备悬浮液。
γ-辐照
粉末和冷冻生物质(例如，来自细菌的EV)可以被γ辐照。
在一些实施例中，粉末(例如，来自细菌的EV)在环境温度下以17.5kGy辐射单位进行γ辐照。
在一些实施例中，冷冻生物质(例如，来自细菌的EV)在干冰存在下以25kGy辐射单位进行γ辐照。
另外的治疗剂
在某些方面，本文提供的方法包括向受试者单独地或与另外的治疗剂组合地施用本文所述的治疗性组合物。在一些实施例中，另外的治疗剂是免疫抑制剂、抗炎剂、类固醇和/或癌症治疗剂。
在一些实施例中，在施用另外的治疗剂之前(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之前)将包含来自细菌的EV的治疗性组合物施用给受试者。在一些实施例中，在施用另外的治疗剂之后(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时之后或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之后)将包含来自细菌的EV的治疗性组合物施用给受试者。在一些实施例中，将包含来自细菌的EV的治疗性组合物和另外的治疗剂同时或几乎同时施用给受试者(例如施用彼此在一小时内发生)。
在一些实施例中，在将包含来自细菌的EV的治疗性组合物施用于受试者之前(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时之前或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之前)给受试者施用抗生素。在一些实施例中，在将包含来自细菌的EV的治疗性组合物施用于受试者之后(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时之后或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之后)给受试者施用抗生素。在一些实施例中，将包含来自细菌的EV的治疗性组合物和抗生素同时或几乎同时施用给受试者(例如施用彼此在一小时内发生)。
在一些实施例中，另外的治疗剂是癌症治疗剂。在一些实施例中，癌症治疗剂是化学治疗剂。这些化学治疗剂的实例包含(但不限于)烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)及环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及乌得哌(uredopa)；乙撑亚胺及甲基密胺，包含六甲密胺(altretamine)、三乙撑密胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺及三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包含合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包含其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γlI及卡奇霉素Ωl1；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包含吗啉基-多柔比星、氰吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯酮(testolactone)；抗肾上腺素，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布什(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦辛(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣疱菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂配位错合物，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)及卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施例中，癌症治疗剂是癌症免疫疗法药剂。免疫疗法是指使用受试者的免疫系统来治疗癌症的治疗，例如，检查点抑制剂、癌症疫苗、细胞因子、细胞疗法、CAR-T细胞及树突细胞疗法。检查点抑制剂免疫疗法的非限制性实例包含尼沃鲁单抗(Nivolumab)(BMS，抗PD-1)、派姆单抗(Pembrolizumab)(Merck，抗PD-1)、伊匹单抗(Ipilimumab)(BMS，抗CTLA-4)、MEDI4736(阿斯利康公司(AstraZeneca)，抗PD-L1)及MPDL3280A(罗氏公司(Roche)，抗PD-L1)。其他免疫疗法可为肿瘤疫苗，例如Gardail、Cervarix、BCG、西普赛尔-T(sipulencel-T)、Gp100:209-217、AGS-003、DCVax-L、阿尔土赛尔-L(Algenpantucel-L)、特尔土赛尔-L(Tergenpantucel-L)、TG4010、ProstAtak、Prostvac-V/R-TRICOM、林多穆尔(Rindopepimul)、E75乙酸肽、IMA901、POL-103A、贝拉土赛尔-L(Belagenpumatucel-L)、GSK1572932A、MDX-1279、GV1001及替西泰德(Tecemotide)。免疫疗法药剂可经由注射(例如经静脉内、经肿瘤内、经皮下或注射至淋巴结中)来施用，但还可经口、经局部或经由气溶胶来施用。免疫疗法可包括佐剂(例如细胞因子)。
在一些实施例中，免疫疗法药剂是免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制在广义上是指抑制癌细胞可产生的检查点以预防或下调免疫应答。免疫检查点蛋白的实例包括但不限于CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。免疫检查点抑制剂可为结合至并抑制免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段。免疫检查点抑制剂的实例包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0010718C(阿维鲁单抗)、AUR-012及STI-A1010。
在一些实施例中，本文提供的方法包括施用本文描述的治疗性组合物与一种或多种另外的治疗剂的组合。在一些实施例中，本文披露的方法包括施用两种免疫疗法药剂(例如，免疫检查点抑制剂)。例如，本文提供的方法包括将本文描述的药物组合物与PD-1抑制剂(例如派姆单抗或尼沃鲁单抗或匹利珠单抗)或CLTA-4抑制剂(例如伊匹单抗)或PD-L1抑制剂(例如阿维鲁单抗)组合施用。
在一些实施例中，免疫疗法药剂是(例如)结合至癌症相关抗原的抗体或其抗原结合片段。癌症相关抗原的实例包括但不限于亲脂素(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、α-胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-链蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延长因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、海普森(Hepsin)、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放素4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(又称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、莱格西因(Lengsin)、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、黏蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌凝蛋白、I类肌凝蛋白、N-raw、NA88-A、新-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多态上皮黏蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、分离蛋白1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活蛋白、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施例中，抗原是新抗原。
在一些实施例中，免疫疗法药剂是癌症疫苗和/或癌症疫苗的组分(例如，抗原性肽和/或蛋白质)。癌症疫苗可为蛋白质疫苗、核酸疫苗或其组合。例如，在一些实施例中，癌症疫苗包括含有癌症相关抗原的表位的多肽。在一些实施例中，癌症疫苗包括编码癌症相关抗原的表位的核酸(例如，DNA或RNA(例如mRNA))。癌症相关抗原的实例包括但不限于亲脂素(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、α-胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-链蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延长因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、海普森(Hepsin)、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放素4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(又称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、莱格西因(Lengsin)、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、黏蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌凝蛋白、I类肌凝蛋白、N-raw、NA88-A、新-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多态上皮黏蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、分离蛋白1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活蛋白、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施例中，抗原是新抗原。在一些实施例中，将癌症疫苗与佐剂一起施用。佐剂的实例包括但不限于免疫调节蛋白、佐剂65、α-GalCer、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、β-葡聚糖肽、CpG ODN DNA、GPI-0100、脂质A、脂多糖、利波夫(Lipovant)、蒙塔尼(Montanide)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺、Pam3CSK4、quil A、霍乱毒素(CT)及来自肠毒性大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热毒素(LT)，包括这类的衍生物(CTB、mmCT、CTA1-DD、LTB、LTK63、LTR72、dmLT)及海藻糖二霉菌酸酯。
在一些实施例中，免疫疗法药剂是用于受试者的免疫调节蛋白。在一些实施例中，该免疫调节蛋白是细胞因子或趋化因子。免疫调节蛋白的实例包括但不限于B淋巴细胞化学引诱物(“BLC”)、C-C基序趋化因子11(“嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin-1”)、嗜酸性粒细胞趋化蛋白2(“嗜酸性粒细胞趋化因子-2”)、粒细胞群落刺激因子(“G-CSF”)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(“GM-CSF”)、1-309、细胞间黏附分子1(“ICAM-1”)、干扰素α(“IFN-α”)、干扰素β(“IFN-β”)、干扰素γ(“IFN-γ”)、白细胞介素-1α(“IL-1α”)、白细胞介素-1β(“IL-1β”)、白细胞介素1受体拮抗剂(“IL-1ra”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-6可溶性受体(“IL-6sR”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12的亚基β(“IL-12p40”或“IL-12p70”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、白细胞介素-15(“IL-15”)、白细胞介素-16(“IL-16”)、白细胞介素17A-F(“IL-17A-F”)、白细胞介素-18(“IL-18”)、白细胞介素-21(“IL-21”)、白细胞介素-22(“IL-22”)、白细胞介素-23(“IL-23”)、白细胞介素-33(“IL-33”)、趋化因子(C-C基序)配体2(“MCP-1”)、巨噬细胞群落刺激因子(“M-CSF”)、由γ干扰素诱导的单核因子(“MIG”)、趋化因子(C-C基序)配体2(“MIP-1α”)、趋化因子(C-C基序)配体4(“MIP-1β”)、巨噬细胞炎症蛋白-1-δ(“MIP-1δ”)、血小板源生长因子亚基B(“PDGF-BB”)、趋化因子(C-C基序)配体5、调控活化正常T细胞表达及分泌蛋白(“RANTES”)、TIMP金属肽酶抑制剂1(“TIMP-1”)、TIMP金属肽酶抑制剂2(“TIMP-2”)、肿瘤坏死因子、淋巴毒素-α(“TNFα”)、肿瘤坏死因子、淋巴毒素-β(“TNFβ”)、1型可溶性TNF受体(“sTNFRI”)、sTNFRIIAR、脑源神经营养因子(“BDNF”)、碱性成纤维细胞生长因子(“bFGF”)、骨成形性蛋白4(“BMP-4”)、骨成形性蛋白5(“BMP-5”)、骨成形性蛋白7(“BMP-7”)、神经生长因子(“b-NGF”)、表皮生长因子(“EGF”)、表皮生长因子受体(“EGFR”)、内分泌腺源血管内皮生长因子(“EG-VEGF”)、成纤维细胞生长因子4(“FGF-4”)、角质细胞生长因子(“FGF-7”)、生长分化因子15(“GDF-15”)、神经胶细胞源神经营养因子(“GDNF”)、生长激素、结合肝素的EGF样生长因子(“HB-EGF”)、肝细胞生长因子(“HGF”)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(“IGFBP-1”)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(“IGFBP-2”)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(“IGFBP-3”)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(“IGFBP-4”)、胰岛素样生长因子结合蛋白6(“IGFBP-6”)、胰岛素样生长因子1(“IGF-1”)、胰岛素、巨噬细胞群落刺激因子(“M-CSF R”)、神经生长因子受体(“NGF R”)、神经营养因子-3(“NT-3”)、神经营养因子-4(“NT-4”)、破骨细胞发生抑制因子(“护骨素(Osteoprotegerin)”)、血小板源生长因子受体(“PDGF-AA”)、磷脂酰肌醇-聚糖生物合成蛋白(“PIGF”)、Skp、Cullin、含有F-盒的复合物(“SCF”)、干细胞因子受体(“SCF R”)、转形生长因子α(“TGFα”)、转形生长因子β-1(“TGFβ1”)、转形生长因子β-3(“TGFβ3”)、血管内皮生长因子(“VEGF”)、血管内皮生长因子受体2(“VEGFR2”)、血管内皮生长因子受体3(“VEGFR3”)、VEGF-D6Ckine、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(“Axl”)、β细胞素(Betacellulin)(“BTC”)、黏膜相关上皮趋化因子(“CCL28”)、趋化因子(C-C基序)配体27(“CTACK”)、趋化因子(C-X-C基序)配体16(“CXCL16”)、C-X-C基序趋化因子5(“ENA-78”)、趋化因子(C-C基序)配体26(“嗜酸性粒细胞趋化因子-3”)、粒细胞趋化蛋白2(“GCP-2”)、GRO、趋化因子(C-C基序)配体14(“HCC-l”)、趋化因子(C-C基序)配体16(“HCC-4”)、白细胞介素-9(“IL-9”)、白细胞介素-17F(“IL-17F”)、白细胞介素-18结合蛋白(“IL-18BPa”)、白细胞介素-28A(“IL-28A”)、白细胞介素29(“IL-29”)、白细胞介素31(“IL-31”)、C-X-C基序趋化因子10(“IP-10”)、趋化因子受体CXCR3(“I-TAC”)、白血病抑制因子(“LIF”)、Light、趋化因子(C基序)配体(“淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)”)、单核细胞化学吸引蛋白2(“MCP-2”)、单核细胞化学吸引蛋白3(“MCP-3”)、单核细胞化学吸引蛋白4(“MCP-4”)、巨噬细胞源趋化因子(“MDC”)、巨噬细胞迁移抑制因子(“MIF”)、趋化因子(C-C基序)配体20(“MIP-3α”)、C-C基序趋化因子19(“MIP-3β”)、趋化因子(C-C基序)配体23(“MPIF-1”)、巨噬细胞刺激蛋白α链(“MSPα”)、核小体组装蛋白1样4(“NAP-2”)、分泌磷蛋白1(“骨桥蛋白(Osteopontin)”)、肺及活化调控细胞因子(“PARC”)、血小板因子4(“PF4”)、基质细胞源因子-1α(“SDF-1α”)、趋化因子(C-C基序)配体17(“TARC”)、胸腺表达的趋化因子(“TECK”)、胸腺基质淋巴生成素(“TSLP 4-IBB”)、CD 166抗原(“ALCAM”)、分化簇80(“B7-1”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(“BCMA”)、分化簇14(“CD14”)、分化簇30(“CD30”)、分化簇40(“CD40配体”)、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(胆管糖蛋白)(“CEACAM-1”)、死亡受体6(“DR6”)、脱氧胸苷激酶(“Dtk”)、1型膜糖蛋白(“内皮糖蛋白(Endoglin)”)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(“ErbB3”)、内皮-白血球黏附分子1(“E-选择素(Selectin)”)、细胞凋亡抗原1(“Fas”)、Fms样酪氨酸激酶3(“Flt-3L”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1(“GITR”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员14(“HVEM”)、细胞间黏附分子3(“ICAM-3”)、IL-1R4、IL-1RI、IL-10Rβ、IL-17R、IL-2Rγ、IL-21R、溶酶体膜蛋白2(“LIMPII”)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(“脂质运载蛋白-2”)、CD62L(“L-选择素”)、淋巴内皮(“LYVE-1”)、I类MHC多肽相关序列A(“MICA”)、I类MHC多肽相关序列B(“MICB”)、NRGl-βl、β-型血小板源生长因子受体(“PDGF Rβ”)、血小板内皮细胞黏附分子(“PECAM-1”)、RAGE、A型肝炎病毒细胞受体1(“TIM-1”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员IOC(“TRAIL R3”)、特拉平(Trappin)蛋白转谷氨酰胺酶结合结构域(“特拉平-2”)、尿激酶受体(“uPAR”)、血管细胞黏附蛋白1(“VCAM-1”)、XEDAR活化素A、野鼠色相关蛋白(“AgRP”)、核糖核酸酶5(“血管生成素(Angiogenin)”)、血管生成素(Angiopoietin)1、血管抑素(Angiostatin)、卡色谱因(Catheprin)S、CD40、隐藏家族蛋白IB(“Cripto-1”)、DAN、Dickkopf相关蛋白1(“DKK-1”)、E-钙黏蛋白、上皮细胞黏附分子(“EpCAM”)、Fas配体(FasL或CD95L)、Fcg RIIB/C、卵泡抑素、半乳糖凝集素-7、细胞间黏附分子2(“ICAM-2”)、IL-13Rl、IL-13R2、IL-17B、IL-2Ra、IL-2Rb、IL-23、LAP、神经元细胞黏附分子(“NrCAM”)、纤维蛋白溶酶原活化抑制剂-1(“PAI-1”)、血小板源生长因子受体(“PDGF-AB”)、抵抗素(Resistin)、基质细胞源因子1(“SDF-1β”)、sgpl30、分泌型卷曲相关蛋白2(“ShhN”)、唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(“Siglec-5”)、ST2、转形生长因子-β2(“TGFβ2”)、Tie-2、血小板生成素(“TPO”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10D(“TRAIL R4”)、表达于骨髓性细胞上的触发受体1(“TREM-1”)、血管内皮生长因子C(“VEGF-C”)、VEGFRl脂联素、脂素(Adipsin)(“AND”)、α-胎蛋白(“AFP”)、血管生成素样4(“ANGPTL4”)、β-2-微球蛋白(“B2M”)、基底细胞黏附分子(“BCAM”)、碳水化合物抗原125(“CA125”)、癌症抗原15-3(“CA15-3”)、癌胚抗原(“CEA”)、cAMP受体蛋白(“CRP”)、人表皮生长因子受体2(“ErbB2”)、滤泡抑素、滤泡刺激素(“FSH”)、趋化因子(C-X-C基序)配体1(“GROα”)、人绒毛膜促性腺激素(“βHCG”)、胰岛素样生长因子1受体(“IGF-1sR”)、IL-1sRII、IL-3、IL-18Rb、IL-21、瘦素(Leptin)、基质金属蛋白酶-1(“MMP-1”)、基质金属蛋白酶-2(“MMP-2”)、基质金属蛋白酶-3(“MMP-3”)、基质金属蛋白酶-8(“MMP-8”)、基质金属蛋白酶-9(“MMP-9”)、基质金属蛋白酶-10(“MMP-10”)、基质金属蛋白酶-13(“MMP-13”)、神经细胞黏附分子(“NCAM-1”)、巢蛋白(Entactin)(“巢蛋白(Nidogen)-1”)、神经元特异性烯醇酶(“NSE”)、抑瘤素(Oncostatin)M(“OSM”)、原降钙素(Procalcitonin)、泌乳素(Prolactin)、前列腺特异性抗原(“PSA”)、结合唾液酸的Ig样凝集素9(“Siglec-9”)、ADAM 17内肽酶(“TACE”)、甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)、金属蛋白酶抑制剂4(“TIMP-4”)、TSH2B4、含有去整合素(Disintegrin)及金属蛋白酶结构域的蛋白质9(“ADAM-9”)、血管生成素2、肿瘤坏死因子配体超家族成员13/富酸性白氨酸核磷蛋白32家族成员B(“APRIL”)、骨成形性蛋白2(“BMP-2”)、骨成形性蛋白9(“BMP-9”)、补体组分5a(“C5a”)、细胞自溶酶L、CD200、CD97、趋化素(Chemerin)、肿瘤坏死因子受体超家族成员6B(“DcR3”)、脂肪酸结合蛋白2(“FABP2”)、成纤维细胞活化蛋白、α(“FAP”)、成纤维细胞生长因子19(“FGF-19”)、半乳糖凝集素-3、肝细胞生长因子受体(“HGFR”)、IFN-γα/βR2、胰岛素样生长因子2(“IGF-2”)、胰岛素样生长因子2受体(“IGF-2R”)、白细胞介素-1受体6(“IL-1R6”)、白细胞介素24(“IL-24”)、白细胞介素33(“IL-33”)、激肽释放素(Kallikrein)14、天门冬酰胺酰基内肽酶(“天门冬酰胺内肽酶(Legumain)”)、氧化型低密度脂蛋白受体1(“LOX-1”)、甘露糖结合凝集素(“MBL”)、脑啡肽酶(Neprilysin)(“NEP”)、Notch同系物1、易位相关(果蝇(Drosophila))(“Notch-1”)、肾胚细胞瘤过度表达的蛋白(“NOV”)、骨活化素(Osteoactivin)、程序化细胞死亡蛋白1(“PD-1”)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶(“PGRP-5”)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)A4、分泌型卷曲相关蛋白3(“sFRP-3”)、血栓调节蛋白(Thrombomodulin)、Toll样受体2(“TLR2”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(“TRAIL Rl”)、运铁蛋白(“TRF”)、WIF-lACE-2、白蛋白、AMICA、血管生成素4、B细胞活化因子(“BAFF”)、碳水化合物抗原19-9(“CA19-9”)、CD 163、丛生蛋白(Clusterin)、CRT AM、趋化因子(C-X-C基序)配体14(“CXCL14”)、胱抑素(Cystatin)C、核心蛋白聚糖(Decorin)(“DCN”)、Dickkopf相关蛋白3(“Dkk-3”)、δ样蛋白质1(“DLL1”)、胎球蛋白(Fetuin)A、肝素结合生长因子1(“aFGF”)、叶酸受体α(“FOLR1”)、弗林蛋白酶(Furin)、GPCR相关分选蛋白1(“GASP-1”)、GPCR相关分选蛋白2(“GASP-2”)、粒细胞群落刺激因子受体(“GCSF R”)、丝氨酸蛋白酶海普森(“HAI-2”)、白细胞介素-17B受体(“IL-17B R”)、白细胞介素27(“IL-27”)、淋巴细胞活化基因3(“LAG-3”)、缺脂脂蛋白A-V(“LDL R”)、胃蛋白酶原I、视黄醇结合蛋白4(“RBP4”)、SOST、类肝素硫酸蛋白聚糖(“共结合蛋白聚糖-1(Syndecan-1)”)、肿瘤坏死因子受体超家族成员13B(“TACI”)、组织因子通路抑制剂(“TFPI”)、TSP-1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(“TRAIL R2”)、TRANCE、肌钙蛋白I(Troponin I)、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(“uPA”)、钙黏蛋白5、2型或VE-钙黏蛋白(血管内皮)(还称为CD144，“VE-钙黏蛋白”)、WNTl可诱导型信号传导通路蛋白1(“WISP-1”)及核因子κB的受体活化剂(“RANK”)。
在一些实施例中，癌症治疗剂是抗癌症化合物。示例性抗癌症化合物包括但不限于阿仑单抗阿利维A酸/>阿那曲唑/>贝伐单抗贝沙罗汀/>硼替佐米/>博舒替尼/>本妥昔单抗/>卡巴坦尼(CometriqTM)、卡菲佐米(KyprolisTM)、西妥昔单抗克里唑蒂尼/>达沙替尼/>地尼介白素/>盐酸埃罗替尼/>依维莫司/>依西美坦/>氟维司群吉非替尼/>替坦异贝莫单抗/>甲磺酸伊马替尼伊匹单抗(YervoyTM)、二对甲苯磺酸拉帕替尼/>来曲唑尼洛替尼/>奥法木单抗/>帕尼单抗/>盐酸帕唑帕尼/>帕妥珠单抗(PerjetaTM)、普拉曲沙/>瑞戈非尼利妥昔单抗/>罗米地辛/>甲苯磺酸索拉非尼苹果酸舒尼替尼/>他莫昔芬、西罗莫司/>托瑞米芬托西莫单抗及131I-托西莫单抗/>曲妥珠单抗/>维甲酸/>凡德他尼/>威罗菲尼/>伏立诺他及阿柏西普/>
修饰调节基因表达及其他细胞功能的蛋白质的功能的示例性抗癌症化合物(例如，HDAC抑制剂，类视黄醇受体配体)是伏立诺他贝沙罗汀/>及罗米地辛/>阿利维A酸/>及维甲酸/>
诱导细胞凋亡的示例性抗癌症化合物(例如，蛋白酶体抑制剂，叶酸拮抗剂)是硼替佐米卡菲佐米(KyprolisTM)及普拉曲沙/>
增加抗肿瘤免疫应答的示例性抗癌症化合物(例如抗CD20、抗CD52；抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4)为利妥昔单抗阿仑单抗/>奥法木单抗及伊匹单抗(YervoyTM)。
将毒剂递送至癌细胞的示例性抗癌症化合物(例如，抗CD20-放射性核素融合物；IL-2-白喉毒素融合物；抗CD30-单甲基澳瑞他汀E(MMAE)-融合物)是托西莫单抗及131I-托西莫单抗及替坦异贝莫单抗/>地尼介白素/>及本妥昔单抗/>
其他示例性抗癌症化合物是小分子抑制剂及其结合物，例如，Janus激酶、ALK、Bcl-2、PARP、PI3K、VEGF受体、Braf、MEK、CDK及HSP90。
示例性基于铂的抗癌症化合物包括(例如)顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂(Triplatin)及脂铂(Lipoplatin)。适用于治疗的其他基于金属的药物包括但不限于基于钌的化合物、二茂铁衍生物、基于钛的化合物及基于镓的化合物。
在一些实施例中，癌症治疗剂是包括放射性核素的放射性部分。示例性放射性核素包括但不限于Cr-51、Cs-131、Ce-134、Se-75、Ru-97、I-125、Eu-149、Os-189m、Sb-119、I-123、Ho-161、Sb-117、Ce-139、In-111、Rh-103m、Ga-67、Tl-201、Pd-103、Au-195、Hg-197、Sr-87m、Pt-191、P-33、Er-169、Ru-103、Yb-169、Au-199、Sn-121、Tm-167、Yb-175、In-113m、Sn-113、Lu-177、Rh-105、Sn-117m、Cu-67、Sc-47、Pt-195m、Ce-141、I-131、Tb-161、As-77、Pt-197、Sm-153、Gd-159、Tm-173、Pr-143、Au-198、Tm-170、Re-186、Ag-111、Pd-109、Ga-73、Dy-165、Pm-149、Sn-123、Sr-89、Ho-166、P-32、Re-188、Pr-142、Ir-194、In-114m/In-114及Y-90。
在一些实施例中，癌症治疗剂是抗生素。例如，如果根据本文提供的方法来检测癌症相关细菌和/或癌症相关微生物组特征的存在，则可施用抗生素以从受试者消除癌症相关细菌。“抗生素”在广义上是指能够抑制或预防细菌感染的化合物。抗生素可以诸多方式(包含根据其用于特定感染的用途、其作用机制、其生物可用性或其靶微生物范围(例如革兰氏阴性细菌对革兰氏阳性细菌、需氧细菌对厌氧细菌等))进行分类且可使用这些方式来杀死宿主的特定区域(“生态位”)中的特定细菌(Leekha等人,2011.General Principlesof Antimicrobial Therapy[抗微生物疗法的一般原则].Mayo Clin Proc.[梅欧医院院刊]86(2):156-167)。在某些实施例中，可使用抗生素来选择性靶向特定生态位的细菌。在一些实施例中，可使用已知治疗包含癌症生态位的特定感染的抗生素来靶向癌症相关细菌(包含该生态位中非癌症相关细菌)。在一些实施例中，在包含来自细菌的EV的治疗性组合物之后施用抗生素。在一些实施例中，在包含来自细菌的EV的治疗性组合物之前施用抗生素。
在一些方面，可基于杀细菌或细菌抑制性质来选择抗生素。杀细菌抗生素包含破坏细胞壁(例如，β-内酰胺)、细胞膜(例如，达托霉素(daptomycin))或细菌DNA(例如，氟喹诺酮(fluoroquinolone))的作用机制。细菌抑制剂抑制细菌复制且包含磺酰胺、四环素(tetracycline)及巨环内酯并通过抑制蛋白质合成来发挥作用。另外，尽管一些药物可在某些生物体中具有杀细菌性且在其他生物体中具有细菌抑制性，但知晓靶生物体使得本领域技术人员可选择具有适当性质的抗生素。在某些治疗条件中，细菌抑制抗生素抑制杀细菌抗生素的活性。因此，在某些实施例中，并不组合杀细菌抗生素及细菌抑制抗生素。
抗生素包括但不限于氨基糖苷、安莎霉素(ansamycin)、碳头孢烯(carbacephem)、碳青霉烯(carbapenem)、头孢菌素(cephalosporin)、糖肽、林可酰胺(lincosamide)、脂肽、巨环内酯、单酰胺菌素(monobactam)、硝基呋喃、噁唑烷酮、青霉素(penicillin)、多肽抗生素、喹诺酮(quinolone)、氟喹诺酮、磺酰胺、四环素及抗分枝杆菌化合物及其组合。
氨基糖苷包括但不限于阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、妥布霉素(Tobramycin)、巴龙霉素(Paromomycin)及大观霉素(Spectinomycin)。氨基糖苷可有效抵抗例如革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及土伦病弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis))且抵抗某些需氧细菌，但对于专性/兼性厌氧菌具有较小有效性。据信，氨基糖苷结合至细菌30S或50S核糖体亚基，由此抑制细菌蛋白合成。
安莎霉素包括但不限于格尔德霉素(Geldanamycin)、除莠霉素(Herbimycin)、利福霉素(Rifamycin)及曲张链菌素(Streptovaricin)。据信，格尔德霉素及除莠霉素抑制或改变热休克蛋白90的功能。
碳头孢烯包括但不限于氯碳头孢(Loracarbef)。据信，碳头孢烯抑制细菌细胞壁合成。
碳青霉烯包括但不限于厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南(Imipenem)/西司他丁(Cilastatin)及美罗培南(Meropenem)。碳青霉烯作为宽谱抗生素对革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均具有杀细菌性。据信，碳青霉烯抑制细菌细胞壁合成。
头孢菌素包括但不限于头孢羟氨苄(Cefadroxil)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢金素(Cefalothin)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢丙烯(Cefprozil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢克肟(Cefixime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢托仑(Cefditoren)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢布烯(Ceftibuten)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢他洛林酯(Ceftaroline fosamil)及头孢比普(Ceftobiprole)。所选头孢菌素可效抵抗(例如)革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌(包含假单胞菌(Pseudomonas))，某些头孢菌素可有效抵抗甲氧西林(methicillin)抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)。据信，头孢菌素通过破坏细菌细胞壁的肽聚糖层的合成来抑制细菌细胞壁合成。
糖肽包括但不限于替考拉宁(Teicoplanin)、万古霉素(Vancomycin)及特拉万星(Telavancin)。糖肽可有效抵抗(例如)好氧及厌氧革兰氏阳性细菌(包含MRSA及艰难梭菌)。据信，糖肽通过破坏细菌细胞壁的肽聚糖层的合成来抑制细菌细胞壁合成。
林可酰胺包括但不限于克林达霉素(Clindamycin)及林可霉素(Lincomycin)。林可酰胺可有效抵抗例如厌氧细菌以及葡萄球菌属(Staphylococcus)及链球菌属(Streptococcus)。据信，林可酰胺结合至细菌50S核糖体亚基，由此抑制细菌蛋白合成。
脂肽包括但不限于达托霉素。脂肽可有效抵抗例如革兰氏阳性细菌。据信，脂肽结合至细菌膜并引起快速去极化。
巨环内酯包括但不限于阿奇霉素(Azithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、地红霉素(Dirithromycin)、红霉素(Erythromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、醋竹桃霉素(Troleandomycin)、泰利霉素(Telithromycin)及螺旋霉素(Spiramycin)。巨环内酯可有效抵抗例如链球菌属及支原体属(Mycoplasma)。据信，巨环内酯结合至细菌或50S核糖体亚基，由此抑制细菌蛋白合成。
单酰胺菌素包括但不限于胺曲南(Aztreonam)。单酰胺菌素可有效抵抗例如革兰氏阴性细菌。据信，单酰胺菌素通过破坏细菌细胞壁的肽聚糖层的合成来抑制细菌细胞壁合成。
硝基呋喃包括但不限于呋喃唑酮(Furazolidone)及呋喃妥因(Nitrofurantoin)。
噁唑烷酮包括但不限于利奈唑胺(Linezolid)、泼斯唑来(Posizolid)、雷得唑来(Radezolid)及特地唑胺(Torezolid)。据信，噁唑烷酮是蛋白质合成抑制剂。
青霉素包括但不限于阿莫西林(Amoxicillin)、氨苄西林(Ampicillin)、阿洛西林(Azlocillin)、羧苄青霉素(Carbenicillin)、氯噻青霉素(Cloxacillin)、二氯噻青霉素(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林(Mezlocillin)、甲氧西林、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、青霉素G、青霉素V、哌拉西林(Piperacillin)、替莫西林(Temocillin)及替卡西林(Ticarcillin)。青霉素可有效抵抗例如革兰氏阳性细菌、兼性厌氧菌(例如链球菌属、包柔氏螺旋体属(Borrelia)及密螺旋体属(Treponema))。据信，青霉素通过破坏细菌细胞壁的肽聚糖层的合成来抑制细菌细胞壁合成。
青霉素组合包括但不限于阿莫西林/克拉维酸盐(clavulanate)、氨苄西林/舒巴坦(sulbactam)、哌拉西林/三唑巴坦(tazobactam)及替卡西林/克拉维酸盐。
多肽抗生素包括但不限于杆菌肽(Bacitracin)、黏菌素(Colistin)及多黏菌素(Polymyxin)B及E。多肽抗生素可有效抵抗例如革兰氏阴性细菌。据信，某些多肽抗生素抑制涉及细菌细胞壁的肽聚糖层的合成的焦磷酸异戊二烯基酯，而其他多肽抗生素通过置换细菌相对离子来去稳定细菌外膜。
喹诺酮及氟喹诺酮包括但不限于环丙沙星(Ciprofloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、吉米沙星(Gemifloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、萘啶酮酸(Nalidixic acid)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、曲伐沙星(Trovafloxacin)、格帕沙星(Grepafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)及替马沙星(Temafloxacin)。喹诺酮/氟喹诺酮可有效抵抗(例如)链球菌属及奈瑟菌属(Neisseria)。据信，喹诺酮/氟喹诺酮抑制细菌DNA旋转酶或拓扑异构酶IV，由此抑制DNA复制及转录。
磺酰胺包括但不限于磺胺米隆(Mafenide)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛(Sulfadimethoxine)、磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、磺胺亚胺基(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、磺胺异噁唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)(复方磺胺甲噁唑(Co-trimoxazole))及磺酰胺基柯衣汀(Sulfonamidochrysoidine)。据信，磺酰胺通过竞争性抑制二氢蝶酸合成酶来抑制叶酸合成，由此抑制核酸合成。
四环素类包括但不限于地美环素(Demeclocycline)、强力霉素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline)、土霉素(Oxytetracycline)及四环素。四环素可有效抵抗例如革兰氏阴性细菌。据信，四环素结合至细菌30S核糖体亚基，由此抑制细菌蛋白合成。
抗分枝杆菌化合物包括但不限于氯法齐明(Clofazimine)、胺苯砜(Dapsone)、卷曲霉素(Capreomycin)、环丝氨酸(Cycloserine)、乙胺丁醇(Ethambutol)、乙硫异烟酰胺(Ethionamide)、异烟酸肼(Isoniazid)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、利福平(Rifampicin)、利福布汀(Rifabutin)、利福喷丁(Rifapentine)及链霉素(Streptomycin)。
合适的抗生素还包含胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、平板霉素(platensimycin)、奎奴普汀(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)、替吉环素(tigecycline)、替硝唑(tinidazole)、甲氧苄啶-阿莫西林(trimethoprim amoxicillin)/克拉维酸盐、氨苄西林/舒巴坦、安福霉素-利托菌素(amphomycin ristocetin)、阿奇霉素、杆菌肽、卜福林(buforin)II、卡波霉素(carbomycin)、杀菌肽(cecropin)Pl、克拉霉素、红霉素、呋喃唑酮、夫西地酸、夫西地钠、短杆菌素(gramicidin)、亚胺培南、吲哚菌素(indolicidin)、交沙霉素(josamycin)、马盖纳尼(magainan)II、甲硝唑(metronidazole)、硝基咪唑、米卡霉素(mikamycin)、变链素(mutacin)B-Ny266、变链素B-JHl 140、变链素J-T8、乳链球菌素(nisin)、乳链球菌素A、新生霉素(novobiocin)、竹桃霉素(oleandomycin)、奥斯立星(ostreogrycin)、哌拉西林/三唑巴坦、普那霉素(pristinamycin)、雷莫拉宁(ramoplanin)、牛蛙皮肤抗菌肽(ranalexin)、罗伊氏素(reuterin)、利福昔明(rifaximin)、蔷薇霉素(rosamicin)、罗沙米星(rosaramicin)、大观霉素、螺旋霉素、葡萄霉素(staphylomycin)、链霉杀阳素(streptogramin)、链霉杀阳素A、协同菌素(synergistin)、牛磺罗定(taurolidine)、替考拉宁、泰利霉素、替卡西林/克拉维酸(clavulanic acid)、三乙酰基竹桃霉素(triacetyloleandomycin)、泰洛星(tylosin)、短杆菌酪肽(tyrocidin)、短杆菌素(tyrothricin)、万古霉素、维马霉素(vemamycin)及维吉霉素(virginiamycin)。
在一些实施例中，另外的治疗剂是免疫抑制剂、DMARD、止痛药、类固醇、非类固醇抗炎药(NSAID)或细胞因子拮抗剂，及其组合。代表性药剂包括但不限于环孢菌素、类视黄醇、皮质类固醇、丙酸衍生物、乙酸衍生物、烯醇酸衍生物、芬那酸衍生物、Cox-2抑制剂、鲁美昔布(lumiracoxib)、布洛芬(ibuprophen)、水杨酸胆碱镁(cholin magnesiumsalicylate)、非诺洛芬(fenoprofen)、双水杨酯(salsalate)、二氟苯水杨酸(difunisal)、托美汀(tolmetin)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、依托度酸(etodolac)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、依托考昔(etoricoxib)、MK0966；罗非昔布(rofecoxib)、对乙酰胺基酚(acetominophen)、塞来昔布(Celecoxib)、双氯芬酸(Diclofenac)、曲马多(tramadol)、吡罗昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、屈昔康(droxicam)、氯诺昔康(lornoxicam)、伊索昔康(isoxicam)、甲芬那酸(mefanamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、氟芬那酸(flufenamic acid)、托芬那酸(tolfenamic)、伐地考昔(valdecoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprophen)、非罗考昔(firocoxib)、氨甲喋呤(methotrexate(MTX))、抗疟疾药物(例如，羟基氯喹(hydroxychloroquine)及氯喹(chloroquine))、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(Leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、环孢菌素(cyclosporin)、金盐(gold salt)、米诺环素(minocycline)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、D-青霉胺(D-penicillamine)、米诺环素(minocycline)、金诺芬(auranofin)、他克莫司(tacrolimus)、硫代苯酸金钠(myocrisin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、TNFα拮抗剂(例如，TNFα拮抗剂或TNFα受体拮抗剂)，例如，阿达木单抗依那西普/>英夫利昔单抗(/>TA-650)、聚乙二醇赛妥珠单抗(/>CDP870)、戈利木单抗(/>CNTO 148)、阿那白滞素/>利妥昔单抗/>阿巴西普/>托珠单抗(RoActemra/)、整合素拮抗剂(/>(那他珠单抗))、IL-1拮抗剂(ACZ885(Ilaris))、阿那白滞素/>CD4拮抗剂、IL-23拮抗剂、IL-20拮抗剂、IL-6拮抗剂、BLyS拮抗剂(例如，阿塞西普、/>/LymphoStat-/>(贝利木单抗))、p38抑制剂、CD20拮抗剂(奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗/>)、干扰素γ拮抗剂(芳妥珠单抗(Fontolizumab))、泼尼松龙(prednisolone)、强的松(Prednisone)、地塞米松(dexamethasone)、皮质醇(Cortisol)、可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、曲安奈德(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasome)、氟氢可的松(fludrocortisone)、脱氧皮质酮(deoxycorticosterone)、醛固酮(aldosterone)、强力霉素(Doxycycline)、万古霉素(vancomycin)、吡格列酮(pioglitazone)、SBI-087、SCIO-469、Cura-100、Oncoxin+Viusid、TwHF、甲氧沙林(Methoxsalen)、维生素D-麦角钙化醇(Vitamin D-ergocalciferol)、米那普仑(Milnacipran)、紫杉醇(Paclitaxel)、罗西格塔松(rosigtazone)、他克莫司(Tacrolimus)/>RADOOl、拉帕蒙(rapamune)、雷帕霉素(rapamycin)、福斯马替尼(fostamatinib)、芬太尼(Fentanyl)、XOMA 052、福斯马替尼二钠(Fostamatinib disodium)、罗格列酮(rosightazone)、姜黄素(Curcumin)(LongvidaTM)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)、马拉韦罗(Maraviroc)、雷米普利(ramipnl)、米那普仑(Milnacipran)、考前列酮(Cobiprostone)、生长激素(somatropin)、tgAAC94基因治疗媒剂、MK0359、GW856553、埃索美拉唑(esomeprazole)、依维莫司(everolimus)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、JAKl及JAK2抑制剂、泛JAK抑制剂，例如，四环吡啶酮6(P6)、325、PF-956980、狄诺塞麦(denosumab)、IL-6拮抗剂、CD20拮抗剂、CTLA4拮抗剂、IL-8拮抗剂、IL-21拮抗剂、IL-22拮抗剂、整合素拮抗剂(/>(那他珠单抗))、VGEF拮抗剂、CXCL拮抗剂、MMP拮抗剂、防御素拮抗剂、IL-1拮抗剂(包括IL-1β拮抗剂)，及IL-23拮抗剂(例如，受体诱捕物、拮抗性抗体等)。
在一些实施例中，另外的治疗剂是免疫抑制剂。免疫抑制剂的实例包括但不限于皮质类固醇、美色拉嗪(mesalazine)、美色拉明(mesalamine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯基嘌呤、硫唑嘌呤(azathiopurine)、强的松、氨甲喋呤、抗组胺药、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯、用于鼻炎的抗胆碱能药物、TLR拮抗剂、发炎体抑制剂、抗胆碱能解充血剂、肥大细胞稳定剂、单株抗IgE抗体、疫苗(例如，用于其中使过敏原的量逐渐增加的疫苗接种的疫苗)、细胞因子抑制剂(如抗IL-6抗体)、TNF抑制剂(如英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇赛妥珠单抗、戈利木单抗或依那西普及其组合)。
施用
在某些方面，本文提供将本文所述的治疗性组合物(例如，包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物)递送至受试者的方法。在本文提供的方法的一些实施例中，治疗性组合物与另外的治疗剂的施用联合施用。在一些实施例中，包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物与另外的治疗剂共同配制。在一些实施例中，包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物与另外的治疗剂共同施用。在一些实施例中，在施用包含本文所述的溶液或干燥形式治疗性组合物之前(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分钟之前，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时之前，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之前)，向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施例中，在施用包含本文所述溶液或干燥形式的治疗性组合物之后(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分钟之后，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时之后，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之后)，向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施例中，相同的递送模式用于递送包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物和另外的治疗剂。在一些实施例中，不同的递送模式用于施用包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物和另外的治疗剂。例如，在一些实施例中，包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物是口服施用的，而另外的治疗剂是通过注射施用的(例如，静脉内、肌肉内和/或肿瘤内注射)。
在一些实施例中，本文所述的治疗性组合物每天施用一次。在一些实施例中，本文所述的治疗性组合物每天施用两次。在一些实施例中，本文所述的治疗性组合物被配制成每日剂量。在一些实施例中，本文所述的治疗性组合物配制为每天两次剂量，其中每次剂量为每日剂量的一半。
在某些实施例中，本文所述的治疗性组合物可与任一其他常规抗癌治疗(例如诸如放射疗法及肿瘤手术切除术)联合施用。这些治疗可以根据需要和/或根据指示应用，并且可以在施用包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物之前、同时或之后进行。
剂量方案可为各种方法及量中的任一者，且可通过本领域技术人员根据已知临床因素来确定。如医学技术中已知，任一患者的剂量可取决于许多因素，包含受试者物种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性及总体健康状况、有待施用的特定微生物、持续时间及施用途径、疾病种类及阶段(例如肿瘤大小)及其他化合物(例如同时或近乎同时施用的药物)。除上述因素外，这些水平可受微生物感染性及微生物性质影响，如可由本领域技术人员所测定。在本发明的方法中，微生物的适当最小剂量水平可为足够使微生物存活、生长及复制的水平。可根据剂型、施用途径、靶疾病的程度或阶段等来适当地设定或调节包含本文所述的溶液或干燥形式的治疗性组合物的剂量。例如，药剂的一般有效剂量范围可为0.01mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天、0.1mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天、0.5mg/kg体重/天至500mg/kg体重/天、1mg/kg体重/天至100mg/kg体重/天或5mg/kg体重/天至50mg/kg体重/天。有效剂量可为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500或1000mg/kg体重/天或更高，但剂量并不限于此。
在一些实施例中，向受试者施用的剂量足以预防疾病(例如，自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢疾病或癌症)、延迟其发作或减缓或停止其进展，或减轻疾病的一个或多个症状。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包含所采用特定药剂(例如治疗剂)的强度以及受试者的年龄、物种、病症及体重。还根据以下因素来确定剂量大小：施用途径、时机及频率以及可伴随施用特定治疗剂的任何不良副作用的存在、性质及程度及期望的生理学效果。
可通过本领域技术人员已知的常规范围探测技术来确定合适的剂量及剂量方案。通常，以较小剂量开始治疗，该剂量小于化合物的最佳剂量。然后，以小增量增加剂量直至达到该状况下的最佳效果为止。有效剂量及治疗方案可通过常规及常规方式来确定，例如，其中在实验室动物中以低剂量开始且然后增加剂量，同时监测效果，且还系统地改变剂量方案。通常使用动物研究来测定每千克重量的生物活性药剂的最大可耐受剂量(“MTD”)。本领域技术人员通常在其他物种(包含人)中外推剂量以达到功效，同时避免毒性。
根据上文，在治疗应用中，与影响所选剂量的其他因素相比，用于本发明的治疗剂的剂量尤其取决于以下因素有所变化：活性剂、年龄、体重及接受患者的临床状况及施用疗法的临床医师或从业人员的经历及判断。例如，对于癌症治疗，剂量应足以导致减缓肿瘤的生长，优选地使肿瘤的生长消退，并且最优选地导致癌症的完全消退，或者转移的大小或数目的减小。作为另一个实例，剂量应足以导致减缓受试者正在治疗的疾病的进展，优选地改善受试者正在治疗的疾病的一个或多个症状。
分开施用可包括任何数量的两次或更多次施用，包括二、三、四、五或六次施用。本领域技术人员可容易地根据本领域中已知的用于监测治疗方法的方法及本文提供的其他监测方法确定进行施用的次数或进行一或多次另外的施用的期望。因此，本文提供的方法包括向受试者提供药物组合物的一或多次施用的方法，其中施用次数可通过监测受试者确定，且基于监测的结果，判定是否需提供一或多次另外施用。可基于各种监测结果决定是否需提供一或多次另外施用。
施用间的时间段可为各个时间段中的任一者。施用间的时间段可随各种因素中的任一者而变化，包括监测步骤(如关于施用数量所描述)、受试者建立免疫应答的时间段。在一个实例中，时间段可随受试者建立免疫应答的时间段而变化；例如，时间段可大于受试者建立免疫应答的时间段，例如大于约一周、大于约十天、大于约两周或大于约一个月；在另一个实例中，时间段可小于受试者建立免疫应答的时间段，例如小于约一周、小于约十天、小于约两周或小于约一个月。
在一些实施例中，另外的治疗剂与本文描述的治疗性组合物的组合的递送减少另外的治疗剂的不良反应和/或改善另外的治疗剂的功效。
本文所述的另外的治疗剂的有效剂量是针对特定受试者、组合物及施用模式有效达成所需治疗剂反应且对受试者的毒性最小的另外的治疗剂的量。可使用本文所述的方法来鉴别有效剂量水平且将取决于多种药物动力学因素，包含所施用特定组合物或药剂的活性、施用途径、施用时间、所采用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗受试者的年龄、性别、体重、病症、总体健康状况及先前医学史以及医学技术中熟知的类似因素。一般而言，另外的治疗剂的有效剂量将是所述另外的治疗剂的量，其为有效产生治疗效应的最低剂量。通常这样的有效剂量将取决于上文所述的这些因素。
另外的治疗剂的毒性是受试者在治疗期间及治疗之后经受的不利效应的程度。与另外的治疗毒性相关的不良事件可以包括但不限于腹痛、酸消化不良、酸回流、过敏反应、秃发、全身性过敏性反应、贫血、焦虑、食欲不振、关节痛、无力、运动失调、氮质血症、失去平衡、骨痛、出血、血凝块、低血压、血压升高、呼吸困难、支气管炎、淤血、白细胞计数降低、红细胞计数降低、血小板计数降低、心脏毒性、膀胱炎、出血性膀胱炎、心律失常、心瓣膜疾病、心肌病、冠状动脉疾病、白内障、中枢神经毒性、认知障碍、意识模糊、结膜炎、便秘、咳嗽、痉挛、膀胱炎、深层静脉栓塞、脱水、抑郁、腹泻、眩晕(dizziness)、口干、皮肤干燥、消化不良、呼吸困难(dyspnea)、水肿、电解质不平衡、食道炎、疲乏、生育力丧失、发烧、肠胃气胀、面红、胃逆流、胃食道逆流病、生殖器疼痛、粒细胞减少症、男子女性型乳房、青光眼、脱发、手足综合征(hand-foot syndrome)、头痛、听觉损失、心脏衰竭、心悸、胃灼热、血肿、出血性膀胱炎、肝毒性、高淀粉酶血症、高钙血症、高氯血症、高糖血症、高钾血症、高脂血症、高镁血症、高钠血症、高磷血症、色素沉着、高甘三油酯血症、高尿酸血症、低白蛋白血症、低钙血症、低氯血症、低血糖症、低钾血症、低镁血症、低钠血症、低磷血症、阳萎、感染、注射部位反应、失眠、缺铁、瘙痒、关节痛、肾衰竭、白细胞减少症、肝功能障碍、失忆、闭经、口疮、黏膜炎、肌肉痛、肌痛、骨髓抑制、心肌炎、嗜中性白血球减少性发热、恶心、肾毒性、嗜中性白血球减少症、流鼻血、麻木、耳毒性、疼痛、手足综合征(palmar-plantarerythrodysesthesia)、各类血细胞减少症、心包炎、周边神经病变、咽炎、畏光、光敏感、肺炎(pneumonia)、肺炎(pneumonitis)、蛋白尿、肺栓塞、肺性纤维化、肺毒性、皮疹、心跳加快、直肠出血、坐立不安、鼻炎、癫痫、呼吸短促、鼻窦炎、血小板减少症、耳鸣、泌尿道感染、阴道出血、阴道干燥、眩晕(vertigo)、水潴留(water retention)、虚弱、体重减轻、体重增加及口腔干燥(xerostomia)。一般而言，如果经由疗法所达到的受试者益处胜过受试者因疗法所经历的不良事件，则毒性是可接受的。
免疫障碍
在一些实施例中，本文所述的方法及治疗性组合物涉及治疗或预防与病理学免疫应答相关的疾病或障碍(如自身免疫性疾病、过敏反应和/或炎性疾病)。在一些实施例中，疾病或障碍是炎性肠病(例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎)。在一些实施例中，疾病或障碍是银屑病。在一些实施例中，疾病或障碍是特应性皮炎。
本文所述的方法可用以治疗有需要的任何受试者。如本文中所使用，“有需要的受试者”包括患有与病理学免疫应答相关的疾病或障碍(例如，炎性肠病)的任何受试者，及具有增加获得此疾病或障碍的可能性的任何受试者。
本文所述的治疗性组合物可(例如)用作预防或治疗(部分或完全减少以下疾病的不利影响)自身免疫性疾病，如慢性炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、穆-韦二氏综合征、类风湿性关节炎、多发性硬化或桥本病(Hashimoto's disease)；过敏性疾病，如食物过敏、花粉热或哮喘；传染性疾病，如艰难梭菌感染；炎性疾病，如TNF介导的炎性疾病(例如，胃肠道炎性疾病，如结肠袋炎(pouchitis)；心血管炎性疾病，如动脉粥样硬化；或炎性肺病，如慢性阻塞性肺疾病)的药物组合物；用作用于抑制器官移植中的排斥或其中可能发生组织排斥的其他情况的药物组合物；用作用于改善免疫功能的补充剂、食物或饮料；或用作用于抑制免疫细胞的增殖或功能的试剂。
在一些实施例中，本文提供的方法适用于治疗炎症。在某些实施例中，身体的任何组织及器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统炎症及其他炎症，如下文讨论。
肌肉骨骼系统的免疫障碍包括但不限于那些影响骨骼关节(包括手、手腕、肘部、肩部、下巴、脊柱、颈部、臀部、膝盖、踝部及足部的关节)的病症，及影响将肌肉连接至骨头的组织(如肌腱)的病症。可用本文所述的方法及组合物治疗的这类免疫障碍的实例包括但不限于关节炎(包括，例如，骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、急性及慢性感染性关节炎、与痛风和假痛风相关的关节炎及幼年特发性关节炎)、肌腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑囊炎、纤维组织炎(纤维肌痛)、上髁炎、肌炎及骨炎(包括，例如，佩吉特氏病(Paget's disease)、耻骨炎及囊性纤维性骨炎)。
眼部免疫障碍是指影响眼睛的任何结构(包括眼睑)的免疫障碍。可用本文描述的方法及组合物治疗的眼部免疫障碍的实例包括但不限于睑缘炎、眼睑皮肤松垂症、结膜炎、泪腺炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(干眼症)、巩膜炎、倒睫及葡萄膜炎。
可用本文所述的方法及组合物治疗的神经系统免疫障碍的实例包括但不限于脑炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、脑膜炎、神经性肌强直、发作性睡病、多发性硬化、脊髓炎及精神分裂症。可用本文所述的方法及组合物治疗的脉管系统或淋巴系统炎症的实例包括但不限于关节硬化、关节炎、静脉炎、血管炎及淋巴管炎。
可用本文所述的方法及药物组合物治疗的消化系统免疫障碍的实例包括但不限于胆管炎、胆囊炎、肠炎、小肠结肠炎、胃炎、肠胃炎、炎性肠病、回肠炎及直肠炎。炎性肠病包括(例如)一组相关病症的某些本领域公认的形式。已知炎性肠病的几种主要形式，这类障碍中最常见的为克罗恩病(区域性肠病，例如，非活性及活性形式)及溃疡性结肠炎(例如，非活性及活性形式)。另外，炎性肠病涵盖肠易激综合征、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性-浆细胞性肠炎、乳糜泻、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎及嗜酸性小肠结肠炎。IBD的其他不常见形式包括非确定型结肠炎、伪膜性结肠炎(坏死性结肠炎)、缺血性炎性肠病、白塞氏病、结节病、硬皮病、IBD相关性发育不良、与发育不良相关性团块或病变及原发性硬化性胆管炎。
可用本文所述的方法及药物组合物治疗的生殖系统免疫障碍的实例包括但不限于子宫颈炎、绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、附睾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、尿道炎、阴道炎、外阴炎及外阴痛。
本文所述的方法及治疗性药物组合物可用以治疗具有发炎成分的自身免疫性疾病。此病症包括但不限于全身性急性播散性秃头症、白塞氏病、恰加斯氏病(Chagas'disease)、慢性疲劳综合征、自主神经失调、脑脊髓炎、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、化脓性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜泻、克罗恩病、1型糖尿病、巨细胞动脉炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本病、亨诺-许兰二氏紫斑症(Henoch-Schonlein purpura)、川崎病(Kawasaki's disease)、红斑狼疮、显微镜下结肠炎、显微镜下多动脉炎、混合结缔组织病、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)、多发性硬化、重症肌无力、眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、结节性多动脉炎、多肌痛、类风湿性关节炎、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、休格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、温热自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病(Lyme disease)、局限性硬皮病、银屑病、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎及白癜风。
本文所述的方法及治疗性组合物可用于治疗具有发炎成分的T细胞介导的超敏性疾病。此类病症包括但不限于接触性超敏反应、接触性皮炎(包括由于毒葛引起的接触性皮炎)、荨麻疹、皮肤过敏、呼吸道过敏(花粉热、过敏性鼻炎、屋尘螨过敏)及麸胶敏感性肠病(乳糜泻)。
可用本发明的方法及治疗性组合物治疗的其他免疫障碍包括(例如)阑尾炎、皮炎、皮肌炎、心内膜炎、纤维组织炎、齿龈炎、舌炎、肝炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肾炎、耳炎、胰脏炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎(peritonoitis)、咽炎、胸膜炎、局限性肺炎、前列腺增生症(prostatistis)、肾盂肾炎及口炎(stomatisi)、移植排斥(涉及如肾、肝、心脏、肺、胰脏(例如，胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠的器官，同种异体皮肤移植、皮肤同种移植物及心脏瓣膜异种移植、血清病及移植物抗宿主病)、急性胰脏炎、慢性胰脏炎、急性呼吸窘迫综合征、西扎利氏综合征(Sexary's syndrome)、先天性肾上腺增生、非化脓性甲状腺炎、高钙血症相关癌症、天疱疮、大疱性疱疹样皮炎、重度多形红斑、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、季节性或常年性过敏性鼻炎、支气管哮喘、接触性皮炎、特应性皮炎、药物超敏反应、过敏性结膜炎、角膜炎、眼带状疱疹、虹膜炎及虹膜睫状体炎、脉络膜视网膜炎、视神经炎、结节病性结节病、暴发性或散播性肺结核化学疗法、成人特发性血小板减少性紫癜、成人继发性血小板减少症、获得性(自身免疫性)溶血性贫血症、成人白血病及淋巴瘤、儿童急性白血病、局限性肠炎、自身免疫性血管炎、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、实体器官移植排斥反应、败血症。优选治疗包括以下的治疗：移植排斥、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、哮喘、炎性肠病、系统性红斑狼疮、银屑病、慢性阻塞性肺疾病及伴随感染病症的炎症(例如，败血症)。
代谢障碍
在一些实施例中，本文所述的方法和治疗性组合物涉及治疗或预防代谢疾病或障碍，例如II型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症、高甘油三酯血症、酮酸中毒、低血糖、血栓性疾病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或相关疾病。在一些实施例中，相关疾病是心血管疾病、动脉粥样硬化、肾脏疾病、肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病变、性功能障碍、皮肤病、消化不良或水肿。在一些实施例中，本文所述的方法和药物组合物涉及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗。
本文所述的方法可用以治疗有需要的任何受试者。如本文所使用的，“有需要的受试者”包括具有代谢疾病或障碍的任何受试者，以及具有获得这种疾病或障碍的增加的可能性的任何受试者。
本文所述的治疗性组合物可用于例如预防或治疗代谢疾病(部分或完全地减少代谢疾病的不利影响)，所述代谢疾病是例如II型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症、高甘油三酯血症、酮酸中毒、低血糖、血栓性疾病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或相关疾病。在一些实施例中，相关疾病是心血管疾病、动脉粥样硬化、肾脏疾病、肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病变、性功能障碍、皮肤病、消化不良或水肿。
癌症
在一些实施例中，本文所述的方法及治疗性组合物涉及癌症治疗。在一些实施例中，任何癌症可使用本文所述的方法治疗。可通过本文所述的方法及药物组合物治疗的癌症的实例包括但不限于来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨头、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。另外，所述癌症可特定地是下列组织学类型，但其不限于这类类型：赘瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨大及梭细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌(basal cellcarcinoma)；毛发基质(pilomatrix)癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡(branchiolo-alveolar)腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状及滤泡性腺癌；非包膜性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附器癌；顶浆(apocrine)腺癌；皮脂腺癌；耵聍(ceruminous)腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒环细胞癌；浸润性管状癌；髓样癌；小叶癌；发炎癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌与鳞状转移瘤(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；及成釉细胞瘤，恶性；赛特利氏(sertoli)细胞癌；睾丸间质细胞(leydig cell)瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肉瘤(liposarcoma)；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤(Brenner tumor)，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨胚细胞瘤，恶性；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(Ewing'ssarcoma)；齿源性肿瘤，恶性；釉质母细胞齿源性瘤；釉质母细胞瘤，恶性；釉质母细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚叶肿瘤；小脑肉瘤；节细胞母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡型恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞性白血病；髓样肉瘤；及毛细胞白血病。
在一些实施例中，本文提供的方法及药物组合物涉及白血病的治疗。白血病疾病的非限制性实例包含急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前骨髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、里德尔细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病、未分化细胞白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血胚细胞性白血病(hemocytoblasticleukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、浆细胞性白血病及前骨髓细胞性白血病。
在一些实施例中，本文提供的方法及治疗性组合物涉及癌治疗。癌的非限制性示例性类型包含腺泡癌、腺泡样癌、腺囊样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶状癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑状癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶状癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma)、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、毛细管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、块状癌、结节性皮癌、疣状癌、绒毛状癌、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺体癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、毛基质细胞癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌(Hurthle cellcarcinoma)、玻质状癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏肿瘤(Krompecher's carcinoma)、库尔契茨基氏细胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆样癌(carcinomalenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、黑色素癌、软癌、黏液性癌(mucinous carcinoma)、黏液癌(carcinoma muciparum)、黏液细胞癌(carcinomamucocellulare)、黏液表皮样癌、黏膜癌(carcinoma mucosum)、黏膜性癌(mucouscarcinoma)、黏液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨质癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、糜烂性癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌(Schneiderian carcinoma)、硬性癌(scirrhous carcinoma)及阴囊癌(carcinoma scroti)。
在一些实施例中，本文提供的方法及治疗性组合物涉及肉瘤的治疗。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、釉质母细胞肉瘤、葡萄形肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤(Wilms'tumorsarcoma)、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤(Hodgkin's sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、晏森氏肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤(Roussarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤及毛细血管扩张性肉瘤。
可使用本文描述的方法及治疗性组合物治疗的另外的示例性肿瘤包括霍奇金病(Hodgkin’s Disease)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、癌前皮肤病变、睪丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、结肠直肠癌、直肠癌及肾上腺皮质癌。
在一些实施例中，所治疗的癌症是黑色素瘤。黑色素瘤的非限制性实例是哈-巴二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年型黑色素瘤、恶性小痣性痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性幼年型黑色素瘤、克劳德曼氏黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、结节性黑色素瘤甲下黑色素瘤及浅表扩展性黑色素瘤。
在一些实施例中，癌症包括乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)。
在一些实施例中，癌症包括结直肠癌(例如，微卫星稳定(MSS)结直肠癌)。
在一些实施例中，癌症包含肾细胞癌。
在一些实施例中，癌症包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)。
在一些实施例中，癌症包含膀胱癌。
在一些实施例中，癌症包含胃食管癌。
可使用本文所述的方法及治疗性组合物治疗的肿瘤的特定类别包括淋巴组织增生性疾病、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、中枢神经系统的癌症、外周神经系统的癌症、皮肤癌、肾癌、及所有上述的转移。特定类型的肿瘤包含肝细胞癌、肝细胞瘤、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、恶性神经节瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌内皮肉瘤、侵袭性导管癌、乳头状腺癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(充分分化、中等分化、分化不良或未分化)、支气管肺泡癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、肾上腺样腺癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、睾丸肿瘤、肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌及大细胞肺癌)、膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、血液系统恶性肿瘤(包含所有类型的白血病及淋巴瘤，包含：急性髓性白血病、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、髓样淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞瘤、结直肠癌及直肠癌。
某些实施例中，所治疗的癌症还包含癌症前期病灶，例如光化性角化病(日旋光性角化病)、莫耳痣(发育异常痣)、光化性唇炎(农夫唇)、皮角、巴瑞特氏食管症(Barrett'sesophagus)、萎缩性胃炎、先天性角化不良、缺铁性咽下困难、扁平苔藓、口腔黏膜下纤维化、光化性(日旋光性)弹性组织变性及子宫颈发育不良。
一些实施例中所治疗的癌症包含非癌性或良性肿瘤，例如，内胚层、外胚层或间质起源的肿瘤，包括但不限于胆管瘤、结肠息肉、腺瘤、乳头瘤、囊腺瘤、肝细胞腺瘤、葡萄胎、肾小管腺瘤、鳞状细胞乳头瘤、胃息肉、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、脂肪瘤、纤维瘤、淋巴管瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、星形细胞瘤、痣、脑膜瘤及神经节瘤。
其他疾病及障碍
在一些实施例中，本文描述的方法及治疗性组合物涉及肝疾病的治疗。此类疾病包括但不限于阿拉日耶综合征、酒精相关性肝病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、良性肝肿瘤、胆道闭锁、肝硬化、半乳糖血症、吉尔伯特综合征、血色素沉着病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝性脑病、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(LAL-D)、肝囊肿、肝癌、新生儿黄疸、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、瑞氏综合征、I型糖原贮积病及威尔逊病。
本文所述的方法及治疗性组合物可用于治疗神经退化性和神经性疾病。在某些实施例中，神经退化性和/或神经性疾病是帕金森病、阿尔茨海默病、朊病毒病、亨廷顿病、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、肌张力障碍、特发性颅内高压、癫痫、神经系统疾病、中枢神经系统疾病、运动障碍、多发性硬化症、脑病、周围神经病变或术后认知功能障碍。
菌群失调
肠道微生物组(也称为“肠道微生物群”)可通过微生物对宿主的免疫细胞和其他细胞的活性以及影响(局部和/或远端)对个体健康产生显著影响(Walker,W.A.,Dysbiosis[菌群失调].The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology[胃肠道病理生理学中的微生物群].第25章.2017；Weiss和Thierry,Mechanisms and consequences ofintestinal dysbiosis[肠道菌群失调的机制和后果].Cellular and Molecular LifeSciences[细胞与分子生命科学].(2017)74(16):2959-2977.Zurich Open Repositoryand Archive[苏黎世开放存储库和档案馆],doi:doi.org/10.1007/s00018-017-2509-x))。
健康的宿主肠道微生物组稳态有时被称为“生态平衡”或“正常微生物”，而宿主微生物组的组成和/或其多样性的有害变化可能导致微生物组的不健康失衡，或“菌群失调”(Hooks和O'Malley.Dysbiosis and its discontents[菌群失调及其不满].AmericanSociety for Microbiology[美国微生物学会].2017年10月.第8卷.第5期.mBio 8:e01492-17.https://doi.org/10.1128/mBio.01492-17)。当微生物组稳态丧失或减弱时，可能会发生菌群失调以及相关的局部或远端宿主发炎或免疫效应，从而导致：对病原体的敏感性增加；宿主细菌代谢活性改变；诱导宿主促炎活性和/或降低宿主抗炎活性。此类效应部分地由宿主免疫细胞(例如，T细胞、树突细胞、肥大细胞、NK细胞、肠上皮淋巴细胞(IEC)、巨噬细胞和吞噬细胞)和细胞因子，以及由此类细胞和其他宿主细胞释放的其他物质之间的相互作用介导。
菌群失调可能发生在胃肠道内(“胃肠道菌群失调”或“肠道菌群失调”)，或者可能发生在胃肠道内腔外(“远端菌群失调”)。胃肠菌群失调通常与肠上皮屏障完整性降低、紧密连接完整性降低和肠通透性增加有关。Citi,S.Intestinal Barriers protect againstdisease[肠屏障可预防疾病],Science[科学]359:1098-99(2018)；Srinivasan等人,TEERmeasurement techniques for in vitro barrier model systems[用于体外屏障模型系统的TEER测量技术].J.Lab.Autom[实验室自动化杂志].20:107-126(2015)。胃肠道菌群失调可以在胃肠道内外产生生理和免疫作用。
菌群失调的存在可与多种疾病和病症相关，包括：感染、癌症、自身免疫障碍(例如系统性红斑狼疮(SLE))或炎性障碍(例如功能性胃肠道疾病，例如炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎和克罗恩病)、神经炎性疾病(例如多发性硬化症)、移植障碍(例如移植物抗宿主病)、脂肪肝疾病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、干燥综合征、乳糜泻、囊性纤维化，慢性阻塞性肺病(COPD)以及其他与免疫功能障碍相关的疾病和病症。Lynch等人,The HumanMicrobiome in Health and Disease[健康与疾病中的人微生物组],N.Engl.J.Med[新英格兰医学杂志].375:2369-79(2016)，Carding等人,Dysbiosis of the gut microbiotain disease[疾病中肠道微生物群的菌群失调].Microb.Ecol.Health Dis[微生物生态与健康疾病].(2015)；26:10:3402/mehd.v26.2619；Levy等人,Dysbiosis and the ImmuneSystem[菌群失调和免疫系统],Nature Reviews Immunology[自然评论免疫学]17:219(2017年4月)。
在某些实施例中，本文披露的示例性治疗性组合物可以通过修饰存在于菌群失调部位的免疫活性来治疗菌群失调及其影响。如本文所述，此类组合物可以通过对宿主免疫细胞的影响(导致例如对细胞因子分泌的影响、减少受试接受者的炎症)或通过代谢物生产方面的变化来改变菌群失调。
本文披露的可用于治疗与菌群失调相关的障碍的示例性治疗性组合物包含一种或多种类型的源自免疫调节性细菌的EV。这样的组合物能够影响接受者宿主在胃肠道中的免疫功能，和/或在受试者胃肠道外的远端部位产生全身性作用。
可用于治疗与菌群失调相关的障碍的本文披露的示例性治疗性组合物包含单一细菌物种(例如单一菌株)的免疫调节性细菌的群体和/或源自单一细菌物种(例如，单一菌株)的免疫调节性细菌的EV的群体。这样的组合物能够影响接受者宿主在胃肠道中的免疫功能，和/或在受试者胃肠道外的远端部位产生全身性作用。
在一个实施例中，将含有源自免疫调节性细菌的分离的EV群体的治疗性组合物以有效治疗菌群失调及其在接受者中的一种或多种影响的量施用给哺乳动物接受者(例如，口服)。该菌群失调可以是胃肠道菌群失调或远端菌群失调。
在一些实施例中，本发明的治疗性组合物可以治疗胃肠道菌群失调及其对宿主免疫细胞的一种或多种影响，导致对细胞因子分泌的影响，减轻受试接受者的炎症。
在一些实施例中，治疗性组合物可以通过以下来治疗胃肠道菌群失调及其一种或多种影响：经由细胞和细胞因子调节来调节接受者的免疫应答，以通过增加肠上皮屏障的完整性来降低肠道通透性。
在一些实施例中，治疗性组合物可以通过以下来治疗远端菌群失调及其一种或多种影响：经由调节宿主免疫细胞来调节菌群失调部位的接受者免疫应答。
其他示例性治疗性组合物可用于治疗与菌群失调有关的障碍，这些组合物包含一种或多种类型的细菌和/或EV，这些细菌和/或EV能够改变接受者中的宿主免疫细胞亚群(例如T细胞、免疫淋巴样细胞、树突细胞、NK细胞和其他免疫细胞的亚群)的相对比例或其功能。
其他示例性治疗性组合物可用于治疗与菌群失调有关的障碍，这些组合物包含单一免疫调节性细菌物种(例如单一菌株)的EV群体，其能够改变接受者中免疫细胞亚群(例如T细胞亚群、免疫淋巴样细胞、NK细胞和其他免疫细胞)的相对比例或其功能。
在一个实施例中，本发明提供了通过以下来治疗胃肠道菌群失调及其一种或多种影响的方法：向有需要的受试者口服施用治疗性组合物，该治疗性组合物改变存在于菌群失调部位的微生物组群体。治疗性组合物可包含一种或多种类型的来自免疫调节性细菌的EV或单一免疫调节性细菌物种(例如单一菌株)的EV群体。
在一个实施例中，本发明提供了通过以下来治疗远端菌群失调及其一种或多种影响的方法：向有需要的受试者口服施用治疗性组合物，该治疗性组合物改变受试者的胃肠道外的免疫应答。治疗性组合物可包含一种或多种类型的来自免疫调节性细菌的EV或单一免疫调节性细菌物种(例如单一菌株)的EV群体。
在示例性实施例中，可用于治疗与菌群失调有关的失调症的治疗性组合物刺激宿主免疫细胞分泌一种或多种抗炎细胞因子。抗炎细胞因子包括但不限于IL-10、IL-13、IL-9、IL-4、IL-5、TGFβ及其组合。在其他示例性实施例中，可用于治疗与菌群失调有关的失调症的药物组合物减少(例如抑制)宿主免疫细胞分泌一种或多种促炎细胞因子。促炎细胞因子包括但不限于IFNγ、IL-12p70、IL-1α、IL-6、IL-8、MCP1、MIP1α、MIP1β、TNFα及其组合。其他示例性细胞因子是本领域已知的并且在本文中描述。
在另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗或预防与菌群失调有关的障碍的方法，所述方法包括向受试者施用(例如口服施用)益生菌食品或医疗食品形式的治疗组合物，所述治疗组合物包含的细菌或EV的数量足以改变菌群失调部位的微生物组，从而治疗与菌群失调有关的障碍。
在一些实施例中，益生菌食品或医疗食品形式的本发明的治疗组合物可用于预防或延迟处于发展为菌群失调风险的受试者中菌群失调的发作。
制造增强的细菌的方法
在某些方面中，本文提供制造用于产生本文描述的EV的工程改造的细菌的方法。在一些实施例中，这些工程改造的细菌经修饰以增强某些所需性质。例如，在一些实施例中，对工程改造的细菌进行修饰以增强EV的免疫调节作用和/或治疗作用(例如，单独或与另一种治疗剂组合)，以降低毒性和/或改善细菌和/或细菌和/或EV制造(例如更高的耐氧性，更高的抗冻融性，更短的产生时间)。工程改造的细菌可使用本领域中已知的任何技术产生，包括(但不限于)定点诱变、转座子诱变、敲除、敲入、聚合酶链反应诱变、化学诱变、紫外线诱变、转形(化学或通过电穿孔)、噬菌体转导、定向演化、CRISPR/Cas9或其任何组合。
在本文提供的方法的一些实施例中，细菌通过定向演化进行修饰。在一些实施例中，该定向演化包含将细菌暴露于环境条件并选择在环境条件下具有经改善的存活和/或生长的细菌。在一些实施例中，所述方法包括使用识别增强的细菌的分析筛选诱变细菌。在一些实施例中，所述方法还包括诱变细菌(例如，通过暴露于化学诱变剂和/或UV辐射)，或将它们暴露于治疗剂(例如抗生素)，接着进行分析以检测具有所需表型的细菌(例如，体内分析、离体分析或体外分析)。
实例
实例1：冻干物的制备
将具有表A至表D中提供的配方的赋形剂原液制备为溶液(所示量为配方中各组分的百分比)。赋形剂原液的配方分为两大类：有和没有聚合物。将赋形剂原液溶液与细胞外囊泡的液体制剂混合。将所得溶液冷冻干燥并分析。
在本实例中，研究中使用的细胞外囊泡(EV)是从栖组织普雷沃菌菌株分离的。
表E中提供了从这些混合物的冻干中收集的数据。所有测量的样品具有小于5％的残留水分含量。在延迟型超敏反应(DTH)模型中，使用锁孔血蓝蛋白(KLH)特异性炎症在体内另外测试了一些样品。在KLH-DTH中测试的样品显示出功效。
表A：包含用于在冻干过程中稳定细胞外囊泡的赋形剂的原液。给出的数值基于溶液中的重量百分比。
配方 蔗糖 海藻糖 甘露醇 山梨糖醇 葡聚糖 麦芽糖糊精
1 40 15 20 25
2 20 20 50 10
3 50 50
4 40 10 50
5 10 70 0.5 19.5
7 19.5 80 0.5
7a 20 80
7e 27 20 53
8 10 75 15
15 19.5 70 0.5 10
16 19.5 75 0.5 5
17 20 80
18 10 60 30
19 10 30 60
20 100
表B：包含赋形剂的原液，包括用于在冻干过程中稳定细胞外囊泡的聚合物。给出的数值基于溶液中的重量百分比。
配方 蔗糖 PVP-K30 Ficoll 柠檬酸盐 精氨酸
6 20 78 1 1
14 20 78 1 1
表C：包含赋形剂的原液，包括用于在冻干过程中稳定细胞外囊泡的聚合物。给出的数值基于溶液中的重量百分比。
表D：包含赋形剂的原液，包括用于在冻干过程中稳定细胞外囊泡的聚合物。给出的数值基于溶液中的重量百分比。
配方 甘露醇 泊洛沙姆188
11 95 5
12 90 10
表E：用于稳定细胞外囊泡的赋形剂原液溶液的分析数据。“％稳定剂”是指添加到EV液体制剂中的原液溶液配方的基于重量的百分比。“％水分”通过卡尔费休滴定法确定。Zave通过动态光散射(DLS)确定。对于颗粒数/质量，颗粒数由Z-view或NTA仪器确定；质量(mg)由分析天平确定。
配方 ％稳定剂 ％水分 Zave，nm 颗粒数/质量，p/mg
-- 0％ 226.1 6.45E+11
4 34％ 2 206.2 6.28E+10
5 41％ 209.1 6.76E+10
6 35％ 3.6 212.8 3.25E+10
7 47％ 2.7 204 7.02E+10
8 44％ 3 206.4 6.99E+10
9 34％ 2.5 187.3 7.15E+10
10 34％ 2.7 180.1 7.37E+10
11 56％ 1.8 205.2 7.08E+10
12 53％ 1.8 202 7.66E+10
13 30％ 3 172.3 7.77E+10
14 35％ 3.8 137.4 6.12E+10
15 41％ 2.9 205.8
16 44％ 2.8 203.9
细胞外囊泡(EV)的冻干循环
冻干循环针对每种赋形剂配制进行了优化。混合物的临界温度和塌陷温度的差异意味着冻干过程中的搁板温度会相应调整。优化过程包括3个步骤：初步筛选、一级干燥优化和二级干燥优化。确认最后一个循环足以使材料干燥低于5％残留水分。在本实例中，为优化选择的赋形剂配方是赋形剂配方7。
表F
表G
表H
配方#7 ％水分 二级干燥时间(小时)
一级干燥 2.8 2
二级干燥 2.6 29
表I：最终的冻干循环优化了用47％(按体积)的赋形剂配方7稳定的细胞外囊泡。
实例2：作为EV来源的代表性菌株
从表J中列出的菌株中分离出细胞外囊泡(EV)。表J中还提供了每种菌株的革兰氏染色、细胞壁结构和分类学分类的信息。可以从任何这些菌株中制备或分离EV，以制备本文所述的溶液和/或干燥形式。
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实例3：从细菌中纯化和制备细胞外囊泡(EV)
纯化
细胞外囊泡(例如smEV)通过使用本领域技术人员已知的方法纯化和制备自细菌培养物(S.Bin Park等人,PLoS ONE.[公共科学图书馆·综合]6(3):e17629(2011))。
例如，细菌培养物在4℃或室温下以10,000-15,500x g离心10-40分钟，使细菌沉淀。然后过滤培养上清液，以包括≤0.22μm的物质(例如，经由0.22μm或0.45μm过滤器)并排除完整的细菌细胞。使用可包括(但不限于)硫酸铵沉淀、超离心或过滤的方法浓缩经过滤的上清液。简而言之，就硫酸铵沉淀而言，将1.5至3M硫酸铵缓慢添加至经过滤的上清液，同时在4℃下搅拌。在4℃下将沉淀培养8至48小时及然后在4℃下以11,000x g离心20至40分钟。沉淀含有EV及其他碎片。简而言之，使用超离心，将经过滤的上清液在4℃下以100,000至200,000x g离心1至16小时。此离心的沉淀含有EV及其他碎片。简言之，使用过滤技术，使用Amicon超自旋过滤器或通过切向流过滤，过滤上清液以便于保留分子量>50、100、300或500kDa的物质。
可替代地，EV在生长期间(或在生长期间的在所选时间点下)连续获得自细菌培养物，通过根据制造商的说明书将生物反应器连接至交变切向流(ATF)系统(例如，来自Repligen的XCell ATF)。该ATF系统保留完整细胞(>0.22μm)于生物反应器中，及容许较小组分(例如，EV、游离蛋白质)通过过滤器以供收集。例如，所述系统可经结构设计使得<0.22μm滤液然后通过100kDa的第二过滤器，容许收集如在0.22μm与100kDa之间的EV的物质，并将小于100kDa的种类泵送回生物反应器中。可替代地，该系统可经结构设计以容许生物反应器中的培养基在培养物的生长期间得到补充和/或修饰。通过此方法收集的EV可通过如上文描述用于经过滤的上清液的超离心或过滤进行进一步纯化和/或浓缩。
通过上文描述的方法获得的EV可通过梯度超离心，使用可包括(但不限于)使用蔗糖梯度或Optiprep梯度的方法进行进一步纯化。简言之，在使用蔗糖梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，将沉淀物重悬浮于60％蔗糖、30mM pH 8.0Tris中。如果使用过滤来浓缩经过滤上清液，则使用Amicon Ultra柱将浓缩物缓冲液交换至60％蔗糖、30mM pH 8.0 Tris中。将样品施加至35％-60％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000x g离心持续3-24小时。简言之，在使用Optiprep梯度方法时，如果使用硫酸铵沉淀或超离心来浓缩经过滤上清液，则将集结粒重悬于PBS中的45％Optiprep中。如果使用过滤以浓缩经过滤的上清液，则浓缩物通过使用60％Optiprep稀释至45％Optiprep的最终浓度。将样品施加至0％-45％不连续蔗糖梯度中并在4℃下以200,000×g离心持续3-24小时。可替代地，高分辨率密度梯度分级可用于基于密度分离EV颗粒。
制备
为证实EV制剂的无菌性及分离，将EV连续稀释于琼脂培养基(其用于测试中的细菌的例行培养)上，并使用例行条件进行培养。使未经灭菌的制剂通过0.22μm过滤器以去除完整细胞。为进一步增加纯度，经分离的EV可用DNA酶或蛋白酶K处理。
可替代地，为制备用于活体内注射的EV，经纯化的EV如先前描述进行处理(G.Norheim等人,PLoS ONE.[公共科学图书馆·综合]10(9):e0134353(2015))。简而言之，在蔗糖梯度离心后，将含有EV的带于含有3％蔗糖的溶液中或本领域技术人员已知的适用于活体内注射的其他溶液中重悬浮至50μg/mL的终浓度。此溶液还可含有浓度为0-0.5％(w/v)的佐剂(例如氢氧化铝)。
为制备与其他测试(例如用以在TEM成像或体外分析之前去除蔗糖)兼容的样品，使用以下将样品进行缓冲液交换至PBS或30mM pH 8.0 Tris中：过滤(例如Amicon Ultra柱)，透析，或超离心(在用PBS稀释15倍或以上之后，200,000x g，1-3小时，4℃)并重悬浮于PBS中。
对于所有这些研究，EV可以在施用之前加热、辐照和/或冻干(如本文所述)。
实例4：通过压力操作细菌以产生各种量的EV和/或改变EV的内容物
已显示应激，且尤其外膜应激会增加由一些菌株产生的EV(例如smEV)(I.MacDonald,M.Kuehn.J Bacteriol[细菌学杂志]195(13):doi:10/1128/JB.02267-12)。为改变细菌产生EV，细菌是使用各种方法施加压力。
细菌可经受单一应激源或应激源组合。不同应激源对不同细菌的影响是通过改变应激条件及测定IC50值(抑制50％细胞生长所需的条件)来经验性地确定。发生EV纯化、定量及表征。EV产生是(1)在细菌及EV的复杂样本中通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)或透射电子显微术(TEM)；或(2)在EV纯化后，通过NTA、脂质定量或蛋白质定量进行定量。EV内容物是纯化后接着通过上文描述的方法进行评估。
抗生素应激
细菌是在标准生长条件下以添加亚致死浓度的抗生素进行培养。这可包括0.1至1μg/mL氯霉素，或0.1至0.3μg/mL庆大霉素，或类似浓度的其他抗生素(例如，安比西林、多黏菌素B)。宿主抗菌产物(诸如溶菌酶、防御素及Reg蛋白)可代替抗生素使用。亦可使用由细菌产生的抗微生物肽(包括细菌素及小菌素)。
温度应激
细菌是在标准生长条件下，但在比通常用于它们生长的温度更高或更低的温度下进行培养。可替代地，细菌是在标准条件下生长，及然后分别通过在低温或高温下短期间培养而经受冷休克或热休克。例如，在37℃下生长的细菌是在4℃至18℃下培养1小时用于冷休克或在42℃至50℃下培养1小时用于热休克。
饥饿及营养物限制
为诱导营养应激，细菌是在其中一种或多种营养素受限的条件下培养。细菌可在整个生长期间经受营养应激或自富培养基转移至贫培养基。受限的培养基组分的一些实例是碳、氮、铁及硫。一项实例培养基是M9最小培养基(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，其含有低葡萄糖作为唯一碳源。特别对于普雷沃菌属，铁可用性是通过改变培养基中氯化血红素的浓度和/或通过改变培养基中存在的卟啉或其他铁载剂的类型改变，因为发现在低氯化血红素条件中生长的细胞产生更多EV(S.Stubbs等人，Letters inApplied Microbiology.[应用微生物学快报]29:31-36(1999)。培养基组分亦通过添加螯合剂(诸如EDTA及去铁胺)进行操作。
饱和度
使细菌生长至饱和及在饱和点后培养各种时间周期。可替代地，使用条件培养基以在指数生长期间模拟饱和环境。条件培养基是通过离心及过滤自饱和培养物移除完整细胞制备，及条件培养基可经进一步处理以浓缩或移除特定组分。
盐应激
细菌是在含有NaCl、胆汁盐或其他盐的培养基中培养或短暂暴露于含有NaCl、胆汁盐或其他盐的培养基。
UV应激
UV应激是通过在UV灯下培养细菌或通过将细菌暴露于UV使用诸如Stratalinker(安捷伦公司(Agilent))的仪器达成。UV可在整个培养周期期间，在短爆发期内或生长后的单一定义周期内施用。
反应性氧应激
细菌是在亚致死浓度的过氧化氢(250至1,000μM)的存在下培养以诱导反应性氧物质形式的应激。厌氧细菌是在对它们有毒的浓度的氧中培养或暴露于对它们有毒的浓度的氧。
洗涤剂应激
细菌是在洗涤剂中培养或暴露于洗涤剂，诸如月桂基硫酸钠(SDS)或脱氧胆酸盐。
pH应激
细菌是在不同pH培养基中培养有限时间或暴露于不同pH培养基有限时间。
实例5：图谱分析EV组成及内容物
EV可通过包括(但不限于)以下的各种方法中的任一者来表征：NanoSight表征、SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白质印迹、ELISA、液相色谱-质谱法及质谱、动态光散射、脂质水平、总蛋白、脂质与蛋白质比、核酸分析和/或ζ电位。
EV的NanoSight表征
纳米颗粒跟踪分析(NTA)用以表征经纯化的EV的粒度分布。于NanoSight机器(马尔文仪器公司(Malvern Instruments))上运行经纯化的EV制剂以评估EV尺寸及浓度。
SDS-PAGE凝胶电泳
为了鉴定纯化的EV的蛋白质组分，将样品使用标准技术在凝胶上运行，例如BoltBis-Tris Plus 4-12％凝胶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))。将样品于1x SDS样品缓冲液中煮沸10分钟，冷却至4℃，及然后在16,000x g下离心1分钟。然后，将样品于SDS-PAGE凝胶上运行并使用几种标准技术(例如，银染色、考马斯蓝、凝胶代码蓝)中的任何一者进行染色以使条带可视化。
蛋白质印迹分析
为识别及定量经纯化的EV的特定蛋白质组分，EV蛋白通过如上文描述的SDS-PAGE分离及经受西方墨点转渍法分析(Cvjetkovic等人，Sci.Rep.[科学报告]6,36338(2016))并经由ELISA定量。
EV蛋白质组学与液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)及质谱法(MS)
存在于EV中的蛋白质通过质谱法技术识别及定量。可以使用标准技术制备EV蛋白用于LC-MS/MS，所述标准技术包括使用二硫苏糖醇溶液(DTT)进行蛋白还原以及使用酶(例如LysC和胰蛋白酶)进行蛋白消化(如在Erickson等人,2017(Molecular Cell[分子细胞],第65卷,第2期,第361-370页,2017年1月19日)中所述)。另一方面，肽是如Liu等人.2010(JOURNAL OF BACTERIOLOGY[细菌学杂志],2010年6月,第2852-2860页第192卷,第11期)，Kieselbach和Oscarsson 2017(Data Brief[数据摘要].2017年2月；10:426–431.)，Vildhede等人,2018(Drug Metabolism and Disposition[药物代谢与处置]2018年2月8日)中所述制备。消化后，直接在液相色谱和质谱仪上运行肽制剂，用于在单个样品中鉴定蛋白质。为了相对定量样品之间的蛋白质，使用iTRAQ试剂-8plex多重试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州)或TMT 10plex和11plex标记试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fischer Scientific)，圣何塞，加利福尼亚州，USA)将来源于不同样品的肽消化物用同量异位素标签进行标记。每个肽消化物都用不同的同量异位素标签标记，然后将经标记的消化物合组合进入一个样品混合物。通过LC-MS/MS分析组合的肽混合物，以进行鉴定和定量。使用LC-MS/MS数据进行数据库搜索，以鉴定经标记的肽和相应的蛋白质。在同量异位素标记的情况下，附着标签的片段产生低分子量的报告离子，该离子用于获得每个EV中存在的肽和蛋白质的相对定量。
另外，代谢内容物使用液体色谱法与质谱法的组合进行确定。存在测定各种样品的代谢内容物且为本领域技术人员已知的各种技术，这些技术涉及溶剂萃取、层析分离及耦合至质量测定的各种电离技术(Roberts等人，2012Targeted Metabolomics.[靶向代谢组学]Curr Protoc Mol Biol.[当代分子生物学方案]30:1-24；Dettmer等人，2007,Massspectrometry-based metabolomics.[基于质谱的代谢组学]Mass Spectrom Rev.[质谱综述]26(1):51-78)。作为一项非限制性实例，LC-MS系统包括与1100系列泵(安捷伦公司(Agilent))及HTS PAL自动进样器(Leap科技公司(Leap Technologies))组合的4000QTRAP三重四级杆质谱仪(AB SCIEX)。培养基样品或其他复杂代谢混合物(约10μL)是使用九体积的含有稳定的同位素标记内标物(缬氨酸-d8，Isotec；及苯丙氨酸-d8，剑桥同位素实验室(Cambridge Isotope Laboratories))的74.9:24.9:0.2(v/v/v)乙腈/甲醇/甲酸进行萃取。标准物可取决于受关注的代谢物进行调整或修饰。样品是经离心(10分钟，9,000g，4℃)，及上清液(10μL)是通过将溶液注射于HILIC管柱(150×2.1mm,3μm粒度)上而呈递至LCMS。管柱通过使5％流动相[10mM甲酸铵，0.1％甲酸于水中]以250μL/分钟的速率流动1分钟，接着线性梯度历时10分钟至40％流动相的溶液[具有0.1％甲酸的乙腈]进行洗脱。将离子喷雾电压设定至4.5kV及源温度是450℃。
数据是使用市售软件(诸如来自AB SCIEX的Multiquant 1.2)进行分析以用于质谱峰积分。受关注的峰应手动控制并与标准进行比较来证实该峰的同一性。用适当的标准物进行定量以确定在细菌调节(bacterial conditioning)后及在肿瘤细胞生长后，初始培养基中存在的代谢物的量。也可以使用代谢物数据库(例如但不限于NIST数据库)将非靶向代谢组学方法用于峰鉴定。
动态光散射(DLS)
DLS量测(包括不同尺寸的颗粒在不同EV制剂中的分布)是使用仪器诸如DynaProNanoStar(怀雅特技术公司(Wyatt Technology))及Zetasizer Nano ZS(马尔文仪器公司(Malvern Instruments))进行。
脂质水平
脂质水平是使用FM4-64(生命科技公司(Life Technologies))，通过类似于那些由A.J.McBroom等人,J Bacteriol[细菌学杂志]188:5385-5392.及A.Frias等人,MicrobEcol[微生物生态学].59:476-486(2010)。样品是用FM4-64培养(3.3μg/mL于PBS中，在37℃下在黑暗中培养10分钟)。在515nm下激发后，在635nm下的发射是使用Spectramax M5平板阅读器(分子仪器公司(Molecular Devices))量测。绝对浓度是通过将未知样品与已知浓度的标准物(诸如棕榈酰油酸磷脂酰甘油(POPG)囊泡)进行比较而测定。脂质组学可用于鉴定EV中存在的脂质。
总蛋白质
蛋白质水平是通过标准分析(诸如布拉德福德及BCA分析)定量。这些布拉德福德分析是使用Quick Start布拉德福德1x染料试剂(伯乐公司(Bio-Rad))，根据制造商的方案运行。BCA分析是使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo-FisherScientific))运行。绝对浓度是通过与产生自已知浓度的BSA的标准曲线进行比较而测定。可替代地，蛋白质浓度可以使用比尔-朗伯(Beer-Lambert)方程使用如在纳米滴分光光度计(赛默飞世尔科技公司)上测量的样品在280nm(A280)处的吸光度来计算。此外，蛋白质组学可以用于鉴定样品中的蛋白质。
脂质：蛋白质比率
脂质：蛋白质比率是通过脂质浓度除以蛋白质浓度产生。相较于各制剂中的游离蛋白质，这类提供囊泡的纯度的量度。
核酸分析
核酸萃取自EV并使用Qubit荧光计定量。粒度分布是使用生物分析仪评估并将材料测序。
ζ电位
不同制剂的ζ电位是使用诸如Zetasizer ZS(Malvern Instruments)的仪器量测。
实例6：制造条件
富集培养基用于生长和制备用于体外和体内使用、并最终用于EV制剂的细菌。例如，培养基可含有糖、酵母提取物、基于植物的蛋白胨、缓冲液、盐、微量元素、表面活性剂、消泡剂及维生素。复杂组分(如酵母提取物及蛋白胨)的组成可未经定义或经部分定义(包括氨基酸、糖等的近似浓度)。微生物代谢可取决于资源(如碳及氮)的可用性。可测试各种糖或其他碳源。可替代地，可制备培养基并使所选细菌生长，如由Saarela等人,J.AppliedMicrobiology[应用微生物学杂志].2005.99:1330-1339所示，该文献通过引用特此并入。发酵时间、冷冻保护剂及细胞浓缩物的中和对冷冻干燥存活、储存稳定性及无基于牛奶的成分所产生的所选细菌的酸及胆汁暴露的影响。
对培养基大规模灭菌。灭菌可以通过超高温(UHT)处理来完成。在极高温下实施短时间段的UHT处理。UHT范围可为135℃-180℃。例如，可在135℃下将培养基灭菌10至30秒。
可在烧瓶或较小生物反应器中制备接种物且监测生长。例如，接种物大小可为总生物反应器体积的大约0.5％至3％。取决于应用及材料需要，生物反应器体积可以为至少2L、10L、80L、100L、250L、1000L、2500L、5000L、10,000L。
在接种之前，生物反应器为使用培养基在所需的pH、温度及氧浓度下进行制备。培养基的初始pH可不同于制程设定点。pH应激在低细胞浓度下可以是不利的；初始pH可在pH7.5与处理设定点之间。例如，pH可设定于4.5与8.0之间。在发酵期间，pH可通过使用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵进行控制。温度可控制于25℃至45℃，例如在37℃下。通过将培养液中的氧含量从约8mg/L降低至0mg/L来产生厌氧条件。例如，可以使用氮或气体混合物(N2、CO2、和H2)来确立厌氧条件。可替代地，不使用气体且通过消耗来自培养基的剩余氧的细胞来确立厌氧条件。取决于菌株及接种物大小，生物反应器发酵时间可有所变化。例如，发酵时间可从大约5小时至48小时有所变化。
自冷冻状态恢复细菌可需具体考虑。产生培养基可在解冻后对细胞产生应激；可能需要特定解冻培养基以自始至终地自经解冻的材料开始菌种培养。出于增加菌种体积或维持微生物生长状态的目的，种材料至新鲜培养基的转移或传代的动力学可受细菌的当前状态(例如，指数生长、静止生长、无应激、受应激)影响。
产生发酵器的接种可影响生长动力学及细胞活性。生物反应器系统的初始状态必须经优化以促进成功且始终如一的产生。种培养物相对于总培养基的分率(例如，百分率)对生长动力学有显著影响。范围可以是发酵器工作体积的1％至5％。培养基的初始pH可不同于处理设定点。pH应激在低细胞浓度下可以是不利的；初始pH可在pH 7.5与处理设定点之间。在接种期间，搅动及气体流入系统内可不同于处理设定点。在低细胞浓度下，物理及化学应激因两个条件而可以是不利的。
处理条件及对照设定可影响微生物生长及细胞活性的动力学。处理条件的变化可改变膜组成、代谢物的产生、生长速率、细胞应激等。用于生长的优化温度范围可随菌株改变。该范围可以是20℃至40℃。用于细胞生长及下游活性表现的最佳pH可随菌株改变。该范围可以是pH 5至8。溶解于培养基中的气体可被细胞用于代谢。可能需要在整个过程期间调节O2、CO2及N2浓度。营养素的可用性可改变细胞生长。当可获得过量的营养素时，细菌可具有替代动力学。
细菌在发酵结束时及在获取期间的状态可影响细胞存活及活性。细菌可在获取前不久进行预处理以更好地制备它们用于涉及分离及下游处理的物理及化学应激。当自发酵器移除时，温度的变化(通常减小至20℃至5℃)可减少细胞代谢、减缓生长(和/或死亡)及生理变化。离心浓度的有效性可受培养pH影响。pH上升1至2点可改善浓度的有效性但对细胞也可以是不利的。细菌可通过增加盐和/或糖在培养基中的浓度而在获取前不久即受应激。以此方式受应激的细胞可在下游期间更好地在冷冻及冻干中存活。
分离方法及技术可影响自培养基分离细菌的效率。固体可使用离心技术移除。离心浓度的有效性可受培养pH或由利用絮凝剂影响。pH上升1至2点可改善浓度的有效性但对细胞也可以是不利的。细菌可通过增加盐和/或糖在培养基中的浓度而在获取前不久即受应激。以此方式受应激的细胞可在下游期间更好地在冷冻及冻干中存活。另外，细菌也可经由过滤进行分离。若细胞需过量的g分钟以成功离心，则就纯化而言，过滤优于离心技术。可在分离之前之后添加赋形剂。可添加赋形剂以用于冷冻保护或用于冻干期间的保护。赋形剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖或乳糖，且可替代地这些赋形剂可与缓冲剂及抗氧化剂混合。在冻干之前，将与赋形剂混合的细胞沉淀物液滴浸没于液氮中。
可通过连续离心实施收获。产品可用各种赋形剂重悬浮至所需的最终浓度。可添加赋形剂以用于冷冻保护或用于冻干期间的保护。赋形剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖或乳糖，且可替代地这些赋形剂可与缓冲剂及抗氧化剂混合。在冻干之前，将与赋形剂混合的细胞沉淀物液滴浸没于液氮中。
材料(包括活细菌、囊泡或其他细菌衍生物)的冻干包括冷冻、一级干燥和二级干燥阶段。冻干从冷冻开始。在冷冻阶段之前，产品材料可以与冻干保护剂或稳定剂混合，也可以不与冻干保护剂或稳定剂混合。产品可以在冻干机装载之前冷冻，或者在冻干机的架上在受控的条件下冷冻。在下一阶段，即一级干燥阶段，通过升华除去冰。这里，产生真空，并向材料提供适量的热量。冰将升华，同时保持产物温度低于冰点，并低于材料的临界温度(Tc)。装载材料的架的温度和腔室的真空度可以被操纵以达到所需的产物温度。在二级干燥期期间，去除结合产物的水分子。在此处，将温度通常升至高于一级干燥期以裂解已在水分子与产物材料之间形成的任何物理-化学相互作用物。在冷冻干燥处理完成之后，可使用惰性气体(例如氮)填充室。产物可以在干燥条件下密封在冷冻干燥器内，在玻璃瓶或其他类似容器中，以防止暴露于大气水和污染物。
实例7：EV准备
栖组织普雷沃菌和小韦荣氏球菌smEV如下制备。
EV：生物反应器收获后，立即开始了EV的下游加工。以20,000g离心以从液体培养基中除去细胞。使用0.22μm过滤器澄清所得的上清液。将EV浓缩，并使用切向流过滤(TFF)和具有100kDa分子量截留值(MWCO)的平板式盒式超滤(UF)膜进行清洗。渗滤(DF)用于使用5个体积的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗脱小分子和小蛋白。将来自TFF的渗余物在超速离心机中以200,000g离心1小时，以形成富含EV的沉淀物，称为高速沉淀物(HSP)。将沉淀物用最少的PBS重悬，并用optiprepTM密度梯度培养基制备梯度，并以200,000g超速离心16小时。在所得级分中，有2个中间条带包含EV。用15倍的PBS洗涤级分，并将EV以200,000g离心1小时以产生分级的HSP或fHSP。随后将其用最少的PBS重悬，合并，并分析颗粒数/mL和蛋白质含量。由颗粒数/mL计数制备剂量以达到所需浓度。使用马尔文帕纳科公司(MalvernPanalytical)的NanoSight NS300在532nm激光的散射模式下表征EV。
实例8：EV的分离和计数
EV分离中使用的设备包括带有SLA-3000转子的Sorvall RC-5C离心机；贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter)的带45Ti转子的Optima XE-90超速离心机；赛默飞世尔科技公司的Sorvall wX+Ultra系列离心机；和Fiberlite F37L-8x100转子。
细菌上清液收集与过滤
为了回收EV而不是细菌，必须将细菌沉淀并从上清液中过滤掉。
通过使用具有SLA-3000转子的Sorvall RC-5C离心机并且在至少7,000rpm的转速下离心培养至少15min沉淀细菌培养物。然后将上清液倾入新的无菌容器中。
上清液通过0.2μm过滤器过滤。对于过滤性较差的上清液(小于300ml的上清液通过过滤器)，在0.2μm真空过滤器之前附加0.45μm胶囊过滤器。过滤的上清液保存在4℃。然后可以使用TFF浓缩过滤的上清液。
使用超速离心分离EV
浓缩的上清液在超速离心机中离心，使EV沉淀，并从较小的生物分子中分离EV。速度为200,000x g，时间为1小时，温度在4℃。当转子停止时，从超速离心机中取出管，轻轻地倒出上清液。添加更多的上清液，再次离心管。所有浓缩的上清液离心后，生成的沉淀物称为“粗”EV沉淀物。将无菌1x PBS添加到放在容器中的沉淀物中。将容器置于转速为70的摇床上，在4℃冰箱中过夜或更长时间。用另外的无菌1x PBS重悬浮EV沉淀物。重悬浮的EV粗样品保存在4℃或-80℃下。
使用密度梯度法纯化EV
密度梯度用于EV纯化。在超速离心过程中，样品中的颗粒将根据其“浮力”密度在梯度密度介质中移动和分离。通过这种方式，EV样品中的其他颗粒(如糖、脂质或其他蛋白质)分离。
对于EV纯化，使用四种不同百分比的密度介质(60％Optiprep)：45％层、35％层、25％层和15％层。这将创建分级层。在顶部添加一个0％层，由无菌的1x PBS组成。45％梯度层应包含粗EV样品。将5ml样品添加到15ml Optiprep中。如果粗EV样品少于5ml，则使用无菌1x使其达到体积PBS。
使用血清学移液管，上下移液45％梯度混合物用以混合。然后将样品移液进入经标记的清洁无菌的超速离心管中。接下来，用10ml血清学移液管缓慢添加13ml 35％梯度混合物。接着添加13ml 25％梯度混合物，接着添加13ml 15％混合物，最后添加6ml无菌1xPBS。超速离心管用无菌1x PBS平衡。梯度小心地放置在转子中，并且超速离心机设置为200,000x g和4℃。梯度离心至少16小时。
使用清洁移液管除去一种或多种目的级分，将其加入15ml锥形管中。这些“纯化”的EV样品保存在4℃。
为了清洁和去除EV中残留的optiprep，向纯化的EV中加入10x体积的PBS。超速离心机设定为200,000x g和4℃。离心并且旋转1小时。管小心地从超速离心机中取出，并倾析上清液。洗涤纯化的EV，直到所有样品都被沉淀。将1x PBS添加到放在容器中的纯化的沉淀物中。将容器置于转速为70的摇床上，在4℃冰箱中过夜或更长时间。用另外的无菌1x PBS重悬浮‘纯化的’EV沉淀物。重悬浮的纯化的EV样品储存在4℃或-80℃。
实例9：普雷沃菌属EV冻干物：DTH功效
从泰康利生物科学公司购买了5周大的雌性C57BL/6小鼠，并在饲养箱中适应了一周。在第0天通过皮下免疫用KLH和CFA(1:1)乳剂对小鼠进行初免。从第6-8天开始，每天用栖组织普雷沃菌EV对小鼠进行口服管饲，或以1mg/kg腹膜内给药地塞米松(阳性对照)。在第8天给药后，用异氟烷麻醉小鼠，用Fowler卡尺测量左耳的基础测量值，并在左耳中用含KLH的生理盐水(10μl)皮内激发小鼠，并且在24小时测量耳厚度。
在本实施例中，研究中使用的普雷沃菌属smEV分离自普雷沃菌属菌株B(NRRL登录号B 50329)。EV在赋形剂配方7a中冻干。
24小时耳测量结果显示在图1中。由栖组织普雷沃菌制成并在配方7a的赋形剂中冻干的EV在一项剂量范围研究中进行了测试，该剂量范围研究有四个剂量(2E09、2E07、2E05、2E03)，给药三天。栖组织普雷沃菌EV的所有剂量除了最低剂量(2E03)与媒剂相比均有效，并且观察到剂量应答趋势。作为阴性对照，仅使用配方7a(赋形剂组分的剂量相当于已配制2e11 EV情况下存在的量)。
实例10：EV(smEV)的分离和表征
从下列科中分离的菌株：
所有EV均在配方7a(20％海藻糖、80％甘露醇)中冻干。
分类来自lpsn.dsmz.de/
普雷沃菌科：
域：细菌，门：拟杆菌门，拟杆菌纲，目：拟杆菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
变黑普雷沃菌
粪便普雷沃菌
口腔普雷沃菌
颊普雷沃菌
颤螺旋菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：梭菌纲，目：真细菌目
革兰氏阳性细胞壁结构(单层)
黑罗特克斯欧里何米尼斯菌(第1批，在葡萄糖中生长)
黑罗特克斯欧里何米尼斯菌(第2批，在NAG中生长)
变异罕见小球菌
Harryflintia acetispora(第1批，吐温中生长)
Harryflintia acetispora(第2批，无吐温生长)
Acutalibacter sp.
韦荣氏球菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：Negativicutes，目：韦荣球氏菌属目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
小韦荣氏球菌(第1批，菌株A)
小韦荣氏球菌(第2批，菌株B)
鞘状巨型球菌(Megasphaera vaginalis)
巨型球菌属物种
非典型韦荣氏球菌
坦纳菌科
域：细菌，门：拟杆菌门，纲：拟杆菌纲，目：拟杆菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
狄氏副拟杆菌
戈登氏副拟杆菌
屎副拟杆菌
古氏副拟杆菌
梭菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：梭菌纲，目：真细菌目
革兰氏阳性细胞壁结构(单层)
Anaeromassilibacillus sp.
尸毒梭菌
丁酸梭菌
毛螺菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：梭菌纲，目：真细菌目
革兰氏阳性细胞壁结构(单层)
长链多尔氏菌
地中海杆菌/活泼[瘤胃球菌]
马赛布劳特氏菌
理研菌科
域：细菌，门：拟杆菌门，拟杆菌纲，目：拟杆菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
不明显另枝菌
Alistipes timonensis
月形单孢菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：Negativicutes，目：月形单孢菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
菲利克斯新月形单胞菌
生痰月形单胞菌
Sporomusaceae科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：Negativicutes，目：月形单孢菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
Propionispora sp.
克里斯滕森菌科
域：细菌，门：厚壁菌门，纲：真细菌目(Eubacteriales)，目：克里斯滕森菌目(Christensenellales)
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
小克里斯滕森氏菌
互养菌科
域：细菌，门：互养菌门，纲：互养菌纲，目：互养菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
埃夫里杆菌
阿克曼氏菌科
域：细菌，门：疣微菌门，纲：疣微菌纲，目：疣微菌目
革兰氏阴性细胞壁结构(双层)
嗜黏蛋白阿克曼氏菌
EV分离工艺
用于冻干的EV的制备如下：
在生物反应器中微生物生长后，用带有SLA-3000转子的Sorvall RC-5C离心机以每分钟至少7,000转的速度将培养物沉淀至少15分钟。收集上清液并通过0.2μm PallVacu-Cap过滤器(VWR，28139-706)。对于过滤性差的上清液(通过过滤器的上清液少于300ml)，在0.2μm真空过滤器之前连接附加0.45μm胶囊过滤器(VWR，28145-870)。
使用平板TFF(切向流过滤)浓缩细菌上清液。通过两个300kDa可重复使用的盒(Repligen)浓缩来自单层细菌的上清液。通过两个300kDa(密理博公司(Millipore))可重复使用的盒浓缩来自双层细菌的上清液，以限制LPS(内毒素)可能从不含LPS的细菌转移到上清液中。在上清液浓缩之前，平板TFF系统、进料、渗余物和渗透物管线用0.5M NaOH冲洗，然后用0.22μm无菌过滤的去离子(DI)水冲洗，直到流出的DI水显示中性pH值(约4L)。然后通过将渗透物管线放置在废液容器中来浓缩上清液，并将进料管线和渗余物管线放置在含有上清液的瓶子中。浓缩上清液直至体积达到100ml。压力传感器被监测并保持在10psi以下。在浓缩的上清液达到100ml后，对材料进行渗滤以去除小的代谢物和培养基组分。根据样品，将无菌过滤的DI水缓慢添加至500ml或1L的体积。为了去除和收集管道中的剩余材料，将渗透物管线夹住，并将进料和渗余物管线放入较小的二级瓶中，该瓶中装有50ml的0.22μm无菌过滤的去离子水。管线用无菌DI水冲洗。收集所得材料并添加到浓缩的上清液中。在配制品7a(20％海藻糖，80％甘露醇)中冻干浓缩的渗余物。
仅用于梯度纯化：
然后将过滤和浓缩的上清液分装到干净的超速离心管中，将材料离心过滤并将浓缩的上清液分装到干净的超速离心管中，将材料在超速离心机中在4℃在200,000x g离心1小时，将样品重悬浮于无菌PBS中。然后在浓度为15％、35％和45％的Optiprep(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，D1556-250ML)梯度上梯度纯化粗沉淀。将材料在4℃以200,000x g超速离心(贝克曼库尔特公司的配备45Ti转子的Optima XE-90超速离心机或赛默飞世尔科技公司的配备Fiberlite F37L-8x100转子的Sorvall wX+Ultra系列离心机)10-16小时。为了去除Optiprep，样品在10倍体积的PBS中洗涤。洗涤后的样品在4℃以200,000x g离心1小时(需要2次洗涤以从样品层收集所有材料)。将样品重悬浮在无菌PBS中。
冻干
冻干条件提供在表6中。
表6.微生物EV样品的复合循环
EV表征测定
1.冻干粉的颗粒计数
目标：使用纳米颗粒跟踪分析在ZetaView上确定粉末中存在的颗粒数量。
实验方案：简而言之，将在分析天平上称重的50mg每种粉末重悬浮于5mL MilliQ水(密理博公司)并且制备一系列稀释液(10-3、10-4和10-5重量/体积)以在Zetaview(Particle Metrix)上进行测试，以获得制造商方案中规定的每个视野50-400个颗粒的最佳读取范围。Zetaview相机使用100nm PS校准珠(Particle Metrix，目录号110-0020)进行校准，1E8个颗粒/毫升浓度的100nm胶体二氧化硅珠(日本加野公司(Kanomax))用作参考标准。激光设置为488散射，相机灵敏度设置为80，快门设置为300。一式两份测量样品并报告平均值。结果显示在图2-6中。y轴提供从5mg/mL milliQ水重悬浮液外推的颗粒数/mg粉末。
2.动态光散射测量颗粒尺寸和电荷
目标：颗粒的尺寸和电荷是可能影响EV在体外和体内的功效和效力的物理特性。有证据表明颗粒的尺寸和电荷会影响与免疫细胞的相互作用，包括吞噬作用(Paul等人(2013)Biophys J.[生物物理学杂志]105(5):1143-50)。电荷还可能影响含有EV的上清液的过滤性和EV在溶液中的稳定性(Getnet Midekessa等人(2020)ACS Omega.[美国化学会Omega刊]5(27):16701-10)。动态光散射(DLS)是一种颗粒检测的整体方法，它测量作为时间函数的散射光强度，以确定颗粒的特征，包括直径(尺寸)和ζ电位(电荷)(Szatanek等人(2017)Int J Mol Sci.[国际分子科学杂志]18(6):1153。使用DLS作为测量尺寸的方法的优点是可以检测广泛范围的粒度。在非均质或多分散样品中，例如囊泡制剂，DLS可以检测多达三个亚群。
实验方案：所有样品均使用DTS1070比色皿在Malvern Zeta Sizer Nano ZS上运行。样品在0.1x PBS(吉布科公司(Gibco))中稀释100x或1000x。对于这些设置，折射率设置为1.39，基于关于囊泡折射率的文献报告(Welsh等人(2020)J Extracell Vesicles[细胞外囊泡杂志],9(1):1816641)并且材料吸收设置为0.01。用于稀释样品的分散剂是0.1xPBS(吉布科公司)。添加痕量盐以限制颗粒之间的长距离相互作用。测量角度设置为173°。总共进行5次重复测量以确定尺寸，并进行3次测量以确定ζ电位。所有运行一起平均以确定平均尺寸和电荷值。最终报告给出了“Z平均”或整个群体的强度加权均值以及尺寸或电荷的分布。记录了Z平均和最优势峰的均值。
A.尺寸确定
结果：
梯度纯化且冻干的EV的尺寸测定结果如图7-11所示。图上的y轴代表以纳米为单位报告的尺寸。柱代表最优势DLS积分峰的均值，误差条显示与均值的标准偏差。
B.电荷(ζ电位)确定
结果：
梯度纯化且冻干的EV的电荷结果如图12-16所示。图上的y轴提供ζ电位(mV)。已针对最优势DLS积分峰计算了电荷。柱代表均值，误差条显示与均值的标准偏差。
结论：
EV的尺寸范围从25nm到约500nm。
梯度纯化材料和冻干材料通常具有相似的尺寸和电荷，但并非在所有情况下。
变异罕见小球菌、Acutalibacter sp.、变黑普雷沃菌、尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、和Cloacibacilus evryensis在梯度纯化后更大。这可能是由于梯度纯化材料的聚集或梯度纯化消除了蛋白质或其他小颗粒污染物。
口腔普雷沃菌在冻干后具有大得多的尺寸，这可能是由于聚集。
几乎所有的EV都带负电。唯一的例外是变黑普雷沃菌和来自Alistipestimonensis、Cloacibacilus evryensis、和巨型球菌属物种的梯度纯化的材料。
3.粒度和电荷的Z平均测量值
这里报告了Z平均尺寸和电荷测量值。Z平均表示从整个样品群体而不是最优势峰计算的均值尺寸或电荷。
A.尺寸确定
结果：
梯度纯化且冻干的EV的Zave尺寸测定结果如图17-21所示。图上的y轴表示尺寸(以nm)。柱代表强度加权均值或z平均。
B.电荷(ζ电位)确定
结果：
图22-26显示了梯度纯化且冻干的EV的平均电荷结果。图上的y轴提供ζ电位(mV)。柱代表强度加权均值或z平均。
结论：
Z平均尺寸总体上大于最优势峰的平均尺寸，这可能是因为EV制剂中存在的导致平均值偏斜的非常大的颗粒数量很少。
梯度纯化材料和冻干材料通常具有相似的尺寸和电荷，但并非在所有情况下。
源自活泼瘤胃球菌、马赛布劳特氏菌、狄氏副拟杆菌、戈登氏副拟杆菌、黑罗特克斯欧里何米尼斯菌第1批、Harryflintia acetispora的梯度纯化的材料相对于冻干材料更大。这可能是由于梯度纯化材料的聚集或环境污染或梯度纯化消除了蛋白质或其他小颗粒污染物。
所有Z平均电荷值为负。这表明EV制剂中的大部分材料都带负电。
源自狄氏副拟杆菌、人体普雷沃菌、Alistipes timonensis、损伤新月形单胞菌、Proprionispora sp.、小克里斯滕森菌、活泼瘤胃球菌、和Cloacibacilus evryensis的梯度纯化且冻干的材料具有不同的电荷值。这可能是由于赋形剂对电荷的稳定或存在使平均值偏斜的污染物。
4.卡尔费休水分含量
目标：本实验的目的是测量冻干细胞外囊泡(EV)粉末中的水含量。
实验方案：通过称量4mL Hydranal水标准品1.0(弗卢卡公司(Fluka)，CAT#34828-40ML)并用注射器和针注入反应容器来评估系统适用性。为了计算水百分比，报告的水含量除以添加的标准品的质量。在进行样品分析之前，已验证标准品中测得的水百分比在制造商提供的值的5％以内。为了分析样品材料，在分析天平上的称量盘中称量约30mg样品。记录样品的精确最终重量，并将样品转移到反应容器中。如上所述计算一式三份样品的水百分比。报告均值水含量和相对标准偏差。结果如图27-31所示。
结论：
所有样品的水含量值范围为2.3％至5.2％，所有样品的平均值为3.99％(标准偏差＝0.76)。
个别测量的重复性是精确的，但有一些例外。Anaeromassilibacillus sp.、Dorealongicatena、和地中海杆菌/活泼[瘤胃球菌]的RSD≥10％，这可能是由于每种粉末的物理状态所致。这些粉末中的每一种都具有片状外观，而不是在许多其他分析批次中看到的小颗粒，小颗粒导致到在卡尔费休反应容器中溶解样品的困难。
5.U937体外表征
目标：巨噬细胞很可能是口服施用后EV在小肠中与它们相互作用的首批免疫细胞之一。微生物相关分子模式(MAMP)，如膜蛋白、核酸、脂质和聚糖，可以通过免疫模式识别受体(PRR)(如TLR(Toll样受体)、CLR(C型凝集素受体)和NLR(Nod样受体))来检测并启动免疫应答(Kuipers等人(2018)Front Microbiol.[微生物学前沿],9:2182,doi:10.3389/fmicb.2018.02182)。基于EV中所含大分子的复杂组成，与宿主巨噬细胞的相互作用可能会引发更促炎的M1样应答(其特征是分泌IL-6、TNFα和IL-1β细胞因子)或更耐受的M2样细胞因子应答(其特征是分泌IL-10)。在该测定中，我们开发了一种体外方法来观察U937巨噬细胞对从不同微生物来源分离并在配方7a中配制为粉末的EV的应答。
实验方案：U-937细胞在完全RPMI 1640培养基中以每孔100,000个细胞的密度接种在96孔板中。为了分化细胞，在37℃以20nM的终浓度添加PMA，在5％CO2培养箱中72小时。在开始实验前洗涤细胞并在新鲜培养基中孵育24小时。细胞外囊泡在RPMI培养基中稀释至每孔106、107、108和109个颗粒的浓度。LPS和FSL对照在RPMI 1640培养基中稀释至终浓度为10ng/ml。在一式三份的孔中添加总体积200μL的稀释EV以及LPS和FSL对照。将板放入装有湿纸巾的容器中，并在5％CO2的需氧条件下在37℃培养箱中孵育24小时。24小时后，用乳酸脱氢酶检测试剂盒(Promega CytoTox 96非放射性细胞毒性测定，目录号G1780)对细胞死亡进行测定。收集上清液并根据随附的制造商方案进行MSD U-Plex测定以测量IL-10、IL-1β、IL-6、IP-10和TNFα。
结果显示在图32-37(IL-10)、图38-43(IP-10)、图44-49(IL-1β)、图50-55(TNFα)和图56-61(IL-6)中。具体而言，图32-37显示了U937巨噬细胞应答于特定剂量的EV的IL-10分泌；图38-43显示了U937巨噬细胞应答于特定剂量的EV的IP-10分泌；图44-49显示了U937巨噬细胞应答于特定剂量的EV的IL-1B分泌；图50-55显示了U937巨噬细胞应答于特定剂量的EV的TNFα分泌；并且图56-61显示了U937巨噬细胞应答于特定剂量的EV的IL-6分泌。结果表明，配制为冻干粉末的EV在该体外测定中具有效果。
结论：
人体普雷沃菌诱导了普雷沃菌科的最高IL-10表达。
所有坦纳菌科的IL-10水平相似，但在戈登氏副拟杆菌和屎副拟杆菌中最高。
黑罗特克斯欧里何米尼斯菌第1批(葡萄糖)诱导了颤螺旋菌科的最高IL-10表达。
鞘状巨型球菌诱导了韦荣氏球菌科中的最高IL-10表达。
来自梭菌科的Anaeromassilibacillus sp.也强烈诱导IL-10。
与LPS相比，许多测试的EV激活了IP-10的低分泌。韦荣氏球菌科的所有成员都诱导了最高的IP-10。
屎副拟杆菌诱导了坦纳菌科中的最高IL-1β表达。
人体普雷沃菌诱导了普雷沃菌科的最高IL-1β表达。
鞘状巨型球菌和非典型韦荣氏球菌诱导了韦荣氏球菌科的最高IL-1β表达。
Subdoligranulum variabile在所有细菌来源的EV中诱导了最高的IL-1β表达，并且在颤螺旋菌科中最高。
小韦荣氏球菌第1批是韦荣氏球菌科中最促炎的细菌，引发最多的IL-6和TNFα表达。
人体普雷沃菌是普雷沃菌科中最促炎的细菌，具有最高的IL-6和TNFα表达。
Subdoligranulum variabile是所有EV中IL-6和TNFα最高的最促炎细菌。
总体结论：
细菌EV的尺寸范围为25nm至457nm。更大尺寸的EV可能是由于聚合。
普雷沃菌科和颤螺旋菌科比坦纳菌科和韦荣氏球菌科具有更大的尺寸分布。
平均而言，颤螺旋菌科具有最高的蛋白质浓度/E9颗粒。
几乎所有的EV都带负电。唯一带正电荷的EV是变黑普雷沃菌。
韦荣氏球菌科引起最大的细胞因子应答。
实例11：小韦荣氏球菌和Fournierella massiliensis smEV
这些研究的目的是收集有关EV物理特征的数据。EV是从小韦荣氏球菌(V.parvula)菌株培养物和Fournierella massiliensis(F.massiliensis)菌株培养物的培养基中分离出来的，与赋形剂配制品混合，冻干并研磨成冻干粉。评估所得粉末的特性。
用作EV来源的小韦荣氏球菌菌株是保藏为ATCC指定编号PTA-125691的韦荣氏球菌属细菌。另见WO 2019/157003。用作EV来源的Fournierella massiliensis菌株是保藏为ATCC指定编号PTA-126696的Fournierella massiliensis细菌。另见PCT/US21/36927。
从这些菌株中纯化的EV使用选择的24种稳定剂混合物(赋形剂原液)进行冻干。
冻干EV粉末的制备：
小韦荣氏球菌菌株和Fournierella massiliensis菌株各自的50L培养物在分批发酵条件下生长以产生EV材料。每种培养物首先通过离心澄清，然后无菌过滤或深度过滤和无菌过滤的组合。
然后使用300kd mPES中空纤维过滤器通过切向流过滤(TFF)将澄清的上清液浓缩约25倍。浓缩物通过5体积连续渗滤进一步纯化，以去除残留的培养基组分和废物。
为了与纯化的EV浓缩物混合，将包含赋形剂的每种原液(见表K)制备为15％(w/w)原液。用0.2μm瓶顶过滤器对原液进行过滤灭菌，并在环境条件下储存直至使用。每种稳定剂溶液与纯化浓缩物按质量以0.5875:1的比例混合，形成EV-稳定剂“浆料”。
将浆液转移到塑料冻干托盘中，使每个托盘填充到大约1cm的深度。将托盘转移到搁板式冻干机，在此使用保守的冻干循环对其进行冷冻和冻干，以适应所测试的各种稳定剂(见表L)。每种条件产生按质量计95-99％是稳定剂的粉末。
冻干后，分析每种粉末的水分含量(通过卡尔费休滴定法(KF))、粒度分布和ζ电位(通过动态光散射(DLS))和颗粒(通过具有Zetaview的纳米颗粒跟踪分析(NTA)定量)。结果报告在表M、N和O中并显示在图62-66中。DLS方法基于来自激光源的单色光的衍射测量纳米颗粒的粒径和电动电位(电荷)。DLS测量值(尺寸或电荷)可以作为整个样品分布的平均值进行分析，也可以分解为多达三个不同的亚群/样品。结果报告为整个分布的平均值(例如，z平均)，或作为最优势亚群的平均值(例如，峰大小、峰ζ电位)。
表K：原液按相对浓度包含赋形剂(％w:w)
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表L：EV的一般保守冻干循环。
步骤 斜坡时间(分钟) 保持时间(分钟) 搁板温度(C) 真空(毫托)
冷冻 200 360 -45 100-300
一级干燥 75 5000 -20 100-300
二级干燥 180 1000 25 100-300
保持 0 N/A 25 100-300
表M：根据NTA的颗粒计数和根据KF的水分含量。
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表N：由DLS确定的粒度分布，包括分布的平均尺寸和优势亚群的尺寸(峰尺寸)。
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表O：由DLS确定的优势亚群的电动电位。
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实例12：从细菌中纯化和制备膜以获得经加工的微生物细胞外囊泡(pmEV)
纯化
使用本领域技术人员已知的方法从细菌培养物(例如表1、表2和/或表3中列出的细菌)中纯化和制备经加工的微生物细胞外囊泡(pmEV)(Thein等人,(2010)J.ProteomeRes.[蛋白质组研究杂志],9(12):6135-47；Sandrini等人(2014)Bio-Protocol.[生物方案]4(21)doi:10.21769/BioProtoc.1287)。
可替代地，pmEV可以通过Thein等人的方法进行纯化。例如，细菌培养物在10,000-15,500x g下在室温或4℃下离心10-30分钟。弃去上清液，并且将细胞沉淀物在-80℃冷冻。细胞沉淀物在冰上解冻并在pH 7.5的100mM Tris-HCl中重悬浮，并且可以补充1mg/mL DNA酶I和/或100mM NaCl。将解冻的细胞在500μg/ml溶菌酶、40μg/ml溶葡萄球菌素(lyostaphin)和/或1mg/ml DNA酶I中孵育40分钟以促进细胞裂解。可以使用其他酶来促进裂解过程(例如，EDTA(5mM)，PMSF(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))和/或苯甲脒(西格玛奥德里奇公司)。然后在制造商建议的条件下使用Emulsiflex C-3(奥维斯丁公司(Avestin,Inc.))裂解细胞。另外，也可以在-80℃冷冻沉淀物并在裂解之前再次解冻。碎片和未裂解细胞在4℃下以10,000-12,500x g离心15分钟沉淀。然后将上清液在4℃下以120,000x g离心1小时。将沉淀物重悬浮在冰冷的100mM碳酸钠，pH 11中，在4℃下搅拌孵育1小时。可替代地，将沉淀物在重悬浮后立即在碳酸钠中以120,000x g在4℃离心1小时。将沉淀物重悬浮在补充有100mM NaCl的pH 7.5的100mM Tris-HCl中，在4℃下以120,000x g再离心20分钟，然后重悬浮在补充有多达或约100mM NaCl的pH 7.5的100mM Tris-HCl或重悬浮在PBS中。样品储存在-20℃。为了在冷冻/解冻步骤期间保护pmEV制剂，可向最终制剂中添加250mM蔗糖和多达500mM NaCl以稳定pmEV制剂中的囊泡。
可替代地，pmEV是通过改编自Sandrini等人(2014年)的方法获得的。然后，细菌培养物在室温或4℃下以10,000-15,500x g离心10-15分钟，细胞沉淀物在-80℃冷冻，并且弃去上清液。然后，将细胞沉淀物在冰上解冻，并重悬于10mM Tris-HCl(pH 8.0)、补充有0.1mg/mL溶菌酶的1mM EDTA中。然后将样品在室温或37℃下混合孵育30分钟。在一个任选步骤中，将样品在-80℃下重新冷冻，然后再次在冰上解冻。添加DNA酶I至终浓度为1.6mg/mL，并添加MgCl2至终浓度为100mM。使用QSonica Q500超声仪以30秒开启和30秒关闭的7个循环对样品进行超声处理。通过在4℃下以10,000x g离心15分钟来沉淀碎片和未裂解的细胞。然后将上清液在4℃下以110,000x g离心15分钟。将沉淀物重悬浮在10mM Tris-HCl(pH8.0)中，并在室温下混合孵育30-60分钟。将样品在4℃下以110,000x g离心15分钟。将沉淀物重悬于PBS中并储存在-20℃。
任选地，pmEV可以使用本领域已知的方法与其他细菌组分和碎片分离。尺寸排阻色谱法(FPLC)或快速蛋白液相色谱法可用于pmEV纯化。可以使用的其他分离方法包括场流分级、微流过滤、无接触分选和/或免疫亲和富集色谱。可替代地，高分辨率密度梯度分级可用于基于密度分离pmEV颗粒。
制备
细菌培养物在10,000-15,500x g下在室温或4℃下离心10-30分钟。弃去上清液，并且将细胞沉淀物在-80℃冷冻。将细胞沉淀物在冰上解冻并在以下中重悬浮：100mMTris-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl、500μg/ml溶菌酶和/或40μg/ml溶葡萄球菌素(以促进细胞裂解)；多达0.5mg/ml DNA酶I(以减小基因组DNA大小)、EDTA(5mM)、PMSF(1mM，西格玛奥德里奇公司)和苯甲脒(1mM，西格玛奥德里奇公司)(以抑制蛋白酶)。然后在制造商建议的条件下使用Emulsiflex C-3(奥维斯丁公司(Avestin,Inc.))裂解细胞。可替代地，也可以在-80℃冷冻沉淀物并在裂解之前再次解冻。碎片和未裂解物通过以10,000-12,500x g在4℃下离心15分钟沉淀。使用FPLC仪器(AKTA Pure 150，通用健康医疗集团(GE Healthcare))(其中使用PBS和补充有多达0.3M NaCl的运行缓冲液)对上清液进行尺寸排阻层析(Sepharose 4FF，通用健康医疗集团)。将纯pmEV收集到柱空隙体积中，浓缩并保存在-20℃。浓缩可以通过多种方法进行。例如，可以使用超离心(140,000x g，1小时，4℃，然后在小体积PBS中重悬浮)。为了在冷冻-解冻步骤期间保护pmEV制剂，可向最终制剂中添加250mM蔗糖和多达500mM NaCl以稳定pmEV制剂中的囊泡。可以使用的其他分离方法包括场流分级、微流过滤、无接触分选和/或免疫亲和富集色谱。使用本领域已知的方法可以采用的其他技术包括鞭打膜蒸发(Whipped Film Evaporation)、分子蒸馏、短程蒸馏和/或切向流过滤。
在某些情况下，对pmEV进行称重，并以不同的剂量(以μg/ml)施用。任选地，使用本领域已知的方法，使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)来评估pmEV的颗粒计数和尺寸分布。例如，Malvern NS300仪器可以根据制造商的说明或如Bachurski等人2019.Journal ofExtracellular Vesicles.[细胞外囊泡杂志]卷8(1)所描述的那样使用。可替代地，对于pmEV，可以使用Bio-rad测定法(Cat#5000205)测量总蛋白(按照制造商的说明执行)并基于蛋白含量/剂量以不同剂量施用。
对于本文所述的研究，pmEV可以在施用之前被辐照、加热和/或冻干。
pmEV可以使用本文所述的赋形剂和干燥条件进行冻干，以产生冻干物或粉末。
实例13：栖组织普雷沃菌smEV的喷雾干燥粉末
在本实例中，研究中使用的细胞外囊泡(smEV)是从栖组织普雷沃菌菌株B中分离。
如下将smEV喷雾干燥：
EV渗余物与表P中提供的赋形剂之一混合。
表P：原液按相对浓度包含赋形剂(％w:w)
喷雾干燥在100℃或130℃进行。温度也包括在表Q中。
喷雾干燥后，分析每种粉末的水分含量(MC)(通过卡尔费休滴定法(KF))和颗粒(颗粒/mg喷雾干燥粉末(p/mg))(通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)使用Zetaview量化)。结果显示在表Q中。EXP7A是配方7a的原液。
表Q：喷雾干燥样品的水分含量和颗粒含量
样品ID 入口温度(℃) 水分含量(％) 颗粒数/mg
EXP7A-130℃入口 130 3.64 1.30E+10
EXP7A-100℃入口 100 2.54 1.25E+10
Man-Malt-Tre(20:60:20) 130 5.35 1.40E+10
Malt-Tre(70:30) 130 8.38 2.00E+10
100％海藻糖 130 6.37 1.60E+10
还使用由PEG6000-甘露醇-海藻糖(60:20:20)组成的原液进行喷雾干燥。然而，相对于本文所述的其他方法，获得了降低的干燥产物回收率。
栖组织普雷沃菌smEV在两种浓度(25X和500X)的配方7a(F7A)原液中喷雾干燥或冻干，其中入口温度为130℃。
颗粒数/mg喷雾干燥粉末和尺寸的比较见表R。SD＝喷雾干燥；L0.47＝冻干；0.47是指使用的原液比率：47g赋形剂/100g渗余物。
喷雾干燥的和冻干的EV的颗粒堆积和尺寸在两种干燥方法情况下相似。
表R
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通过引用并入
在本文中提及的所有出版物、专利申请都通过引用以其全文特此并入，如同各个单独的出版物或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用并入。如果出现冲突，则以本申请(包含本文的任何定义)为准。
等效形式
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实例的许多等效形式。此类等效形式旨在为下列权利要求所涵盖。

Claims (26)

1.一种包含来自细菌的细胞外囊泡(EV)的干燥形式，其中该干燥形式具有低于约6％的水分含量。
2.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式具有低于约5％的水分含量。
3.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式具有低于约4％的水分含量。
4.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式具有约1％至约4％之间的水分含量。
5.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式具有约2％至约3％之间的水分含量。
6.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含粉末。
7.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含冻干物。
8.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自与粘液相关的细菌菌株的EV。
9.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自厌氧细菌的EV。
10.如权利要求1所述的干燥形式，其中该厌氧细菌是专性厌氧菌。
11.如权利要求1所述的干燥形式，其中该厌氧细菌是兼性厌氧菌。
12.如权利要求1所述的干燥形式，其中该厌氧细菌是耐氧厌氧菌。
13.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自单层细菌的EV。
14.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自双层细菌的EV。
15.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自革兰氏阴性细菌的EV。
16.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自以下的细菌的EV：普雷沃菌科；韦荣氏球菌科；坦纳菌科；理研菌科；月形单孢菌科；Sporomusaceae科；互养菌科；克里斯滕森菌科；或阿克曼氏菌科。
17.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自革兰氏阳性细菌的EV。
18.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自以下的细菌的EV：颤螺旋菌科；梭菌科；或毛螺菌科。
19.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自普雷沃菌属细菌的EV。
20.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自韦荣氏球菌属细菌的EV。
21.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自副拟杆菌属细菌的EV。
22.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自颤螺旋菌科细菌的EV。
23.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自坦纳菌科细菌的EV。
24.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自普雷沃菌科细菌的EV。
25.如权利要求1所述的干燥形式，其中该干燥形式包含来自韦荣氏球菌科细菌的EV。
26.一种治疗性组合物，其包含如权利要求1至25中任一项所述的干燥形式。
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