CN117062907A - 培养并使多能细胞分化为肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的方法和包含所述细胞的组合物 - Google Patents

培养并使多能细胞分化为肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的方法和包含所述细胞的组合物 Download PDF

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Abstract

本文提供了包含成熟肌肉祖细胞和/或成熟肌肉细胞的人工培养体节、获得其的方法和用于快速、大规模生产包含成熟肌肉细胞的培养肉类的方法。

Description

培养并使多能细胞分化为肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的方法 和包含所述细胞的组合物
发明领域
本文提供了包含成熟肌肉祖细胞和/或成熟肌肉细胞的人工培养体节、获得其的方法和用于快速、大规模生产包含成熟肌肉细胞的培养肉类的方法。
发明背景
肉类行业是环境和气候恶化的主要原因之一。由于世界人口增长和需求增加，肉类消费预计在1999年与2050年之间将翻一番。该行业还与抗生素耐药性和动物源性疾病的发生密切相关。虽然完全基于植物的饮食可以被认为是减少环境影响的良好替代方案，但存在很多理由认为，在肉类仍然可得的情况下，世界人口的大多数不会自愿改成这样的饮食。培养肉类是使用细胞培养物在体外生产的，为肉类提供了既便宜、更道德又环境友好的替代生产方法，但同时保持了特征性味道、质地和营养价值，并且甚至与动物源性产品具有相同的生物来源。由于骨骼肌是大多数动物肉类中使用的主要可食用组织，因此为了有效生产培养肉类，要求在体外大量生产骨骼肌。
Schmidt等人(Cellular and Molecular Life Sciences,76:2559–2570,2019)公开了从卫星细胞(骨骼肌的干细胞)再生骨骼肌。
Suzuki等人(Differentiation,96:70-81,2017)公开了在补充有100ng/ml FGF-2和100ng/ml EGF的培养基中，使用经过超过6周的长分化时间段的游离漂浮球形培养物直接(无遗传修饰)从人类多能细胞衍生肌源性祖细胞的方案。
Nachman等人(bioRxiv,728642,2019)公开了控制从中内胚层祖细胞群体内发生定型内胚层细胞(definitive endoderm cells)的基本规则，涉及在上皮钙黏素上调之后Sox17+细胞的自我分选，其中高表达Bra的细胞的小亚群体独立于外部Wnt信号地定向至(committed to)它们的Sox17+命运。
对于用于生产体外肌肉细胞(优选地在组织结构内)的高效、快速且成本有效的方法存在尚未满足的需求。
发明概述
本文提供了一种基于发育途径的无血清、无基因组修饰的用于在培养物中产生体节、肌源性祖细胞、肌肉细胞和肌肉组织的方案。该方案包括从胚胎干细胞起始，在3D悬浮细胞培养物中诱导肌肉分化。还提供了包含肌肉细胞的培养体节和体节样结构。
有利的是，本文公开的用于在培养物中制备肉类产品的方案将胚胎3D发育系统在微观尺度上的自我组织特性与生物技术解决方案组合，这使得其非常适用于肉类产品的大规模生产和类器官培养物中的肌肉组织成熟。该方案解决了现有的已建立的肌肉分化方案与食品生产的扩大规模和安全性要求之间的巨大差距。
令人惊讶的是，本文公开的方案生产体节和体节样结构，它们是在胚胎中产生椎骨和骨骼肌的封闭结构。体节的生产具有重要益处。首先，体节的生产表明，本文公开的方案(方法/过程)以3D悬浮类器官形式良好模拟细胞在胚胎发育期间从多能(ES)细胞至完全分化的骨骼肌细胞所经历的发育阶段。因此，本文生产的培养组织包括‘真正的’肉类的所有特征，即，它主要由肌肉组织构成，但也包括对从家畜生产的肉类的结构和味道有贡献的脂肪细胞、结缔组织和血液。第二，体节在生产过程中的存在导致类器官内信号传导，这促进所要求的分化而不依赖于外部补充剂，并且因此仅使用少量的生长因子来补充培养基(例如，约10ng/ml量级)。因此，本文公开的方案是成本有效的，因为它不要求大量昂贵的生长因子(通常在培养组织的生产中产生主要的支出)。
出乎意料的是，对多能细胞应用本文公开的方案导致在短时间范围(time frame)内，例如仅在两周内，使用不多于约20ng/ml的FGF-2和EGF生长因子，产生肌源性祖细胞。
此外，由于包括体节形成和肌肉形成的发育过程在脊椎动物中高度保守，因此本文公开的遵循胚胎发育原则的方案可以成功实施，以从任何家畜物种的祖细胞生产培养肉类。
最后，本发明方案从干细胞起始，并且能够在悬浮液中分化(例如，在大规模生物反应器中或甚至在常规转动器(steerer)中)，直到获得肌源性祖细胞。
根据一些实施方案，鉴于上文，本文公开的快速、成本有效、可重复、适用于大规模生物反应器，以及生产包括家畜肉类特征的培养肉的方案，非常适于培养的肌源性祖细胞和培养肉类的工业制造。
公开的方案包括一系列步骤，其中每个步骤试图有效地模拟在相关发育阶段由肌源性谱系(例如中胚层、前体节(pre-somitic)中胚层、肌源性祖细胞和成熟肌肉细胞)感测的体内信号传导环境。该方案的第一步包括在第一培养基下使mES细胞聚集，然后使悬浮液中的聚集体分化，其中培养基可以在一些相继步骤之间改变，如下文进一步详述和示例的。
根据一些实施方案，提供了一种用于产生体节的方法，该方法包括：
(a)将胚胎干细胞悬浮在培养基中以获得基本上球形聚集体；
(b)向所述培养基中添加至少一种Wnt激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)去除所述Wnt激活剂；
(d)观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态(ovoid-like morphology)时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；以及
(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体。
根据一些实施方案，该方法还包括向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、Knock-out血清替代物、运铁蛋白-硒和BMP4中的一种或更多种。
根据一些实施方案，Wnt激活剂选自由以下组成的组：Chir99021、Wnt3a和Rspo3。
根据一些实施方案，向培养基中添加至少一种Wnt激活剂在获得所述基本上球形聚集体之后12至36小时内进行。
根据一些实施方案，去除Wnt激活剂在添加其之后8至36小时内进行。根据一些实施方案，去除Wnt激活剂在添加其之后12至36小时内进行。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体出现后，向培养基中添加至少一种Nodal抑制剂。
根据一些实施方案，细胞外基质或其组分的量在约1％至15％vol/vol的范围内。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在步骤(d)中添加选自由以下组成的组的至少一种化合物：Wnt激活剂和BMP抑制剂。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在获得多于一个体节后去除细胞外基质或其组分。
根据一些实施方案，提供了用于产生肌源性祖细胞的方法，该方法包括：
(a)将胚胎干细胞在培养基中繁殖以获得球形聚集体；
(b)向所述培养基中添加至少一种Wnt激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)去除所述Wnt激活剂；
(d)观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；
(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体；以及
(f)向步骤(e)的培养基中添加低于30ng/ml浓度的一种或更多种生长因子，从而获得肌源性祖细胞。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子可以包括HGF、IGF和FGF2。
根据一些实施方案，步骤(a)可以在悬浮液中进行。
根据一些实施方案，该方法还可以包括向步骤(d)的培养基中添加选自以下的化合物中的至少一种：BMP抑制剂和Wnt激活剂。根据一些实施方案，Wnt激活剂选自由以下组成的组：Chir99021、Rspo3和Wnt3a。
根据一些实施方案，向培养基中添加至少一种Wnt激活剂在获得所述球形聚集体之后12至36小时内进行。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在步骤(e)之前去除细胞外基质(ECM)或其组分。根据一些实施方案，该方法还可以包括在步骤(f)之前去除细胞外基质或其组分。
根据一些实施方案，每种生长因子的浓度在约1ng/ml至25ng/ml的范围内。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子是IGF，并且IGF的浓度在约1ng/ml至5ng/ml的范围内。
根据一些实施方案，肌源性祖细胞包括成肌细胞和肌细胞。
根据一些实施方案，该方法还可以包括向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、Knock-out血清替代物、运铁蛋白-硒和BMP4中的一种或更多种。
根据一些实施方案，去除Wnt激活剂可以在约8至36小时的范围内进行。根据一些实施方案，去除Wnt激活剂可以在添加其之后约12至36小时内进行。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体出现后，向培养基中添加至少一种Nodal抑制剂。
根据一些实施方案，细胞外基质或其组分的量可以在约1％至15％vol/vol的范围内。
根据一些实施方案，提供了通过本文公开的方法制备的包含成熟肌肉祖细胞和/或成熟肌肉细胞的培养体节。
本发明的其他目的、特征和优点从以下描述、实施例和附图将变得清楚。
本公开内容的某些实施方案可以包括上述一些优点、上述所有优点或不包括上述优点。根据本文包括的附图、说明书和权利要求书，一种或更多种其他技术优点对本领域技术人员来说可以是很明显的。此外，虽然上文已经列举了特定优点，但是各种实施方案可以包括所有列举的优点、一些列举的优点或不包括列举的优点。
附图简述
本公开内容的一些实施方案在本文中参考附图进行描述。该描述与附图一起，使得一些实施方案可以如何被实践对于本领域普通技术人员来说是明显的。附图是出于说明性描述的目的，并不试图以超过对本公开内容的基本理解所必要的细节来示出实施方案的结构细节。为清楚起见，在附图中描绘的一些对象不是按比例的。
在附图中：
图1A示出了遵循公开的方案中的步骤2从接种在板中的ESC细胞获得的包含中胚层细胞(Brachyury阳性细胞(Bra-GFP)；上图)和内胚层细胞(Sox17阳性细胞(Sox-RFP)；中图)的聚集体。
图1B示出了遵循公开的方案中的步骤2从悬浮液中的ESC细胞获得的包含中胚层细胞(Brachyury阳性细胞；窄箭头)和内胚层细胞(Sox17阳性细胞；白色粗箭头)的聚集体。
图2A表示在公开的方案的步骤3期间形成的小鼠3D类器官中的后前体节中胚层(posterior presomitic mesoderm，pPSM)空间-时间模式。类器官由Msgn1-YFP mES细胞聚集而成，并且在悬浮液中培养6天。比例尺100μm。
图2B表示对于在公开的方案的步骤3期间形成的20个类器官测量的针对绝对类器官长度(左图)和归一化类器官长度(右图)绘制的荧光水平。Msgn1-YFP标记pPSM。
图2C表示两簇延长的类器官：Msgn1+细胞迁移形成两个簇。
图2D表示三簇类器官：Msgn1+细胞迁移形成三个簇，都从类器官的核心延伸。
图2E表示每个类器官的Msgn1+簇的数目的直方图。
图3A表示在步骤3期间形成的、固定并且针对Brachyury免疫染色(Brachyury位于左/后极，由灰色箭头标记)的第5天的类器官，其中Msgn1-YFP标记pPSM(明亮区域，由虚线箭头标记)。
图3B是图3A中示出的类器官的示意性描述，包括在后极处的Brachyury阳性细胞、Msgn1阳性pPSM细胞和在前极处的前前体节中胚层(anterior pre-somitic mesoderm，aPSM)细胞。
图3C表示pPSM相关基因在mESC衍生的类器官朝向PSM分化的第4天(黑色柱)和第6天(灰色柱)的ΔCT平均值。
图3D表示在分化的第6天，Msgn1-YFP mESC类器官(中图)针对Pax3(右图)免疫染色的示例性图像。比例尺100μm。
图3E表示在分化的第6天，Msgn1-YFP mESC类器官(中图)针对神经钙黏素(Cdh2；右图)免疫染色的示例性图像。比例尺100μm。
图4A-图4C表示在步骤3期间获得的聚集体的图像。Msgn1-YFP(明亮区域)指示pPSM的存在。比例尺100μm。
图5A-图5C表示在步骤4结束时获得的用体节标志物(Pax3)染色、并且在两个z截面(左图，中图)和明场(右图)成像的延长的聚集体的图像。体节被编号。白色粗箭头指向Sox17-RFP阳性区域，标记内胚层。比例尺100μm。
图5D表示在步骤4结束时获得的延长的聚集体的图像，其中Brachyury-GFP和Sox17-RFP阳性区域分别标记中胚层和内胚层。体节由指向前区处圆形结构的白色小箭头指示。比例尺100μm。
图6A表示在步骤5结束时获得的用肌源性祖细胞标志物Pax7(聚集体上半部分处的明亮区域)染色的聚集体的图像和Sox17-RFP阳性内胚层区域(左下角，用白色箭头标记)。比例尺100μm。
图6B表示在步骤5结束时获得的用成肌细胞标志物MyoD(明亮区域)染色的聚集体的图像。比例尺100μm。
图6C表示在步骤5结束时获得的用肌细胞标志物MyoG(明亮区域)染色的聚集体的图像。比例尺100μm。
图6D表示成熟体节的图像，其中黑色箭头指向代表性体节。比例尺100μm。
详述
本文教导的原理、用途和实现可以参照所附说明书和附图被更好地理解。在仔细阅读本文呈现的说明书和附图后，本领域技术人员将能够实施本文的教导而无需过多努力或实验。在附图中，相同的附图标记始终指代相同的部分。在附图中，相同的附图标记始终指代相同的部分。
虽然基于细胞的肉类科学在过去几年中已有发展，但获得大量骨骼肌组织仍是重大挑战。为了迎接这一挑战，需要可扩展且有效的增殖和肌肉分化过程。虽然悬浮培养方法为扩大规模提供了最大的希望，但悬浮培养方法对肌肉分化构成了障碍，因为肌肉分化目前需要物理锚定点。
近年来，在模拟来源器官(original organ)的各方面(包括细胞组成)的小器官样3D结构(称为类器官)的3D悬浮培养方面取得了巨大进展。许多类器官系统从胚胎干细胞起始，提供完整的从起始到结束的分化过程，在一定程度上模拟胚胎过程，而无需重复地从动物中收获起始细胞群体。
简言之，存在两种主要的用于生产培养肉类的方法：(1)从卫星细胞起始——培养卫星细胞的相对益处是其向肌肉细胞的分化相对快速且容易。然而，由于卫星细胞是有丝分裂后(终末分化)的，它们不增殖，并且因此其作为起始细胞的使用对于大规模生产是不可行的；(2)从多能细胞(胚胎干细胞)起始——使用多能细胞的益处是其突出的长期增殖潜力及其在暴露于合适条件后被驱动朝向分化的能力。然而，这些细胞向成熟肌肉细胞的分化过程花费非常长的时间(超过一个月，通常超过6周)。
主要的挑战是大量肌肉细胞(优选地在组织环境内，即，类似于主要由肌肉组织(约90％)构成并且还包括脂肪(adipose，fat)细胞、血液和结缔组织的组合的肉类产品的内容物的培养肉类)的有效生长。目前的解决方案主要依赖于成体祖细胞(例如卫星细胞)作为起点，以及单细胞类型分化方案，这限制了增殖能力和与完整组织结构的相似性。因此，需要可扩展且有效的增殖和肌肉分化过程。
根据一些实施方案，利用如本文公开的方案允许生产包括肉类产品的各种组分的培养肉类，主要是因为该方案生产体节细胞。
在用于获得体节和3D可食用类器官的方案的上下文中，如本文使用的术语“方案”与术语“方法”或“过程”是可互换的。
迄今为止，已知的肌肉分化方案是基于2D黏附培养的或者是无效的。许多方案使用血清和/或遗传修饰来激活某些关键基因。一些使用部分分化的细胞(诸如卫星细胞)作为起始细胞类型，这可能对这些起始细胞的增殖速率和能力造成限制。本文公开的方案将仅信号传导的分化方案与悬浮3D培养系统(从ES细胞起始)组合，产生了可扩展且不含血清和其他动物源性因子的有效肌肉分化方法。多能干细胞的使用去除了重复地从动物中收获起始细胞群体的需要。
因此，根据一些实施方案，提供了一种用于产生体节的方法，该方法包括：
(a)将胚胎干细胞悬浮在培养基中以获得基本上或实质上球形聚集体；
(b)向所述培养基中添加至少一种Wnt激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)去除所述Wnt激活剂；
(d)观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质(ECM)或其组分，以获得包括轴旁中胚层的聚集体；以及
(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含/具有多于一个体节的聚集体。
根据一些实施方案，如本文使用的术语“繁殖”和“悬浮”是指在适用于维持多能细胞的增殖和多能性的条件下，在2-D培养物或悬浮液(3-D)中培养。细胞增殖通常增加聚集体的尺寸，形成较大的聚集体，该较大的聚集体可以常规地机械或酶促解离为较小的聚集体，以维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数目。通常，在维持培养物中的聚集体内培养的细胞维持多能性标志物。多能性可以部分通过评估细胞的多能性特征来确定。多能性特征包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多能干细胞标志物的表达，包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化为所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；和(vi)由来自三个体细胞谱系的细胞组成的胚状体(embryoid body)的形成。多能干细胞聚集体需要进一步的分化因素(cues)来诱导分化。
根据一些实施方案，在该方法的步骤(a)结束时，获得多于一个球形聚集体。根据一些实施方案，在步骤(a)结束时获得的多于一个球形聚集体包括至少50个球形聚集体、至少100个球形聚集体、至少150个球形聚集体、至少200个球形聚集体、至少250个球形聚集体、至少300个球形聚集体、约300个球形聚集体。每种可能性代表单独的实施方案。
如本文使用的，术语“约”可以用于将量或参数(例如，量、百分比、长度)的值指定为在给定(陈述的)值附近(并且包括该给定(陈述的)值)的连续值范围内。根据一些实施方案，“约”可以指定参数的值在给定值的80％与120％之间。根据一些实施方案，“约”可以指定参数的值在给定值的90％与110％之间。根据一些实施方案，“约”可以指定参数的值在给定值的95％与105％之间。
如本文使用的术语“多能干细胞”、“胚胎干细胞”和ESC是可互换的。
根据一些实施方案，胚胎干细胞来源于家畜。根据一些实施方案，胚胎干细胞来源于选自由以下组成的组的动物：牛、绵羊、山羊、鱼、猪和家禽。
应当理解，本文使用的胚胎干细胞(ESC)没有经受遗传工程化。
多能干细胞形态具有胚胎干细胞的经典形态特征。正常胚胎干细胞形态的特征是圆形(球形)和形状小，具有高细胞核与细胞质比率、明显的核仁存在以及典型的细胞间间距。相比之下，如通过本文公开的方法的步骤(b)获得的包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体具有卵样形态，如下文显示的，例如，如图2A中第4.5天示出的。
根据一些实施方案，步骤(a)在培养板(例如培养皿和/或多孔板)上进行。因此，根据一些实施方案，胚胎干细胞在一个或更多个培养板中形成黏附细胞培养物。根据一些实施方案，该方法还可以包括向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、运铁蛋白-硒、Knock-out血清替代物和BMP4中的一种或更多种。每种可能性是单独的实施方案。
进行向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、运铁蛋白-硒、Knock-out血清替代物和BMP4中的一种或更多种的步骤，以便增加类器官/聚集体内PSM细胞的比例。因此，用胰岛素、运铁蛋白-硒、Knock-out血清替代物和/或BMP4补充步骤(a)的培养基提高了本文公开的方案的质量。
根据一些实施方案，可以向培养基中添加胰岛素。根据一些实施方案，向培养基中添加的胰岛素的浓度在5μl/ml至15μl/ml、5μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至12μl/ml、5μl/ml至12μl/ml、约7μl/ml或约10μl/ml的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，可以向培养基中添加运铁蛋白-硒。根据一些实施方案，向培养基中添加的运铁蛋白-硒的浓度在0.1％至5％、0.2％至4％、0.2％至3％、0.5％至3％、0.5％至2％、0.8％至3％、0.8％至2％、约2％、约1.5％或约1％的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，可以向培养基中添加BMP4。根据一些实施方案，向培养基中添加的BMP4的浓度在5μl/ml至15μl/ml、5μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至12μl/ml、5μl/ml至12μl/ml、约7μl/ml或约10μl/ml的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，可以向培养基中添加Knock-Out血清替代物(KSR)。
根据一些实施方案，步骤(a)可以在N2B27培养基中进行。根据一些实施方案，步骤(a)可以在补充有Knock-out血清替代物(KSR)、牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素和BMP4中的至少一种的培养基中进行。根据一些实施方案，步骤(a)可以在补充有低浓度胰岛素的培养基中进行。根据一些实施方案，胰岛素的低浓度在约1μg/ml至25μg/ml胰岛素、约1μg/ml至20μg/ml胰岛素、约1μg/ml至15μg/ml胰岛素、约5μg/ml至25μg/ml胰岛素或约5μg/ml至20μg/ml胰岛素的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，通过旋转平板将细胞保持悬浮。
根据一些实施方案，在步骤(b)中添加的Wnt激活剂选自由以下组成的组：Chir99021、Rspo3和Wnt3a。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，在步骤(b)中添加的Wnt激活剂的浓度在约0.5μM至10μM、0.5μM至7μM、0.7μM至10μM、0.7μM至7μM、1μM至7μM或1μM至5μM的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，在培养物中形成多于一个聚集体后约24小时，在步骤(b)中添加Wnt激活剂。根据一些实施方案，在悬浮液中形成多于一个聚集体后约24小时，在步骤(b)中添加Wnt激活剂。
根据一些实施方案，Wnt激活剂在被添加至培养基之后约一天内、被添加之后8至36小时内、被添加之后12至36小时内、被添加之后18至30小时内、被添加之后约24小时内从培养基中去除。每种可能性代表单独的实施方案。在一些实施方案中，Wnt激活剂的去除可以通过用缺乏Wnt激活剂的类似培养基替代培养基来实现。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体出现后，向培养基中添加至少一种Nodal抑制剂。通过用至少一种Nodal抑制剂补充培养基，有助于抑制非体细胞群体诸如定型内胚层的扩增。
根据一些实施方案，Nodal抑制剂选自由以下组成的组：SB-431542和SB-505124。每种可能性是单独的实施方案。根据一些实施方案，在步骤(b)中添加的Nodal抑制剂的浓度在200nM 50 700nM、5μM至15μM、5μM至12μM、7μM至15μM、7μM至12μM、约7μM或约10μM的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，支架(细胞外)基质或其组分被掺入到悬浮液中的聚集体中。根据一些实施方案，培养基包含低浓度的细胞外基质(ECM)或其组分，特别地，少于约20％vol/vol、少于15％vol/vol、少于10％vol/vol、少于8％vol/vol、少于5％vol/vol。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约1％至15％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在1％至12％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约2％至12％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约3％至13％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约2％至12％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约3％至11％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约3％至10％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约4％至10％vol/vol的范围内。根据一些实施方案，培养基中ECM的量在约5％至10％vol/vol的范围内。
根据一些实施方案，ECM包括MatrigelTM。根据一些实施方案，培养基包含ECM的组分。根据一些实施方案，ECM的组分包括但不限于纤连蛋白、胶原和层黏连蛋白。
根据一些实施方案，添加ECM或其组分是在观察到具有卵样形态的聚集体之后进行的。因此，该方案不是基于添加ECM或其组分的随机/恒定时机，因为已经发现正确的时机因批次而变化，并且令人惊讶的是，最好基于对聚集体的观察来添加ECM或其组分，其中理想的时机是在聚集体呈现卵样形态时。
添加ECM或其组分后，形成轴旁中胚层细胞。根据一些实施方案，在聚集体内形成轴旁中胚层细胞后从培养基中去除ECM或其组分。从培养基中去除ECM或其组分赋予公开的方案另外的优点：它减少整个方案的总成本，同时不损害期望的结果。
根据一些实施方案，还存在在培养基中维持ECM或其组分的选择。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在步骤(d)中向培养基中添加至少一种Wnt激活剂和/或至少一种BMP抑制剂。因此，根据一些实施方案，步骤(d)中的培养基还可以包括至少一种Wnt激活剂和/或至少一种BMP抑制剂。用一种或更多种Wnt激活剂和/或一种或更多种BMP抑制剂补充步骤(d)中的培养基，即，包含ECM或其组分的培养基是有益的，因为它可以提高体节形成的产量。此外，在该阶段向培养基中添加一种或更多种Wnt激活剂和/或一种或更多种BMP抑制剂减少培养基的总黏度，从而有利于在混合悬浮液条件下生长，这特别适用于工业规模的生物反应器。
根据一些实施方案，至少一种Wnt激活剂选自Chir99201和Rspo3。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，至少一种BMP抑制剂选自LDN193189和Noggin。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，在分化过程结束时将多于一个类器官包埋到支架基质中。
如本文使用的术语“聚集体”、“3D类器官”和“类器官”是可互换的。
根据一些实施方案，提供了一种用于产生肌源性祖细胞的方法，该方法包括以上列举的用于获得体节的步骤，并且还包括以下步骤：(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体；以及(f)添加低于约30ng/ml浓度的一种或更多种生长因子，从而获得肌源性祖细胞。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子包括但不限于HGF、IGF和FGF2，其中一种或更多种生长因子的浓度在约1ng/ml至25ng/ml的范围内。根据一些实施方案，步骤(f)的培养基还补充有至少一种选自以下的化合物：BMP抑制剂和Wnt激活剂。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子可以包括HGF。根据一些实施方案，向步骤(f)的培养基中添加的HGF的浓度在约5μl/ml至15μl/ml、5μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至13μl/ml、7μl/ml至12μl/ml、5μl/ml至12μl/ml、约7μl/ml或约10μl/ml的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子可以包括IGF。根据一些实施方案，向步骤(f)的培养基中添加的IGF的浓度在约0.5μl/ml至5μl/ml、0.5μl/ml至3μl/ml、0.7μl/ml至3μl/ml、0.7μl/ml至2.5μl/ml、1μl/ml至2.5μl/ml、约2.5μl/ml或约2μl/ml的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，一种或更多种生长因子可以包括FGF2。根据一些实施方案，向步骤(f)的培养基中添加的FGF2的浓度可以在约10μl/ml至25μl/ml、12μl/ml至25μl/ml、12μl/ml至23μl/ml、15μl/ml至25μl/ml、15μl/ml至23μl/ml、约25μl/ml或约20μl/ml的范围内。每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，获得的肌源性祖细胞包括成肌细胞、肌细胞和卫星细胞。
已经显示肌肉细胞的成熟依赖于细胞在(半)刚性表面上的锚定，可能模拟对骨结构的锚定。因此，本文公开的方法还可以包括将晚期类器官包埋在可食用基质中的步骤，以试图产生肌细胞成熟的锚点。任选的基质包括但不限于菌丝体、藻酸盐和纤维素(例如来自脱细胞的苹果)。
根据一些实施方案，该方法还包括监测悬浮的3D类器官中的分化。
根据一些实施方案，监测可以使用选自由以下组成的组的至少一种技术来进行：高通量双光子3D成像、用加GFP标签的发育标志物(诸如Msgn1、Pax3、Pax7)的活体成像和针对标志物蛋白的免疫染色。
成像也用于监测在该过程不同阶段的细胞组成，目的是根据类器官中肌肉谱系细胞的比例来鉴定效率瓶颈。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在不同时间点表征3D类器官中的细胞群体。
根据一些实施方案，该方法还可以包括在不同时间点表征3D类器官中细胞群体的空间组织。
根据一些实施方案，表征3-D类器官中的细胞群体可以通过各种方法(包括但不限于RT-PCR和FISH)来进行。
根据一些实施方案，该方法还可以包括对3-D类器官进行营养谱分析。对于营养谱分析，可以应用各种方法，诸如GC、HPLC和带冷EI的GC-MS。
根据一些实施方案，3D类器官呈选自由以下组成的组的形式：悬滴(hangingdrops)、旋转悬浮液、游离悬浮液(free suspension)、图案化微孔和高通量96孔。
根据一些实施方案，提供了通过本文公开的方案获得的包含成熟肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的培养体节和培养组织。
在本申请的说明书和权利要求书中，词语“包括”和“具有”及其各种形式不限于可能与这些词语相关联地列出的成员。
本领域技术人员很容易理解本发明很适合进行目的并获得所提到的结果和优点，以及在其中固有的结果和优点。本文提供的实例代表优选的实施方案的，是示例性的，并且不旨在作为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：用于产生体节和肌源性祖细胞的方案
本文公开的3D分化模式形成了工业级扩大规模过程和适应其他可食用物种的基础。如本文公开的基于全悬浮、细胞簇的方案可以并入不限尺寸的生物反应器中。此外，该方案不含血清，并且不涉及遗传修饰，使得其适用于工业加工。
以下方案在几天内提供了肌源性祖细胞。该方案包括以下步骤：
步骤1-ESC聚集体形成：50-300个ESC的聚集体球体通过将ESC接种在N2B27或NDIFF培养基中获得(例如，在ULA u底板处；图1A)。培养基可以补充有胰岛素(例如10μl/ml)、运铁蛋白-硒(例如1％)和BMP4(例如10ng/ml)中的一种或更多种。20-300个ESC的聚集体球体还通过将ESC以10K-30K个细胞/ml的密度在补充有1％-5％ Knock-out血清替代物(KSR)、10-30μg/ml牛血清白蛋白(BSA)、5-15μg/ml低浓度的胰岛素和5-15ng/ml BMP4的N2B27培养基中培养来获得(图1B)。优选地，细胞应该保持悬浮，例如通过以100-300rpm的速度旋转板。
步骤2-胚层形成：该步骤在每个孔中形成多于一个聚集体之后约一天进行，或者在每个孔中产生直径在50-200μm之间的多个漂浮的细胞聚集体球体之后进行。在步骤2中，通过向培养基中添加Wnt激活剂Chir99021(1-5μM)或Rspo3(10-30ng/ml)或Wnt3a(50-300ng/ml)来激活Wnt途径持续约12至24小时。此后，去除包含Wnt激活剂的培养基，并且用不含Wnt激活剂的新鲜培养基替代。
Wnt激活剂的添加推动分化朝向中胚层谱系，并因此在该步骤结束时在聚集体中可观察到中胚层细胞(通过Brachyury-GFP标记；例如图1B-细箭头)和内胚层细胞(用Sox17RFP标记；图1B，宽箭头标记)，如图1A和图1B中示出的。注意到，在步骤2和胚层形成结束时获得的聚集体的形态通常是卵样形态，如在图1B中可以观察到的。
步骤3A-轴旁中胚层(PSM，也称为前体节中胚层)形成：在最初中胚层细胞(Brachyury阳性细胞)出现之后1-2天内可观察到PSM细胞，并且可以使用标志物Mesogenin1(Msgn1)进行鉴定(图2A-图2E和图4A-图4C)。如图2A中显示的，细胞最初在聚集体中随机分散(图2A，左图，第4天)，并且逐渐集中在聚集体的一个位置上。
在第一PSM细胞出现之后一至两天，聚集体的形态从圆形、圆形球体变为卵形，与轴旁中胚层的成熟并行(例如图2A的中图，图2C和图2F)。PSM细胞在该阶段迁移并且聚集在聚集体内的一个(或几个)极(也称为‘PSM极化’)中(例如图2A和图2D，明亮区域)。
在聚集体形态从圆形球体变为卵样形态后，添加低百分比的细胞外基质(ECM)，诸如5％-10％的Matrigel，或以下ECM组分之一(纤连蛋白、胶原和/或层黏连蛋白)。任选地，可以在中胚层细胞发生之后12-24小时向培养基中添加以下中的一种或更多种：
(a)Nodal抑制剂(例如5-15μM SB-431542)。
(b)高浓度的Wnt激活剂(例如Chir99201或Rspo3)，通常分别在3μM至9μM和20ng/ml-60ng/ml的范围内。
(c)BMP抑制剂(例如LDN193189或Noggin)。
步骤3B-PSM成熟和Pax3阳性的前前体节细胞中胚层(aPSM)细胞的形成，与前述(步骤3A)PSM极化并行发生。aPSM细胞产生于聚集体内PSM区域(domain)的前极处(例如图3A和图3B)。这些细胞能够产生体节，并且稍后产生肌源性祖细胞。
步骤4-体节形成和轴延长：在形成的轴旁中胚层聚集体完全延长并且包含体节样结构(分别在图5A-图5B和图5D中被编号和指出)之后约1天或2天，从培养基中去除ECM(或ECM组分)。注意到，ECM去除是任选的。还注意到，从圆形球体(例如，图1A)，到卵形形状(例如，图2C)到图5A-图5D中示出的延长形状的形态变化指示本文公开的方案类似于胚胎发育。
步骤5-肌源性祖细胞形成：在体节样结构形成之后约1-2天，向培养基中添加低浓度的以下生长因子(GF)中的一种或更多种：10ng/ml HGF、2ng/ml IGF、20ng/ml FGF2。任选地，GF被单独添加或与BMP抑制剂、Wnt激活剂和ECM中的一种或更多种组合添加，如先前步骤提到的。
在该步骤结束时，在添加GF之后约1-2天，在成熟体节中可观察到肌源性祖细胞，诸如成肌细胞、肌细胞等(图6A-图6D)。
在整个方案中，培养基每隔一天更新一次。
实施例2：轴旁中胚层分化的阶段特异性标志物的空间表达
将体外模式的分子和细胞特性与胚胎进行比较。这种比较是至关重要的，因为邻近的细胞层为肌肉组织的形成提供了必要的信号传导和机械支持。
为此，对轴旁中胚层分化(Brachyury/T、Msgn1、Pax3、Mesp2、Meox1)、体节(Uncx、Tbx18)、肌肉祖细胞(Pax7)、肌细胞(MyoG)和成熟肌细胞(快速(fast)MHC)的阶段特异性标志物的空间表达进行了表征。这是使用现有的活细胞系荧光标志物诸如Brachyury、Msgn1、Pax3、Pax7、MyoG或用标志物特异性抗体进行免疫染色来完成的。
还使用荧光原位杂交(FISH)来获得针对每个阶段预先选择的一组扩展基因在不同阶段的空间mRNA表达图。该方法对于不存在有效抗体的基因是必要的。这在抗体可用性特别有限的非模式生物体诸如牛或鸡中变得至关重要。
虽然已经参考具体实施方案公开了本发明，但是明显的是，本领域技术人员可以设计本发明的其他实施方案和变化，而不偏离本发明的真正精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方案和等同变化。
除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。如发生冲突，则以专利说明书(包括定义)为准。除非上下文另外明确指出，否则如本文所使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”意指“至少一个”或“一个或更多个”。

Claims (23)

1.一种用于产生体节的方法，所述方法包括：
(a)将胚胎干细胞悬浮在培养基中以获得球形聚集体；
(b)向所述培养基中添加至少一种Wnt激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)去除所述Wnt激活剂；
(d)观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；以及
(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、Knock-out血清替代物、运铁蛋白-硒和BMP4中的一种或更多种。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述Wnt激活剂选自由以下组成的组：Chir99021、Wnt3a和Rspo3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述向培养基中添加至少一种Wnt激活剂在获得所述球形聚集体之后12至36小时内进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述去除所述Wnt激活剂在8至36小时的范围内进行。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体出现后，向所述培养基中添加至少一种Nodal抑制剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分的量在1％至15％vol/vol的范围内。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括在步骤(d)中添加选自由以下组成的组的至少一种化合物：Wnt激活剂和BMP抑制剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括在所述获得多于一个体节后去除细胞外基质或其组分。
10.一种用于产生肌源性祖细胞的方法，所述方法包括：
(a)将胚胎干细胞在培养基中繁殖以获得球形聚集体；
(b)向所述培养基中添加至少一种Wnt激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)去除所述Wnt激活剂；
(d)观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；
(e)将步骤(d)的聚集体孵育10至48小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体；以及
(f)向步骤(e)中的培养基中添加低于30ng/ml浓度的一种或更多种生长因子，从而产生肌源性祖细胞。
11.根据权利要求所述10的方法，其中所述一种或更多种生长因子包括HGF、IGF和FGF2。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中步骤(a)在悬浮液中进行。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，还包括向步骤(d)的培养基中添加选自以下的化合物中的至少一种：BMP抑制剂和Wnt激活剂。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，还包括在步骤(d)之前去除所述细胞外基质或其组分。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其中每种生长因子的浓度在1ng/ml至25ng/ml的范围内。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或更多种生长因子是IGF，并且IGF的浓度在1ng/ml至5ng/ml的范围内。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述肌源性祖细胞包括成肌细胞和肌细胞。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的方法，还包括向步骤(a)的培养基中添加胰岛素、Knock-out血清替代物、运铁蛋白-硒和BMP4中的一种或更多种。
19.根据权利要求10-18中任一项所述的方法，其中所述Wnt激活剂选自：Chir99021、Rspo3和Wnt3a。
20.根据权利要求10-19中任一项所述的方法，其中所述向培养基中添加至少一种Wnt激活剂在获得所述球形聚集体之后12至36小时内进行。
21.根据权利要求10-20中任一项所述的方法，其中所述去除所述Wnt激活剂在8至36小时的范围内进行。
22.根据权利要求10-21中任一项所述的方法，还包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体出现后，向所述培养基中添加至少一种Nodal抑制剂。
23.根据权利要求10-22中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分的量在1％至15％vol/vol的范围内。
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