CN117054385A - 一种高通量蛋白荧光标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于蛋白质样品荧光标记分析领域，提供了一种高通量蛋白荧光标记方法，该方法利用荧光探针与蛋白分子的相互作用实现蛋白质的荧光标记，进一步用于生物样品分析，本发明在病理检测中利用近红外花菁荧光探针对蛋白的特异性标记能力，实现一种探针对多种肿瘤蛋白的标记，由于肿瘤细胞微环境上调的蛋白以及探针‑蛋白复合物所增强的荧光效果，实现肿瘤区域的突出图案化标记，从而达到快速识别肿瘤区域的目的，该方法检测过程简单，有效克服了单次检测目标单一和抗体成本高等问题。

Description

一种高通量蛋白荧光标记方法
技术领域
本发明涉及蛋白质样品荧光标记分析领域，具体是一种高通量蛋白荧光标记方法。
背景技术
复杂的信号转导是实现生物体多种功能的基站。随着翻译后修饰，蛋白质携带着多样化的生物信息来调控机体的生物过程。而基因突变导致的功能损伤也与蛋白质水平调节的失衡密切相关。对于异常基因转录所造成的疾病诊断是了解疾病发生发展的关键信息，通过检测蛋白质的表达种类和水平去分析疾病的调控动态有利于对疾病发展的控制。随着关键高通量技术的发展，蛋白质组学技术已经能够以深广的角度去探索基因组的转录和蛋白质表达情况。临床上也常用免疫组织化学染色法和Elisa试剂盒等检测方式分析病变组织的异常蛋白质表达情况。
基于抗原抗体的特异性标记是昂贵且耗时耗力的，并且在临床检测中高通量、多维度和快速的疾病诊断对于提高治疗效率是亟需解决的重要问题。为了进一步拓展生物样品分析的时效性，丰富检测样本种类和数量，需要在设备和方法上对原有检测手段进行大幅度原始创新。
由上可见，目前关于蛋白质检测的原理主要是基于抗体抗原的多重孵育和标记，检测过程繁琐、单次检测目标单一和抗体成本高等。因此，迫切需要提供一种高通量蛋白荧光标记方法，以克服当前实际应用中的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量蛋白荧光标记方法，旨在解决上述背景技术中的问题。
本发明是这样实现的，一种高通量蛋白荧光标记方法，包括：
利用近红外花菁荧光探针与蛋白分子的相互作用，实现蛋白质的荧光标记。
作为本发明进一步的方案：所述近红外花菁荧光探针具有式I所示的结构式：
其中，X-选自Cl-、Br-和I-中的一种，Y选自碳、氮、氧和硫中的一种；
杂环盐选自吲哚和苯并吲哚中的一种；
n和m为任一大于0的整数；
R1和R2各自独立选自磺酸、羧酸、磺酸盐、羧酸盐和烷基中的一种；
p＝0–6,R选自烷基链和卤素中的一种；
R3和R4选自胺基、羧基、磺酸基、氰基、硝基、烷基和卤素中的一种；
R5和R6各自独立选自C1–8的烷基链、烷基羧酸、烷基磺酸、烷基叠氮和烷基卤代烃中的一种。
作为本发明进一步的方案：所述近红外花菁荧光探针能够以共价键或者非共价键与蛋白质结合。
作为本发明进一步的方案：蛋白分子与探针分子结合后，蛋白分子空腔能够稳定近红外花菁荧光探针在溶液中状态，提高近红外花菁荧光探针的发光效率而点亮蛋白；
一种探针能够同时标记多种蛋白分子，且一种蛋白分子能够被多种探针标记。
作为本发明进一步的方案：用于高通量蛋白荧光标记的具体操作平台包括探针分子与蛋白溶液标记、探针分子与载玻片上组织切片标记、探针分子与凝胶电泳中蛋白标记、探针分子与细胞/组织直接标记以及探针分子与活体中特定蛋白标记。
作为本发明进一步的方案：该方法所使用的近红外花菁荧光探针溶液的浓度为1nM-100μM；荧光标记的操作温度为4℃-70℃；荧光标记操作所需要的时间不小于1min。
作为本发明进一步的方案：荧光标记的生物样本是组织块、组织切片、活检样本、血清、细胞、组织提取液、细胞提取液、蛋白混合溶液、纯化蛋白质以及用于活体注射。
作为本发明进一步的方案：该方法能够对肿瘤组织阳性边缘的快速识别，具体步骤如下：
S1：对组织切片上的蛋白进行荧光标记；
S2：组织切片扫描和组织形貌分析；
在步骤S1中，用于组织切片支撑的器件包括载玻片和凝胶电泳装置，组织切片上的蛋白进行荧光标记后对组织切片可以用水、磷酸盐缓冲液、含表面活性剂的磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜溶液进行洗涤，且洗涤时间不少于10s；
在步骤S2中，组织切片上的多种肿瘤相关蛋白被标记后可以实现集成式或者分离式肿瘤形貌分析。
作为本发明进一步的方案：该方法还用于多种癌症或疾病模型的蛋白差异化分析。
作为本发明进一步的方案：用于高通量生物样品分析的方法包括定量或定性分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明可以兼容多种形式的生物样本，如组织块、组织切片、活检样本、血清、细胞、组织提取液、细胞提取液、蛋白混合溶液、纯化蛋白质以及用于活体注射等；
在病理检测中利用近红外花菁荧光探针对蛋白的特异性标记能力，实现一种探针对多种肿瘤蛋白的标记，由于肿瘤细胞微环境上调的蛋白以及探针-蛋白复合物所增强的荧光效果，实现肿瘤区域的突出图案化标记，从而达到快速识别肿瘤区域的目的；
该方法检测过程简单，有效克服了单次检测目标单一和抗体成本高等问题。
附图说明
图1为近红外花菁荧光探针IR-6B3(IR-780)与人乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织裂解液中的蛋白复合后在二维凝胶电泳中的荧光条带示意图。
图2为近红外花菁荧光探针IR-6B3(IR-780)标记的人乳腺癌肿瘤组织和正常组织的组织切片荧光扫描图。
图3为本发明中部分近红外花菁荧光探针(IR-6N3、IR-6B3、IR-6B3C、IR-6B3S、IR-4B3、IR-3S3、IR-6B5、IR-3B1、IR-0N4S、IR-6B7、IR-6B9、IR-6B12、IR-6B16、IR-6B1、IR-6B3、IR-6B4S、IR-5B1、IR-5B4S、IR-6B5C、IR-6N4S、IR-3B4S和IR-3N4S)与肿瘤组织和癌旁组织裂解液中的蛋白复合后在二维凝胶电泳中的荧光条带示意图。
图4为三维凝胶电泳示意图(a)、所展示的不同凝胶层所分离的组织切片荧光扫描图(b)以及最终判定的肿瘤区域；包含对组织切片进行原位裂解和荧光标记；三维凝胶电泳装置用于对组织切片内蛋白质进行保持空间位置的分离；最后对凝胶介质进行处理和分析，证明近红外花菁荧光探针IR-6B3(IR-780)与肿瘤相关蛋白的荧光标记作用可以用于不同分子量蛋白质的快速可视化分析，进而给出阳性肿瘤轮廓。
图5为乳腺癌肿瘤组织、癌旁组织和正常组织中不同的肿瘤相关蛋白标志物表达差异对比示意图。
图6为人乳腺癌中肿瘤组织和癌旁组织差异化表达的蛋白标志物与近红外花菁荧光探针的结合能力以及对近红外花菁荧光探针的荧光增强效果示意图。
图7为探针IR-6B3(IR-780)与不同分子量人重组蛋白(EGFR,HSA,AKT,VEGF,TGF-β,IL-8)的荧光标记二维凝胶电泳条带(a)，以及对BSA(c)和AKT(d)重组蛋白标记后的质谱。
图8为探针IR-6B3(IR-780)标记的人炎症组织切片荧光扫描图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明实施例提供的一种高通量蛋白荧光标记方法，所述高通量蛋白荧光标记方法包括：
利用近红外花菁荧光探针与蛋白分子的相互作用，实现蛋白质的荧光标记，进一步用于生物样品分析。
所述近红外花菁荧光探针具有式I所示的结构式：
其中，X-选自Cl-、Br-或I-等；Y选自碳、氮、氧或硫等；
杂环盐选自吲哚或苯并吲哚等；
n和m为任意大于0的整数；
R1和R2各自独立选自磺酸、羧酸、磺酸盐、羧酸盐或烷基等；
p＝0–6，R选自烷基链或卤素等；
R3和R4选自胺基、羧基、磺酸基、氰基、硝基、烷基或卤素等；
R5和R6各自独立选自C1–8的烷基链、烷基羧酸、烷基磺酸、烷基叠氮或烷基卤代烃等；且以上结构可以任意组合；
由于近红外花菁荧光探针其独特的功能基团，这类探针能够与多种病灶(如肿瘤)相关蛋白进行特异性结合。
所述近红外花菁荧光探针能够以共价键或者非共价键与蛋白质(如肿瘤泛蛋白标志物)结合。
蛋白分子与探针分子结合后，蛋白分子空腔能够稳定近红外花菁荧光探针在溶液中状态，提高近红外花菁荧光探针的发光效率而点亮蛋白；一种探针可以同时标记多种蛋白分子；且一种蛋白分子可以被多种探针标记。
用于高通量蛋白荧光标记的具体操作平台包括探针分子与蛋白溶液标记、探针分子与载玻片上组织切片标记、探针分子与凝胶电泳中蛋白标记、探针分子与细胞/组织直接标记以及探针分子与活体中特定蛋白标记等；其中用于装载生物样本的器件可以是载玻片、凝胶电泳装置、芯片或者其他可以进行支撑的器件等；近红外花菁荧光探针溶液的浓度为1nM-100μM；荧光标记的操作温度可以为4℃-70℃；荧光标记操作所需要的时间为不小于1min；荧光标记的生物样本可以是组织块、组织切片、活检样本、血清、细胞、组织提取液、细胞提取液、蛋白混合溶液、纯化蛋白质以及用于活体注射等。
该方法可实现高通量肿瘤蛋白荧光标记用于肿瘤组织阳性边缘的快速识别，具体步骤如下：
S1：对组织切片上的蛋白进行荧光标记；
S2：组织切片扫描和组织形貌分析；
在步骤S1中，用于组织切片支撑的器件包括载玻片和凝胶电泳装置，以及其他可以进行支撑的器件,所涉及的探针和支撑器件可以进行任意组合。组织切片上的蛋白进行荧光标记后对组织切片可以用水、磷酸盐缓冲液、含表面活性剂的磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜等溶液进行洗涤，其中，洗涤时间不少于10s；
在步骤S2中，组织切片上的多种肿瘤相关蛋白被标记后可以实现集成式或者分离式肿瘤形貌分析；
该方法还用于多种癌症或疾病模型的蛋白差异化分析；
用于高通量生物样品分析的方法包括定量或定性分析，可根据样品实际需求选择合适的探针和分析方法。如可集成三维组织凝胶电泳原位裂解平台，包含对组织切片进行原位裂解和荧光标记；三维凝胶电泳装置用于对组织切片内蛋白质进行原位分离；最后对三维凝胶不同层的标记蛋白进行处理和分析；
荧光标记的组织样本在荧光扫描仪上进行扫描，从而得到荧光标记的蛋白所描绘的组织区域或者不同分子量/种类蛋白质的表达情况。如果是凝胶电泳分离的组织蛋白，将含有组织蛋白的凝胶(二维凝胶)或者凝胶切片(三维凝胶)在荧光扫描仪上进行扫描，从而得到荧光标记的肿瘤蛋白描绘的肿瘤区域；所得到荧光扫描图片可以进行进一步的定量分析不同区域或不同分子量的蛋白质的表达水平，从而深入分析疾病的发展状态，进行病人预后分析和治疗决策。
具体实施例如下：
实施例1：研究近红外花菁荧光探针与蛋白的特异性识别能力。本实施例中，预先将人乳腺癌组织和癌旁组织进行裂解，离心取上清并对总蛋白进行定量。进一步地，将蛋白提取液与探针溶液进行等摩尔量混合，37℃反应2h，得到探针标记的蛋白混合液。通过二维SDS-PAGE凝胶电泳比较探针对肿瘤和癌旁组织中蛋白质的特异性标记能力。
如图1所示，从电泳结果可以看出，不同的探针对不同蛋白质的标记具有选择差异性，可以用于区分肿瘤组织和癌旁组织，肿瘤组织中被标记的蛋白条带明显多于癌旁组织和正常组织(图1a)，且荧光信号明显最高(图1b)，可以用于进一步的肿瘤组织区分和肿瘤相关蛋白荧光标记分析。
实施例2：利用近红外花菁荧光探针对肿瘤相关蛋白的特异性标记能力区分肿瘤组织形貌和组织阳性边缘。所使用的组织切片支撑器件是载玻片。
具体步骤包括：S1：将探针溶液与组织切片进行孵育，达到对组织切片上的蛋白进行荧光标记(可优化信号对比度的步骤包含：多聚甲醛固定，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗脱，Triton X-100破膜处理，过氧化氢溶液处理等)；
S2：组织切片扫描和组织形貌分析。
本实施例中，所使用的近红外花菁荧光探针溶液浓度为1nM-100μM。对组织切片进行孵育的温度为4℃-70℃。对组织切片进行孵育的时间为1-60min。组织切片进行孵育后可以用水、磷酸盐缓冲液、含表面活性剂的磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜等溶液进行洗涤，其中，洗涤时间不少于10s。
本实施例中，荧光标记后的组织切片置于荧光扫描仪上进行快速扫描，得到由探针标记的肿瘤荧光区域。由于肿瘤组织较高的蛋白质表达水平以及蛋白质对近红外花菁荧光探针的荧光增强效果，使近红外花菁荧光探针标记后的肿瘤区域显示出荧明显高于正常组织的荧光效果，实验结果可以看出，近红外花菁荧光探针对肿瘤组织富含的蛋白质具有显著的标记效果，能够明显区分于癌旁组织和正常组织(如图2所示)，证明了近红外花菁荧光探针对肿瘤相关蛋白的特异性识别能力。
实施例3：进一步利用多种染料分子，包括IR-6N3、IR-6B3、IR-6B3C、IR-6B3S、IR-4B3、IR-3S3、IR-6B5、IR-3B1、IR-0N4S、IR-6B7、IR-6B9、IR-6B12、IR-6B16、IR-6B1、IR-6B3、IR-6B4S、IR-5B1、IR-5B4S、IR-6B5C、IR-6N4S、IR-3B4S、IR-3N4S采用实施例2的方案验证与肿瘤组织和癌旁组织裂解液中的蛋白结合能力。从图3中的a图可以看出近红外花菁荧光探针对肿瘤组织和癌旁组织具有不同分子量的标记特点，并且通过图3中的b图定量得到这些近红外花菁荧光探针在肿瘤组织中比癌旁组织中较高的荧光强度，说明这系列近红外花菁荧光探针能够对蛋白质进行特异性标记，并且在肿瘤组织和癌旁组织中有不同的蛋白质选择性。由于肿瘤组织较高的蛋白质表达水平以及蛋白质对近红外花菁荧光探针的荧光增强效果，使这些探针标记后的肿瘤区域显示出荧光明显高于正常组织的荧光效果。由于结合能力的不同，不同探针的标记效率有高低。
实施例4：利用近红外花菁荧光探针对肿瘤相关蛋白的特异性标记能力区分肿瘤组织形貌和组织阳性边缘。所使用的组织切片支撑器件是三维凝胶电泳装置。利用三维凝胶电泳对组织切片进行蛋白质分离，进一步分析不同分子量肿瘤相关蛋白在组织各个区域的表达水平。三维凝胶电泳平台包括：组织切片制备，用于对手术切除组织进行快速冰冻包埋、冷冻切片、黏附于加样板表面；原位裂解与标记平台，用于对组织切片进行原位裂解和蛋白标记；三维凝胶电泳装置，用于对组织切片内蛋白质进行原位分离；处理平台，用于对凝胶介质进行处理和分析；肿瘤发现器，用于自动预测肿瘤轮廓。
本实施例中，通过预先将近红外花菁荧光探针溶液和裂解液的混合液与组织切片进行孵育对组织中蛋白进行标记，进一步的通过三维凝胶电泳对组织中的蛋白进行原位纵向电泳分离，从而可以实现组织中原位蛋白质在z轴纵向的分离，可以利用某一层特定分子量的标记蛋白质进行肿瘤形貌分析(如图4所示)。荧光标记、冰冻切割后的凝胶层(含某一范围分子量的蛋白质)置于荧光扫描仪上进行快速扫描，得到由探针标记的肿瘤荧光区域。
实施例5：为了分析近红外花菁荧光探针与蛋白的相互作用，分析了乳腺癌中不同分子量的蛋白标志物与近红外花菁荧光探针的结合能力(如图5所示)。在乳腺癌发展过程中，不同发展阶段蛋白质上调或者下调水平一直存在波动，通过近红外花菁荧光探针对蛋白的荧光标记作用以及荧光定量分析可以辅助判断蛋白表达水平差异化分析。同时，由于近红外花菁荧光探针的广谱标记能力，可同时标记多种肿瘤相关蛋白，减少单一蛋白检测带来的误诊/漏诊。通过与不同分子量的乳腺癌相关蛋白进行相互作用，近红外花菁荧光探针与重组蛋白在37℃或60℃孵育2h后，近红外花菁荧光探针对不同蛋白质的标记能力是不一样的(如图6和图7中的a图所示)。同时不同系列的近红外花菁荧光探针对同一蛋白质也具有标记的选择差异性和结合强弱差异。这不仅可以实现多种探针选择性，还可以实现泛肿瘤标志物的检测。进一步的质谱分析证明了IR-6B3(IR-780)探针与BSA(图7c)和AKT(图7d)重组蛋白的共价结合能力。
在附图6中，通过不同分子量的肿瘤相关调节蛋白与近红外花菁荧光探针的结合比较可以看出，高温或者低温对近红外花菁荧光探针的标记作用影响几乎不影响，证明了该系列近红外花菁荧光探针可以实现较大温度变动下的肿瘤标记。并且该系列近红外花菁荧光探针可以与泛肿瘤标志物进行较好的结合，可以实现多种癌症的检测。
在附图7中，证明了泛蛋白与近红外花菁荧光探针的具有较好的结合能力，以及近红外花菁荧光探针与蛋白质的有效共价结合。
实施例6：通过实施例2或4的方法对炎症组织切片进行标记。所使用的组织切片支撑器件是载玻片或三维凝胶电泳；
具体步骤包括：
S1：将探针溶液与组织切片进行孵育，达到对组织切片上的蛋白进行荧光标记；
S2：组织切片或凝胶电泳切片扫描和组织形貌分析。
本实施例中，所使用的近红外花菁荧光探针溶液浓度为1nM-100μM。对组织切片进行孵育或者电泳的温度为4℃-70℃。对组织切片进行孵育或者电泳的时间为1-60min。组织切片进行孵育后可以用水、磷酸盐缓冲液、含表面活性剂的磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜等溶液进行洗涤，其中，洗涤时间不少于10s。
结果显示，近红外花菁荧光探针可以实现优异的炎症区域的标记能力(如图8所示)，在附图8中，由于炎症组织较高的蛋白质表达水平以及蛋白质对探针的荧光增强效果，使探针标记后的炎症区域显示出荧明显高于正常组织的荧光效果。
通过以上实施例的优化分析，我们验证了该系列近红外花菁荧光探针能够对肿瘤组织进行特异性识别的蛋白标记能力，该结果体现了我们开发的这系列花菁荧光探针能够对肿瘤组织中的泛肿瘤通路蛋白的广谱标记能力，能够通过肿瘤组织和癌旁组织的蛋白水平差异化表达以及蛋白质与近红外花菁荧光探针结合后对近红外花菁荧光探针的荧光增强能力实现肿瘤区域的准确判定，证明了该方法在临床快速肿瘤诊断和病理分析中的应用潜力。需要注意的是，上述实施例主要对肿瘤、炎症相关受体蛋白的标记能力进行了详细验证。近红外花菁荧光探针可以拓展对多种疾病的相关受体蛋白进行标记，实现快速检测的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，利用近红外花菁荧光探针与蛋白分子的相互作用，实现蛋白质的荧光标记。
2.根据权利要求1所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，所述近红外花菁荧光探针具有式I所示的结构式：
其中，X-选自Cl-、Br-和I-中的一种，Y选自碳、氮、氧和硫中的一种；
杂环盐选自吲哚和苯并吲哚中的一种；
n和m为任一大于0的整数；
R1和R2各自独立选自磺酸、羧酸、磺酸盐、羧酸盐和烷基中的一种；
p＝0–6,R选自烷基链和卤素中的一种；
R3和R4选自胺基、羧基、磺酸基、氰基、硝基、烷基和卤素中的一种；
R5和R6各自独立选自C1–8的烷基链、烷基羧酸、烷基磺酸、烷基叠氮和烷基卤代烃中的一种。
3.根据权利要求1所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，所述近红外花菁荧光探针能够以共价键或者非共价键与蛋白质结合。
4.根据权利要求3所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，蛋白分子与探针分子结合后，蛋白分子空腔能够稳定近红外花菁荧光探针在溶液中状态，提高近红外花菁荧光探针的发光效率而点亮蛋白；
一种探针能够同时标记多种蛋白分子，且一种蛋白分子能够被多种探针标记。
5.根据权利要求1所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，用于高通量蛋白荧光标记的具体操作平台包括探针分子与蛋白溶液标记、探针分子与载玻片上组织切片标记、探针分子与凝胶电泳中蛋白标记、探针分子与细胞/组织直接标记以及探针分子与活体中特定蛋白标记。
6.根据权利要求1所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，该方法所使用的近红外花菁荧光探针溶液的浓度为1nM-100μM；荧光标记的操作温度为4℃-70℃；荧光标记操作所需要的时间不小于1min。
7.根据权利要求1所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，荧光标记的生物样本是组织块、组织切片、活检样本、血清、细胞、组织提取液、细胞提取液、蛋白混合溶液、纯化蛋白质以及用于活体注射。
8.根据权利要求1-7任一项所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，该方法能够对肿瘤组织阳性边缘的快速识别，具体步骤如下：
S1：对组织切片上的蛋白进行荧光标记；
S2：组织切片扫描和组织形貌分析；
在步骤S1中，用于组织切片支撑的器件包括载玻片和凝胶电泳装置，组织切片上的蛋白进行荧光标记后对组织切片可以用水、磷酸盐缓冲液、含表面活性剂的磷酸盐缓冲液或者二甲基亚砜溶液进行洗涤，且洗涤时间不少于10s；
在步骤S2中，组织切片上的多种肿瘤相关蛋白被标记后可以实现集成式或者分离式肿瘤形貌分析。
9.根据权利要求8所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，该方法还用于多种癌症或疾病模型的蛋白差异化分析。
10.根据权利要求8所述的高通量蛋白荧光标记方法，其特征在于，用于高通量生物样品分析的方法包括定量或定性分析。
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