CN117045788A - Pes1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用 - Google Patents

Pes1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了PES1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用。具体地，本发明提供了PES1靶向抑制剂在预防和/或治疗PES1高表达的食管癌中的应用。PES1靶向抑制剂能有效提高CD8+T细胞在高表达PES1的ESCC肿瘤中的浸润。本发明的PES1靶向抑制剂可与免疫检查点抑制剂等药物联用，从而协同性地治疗肿瘤，为免疫检查点阻断疗法耐药或无效的患者提供了新的治疗手段。

Description

PES1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及PES1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用。
背景技术
食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌或ESCC)是最常见的恶性肿瘤之一，我国食管鳞癌新发和死亡病例占全球一半以上。食管鳞癌预后较差，总体5年生存率不到40％。食管鳞癌的治疗以多学科综合治疗模式为主，包括手术和放疗化疗，尽管能够带来生存获益，但治疗效果仍不尽人意。
近些年来，肿瘤免疫治疗兴起与发展，它利用患者自身的免疫系统，通过抑制免疫检查点通路来对抗癌细胞。其中，抑制程序性死亡1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)的单克隆抗体在包括食管癌在内的多种肿瘤中为患者带来了生存获益，改变了癌症患者的治疗格局。
尽管如此，在食管癌的临床治疗中发现：对于二线治疗，免疫治疗仅能达到20％的客观有效缓解率；而对于一线治疗，有效缓解时间也仅有7个月；而这与肿瘤微环境的高度异质性密切相关。因此，深入解析肿瘤微环境的调控关键分子和信号通路，有望为提高食管鳞癌的免疫治疗响应率、靶向肿瘤微环境的治疗等提供新的标志物，给患者带来更好的治疗策略。
为了有效提高食管癌的免疫治疗效果，本领域迫切需要开发一种适用范围更广泛的、生存获益更高的新型治疗手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PES1靶向抑制剂及其在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种PES1靶向抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述的组合物或制剂用于：(a)预防和/或治疗食管癌，所述的食管癌是PES1高表达的食管癌；和/或(b)抑制食管癌细胞，所述的食管癌细胞是PES1高表达的食管癌细胞。
在另一优选例中，(a)中所述预防和/或治疗包括抑制食管癌的生长和/或转移。
在另一优选例中，(b)中所述抑制包括对食管癌细胞生长和/或转移的抑制。
在另一优选例中，所述的食管癌为哺乳动物(包括人和非人哺乳动物)的食管癌。
在另一优选例中，所述的PES1高表达是指与正常对照细胞相比，PES1的表达和/或活性显著上调。
在另一优选例中，所述的显著上调指，在食管癌细胞或组织中PES1表达量E1与正常细胞或组织中的PES1表达量E0之比(即E1/E0)＞1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0；和/或食管癌细胞或组织中PES1的活性A1与正常细胞或组织中的PES1活性A0之比(即A1/A0)＞1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。
在另一优选例中，所述的食管癌或食管癌细胞中，IL15的表达是下调的，或其活性显著降低。
在另一优选例中，所述的食管癌或食管癌细胞中，IL15 mRNA的稳定性下降。
在另一优选例中，所述的食管癌选自下组：腺癌、鳞状细胞癌、小细胞未分化癌、癌肉瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂选自下组：小分子化合物、抗体、反义核酸、基因编辑药物，或其组合。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂为核酸分子。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂为shRNA。
在另一优选例中，所述的基因编辑药物用于抑制或消除PES1基因的表达。
在另一优选例中，所述的治疗包括：抑制食管癌细胞的增殖速率、改变食管癌细胞周期分布、促进食管癌细胞凋亡，抑制食管癌组织生长，或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种PES1基因、mRNA、cDNA、蛋白，或其检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于选自下组一种或多种用途：
(i)用于评估食管癌患者是否适合用PES1靶向抑制剂进行治疗；和/或
(ii)用于评估食管癌患者用PES1靶向抑制剂进行治疗的预后。
在另一优选例中，所述的试剂盒还用于
(iii)检测患食管癌或患食管癌风险；
(iv)对食管癌患者的预后评估。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于对食管癌患者基于PES1表达和/或活性进行分型。
在另一优选例中，所述检测试剂包括：
(a)PES1的特异性抗体、PES1的特异性结合分子；和/或
(b)特异性扩增PES1 mRNA或PES1 cDNA的引物或引物对、探针或芯片。
在本发明的第三方面，提供了一种产品组合，所述产品包括：
(a)检测试剂或含所述检测试剂的试剂盒，所述检测试剂为检测PES1基因、mRNA、cDNA、蛋白，或其组合的检测试剂；和
(b)药物组合物，所述的药组合物含有PES1靶向抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测PES1基因、mRNA、cDNA、蛋白，或其组合的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于评估食管癌患者是否适合用PES1靶向抑制剂进行治疗。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有PES1基因、mRNA、cDNA、和/或蛋白作为对照品或质控品。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第三方面所述的产品组合的用途，用于制备治疗PES1高表达的食管癌的医疗产品。
在本发明的第五方面，提供了一种活性成分组合的用途，所述活性成分组合包括第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物或药盒，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫检查点抑制剂为免疫检查点抗体。
在另一优选例中，所述的肿瘤是免疫检查点抑制剂治疗耐药或无效的肿瘤，或不适合用免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤是PD-1抗体或PD-1抑制剂治疗耐药或无效的肿瘤，或不适合用PD-1抗体或PD-1抑制剂治疗的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：食管癌、肝癌、胰腺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂选自下组：小分子化合物、抗体、反义核酸、基因编辑药物，或其组合。
在另一优选例中，所述的第二活性成分选自下组：IL15、ILF3、免疫检查点抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫检查点抗体为PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂和免疫检查点抗体之重量比为1：10000至10000：1，较佳地1：1000至1000：1。
在另一优选例中，所述的药物组合物或药盒用于治疗哺乳动物或施用于哺乳动物，更佳地所述哺乳动物为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。
在另一优选例中，所述活性成分组合包括第三活性成分，所述第三活性成分为第二活性成分的促进剂。
在另一优选例中，所述第三活性成分包括其他肿瘤药物(如化疗剂)。
在另一优选例中，所述的其他肿瘤药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(Auristatins)、喜树碱(Camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(Duocarmycins)、依托泊甙(Etoposides)、美登木素(Maytansines)和美登素类化合物(Maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(Taxanes)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(Benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(Indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(Oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(Vinca alkaloids)，或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(Tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(Mitogellin)、局限曲菌素(Retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(Curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
在本发明的第六方面，提供了一种活性成分组合，所述组合由第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分构成，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分为PES1靶向抑制剂；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合；和
(iii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的所述免疫偶联物、所述活性成分组合，或其组合和0.01～99.99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括额外的治疗药物(如抗肿瘤剂)。
在本发明的第八方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有第一活性成分PES1靶向抑制剂以及药学上可接受的载体；
(b)第二制剂，所述第二制剂含有第二活性成分以及药学上可接受的载体，其中，所述第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合；
(c)说明书，所述说明书描述了将PES1靶向抑制剂和第二活性成分联用以治疗肿瘤的方法。
在另一优选例中，所述的肿瘤是PES1高表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括ESCC。
在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂是各自独立的。
在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂为冻干制剂或液态制剂。
在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂是注射剂。
在另一优选例中，所述的第一制剂在施用第二制剂之前、之中或之后被施用。
在本发明的第九方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：在第一活性成分PES1靶向抑制剂和任选的第二活性成分存在下，培养肿瘤细胞，从而协同抑制所述肿瘤细胞的生长，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括处于对数生长期的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为ESCC肿瘤细胞。
在本发明的第十方面，提供了一种活性成分组合的用途，其特征在于，所述活性成分组合由第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分免疫检查点抑制剂构成，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物或药盒。
在另一优选例中，所述的免疫检查点抑制剂包括免疫检查点抗体。
在另一优选例中，所述的免疫检查点抗体选自下组：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体，或其组合。
在本发明的第十一方面，提供了一种治疗食管癌的方法，包括步骤：
(a)对食管癌患者基于PES1表达和/或活性进行分型，从而将所述患者划分为PES1阳性的食管癌患者和PES1阴性的食管癌患者；和
(b)对所述的PES1阳性的食管癌患者施用PES1靶向抑制剂。
在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括：在治疗过程中，检测PES1的表达和/或活性。
在另一优选例中，所述的PES1靶向抑制剂被施用于人。
在本发明的第十二方面，提供了一种协同治疗肿瘤的方法，包括步骤：向需要的对象(如人)施用如本发明第六方面所述的活性成分组合，从而协同治疗肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了PES1在ESCC中的表达增加。(A)研究中使用的数据来源和基因筛选过程；(B-C)PES1的表达与CD8A或CD8B的表达之间的相关性。使用TCGA_ESCC数据估计相关性；(D)用t检验分析16个ESCC组织和16个相邻组织中PES1的mRNA水平。**p<0.01；(E)进行蛋白质印迹以检测PES1在12个ESCC组织(T)和匹配的相邻组织(N)中的表达。GAPDH用作内部控制；(F)ESCC肿瘤和配对非肿瘤组织中PES1的免疫组织化学染色；(G)60对ESCC样本组织中PES1染色评分的散点图。***p<0.001；(H)对包含230名患者的组织微阵列(TMA)数据的总体存活率进行Kalpan-Meier分析；(I)PES1表达对ESCC队列总生存期的多变量生存分析。多变量Cox比例风险模型针对年龄、分化、TNM分期和PES-1表达进行了调整。
图2显示了PES1抑制ESCC中的CD8+T细胞浸润。(A-C)对C57BL/6J小鼠进行皮下肿瘤形成试验，以评估PES1敲低对AKR细胞的影响。显示了异种移植物的代表性图像(A)，肿瘤生长曲线显示(B)和肿瘤重量(C)(每组n＝6只小鼠)；(D)蛋白质印迹分析PES1在肿瘤异种移植物中的表达；(E-G)AKR肿瘤中PES1敲低对T细胞功能的影响。指定组的CD45+ CD3+ T细胞(E)、CD3+ CD8+ T细胞(F)和CD8+ GZMB+ T细胞(G)的代表性定量(每组n＝4只小鼠)；(H)进行HE和IHC检查肿瘤区域并检测Ki67、CD3、CD4、CD8和GZMB的表达。显示了比例尺。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图3显示了敲低PES1抑制IL15的表达。(A)火山图显示PES1敲低或控制KYSE150细胞中的上下基因；(B)筛选免疫相关基因的过程。免疫相关基因来自TIMER2.0数据库；(C-D)PES1敲低对KYSE150(C)和AKR(D)细胞中IL15转录的影响(n＝3个独立实验)；(E)TCGA_ESCC数据库中PES1表达与IL15表达之间的相关性；(F-G)PES1敲低ESCC细胞的KYSE150(左)、AKR(右)中IL15的蛋白质印迹分析；(H)肿瘤异种移植物中IL15的蛋白质印迹分析；(I-J)60对ESCC样本中PES1表达和IL15表达之间的相关性。线性回归分析显示PES1和IL15(I)之间的负相关。显示了具有代表性的IHC图像(J)。显示了比例尺。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图4显示了PES1通过减弱IL15的表达来抑制T细胞浸润。(A)指定组中异种移植物的代表性图像；(B-C)所示组的肿瘤生长曲线(B)和肿瘤重量(C)(每组n＝6只小鼠)；(D)IL15中和作用的Western Blot分析；(E)进行HE和IHC检查肿瘤区域并检测Ki67、CD3、CD4、CD8和GZMB的表达。显示了比例尺。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图5显示了PES1与ILF3相互作用。(A)在EC9706细胞中用抗标记M2珠进行免疫沉淀，然后进行考马斯亮蓝染色试验，箭头指示PES1和ILF3；(B-C)在EC9706细胞(B)和293T细胞(C)中使用Flag抗体进行免疫沉淀，证明了外源性PES1和内源性ILF3之间的相互作用；(D-E)在EC9706(D)和293T(E)细胞中使用PES1抗体进行免疫沉淀显示PES1和ILF3之间的内源性相互作用；(F-G)ILF3在PES1敲低KYSE150细胞和对照细胞中均被稳定敲低，通过qRT-PCR(F)和蛋白质印迹(G)检查IL15水平。
图6显示了PES1破坏了ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用。(A-C)在PES1敲低KYSE150细胞(A)和AKR细胞(B)和PES1过表达EC9706细胞(C)中测定IL15 mRNA稳定性，用转录抑制剂放线菌素D处理指定时间(n＝3个独立实验)；(D-E)KYSE150(D)和EC9706(E)细胞中ILF3与内源性ILF3和IL15 mRNA结合的RNA免疫沉淀分析(n＝3独立实验)；(F-G)PES1通过与ILF3抗体的RNA免疫沉淀抑制KYSE150(F)和EC9706(G)细胞中的ILF3-IL15 mRNA相互作用(n＝3个独立实验)；(H)工作模型显示PES1干扰ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用。显示了比例尺。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图7显示了敲低PES1使癌细胞对抗PD1治疗敏感。(A)指定治疗中异种移植物的代表性图像；(B-C)AKR荷瘤小鼠(每组n＝4只小鼠)的肿瘤体积随时间(B)和肿瘤重量(C)；(D)进行HE和IHC检查肿瘤区域并检测Ki67、CD3、CD4、CD8和GZMB的表达；(E-F)免疫印迹法(E)和IHC(F)显示PES1在免疫治疗的ESCC肿瘤中的表达。显示了比例尺。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图8显示了PES1调节CD8+T细胞浸润示意图。PES1通过破坏ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用来抑制CD8+ T细胞浸润，进而导致肿瘤进展并抑制抗肿瘤免疫反应。
图9显示了在线数据库中PES1上调。(A-C)在TCGA_ESCC(A)、GSE23400(B)和GSE161533(C)公布的数据集中，比较正常组织和ESCC组织中PES1的mRNA水平。
图10显示了其他免疫细胞的渗透分析。(A-C)AKR肿瘤中PES1基因敲除对其他细胞浸润的影响。显示了CD3+ CD4+ T细胞(A)、NK1.1细胞(B)和CD11B+ F4/80+细胞(C)指定组的代表性定量(每组4只小鼠)。(D)IHC检测CD4、NCR1和F4/80的表达。n.s：没有显著差异。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次报道了PES1靶点在ESCC进展中的作用和分子机制，并经过大量的筛选，首次开发了PES1靶向抑制剂对ESCC等癌症的应用。本发明的PES1靶向抑制剂能有效提高CD8+ T细胞在高表达PES1细胞和肿瘤中的浸润，从而有效抑制肿瘤细胞的生长，并提升ESCC患者的预后。同时，本发明的PES1靶向抑制剂可与IL15及其促进剂、ILF3及其促进剂联用，和/或与免疫检查点抑制剂(如免疫检查点抗体)联用，从而协同性地抑制多种肿瘤。PES1靶向抑制剂耐药性较低，适用范围更广，为免疫检查点阻断疗法失效或无效的患者提供了新的治疗手段。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
如本文所用，“本发明的PES1靶向抑制剂”、“PES1靶向抑制剂”、“PES1抑制剂”、“本发明的PES1抑制剂”、“本发明的抑制剂”均指特异性靶向降低PES1表达的抑制剂。
如本文所用，“本发明的活性成分组合”指如本发明第六方面中所述的，由本发明的PES1抑制剂(作为第一活性成分)和第二活性成分构成的组合。
CD8+ T细胞浸润
肿瘤免疫治疗通过重新激活人体的免疫系统来达到杀伤肿瘤细胞的目的，其中最重要的就是T淋巴细胞，尤其是CD8阳性的细胞毒性T细胞(CTL)。CD8+ T细胞可以杀死肿瘤细胞并分泌多种细胞因子，将CD8+ T细胞驱动到肿瘤是任何有效免疫治疗方法的必要先决条件。然而，在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞为了避免清除，已经发展出丰富的机制将T细胞排除在微环境之外，包括下调招募T细胞的趋化因子和细胞因子，减少T细胞阻滞和通过上皮细胞迁移所需要的整合素的激活，重塑基质成分形成物理屏障，以及阻碍T细胞迁移的异常血管结构。
食管癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与预后密切相关，浸润性T细胞多的患者比低浸润程度的患者总生存期显著更长。有效的治疗策略应该是将具有低免疫细胞浸润的“冷”肿瘤(非炎症)转化为具有高免疫细胞(包括T细胞)浸润的“热”肿瘤(炎症)，增加肿瘤内部浸润T细胞可以改善免疫微环境，促进免疫治疗。
PES1及其抑制剂
PES1(Pescadillo ribosomal biogenesis factor 1)是一种由588个氨基酸组成的核蛋白，在进化上是高度保守的，含有乳腺癌相关基因1(BRCA1)C端(BRCT)结构域，介导蛋白质转运过程，它在胚胎发育，核糖体合成，DNA复制和细胞周期进展中起着重要作用。
在本发明人研究发现，PES1的表达与CD8A/CD8B的表达表现出最强的负相关性，并进一步通过实验验证了食管鳞癌肿瘤细胞中高表达PES1抑制了CD8+ T细胞的浸润，从而影响免疫微环境和免疫治疗疗效。
具体地，实验表明，PES1的表达在食管鳞癌组织中显著上调，而且在免疫治疗不敏感病人组织中的表达量显著高于免疫治疗敏感的病人组织，敲低PES1表达显著抑制了小鼠食管鳞癌细胞AKR的皮下肿瘤生长。流式和免疫组化表明，敲低PES1表达后肿瘤组织中活化的CD8+ T细胞浸润显著增多。此外，本发明人在ED-L2-Cre；PES1loxp/loxp小鼠中，进一步用4-NQO诱导原位食管鳞癌验证了这一表型。
本发明人首次揭示PES1在调控免疫微环境中的功能与机制，阐述了PES1调控CD8+T细胞浸润的机理，从新的角度解释PES1在肿瘤中的功能及在免疫治疗中的作用。
基于本发明的研究，本发明提供了PES1抑制剂(尤其是PES1靶向的或特异性抑制剂)的用途，其可用于预防和/或治疗食管癌(尤其是PES1高表达的食管癌)，或抑制食管癌细胞(尤其是PES1高表达的食管癌细胞)的生长或转移。
IL-15及促进剂
细胞因子(cytokines)是有效的免疫调节蛋白分子，它们刺激自然杀伤细胞(NKcell)和T细胞的功能、存活、浸润和增殖，介导对肿瘤的免疫应。近年来，许多细胞因子，包括白细胞介素IL-2、IL-12、IL-15和IL-21，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素(IFN)-α已被证明在临床前小鼠模型中治疗肿瘤有效，这些临床前的工作支持了临床试验中对这些细胞因子的评估。
其中，细胞因子IL-15是独一无二的，因为它具有广泛的表达，严格调节的分泌。作为一种生长因子，它可以通过上调抗凋亡和下调促凋亡因子来防止细胞凋亡，从而促进T细胞、B细胞和NK细胞的存活，在T和NK细胞的发育、稳态和功能中也起着至关重要的作用，而且也是B细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和肥大细胞的各种功能所必需的。
IL-15促进肿瘤T细胞浸润可以作为将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的一种方法。IL-15主要是通过活化的淋巴细胞产生趋化因子配体1(CXCL1)，该配体将常规的1型树突状细胞(cDC1)招募到肿瘤中。这些cDC1分泌CXCL9、CXCL10和IFNγ，进而导致NK细胞和T细胞的募集。
内源性IL-15的表达受到严格监管，除了转录水平进行调控外，还受到转录后和翻译后的控制，例如mRNA稳定性、替代剪接同种型的产生、细胞内运输和分泌。本发明人通过RNA-Seq研究发现敲低PES1表达显著促进了细胞因子IL15的表达，而且回复实验也很好的验证了PES1通过影响IL15的表达影响CD8+ T细胞浸润，进而影响肿瘤生长。这一结果提示，研究PES1如何调控IL-15内源性表达的机制对于提高肿瘤细胞内部IL-15的表达水平和促进免疫细胞在肿瘤中的浸润，改善免疫治疗的效果有着至关重要的作用。
ILF3及其促进剂
ILF3，也称为NF90/NF110，编码双链RNA结合蛋白，与其他蛋白质，mRNA，小非编码RNA结合以调节mRNA稳定性和基因表达，ILF3主要通过参与细胞抗病毒反应在先天免疫中发挥作用。ILF3可以通过调节许多炎症因子mRNA的稳定性，进而影响其基因表达，包括VEGF、CXCL1、IL-8等。
在本发明中，亲和层析联合质谱实验表明，ILF3与PES1发生相互作用。通过免疫沉淀实验进一步证明了PES1与ILF3存在相互作用。
标志物、检测试剂盒及其用途
本发明还提供一种用于判断肿瘤(如ESCC)患者是否适合采用本发明的PES1抑制剂进行预防和/或治疗的标志物，所述的标志物包括PES1、IL15、或其组合。
在一个实施例中，本发明提供一种用于检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括：
(i)用于检测标志物(PES1和/或IL15)基因表达水平和活性的检测试剂。
本发明还提供一种本发明所述检测试剂盒的用途，用于制备一伴随诊断试剂盒，所述伴随诊断试剂盒用于判断肿瘤患者是否适合采用本发明的PES1抑制剂或本发明的活性成分组合进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的伴随诊断试剂盒还包括说明书或标签。
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载了判断PES1阳性或PES1阴性的方法：若肿瘤患者的细胞或组织中PES1表达量E1与正常细胞或组织中的PES1表达量E0之比(即E1/E0)＞1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0；和/或食管癌细胞或组织中PES1的活性A1与正常细胞或组织中的PES1活性A0之比(即A1/A0)＞1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0，则判断为PES1阳性，适合采用本发明的PES1抑制剂或本发明的活性成分组合进行预防和/或治疗；否则判断为PES1阴性，不适合采用本发明的PES1抑制剂或本发明的活性成分组合进行预防和/或治疗。
组合物或制剂、活性成分的组合和药盒和施用方法
本发明提供一种本发明的PES1抑制剂或本发明的活性成分组合在预防和/或治疗肿瘤方面中的用途。本发明的PES1抑制剂能够用于预防和/或治疗肿瘤。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物或药盒。本发明的药物组合物含有本发明的PES1抑制剂或活性成分组合，以及药学上可接受的载体。
如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于人体或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
应理解，在本发明中，所述的药学上可接受的载体没有特别的限制，可选用本领域常用材料，或用常规方法制得，或从市场购买得到。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂
代表性地，所述的组合物或制剂的剂型为片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球或膜剂。
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药剂还可与其他协同治疗剂一起使用(包括之前、之中或之后使用)。使用药物组合物或制剂时，是将安全有效量的药物施用于所需对象(如人或非人哺乳动物)，所述安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的PES1抑制剂，可有效用于治疗ESCC。
(2)本发明的PES1抑制剂的耐药性较低，适用范围更广。
(3)在本发明中，首次报道了PES1靶点在ESCC进展中的作用和分子机制，为ESCC的机制研究及治疗手段等领域提供新了的理论基础。
(4)本发明的PES1抑制剂可与IL15、rIL15、ILF3及其促进剂联用，进一步提高疗效。
(5)本发明的PES1抑制剂可与免疫检查点抑制剂(如抗体)联用，从而协同性地抑制多种肿瘤，为对免疫检查点阻断疗法耐药或失效的患者提供了新的治疗手段。
(6)PES1可作为评估ESCC患者的预后的生物标志物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
人类ESCC样本
ESCC标本和组织芯片来自上海市胸科医院。该研究得到了上海交通大学医学院附属胸科医院伦理审查委员会的批准。
动物研究
C57BL/6J小鼠(雄性，4或6周龄)购自Gempharmatech Co,Ltd.。将小鼠随机分组，由独立人员指定分组。在所有动物实验中，每个实验组使用6到10只小鼠。在每个部位皮下注射PES1敲低和对照的AKR细胞(3×106)。
①为了中和IL15，在第一次注射后第0、2、4、8天，向小鼠腹腔内以100μg/只小鼠的剂量注射IL15中和抗体(Bioxcell，克隆AIO.3)。第一次注射后10天处死小鼠；②对于抗PD1治疗，上述小鼠皮下注射AKR细胞7天后，每3天注射抗PD-1(2mg/kg体重)，第一次注射后14天处死小鼠。
在所有动物实验过程中，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤大小。根据以下公式计算肿瘤体积：体积＝(长*宽2)/2。动物研究按照批准的方案进行。
细胞系
小鼠食管鳞状细胞癌细胞株AKR购自上海滨穗生物科技有限公司，293T、EC9706、KYSE150细胞株由谢东教授(中国科学院)友情提供。AKR和293T细胞系在DMEM、10％FBS和1％青霉素-链霉素中培养；EC9706和KYSE150细胞系在1640、10％FBS和1％青霉素-链霉素中培养。上述全部细胞均保持在37℃、5％CO2的培养箱中。
qRT-PCR
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养的细胞或肿瘤样品中分离总mRNA。然后使用HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，R312)按照说明书将1μgRNA逆转录成cDNA。Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q712)用于定量PCR扩增。使用ΔCt方法计算表达水平。引物如下：
Huamn-PES1-F:GGCCACCAACTACATCACCC(SEQ ID NO:1)
Human-PES1-R:AGAATGCACAGCCGCCTAAA(SEQ ID NO:2)
Human-IL15-F:ACCATAGATTTGTGCAGCTGTTT(SEQ ID NO:3)
Human-IL15-R:GCTGTTACTTTGCAACTGGGG(SEQ ID NO:4)
蛋白质印迹
HEK293T细胞、KYSE150细胞和EC9706细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中在冰上裂解15分钟，在4℃下以13,000rpm离心10分钟。然后由Broadford测定蛋白质浓度。接下来，使用8％和12％SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，然后转移到PVDF膜(0.45μm)。60分钟后，将膜在5％BSA中封闭，在4℃下与一抗孵育过夜，然后在室温下与小鼠或兔二抗孵育70分钟。使用Tanon-5200多功能化学发光仪器对蛋白质水平进行量化，并将其标准化为GAPDH的水平。
通过流式细胞术进行免疫表型分析
为了量化免疫细胞，根据制造商的说明，使用肿瘤解离试剂盒(MACS MiltenyiBiotec,130-096-730)从新鲜肿瘤组织中制备单细胞悬液。然后，在单细胞悬液中加入抗CD45、抗CD3、抗CD8、抗NCR1、抗CD4、抗GZMB和抗F4/80 20分钟。随后将细胞洗涤并重新悬浮在PBS(包括2％FBS)中。所有样品均在BD FACS Verse流式细胞仪上运行，并通过FlowJo_V10软件进行分析。
RIP检测
根据制造商的协议，Magna RIPTM Kit(17-700；EMD Millipore,Billerica,MA,USA)用于KYSE150、EC9706、KYSE150-shPES1和EC9706-Flag-PES1细胞的RIP实验。简单地说，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次并离心以收集细胞。将细胞重悬于RIP缓冲液中，然后与结合有ILF3抗体的磁性蛋白A/G珠在4℃孵育过夜。第二天，将珠子用RIP缓冲液(包括蛋白酶K)重新悬浮，以从洗脱的免疫复合物中分离ILF3蛋白相关RNA。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离和提取RNA，并使用qRT-PCR测定RIP复合物中IL15 mRNA的水平。
统计分析
使用GraphPad Prism 7分析所有数据。定量值表示为平均值±S.E.M.通过t检验分析两个实验组之间的统计学差异。p<0.05被认为差异是显著的。
实施例1.PES1在ESCC中高度表达与肿瘤浸润CD8+ CTL呈负相关
本发明人推测ESCC中一些显着上调的基因可能在抑制CD8+ CTL浸润中起关键作用。为了识别候选基因，本发明人综合分析了6个ESCC数据集，包括4个mRNA表达数据集(GSE161513、GSE23400、GSE45670、TCGA_ESCC)和两个蛋白质组学数据集(27、28)。
如图1A所示，该分析确定了ESCC中56个基因在mRNA和蛋白质水平上显着上调。
如图1B和1C、表1和表2所示，使用TCGA_ESCC数据集进行的进一步相关性分析显示，PES1的表达与CD8A和CD8B的表达具有最强的负相关性，CD8A和CD8B是CD8+ CTL的两个标志物。
表1CD8A与前5个所列基因的皮尔逊相关性分析
Gene Symbol Case Number Pearson R P value(two-tailed)
PES1 107 -0.3245 0.0006
SLC2A1 107 -0.2687 0.0051
TFRC 107 -0.2623 0.0063
MYO1B 107 -0.257 0.0075
MMP14 107 -0.2329 0.0158
表2CD8B与前5个所列基因的皮尔逊相关性分析
Gene Symbol Case Number Pearson R P value(two-tailed)
PES1 107 -0.359 0.0001
TFRC 107 -0.322 0.0007
SLC2A1 107 -0.3039 0.0015
MYO1B 107 -0.2974 0.0019
KPNA2 107 -0.2304 0.0169
因此，数据分析暗示，PES1表达的增加可能会抑制CD8+ CTL的浸润。
然后，本发明人通过qRT-PCR检测了16个ESCC组织样本和来自ESCC患者的配对非肿瘤食管组织中的PES1mRNA水平。
结果如图1D显示，ESCC组织中PES1 mRNA的表达显着高于非肿瘤组织，这与如图9A-9C所示公共数据库的分析一致。
接下来，本发明人检测了PES1在12对ESCC组织和邻近的非肿瘤组织中的蛋白质表达。
如图1E的结果显示，PES1的蛋白质表达在ESCC样本中显着上调。
如图1F和1G所示，通过免疫组织化学(IHC)在60对ESCC样本中也观察到PES1蛋白水平升高。
为了研究PES1在ESCC中的临床意义，用PES1抗体对含有230个肿瘤标本的ESCC组织微阵列进行染色。如前所述检查和评分PES1的染色信号。
如图1H所示，本发明人发现PES1高表达的患者比PES1低表达的患者预后更差。
如图1I所示，在调整包括肿瘤分期在内的临床因素后，较高的PES1表达仍然是预后风险因素(HR3.17和P<0.001)。
但是如表3所示，PES1表达与年龄、性别、肿瘤分级或TNM分期之间没有相关性。
表3PES1表达水平与ESCC患者临床病理特征的相关性
上述结果提示，PES1的表达在ESCC组织中上调，并与患者预后密切相关。
实施例2.ESCC组织中PES1的高表达抑制CD8+ CTL浸润
在本实施例中，基于PES1与CD8+ CTL的标志物之间的负相关性，本发明人进一步探讨了PES1是否参与了肿瘤免疫反应的调节。
为此，本发明人构建了敲低PES1的小鼠食管鳞癌细胞系AKR，然后将所述敲低细胞系及对照组皮下接种于具有免疫活性的C57BL/6J小鼠中，敲低序列如下：
Mouse-PES1-shRNA-F:
5'-CCGGCGAGAGTACAAGGTGTTTGTTCTCGAGAACAAACACCTTGTACTCTCGTTTTTG-3'(SEQID NO:5)
Mouse-PES1-shRNA-R:
5'-AATTCAAAAACGAGAGTACAAGGTGTTTGTTCTCGAGAACAAACACCTTGTACTCTCG-3'(SEQID NO:6)
如图2A所示，PES1的敲低显著降低了小鼠AKR肿瘤的生长。如图2B和2C所示，在PES1特异性抑制剂(shPES1)存在下，肿瘤体积和肿瘤重量显著下降。
此外，如图2D所示，Western印迹证实了PES1在皮下肿瘤块中的敲低作用。
为了弄清楚PES1表达对CD8+ CTL浸润的影响，本发明人通过流式细胞术检测了几种类型的肿瘤浸润免疫细胞(CD4+ T淋巴细胞、CD8+ CTL、NK细胞、巨噬细胞)。
如图2E和2F所示，有趣的是，本发明人观察到与SCR组相比，PES1表达的敲低显着增强了CD8+ CTL的浸润，并且如图2G所示增加了肿瘤微环境中颗粒酶B+(GZMB+)/CD8+ CTL的百分比。
然而，如图10A-10C所示，CD4+ T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞的浸润在PES1敲低AKR和SCRAKR之间没有显着差异，且如图2H和图10D所示，本发明人还通过IHC证实了这些发现。
因此，这些数据表明高PES1表达阻碍了ESCC组织中的CD8+ CTL浸润。
实施例3.PES1通过降低IL15表达抑制CD8+ CTL浸润
在本实施例中，探讨了PES1影响CD8+CTL浸润的机制。
如图3A所示，使用KYSE150SCR细胞和shPES1细胞进行RNA-Seq来分析显著改变的基因。
为了进一步鉴定负责免疫调节的基因，对TIMER2.0数据库中免疫相关基因和上调基因之间的重叠基因进行计数。
如图3B的结果显示shPES1组中9个免疫相关基因上调，而据报道IL15与CD8+ CTL的浸润密切相关。因此，本发明人专注于PES1对IL15的调节。
首先，本发明人通过qRT-PCR证实了IL15的表达，如图3C和3D所示，实际上，shPES1ESCC细胞中IL15的mRNA水平高于SCR对照组。一致地，如图3E所示，TCGA_ESCC分析表明PES1表达与IL15表达呈负相关。
本发明人还通过蛋白质印迹分析检查了IL15的表达，并且如图3F和3G所示，观察到在PES1敲低的KYSE150和AKR细胞中IL15的蛋白质水平显著增加，这也通过如图3H的皮下肿瘤检测得到证实。
为了探索它们在临床中的关系，本发明人通过IHC检查了60个ESCC样本中PES1和IL15的蛋白质水平，并且如图3I和3J所示，观察到PES1表达与IL15水平之间的负相关。
总之，这些结果表明PES1可以抑制IL15的表达。
本发明人接下来探究PES1是否通过影响IL15表达来减少ESCC中的CD8+ CTL浸润。
本发明人通过腹腔内注射抗IL15的抗体在体内中和IL15。有趣的是，如图4A-4D所示，IL15的中和削弱了PES1敲低对肿瘤生长的抑制作用。此外，如图4E使用上述样品的免疫组织化学显示，IL15的缺失消除了PES1对CD8+ CTL浸润的抑制作用。
因此，这些数据表明PES1可能通过降低IL15表达来抑制CD8+ CTL浸润。
实施例4.PES1与ILF3相互作用并调节IL15表达
在本实施例中，为了进一步阐明PES1调节IL15表达的机制，通过免疫共沉淀和质谱分析PES1相互作用蛋白。
用3×Flag-PES1和空载体作为对照瞬时转染EC9706细胞。3×Flag-PES1用抗Flag-M2珠子从细胞裂解物中免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色检查免疫沉淀物。
如图5A所示，在3×Flag-PES1组中检测到几个独特的条带。这些条带被分离并进行串联质谱以进行蛋白质鉴定。结果显示ILF2和ILF3是PES1的潜在结合伙伴。
已知ILF2和ILF3可稳定mRNA并因此增加基因表达。为了验证MS/MS数据，本发明人用3×Flag-PES1转染EC9706细胞并用Flag抗体进行IP。
如图5B所示，观察到PES1可以与ILF3相互作用，但不能与ILF2相互作用。如图5C所示，在293T细胞中也观察到了类似的发现。此外，如图5D和5E所示，在EC9706和293T细胞中检测到内源性PES1和ILF3之间的相互作用。
为了验证PES1是否通过与ILF3的相互作用影响IL15表达，用慢病毒感染KYSE150-SCR和KYSE150-shPES1细胞以敲低ILF3表达。
如图5F和5G的qRT-PCR和蛋白质印迹显示，在shPES1的情况下，ILF3敲低后IL15的mRNA和蛋白质水平显着降低。
总之，这些发现表明PES1通过与ILF3的相互作用调节IL15的表达。
实施例5.PES1干扰ILF3-IL15 mRNA相互作用并降低了IL15 mRNA的稳定性
在本实施例中，探索了PES1如何通过与ILF3相互作用来调节IL15的表达。
由于PES1的表达影响IL15 mRNA水平，并且ILF3是一种RNA结合蛋白(RBP)并且可以调节各种转录物的稳定性，本发明人假设PES1通过与ILF3竞争性相互作用来调节IL15mRNA的稳定性。
为了测试这种可能性，本发明人使用放线菌素D来抑制转录，并进行qRT-PCR以测量IL15的衰减率。
结果如图6A和6B所示，IL15 mRNA在敲低PES1的KYSE150和AKR细胞中更稳定。
相反，如图6C所示，在EC9706细胞中过表达PES1明显降低了IL15 mRNA的稳定性。
此外，如图6D和6E所示，RIP测定证实了KYSE150和EC9706细胞提取物中ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用。
由于ILF3直接与mRNA相互作用以维持其稳定性，本发明人假设PES1可能干扰ILF3-IL15 mRNA相互作用。
为了检验这一假设，本发明人在EC9706细胞中过表达PES1，然后用ILF3抗体进行RIP测定。
如图6F所示，ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用通过PES1的过表达减弱。此外，如图6G所示，本发明人观察到PES1敲低显着增强了ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用。
总的来说，以上数据表明PES1通过干扰ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用来抑制IL15表达，并且如图6H所示，最终促进IL15 mRNA的降解。
实施例6.靶向PES1增效ESCC对免疫检查点治疗
为了探索靶向PES1在体内肿瘤免疫治疗中的潜力，本发明人将SCR和shPES1 AKR细胞接种到C57BL/6小鼠中，并在第7、10、13天注射抗PD1抗体，同时注射IgG2同种型对照。
如图7A-7C所示的结果表明，抗PD1抗体与PES1敲低产生了协同作用，并表现出增强的抗肿瘤作用。
其中，肿瘤体积(mm3)如图7B和表4所示：
表4肿瘤体积(mm3)
结果表明，PES1抑制剂与抗PD1抗体联用，可以更有效地抗ESCC肿瘤，显著降低ESCC肿瘤的体积。
25天时的肿瘤重量(g)如图7C和表5所示。
表5肿瘤重量(g)
出乎意料地，如表6所示，PES1抑制剂与抗PD1抗体联用，在25天时的抑瘤率居然高达97％，高于单用PES1抑制剂的抑瘤率(78.0％)和单用抗PD1抗体的抑瘤率(79.7％)的简单叠加。按相对肿瘤重量计，若单用PES1抑制剂和单用抗PD1抗体简单叠加，则预计的相对肿瘤重量WR(简单叠加)＝22.0％×20.3％＝4.46％。PES1抑制剂与抗PD1抗体联用组的相对肿瘤重量WR(联用)仅为3.0％，小于4.46％的WR(简单叠加)。这提示，PES1抑制剂与抗PD1抗体联用，存在协同的抗ESCC的治疗效果。
与单独shPES1和抗PD1相比，联合治疗进一步增加了CD8+ CTL浸润，并且如图7D所示，增加了GZMB+ /CD8+ CTL在肿瘤微环境中的百分比。
为了进一步证实PES1在免疫治疗患者中的临床影响，进行了蛋白质印迹。
如图7E所示，免疫治疗敏感患者的ESCC组织中PES1蛋白水平显着升高，并且如图7F所示，免疫组织化学实验产生了相似的结果。
因此，以上结果表明，PES1抑制剂与免疫检查点抑制剂(如抗PD1抗体)联用可以协同地治疗ESCC，即PES1抑制剂可以协同增强抗PD1抗体对ESCC的疗效。
讨论
食管鳞状细胞癌(ESCC)是食管癌的主要类型，在中国占90％。以手术为基础的多学科治疗是主要的治疗方式，但其预后仍然不利。最近，免疫检查点阻断(ICB)疗法在包括ESCC在内的多种恶性肿瘤中产生了显着的治疗反应。然而，由于耐药性，只有少数患者获得了临床益处。因此，应确定精确的标志物来指导个性化免疫治疗。最近的研究描述了影响临床反应和生存的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，尤其是CD8+ CTL。高密度CD8+ CTL与更有利的OS和RFS显着相关。因此，阐明和靶向肿瘤用于预防CD8+ CTL浸润的机制对于提高临床癌症免疫治疗的疗效至关重要。
几项研究表明，肿瘤固有癌基因在调节免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤免疫逃逸中起关键作用。这些基因的成功鉴定将带来新的治疗策略。本发明人的在线数据库分析表明，PES1在ESCC中的表达可能与CD8+ CTL的浸润有关。在这里，本发明人报道了PES1在抑制CD8+ CTL浸润到ESCC组织中的功能作用。机制研究表明，PES1干扰了ILF3和IL15 mRNA之间的相互作用，降低了IL15 mRNA的稳定性和基因表达。PES1表达的敲低增强了免疫疗法的效果，表明ESCC免疫疗法的潜在治疗靶点。因此，如图8所示，本发明人在此的工作揭示了PES1通过ILF3-IL15轴抑制CD8+ CTL浸润的机制，这反过来导致肿瘤进展并抑制抗肿瘤免疫反应。
PES1已被证明在许多癌症类型中过度表达，并通过影响各种致癌信号通路促进肿瘤细胞的恶性行为。然而，PES1在ESCC中的功能以及PES1对ESCC免疫景观的影响仍然很大程度上未知。本发明人的研究首次报道了PES1在ESCC进展中的作用和分子机制。本发明人的研究结果表明，PES1通过抑制CD8+ CTL浸润促进肿瘤生长，抑制PES1表达可以提高免疫治疗的效果。因此，本发明人的研究揭示了PES1的生理作用，并扩展了对该基因的理解。
据报道，细胞因子可以控制免疫反应。它们控制白细胞的增殖、分化、效应功能和存活。近年来，一些细胞因子，包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF和干扰素-α已显示在小鼠癌症模型中有效。重要的是，IL-15是NK细胞和CD8+ CTL的癌基因所必需的，并诱导增殖、细胞毒作用和浸润。事实上，许多临床前研究和临床研究表明，IL15对肿瘤免疫治疗具有协同作用。但其半衰期短和生物利用度差限制了其治疗作用。如何提高IL15的稳定性和治疗的副作用是当务之急。因此，解释肿瘤细胞内源性IL15产生的机制也很重要，靶向IL15的上游调节蛋白可能有更好的效果。本发明人首次发现并证实了PES1可以调节IL15的mRNA表达。抗IL15治疗实验表明PES1通过IL15抑制CD8+ CTL浸润。进一步的机制研究表明，PES1与RNA结合蛋白ILF3相互作用，并且敲低PES1和ILF3减弱了由于PES1的敲低而导致的IL15增加的作用。这些结果表明PES1通过与ILF3相互作用来调节IL15的表达。
ILF3，也称为NF90/NF110，编码一种双链RNA结合蛋白。ILF3调节各种转录物的稳定性，例如IL-2、Tau、血管内皮生长因子(VEGF)和MyoD。有趣的是，本发明人发现ILF3可以与IL15 mRNA相互作用，而PES1可以干扰它们的相互作用并影响IL15mRNA的稳定性。这一发现使本发明人能够证实PES1通过ILF3-IL15轴减弱IL15表达，从而抑制CD8+ CTL浸润并促进肿瘤进展。总之，本发明人的结果表明，PES1通过抑制ESCC中的ILF3-IL15轴来促进免疫排斥。PES1的失调是ESCC中以前未被重视的免疫逃避机制。此外，本发明人提供了靶向PES1可能使ESCC肿瘤对免疫治疗敏感的原理证明，表明PES1作为一种治疗靶点使ESCC患者受益。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 马, 宁
<120> PES1抑制剂在食管鳞状细胞癌免疫治疗中的应用
<130> P2022-0564
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Huamn-PES1-F引物
<400> 1
ggccaccaac tacatcaccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Human-PES1-R引物
<400> 2
agaatgcaca gccgcctaaa 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Human-IL15-F引物
<400> 3
accatagatt tgtgcagctg ttt 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Human-IL15-R引物
<400> 4
gctgttactt tgcaactggg g 21
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 敲低序列Mouse-PES1-shRNA-F
<400> 5
ccggcgagag tacaaggtgt ttgttctcga gaacaaacac cttgtactct cgtttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 敲低序列Mouse-PES1-shRNA-R
<400> 6
aattcaaaaa cgagagtaca aggtgtttgt tctcgagaac aaacaccttg tactctcg 58

Claims (10)

1.一种PES1靶向抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述的组合物或制剂用于：(a)预防和/或治疗食管癌，所述的食管癌是PES1高表达的食管癌；和/或(b)抑制食管癌细胞，所述的食管癌细胞是PES1高表达的食管癌细胞。
2.一种PES1基因、mRNA、cDNA、蛋白，或其检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于选自下组一种或多种用途：
(i)用于评估食管癌患者是否适合用PES1靶向抑制剂进行治疗；和/或
(ii)用于评估食管癌患者用PES1靶向抑制剂进行治疗的预后。
3.一种产品组合，所述产品包括：
(a)检测试剂或含所述检测试剂的试剂盒，所述检测试剂为检测PES1基因、mRNA、cDNA、蛋白，或其组合的检测试剂；和
(b)药物组合物，所述的药组合物含有PES1靶向抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。
4.一种如权利要求3所述的产品组合的用途，用于制备治疗PES1高表达的食管癌的医疗产品。
5.一种活性成分组合的用途，所述活性成分组合包括第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物或药盒，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
6.一种活性成分组合，所述组合由第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分构成，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
7.一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分为PES1靶向抑制剂；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合；和
(iii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.一种药盒，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有第一活性成分PES1靶向抑制剂以及药学上可接受的载体；
(b)第二制剂，所述第二制剂含有第二活性成分以及药学上可接受的载体，其中，所述第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合；
(c)说明书，所述说明书描述了将PES1靶向抑制剂和第二活性成分联用以治疗肿瘤的方法。
9.一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：在第一活性成分PES1靶向抑制剂和任选的第二活性成分存在下，培养肿瘤细胞，从而协同抑制所述肿瘤细胞的生长，其中第二活性成分选自下组：免疫检查点抑制剂、IL15或IL15促进剂、ILF3或ILF3促进剂，或其组合。
10.一种活性成分组合的用途，其特征在于，所述活性成分组合由第一活性成分PES1靶向抑制剂和第二活性成分免疫检查点抑制剂构成，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物或药盒。
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