CN117045657A - 一种药物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合及其应用。本发明提供了一种药物组合或药物组合物，所述药物组合或药物组合物的活性组分包括物质A、物质B、物质C和物质D；物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐。本发明的药物组合或药物组合物能减少肺泡炎症、肺结核炎症性肺损伤和肺结核继发性纤维化，同时增加抗结核药物在病变部位的渗透，以加速治疗反应，降低复发风险。

Description

一种药物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一种药物组合及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的严重威胁人类健康的主要传染性疾病之一。2021年世界卫生组织(WHO)结核病报告显示，2020年，全球新发结核病患者987万，发病率为127/10万。化学治疗是控制结核病的主要手段，尽管标准的6个月治疗方案对药物敏感性结核病高度有效，但肺部病灶完全吸收的可能性较小，仍有超过一半的人存在永久性肺功能损伤，往往遗留有大量纤维病灶。肺结核继发性纤维化是肺结核常见的并发症，广泛肺纤维化会严重影响患者的肺功能，肺结核继发性纤维化是常见的肺结核后肺病(pulmonaryimpairment after TB,PIAT)，同时结核菌被纤维包裹导致药物难以完全杀灭细菌容易复发。“钙化结节和纤维化病灶”均增加了结核病复发的风险，有纤维化病灶者的结核病复发风险明显升高。
PFD(吡非尼酮,Pirfenidone)是2014年FDA批准用于治疗特发性纤维化的药物，其作用主要体现在抗氧化、抗炎症和抗纤维化，具有广谱性。它能够抑制转化生长因子(TGF-β1)的表达，同时抑制多种炎性因子释放，减轻炎症反应。
至今，尚无含有含杂原子环丁烷取代基的吡啶酮衍生物的药物组合应用于减少肺泡炎症、肺结核炎症性肺损伤和肺结核继发性纤维化，同时增加抗结核药物在病变部位的渗透，以加速治疗反应，降低复发风险的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有的治疗结核病的药物难以完全杀灭细菌，控制结核病复发的缺陷，而提供了一种药物组合或药物组合物及其应用。本发明的药物组合物能减少肺泡炎症、肺结核炎症性肺损伤和肺结核继发性纤维化，同时增加抗结核药物在病变部位的渗透，以加速治疗反应，降低复发风险。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种药物组合，所述药物组合的活性组分包括物质A、物质B、物质C和物质D；
物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；
物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；
物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
在一些实施方式中，所述药物组合为药物组合物。
在一些实施方式中，所述的药物组合中，所述物质B和所述物质A的重量比为(3：1)-(1：30)，优选1：6。
在一些实施方式中，所述的药物组合中，所述的物质C和所述物质A的重量比为(3：1)-(1：60)，优选1：6。
在一些实施方式中，所述的药物组合中，所述的物质D和所述物质A的重量比为(30：1)-(1：3)，优选5：2。
在一些实施方式中，所述的药物组合中，所述活性组分由所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D组成。
在一些实施方式中，所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D可以采用本领域中任何合适的途径施用，包括口服、注射(例如静脉、肌肉、皮下)等。
在一些实施方式中，所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D可以同时施用或分开施用。
所述“同时施用”例如物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D包含在单独药物组合物中同时施用；或者，“包含物质A的单独药物组合物”、“包含物质B的单独药物组合物”、“包含物质C的单独药物组合物”和“包含物质D的单独药物组合物”同时施用。
所述“分开施用”例如“包含物质A的单独药物组合物”、“包含物质B的单独药物组合物”、“包含物质C的单独药物组合物”和“包含物质D的单独药物组合物”在不同时间分开施用，例如：“包含物质A的单独药物组合物”、“包含物质B的单独药物组合物”、“包含物质C的单独药物组合物”和“包含物质D的单独药物组合物”其中之一首先施用，其余随后施用。所述的分开施用可在时间上距离接近或时间上距离较远。
无论同时施用还是分开施用，所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D的施用方案(包括施用途径、施用剂量、施用间隔等)可以相同或不同，其可以由本领域技术人员根据需要进行调整，以提供最优的治疗效果。
另一方面，本发明提供一种药物组合物X，其包括物质A、物质B、物质C、物质D和药用辅料；
物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；
物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；
物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
所述药物组合物X是单独药物组合物。
在一些实施方式中，所述药物组合物X由所述物质A、所述物质B、所述物质C、所述物质D和药用辅料组成。
在一些实施方式中，所述药物组合物X以口服剂型形式呈现。
在一些实施方式中，所述药物组合物X以注射剂型形式呈现。
另一方面，本发明还提供一种药物组合物Y，其包括第一药物组合物、第二药物组合物、第三药物组合物和第四药物组合物；
所述第一药物组合物包括物质A和药用辅料；物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
所述第二药物组合物包括物质B和药用辅料；物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；
所述第三药物组合物包括物质C和药用辅料；物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；
所述第四药物组合物包括物质D和药用辅料；物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
所述第一药物组合物是单独药物组合物；所述第二药物组合物是单独药物组合物；所述第三药物组合物是单独药物组合物；所述第四药物组合物是单独药物组合物。
在一些实施方式中，所述药物组合物Y由第一药物组合物、第二药物组合物、第三药物组合物和第四药物组合物组成。
在一些实施方式中，所述第一药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现。
在一些实施方式中，所述第二药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现。
在一些实施方式中，所述第三药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现。
在一些实施方式中，所述第四药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现。
本发明提供了一种上述药物组合、药物组合物X或药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防结核病的药物中的应用。
本发明提供了一种上述药物组合、药物组合物X或药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺泡炎症的药物中的应用；优选地，所述肺泡炎症为肺结核引起的肺泡炎症。
本发明提供了一种上述药物组合、药物组合物X或药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺结核炎症性肺损伤的药物中的应用。
本发明提供了一种上述药物组合、药物组合物X或药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺部纤维化的药物中的应用；优选地，所述肺部纤维化为肺结核继发性纤维化。
本发明提供了一种上述药物组合、药物组合物X或药物组合物Y在制备用于降低结核病复发率的药物中的应用；优选地，所述药物用于降低肺组织和/或脾组织结核菌复发率。
在一些实施方式中，所述药物用于降低脾组织结核菌复发率，使得脾组织复发率降低80％。
在一些实施方式中，所述药物用于降低肺组织结核菌复发率，使得肺组织复发率降低40％-50％。
另一方面，本发明提供一种治疗和/或预防结核病的方法，其包括向有此需要的患者给予治疗有效量的如本文所述的药物组合、药物组合物X或药物组合物Y。
所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D可以同时施用或分开施用。
所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D可以采用本领域中任何合适的途径施用，包括口服、注射(例如静脉、肌肉、皮下)等。
所述异烟肼的给药剂量可依据患者的体重来施用，非限制性实例范围可以为10mg/kg-30mg/kg，例如10mg/kg或25mg/kg。
所述利福平的给药剂量可依据患者的体重来施用，非限制性实例范围可以为5mg/kg-30mg/kg，例如10mg/kg。
所述吡嗪酰胺的给药剂量可依据患者的体重来施用，非限制性实例范围可以为100mg/kg-300mg/kg，例如150mg/kg。
所述化合物Ⅰ的给药剂量可依据患者的体重来施用，非限制性实例范围可以为10mg/kg-300mg/kg，例如25mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、100mg/kg、150mg/kg或200mg/kg。
本文所用术语“治疗”指治疗性疗法。涉及具体病症时，治疗指：(1)缓解疾病或者病症的一种或多种生物学表现，(2)干扰(a)导致或引起病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现，(3)改善与病症相关的一种或多种症状、影响或副作用，或者与病症或其治疗相关的一种或多种症状、影响或副作用，或(4)减缓病症或者病症的一种或多种生物学表现发展。
本文所用术语“治疗有效量”是指在给予患者时足以有效治疗本文所述的疾病或病症的化合物的量。构成“治疗有效量”的化合物的量将根据化合物、病症及其严重度、以及欲治疗患者的年龄而变化，但可由本领域技术人员根据需要进行调整。
本文所用术语“药物组合物”是指含有指定的活性成分、可被制备成同一剂型的组合物。
本文所用术语“患者”是指根据本发明的实施例，即将或已经接受了该化合物或组合物给药的任何动物，哺乳动物为优，人类最优。如本文所用，术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴、人等，以人类为最优。
本文所用术语“药用辅料”是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，是除活性成分以外，包含在药物制剂中的所有物质。可参见中华人民共和国药典(2020年版)四部、或、Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C Rowe,2009SixthEdition)。
本文所用术语“药学上可接受的”是指(制备盐所使用的)酸或碱、溶剂、辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。
本文所用术语“药学上可接受的盐”是指化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、碳酸氢根、磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、亚磷酸、硫酸、硫酸氢根等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’-亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977)、或、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(P.HeinrichStahl and Camille G.Wermuth,ed.,Wiley-VCH,2002)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的药物组合或药物组合物能减少肺泡炎症、肺结核炎症性肺损伤和肺结核继发性纤维化，同时增加抗结核药物在病变部位的渗透，以加速治疗反应，降低复发风险。
附图说明
图1为小鼠肺组织HE染色及Masson染色的病理学分析。
图2为碱水解法测定各治疗组肺组织中的羟脯氨酸含量。
图3为各治疗组在结核病小鼠模型中抗菌作用的评估。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1化合物Ⅰ在结核病肺损伤中的保护作用研究
一、实验材料：
1.实验菌株
实验室标准MTB菌株：H37Rv(ATCC 27294)由首都医科大学附属北京胸科医院/北京市耐药结核病重点实验室保存并提供。
2.实验动物
SPF级6-8周C57BL/6雌性小鼠，体质量为16～19g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
3.实验药物
利福平(批号：WXBB7288V，购自美国Sigma公司)；
异烟肼(批号：MKBQ8553V，购自美国Sigma公司)；
吡嗪酰胺(批号：H1929213购自上海阿拉丁生化科技公司)；
吡非尼酮(批号：53179-13-8购自瀚香生物科技公司)；
化合物Ⅰ由广州嘉越医药科技有限公司提供。
4.实验试剂
Middlebrook OADC营养液购自美国Becton Dickinson公司(批号：9043888)；
阿尔玛蓝(Alamar Blue)指示剂购自美国Bio-Rad公司(批号：154244)；
二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)购自成都化学试剂厂(批号：Y190601)；
吐温-80购自北京索莱宝科技有限公司(批号：1114D0123H)；
羟脯氨酸测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：A030-2-1)；
Masson染液套装(购自Servicebio G1006公司)。
5.实验方法
(1)微孔板阿尔玛蓝(microplate alamar blue assay，MABA)法测PFD及化合物Ⅰ的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)
将H37Rv菌株培养至对数生长期，7H9液体培养基稀释菌悬液至1×106CFU/ml备用。取96孔板依次将异烟肼(H)、利福平(R)、化合物Ⅰ、以及吡非尼酮(PFD)+异烟肼(H)、吡非尼酮(PFD)+利福平(R)、化合物Ⅰ+异烟肼(H)、化合物Ⅰ+利福平(R)倍比稀释。37℃培养7天后，各孔加入20μl的阿尔玛蓝和12.5μl的20％吐温-80，37℃继续培养24h，记录各孔颜色，蓝色表示菌株无生长，红色表示有菌生长，MIC表示由蓝色变为红色的最低药物浓度。重复试验两次。
(2)将处于对数生长期的H37Rv菌株以20ml 1×PBS稀释至菌浓度为1×107CFU/ml，将75只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠气溶胶下感染。建立气溶胶感染慢性小鼠结核病模型，用该模型评价PFD+HRZ、化合物Ⅰ+HRZ、HRZ治疗组的抗菌活性。在感染后第10天(D-32)随机取3只小鼠处死，给药治疗当天(D0)随机取6只小鼠处死，解剖取脾、肺组织匀浆后在7H10板上进行脾、肺菌落(CFU)计数，以确定感染初始及治疗开始时小鼠肺部及脾脏结核分枝杆菌的基线数量。感染6周后开始给药，每周称量小鼠体重，根据各组小鼠体重平均值计算每周所需要的药物总质量以及总体积，配置相应的给药浓度。异烟肼(H)溶于无菌水中，其余各药物均溶于DMSO溶液中。一周给药5天，于每日清晨8点灌胃给药。异烟肼(H)与吡嗪酰胺(Z)混匀，每只小鼠给药0.2ml；化合物Ⅰ+HRZ治疗组、PFD+HRZ治疗组分别给予每只小鼠化合物Ⅰ0.1ml、PFD 0.1ml；利福平(R)于所有药物给药结束后间隔至少1h给药。所有药物给药之前37℃预热混匀。于给药4周、8周后随机分别取各治疗组7-8只小鼠处死解剖，取脾、肺组织匀浆后在7H10板上进行脾、肺菌落(CFU)计数。治疗8周停药12周后观察各治疗组7只小鼠肺部及脾脏结核分枝杆菌的复发情况。C57BL/6小鼠感染6周后随机分为3组(见表1)
表1C57BL/6小鼠分组及给药方案
备注：吡非尼酮(PFD)；异烟肼(H)；利福平(R)；吡嗪酰胺(Z)；D-32：感染10天；W4：治疗4周；W8：治疗8周；W8+12W：治疗8周后停药12周观察复发。D：天；W：周。异烟肼：10mg/kg/d；利福平：10mg/kg/d；吡嗪酰胺：150mg/kg/d；吡非尼酮PFD：100mg/kg/d；化合物Ⅰ：60mg/kg/d。
病理组织学HE染色及肺泡炎症评分
肺组织病理学观察：取小鼠左肺组织进行修剪，经4％多聚甲醛固定，固定状态良好后，经生理盐水洗净后于4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，制作3μm石蜡切片，HE染色观察肺组织病理改变，光镜下观察肺组织病理改变，描述炎症浸润程度并行肺损伤病理评分。采用4项指标评估肺损伤程度：①肺泡充血；②肺泡出血；③肺泡间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚。评分标准：无损伤记0分，轻度损伤记1分，中度损伤记2分，重度损伤记3分，各项评分的总和即为肺损伤病理评分。
Masson染色及特殊染色占比
Masson染色按照试剂盒说明书中的方法进行操作。切片常规脱蜡至水，Masson A液浸泡过夜，Masson B液与Masson C液等比例混合浸泡1min，Masson D液浸泡6min,MassonE液1min,Masson F液2-30s,1％冰醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，普通光学显微镜观察。结果判读胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。采用成像系统采集组织染色切片上的图像，利用分析软件自动读取组织测量区域，计算测量区域中的阳性面积以及组织面积，并计算出阳性面积占比。
碱水解法检测肺组织羟脯氨酸含量
使用HYP检测试剂盒进行测定。测定右肺组织中羟脯氨酸含量。将新鲜的肺组织解剖分离，称重，置于试管中，准确加水解液1ml。水浴锅中水浴20min。调节PH为6.0-6.8左右。然后加蒸馏水至10ml,取4ml稀释的水解液加入适量的活性炭。3500r/min离心10min，取上清液1mlzuo检测。空白管和标准管分别表示蒸馏水和标准品。按说明书依次添加各试剂。最后采用酶标仪在550nm处蒸馏水调零，测各管吸光度A值。用下列公式计算HYP含量(ug/mg湿重)＝(A测-A空)/(A标-A空)*5ug/ml(标准管含量)*[10(水解液总体积)/肺组织湿重]。A测：测定管吸光度；A空：空白管吸光度；A标：标准管吸光度。
6.统计分析
数据绘图使用GraphPad prism 8.0软件(美国GraphPad公司)、数据统计使用SPSS22软件。计量资料符合正态分布，采用“x±s”描述，多组间差异的比较采用单因素方差分析，进一步的组内两两比较采用t检验，以P＜0.05表示有统计学差异。
7.结果
1)MABA法测定PFD、化合物Ⅰ单药及与H/R联用对H37Rv标准株的MIC
采用微量肉汤稀释法测定PFD、化合物Ⅰ单独及与H/R联用对结核分枝杆菌H37Rv标准株的MIC值，结果显示化合物Ⅰ、PFD的MIC值均＞100ug/ml；同时测定100ug/ml的化合物Ⅰ/PFD与H/R组合药物的MIC值。异烟肼单药MIC值为：0.037ug/ml。利福平单药MIC值为：0.038ug/ml。PFD+H、化合物Ⅰ+H的MIC值都为0.037ug/ml；PFD+R、化合物Ⅰ+R的MIC值都为0.038ug/ml。结果表明添加100ug/ml PFD或者化合物Ⅰ组合药物的MIC值与抗结核药物单药MIC值相比未发生明显改变。即PFD与化合物Ⅰ不具有抑菌活性也不影响抗结核药物的抑菌活性。
表2MIC结果
序号 药物 MIC(ug/ml)
1 异烟肼(H) 0.037
2 利福平(R) 0.038
3 化合物Ⅰ >100
4 PFD >100
5 化合物I+利福平(R) 0.038
6 PFD+利福平(R) 0.038
7 化合物I+异烟肼(H) 0.037
8 PFD+异烟肼(H) 0.037
2)小鼠肺组织HE染色及Masson染色的病理学分析
光学显微镜下观察各组的病理切片并评分：各治疗组小鼠于治疗当天，治疗4周、8周分别取三只小鼠左肺组织进行HE染色并进行肺泡炎症评分。治疗4周PFD+HRZ治疗组及化合物Ⅰ+HRZ治疗组相较于HRZ治疗组可显著减轻肺泡炎症(P<0.05)。治疗4周肺组织病理学切片结果显示：HRZ治疗组肺组织中可见广泛肺泡壁轻度增厚，伴有弥散的淋巴细胞与中性粒细胞浸润、局部血管周围可见炎性细胞浸润成环，形成血管套袖；PFD+HRZ治疗组组织中可见少量淋巴细胞与巨噬细胞浸润；化合物Ⅰ+HRZ治疗组组织中可见少量淋巴细胞与巨噬细胞浸润，局部可见肺泡壁轻度增厚。治疗8周肺泡炎症评分显示：PFD+HRZ治疗组、化合物Ⅰ+HRZ治疗组相较于HRZ治疗组可降低肺泡炎症(P<0.05)，结果如表3所示。
各治疗组小鼠于治疗4周、8周分别取3只小鼠左肺组织进行Masson染色,将Masson染色结果经过成像系统采集组织染色切片上的图像，利用分析软件自动读取组织测量区域，计算测量区域中的阳性面积以及组织面积，并计算出阳性面积占比，结果如表4所示，结果表明：治疗4周PFD+HRZ治疗组、化合物Ⅰ+HRZ治疗组相较于HRZ治疗组可显著降低肺组织纤维化(P<0.001)；治疗8周PFD+HRZ治疗组、化合物Ⅰ+HRZ治疗组相较于HRZ治疗组仍可降低肺组织纤维化(P<0.05)；结果如图1所示，小鼠肺组织病理学观察，评估三种治疗方案对小鼠肺结核肺损伤的保护作用。(图1的A表示：小鼠经4周、8周给药治疗后肺内HE染色结果。图1的B表示：小鼠经4周、8周给药治疗后肺内Masson染色结果。图1的C-D表示：小鼠经4周、8周给药治疗后肺组织HE染色肺泡炎症评分。图1的E-H表示：小鼠经4周、8周给药治疗后肺组织Masson染色、特殊染色阳性面积占比统计图.ns，无统计学差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)。
表3各组小鼠肺泡炎症评分
表4各治疗组不同治疗时间点特殊染色阳性面积比率(％)
3)羟脯氨酸试剂盒检测各治疗组小鼠肺纤维化程度
于治疗4周、8周时间点，各治疗组取3只小鼠处死，解剖，取小鼠右肺组织按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书检测各治疗组右肺组织羟脯氨酸含量。实验结果表明尽管接受HRZ治疗，随着结核分枝杆菌感染周期的延长，肺组织中纤维化程度也在不断加深。另外吡非尼酮+HRZ治疗组、化合物Ⅰ+HRZ治疗组相较于HRZ治疗组在治疗4周、8周时都能降低小鼠肺组织中的纤维化程度，其中8周时降低纤维化程度更为显著(P<0.05)，结果如表5和图2所示(碱水解法测定各治疗组肺组织中的羟脯氨酸含量，评估三种治疗方案的抗纤维化作用，图2的A表示：治疗4周各治疗组右肺组织中羟脯氨酸含量；图2的B表示：治疗8周各治疗组右肺组织中羟脯氨酸含量；图2的C表示：不同时间点各治疗组右肺组织中羟脯氨酸含量。ns，无统计学差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。
表5各治疗时间点肺组织Hyp含量
4)小鼠慢性结核病模型评估各治疗组的抗结核活性
在感染10天，治疗当天，治疗4周，治疗8周，以及治疗8周停药12周后各组取一定数量的小鼠解剖后，取脾脏、肺脏组织匀浆，匀浆后在7H10板上进行肺CFU计数。各时间点肺组织CFU计数结果见下表6。各时间点脾脏组织CFU计数结果见下表7。PFD+HRZ治疗组，因为灌胃操作不当导致两只实验小鼠因意外死亡。余实验组小鼠在感染和给药过程中各组小鼠耐受性良好，无死亡。治疗当天(D0)小鼠肺组织中CFU计数结果为(5.27±0.07)lg(CFU+1)作为治疗初始的小鼠肺组织中活菌计数的基线值。PFD+HRZ、化合物Ⅰ+HRZ、HRZ三个治疗组治疗4周后，均能显著的降低小鼠肺组织中活菌数量，分别降低2.75lg(CFU+1)、2.54lg(CFU+1)、2.70lg(CFU+1)。治疗8周后PFD+HRZ、化合物Ⅰ+HRZ、HRZ组脾脏中活菌数均达到无菌化；治疗8周分别有2/3、3/5、3/5的小鼠肺脏中活菌计数达到无菌化。CFU计数结果表明：在C57BL/6小鼠体内，100mg/kg/d的PFD或者化合物Ⅰ的添加对现有的抗结核药物的抑菌作用没有显著的影响，也没有导致结核分枝杆菌的进一步播散，结果见图3(100mg/kg/d PFD、化合物Ⅰ联用HRZ在结核病小鼠模型中抗菌作用的评估(图3中A表示：治疗4周各组肺组织中CFU计数；图3中B表示：治疗8周各治疗组脾脏中CFU计数；图3中C表示：不同治疗时间点各组肺组织中CFU计数汇总；图3中D表示：不同治疗时间点各组脾脏中CFU计数汇总；每个点代表一只小鼠，CFU数据代表n≥3只小鼠脏器的平均值用Mean±SD表示；将所有肺CFU计数使用单因素ANOVA检验确定组间的统计学差异)。
表6各组肺组织中CFU计数
对照 HRZ+PFD HRZ+化合物Ⅰ HRZ
D-32 4.38±0.09 - - -
D0 5.271±0.066 - - -
4W - 2.52±0.23 2.73±0.08 2.57±0.18
8W - 0.30(2/3) 0.48±0(3/5) 0.39±0.09(3/5)
表7各组脾脏中CFU计数
对照 HRZ+PFD HRZ+化合物Ⅰ HRZ
D-32 2.15±0.11 - - -
D0 3.496±0.257 - - -
D4W - 1.82±0.08 1.91±0.05 1.79±0.17
D8W - 0 0 0
5)为了进一步评估化合物Ⅰ、PFD的抗炎、抗纤维化作用对结核分枝杆菌感染的远期预后是否有影响，我们观察了治疗8周停药12周后各治疗组，实验结果表8所示。
表8不同治疗组小鼠脾、肺组织停药12周后复发情况
结果表明PFD+HRZ、化合物Ⅰ+HRZ、HRZ治疗组小鼠肺脏结核菌复发率分别为：85.7％、42.9％、71.4％；脾脏复发率分别为：71.4％、14.3％、71.4％。其中化合物Ⅰ+HRZ治疗组脾脏复发率较HRZ治疗组明显降低(降低了约80％)。Fisher精确检验比较两组有统计学差异(χ2＝4.67v＝1p＜0.05)。化合物Ⅰ+HRZ治疗组肺组织复发率较HRZ治疗组明显降低(降低了约40％)；化合物Ⅰ+HRZ治疗组脾组织复发率较PFD+HRZ治疗组明显降低(降低了约80％)；化合物Ⅰ+HRZ治疗组肺组织复发率较PFD+HRZ治疗组明显降低(降低了约50％)。通过实验数据未观察到PFD+HRZ治疗组在结核病小鼠中有降低复发率的作用。
在C57BL/6小鼠慢性结核病模型中，三种治疗方案均具有抑菌作用，抑菌效果没有明显的组内差异。化合物Ⅰ可能具有比PFD更突出的优势，尽管其在降低小鼠肺部活菌数量没有显著的作用，但在结核病小鼠的远期疗效中，可以降低结核病小鼠的复发率，尤其是对降低小鼠脾脏的复发率上作用明显。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不违背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (14)

1.一种药物组合，所述药物组合的活性组分包括物质A、物质B、物质C和物质D；
物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
物质B为异烟肼或其药学上可接受的盐；
物质C为利福平或其药学上可接受的盐；
物质D为吡嗪酰胺或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
2.如权利要求1所述的药物组合，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述的药物组合中，所述物质B和所述物质A的重量比为(3：1)-(1：30)；
(2)所述的药物组合中，所述的物质C和所述物质A的重量比为(3：1)-(1：60)；
(3)所述的药物组合中，所述的物质D和物质A的重量比为(30：1)-(1：3)；
(4)所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D采用口服或注射的途径施用；
(5)所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D同时施用或分开施用；
(6)所述药物组合为药物组合物。
3.如权利要求2所述的药物组合，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述的药物组合中，所述物质B和所述物质A的重量比为1：6；
(2)所述的药物组合中，所述的物质C和所述物质A的重量比为1：6；
(3)所述的药物组合中，所述的物质D和所述物质A的重量比为5：2。
4.如权利要求1所述的药物组合，其特征在于，
所述的药物组合中，所述活性组分由所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D组成。
5.一种药物组合物X，其包括物质A、物质B、物质C、物质D和药用辅料；
物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；
物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；
物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
6.如权利要求5所述的药物组合物X，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述药物组合物X由所述物质A、所述物质B、所述物质C、所述物质D和药用辅料组成；
(2)所述药物组合物X以口服剂型形式或注射剂型形式呈现。
7.一种药物组合物Y，其包括第一药物组合物、第二药物组合物、第三药物组合物和第四药物组合物；
所述第一药物组合物包括物质A和药用辅料；物质A为化合物I或其药学上可接受的盐；
所述第二药物组合物包括物质B和药用辅料；物质B为异烟肼(H)或其药学上可接受的盐；
所述第三药物组合物包括物质C和药用辅料；物质C为利福平(R)或其药学上可接受的盐；
所述第四药物组合物包括物质D和药用辅料；物质D为吡嗪酰胺(Z)或其药学上可接受的盐；
所述化合物I的结构如下所示：
8.如权利要求7所述的药物组合物Y，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述药物组合物Y由第一药物组合物、第二药物组合物、第三药物组合物和第四药物组合物组成；
(2)所述第一药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现；
(3)所述第二药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现；
(4)所述第三药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现；
(5)所述第四药物组合物以口服剂型或注射剂型形式呈现。
9.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合、如权利要求5或6所述的药物组合物X或如权利要求7或8所述的药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防结核病的药物中的应用。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合、如权利要求5或6所述的药物组合物X或如权利要求7或8所述的药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺泡炎症的药物中的应用；优选地，所述肺泡炎症为肺结核引起的肺泡炎症。
11.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合、如权利要求5或6所述的药物组合物X或如权利要求7或8所述的药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺结核炎症性肺损伤的药物中的应用。
12.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合、如权利要求5或6所述的药物组合物X或如权利要求7或8所述的药物组合物Y在制备用于治疗和/或预防肺部纤维化的药物中的应用；优选地，所述肺部纤维化为肺结核继发性纤维化。
13.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合、如权利要求5或6所述的药物组合物X或如权利要求7或8所述的药物组合物Y在制备用于降低结核病复发率的药物中的应用；优选地，所述药物用于降低肺组织和/或脾组织结核菌复发率。
14.如权利要求9-13中任一项所述的应用，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D同时施用或分开施用；
(2)所述物质A、所述物质B、所述物质C和所述物质D采用口服或注射的方式施用；
(3)所述异烟肼的给药剂量为10mg/kg-30mg/kg；
(4)所述利福平的给药剂量为5mg/kg-30mg/kg；
(5)所述吡嗪酰胺的给药剂量为100mg/kg-300mg/kg；
(6)所述化合物Ⅰ的给药剂量为10mg/kg-300mg/kg；
优选地，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)所述异烟肼的给药剂量为10mg/kg或25mg/kg；
(2)所述利福平的给药剂量为10mg/kg；
(3)所述吡嗪酰胺的给药剂量为150mg/kg；
(4)所述化合物Ⅰ的给药剂量为25mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、100mg/kg、150mg/kg或200mg/kg。
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