CN117025528A - 一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，公开了一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，工程菌发酵,发酵后收集菌体,然后将菌体裂解,采用异硫氰酸胍进行抽提,将产品纯化；在盐酸浓度为2‑5摩尔时凝胶层析,用还原型和氧化型谷胱甘肽复性,乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即得到rIL‑2，并根据NK细胞表面受体进行设计；采用葡聚糖‑泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞,再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞；细胞的稀释和接种；细胞的培养。本发明提供的培养方法无任何动物血清蛋白类等外源性组分，避免了可能引起的免疫排斥、过敏反应和感染、污染等风险，同时合成方法简单，具有很高的应用价值。

Description

一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，尤其涉及一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法。
背景技术
现有的抗癌治疗技术存在一些局限性和缺陷，这些限制了其在临床应用中的有效性和安全性。以下是对现有技术的缺点进行更为详细的分析：
1)分子靶向治疗
缺点：肿瘤细胞往往会在治疗过程中产生耐药性，使得药物不能再有效地杀死肿瘤细胞。此外，靶向药物往往会对正常细胞产生毒副作用。
2)免疫检查点抑制剂
缺点：免疫检查点抑制剂在一些患者中可能会导致自身免疫反应、严重不良事件的发生，同时只有部分患者对该类治疗有效。
3)过继性免疫细胞治疗
缺点：过继性免疫细胞治疗需要大量的免疫细胞扩增，对于一些患者来说，免疫细胞的扩增可能会遇到技术上的难题和临床上的限制，如细胞质量、扩增时间等问题。此外，由于免疫细胞的来源和个体差异，可能会存在排斥反应和其他潜在的毒副作用。
4)细胞因子疗法
缺点：由于细胞因子的作用机制十分复杂，细胞因子疗法往往会导致全身性炎症反应、多器官功能衰竭等严重不良事件的发生，同时在一些患者中可能会出现药物耐受性。
5)肿瘤疫苗
缺点：肿瘤疫苗需要确定有效的肿瘤抗原，但是不同类型的癌症可能存在抗原异质性，因此寻找适当的肿瘤抗原是一个具有挑战性的过程。此外，肿瘤细胞可能会通过多种机制逃避免疫监视，使得肿瘤疫苗的抗癌效果受到限制。
针对上述技术的缺陷，需要进一步研究相关机制，开发更为精准的治疗方案，以提高治疗效果和降低治疗风险。具体而言，可以从以下几个方面进行细化：
1)分子靶向治疗
需要进一步研究肿瘤细胞耐药机制，并开发更为精准的个体化治疗方案，以避免耐药性和毒副作用的发生。此外，需要加强对靶向药物的监测和管理，以确保疗效和安全性的平衡。
2)免疫检查点抑制剂
需要进一步研究免疫检查点的调节机制，以开发更为有效的治疗策略。同时，需要确定哪些患者适合使用免疫检查点抑制剂，以避免不必要的治疗和潜在的毒副作用。此外，需要加强对免疫检查点抑制剂的监测和管理，以确保治疗的安全性和有效性。
3)过继性免疫细胞治疗
需要进一步研究免疫细胞的扩增和转移技术，以提高治疗效果和降低毒副作用的风险。此外，需要加强对免疫细胞治疗的监测和管理，以避免排斥反应和其他潜在的不良事件。
4)细胞因子疗法
需要进一步研究分子的作用机制和剂量效应，以确保疗效和安全性的平衡。同时，需要开发更为精准的治疗方案，并加强对细胞因子疗法的监测和管理，以避免全身性炎症反应和多器官功能衰竭等严重不良事件的发生。
5)肿瘤疫苗
需要进一步研究肿瘤抗原的识别和验证方法，以确定有效的治疗靶点。同时，需要开发更为精准的个体化治疗方案，以提高疗效和降低免疫耐受和抗原逃逸的风险。此外，需要加强对肿瘤疫苗的监测和管理，以确保疗效和安全性的平衡。
综上所述，针对现有技术的局限性和缺陷，需要进一步深入研究相关机制，开发更为精准的治疗方案，并加强对治疗的监测和管理，以确保治疗的安全性和有效性。此外，需要加强多学科合作，集成各种治疗手段，以实现个体化治疗的最大化效果。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法。
本发明是这样实现的，一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，包括：
S1：工程菌发酵,发酵后收集菌体,然后将菌体裂解,采用异硫氰酸胍进行抽提,将产品纯化；
S2：在盐酸浓度为2-5摩尔时凝胶层析,用还原型和氧化型谷胱甘肽复性,乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即得到rIL-2，并根据NK细胞表面受体进行设计；
S3：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞,再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞；
S4：细胞的稀释和接种；用一定量的X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，350-450g离心3-5min，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml，获得后接种到无菌培养瓶中，再加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的X-VIVO 15培养基；
S5：细胞的培养；将培养瓶放入37℃，5％ CO2的培养箱中，每天轻轻摇动一次。孵化3-10天后，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，用无菌的PBS洗涤两次，得到NK细胞；
S6：细胞的检测；用FACS或其他方法检测NK细胞的表型和功能。
进一步，优化来增强杀伤细胞的增殖和活性的方法为：
S01：选择一种高效的工程菌进行发酵，发酵过程中添加适当的营养物质和诱导剂，以提高目标产物的表达水平；发酵结束后，采集菌体并进行裂解，使用离子交换层析或凝胶过滤层析等方法对目标产物进行初步纯化；
S02：使用亲和层析或其他高效的柱层析技术对初步纯化的目标产物进行进一步纯化和富集；为了避免对产物的损伤，可以在pH值和温度等条件的控制下进行纯化；同时，可以对目标产物进行活性检测，以确认纯化效果和产物的活性；
S03：选择适当的细胞来源，进行细胞的分离和纯化；可以使用密度梯度离心、免疫磁珠分离方法来提高细胞的纯度和活性；
S04：对分离得到的细胞进行稀释和接种，根据所需的细胞密度和体积来确定稀释倍数和接种方式；同时，根据细胞的需求添加适当的培养基和生长因子，以促进细胞的生长和增殖；
S05：对接种后的细胞进行培养和扩增，可以在恒温恒湿、含有适当CO2浓度的培养箱中进行培养；定期观察和记录细胞的生长情况，调整培养条件和生长因子的浓度，以保证细胞的健康和生长；
S06：对培养得到的细胞进行表型和功能的检测，评估细胞的性质和活性；同时，也可以对细胞进行基因表达分析和蛋白质组学研究，以深入了解细胞的分子机制和生物学特性；根据检测结果，可以进一步优化培养条件和生长因子的配比，以提高细胞的生长和活性。
进一步，S1具体实现方法为：在工程菌中表达目标蛋白质，通过发酵，大量生产目标蛋白质；收集菌体后，将其裂解，释放目标蛋白质，然后使用异硫氰酸胍等化学试剂进行抽提，将目标蛋白质从裂解液中纯化出来；
进一步，S2具体实现方法为：通过盐酸凝胶层析技术，根据蛋白质的分子大小和电荷性质，将混合物中的目标蛋白质分离出来；然后，使用还原型和氧化型谷胱甘肽等化学试剂将纯化得到的蛋白质复性，恢复其天然构象和生物活性；接着，使用乙腈等有机溶剂进行洗脱和分离，收集得到具有活性的蛋白质峰；最后，通过低温减压去除乙腈等溶剂，得到纯化的rIL-2；根据NK细胞表面受体的特征，设计rIL-2的结构和性质，以提高其对NK细胞的刺激作用。
进一步，S3：具体实现方法为：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，根据细胞的密度差异，将外周血中的单个核细胞分离出来；随后，使用红细胞裂解液等化学试剂，进一步去除悬浮液中的红细胞，以获得纯净的MNC。
进一步，S4：具体实现方法为：将分离得到的MNC稀释到适当的细胞密度，然后接种到无菌培养瓶中，并加入含有rIL-2的培养基，以促进NK细胞的生长和增殖；离心的目的是使细胞均匀分布在培养基中，保证细胞生长的稳定性和可重复性。
进一步，S5：具体实现方法为：将接种好rIL-2的细胞培养在含有适当气体和温度的培养箱中；在培养过程中，通过轻轻摇动细胞，使其生长均匀；根据细胞密度的变化，调整培养时间和rIL-2的浓度，以保证NK细胞的生长和增殖；当细胞密度达到一定值时，用无菌的PBS洗涤两次，以去除培养基和废弃物，得到纯净的NK细胞。
进一步，S6具体实现方法为：使用细胞分析技术，检测NK细胞的表型和功能，了解细胞的表面标志物、细胞分化状态、生长速度等信息；根据检测结果，评估NK细胞的质量和活性。
进一步，S4：细胞的稀释和接种具体实现方法为：
准备所需的材料和试剂，包括X-VIVO 15培养基、无菌离心管、离心机、MNC细胞；
用X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
将稀释后的MNC细胞用无菌离心管离心，速度为350-450g，离心时间为3-5分钟，以获得细胞沉淀；
弃去上清液，将沉淀的细胞用无菌PBS缓慢洗涤一次，使其悬浮在PBS中；
将洗涤后的细胞用X-VIVO 15培养基进行接种，加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的培养基，使其浓度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
将细胞悬液用无菌技术接种到无菌培养瓶中。
进一步，S5：细胞的培养具体实现方法为：
将接种好的细胞培养瓶放入37℃，5％ CO2的细胞培养箱中；
每天轻轻摇动一次培养瓶，以保证细胞均匀生长；
孵化3-10天后，观察细胞生长情况，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，即可进行后续操作；
用无菌PBS洗涤细胞两次，将细胞沉淀收集，得到NK细胞。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、本发明不需要添加任何动物血清蛋白类组分，避免了可能引起的免疫排斥或过敏反应。同时由于无任何外源性物质，避免了可能引起的感染或污染风险。所述的人工合成多肽可以根据NK细胞表面的受体进行定制设计，提高了特异性和亲和力。本发明中所述的人工合成多肽可以通过简单的化学合成方法制备，降低了成本和复杂度。
第二、本发明增强NK细胞杀伤活性和增殖活性，通过将NK细胞和DC细胞共培养，明显促进NK细胞的增殖并且增强了杀伤活性，避免了现有技术文件中可能存在的免疫排斥、过敏反应、感染或污染风险，提高了特异性和亲和力，同时合成方法简单。
第二，本细胞培养方法旨在增强杀伤细胞(NK细胞)的增殖和活性。以下是每个步骤的优点和积极效果：
S1：工程菌发酵及纯化
优点：工程菌的发酵和纯化过程可实现高产量和高纯度的重组蛋白，如rIL-2。这种方法具有较高的生产效率和成本效益。
积极效果：生产出高质量的rIL-2，为下一步细胞培养提供关键的生长因子。
S2：凝胶层析与复性
优点：凝胶层析可有效地分离和纯化目标蛋白，通过谷胱甘肽复性可恢复蛋白的生物活性。
积极效果：获得具有高生物活性的rIL-2，为后续NK细胞培养提供有效的刺激。
S3：单个核细胞的分离
优点：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法可以有效地从外周血中分离出单个核细胞，红细胞裂解液可进一步去除红细胞，提高纯度。
积极效果：获得高纯度的单个核细胞，为后续NK细胞培养提供良好的起始细胞。
S4：细胞稀释与接种
优点：通过调整细胞密度和培养基组成，可以为NK细胞的增殖和活性提供适宜的生长环境。
积极效果：创造有利于NK细胞增殖和活性的培养条件，提高培养效果。
S5：细胞培养
优点：在恒温、恒湿、适宜CO2浓度的培养箱中进行培养，有助于细胞生长和功能发挥。
积极效果：培养出具有较高增殖和活性的NK细胞，为后续研究和应用提供高质量的细胞材料。
S6：细胞检测
优点：通过FACS或其他方法检测NK细胞的表型和功能，可实时评估培养效果和细胞质量。
积极效果：确保得到的NK细胞具备所需的表型和功能，为后续实验和临床应用提供着可靠的数据支持。
总之，本细胞培养方法通过多个步骤有效地提高了NK细胞的增殖和活性，为研究和临床应用提供了高质量的NK细胞。同时，每个步骤在技术上具有可操作性和成本效益，为实验操作和推广提供了便利。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
1)高效纯化rIL-2：通过工程菌发酵、异硫氰酸胍抽提、盐酸凝胶层析等多个步骤，可以高效、纯化得到rIL-2，保证了NK细胞的生长和增殖所需的生长因子的纯度和活性。
2)高效分离MNC：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和红细胞裂解液，可以快速、高效地分离出外周血中的MNC，减少了其他细胞类型对NK细胞生长和增殖的干扰，提高了NK细胞的纯度和活性。
3)稳定的细胞培养：采用X-VIVO 15培养基和含有适当浓度的rIL-2，可以提供足够的营养和生长因子，保证NK细胞在37℃、5％ CO2的培养箱中稳定地生长和增殖。
4)高纯度的NK细胞：通过多次洗涤和检测，可以得到高纯度的NK细胞，具有较好的表型和功能，可用于进一步研究和应用。
5)可重复性和规模化：该方案的步骤清晰、流程简单，易于操作和控制，可以实现细胞的规模化生产和应用，具有良好的可重复性和稳定性。
综上所述，该方案可以高效、稳定地生产和分离出高质量的NK细胞，为NK细胞的研究和应用提供了可靠的基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法流程图；
图2是本发明实施例提供的增强杀伤细胞增殖和活性的优选方案实验流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，所述增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法具体包括以下步骤：
S1：工程菌发酵,发酵后收集菌体,然后将菌体裂解,采用异硫氰酸胍进行抽提,将产品纯化；
在细胞培养方法中，工程菌的选择对最终产物的质量和产量具有重要影响。以下是一些常用的工程菌株：
1)大肠杆菌(Escherichia coli)：大肠杆菌是常用的原核表达系统，广泛应用于蛋白质的表达和纯化。常用的大肠杆菌工程菌株有BL21(DE3)、DH5α、JM109等。
2)酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)：酵母菌是一种常用的真核表达系统，适用于糖基化或翻译后修饰的蛋白质表达。常用的酵母工程菌株有W303、S288C、CEN.PK等。
3)昆虫细胞(Spodoptera frugiperda)：昆虫细胞是另一种适用于翻译后修饰的真核表达系统。常用的昆虫细胞工程菌株有Sf9、Sf21等。
4)哺乳动物细胞：哺乳动物细胞表达系统适用于复杂翻译后修饰的蛋白质表达。常用的哺乳动物细胞工程菌株有CHO(Chinese hamster ovary)细胞、HEK293(HumanEmbryonic Kidney 293)细胞、COS(CV-1Origin of SV40)细胞等。
5)植物细胞：植物细胞表达系统适用于植物源性蛋白质的表达。常用的植物细胞工程菌株有烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞、拟南芥(Arabidopsis thaliana)悬浮细胞等。
6)藻类细胞：藻类细胞表达系统适用于光合作用相关蛋白质的表达。常用的藻类细胞工程菌株有裸藻(Chlamydomonas reinhardtii)、硅藻(Thalassiosira pseudonana)等。
S2:在盐酸浓度为2-5摩尔时凝胶层析,用还原型和氧化型谷胱甘肽复性,乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即得到rIL-2，并根据NK细胞表面受体进行设计；在该细胞培养方法中,rIL-2指重组白细胞介素-2(recombinant interleukin-2)。
S3:采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞,再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞；
具体地：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞，在试管中，将血液重叠与淋巴细胞分层液(密度1.077g/L)之上离心时，由于粒细胞(1.090g/L)、红细胞(1.092g/L)、淋巴细胞(1.070g/L)的密度不同而相互分开。从顶部到底部可分为四层：血浆、单核细胞、淋巴细胞、粒白细胞及红细胞，再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞。本实施例中分离步骤：20mL外周血在350-450g离心8-15min后，收集上层血浆；下层血细胞用生理盐水进行稀释，将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，700-900g离心15-20min；离心后将含有单个核细胞的上层液体从sepmate离心管中倒出。
S4、细胞的稀释和接种；用一定量的X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，350-450g离心3-5min，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml，获得后接种到无菌培养瓶中，再加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的X-VIVO 15培养基；
S5、细胞的培养；将培养瓶放入37℃，5％ CO2的培养箱中，每天轻轻摇动一次。孵化3-10天后，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，用无菌的PBS洗涤两次，得到NK细胞；
S6、细胞的检测；用FACS或其他方法检测NK细胞的表型和功能。
S4中的参数的意义和作用如下：
-X-VIVO 15培养基：是一种适用于体外培养人类细胞的无血清培养基，可提供营养物质和生长因子以促进细胞增殖和生存。
-MNC：单个核细胞(mononuclear cell)是指细胞核没有聚集在一起形成多个核的细胞，通常是淋巴细胞、单核细胞和造血祖细胞的总称。
-离心：通过离心作用，使得MNC沉淀到离心管底部，分离出细胞和培养基的上清液。
-密度为1.0×106-3.0×106cells/ml：为了确保细胞在培养过程中能够正常生长和分裂，需要将MNC的密度控制在一定范围内。
-rIL-2：重组白介素-2是一种生长因子，可以促进淋巴细胞增殖和活化，是NK细胞培养的必需品。
-Cetus单位/ml：是rIL-2的浓度单位，表示每毫升培养基中含有多少单位的rIL-2。
S5中的参数的意义和作用如下：
-37℃：是NK细胞培养的适宜温度，可以提供适当的热能以促进细胞代谢和生长。
-5％ CO2：是NK细胞培养的适宜CO2浓度，可以维持培养基的酸碱平衡和细胞代谢需要。
-每天轻轻摇动一次：可以保持培养基中细胞和营养物质的均匀分布，促进细胞生长和增殖。
-3-10天：是NK细胞培养的适宜时间范围，可以使细胞达到足够的密度。
-用无菌的PBS洗涤两次：PBS是一种无菌的缓冲液，可以将细胞上的培养基和废物洗掉，以便提取纯净的NK细胞。
以下为对本发明实施例每个步骤的细化和优化，具体如下：
S1：工程菌发酵，收集菌体，菌体裂解，采用异硫氰酸胍进行抽提，将产品纯化。
工作原理：在工程菌中表达目标蛋白质，通过发酵，大量生产目标蛋白质。收集菌体后，将其裂解，释放目标蛋白质，然后使用异硫氰酸胍等化学试剂进行抽提，将目标蛋白质从裂解液中纯化出来。
S2：在盐酸浓度为2-5摩尔时凝胶层析，用还原型和氧化型谷胱甘肽复性，乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即得到rIL-2，并根据NK细胞表面受体进行设计。
通过盐酸凝胶层析技术，根据蛋白质的分子大小和电荷性质，将混合物中的目标蛋白质分离出来。然后，使用还原型和氧化型谷胱甘肽等化学试剂将纯化得到的蛋白质复性，恢复其天然构象和生物活性。接着，使用乙腈等有机溶剂进行洗脱和分离，收集得到具有活性的蛋白质峰。最后，通过低温减压去除乙腈等溶剂，得到纯化的rIL-2。根据NK细胞表面受体的特征，设计rIL-2的结构和性质，以提高其对NK细胞的刺激作用。
S3：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞，再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞。
工作原理：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，根据细胞的密度差异，将外周血中的单个核细胞(MNC)分离出来。随后，使用红细胞裂解液等化学试剂，进一步去除悬浮液中的红细胞，以获得纯净的MNC。
S4：细胞的稀释和接种；用一定量的X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，350-450g离心3-5min，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml，获得后接种到无菌培养瓶中，再加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的X-VIVO 15培养基。
工作原理：将分离得到的MNC稀释到适当的细胞密度，然后接种到无菌培养瓶中，并加入含有rIL-2的培养基，以促进NK细胞的生长和增殖。离心的目的是使细胞均匀分布在培养基中，保证细胞生长的稳定性和可重复性。
S5：细胞的培养；将培养瓶放入37℃，5％ CO2的培养箱中，每天轻轻摇动一次。孵化3-10天后，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，用无菌的PBS洗涤两次，得到NK细胞。
工作原理：将接种好rIL-2的细胞培养在含有适当气体和温度的培养箱中。在培养过程中，通过轻轻摇动细胞，使其生长均匀。根据细胞密度的变化，调整培养时间和rIL-2的浓度，以保证NK细胞的生长和增殖。当细胞密度达到一定值时，用无菌的PBS洗涤两次，以去除培养基和废弃物，得到纯净的NK细胞。
S6：细胞的检测；用FACS或其他方法检测NK细胞的表型和功能。
工作原理：使用流式细胞仪(FACS)等细胞分析技术，检测NK细胞的表型和功能，了解细胞的表面标志物、细胞分化状态、生长速度等信息。根据检测结果，评估NK细胞的质量和活性，为进一步研究和应用提供参考和依据。
作为本申请的优选方案，本申请所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法包括：首先进行工程菌发酵,发酵后收集菌体,然后将菌体裂解,采用异硫氰酸胍进行抽提,将产品纯化,在盐酸浓度为2-5摩尔时凝胶层析,用还原型和氧化型谷胱甘肽复性,乙腈梯度洗脱,收集活性峰,低温减压下快速去除乙腈,即得到rIL-2，并根据NK细胞表面受体进行设计。在使用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离单个核细胞(MNC)，用红细胞裂解液去除红细胞。用X-VIVO 15培养基1稀释MNC，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml。将MNC接种到无菌的培养瓶中，每瓶加入10ml培养基。将培养瓶放入37℃，5％ CO2的培养箱中，每天轻轻摇动一次。在含rIL-2为102-103Cetus单位/ml的X-VIVO 15培养基1中孵化3-10天后，当MNC密度达到1.0×106-6.0×106cells/ml时，收获NK细胞。具体流程图如图2所示。
作为本发明实施例的一个优化方案，可以进一步优化来增强杀伤细胞的增殖和活性：
S01、选择一种高效的工程菌进行发酵，发酵过程中添加适当的营养物质和诱导剂，以提高目标产物的表达水平。发酵结束后，采集菌体并进行裂解，使用离子交换层析或凝胶过滤层析等方法对目标产物进行初步纯化。
S02、使用亲和层析或其他高效的柱层析技术对初步纯化的目标产物进行进一步纯化和富集。为了避免对产物的损伤，可以在pH值和温度等条件的控制下进行纯化。同时，可以对目标产物进行活性检测，以确认纯化效果和产物的活性。
S03、选择适当的细胞来源，如外周血单个核细胞等，进行细胞的分离和纯化。可以使用密度梯度离心、免疫磁珠分离等方法来提高细胞的纯度和活性。
S04、对分离得到的细胞进行稀释和接种，可以根据所需的细胞密度和体积来确定稀释倍数和接种方式。同时，可以根据细胞的需求添加适当的培养基和生长因子，如rIL-2等，以促进细胞的生长和增殖。
S05、对接种后的细胞进行培养和扩增，可以在恒温恒湿、含有适当CO2浓度的培养箱中进行培养。定期观察和记录细胞的生长情况，调整培养条件和生长因子的浓度，以保证细胞的健康和生长。
S06、对培养得到的细胞进行表型和功能的检测，可以使用流式细胞术、细胞增殖和杀伤实验等方法来评估细胞的性质和活性。同时，也可以对细胞进行基因表达分析和蛋白质组学研究，以深入了解细胞的分子机制和生物学特性。根据检测结果，可以进一步优化培养条件和生长因子的配比，以提高细胞的生长和活性。
作为本发明实施例的一个优化方案，S4：细胞的稀释和接种的具体实现方法为：
1)准备所需的材料和试剂，包括X-VIVO 15培养基、无菌离心管、离心机、MNC细胞等；
2)用X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
3)将稀释后的MNC细胞用无菌离心管离心，速度为350-450g，离心时间为3-5分钟，以获得细胞沉淀；
4)弃去上清液，将沉淀的细胞用无菌PBS缓慢洗涤一次，使其悬浮在PBS中；
5)将洗涤后的细胞用X-VIVO 15培养基进行接种，加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的培养基，使其浓度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
6)将细胞悬液用无菌技术接种到无菌培养瓶中。
S5：细胞的培养的具体实现方法为：
1)将接种好的细胞培养瓶放入37℃，5％ CO2的细胞培养箱中；
2)每天轻轻摇动一次培养瓶，以保证细胞均匀生长；
3)孵化3-10天后，观察细胞生长情况，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，即可进行后续操作；
4)用无菌PBS洗涤细胞两次，将细胞沉淀收集，得到NK细胞。
作为本发明实施例的一个优化方案，还可以具体采用以下方案：
1)在细胞稀释和接种前，需要对细胞进行质量控制，包括检测细胞的纯度、活性和细胞数等；
2)在接种细胞前，需要进行无菌操作，避免细胞受到外界污染，影响其生长和活性；
3)在细胞的稀释和接种过程中，需要控制好细胞密度和接种量，以保证细胞的均一性和生长情况；
4)在细胞的培养过程中，需要定期观察细胞生长情况，及时调整培养条件，如细胞密度、培养基成分、CO2浓度等，以促进细胞生长和增殖；
5)在洗涤细胞时，需注意洗涤液的温度和pH值，避免对细胞造成损伤；
6)在收集NK细胞时，需注意保持细胞的完整性和活性，避免细胞受到机械刺激或温度变化等因素的影响。
作为本发明实施例可以采用以下技术方案进行进一步的优化：
1)优化rIL-2的生产：可以采用基因工程技术，将rIL-2基因转入大肠杆菌或酵母等常用的表达宿主中，以获得高效的rIL-2生产。同时，可以采用更高效的纯化方法，如亲和层析、高效液相色谱等技术，提高rIL-2的纯度和活性。
2)优化MNC的分离：除了葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外，还可以采用负选择法，如磁珠分离法或流式细胞术等技术，以更精确地分离出MNC。
3)优化NK细胞的培养：可以采用动态培养技术，如旋转培养或微流控培养等，以提高细胞的生长速率和产量。此外，可以通过优化培养条件，如pH、氧气浓度、营养物质等，进一步提高NK细胞的生长和增殖效率。
4)优化NK细胞的检测：可以采用多参数流式细胞术等高通量检测技术，同时检测细胞的多个性状和功能，以更全面地评估NK细胞的质量和活性。同时，也可以结合细胞生物学和分子生物学等方法，研究NK细胞的分子机制和生理功能。
5)优化生产成本：可以通过改变培养基配方、优化工艺流程、采用自动化设备等方式，降低NK细胞的生产成本，提高生产效率和经济效益。
本发明实施例提供的技术方案是一种制备NK(淋巴细胞相关杀伤细胞)细胞的方法，应用于免疫治疗等领域。具体的应用和产品如下：
能够应用于免疫治疗：
1)免疫治疗：NK细胞具有杀伤肿瘤细胞的能力，可用于治疗多种癌症，如肝癌、结肠癌、肺癌等；
2)细胞治疗：NK细胞可用于治疗某些免疫系统疾病，如自身免疫性疾病；
3)研究：NK细胞也可用于研究免疫系统的相关机制。
能够应用于产品：
1)X-VIVO 15培养基：X-VIVO 15培养基是一种无血清的培养基，适用于多种细胞的培养和扩增；
2)rIL-2：rIL-2是一种重组人白细胞介素-2，可用于促进T细胞和NK细胞的增殖和活化，是NK细胞培养和扩增的重要因子；
3)无菌培养瓶：无菌培养瓶是用于生物实验室中细胞培养和扩增的基本实验器具；
4)无菌离心管：无菌离心管是用于细胞离心和沉淀的基本实验器具；
5)PBS缓冲液：PBS缓冲液是一种无菌的生理盐水缓冲液，适用于细胞的洗涤和收集；
6)NK细胞：NK细胞是经过培养和扩增后，具有杀伤肿瘤细胞能力的淋巴细胞相关杀伤细胞，可用于免疫治疗和研究等领域。
实施例1：
1)使用高效的大肠杆菌工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加异丙基硫代β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目标蛋白表达。
2)通过离子交换层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用亲和层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的外周血中分离单个核细胞，并通过免疫磁珠法进一步提纯NK细胞。
5)使用RPMI-1640培养基对NK细胞进行稀释和接种，并添加适量的IL-2和IL-15作为生长因子。
6)在37℃、5％ CO2的培养箱中培养NK细胞，观察细胞生长情况，并根据需要调整培养条件。
7)通过流式细胞术检测培养得到的NK细胞的表型和功能。
实施例2：
1)使用高效的酵母工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加甲基丙烯酸酯(MCS)诱导目标蛋白表达。
2)通过凝胶过滤层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用疏水层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的脐带血中分离单个核细胞，并通过密度梯度离心法进一步提纯NK细胞。
5)使用X-VIVO 15培养基对NK细胞进行稀释和接种，并添加适量的IL-2和IL-21作为生长因子。
6)在37℃、5％CO2的培养箱中培养NK细胞，观察细胞生长情况，并根据需要调整培养条件。
7)通过流式细胞术检测培养得到的NK细胞的表型和功能。
实施例3：
1)使用高效的昆虫细胞工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加昆虫细胞病毒(baculovirus)感染诱导目标蛋白表达。
2)通过离子交换层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用亲和层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的外周血中分离单个核细胞，并通过免疫磁珠法进一步提纯NK细胞。
5)使用RPMI-1640培养基对NK细胞进行稀释和接种，并添加适量的IL-2和IL-12作为生长因子。
6)在37℃、5％CO2的培养箱中培养NK细胞，观察细胞生长情况，并根据需要调整培养条件。
7)通过流式细胞术检测培养得到的NK细胞的表型和功能。
实施例4：
1)使用高效的哺乳动物细胞工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加适量的激素(如胰岛素)诱导目标蛋白表达。
2)通过凝胶过滤层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用疏水层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的骨髓中分离单个核细胞，并通过密度梯度离心法进一步提纯NK细胞。
5)使用X-VIVO 15培养基对NK细胞进行稀释和接种，并添加适量的IL-2和IL-18作为生长因子。
6)在37℃、5％ CO2的培养箱中培养NK细胞，观察细胞生长情况，并根据需要调整培养条件。
7)通过流式细胞术检测培养得到的NK细胞的表型和功能。
实施例5：
1)使用高效的植物细胞工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加适量的植物激素诱导目标蛋白表达。
2)通过离子交换层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用亲和层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的脐带血中分离单个核细胞，并通过免疫磁珠法进一步提纯NK细胞。
5)使用RPMI-1640培养基对NK细胞进行稀释和接种，并添加适量的IL-2和IL-7作为生长因子。
6)在37℃、5％CO2的培养箱中培养NK细胞，观察细胞生长情况，并根据需要调整培养条件。
7)通过流式细胞术检测培养得到的NK细胞的表型和功能。
实施例6：
1)使用高效的藻类细胞工程菌株进行发酵，发酵过程中添加适量的葡萄糖作为碳源，并在菌体生长到一定密度时添加适量的硝酸盐诱导目标蛋白表达。
2)通过凝胶过滤层析法对菌体裂解液中的目标蛋白进行初步纯化。
3)采用疏水层析法对初步纯化的目标蛋白进行进一步纯化和富集。
4)从健康志愿者的外周血中分离单个核细胞，并通过密度梯
综上所述，通过优化技术方案，可以提高NK细胞的生产效率和质量，进一步拓展其在临床治疗和免疫学研究中的应用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养系统，其特征在于，包括：
工程菌发酵和抽提模块:工程菌发酵生产rIL-2,然后裂解菌体,用异硫氰酸胍抽提纯化rIL-2；
凝胶层析纯化模块:用盐酸和梯度洗脱的乙腈进行凝胶层析,收集rIL-2活性峰,快速除去乙腈,得到高纯rIL-2；
外周血单个核细胞分离模块:通过葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血中的单个核细胞；
细胞稀释和接种模块:将单个核细胞用X-VIVO 15培养基稀释到1.0×106-3.0×106cells/ml,然后接种到无菌培养瓶中；
细胞培养模块:将接种的细胞放入37℃,5％CO2的培养箱中培养3-10天,当细胞密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时,获得NK细胞；
细胞检测模块:用FACS或其他方法检测获得的NK细胞的表型和功能。
2.一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，包括：
S1：工程菌发酵,发酵后收集菌体,然后将菌体裂解,采用异硫氰酸胍进行抽提,将产品纯化；
S2：在盐酸浓度为2-5摩尔时凝胶层析,用还原型和氧化型谷胱甘肽复性,乙腈梯度洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙腈，即得到rIL-2，并根据NK细胞表面受体进行设计；
S3：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法外周血中分离出单个核细胞,再用红细胞裂解液进一步去除悬液中的红细胞；
S4：细胞的稀释和接种；用一定量的X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，350-450g离心3-5min，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml，获得后接种到无菌培养瓶中，再加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的X-VIVO 15培养基；
S5：细胞的培养；将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱中，每天轻轻摇动一次；孵化3-10天后，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，用无菌的PBS洗涤两次，得到NK细胞；
S6：细胞的检测；用FACS或其他方法检测NK细胞的表型和功能。
3.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，进一步优化来增强杀伤细胞的增殖和活性的方法为：
S01：选择一种高效的工程菌进行发酵，发酵过程中添加适当的营养物质和诱导剂，以提高目标产物的表达水平；发酵结束后，采集菌体并进行裂解，使用离子交换层析或凝胶过滤层析方法对目标产物进行初步纯化；
S02：使用亲和层析或其他高效的柱层析技术对初步纯化的目标产物进行进一步纯化和富集；为了避免对产物的损伤，可以在pH值和温度的控制下进行纯化；同时，可以对目标产物进行活性检测，以确认纯化效果和产物的活性；
S03：选择适当的细胞来源，进行细胞的分离和纯化；可以使用密度梯度离心、免疫磁珠分离方法来提高细胞的纯度和活性；
S04：对分离得到的细胞进行稀释和接种，根据所需的细胞密度和体积来确定稀释倍数和接种方式；同时，根据细胞的需求添加适当的培养基和生长因子，以促进细胞的生长和增殖；
S05：对接种后的细胞进行培养和扩增，可以在恒温恒湿、含有适当CO2浓度的培养箱中进行培养；定期观察和记录细胞的生长情况，调整培养条件和生长因子的浓度，以保证细胞的健康和生长；
S06：对培养得到的细胞进行表型和功能的检测，评估细胞的性质和活性；同时，也可以对细胞进行基因表达分析和蛋白质组学研究，以深入了解细胞的分子机制和生物学特性；根据检测结果，可以进一步优化培养条件和生长因子的配比，以提高细胞的生长和活性。
4.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，S1具体实现方法为：在工程菌中表达目标蛋白质，通过发酵，大量生产目标蛋白质；收集菌体后，将其裂解，释放目标蛋白质，然后使用异硫氰酸胍化学试剂进行抽提，将目标蛋白质从裂解液中纯化出来；
S2具体实现方法为：通过盐酸凝胶层析技术，根据蛋白质的分子大小和电荷性质，将混合物中的目标蛋白质分离出来；然后，使用还原型和氧化型谷胱甘肽化学试剂将纯化得到的蛋白质复性，恢复其天然构象和生物活性；接着，使用乙腈有机溶剂进行洗脱和分离，收集得到具有活性的蛋白质峰；最后，通过低温减压去除乙腈溶剂，得到纯化的rIL-2；根据NK细胞表面受体的特征，设计rIL-2的结构和性质。
5.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，
S3具体实现方法为：采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，根据细胞的密度差异，将外周血中的单个核细胞分离出来；随后，使用红细胞裂解液等化学试剂，进一步去除悬浮液中的红细胞，以获得纯净的MNC。
6.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，
S4具体实现方法为：将分离得到的MNC稀释到适当的细胞密度，然后接种到无菌培养瓶中，并加入含有rIL-2的培养基，以促进NK细胞的生长和增殖；离心的目的是使细胞均匀分布在培养基中，保证细胞生长的稳定性和可重复性。
7.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，
S5具体实现方法为：将接种好rIL-2的细胞培养在含有适当气体和温度的培养箱中；在培养过程中，通过轻轻摇动细胞，使其生长均匀；根据细胞密度的变化，调整培养时间和rIL-2的浓度，以保证NK细胞的生长和增殖；当细胞密度达到一定值时，用无菌的PBS洗涤两次，以去除培养基和废弃物，得到纯净的NK细胞。
8.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，
S6具体实现方法为：使用细胞分析技术，检测NK细胞的表型和功能，了解细胞的表面标志物、细胞分化状态、生长速度等信息；根据检测结果，评估NK细胞的质量和活性。
9.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，S4：细胞的稀释和接种具体实现方法为：
准备所需的材料和试剂，包括X-VIVO 15培养基、无菌离心管、离心机、MNC细胞；
用X-VIVO 15培养基对MNC进行稀释，使其密度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
将稀释后的MNC细胞用无菌离心管离心，速度为350-450g，离心时间为3-5分钟，以获得细胞沉淀；
弃去上清液，将沉淀的细胞用无菌PBS缓慢洗涤一次，使其悬浮在PBS中；
将洗涤后的细胞用X-VIVO 15培养基进行接种，加入含rIL-2为102–103Cetus单位/ml的培养基，使其浓度为1.0×106-3.0×106cells/ml；
将细胞悬液用无菌技术接种到无菌培养瓶中。
10.如权利要求2所述的增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法，其特征在于，S5：细胞的培养具体实现方法为：
将接种好的细胞培养瓶放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中；
每天轻轻摇动一次培养瓶，以保证细胞均匀生长；
孵化3-10天后，观察细胞生长情况，当MNC密度达到1.0×106-3.0×106cells/ml时，即可进行后续操作；
用无菌PBS洗涤细胞两次，将细胞沉淀收集，得到NK细胞。
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