CN117018031A - 一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用 - Google Patents

一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用，涉及中药炮制技术领域。该炮制方法包括以净制的鹿角或鹿角盘为原料，经过粉碎、水解、浓缩和凝胶处理，得到所述鹿角胶的步骤；所述鹿角及鹿角盘来源于梅花鹿或马鹿；所述水解为酸水解、碱水解或酶水解。本发明制备的鹿角胶中L‑羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L‑脯氨酸四种氨基酸的含量以及活性肽丰度均显著增加，能够有效激活氧化磷酸化过程，可用于制备多靶点氧化磷酸化激活剂及预防、治疗或缓解氧化磷酸化紊乱介导的相关疾病的药物。

Description

一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂 中的应用
技术领域
本发明涉及中药炮制技术领域，特别是涉及一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用。
背景技术
能量是生命活动的基本动力来源，用以满足生命体生存、繁衍和进化等各种需要。生物体产能主要通过2种途径：氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解(Glycolysis)，其中真核细胞的绝大部分能量依赖于线粒体氧化磷酸化作用的供给。氧化磷酸化是指在有氧条件下，线粒体利用生物氧化过程中释放的自由能，促使二磷酸腺苷(ADP)与无机磷酸盐结合生成三磷酸腺苷(ATP)的过程。
氧化磷酸化由电子传递链和ATP合酶两部分偶联而成。呼吸链主要包含四大复合体：NADH脱氢酶(复合体Ⅰ)、琥珀酸脱氢酶(复合体Ⅱ)、细胞色素c还原酶(复合体Ⅲ)和细胞色素c氧化酶(复合体Ⅳ)。其中，复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ是质子泵，可以将呼吸链产生的氢离子从线粒体基质侧泵送至线粒体内膜间隙侧，在线粒体内膜两侧会形成氢离子浓度差(质子梯度)。而质子梯度又可驱动ATP合酶(复合体Ⅴ)利用ADP与无机磷酸盐结合生成ATP，从而实现氧化与磷酸化的偶联。
在线粒体呼吸链的4种复合体中，复合体Ⅰ最易遭受攻击。目前，已知有超过60种物质可以抑制复合体I的活性，包括杀虫剂、防腐剂、酚类污染物等。这些复合体Ⅰ抑制剂结构上均具有一种类似于泛醌的结构：循环结构的头部和疏水性的尾部。复合体Ⅲ是呼吸链中第2个质子泵；根据作用部位的不同，有4类主要的复合体Ⅲ抑制剂：对苯二酚拮抗剂类、十一烷基羟基醌类、抗霉素类和锌离子。复合体Ⅳ是电子传递链末端的酶，具有质子泵的作用，同时可通过血红素中铁原子的氧化还原变化，把电子传递给还原的氧形成水。复合体Ⅳ抑制剂可分为4类：①血红素抑制剂，如叠氮化物、氰化物和硫化物等；②氧竞争性抑制剂，如一氧化碳和一氧化氮等；③细胞色素c竞争性抑制剂；④非竞争性抑制剂，如磷酸盐离子和碱性条件等。
磷酸化部分，其关键酶ATP合酶又称为复合体Ⅴ，其作用为将ADP和无机磷酸盐合成ATP。已知有很多霉菌可以抑制ATP合酶的活性，典型的有金轮菌素、奥萨霉素、杀黑星菌素和寡霉素等。除了霉菌类，还有许多其他物质同样可以抑制ATP合酶的活性，如个别黄酮类、百草枯、DDT、乙烯雌酚、有机锡等。
考虑到氧化磷酸化过程的特点及其在生物体代谢体系中的特殊作用，ATP通常作为能量物质看待。然而事实上ATP不仅是细胞信号分子，也是一种神经递质。还有与氧化磷酸化关系密切的细胞pH、活性氧物质等，虽然表面上看仅是基础指标的变化，但其涉及的潜在影响却范围极广。内源性物质或环境污染物对于生物体氧化磷酸化的干扰作用，将影响细胞的正常产能，其后果轻则表现出肌无力、低血压、发烧和心绞痛等病理现象，重则器官衰竭、少精无精、衰老、代谢功能低下等，甚至危及生命。而细胞若在有氧状态下功能方式由氧化磷酸化切换为糖酵解，则可能成为细胞癌变的重要发生条件(Warburg效应)。在发育阶段，由于整个发育过程的高度动态性，污染物甚至可能通过影响能量供给而改变细胞行为，最终造成发育程序的紊乱，导致严重的发育效应。
慢性心力衰竭是各类或结构或功能等出现异常的心脏疾患导致心室充盈和(或)射血功能发生障碍，心脏射血量不足以供应机体组织维持正常功能所需的病证，以各个器官或组织供血不足为主要表现，其主要症状为呼吸、体力活动相对受限和身体某些部位或多部位液体潴留，具有愈后差、复发率与死亡率高等特点，也是心血管疾病患者最主要的死亡原因。慢性心力衰竭是病理性心肌肥厚的不良后果，病理性心肌肥厚时，ATP的需求与产生之间的动态平衡发生改变，线粒体难以满足心肌的能量需求，导致失代偿的发生，其临床特征为氧输送不足，代谢失调。线粒体可以将碳水化合物、脂肪、蛋白质转化为ATP，为心脏生理消耗提供能量。线粒体功能障碍在慢性心力衰竭发病中的作用越来越受重视。
运动性疲劳是一种常见的生理反应，与机体的活力和体能状态逐渐下降有关。在1982年第五届国际运动生化会议上将运动性疲劳定义为“机体不能维持其机能在特定水平上和(或)不能维持预定的运动的强度”。线粒体在运动性疲劳中起着至关重要的作用。线粒体是细胞的动力室，在提供能量的同时，也将产生较多的代谢产物。特别是在运动应激下，线粒体处于高还原型NADH和高氧状态，电子转移链上的氧化还原酶也将处于异常还原状态，从而导致ROS生成显著增加和ATP生成减少。同时，线粒体中的Ca2+超载将改变线粒体膜的通透性和流动性，使细胞最终以凋亡的形式死亡，导致运动性疲劳发生及组织损伤。
世界卫生组织规定，精子密度＜20×106/mL为少精子症；精子活力a级＜25％或a+b级精子＜50％为弱精子症。弱精子症又称为精子活力低下。临床上少精子症常常与精子活率低下同时存在，此时称之为少弱精子症。精子获能是精子进行受精活动必备的前提条件，只有在获能的基础上，精子活力才会增加，能量代谢在精子完成受精的过程中有重要作用。精子活力是衡量精液质量和男性生育力的一个重要指标，线粒体功能障碍影响到细胞的有氧代谢，线粒体的ATP合酶与精子活力直接相关。因此，精子线粒体的能量供应在获能期间尤为重要。
衰老，通常是指机体对环境的生理适应能力进行性降低、退化的现象。衰老总体上可分为两类：一种是生理性衰老，另一种是病理性衰老。生理性衰老通常在机体的成熟期后出现，是一种生理性退化，病理性衰老则是由于各种内外环境因素所导致的病理性退化。衰老是各种复杂的病理和生理因素共同作用而出现的必然结果。线粒体功能障碍与衰老的发生密切相关。线粒体衰老理论认为，复制衰老往往伴随着线粒体内膜电位的逐渐下降，以及线粒体功能失调，这说明线粒体功能是衰老的重要成因和表征。
代谢重编程是肿瘤恶性转变的重要标志，与正常细胞相比，癌症的代谢改变主要包括：对葡萄糖、氨基酸摄取失控；营养获取途径多样性；利用糖酵解/三羧酸循环中间产物进行生物合成增加；对氮的需求增加；代谢分子驱动的基因表达失控；代谢分子与微环境相互作用。早在20世纪20年代，德国生化和生理学家Warburg提出了著名的“Warburg效应”，即肿瘤细胞在氧气足以支持线粒体氧化磷酸化的情况下，仍偏好采用糖酵解的方式进行代谢。这种低效但快速的代谢方式消耗了肿瘤微环境中大量的葡萄糖，合成了肿瘤快速增殖所需要的前体物质，同时分泌的乳酸形成了免疫抑制微环境，为肿瘤的增殖和转移提供了良好的物质基础和环境。
总之，线粒体氧化磷酸化发生障碍，将直接影响细胞生长、代谢和信号转导，从而影响到各个组织脏器的功能，进而导致整个生命体功能障碍、疾病发生和发展、代谢改变和衰老发生等生命现象。保持细胞氧化磷酸化稳态，激活受抑制的线粒体氧化磷酸化过程，对生命活动来说具有重要意义，因此有必要开发多靶点氧化磷酸化激活剂，从而为开发预防、治疗或缓解氧化磷酸化紊乱介导的相关疾病的药物奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种鹿角胶及其炮制方法和在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备的鹿角胶中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸四种氨基酸的含量以及活性肽丰度均显著增加，能够有效激活氧化磷酸化过程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鹿角胶的炮制方法，包括以净制的鹿角或鹿角盘为原料，经过粉碎、水解、浓缩和凝胶处理，得到所述鹿角胶的步骤；
所述鹿角为梅花鹿或马鹿的鹿角；
所述鹿角盘为梅花鹿或马鹿的鹿角盘；
所述水解为酸水解、碱水解或酶水解。
优选地，所述水解为酸水解。
进一步地，所述酸水解采用的酸性物质选自醋、醋酸、盐酸、硫酸、苹果酸和琥珀酸中的至少一种；
所述碱水解采用的碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的至少一种；
所述酶水解采用的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种。
进一步地，当所述水解为酸水解时，将所述原料粉碎后加入醋进行酸水解；所述原料和所述醋的质量比为1:(5-10)；所述酸水解的温度为80-120℃，时间为2h-15d；所述醋为米醋。
进一步地，当所述水解为碱水解时，所述碱水解采用的碱性物质为氢氧化钠；所述原料和所述氢氧化钠的质量比为1:(0.05-1)；所述碱水解的温度为90-120℃，时间为4h-20d。
进一步地，当所述水解为酶水解时，所述酶水解采用的酶为木瓜蛋白酶；所述原料和所述木瓜蛋白酶的质量比为1:(0.003-0.25)；所述酶水解的温度为30-50℃，时间为8-24h。
本发明还提供根据上述的炮制方法制备得到的鹿角胶在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用。
进一步地，所述的多靶点氧化磷酸化激活剂同时激活NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1和ATP5G2。
本发明还提供根据上述的炮制方法制备得到的的鹿角胶在制备预防、治疗或缓解氧化磷酸化紊乱介导的疾病的药物中的应用。
进一步地，所述氧化磷酸化紊乱介导的疾病的表现包括心肌细胞能量代谢低下、肝细胞能量代谢低下、慢性心力衰竭、运动性疲劳、少弱精子症、衰老和Warburg效应诱导的癌症。
本发明公开了以下技术效果：
按照本发明的炮制方法制备得到的鹿角胶，与传统鹿角胶相比，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸四种氨基酸含量显著增加，活性肽丰度显著增加，并产生数十种独有活性肽，如肝羧酸酯酶、CD177抗原亚型X2、3-酮酰基-辅酶A硫解酶，线粒体异构体X4、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、L-乳酸脱氢酶A链异构体X3、嗅觉受体2G2等。
氧化磷酸化由电子传递链和ATP合酶两部分偶联而成，按照本发明的炮制方法制备得到的鹿角胶，能够通过靶向激活相关基因，显著上调NADH脱氢酶、细胞色素c还原酶、细胞色素c氧化酶和ATP合酶，从而激活氧化磷酸化过程。
按照本发明的炮制方法制备得到的鹿角胶具有精准的靶点治疗效果，相对于传统鹿角胶，作用效果更佳。通过药理实验证实，本发明鹿角胶具有多靶点氧化磷酸化激活剂样作用，可用于制备预防、治疗或缓解氧化磷酸化紊乱介导的相关疾病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例15不同实验组H9C2及BRL细胞ATP含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图2为实施例15不同实验组H9C2及BRL细胞氧化磷酸化相关基因mRNA表达水平的检测结果；其中，A为H9C2细胞的NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；B为H9C2细胞的CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；C为BRL细胞的NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；D为BRL细胞的CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图3为实施例16不同实验组大鼠血浆BNP含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图4为实施例16不同实验组大鼠心脏组织ATP含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图5为实施例16不同实验组大鼠心脏组织氧化磷酸化相关基因mRNA表达水平的检测结果；其中，A为NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；B为CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图6为实施例17不同实验组大鼠血浆BUN(A)及CK(B)含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：**P＜0.01；
图7为实施例17不同实验组大鼠骨骼肌ATP含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图8为实施例17不同实验组大鼠骨骼肌氧化磷酸化相关基因mRNA表达水平的检测结果；其中，A为NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；B为CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：**P＜0.01；
图9为实施例18不同实验组小鼠精子密度(A)及精子活力(B)的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图10为实施例18不同实验组小鼠睾丸组织ATP含量的检测结果；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图11为实施例18不同实验组小鼠睾丸组织氧化磷酸化相关基因mRNA表达水平的检测结果；其中，A为NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；B为CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；与空白组相比：##P＜0.01；与模型组相比：**P＜0.01；
图12为实施例19不同实验组秀丽隐杆线虫存活天数的统计结果；与空白组相比：*P＜0.05；
图13为实施例19不同实验组秀丽隐杆线虫氧化磷酸化相关基因mRNA表达水平的检测结果；其中，A为NDUFA2、NDUFA3和NDUFB3基因；B为CYC1、COX6B1和ATP5G2基因；与空白组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；
图14为实施例20不同实验组HepG2细胞活力的检测结果；与空白组相比：**P＜0.01；
图15为实施例20不同实验组HepG2细胞葡萄糖消耗量及乳酸产生量的检测结果；与空白组相比：**P＜0.01。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明开发了一种鹿角胶的炮制方法，以满足制备多靶点氧化磷酸化激活剂的需求，该鹿角胶具体是以净制梅花鹿或马鹿鹿角(或盘)为原料，经粉碎、水解、浓缩、凝胶和切胶步骤制得。
其中，水解分为酸水解、碱水解、酶解；酸水解中的酸选自醋、醋酸、盐酸、硫酸、苹果酸或琥珀酸等有机或无机酸；碱水解中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾等；酶解中的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或风味蛋白酶等蛋白水解酶。
以下分别以梅花鹿鹿角和马鹿鹿角为原料，以米醋、氢氧化钠和木瓜蛋白酶分别作为酸、碱和酶，对本发明的炮制方法进行说明：
实施例1
5倍量米醋(总酸含量为4g/100g)80℃酸水解15天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于150μm的粉末，加入粉末5倍质量的米醋，80℃酸水解15天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3后，将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例2
10倍量米醋(总酸含量为4g/100g)120℃酸水解2小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于1mm的粉末，加入粉末10倍质量的米醋，120℃酸水解2小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例3
10倍量米醋(总酸含量为4g/100g)80℃酸水解15天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于0.2cm的颗粒，加入粉末10倍质量的米醋，80℃酸水解15天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例4
5倍量米醋(总酸含量为4g/100g)120℃酸水解2小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于300μm的粉末，加入粉末5倍质量的米醋，120℃酸水解2小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例5
5倍量1％氢氧化钠溶液90℃碱水解20天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于0.5mm的粉末，加入粉末5倍质量的1％氢氧化钠溶液，90℃碱水解20天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例6
10倍量10％氢氧化钠溶液120℃碱水解4小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于2mm的颗粒，加入粉末10倍质量的10％氢氧化钠溶液，120℃碱水解4小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例7
5倍量5％氢氧化钠溶液90℃碱水解20天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于0.2cm的颗粒，加入粉末5倍质量的5％氢氧化钠溶液，90℃碱水解20天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例8
10倍量5％氢氧化钠溶液120℃碱水解4小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于2mm的颗粒，加入粉末10倍质量的5％氢氧化钠溶液，120℃碱水解4小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例9
3倍量0.1％木瓜蛋白酶溶液30℃碱水解1天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于150μm的粉末，加入粉末3倍质量的0.1％木瓜蛋白酶溶液，调整溶液pH值为6，30℃水解1天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例10
5倍量5％木瓜蛋白酶溶液50℃碱水解8小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于150μm的粉末，加入粉末5倍质量的5％木瓜蛋白酶溶液，调整溶液pH值为6.5，50℃水解8小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例11
3倍量2.5％木瓜蛋白酶溶液30℃碱水解1天+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于150μm的粉末，加入粉末3倍质量的2.5％木瓜蛋白酶溶液，调整溶液pH值为7，30℃水解1天后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
实施例12
5倍量2.5％木瓜蛋白酶溶液50℃碱水解8小时+浓缩制胶：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：
鹿角粉碎至粒径小于150μm的粉末，加入粉末5倍质量的2.5％木瓜蛋白酶溶液，调整溶液pH值为6.5，50℃水解8小时后过滤，滤液即为鹿角胶胶液；鹿角胶胶液加热浓缩至其密度达到1.4kg/m3，然后将浓缩液冷凝切块，晾干。
对比例1
传统鹿角胶加工炮制方法：
将净制的梅花鹿鹿角和马鹿鹿角分别进行如下操作，制备得到两种鹿角胶：将鹿角锯段，漂泡洗净，加入五倍量水，水煎两次，滤过，合并滤液，静置，滤取胶液，浓缩至密度达到1.4kg/m3，冷凝切块，晾干。
实施例13
L-羟脯氨酸(Hyp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)及L-脯氨酸(Pro)含量测定：
1.色谱条件
层析柱：阳离子交换色谱柱LCAK07/Li(4.6×150mm)；氨基酸分析仪的流动相：A相为柠檬酸锂(0.12N，pH 2.90)、B相为柠檬酸锂(0.2N，pH 4.20)、C相为柠檬酸锂(0.3N，pH8.00)，D相为锂再生液(0.45N/Li)；流速：缓冲泵0.45mL/min，缓冲泵的梯度洗脱程序为：0min：80％A+20％B、3min：79％A+21％B、8min：61％A+39％B、20min：43％A+57％B、32min：100％B、38min：100％C、43min：76％C+24％D、57min：76％C+24％D、57.10min：100％D、61.10min：100％D、61.20min：100％A、73min：100％A；柱温箱温度程序为：0min：42℃；25min：42℃；40min：60℃；46min：74℃；62min：74℃；68min：42℃；73min：42℃；茚三酮衍生泵流速为0.25mL/min，时间为60min，反应器温度为130℃；检测器为紫外检测器，波长为570nm和440nm；进样量50μL。
2.对照品溶液
分别取Hyp对照品、Gly对照品、Ala对照品及Pro对照品，精密称定，加20mol/L的盐酸溶液溶解并稀释成浓度为1μmol/mL的混合对照品储备溶液。精密量取2mL置100mL量瓶中，加20mol/L的盐酸溶液至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
3.供试品溶液
将实施例1至实施例12和对比例1中制得的鹿角胶分别粉碎，过60目筛后，分别进行如下操作：
精密称取30mg粉末，放入安瓿瓶中，加入5mL的6mol/L的盐酸溶液，充入高纯氮气并迅速于喷灯封口，然后置于110℃恒温干燥箱内，水解24小时后取出，冷却至室温，打开封口，将水解液过滤至25mL容量瓶中，用超纯水冲洗安瓿瓶，合并滤液，定容至刻度。精密吸取0.5mL滤液于离心管内，以真空离心浓缩仪去除溶剂，温度60℃，重复蒸干2次。加入1mL样品稀释液复溶，震荡混匀，用0.22μm水系微孔滤膜过滤后，供上机测定使用。
4.测定方法
对照品溶液和供试品溶液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。
5.实验结果
检测结果如表1所示，由表1结果可见，采用本发明所述的水解鹿角胶加工炮制方法，可使鹿角胶中的Hyp、Gly、Ala及Pro含量增加。其中，酸水解可使Hyp含量提高44-78％，Gly含量提高15-50％，Ala含量提高54-86％，Pro含量提高33-69％；碱水解可使Hyp含量提高15-44％，Gly含量提高18-30％，Ala含量提高46-81％，Pro含量提高22-66％；酶解可使Hyp含量提高22-44％，Gly含量提高16-20％，Ala含量提高30-78％，Pro含量提高21-61％。
表1不同加工炮制方法所获得的鹿角胶中的各活性成分的含量(％)
样品 HYP Gly Ala Pro 样品 HYP Gly Ala Pro
实施例1(梅花鹿) 10.42 23.73 10.54 14.49 实施例1(马鹿) 10.43 22.78 9.89 13.54
实施例2(梅花鹿) 11.17 23.24 9.71 13.71 实施例2(马鹿) 11.43 24.57 10.34 13.76
实施例3(梅花鹿) 11.41 26.35 10.26 13.31 实施例3(马鹿) 12.43 27.97 10.76 15.34
实施例4(梅花鹿) 12.86 28.92 11.74 16.90 实施例4(马鹿) 12.76 27.76 11.34 15.31
实施例5(梅花鹿) 8.34 24.31 9.19 14.51 实施例5(马鹿) 8.85 23.98 9.46 13.67
实施例6(梅花鹿) 10.45 24.92 11.44 16.59 实施例6(马鹿) 10.35 24.78 11.43 15.78
实施例7(梅花鹿) 8.96 24.03 10.26 12.20 实施例7(马鹿) 9.14 23.76 10.21 12.78
实施例8(梅花鹿) 9.91 23.70 9.43 13.54 实施例8(马鹿) 10.31 23.71 9.59 13.21
实施例9(梅花鹿) 10.42 23.13 11.21 16.12 实施例9(马鹿) 10.12 22.89 10.54 15.76
实施例10(梅花鹿) 9.57 22.37 8.18 13.02 实施例10(马鹿) 9.21 21.69 8.31 12.47
实施例11(梅花鹿) 8.82 22.69 8.97 12.13 实施例11(马鹿) 7.99 21.87 9.04 12.67
实施例12(梅花鹿) 9.71 22.95 10.19 12.63 实施例12(马鹿) 9.12 22.45 10.01 12.56
对比例1(梅花鹿) 7.24 19.24 6.31 10.01 对比例1(马鹿) 7.21 19.22 6.12 9.45
实施例14
活性肽丰度测定：
1.样品处理
实施例1至实施例12及对比例1中制得的鹿角胶分别采用SDT裂解法提取蛋白质，然后分别采用BCA法进行蛋白质定量。每个样品取适量蛋白质采用FASP方法进行胰蛋白酶酶解，采用C18 Cartridge对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量(OD280)。
2.LC-MS/MS检测
每份样品采用纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱(100μm×2cm，nanoViper C18)，经过分析柱(10cm，ID75μm，3μm，C18-A2)分离，流速为300nL/min。
样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围300-1800m/z，一级质谱分辨率为70000at 200m/z，AGC target为1e6，MaximumIT为50ms，动态排除时间为60.0s。多肽和多肽碎片的质量电荷比，按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，MS2 Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率：17500at 200m/z，Normalized Collision Energy为30eV，Underfill为0.1％。
3.质谱数据解析
使用搜库软件为MaxQuant(v1.6.14)。LC-MS类型为Standard；固定修饰为Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)，并允许最大5个可变修饰；消化酶为Trypsin/P，并允许2个最大漏切；一级质谱匹配容差在初次检索中设置为20ppm，主要检索中设置为6ppm；二级质谱匹配容差设置为20ppm；勾选“matchbetweenruns”；鉴定结果设置：肽段、蛋白质水平的FDR均为1％。为了得到高质量的分析结果，分析结果需要做进一步的数据过滤。鉴定结果需要去除匹配反库和污染蛋白质的PSM、肽段以及蛋白质，且每个蛋白质至少需要包含一个特异性(Razor)肽段。
4.差异化分析
标准化处理后，对蛋白质进行差异定量分析，筛选出在差异分组中各组样本间差异表达的蛋白质。
5.实验结果
不同加工炮制方法所获得的鹿角胶中的活性肽数量及相对于对比例1独有多肽数量如表2所示，可见，采用本发明的炮制方法，可使鹿角胶中活性肽丰度增加，水解可产生多种独有多肽。表3展示了实施例4、实施例6及实施例9中相较于对比例1的传统鹿角胶得分前十的独有活性肽。
表2不同加工炮制方法所获得的鹿角胶中的活性肽数量及相对于对比例1独有多肽数量
样品 活性肽数量 独有活性肽数量 样品 活性肽数量 独有活性肽数量
实施例1(梅花鹿) 475 61 实施例1(马鹿) 475 57
实施例2(梅花鹿) 444 59 实施例2(马鹿) 490 62
实施例3(梅花鹿) 487 52 实施例3(马鹿) 483 58
实施例4(梅花鹿) 499 64 实施例4(马鹿) 490 41
实施例5(梅花鹿) 425 43 实施例5(马鹿) 450 39
实施例6(梅花鹿) 485 45 实施例6(马鹿) 480 44
实施例7(梅花鹿) 422 42 实施例7(马鹿) 428 40
实施例8(梅花鹿) 436 36 实施例8(马鹿) 442 38
实施例9(梅花鹿) 465 55 实施例9(马鹿) 461 51
实施例10(梅花鹿) 433 53 实施例10(马鹿) 425 48
实施例11(梅花鹿) 404 46 实施例11(马鹿) 400 49
实施例12(梅花鹿) 421 52 实施例12(马鹿) 411 50
对比例1(梅花鹿) 389 0 对比例1(马鹿) 376 0
表3实施例4、实施例6及实施例9相较于传统鹿角胶得分前十的独有活性肽
优选酸水解鹿角胶中Hyp、Gly、Ala和Pro含量以及活性肽丰度均最高的实施例4、6、9制得的水解梅花鹿鹿角胶及马鹿鹿角胶，与对比例1中制得的传统梅花鹿鹿角胶及马鹿鹿角胶进行药理作用评价及对比，具体见实施例15-20。
实施例15水解鹿角胶提高心肌细胞及肝细胞能量代谢
1.细胞株
大鼠心肌细胞(H9C2)及大鼠肝细胞(BRL)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
2.实验方法
2.1细胞培养
H9C2和BRL细胞分别在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中培养，培养温度为37℃、CO2浓度为5％。
2.2ATP水平测定
细胞以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中。当细胞融合达到60％-70％时，模型组细胞经1mmol/L的H2O2刺激1小时后更换为正常培养基培养24小时；给药组细胞经1mmol/L的H2O2刺激1小时后更换含有各组相应的鹿角胶含药血清(鹿角胶0.6g/kg/d连续7天灌胃大鼠后分离血清)培养基培养24小时；空白组同一时间正常换液后培养24小时。各组培养24小时后，按照ATP含量测定试剂盒的说明，测定各组细胞ATP水平。
2.3RT-qPCR验证氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
利用信使RNA 3′端polyA结构及相关分子生物学技术，对H9C2和BRL细胞样本完整total RNA分别进行提取，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA(反转录PCR反应在55℃下进行5min，然后在90℃下进行20s)，然后，进行实时荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参基因。
3.实验结果
3.1ATP水平
各组ATP水平检测结果见图1，根据检测结果可知：水解鹿角胶可改善过氧化氢引起的心肌细胞及肝细胞能量代谢低下，提高ATP水平，且效果显著优于传统鹿角胶。
3.2氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
各组氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平检测结果见图2，结果显示：相较于模型组，水解鹿角胶组可显著上调氧化磷酸化相关基因：NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1及ATP5G2的mRNA表达，且显著优于传统鹿角胶。结合3.1结果可知：水解鹿角胶可通过上调氧化磷酸化相关基因的表达，激活氧化磷酸化途径，促进ATP的合成，改善心肌细胞及肝细胞能量代谢低下。
实施例16水解鹿角胶治疗慢性心力衰竭
1.动物处理
110只体重200±5g之间的SPF级SD雄性成年大鼠，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司。实验条件：温度24±2℃，湿度55％±5％，光/暗循环12小时，标准饲料喂养，自由进食进水。
2.建立慢性心力衰竭大鼠模型及给药
110只大鼠每组10只，随机分成11组，分别为：空白组、模型组、曲美他嗪组、各传统鹿角胶及水解鹿角胶组。实验开始首日，空白组腹腔注射生理盐水(30mg/kg)，其余组腹腔注射阿霉素(30mg/kg)进行造模，每周2次，共6周。自实验开始首日，曲美他嗪组组每天灌胃给药曲美他嗪(10mg/kg)，各鹿角胶组灌胃给药对应鹿角胶(0.6g/kg/d)，空白组及模型组灌胃等体积生理盐水。
3.指标测定
3.1血浆脑利钠肽(BNP)含量测定
末次给药后，禁食24h，用2％戊巴比妥钠(50mL/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取血，收集全血至肝素抗凝管后，静置半小时后，离心10分钟，离心后上层黄色液体为血浆。根据RatBNP Elisa试剂盒的说明测定各组大鼠血浆BNP含量。
3.2心脏组织ATP水平测定
末次给药后，禁止进食24h，用2％戊巴比妥钠(50mL/kg)麻醉大鼠，迅速分离并取出心脏，按照ATP含量检测试剂盒的说明测定心脏组织中的ATP水平。
3.3RT-qPCR验证氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平
利用信使RNA 3′端polyA结构及相关分子生物学技术，对大鼠心脏组织样本完整total RNA进行提取，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA(反转录PCR反应在55℃下进行5min，然后在90℃下进行20s)，然后，进行实时荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参基因。
4.实验结果
4.1血浆BNP含量
各组血浆BNP含量检测结果见图3，结果可见：水解鹿角胶能显著降低慢性心力衰竭大鼠血浆BNP含量，且显著优于传统鹿角胶。
4.2心脏组织ATP水平
各组心脏组织ATP水平检测结果见图4，结果可见：水解鹿角胶能显著提高慢性心力衰竭大鼠心脏组织中ATP含量，且显著优于传统鹿角胶。
4.3氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
各组氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平检测结果见图5，结果可见：相较于模型组，水解鹿角胶能显著上调氧化磷酸化相关基因：NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1及ATP5G2的mRNA表达，传统鹿角胶则无显著性差异。结合4.1及4.2结果可知：水解鹿角胶可通过上调氧化磷酸化相关基因的表达，激活氧化磷酸化途径，促进心脏ATP的合成，治疗慢性心力衰竭。
实施例17水解鹿角胶缓解运动性疲劳
1.动物处理
100只体重200±5g之间的SPF级SD雄性成年大鼠，动物来源及实验条件同实施例16。
2.建立运动性疲劳大鼠模型及给药
适应性喂养及游泳训练一周后，每组10只随机分为10组，分别为空白组、模型组、各传统鹿角胶水解鹿角胶组。6周游泳训练方案为：每天负重5％游泳60分钟，每周训练6天，休息1天，共六周。空白组正常饲养，不进行训练。给药方式采用运动后1小时灌胃给药，每周6次，持续6周。各鹿角胶组给药对应鹿角胶，剂量为0.6g/kg灌胃2mL，空白组与模型组在同时间灌胃同体积生理盐水。
3.指标测定
3.1测定血浆尿素氮(BUN)及肌酸激酶(CK)水平
末次运动后24小时，大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠进行麻醉(50mL/kg)，腹主动脉取血，收集全血至肝素抗凝管后，离心10分钟，离心后上层黄色液体为血浆。按照试剂盒的说明，使用试剂盒分别测定大鼠血浆BUN含量和CK酶活。
3.2测定骨骼肌ATP含量
末次运动后24小时，大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠进行麻醉(50mL/kg)，摘取骨骼肌组织。取骨骼肌组织100mg，按照试剂盒的说明，使用ATP含量检测试剂盒测定其ATP含量。
3.3RT-qPCR验证氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
利用信使RNA 3′端polyA结构及相关分子生物学技术，对其骨骼肌组织样本完整total RNA进行提取，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA(反转录PCR反应在55℃下进行5min，然后在90℃下进行20s)，然后，进行实时荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参基因。
4.实验结果
4.1BUN及CK水平
各组血浆BUN及CK水平检测结果见图6，结果可见：造模后，大鼠血浆BUN及CK水平显著上升，提示造模成功。与模型组相比，各水解解鹿角胶组大鼠血浆BUN及CK水平显著下降，而传统鹿角胶组血浆BUN及CK水平与模型组水平并未有显著性差异。
4.2骨骼肌ATP水平
各组骨骼肌ATP水平检测结果见图7，结果可见：模型大鼠骨骼肌ATP水平显著下降；而各水解鹿角胶组骨骼肌ATP水平相较于模型组显著上升，且效果均明显优于传统鹿角胶。
4.3氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
各组氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平的检测结果见图8，结果可见：相较于模型组，水解鹿角胶能显著上调氧化磷酸化相关基因：NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1及ATP5G2的mRNA表达，传统鹿角胶则无显著性差异。结合4.1及4.2结果可知：水解鹿角胶可通过上调氧化磷酸化相关基因的表达，激活氧化磷酸化途径，促进骨骼肌ATP的合成，缓解运动性疲劳。
实施例18水解鹿角胶治疗少弱精子症
1.动物处理
110只体重20±2g之间的SPF级KM雄性成年小鼠，动物来源与实验条件同实施例16。
2.建立少弱精子症小鼠模型及给药
适应性喂养1周后，110只小鼠每组10只，随机分成空白组、模型组、橼酸氯米芬组、各传统鹿角胶及水解鹿角胶组。实验开始首日，空白组腹腔注射生理盐水(30mg/kg)，其余组腹腔注射环磷酰胺(60mg/kg)进行造模，持续5天。造模后，橼酸氯米芬组每天灌胃给药橼酸氯米芬(5mg/kg/d)，各鹿角胶组灌胃给药对应鹿角胶(0.6g/kg/d)，空白组及模型组灌胃等体积生理盐水，持续四周。
3.指标测定
3.1精子参数测定
末次给药24小时后，以2％戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后摘取附睾，将附睾尾部放入4mL，37℃台氏液中，用眼科剪充分剪碎，然后用移液枪稍吹打溶液，于37℃恒温箱内孵育5分钟，然后吸取上层清液稀释6倍后，取10μL悬液滴于精子计数板上，在自动精子分析仪中分析各组精子密度及活力。
3.2睾丸ATP水平测定
末次给药24小时后，以2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，摘取睾丸，按照试剂盒的说明，使用ATP含量检测试剂盒测定其ATP含量。
3.4RT-qPCR验证氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
利用信使RNA 3′端polyA结构及相关分子生物学技术，对小鼠睾丸组织样本完整total RNA进行提取，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA(反转录PCR反应在55℃下进行5min，然后在90℃下进行20s)，然后，进行实时荧光定量PCR反应，以GAPDH为内参基因。
4.实验结果
4.1精子参数测定
各组精子参数测定结果见图9，结果可见：水解鹿角胶可显著提高少弱精子症小鼠精子数量及活力，且效果显著优于传统鹿角胶。
4.2睾丸组织ATP水平测定
各组睾丸组织ATP水平测定结果见图10，结果可见：水解鹿角胶能显著提高少弱精子症小鼠睾丸组织中ATP含量，且显著优于传统鹿角胶。
4.3氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
各组氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平的检测结果见图11，结果可见：相较于模型组，水解鹿角胶能显著上调氧化磷酸化相关基因：NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1及ATP5G2的mRNA表达，且显著优于传统鹿角胶。结合4.1及4.2结果可知：水解鹿角胶可通过上调氧化磷酸化相关基因的表达，激活氧化磷酸化途径，促进小鼠睾丸组织ATP的合成，治疗少弱精子症。
实施例19水解鹿角胶抗衰老效果评价
1.分组及给药
取秀丽隐杆线虫L4幼虫每组100条，随机分成9组，分别为空白组、各传统鹿角胶及水解鹿角胶组。各鹿角胶组秀丽隐杆线虫L4幼虫分别放入含有2mg/mL相应鹿角胶的NGM平板上培养，空白组放入不含药物的NGM平板上培养。
2.指标测定
2.1寿命测定
以不能移动的秀丽隐杆线虫标记为死亡；每天计数，每组实验重复3次；计算各组秀丽隐杆线虫的平均寿命。
2.2RT-qPCR验证氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
给药三天后测定线虫中氧化磷酸化相关基因的mRNA表达量。用M9缓冲液反复多次清洗待测线虫，利用离心机低速离心沉降线虫1分钟，吸取上清液。使用Trizol试剂通过匀浆器在低温下研磨充分，从中提取总RNA。根据逆转录酶试剂盒的说明书进行逆转录，收集逆转录得到的cDNA，进行PCR荧光定量。将act-1作为线虫体内基因转录水平的看家基因。
3.实验结果
3.1寿命测定
各组寿命测定结果见图12，结果可见：与空白组相比，水解鹿角胶可显著提高秀丽隐杆线虫寿命，传统鹿角胶与空白组则无显著性差异。
3.2氧化磷酸化相关基因的mRNA表达
各组氧化磷酸化相关基因的mRNA表达水平检测结果见图13，结果可见：相较于空白组，水解鹿角胶能显著上调氧化磷酸化相关基因：NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1及ATP5G2的mRNA表达，传统鹿角胶则无显著性差异。结合3.1结果可知：水解鹿角胶可通过上调氧化磷酸化相关基因的表达，激活氧化磷酸化途径，起到抗衰老的作用。
实施例20水解鹿角胶抑制Warburg效应
1.细胞株：人肝癌细胞(HepG2)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
2.细胞培养：HepG2细胞在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的MEM(含NEAA)中培养，培养温度为37℃、CO2浓度为5％。
3.指标测定
3.1细胞毒性测定：细胞以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中。当细胞融合达到60％-70％时，给药组换液含有对应鹿角胶含药血清(同实施例15)培养基处理48h，空白组同一时间换液正常培养基培养48h。并向每个孔中添加10μL CCK-8，并在37℃下培养2小时。使用微孔板读取器测量吸光度。
3.2细胞内葡萄糖消耗和乳酸产生量：细胞以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中。当细胞融合达到60％-70％时，给药组换液含有对应鹿角胶含药血清培养基，空白组同一时间换液正常培养基。细胞换上含药培养基与正常培养基后1h分别吸取培养液100μL留样，以相应培养基作为0h样本。采用紫外分光光度计测定培养基中葡萄糖和乳酸的浓度。
4.实验结果
4.1细胞毒性测定
细胞毒性测定结果见图14，结果可见：水解鹿角胶可显著抑制HepG2细胞的增殖，传统鹿角胶组细胞活力与空白组相比则无显著性差异。
4.2细胞内葡萄糖消耗和乳酸产生量
细胞内葡萄糖消耗和乳酸产生量的检测结果见图15，结果可见：水解鹿角胶可显著降低HepG2细胞的葡萄糖消耗量及乳酸产生量，传统鹿角胶组细胞葡萄糖消耗量及乳酸产生量与空白组则无显著性差异。结合4.1结果可知：水解鹿角胶可抑制HepG2细胞的Warburg效应，从而抑制其增殖。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鹿角胶的炮制方法，其特征在于，包括以净制的鹿角或鹿角盘为原料，经过粉碎、水解、浓缩和凝胶处理，得到所述鹿角胶的步骤；
所述鹿角为梅花鹿或马鹿的鹿角；
所述鹿角盘为梅花鹿或马鹿的鹿角盘；
所述水解为酸水解、碱水解或酶水解。
2.根据权利要求1所述的炮制方法，其特征在于，所述水解为酸水解。
3.根据权利要求1所述的炮制方法，其特征在于，所述酸水解采用的酸性物质选自醋、醋酸、盐酸、硫酸、苹果酸和琥珀酸中的至少一种；
所述碱水解采用的碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的至少一种；
所述酶水解采用的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的炮制方法，其特征在于，当所述水解为酸水解时，将所述原料粉碎后加入醋进行酸水解；所述原料和所述醋的质量比为1:(5-10)；所述酸水解的温度为80-120℃，时间为2h-15d；所述醋为米醋。
5.根据权利要求3所述的炮制方法，其特征在于，当所述水解为碱水解时，所述碱水解采用的碱性物质为氢氧化钠；所述原料和所述氢氧化钠的质量比为1:(0.05-1)；所述碱水解的温度为90-120℃，时间为4h-20d。
6.根据权利要求3所述的炮制方法，其特征在于，当所述水解为酶水解时，所述酶水解采用的酶为木瓜蛋白酶；所述原料和所述木瓜蛋白酶的质量比为1:(0.003-0.25)；所述酶水解的温度为30-50℃，时间为8-24h。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的炮制方法制备得到的鹿角胶在制备多靶点氧化磷酸化激活剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多靶点氧化磷酸化激活剂同时激活NDUFA2、NDUFA3、NDUFB3、CYC1、COX6B1和ATP5G2。
9.一种如权利要求1-6任一项所述的炮制方法制备得到的鹿角胶在制备预防、治疗或缓解氧化磷酸化紊乱介导的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述氧化磷酸化紊乱介导的疾病的表现包括心肌细胞能量代谢低下、肝细胞能量代谢低下、慢性心力衰竭、运动性疲劳、少弱精子症、衰老和Warburg效应诱导的癌症。
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