CN117015597A - 用于细胞治疗剂制造的系统、装置和方法 - Google Patents

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CN117015597A CN202280020621.9A CN202280020621A CN117015597A CN 117015597 A CN117015597 A CN 117015597A CN 202280020621 A CN202280020621 A CN 202280020621A CN 117015597 A CN117015597 A CN 117015597A
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安德鲁·W·麦克法兰
P·J·比米勒
G·K·斯塔德勒
A·J·马斯楚安尼
J·J·卡迪尔里维拉
达西·K·凯利-葛林尼
强纳森·克劳德·德瑞根·赫伯德
N·C·马克斯
L·V·勒
K-C·林
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Bruker Cellular Analysis Inc
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Berkeley Lights Inc
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Abstract

本文公开了用于制造适合配制为细胞治疗剂的细胞群的盒，以及用于操作盒和执行产生适合配制为细胞治疗剂的细胞群的方法的系统和仪器。适合配制为细胞治疗剂的细胞群可以是免疫细胞，例如T淋巴细胞，包括内源性T细胞(ETC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CAR T细胞、TCR工程化T细胞或以其他方式工程化的T细胞。所述系统和方法可以很大程度上是自动的。

Description

用于细胞治疗剂制造的系统、装置和方法
交叉引用
本申请要求于2021年1月12日提交的美国临时申请No.63/136,211、于2021年12月29日提交的美国临时申请No.63/294,839和于2022年1月7日提交的美国临时申请No.63/297,649的优先权，出于所有目的，每个上述申请均通过引用全文并入本文。
发明背景
细胞治疗剂提供了成功治疗许多不同疾病的潜在有效方法。然而，迄今为止，很少有细胞疗法被批准用于患者，部分原因是难以以一致和可预测的方式制造疗法。此外，现有的用于细胞疗法制造的方法成本高昂且缺乏可扩展性。产品质量和释放测试是细胞疗法的制造和递送给患者的成本和开发周期的重要部分。参见例如于2021年1月11日访问的https://www.sagentia.com/files/2018/07/Quality-control-testing-in-CAR-T-cell-manufacture.pdf。尽管自动细胞培养系统已问世多年(参见例如Sharma等人，2011年)，但迄今为止，尚不存在能够实现QC测量自动化和小型化的集成解决方案从而通过同时减少手动操作和劳动步骤、材料成本、污染风险以及样品和介质要求来确保细胞治疗剂安全性的技术解决方案。在细胞毒性T细胞疗法的情况下，通过抗原呈递树突细胞激活T淋巴细胞是制备肿瘤靶向细胞毒性T淋巴细胞的一种方法。然而，树突细胞的使用成本高昂、劳动强度大，并且经常产生不一致的结果，这使得合成激活表面对于T细胞治疗剂的有成本效益的制造至关重要。因此，需要细胞疗法制造系统，其提供以有成本效益且可扩展的方式可靠地生产细胞治疗剂所必需的自动化水平和一致性。本公开的一些实施方案涉及此类细胞疗法制造系统和使用此类系统来生产高质量治疗剂(包括细胞毒性T细胞治疗剂)的方法。
发明内容
本公开的各个方面包括根据各种实施方案的用于制造细胞群的盒(cartridge)。用于制造细胞群的盒可以包括具有入口端口和出口端口的密封外壳。在各种实施方案中，密封外壳可以是气密性密封的和/或无菌的。在各种实施方案中，第一流体网络可以连接到出口端口和/或第二流体网络可以连接到入口端口；任选地，第一和第二流体网络可以互连。在各种实施方案中，盒可以包括第一、第二、第三等试剂储存器，每个试剂储存器均可以连接到第一流体网络和/或第二流体网络。在各种实施方案中，分析(或测定)区域可以连接到第一流体网络。在各种实施方案中，分析区域可以包括微流体芯片或装置，其可以包括流动区域和任选地从流动区域开口的隔离坞。在各种实施方案中，盒可以包括用于培养细胞的室(例如生物反应器)，其中该室包括多个开口，包括用于将流体引入到室中的第一输入开口、用于从室中去除流体的第一输出开口和用于从室中去除流体的第二输出开口。在各种实施方案中，细胞培养室的第一和第二输出开口定位在室内不同的垂直高度处。在各种实施方案中，细胞培养室经由第一和/或第二输出开口与第一流体网络之间的连接而连接到出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个。在各种实施方案中，盒可以包括用于细胞培养基的第一储存器。在各种实施方案中，用于细胞培养基的第一储存器可以连接到第二流体网络。在各种实施方案中，细胞培养室经由第一输入开口与第二流体网络之间的连接而连接到入口端口和用于细胞培养基的第一储存器中的每一个。在各种实施方案中，细胞培养室的底座的内表面包括限定在其上的多个凹入特征。在各种实施方案中，室的底座的内表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定半球形空腔、圆锥形空腔或细长空腔；任选地，每个细长空腔的长轴可基本上平行于多个凹入特征的每隔一个细长空腔的长入口。在各种实施方案中，多个凹入特征的每个空腔被配置成容纳约500纳升至约2.5微升、或约900纳升至约2.1微升的体积。在各种实施方案中，细胞培养室包括至少20ml(例如至少50ml或至少100ml)的体积、面积为至少150cm2(例如至少200cm2或至少250cm2)的底座表面以及底座表面中合计空腔体积为大于1.0ml(例如约1.0ml至约6.0ml、约1.0ml至约4.0ml或约1.5ml至约3.5ml)的多个凹入特征。
本公开的各个方面包括根据各种实施方案的用于操作盒的系统(或仪器)。在各种实施方案中，系统/仪器包括能够接收盒的接收元件。该盒可以是本文公开或建议的任何盒。在各种实施方案中，该系统包括被配置成与盒和接收元件接合的盒保持器(例如，以在盒和接收元件之间提供结构和/或功能桥)。例如，接收元件可以包括或可被配置成与盒保持器接合并支撑盒保持器，并且盒保持器可被配置成与盒接合。在各种实施方案中，盒保持器可以至少部分地包围盒。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括能够调节盒的细胞培养室/生物反应器的温度的第一加热和冷却元件。在各种实施方案中，第一加热和冷却元件可以集成到盒保持器中。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括第二(或另外的)加热和冷却元件，其能够调节除细胞培养室/生物反应器之外的盒的区域(例如测定区域，例如微流体芯片和/或试剂储存器)的温度。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括一个或多个(例如多个)空气流量调节器，每个空气流量调节器能够与盒接合(例如经由管道)并且可控且独立地向盒提供加压气体。加压气体可以在进入盒之前被过滤。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括一个或多个(例如多个)流体流量调节器，以及任选的一个或多个用于容纳流体的对应的储存器，每个流体流量调节器能够与盒接合(例如经由管路)并且可控且独立地向盒提供流体(例如培养基、试剂、洗涤缓冲液、配制介质等)的流。流体的流可以在进入盒之前被过滤。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括用于移动(例如移位、倾斜、摇动和/或振荡)盒的致动器。在各种实施方案中，盒的移动可以引起存在于盒(例如盒的生长室/生物反应器)内的流体的搅动。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括一个或多个阀致动器，用于控制(例如打开、关闭、旋转)集成到盒中的阀(例如控制在盒内的流体流动的阀)。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括磁性套件，其被配置成选择性地将磁力施加到盒(例如施加到盒的细胞培养室/生物反应器)。在某些实施方案中，磁性套件可以可移动地安装在系统/仪器内，使得磁性套件被配置成当需要向盒(例如细胞培养室/生物反应器)施加磁力时移动靠近盒并且当不需要向盒施加磁力时远离盒。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括：检测器，例如相机(例如数码相机)，用于检测来自盒的一个或多个组件(例如分析区域、例如集成的微流体装置)的光和/或接收其影像；以及任选的光学系统，用于将光从盒传送至检测器和/或将光投射到盒的一个或多个组件(例如分析区域，例如集成的微流体装置)上。在各种实施方案中，系统/仪器还可以包括一个或多个辅助组件，例如具有各种电子组件的电路板、流体源、传感器等。在各种实施方案中，系统/仪器可以包括与第一(和第二，或另外的，如果存在的话)加热和冷却元件、一个或多个空气流量调节器、一个或多个流体流量调节器、盒致动器、磁性套件、检测器(和光学系统，如果存在的话)和/或辅助组件(例如流体源和/或传感器)联通的控制器模块。例如，控制器模块能够控制一套第一(或第二)加热和冷却元件(例如，以调节生长室的温度)、控制一个或多个空气流量调节器中的每一个(例如，以控制盒内的流体操作)、控制一个或多个流体流量调节器的每一个(例如，以向细胞培养室/生物反应器供应培养基、试剂、洗涤缓冲液、配制介质等)、控制致动器(例如，以控制盒内(包括在生长室/生物反应器内)流体的移动和/或混合，或控制盒上的阀门)、控制磁性套件(例如，将其移动靠近或远离盒)、控制检测器和/或光学系统(例如，以获得包括分析区域在内的盒组件的影像)和/或控制辅助组件。
本公开的各个方面包括根据各种实施方案的用于制造适合配制为细胞治疗剂的细胞群的方法。在各种实施方案中，该方法可以包括将来自受试者的细胞样品引入到盒的入口端口中。该盒可以是本文公开或建议的任何盒。在各种实施方案中，该方法可以包括将细胞样品从盒的入口端口运输至盒的室(例如细胞培养室/生物反应器)。在各种实施方案中，该方法可以包括在适合细胞增殖的条件下在盒的室中孵育细胞样品。在各种实施方案中，该方法可以包括搅动盒以重悬室中存在的增殖的细胞样品。在各种实施方案中，该方法可以包括将增殖的细胞样品的第一部分从盒的室转移至盒的第一分析(或测定)区域。在各种实施方案中，该方法可以包括分析细胞样品的第一部分的细胞计数和/或细胞特征。在各种实施方案中，该方法可以包括任选地重复孵育、重悬、转移和分析的步骤一次或多次(例如，以产生进一步增殖的细胞样品)。在各种实施方案中，该方法可以包括从盒中输出增殖(或进一步增殖)的细胞样品。在各种实施方案中，细胞样品可以是哺乳动物细胞样品(例如人类细胞样品)。在各种实施方案中，细胞样品可以包括外周血单核细胞(PBMC)、基本上由其组成或由其组成。
附图简要说明
图1A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统的示例。
图1B和1C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。
图2A和2B示出了根据本公开的一些实施方案的隔离坞。
图2C示出了根据本公开的一些实施方案的详细的隔离坞。
图2D-F示出了根据本公开的一些其他实施方案的隔离坞。
图2G示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置。
图2H示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置的经涂覆的表面。
图3A示出了根据本公开的一些实施方案的与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统的一个具体示例。
图3B示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。
图4是根据本公开的一个实施方案的T细胞激活途径的图示。
图5A和5B是根据本公开的各种实施方案制备抗原呈递表面的示意图。
图6是根据本公开的一个实施方案的制备抗原呈递表面的方法的示意图。
图7是根据本公开的一个实施方案的第一阶段刺激和培养之后激活的T淋巴细胞的分布的图示，比较了使用抗原呈递珠激活与树突细胞激活。
图8是根据本公开的一个实施方案的第二阶段刺激和培养之后激活的T淋巴细胞的分布的图示，比较了使用抗原呈递珠激活与树突细胞激活。
图9是与树突细胞激活相比，在7天和14天时T淋巴细胞激活的各种表征参数的图示。
图10是共价功能化的聚苯乙烯珠在所选功能化步骤的傅立叶变换红外光谱的图示。
图11A-11D是根据本公开的一个实施方案用于T细胞激活的各种表征参数的图示。
图12A-12E是根据本公开的一个实施方案的细胞产物表征的图示。
图13是根据本公开的一个实施方案的细胞产物表征的图示。
图14是根据本公开的一个实施方案的细胞毒性实验的图示。
图15A-15C是根据本公开的一个实施方案的细胞产物表征的图示。
图16A-16F是根据本公开的一些实施方案使用抗原呈递表面进行激活的表征的图示。
图17A-17I是根据本公开的一些实施方案使用抗原呈递表面进行激活的表征的图示。
图18A-18F是根据本公开的一些实施方案使用抗原呈递表面进行激活的表征的图示。
图19A-19B是根据本公开的一些实施方案的在抗原特异性细胞毒性测定中与T淋巴细胞和Caspase-3底物接触后在选定时间点拍摄的靶细胞的图像。
图19C是根据本公开的一些实施方案的抗原特异性细胞毒性测定的过程的图示。
图20A-20E是根据一些实施方案的使用抗原呈递表面获得的细胞产物的表征的图示。
图21A示出了根据各种实施方案的细胞样品分选过程的示意性流程图。
图21B示出了根据各种实施方案的与合成抗原呈递表面结合的T细胞的T细胞受体。
图22是根据本公开的各种实施方案用于生产用于细胞疗法的产品的示例性细胞疗法工作流程的示意性框图。
图23A示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的示意性框图。
图23B示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的示例性配置。
图23C示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的示例性配置。
图23D示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的各种组件的示例性配置。
图23E示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的各种组件的示例性配置。
图23F示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的各种组件的另一个示例性配置。
图23G示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的盒保持器的一个示例。
图23H是根据各种实施方案的图23G的与盒接合并包围盒的盒保持器的图像。
图23I示出了根据各种实施方案的示例性盒和盒保持器的分解视图。
图23J示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的示例性配置。
图23K示出了根据各种实施方案的与细胞疗法制造系统的各种组件连接的外部(介质)袋的示例性配置。
图23L示出了根据各种实施方案的与细胞疗法制造系统的各种组件连接的外部袋的示例性配置。
图23M示出了根据各种实施方案的可以被配置成控制CTMS的系统控制器的示例性配置。
图24A示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统盒的示意性框图。
图24B-24C是根据本公开的一些实施方案的示例性盒和盒的细胞生长室的图像。
图24D是根据各种实施方案的生物反应器表面的图示。
图24E是根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的生物反应器的图示。
图24F示出了根据各种实施方案的包括具有预设温度的一个或多个区、区域或组件的盒。
图24G示出了根据各种实施方案的盒的示例性配置。
图24H-24I是根据各种实施方案的生物反应器表面的图示。
图25A示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的工艺流程图。
图25B示出了根据各种实施方案的用于将细胞引入到细胞疗法制造系统中的工艺流程图。
图25C示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行细胞培养(例如T细胞扩增)的工艺流程图。
图25D示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行分选后测定的工艺流程图。
图25E示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行激活测定的工艺流程图。
图25F示出了根据各种实施方案的使用细胞疗法制造系统的转导方法的工艺流程图。
图25G示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行转导测定的工艺流程图。
图25H示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行细胞计数测定的工艺流程图。
图25I示出了根据各种实施方案的使用细胞疗法制造系统的生物反应器监测方法的工艺流程图。
具体实施方式
本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的元件大小可以被夸大或者可以不成比例。此外，当在本文中使用术语“在...上”、“附接到”、“连接到”、“耦接到”或类似词语时，一个元件(例如材料、层、衬底等)可以“在另一元件上”、“附接到另一元件”、“连接到另一元件”或“耦接到另一元件”，而不论该一个元件是直接位于该另一元件上、附接、连接或耦接到该另一元件，还是在该一个元件与该另一元件之间存在一个或多个中间元件。而且，除非上下文另有所指，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在…下、在…上、上部、下部、水平、竖直、“x”、“y”、“z”等)，它们是相对地且仅作为示例提供的，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。此外，在提及元件列表(例如，元件a、b、c)的情况下，这种提及旨在包括所列出的元件的任何一个本身、少于全部列出的元件的任何组合和/或全部所列出的元件的组合。本说明书中的段落划分仅为了便于查看，并且不限制所讨论元件的任何组合。
在微流体特征的大小被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴大小来描述该大小，这两个大小均位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面。在一些情况下，诸如通道或通路的微流体特征的横截面积可以参照x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。
为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则本说明书和权利要求中使用的所有表示数量、百分比或比例的数字以及其他数值应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰，其程度为它们还没有被如此修改。“约”指示基本上不影响所描述主题的性质的变化程度，例如在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数至少应当考虑所报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。
I.术语的示例性描述
本文所用的μm意指微米，μm3意指立方微米，pL意指皮升，nL意指纳升，并且μL(或uL)意指微升。
本文所用的“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许从绝对或完美状态、大小、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，诸如本领域普通技术人员可以预期的，但这些变化对整体性能没有明显影响。当与数值或者可以表示为数值的参数或特征一起使用时，“基本上”意指在百分之十之内。
术语“数个”意指多于一个。本文所用的术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
本文所用的“烷基”是指仅由碳和氢原子组成、不含不饱和度、具有1至6个碳原子的直链或支链烃链基团(例如C1-C6烷基)。每当在本文中出现时，诸如“1至6”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至6个碳原子”是指烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等、最多且包括6个碳原子组成，尽管本定义还涵盖其中未指定数值范围的术语“烷基”的出现。在一些实施方案中，它是C1-C3烷基。典型的烷基包括但不以任何方式限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基等。烷基通过单键连接至分子的其余部分，例如甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、己基等。
除非说明书中另有具体说明，否则烷基可任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地为：芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羟基、卤素、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、三甲基硅烷基、-OR’、-SR’、-OC(O)-R’、-N(R’)2、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OC(O)N(R’)2、-C(O)N(R’)2、-N(R’)C(O)OR’、-N(R’)C(O)R’、-N(R’)C(O)N(R’)2、N(R’)C(NR’)N(R’)2、-N(R’)S(O)tR’(其中t为1或2)、-S(O)tOR’(其中t为1或2)、-S(O)tN(R’)2(其中t为1或2)或PO3(R’)2，其中每个R’独立地是氢、烷基、氟代烷基、芳基、芳烷基、杂环烷基或杂芳基。
如本文所提及的，氟化烷部分是烷部分的一个或多个氢被氟取代基替换的烷部分。全氟化烷部分的所有与烷部分连接的氢均被氟取代基替换。
如本文所提及的，“卤素”部分是溴、氯或氟部分。
如本文所提及的，“烯属”化合物是含有“烯烃”部分的有机分子。烯烃部分是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的基团。分子的非烯烃部分可以是任何类别的有机分子，并且在一些实施方案中，可以包括烷基或氟化(包括但不限于全氟化)烷部分，其中任何一个都可以被进一步取代。
本文所用的“空气”是指地球大气中占主导地位的气体的组成。四种最丰富的气体是氮气(通常以约78体积％的浓度存在，例如，在约70-80％的范围内)、氧气(在海平面上通常以约20.95体积％存在，例如在约10％至约25％的范围内)、氩气(通常以约1.0体积％存在，例如在约0.1％至约3％的范围内)和二氧化碳(通常以约0.04％存在，例如在约0.01％至约0.07％的范围内)。空气中可能含有其他微量气体，如甲烷、一氧化二氮或臭氧，微量污染物和有机物质，如花粉、柴油微粒等。空气可以包括水蒸气(通常以约0.25％的量存在，或者可以在按体积计约10ppm至约5％的范围内存在)。空气可以作为过滤的受控组合物提供用于培养实验，并且可以如本文所述进行调节。
本文所用的术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
本文所用的术语“布置(disposed)”在其含义内涵盖“位于”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是一种装置，其包括被配置成容纳流体的一个或多个离散微流体回路，每个微流体回路包括流体互连的回路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、室和/或坞，以及被配置成允许流体(以及任选地，悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置的至少一个端口。通常，微流体装置的微流体回路将包括流动区域，其可以包括微流体通道和至少一个室，并且将容纳小于约1mL，例如小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、或2μL的流体体积。在某些实施方案中，微流体回路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体回路可配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。
如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是具有包含至少一个回路元件的微流体回路的一种类型的微流体装置，该至少一个回路元件被配置成保持小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可以包括多个回路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000个或更多个)。在某些实施方案中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置成保持以下流体体积：约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或者1至50nL。在其他实施方案中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置成保持以下流体体积：约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或者250至750nL。
微流体装置或纳米流体装置在本文中可以被称为“微流体芯片”或“芯片”；或者“纳米流体芯片”或“芯片”。
本文所用的“微流体通道”或“流动通道”或“通道”是指盒或集成在其中的微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直大小。例如，通道可以是水平或垂直大小的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍或更长。在一些实施方案中，微流体装置中的通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括其间的任何值。在一些实施方案中，微流体装置中的通道的水平大小为约100微米至约1000微米(例如约150至约500微米)，并且垂直大小为约25微米至约200微米(例如约40至约150微米)。应当注意，微流体装置中的通道可以具有多种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，通道可以是或包括具有以下构造的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降、分叉(例如多个不同的流动路径)及其任何组合。此外，通道沿其路径可具有不同的横截面积(扩宽和收缩)，以在其中提供期望的流体流动。通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域已知的任何类型。包括阀的微流体通道的示例公开于美国专利6,408,878和9,227,200中，每一篇均通过引用整体并入本文。
本文所用的术语“透明”是指允许可见光穿过而在光穿过时基本上不改变它的材料。
本文所用的“明场”照明和/或图像是指来自广谱光源的微流体视场的白光照明，其中对比度由视场中的物体对光的吸收形成。
如本文所用，“结构光”是经调制以提供一种或多种照明效果的投射光。第一照明效果可以是投射光照亮设备表面的一部分而不照亮(或至少最小化照亮)表面的相邻部分，例如用于激活DEP衬底内的DEP力的投射光图案，如下文更全面描述的。当使用结构光模式来激活DEP力时，强度(例如结构光调制器如DMD的占空比变化)可用于改变施加到光激活DEP致动器的光功率，从而改变DEP力而无需更改标称电压或频率。可由结构光产生的另一种照明效果包括投射光，其可针对表面不规则性和与光投射本身相关联的不规则性进行校正，例如，在照明场的边缘处衰减。结构光通常由结构光调制器生成，例如数字镜像器件(DMD)、微快门阵列系统(MSA)、液晶显示器(LCD)等。用结构光对表面的小区域(例如选定的目标区域)进行照明改善信噪比(SNR)，因为仅对选定的目标区域的照明减少了杂散/散射光，从而降低图像的暗度水平。结构光的一个重要方面是它可能会随着时间的推移而迅速改变。来自结构光调制器(例如DMD)的光图案可用于自动聚焦于困难的目标，例如干净的镜子或远离焦点的表面。通过使用干净的镜子，可以复制许多自测试特征，如调制传递函数和场曲率/倾斜的测量，而无需更昂贵的Shack-Hartmann传感器。在结构光模式的另一种用途中，可以使用简单的功率计代替相机在样品表面测量空间功率分布。结构光模式也可用作光学模块/系统组件对齐的参考特征，以及用作手动对焦的手动读数。通过使用结构光模式可能实现的另一种照明效果是选择性固化，例如微流体装置内水凝胶的固化。
如本文所用，术语“微物体”通常指代根据本公开可被隔离和/或操纵的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、玻璃珠、无定形固体底物、LuminexTM珠等)；磁珠；微棒；微丝；量子点等；生物微物体，如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制剂)；脂质纳米筏等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包被的微珠、脂质体包被的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价连接的部分/分子，如荧光标记、蛋白(包括受体分子)、碳水化合物、抗原、小分子信号部分或能够在测定中使用的其他化学/生物种类。在一些变形中，包括部分/分子的珠/固体底物可以是捕获珠，例如，配置成选择性或非选择性地结合邻近存在的分子，包括小分子、肽、蛋白质或核酸。在一个非限制性示例中，捕获珠可以包括被配置成结合具有特定核酸序列的核酸的核酸序列，或者捕获珠的核酸序列可以被配置成结合具有相关核酸序列的一组核酸序列。任何一种类型的结合都可以理解为是选择性的。当进行结构不同但物理化学相似的分子的结合时，含有部分/分子的捕获珠可以非选择性地结合，例如，大小排阻珠或沸石被配置成捕获选定大小或电荷的分子。例如，在Ritchie et al.(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in PhospholipidBilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中描述了脂质纳米筏。
本文所用的术语“细胞”与术语“生物细胞”互换使用。生物细胞的非限制性示例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞，如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼类细胞等，原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等，从组织分离的细胞，如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝、肺、神经组织等，免疫细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等，胚胎(例如受精卵)、卵母细胞、卵细胞、精子细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。
如果一个生物细胞集落中所有能够繁殖的活细胞均源自单一亲本细胞的子细胞，那么该集落就是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过10次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过14次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过17次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过20次分裂的单一亲本细胞。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。
本文所用的生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000、或大于1000个细胞)。
本文所用的术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞有活力和/或扩增所必需的条件。
如本文所用，当提及细胞时，术语“扩增”是指细胞数量的增加。
如本文所指，“气体可渗透的”是指材料或结构对于氧气、二氧化碳或氮气中的至少一种是可渗透的。在一些实施方案中，气体可渗透材料或结构对于氧气、二氧化碳和氮气中的多于一种是可渗透的，并且可进一步对于所有这三种气体都是可渗透的。
流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生化分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着向下的浓度梯度的热力学运动。
短语“介质的流动”意指主要由于扩散以外的任何机制引起的流体介质的整体运动，并且可以包括灌注。例如，介质的流动可涉及由于点之间的压力差引起的流体介质从一个点到另一个点的运动。这种流动可以包括液体的连续流动、脉冲流动、周期性流动、随机流动、间歇性流动或往复流动，或者其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质中时，会产生介质的湍流和混合。流动可以包括将溶液拉动通过和拉出微流体通道(例如，抽吸)或将流体推入和推动通过微流体通道(例如灌注)。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，当对时间进行平均时，该流速小于材料组分(例如，目标分析物)扩散到流体介质中或流体介质内的扩散速率。流体介质中组分的流速(即平流)除以该组分的扩散速率的比率可以用无量纲佩克莱数(Peclet number)表示。因此，微流体装置内的一个区域在佩克莱数小于1时基本上没有流动。与微流体装置内特定区域相关的佩克莱数可能随所考虑的流体介质的一种或多种组分(例如，目标分析物)而变化，因为流体介质中的一种或多种组分的扩散速率可能取决于例如，温度；该一种或多种组分的大小、质量和/或形状，以及该一种或多种组分与流体介质之间的相互作用的强度。在某些实施方案中，与微流体装置的特定区域和位于其中的组分相关的佩克莱数可以是0.95或更小、0.9或更小、0.85或更小、0.8或更小、0.75或更小、0.7或更小、0.65或更小、0.6或更小、0.55或更小、0.5或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小、0.1或更小、0.05或更小、0.01或更小、0.005或更小或0.001或更小。
如本文中关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上填充有液体(诸如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单一体(single body)。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上一定是相同的。相反，微流体装置的不同的流体连接区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，诸如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，由于溶质沿着它们各自的向下的浓度梯度运动和/或由于流体流经装置，这些成分不断变化。
本文所用的“流动路径”是指限定介质流的轨迹并经历介质流的轨迹的一个或多个流体连接的回路元件(例如，(多条)通道、(多个)区域、(多个)室等)。因此，流动路径是微流体装置的扫过区域的示例。其他回路元件(例如，未扫过区域)可以与包括流动路径而不经历流动路径中的介质流的回路元件流体连接。
如本文所使用的，“隔离微物体”将微物体限制到微流体装置内的限定区域。
本文所用的“移入坞中(pen)”或“移入坞中(penning)”是指将微物体置于微流体装置内的室(例如隔离坞)内。用于将微物体移入坞中的力可以是本文所述的任何合适的力，如介电泳(DEP)，例如光致动介电泳力(OEP)；重力；磁力；或倾斜。在一些实施方案中，将多个微物体移入坞中可以重新定位基本上所有的微物体。在一些其他实施方案中，可以将选定数量的多个微物体移入坞中，并且可以将多个微物体的剩余部分不移入坞中。在一些实施方案中，当将选定的微物体移入坞中时，可以使用DEP力例如光学致动DEP力或磁力重新定位所选定的微物体。通常，可以将微物体引入微流体装置的流动区域，例如微流体通道，并通过移入坞中而引入室中。
本文所用的“从坞中移出(unpen)”或“从坞中移出(unpenning)”是指将微物体从室(例如隔离坞)内重新定位到微流体装置的流动区域(例如微流体通道)内的新位置。用于从坞中移出微物体的力可以是本文所述的任何合适的力，如介电泳，例如光学致动介电泳力；重力；磁力；或倾斜。在一些实施方案中，从坞中移出多个微物体可以重新定位基本上所有的微物体。在一些其他实施方案中，可以从坞中移出选定数量的多个微物体，并且多个微物体的剩余部分可以不从坞中移出。在一些实施方案中，当从坞中移出选定的微物体时，可以使用DEP力例如光学致动DEP力或磁力来重新定位所选定的微物体。
本文所用的“导出(export)”或“导出(exporting)”是指将微物体从微流体装置的流动区域(例如微流体通道)内的一个位置重新定位到微流体装置外部的位置(例如96孔板或其他接收容器)。具有通向微流体通道的开口的室的定向允许容易地输出已定位或重新定位(例如，从室的坞中移出)以设置在微流体通道内的微物体。微流体通道内的微物体可以被输出，而不需要拆卸(例如，去除装置的盖)或将工具插入到室或微流体通道中以移出微物体以用于进一步处理。
微流体(或纳米流体)装置可以包括“扫过(swept)”区域和“未扫过”(unswept)区域。本文所用的“扫过”区域由微流体回路的一个或多个流体互连回路元件组成，当流体正在流经微流体回路时，每个流体互连回路元件都经受着介质流。扫过区域的回路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分室。本文所用的“未扫过”区域由微流体回路的一个或多个流体互连回路元件组成，当流体流经微流体回路时，每个流体互连回路元件基本上不经受流体通量。只要流体连接被构造为使得能够扩散，但在扫过区域与未扫过区域之间基本上没有介质流，则未扫过区域能够流体连接到扫过区域。微流体装置因此可以被构造为基本上将未扫过区域与扫过区域中的介质流隔离，同时使得基本上仅实现在扫过区域与未扫过区域之间的扩散流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫过区域的示例，而微流体装置的隔离区域(在下面进一步详细描述)是未扫过区域的示例。
本文所用的流体介质流的“非扫过(non-sweeping)”速率是指足以允许隔离坞的隔离区域中的第二流体介质的组分扩散到流动区域中的第一流体介质中和/或允许第一流体介质的组分扩散到隔离区域中的第二流体介质中的流速；进一步地，其中第一介质基本上不流动进入隔离区域中。
本文所用的“合成表面”是指支撑结构和气态/液体介质之间的界面，其中合成表面通过非生物过程制备。在各种实施方案中，合成表面可包含抗原呈递表面。合成表面可具有与其连接的生物来源的材料，例如本文所述的初级和共激活分子，以提供抗原呈递合成表面，前提是该合成表面不由生物有机体表达。在各种实施方案中，支撑结构是固体，例如微流体装置的珠、圆片或衬底、盖或回路材料的非表面暴露部分，并且不封入生物核或细胞器。
本文所用的“共激活”是指生物大分子、其片段或其合成或修饰形式与T细胞之间的结合相互作用，而不是初级T细胞受体/抗原:MHC结合相互作用，其增强有效的免疫反应，以产生T细胞的激活。共激活相互作用是抗原非特异性相互作用，例如能够参与细胞内信号传导的T细胞表面蛋白(例如CD28、CD2、ICOS等)与其激动剂之间的相互作用。本文所用的“共激活(co-activation)”和“共激活(co-activating)”分别等同于术语共刺激(co-stimulation)和共刺激(co-stimulating)。
本文所用的“TCR共激活分子”是生物大分子、其片段或其合成或修饰形式，其结合T细胞上的一个或多个共受体，该共受体激活远端信号传导分子，所述远端信号传导分子扩大和/或完成由TCR的抗原特异性结合引发的反应。在一个示例中，诸如转录因子核因子κB(NFkB)和激活T细胞核因子(NFAT)之类的信号传导分子被TCR共激活分子激活。TCR共激活分子可以是例如CD28受体的激动剂，其通过磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt途径发出信号。参见图4。
本文所用的“CD28高”是指T细胞中高CD28表面表达的表型。本领域技术人员熟悉CD28高表型和鉴定CD28高T细胞的适当方法。除非另有说明，否则CD28高T细胞包括满足以下任何标准的T细胞。在一些实施方案中，CD28高T细胞是一种比静息CD8+T细胞表达更高水平CD28的T细胞。CD28高T细胞也可以比不相关的非抗原特异性T细胞表达更高水平的CD28。在一些实施方案中，CD28高T细胞是其中可通过FACS测量的表面CD28水平等于或大于可通过FACS测量的循环记忆T细胞上存在的表面CD28水平的群体。在一些实施方案中，CD28高T细胞的表面CD28水平等于或大于来自相同样品或个体的循环记忆T细胞上存在的表面CD28水平。表面CD28的表达可以通过FACS测定，并且循环记忆T细胞上存在的表面CD28的平均值(例如，几何平均值)或中值水平可以用于确定给定T细胞是否是CD28高。在一些实施方案中，CD28高T细胞是以比来自相同样品或个体的初始CD8 T细胞的典型表达显著更高的水平表达CD28的T细胞，例如高于初始T细胞的75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％或95％。初始CD8 T细胞可以通过已知方法(例如，流式细胞术)鉴定和表征为表达可检测的CD28和极少的CD45RO或不表达CD45RO的CD8+细胞。
本文所用的“TCR辅助激活分子”刺激放大抗原特异性TCR相互作用并且不同于TCR共激活分子的信号传导分子类型。例如，通过TCR近端信号传导复合物的磷酸化产生的TCR近端信号传导是TCR辅助激活分子发挥作用的一种途径。TCR辅助激活分子可以是例如CD2受体的激动剂。参见图4。
本文所用的“激活的T细胞”是已经以能够对抗原产生抗原特异性应答的方式刺激的T细胞。抗原可以是例如癌症相关的抗原。激活T细胞的刺激通常包括细胞表面结合事件，其包括初级信号分子(例如，T细胞受体(TCR)或其重组形式(例如，嵌合抗原受体(CAR))和/或CD3)以及共激活信号传导分子(例如，T细胞共激活受体如CD28，或T细胞辅助受体如CD2)的接合。激活的T细胞通常对CD28、CD45RO、CD127和CD197中的至少一种呈阳性。
本文所用的术语“抗原呈递表面”通常是指包含一种或多种抗原的表面，所述抗原以可激活与表面接触的T细胞的方式呈递。抗原呈递表面可具有与其连接的生物来源的材料，例如本文所述的初级和共激活分子。在各种实施方案中，抗原呈递表面可包含抗CD3。在各种实施方案中，抗原呈递表面可包含抗CD28。在一些实施方案中，抗原呈递表面可包含抗CD3和抗CD28。本文所述的表面可以经过处理以成为抗原-抗原呈递表面。具有表面的非限制性示例支撑结构可以包括珠、磁珠、孔板、毛细管、生物反应器内的表面(例如凹坑)。
本文所用的术语“细胞疗法产品容器”通常指可适合于在填充过程期间接收细胞治疗剂的无菌隔室或容器。在各种实施方案中，细胞疗法产品容器可以包括柔性容器，其具有延展性并且可以变形以适合各种空间(例如，在盒内)。在一些实施方案中，柔性容器可以包括静脉注射袋。在替代实施方案中，细胞疗法产品容器可包含抗刺穿或撕裂的刚性结构。
本文所用的术语“变性”通常是指失去以其天然状态存在的四级结构、三级结构和二级结构的任何分子。非限制性示例包括暴露于外部化合物或环境条件例如酸、碱、温度、压力、辐射等的蛋白质或核酸。
本文所用的术语“盒(cartridge)”可以与术语“盒(cassette)”互换使用，并且通常是指适合于执行细胞疗法制造过程中的一个或多个步骤(例如，分选、激活、转染和/或填充和配制)的装置。例如，细胞疗法制造系统可以接收来自受试者的细胞(例如T细胞)并使用盒对其进行处理。在一些实施方案中，细胞疗法制造系统可以使用盒生产细胞疗法产品(例如，对受试者的治疗)。
在各种实施方案中，细胞制造系统可以包括盒。在各种实施方案中，盒可以是可插入到仪器中并进行处理的模块化装置。在各种实施方案中，可以定制盒以针对特定的一组条件执行细胞疗法制造方法的一个或多个步骤。条件可以包括，例如，针对疾病状况例如癌症(例如，血液或液体癌症，例如白血病或淋巴瘤，或实体瘤癌症，例如肉瘤(例如，血管、淋巴管、骨、脂肪组织、韧带、肌肉或腱的癌症)或上皮癌(例如，皮肤、腺体和器官内壁的癌症))制造特定细胞类型，例如工程化T细胞、CAR T细胞、内源性T细胞等。在各种实施方案中，盒可以适合于处理特定的受试者样品类型(例如全血样品)。在各种实施方案中，可以在处理每个受试者样品之后更换盒。在各种实施方案中，盒可以重复使用。在一些实施方案中，盒可以是仪器上的集成组件。
在各种实施方案中，盒可以包括一个或多个流体网络和至少一个室。在各种实施方案中，室可以包括用于培养细胞疗法产品(例如，包含T细胞的细胞疗法治疗)的生物反应器。在各种实施方案中，盒可以是细胞疗法制造系统的模块化组件。在各种实施方案中，盒可以包括用于各种细胞疗法制造方法的储存器、阀、室和分析组件(例如，微流体装置、传感器等)。可以在盒上进行的方法的非限制性示例包括细胞样品引入、分选/选择、激活、转导、培养、细胞计数和/或表征、清理步骤、配制和填充或其任何组合。
本文所用的术语“可检测标记物”通常意指可被检测的任何物质。更具体地，可检测标记物可以包括荧光分子，例如荧光团或条形码。可检测标记物可以与碳水化合物、蛋白质、核苷酸序列(例如寡核苷酸)、糖、氨基酸、核苷酸或其他生物分子偶联。在各种实施方案中，可检测标记可以直接或通过中介物间接偶联至靶分子，从而允许检测靶分子。可检测标记物可以是外源的或内源的。在各种应用中，可检测标记物可以包括用于降低由另一分子(例如荧光团)发射的信号强度的猝灭剂。
在各种实施方案中，可检测标记物可以通过实验室设备(例如流式细胞仪、显微镜等)进行分析。在各种实施方案中，可检测标记物可以被定量分析。
本文所用的术语“核酸构建体”通常是指可以修饰细胞以用于细胞疗法或细胞疗法制造的分子。在各种实施方案中，核酸构建体可以包含编码用于细胞疗法或细胞疗法制造的分子的一种或多种核苷酸序列。核酸构建体可以被插入到宿主基因组(例如T细胞)中并被表达。在各种实施方案中，插入可以使用基因编辑手段(例如慢病毒载体)进行。在各种实施方案中，核酸构建体可以包含编码嵌合抗原受体(CAR)分子的一种或多种基因。
本文所用的术语“样品”通常是指来自感兴趣的受试者(例如人类受试者)的样品并且可以包括细胞样品。因此，样品可以包括一种或多种细胞，例如免疫细胞或血细胞(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等)。样品可以源自另一个样品。例如，样品可以仅包括来自直接取自受试者的样品的细胞(和其他材料)的子集。样品可以包括组织样品，例如活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以包括流体样品，例如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以包括皮肤样品。样本可能包括脸颊拭子。样品可以源自血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便或眼泪。样品可以源自红细胞或白细胞。样品可以源自脊髓液、CNS液、胃液、羊水、囊液、腹膜液、骨髓、胆汁、其他体液。
本文所用的术语“分选激活(sortavation)”通常是指细胞疗法制造方法中的步骤。在各种实施方案中，分选激活可以包括与一个或多个激活步骤(例如T细胞激活步骤)组合的一个或多个分选步骤。
本文所用的术语“受试者”通常是指动物，例如哺乳动物(例如人类受试者)或其他动物(例如鸟)。例如，受试者可以包括脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如小鼠)、灵长类动物、猿猴或人类。动物可以包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以包括健康或无症状个体、患有或疑似患有疾病(例如癌症)或易患该疾病的个体和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。
本文所用的术语“治疗”通常是指可以使用本文所述的细胞疗法制造方法和系统产生的细胞产品。该产品可以包含活细胞。在各种实施方案中，活细胞可以包括T细胞。在各种实施方案中，T细胞可以是CAR T细胞。在各种实施方案中，T细胞可以是工程化的T细胞。在各种实施方案中，T细胞可以是内源性T细胞(即，来自受试者的未经基因工程改造的T细胞)。II.细胞疗法制造系统和盒的概述
A.细胞疗法制造系统(CTMS)和盒
虽然用于癌症治疗的基于细胞的免疫疗法是一个有前途的进展，但当前用于生产细胞疗法产品的系统在空间、操作员知识方面和成本可能需要大量资源。其他挑战包括再现性。现有的系统可以包括多套设备，其中每台设备只能执行细胞疗法制造方法的一个过程或子过程。随之而来的是材料处理和污染问题，其需要甚至更多的资源来限制。
需要的是一种集成的、自动化的系统和盒，其能够接收来自患者的样品(例如血液样品)并通过细胞疗法制造方法的各个步骤处理该样品以生产可以由患者使用的产品。这样的盒(和/或系统)可以从工作流程开始直到结束完全封闭，以确保产品不受污染。这样的盒(和/或系统)还可以允许任何附带的质量控制程序在线或在盒(和/或系统)内处理。本文所述的新颖的盒、仪器、系统和方法解决了这些问题以及更多问题。
B.合成T细胞激活表面
在生物有机体中，树突细胞的功能是捕获、处理外源性抗原并将其呈递给适应性免疫细胞(例如T细胞)。然而，目前使用抗原呈递树突细胞来激活T淋巴细胞(T细胞)存在几个不利的方面。目前，树突细胞必须从供体来源获得，这增加了成本并限制了生产量。此外，在大多数情况下，必须使树突细胞对于T淋巴细胞激活的每个次序都进行成熟，这可能需要约7天的提前期。还需要对树突细胞进行照射，这限制了可以进行此类处理的场所。
在各种实施方案中，当为了受试者或治疗相关群体而刺激和扩增T淋巴细胞时，用合成表面代替自体抗原呈递树突细胞的使用来激活T淋巴细胞可以提供更大的再现性。根据各种实施方案，合成表面可被工程化用于T淋巴细胞的抗原特异性激活，从而提供具有用于治疗癌症的所需表型的激活的T淋巴细胞群的更可控、可表征、可再现和/或更快速的发展。或者，根据各种实施方案，合成表面可被工程化以用于T淋巴细胞的非抗原特异性激活(例如基因工程化的T淋巴细胞)，这也可以提供具有用于治疗癌症的所需表型的激活的T淋巴细胞群的更可控、可表征、可再现和/或更快速的发展。激活合成表面，无论是否为抗原特异性，还可以允许对T细胞激活进行更多控制和选择性，包括在激活后更精确地靶向期望的T细胞表型，例如特定形式的记忆T细胞的富集。此外，与使用自体抗原呈递树突细胞相比，激活合成表面还可以利用规模经济和/或提供更大程度的再现性。因此，该技术可以为更多有需要的患者提供细胞疗法。此外，由于用于执行细胞疗法制造方法的集成系统的性质，本文所述的系统和方法可以减少生产细胞疗法产品所必需的时间。更快地提供可用于细胞疗法的T细胞对于晚期疾病患者尤其重要。本文描述了此类激活合成表面的结构及其制备和使用方法。在一些实施方案中，激活合成表面包含与TCR共激活分子(例如CD28分子)和/或辅助TCR激活分子组合的初级激活配体(例如结合至抗原肽或CD3激动剂如抗CD3抗体的MHCI类分子)，它们一起用于激活T细胞。本文还公开了这些组分的表面密度范围以及可进一步提高功效的一种与另一种的比率。在一些实施方案中，激活合成表面及其制备和使用方法提供一种或多种前述优点(例如节省成本、节省时间、受控且良好表征的过程)。
III.示例性细胞疗法制造工作流程的概述
本文所述的细胞疗法制造工作流程可以包括生产细胞疗法产品。在各种情况下，工作流程可以针对生产包含活细胞(例如免疫细胞，如CAR T细胞、工程化的T细胞或内源性T细胞或干细胞)的产品，这些活细胞可以被转移到受试者体内用于特定的应用。一些应用可以包括治疗疾病或病患。一些应用可以包括癌症的治疗。图22是用于生产用于细胞疗法的产品的示例性细胞疗法工作流程2500的示意图。细胞疗法工作流程2500可以包括各种操作，非限制性示例可以包括受试者样品收集2502、细胞分选2504、细胞刺激2506、细胞修饰2508、细胞培养物扩增2510、最终确定产品(例如配制和填充2512)、治疗施用2514，以及一种或多种质量控制测定2550。然而，应当理解，细胞疗法工作流程2500可以包括这些操作中任何组合或顺序的两个或更多个。
A.受试者样本收集
受试者样本收集2502可以包括例如获得一个或多个受试者(例如哺乳动物受试者(例如人类受试者))的细胞样品。细胞样品可以采取通过一种或多种采样方法获得的样本的形式。细胞样品可以包括全血样品或来自特定组织的细胞，例如淋巴结、脾脏，或干细胞来源，例如骨髓、肝脏、脂肪组织、肌肉、皮肤、牙龈组织、血管、脑、胚胎组织等。细胞样品可以通过几种不同方式中的任何一种获得。在各种实施方案中，细胞样品包括通过抽血获得的全血样品。在其他实施方案中，细胞样品可以源自全血，例如血清样品、血浆样品、分级的血液样品(例如，富集白细胞(WBC)、淋巴细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、其他类型的血细胞或其组合)。在其他实施方案中，细胞样品可以通过组织活检的解离获得(例如，解离的骨髓细胞、肝细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、牙龈细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎细胞等)。在一些实施方案中，可以部分纯化或纯化解离的细胞样品以选择感兴趣的细胞。细胞样品可以包括核苷酸(例如ssDNA、dsDNA、RNA)、细胞器、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物或其任何组合。
在各种实施方案中，从受试者样品收集2502获得的细胞样品可以包括从全血样品收获的白细胞(例如T细胞)。收获可以包括使用离心方法。在一些实施方案中，离心方法可以包括分离术(例如白细胞分离术)。白细胞分离术可以是将白细胞与其他全血成分分离的有效方法。在各种实施方案中，白细胞分离术可以从细胞样品产生白细胞单采物(leukopak)。其他全血成分可以返回到受试者(例如人类受试者)。在一些实施方案中，收获可以包括使用微流体柱阵列进行确定性横向位移(DLD)。例如，微流体柱阵列可用于从全血样品中去除红细胞和/或其他细胞，和/或改变其中悬浮白细胞(例如T细胞)的介质。
在各种实施方案中，从受试者样品收集2502获得的细胞样品可以经历组织解离过程(例如酶消化过程)。在各种实施方案中，本文所述的系统可以包括一个或多个用于储存酶和用于执行组织解离过程的其他试剂的储存器。储存器的内容物可以通过流体网络递送到系统中可以进行组织解离过程的位置。在许多实施方案中，组织解离过程可以在室(例如盒的生物反应器室)中进行。
B.细胞分选和细胞刺激
各种细胞类型(例如T细胞、NK细胞、其他免疫细胞、干细胞、多能细胞、ipsc、祖细胞等)可以受益于在细胞疗法工作流程2500中包括细胞分选2504。许多细胞类型也可以受益于在本文所述的细胞疗法制造系统上所执行的细胞刺激2506(例如T细胞和NK细胞的激活)和/或(例如干细胞、多能细胞、ipsc、祖细胞、免疫细胞等的分化)。
在各种实施方案中，细胞疗法制造系统可以包括用于执行各种不同的细胞疗法工作流程2500的必要元件(例如试剂和硬件)。例如，在许多实施方案中，细胞疗法制造工作流程2500可以包括细胞分选2504步骤并且排除细胞刺激2506步骤。在其他实施方案中，细胞疗法工作流程2500可以包括独立的细胞分选2504步骤和独立的细胞刺激2506步骤。在替代实施方案中，细胞疗法工作流程2500可以包括集成的细胞分选2504和细胞刺激2506步骤(例如，细胞分选和细胞刺激步骤在时间上重叠)。
是否包括细胞刺激2506可以至少部分地由正在被处理的细胞的细胞类型或特征来确定。在本文所述的许多实施方案中，细胞刺激可以引发免疫应答(例如体外免疫应答)。
在各种细胞疗法工作流程2500中，细胞分选2504和/或细胞刺激2506之后可以进行细胞增殖。在其他细胞疗法工作流程2500中，细胞分选2504和/或细胞刺激2506之后可以是细胞修饰2508。
a.细胞分选
对于基于细胞的细胞疗法，有效的细胞分选2504可以产生更纯的细胞疗法产品，这可以导致更有效的患者结果(例如增加的五年存活率和/或更少和更小的副作用)。
在各种实施方案中，细胞分选2504可以用于通过基于以下一项或多项的选择来分离期望的细胞：大小、活细胞与死细胞或凋亡细胞、CD8阳性和四聚体阳性。在各种实施方案中，分选可以包括将激活的T细胞与非激活的T细胞分离。下文及全文描述了细胞分选2504的各种方法。
b.细胞刺激
在各种细胞疗法工作流程2500中，细胞分选2504和T细胞激活可以包括组合步骤(“分选激活”)。在各种实施方案中，来自受试者样品收集2802的细胞样品可以经历细胞分选2504和T细胞激活。在各种实施方案中，经历分选激活的细胞可以源自细胞样品，例如T细胞富集的样品(例如白细胞单采物或使用微流体柱阵列产生的样品)。
在各种实施方案中，本文所述的系统可适合于执行细胞疗法工作流程2500的各种不同的细胞刺激2506过程。细胞刺激2506过程的非限制性示例包括通过在细胞疗法制造系统上进行的激活过程刺激T细胞或NK。细胞刺激2506过程的另外的非限制性示例包括在分化期间刺激各种细胞类型，例如干细胞、多能细胞、ipsc、祖细胞等。
多种细胞类型也可受益于使用本文描述该系统和方法进行的细胞刺激2506(例如T细胞和NK细胞的激活)和/或分化(例如干细胞、多能细胞、ipsc、祖细胞等)。
在各种实施方案中，可以使细胞(例如T细胞)与生长刺激分子(例如生长因子或细胞因子)和/或诱导表型变化(例如激活)的分子接触。在用于处理经历激活步骤的细胞(例如T细胞)的细胞疗法制造系统中，树突细胞和合成激活表面的共同特征可能是用于细胞接合的抗原呈递。例如，在各种实施方案中，可以使用激活分子例如分子配体来激活细胞。激活配体可以包含初级分子(例如，与感兴趣的抗原结合的MHC，或被CAR识别的抗原)和共激活分子(例如CD28、CD2等)。下文及全文提供了刺激分子及其使用方法的其他示例。
对于在处理T细胞中使用的细胞疗法工作流程2500，激活通常可以包括初级信号和共刺激信号。在各种实施方案中，初级信号可以通过T细胞受体传播(例如，通过直接或经由CD3靶向T细胞受体)。在各种实施方案中，共刺激信号可以经由CD28、CD2和/或其他分子传播。对于CAR T细胞或其他类型的工程化的T细胞，T细胞激活可以发生在转导或转染之前。
用于处理T细胞的一些细胞疗法工作流程2500可以使用树突细胞来执行细胞刺激2506过程。在各种实施方案中，可以使用本文所述的系统进行基于细胞的T细胞激活。一些细胞疗法制造系统可以包括能够模仿树突细胞功能的合成表面。
基于合成表面的T细胞激活可以在本文所述的一种或多种合成激活表面上进行。在一些实施方案中，合成表面可以包含珠。在一些实施方案中，珠可以是可磁性操纵的。在替代实施方案中，合成表面可以包含非珠结构，例如平面表面。
作为激活的替代或补充，细胞疗法制造系统可以进行细胞分化过程和步骤。在各种实施方案中，细胞类型(例如多能干细胞)可以在细胞疗法制造方法中经历分化。
在各种实施方案中，磁珠可用于T细胞的分选和激活，而无需在收获之前去除珠/细胞。在此类实施方案中，细胞分选2504和T细胞激活可以同时发生。这种方法的优点包括能够包括洗涤和富集步骤而不损失刺激分子(例如，使用CD3/CD28抗体包被的磁珠)。用于进行细胞分选的市售系统可以包括荧光激活细胞分选仪(FACS)。在一些实施方案中，可以使用本文所述的系统进行细胞分选方法。在一些实施方案中，类似的珠可以用于细胞分选并且可以省略细胞刺激步骤。
C.细胞修饰
细胞疗法制造方法和系统的各个方面可以包括使用基因转移系统和方法(例如转染或转导)对细胞进行细胞修饰2508以用核酸构建体编码宿主细胞(例如T细胞、NK细胞、干细胞和/或干细胞)。在各种实施方案中，细胞修饰2508可以使用病毒方法(例如转导)来进行。在替代实施方案中，细胞修饰2508可以使用非病毒方法(例如转染)来进行。
细胞修饰2508的病毒方法的非限制性示例包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。在各种病毒方法中，细胞刺激2506(例如，在干细胞的情况下的分化或在T细胞的情况下的激活)可以与细胞修饰2508同时进行。遗传递送的非病毒方法的非限制性示例包括脂质体介导的或质粒介导的方法。其他非限制性方法可以包括使用CRISPR/Cas手段。
在一些方面，逆转录病毒细胞修饰2508可以包括将病毒的核苷酸基因组复制到双链DNA核苷酸序列中。因此，病毒基因组的整合形式可以被转录为正常的细胞基因。在各种实施方案中，慢病毒细胞修饰2508可以在细胞非循环时发生。
示例性的非病毒细胞修饰2508方法可以包括使用基于质粒的表达系统。在一些实施方案中，基于质粒的方法可以包括转座子/转座酶系统。在各种实施方案中，可以通过电穿孔、细胞压力加载或化学处理将转座子/转座酶系统引入到细胞中。
另一个示例性非病毒细胞修饰2508可以包括使用信使(mRNA)转移系统。在一些实施方案中，mRNA转移系统可以包含转基因的瞬时表达。在其他实施方案中，mRNA转移系统可以导致转基因的永久表达。
在各种实施方案中，T细胞修饰可以工程化T细胞以包含能够结合抗原并引起T细胞激活的受体(例如嵌合抗原受体(CAR))。在各种实施方案中，T细胞修饰可以产生CAR T细胞。在各种实施方案中，核酸构建体可以包含嵌合抗原受体(CAR)分子。在其他实施方案中，核酸构建体可以包含具有期望的抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
在各种实施方案中，细胞修饰2508可以使用非病毒方法例如通过细胞分化过程来发生。非病毒载体的非限制性示例包括间充质干/基质细胞(MSC)。在各种实施方案中，非病毒载体可以通过各种细胞疗法工作流程2500中的细胞分化来经历细胞修饰2508。
在各种实施方案中，不与宿主基因组整合的载体(例如腺病毒载体)可以转导分裂细胞。在替代实施方案中，不与宿主基因组整合的载体(例如腺病毒载体)可以转导静止细胞。
D.细胞培养物扩增
细胞疗法有效性的各个方面取决于具有足够的细胞用于施用至受试者。因此，可以将细胞通过一个或多个扩增阶段培养以产生扩增的细胞群。在各种实施方案中，用于快速产生大量细胞的细胞培养物扩增2510方法可以与本文所述的其他方法结合使用。
对于制造T细胞治疗剂的方法，扩增可以包括增加溶细胞T细胞的数目。在各种实施方案中，扩增可以包括辅助T细胞数目的增加。
在各个方面，细胞培养物扩增2510的方法可以包括使细胞与体外细胞培养基接触。在各种实施方案中，细胞培养基可以包含支持T细胞激活和/或溶细胞T细胞产生的因子。例如，细胞培养基可以包括CD3激动剂(例如抗CD3抗体)、CD28激动剂(例如抗CD28抗体)、CD2激动剂(例如抗CD2抗体)、细胞因子(例如，IL2、IL7、IL15和IL21中的一种或多种)或其任何组合。更进一步的实施方案可以包括孵育培养物，从而产生抗原特异性、MHC限制性T淋巴细胞的扩增的群。在各种实施方案中，细胞培养基可以包含生长因子、细胞因子、趋化因子、转录因子、酶和/或微RNA，以及任选的控制细胞刺激(例如激活和分化)的其他分子。
根据各种实施方案，细胞培养物扩增2510的各个方面可以包括使用饲养细胞。在一些扩增方案中，根据各种实施方案，细胞可以与不成比例地大浓度的非分裂饲养细胞(例如，γ-照射的外周血单核细胞(“PBMC”))联合培养。在各种实施方案中，可将非分裂外周血单核细胞(PBMC)添加到体外细胞培养基中。
根据一些实施方案，细胞培养物扩增2510的各个方面可以包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。一些实施方案还可以包括向培养基中添加CD3激动剂(例如抗CD3抗体)和细胞因子(例如IL-2)。更进一步的实施方案可以包括孵育培养物，从而产生抗原特异性、MHC限制性T淋巴细胞的扩增的群。
E.配制和填充
在各个方面，配制和填充2512包括使扩增的细胞群变为适合施用于受试者的治疗形式的一个或多个步骤。在各种实施方案中，配制和填充2512包括使扩增的细胞群变为适合作为施用于受试者的前体的形式的一个或多个步骤。配制和填充2512步骤可以包括产生适合于维持活细胞群的条件。
在各种实施方案中，配制和填充2512对于稳定扩增的细胞群以实现合理的保质期以及储存和处理条件可能是重要的。稳定化可以包括防止聚集、变性或其他降解途径。在各种实施方案中，制剂可以包含治疗剂和另外的分子。
在各种实施方案中，另外的分子可以包括溶液中的盐分子(例如盐水溶液)。可以优化盐水溶液以延长储存条件下的细胞寿命。在各种实施方案中，溶液可以包含有机硫化合物。在各种实施方案中，溶液可以包含二甲基亚砜DMSO((CH3)2SO)。
在各种实施方案中，另外的分子可以包括用于在诸如糖和多元醇的条件下稳定细胞的分子。在一些实施方案中，恶劣条件可以包括脱水。在各种实施方案中，恶劣条件可以包括升高或降低的温度。
在各种实施方案中，另外的分子可以包括氨基酸、表面活性剂、缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或tris)、张力剂、防腐剂、抗氧化剂和螯合剂。
示例性制剂可以包括将经洗涤的细胞沉淀重悬于两种预先配制的赋形剂溶液的1:1体积当量中：盐水中的5％w/v人血清白蛋白(HSA)和CS10(10％w/v DMSO)。
在各个方面，配制和填充2512包括用治疗剂(例如，处理过的样品)填充一个或多个容器的过程。
在本文所述的方法的各个方面，可以包括将治疗剂从细胞扩增过程无菌转移(例如，处理)至细胞疗法产品容器(例如，静脉内袋)。
F.治疗施用
在各种实施方案中，治疗施用2514可以是示例性细胞疗法工作流程2500中的最后步骤，其中可以向受试者施用治疗。在各种实施方案中，可以向提供样品的同一受试者施用治疗。在各种实施方案中，可以向与提供样品的受试者不同的受试者施用治疗。在一些实施方案中，接受治疗的不同受试者可以与提供样品的受试者遗传匹配(例如，他们可以来自同一家庭，例如兄弟姐妹或亲代子代配对等)。
在各种实施方案中，治疗施用2514可以包括从细胞疗法产品容器向受试者施用治疗。在各种实施方案中，可能需要中间步骤来从细胞疗法产品容器中制备治疗。
G.质量控制测定
在示例性细胞疗法工作流程2500中可以使用各种质量控制测定2550。例如，可以对受试者进行预筛查，并且可以在进入工作流程之前、在工作流程期间测试样品，并且可以出于质量控制目的对最终产品(例如，治疗)进行分析。
在各种实施方案中，质量控制测定2550可以涉及受试者的健康史、对受试者进行传染病或其他病患的预筛查、血液特性测试等。
在各种实施方案中，在通过细胞疗法制造工作流程2500进行处理之前，可以对受试者所提供的样品进行质量控制测定2550。在各种实施方案中，可以测定样品的体积和浓度(例如，感兴趣的细胞的细胞计数和/或浓度)。在此期间还可以进行与细胞形态(例如细胞形状、大小和物理特征)相关的观察。
在各种实施方案中，可以使用分析装置例如流式细胞仪和显微镜来评估细胞表面标志物和细胞纯度。在各种实施方案中，可以针对细胞活力进行染料排除测定。
在各种实施方案中，可以进行质量控制测定2550以确保受试者适合接受治疗。在各种实施方案中，可以进行人白细胞抗原(HLA)测定。当提供样品的受试者与接受治疗的受试者不同时，可以进行HLA测定。在各种实施方案中，可以对受试者供体和受试者受赠者进行ABO血液测试。
在各种实施方案中，质量控制测定2550可以在细胞疗法制造工作流程2500期间的任何点进行，包括例如在过程中。例如，可以分析样品的体积、细胞浓度、细胞数目和纯度(例如步骤2504-2512)。
在各种实施方案中，过程中测定可以包括汇集评估(confluence assessment)。在各种实施方案中，用于汇集评估的过程中测定可以包括用于生成定量测量的光学组件。在各种实施方案中，过程中测定可以包括基因表达测定。
在各种实施方案中，质量控制测定2550(例如，产品释放质量控制测定)可以在细胞培养物扩增2510发生之后进行。该测定可以涉及测量体积、细胞浓度、细胞数目、纯度和效力。
评估细胞疗法产品的各个方面通常包括使用效力测定。在各种实施方案中，效力测定可以定量地测量产品的生物活性。在一些实施方案中，效力测定可以描述期望的临床反应和生物活性之间的相似性。
在各种实施方案中，效力测定可用于对多于一种生产样品进行比较的目的并且对多于一种生产样品同时进行。
体外效力测定可以包括生化或生理反应的测量。例如，可以评估响应于效力的细胞表面标志物和激活标志物。用于效力测定的体外系统的非限制性示例可以包括基于珠的ELISA和微流体细胞术，例如以确定细胞大小、细胞形状、基于标志物的细胞身份、细胞活力等。
根据各种实施方案，体外细胞功能测定的示例可以包括细胞毒性测定。在各种实施方案中，细胞毒性测定可以包括使一种或多种产物T细胞与一种或多种靶标接触。在各种实施方案中，细胞毒性测定可以包括测量细胞凋亡的生物标志物。
细胞凋亡的生物标志物的非限制性示例可以包括激活的胱天蛋白酶2、3、7、8和9。在各种实施方案中，激活的胱天蛋白酶2、3、7、8和9可以通过免疫反应或底物/活性位点相互作用来检测。细胞凋亡的生物标志物的另外的非限制性示例可以包括细胞色素c。在各种实施方案中，可以使用酶联免疫吸附测定来测量细胞色素c。细胞凋亡的生物标志物的另一个非限制性示例可以包括外化的磷脂酰丝氨酸。在各种实施方案中，外化的磷脂酰丝氨酸可以指示早期细胞凋亡事件。在各种实施方案中，可以测量与外化配体结合的膜联蛋白。核小体DNA可以是细胞凋亡的生物标志物的另一个非限制性示例。在各种实施方案中，可以在核小体DNA分析中进行聚合酶链式反应。在各种实施方案中，可以定量测量聚合酶链式反应。
IV.示例性细胞疗法制造系统
A.细胞疗法制造系统架构
图23A示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统(CTMS)2600的示意性框图。如图23A所示，CTMS2600或系统2600是用于制造治疗量的期望细胞的装置。例如，CTMS2600被设计为基于输入细胞样品2602产生细胞疗法治疗2604。根据各种实施方案，细胞疗法治疗2604可以包括例如免疫细胞，例如T淋巴细胞(例如内源性T细胞(ETC)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞或工程化的T细胞)、自然杀伤(NK)细胞/或其他免疫细胞。或者或此外，细胞疗法治疗2604可以包括造血祖细胞或干细胞，例如胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)、诱导的多能干细胞(iPSC)等。
如图23A所示，CTMS2600是一个集成系统，其可以被配置成接收、可控地操纵和监测独立的盒(cartridge)(或盒(cassette))2610，用于制造适合被配制为细胞治疗剂的细胞群。根据各种实施方案，盒2610可以包括在具有一个或多个入口和/或出口端口的密封外壳内的一个或多个组件(例如，用于细胞培养/生长的室、用于细胞监测和/或测定的区域、试剂储存器等)。盒2610的密封外壳可以是例如无菌的和/或气密密封的。在各种实施方案中，盒2610可以包括连接到出口端口的第一流体网络、连接到第一流体网络的第一试剂储存器、连接到第一流体网络的第一分析区域以及用于培养细胞的室。在各种实施方案中，用于培养细胞的室可以包括用于将流体引入到室中的第一输入开口、用于从室中去除流体的第一输出开口以及用于从室中去除流体的第二输出开口。在各种实施方案中，第一和第二输出开口可以定位在室内不同的垂直高度处。在各种实施方案中，室的底座的内表面可以包括限定在其上的多个凹入特征。在各种实施方案中，用于培养细胞的室可以经由第一流体网络连接到出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个。图24B和24C中示出了盒2610的示例性实施方案；更一般地，下文参考图24A-24I(其中其被称为盒2700)和本文别处详细描述盒2610。
在各种实施方案中，CTMS2600可以是密封或封闭的系统，和/或无菌环境。在各种实施方案中，CTMS2600可以是单个封闭系统，例如台式系统。在各种实施方案中，盒2610可以是密封或封闭系统、气密密封环境和/或无菌环境。
根据各种实施方案和实施方式，CTMS2600可以包括被配置成接收盒2610的接收元件2630。在各种实施方案中，CTMS2600的接收元件2630可以被设计为用于支撑盒2610的支撑件。在某些实施方案中，接收元件2630可以直接与盒2610接合(interface)。在其他实施方案中，接收元件2630可以间接与盒2610接合，例如经由盒保持器2620(在下面进一步讨论)。无论接合是直接的还是间接的，接收元件2630都可以相对于CTMS 2600内的一个或多个其他组件定位盒2610。例如，接收元件2630可将盒2610定位在CTMS2600内的接收位置处，使得CTMS2600的一个或多个其他组件(例如，本文所述的CTMS2600的组件中的任一个)能够功能性地与盒2610接合和/或相互作用。在各种实施方案中，接收元件2630可以包括台，该台上可放置盒2610(和/或盒保持器2620)。在各种实施方案中，接收元件2630可以包括一根或多根杆(或类似结构)，其可插入到盒2610内的对应孔(或腔)中。更一般地，根据各种实施方案，盒2610可以包括公-母互连/锁定机构的一部分，用于将其自身可逆地附接到接收元件2630，接收元件2630可以包括公-母互连/锁定机构的另一部分。
在各种实施方案中，CTMS2600可以包括盒保持器(cartridge holder)2620(在本文中也被称为“盒保持器(cassette holder)2620”)。盒保持器2620可以被配置成与盒2610和CTMS2600的接收元件2630两者接合，从而在盒2610和CTMS2600之间提供结构和/或功能桥。根据各种实施方案：图23G示出了盒保持器2620的示例性配置；图23H是与盒2610接合的图23G的盒保持器2620的图像；图23C是安装在CTMS2600的接收元件2630上的图23H的接合的盒保持器2620和盒2610的图像。如图23H的示例性配置和图23I的分解视图所示，盒2610可被包围在盒保持器2620内，盒保持器2620可以包括第一部分2620a(例如盖)和第二部分2620b(例如底座)用于围住或部分围住盒2610。盒保持器2620可以包括一个或多个(例如多个)连接器2695，用于将盒2610固定在盒保持器2620内的特定位置处。例如，一个或多个连接器可提供盒保持器2620和盒2610之间的接触点，其将盒保持在盒保持器2620内的固定位置处。或者或此外，一个或多个连接器可将盒保持器的第一部分2620a固定到第二部分2620b，使得盒保持器2620将盒2610保持在盒保持器2620内的固定位置处。连接器2695可以是螺钉(例如，至少如图23C所示)、压缩销、弹簧销、夹具、粘合剂、焊接等。在一些实施方案中，盒保持器的第一部分2620a和/或盒保持器的第二部分2620b可以包括用于一个或多个螺钉的互补螺纹。图23G和图23H中呈现的盒保持器2620的组件及其具体配置和布置是说明性的，并且因此不旨在进行限制。例如，盒保持器2620可以包括能够围住或部分围住盒2610的单个部分；或者，盒保持器2620可以包括可装配在一起(例如，使用一个或多个连接器，其可适当地单独定位)以将盒2610保持在盒保持器2620内的固定位置处的多个部分(例如，2、3、4个等)。
至少如图23G、23H和23I所示，盒保持器2620可以包括一个或多个(例如，多个)开口或“窗口”，其允许CTMS2600的其他组件功能性地与盒2610接合和/或相互作用。例如，在各种实施方案中，盒保持器2620可以包括一个或多个观察窗(例如，窗口2625和/或2626)，每个观察窗可以允许观察CTMS2600的组件并且任选地控制盒2610的相应组件(例如，集成到盒2610中的微流体芯片)。诸如窗口2625和2626的观察窗可以提供用于非接触式测量和/或分析的光学开口。在各种实施方案中，盒保持器2620可以包括一个或多个访问窗口(例如，访问窗口2627、2628或开口2651)，每个访问窗口可允许CTMS2600的组件与盒2610的相应组件物理连接。例如，至少如图23G、23H和23I所示，访问窗口可以提供对盒2610的一个或多个试剂储存器(例如窗口2627)、盒2610的一个或多个入口端口(例如窗口2627或2628)、盒2610的一个或多个出口端口(例如窗口2627或2628)和/或盒2610的一个或多个阀(例如每个可经由开口2651访问)的访问。在各种实施方案中，入口和/或出口端口允许将流体供应到盒2610，所述流体包括气体、加压气体、试剂、生长培养基、细胞等。在各种实施方案中，一个或多个入口端口可以包括通向盒2610的室(例如生物反应器(例如，天花板通道))的端口。盒保持器2620中的开口可以根据其预期功能来确定大小，这可以反映盒2610的相应组件的大小。在各种实施方案中，盒保持器2620中的开口的大小可以为约0.5cm2至约5cm2、约4cm2至约12cm2、约10cm2至约30cm2、约25cm2至约50cm2或约40cm2至约80cm2。在某些实施方案中，观察窗(例如窗口2625或2626)的大小可以为约0.5cm2至约5cm2或约4cm2至约12cm2。在某些实施方案中，访问窗口(例如窗口2627、2628，开口2651)的大小可以为约0.5cm2至约5cm2、约4cm2至约12cm2、约10cm2至约30cm2、约25cm2至约50cm2或约40cm2至约80cm2。如图23G和23H所示，盒保持器2620中的窗口(例如，访问窗口2627)可以邻近一个或多个其他窗口(例如观察窗，例如窗口2625和/或窗口2626)。如图23G和23H进一步所示，盒保持器2620中的窗口(例如访问窗口，例如访问窗口2627和/或2628)可以包括开放侧以允许将盒2610很容易地从盒保持器2620中去除，而无需断开将盒2610物理连接到系统2600的空气/流体供应管线(未示出)。如上文所讨论的，图23G、图23H和图23I中呈现的盒保持器2620的组件及其具体配置和布置是说明性的，并且因此不旨在进行限制。例如，盒保持器2620可以包括少于四个窗口(例如，1、2或3个)或多于四个窗口(例如，5、6、7、8、9、10、10至15、16至20个或更多)，并且任何此类窗口的大小和位置可以单独改变以适应窗口的目的(例如，观察、访问或其组合)。
还如图23D和23E所示，盒保持器2620可以包括一个或多个接收器2629，用于将盒保持器2620(以及其中所含的任何盒2610)安装在系统2600内。根据盒保持器2620的配置，接收器2629可以位于盒保持器2620的第二部分2620b(例如基座部分)中。盒保持器2620的接收器2629可以被配置成与系统2600的接收元件2630接合(例如，物理连接和/或互锁)。在许多实施方案中，接收元件2630可以包括一个或多个突出部(例如杆)，其被配置成与盒保持器2620的凹入特征(例如孔)相互作用(例如，插入到其中)，从而提供通过盒保持器2620用于将盒2610安装在系统2600内的机构。图23B中示出了具有包括一对杆的接收元件2630的CTMS2600的示例性实施方案。在一些实施方案中，接收器2629可以包括一个或多个凹槽或突起，并且接收元件2630可以包括一个或多个相对的突起或凹槽，用于经由盒保持器2620将盒2610安装在系统2600内。在一些实施方案中，接收器2629可以包括一个或多个轨道，并且接收元件2630可以包括一个或多个栏杆、杆或类似结构，用于与一个或多个轨道相互作用，以通过盒支架2620将盒2610安装在CTMS系统2600内。更一般地，盒保持器2620可以包括公母互连/锁定机构的一部分，用于将其自身可逆地附接到接收元件2630，接收元件2630可以包括公-母互连/锁定机构的另一部分。在各种实施方案中，盒2610可以包括一个或多个特征，其可用作将由盒保持器2620(盒保持器的第一部分和第二部分2620a和2620b中的任一个或两者)保持/支撑的公-母互连/锁定机构的一部分，该盒保持器2620可以包括公-母互连/锁定机构的其他部分。因此，可以存在在盒2610和盒保持器2620之间使用的(第一)公-母互连/锁定机构，以及在盒保持器2620和接收元件2630之间使用的(第二)公-母互连/锁定机构。在各种实施方案中，(第三)公-母互连/锁定机构可以用在盒2610和接收元件2630之间，其可以与其他互连/锁定机构相同或不同。在各种实施方案中，盒2610和/或盒保持器2620可以与接收元件2630机械地和/或电子地接合。
此外，CTMS2600可以包括用于促进或实现CTMS2600和/或盒2610内的细胞的制造的一个或多个组件。如图23A所示，系统(CTMS)2600的一个或多个组件可以被认为是仪器2686的一部分，仪器2686可以任选地包括系统控制器2605、接收元件2630、光学感测组件2640、致动组件2650、一个或多个加压空气和/或流体组件2660、磁性组件2670、温度控制和感测组件2680和/或一个或多个辅助组件2690。下面参考图23B-23M进一步详细地描述CTMS2600的各个组件。
图23C示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的示性例配置。图23C中所示的图示是配置有安装在盒保持器2620内的盒2610的CTMS 2600的示例，盒保持器2620本身安装在CTMS2600的仪器2686上。如上文所讨论的，CTMS2600的配置可以包括直接或经由盒保持器2620间接与接收元件2630接合的盒2610，使得盒2610被保持在CTMS2600内的接收位置处。一旦盒2610位于接收位置，CTMS2600的其他组件就可以与盒2610相互作用(例如，功能性地接合和/或监测)。因此，根据包括在CTMS 2600内的组件的类型，位于接收位置处的盒2610可以与例如光学感测组件2640、致动组件2650、磁性组件2670、温度控制和感测组件2680、辅助传感器组件2690和/或供应加压空气或流体的连接件相互作用。接收位置可以是CTMS2600内的固定位置，其可以根据或不根据CTMS2600的哪个组件与盒2610相互作用而变化。例如，适合于光学感测组件2640与盒2610相互作用的固定位置可以与适合于磁性组件2670、温度控制和感测组件2680和/或辅助传感器组件2690与盒2610相互作用的固定位置相同，或者相应的固定位置可以不同。或者或此外，接收位置可以涵盖一系列合适的位置。例如，致动组件2650、磁性组件2670、温度控制和感测组件2680、辅助传感器组件2690可以被配置成在各个位置(例如，当盒2610由致动组件2650致动时盒2610占据的任何或所有位置)与盒2610相互作用。
图23B示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS2600的示例性配置，其包括仪器2686，其上没有安装盒2610和/或盒保持器2620。仪器2686包括接收元件2630的实施方案，其包括用于接收具有或不具有盒2610的盒保持器2620的一对杆。如别处所述，接收元件2630可以能够接收盒2610而不需要盒保持器2620。根据各种实施方案，仪器2686b还包括磁性组件2670，其被配置成提供磁性应用以用于操纵可以在CTMS2600中使用的磁珠。在各种实施方案中，磁性组件2670可以被配置成可移动的以提供按需的磁场施加。在一些实施方案中，磁性组件2670可以安装在螺杆驱动器上以提供磁性组件2670的移动(例如，如图23B所示的上下移动)。在各种实施方案中，通过使用一个或多个位置传感器2691(例如，停止位置)，磁性组件2670的位置可以在一个距离范围内移动，以便不损坏CTMS 2600的其他组件。仪器2686的各种其他组件包括各种辅助部件2690，其可以包括具有各种电子组件的电路板、流体源2693(例如，空气、气体、液体等)等，如图23B所示。
在各种实施方案中，CTMS2600的仪器2686可以包括一个或多个致动器2699(在本文中也被称为“阀调节元件”)，用于调节盒2610上的一个或多个阀。每个致动器可以被配置成与盒保持器2620(例如盒保持器2620b的第二部分)中的开口(参见例如图23J中的开口2651)相互作用和/或通过该开口。在各种实施方案中，致动器2699可以包括驱动机构(例如旋转部件)，以转动一个或多个阀。在各种实施方案中，仪器2686可以包括一个或多个传感器，用于监测阀在盒2610上的位置。例如，仪器2686可以包括用于盒2610上的每个阀的相应传感器。
再次参见图23A，在各种实施方案中，仪器2686可以包括一个或多个光学感测组件2640，用于检测盒2610内的一种或多种环境条件。例如，仪器2686可以包括光学感测组件2640，其被配置成当盒2610位于相应的接收位置处时监测来自盒2610的光发射。光学感测组件2640可以包括例如检测器。光学传感部件2640还可以包括光学系统，用于将从盒2610发射的光传输到检测器和/或用于将光投射到盒2610上。在许多实施方案中，光学感测组件2640可以包括光源和检测器。在各种实施方案中，检测器可以包括相机(例如，数码相机)。在各种实施方案中，光学感测组件2640可以被配置成监测从盒2610的分析区域(或测定区域)(例如集成到盒中的微流体芯片)发射的光。当盒2610由盒保持器2620保持时，可以经由相应的观察窗(例如窗口2625或2626)监测从盒2610的分析区域(或测定区域)发射的光。光发送组件2640的感测装置和/或光学系统可以类似于针对图3B所描述的感测装置和/或光学系统，并且因此可以在图3B的描述中找到更多细节。在各种实施方案中，CTMS2600的光学感测组件2640包括光学系统，其被配置成将结构光投射到盒2610上，并且更具体地，投射到盒2610的分析区域(或测定区域)上，例如微流体芯片上。这种结构光可以支持样品测定和/或实现OEP支持的过程。
在各种实施方案中，仪器2686可以包括一个或多个流体连接器2683(例如端口)。在各种实施方案中，一个或多个流体连接器2683提供仪器2686的流体网络与盒2610和/或盒保持器2620的流体网络之间的接合。
图23D示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的各组件的示例性配置。CTMS2600的接收元件2630(即“容器”)可以被设计为盒2610的支撑件，例如台。在各种实施方案中，根据一些实施方案，支撑件可以将盒2610与CTMS2600的一个或多个组件接合。在许多实施方案中，接收元件2630可以包括一个或多个突出部(例如杆)，其被配置成与盒保持器2620的凹入特征(例如孔)相互作用(例如插入)。在各种实施方案中，盒2610可以与接收元件2630接合，而不需要盒保持器2620。例如，根据各种实施方案，盒2610可以包括一个或多个特征(例如孔)以容纳来自接收元件2630的一个或多个突出部(例如杆)。在各种实施方案中，仪器2686可以被配置成接收盒2610。在各种实施方案中，盒2610的一个或多个接收器2629可以被配置成接收仪器2686的一个或多个接收元件2630。
图23E示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统2600的各组件的示例性配置。在各种实施方案中，盒保持器的第一部分2620a或盒保持器的第二部分2620b可以包括用于将盒2610安装到系统2600的接收元件2630上的接收器2629。或者，盒2610可以包括接收器2629。在各种实施方案中，安装的盒2610可以定位在磁性组件2670上方。
在各种实施方案中，CTMS2600可以包括磁性组件2670，如图23B和23D所示。在各种实施方案中，磁性组件2670可以提供对盒2610内(例如盒2610的培养室或生物反应器内)的颗粒(例如珠和/或细胞)的非接触操纵。在各种实施方案中，磁性组件2670可以被移动更靠近或远离盒2610的一个或多个组件(例如，生物反应器)。在各种实施方案中，磁性组件2670可以相对于盒2610/盒保持器2620的底表面向上(例如接近)和/或向下(例如远离)移动。在本文中，当磁性组件2670“接近”盒2610时，磁性组件充分靠近盒2610，以便在盒2610的一部分(例如细胞培养室)上施加磁力，这足以实现最终目标，例如将磁性颗粒(例如珠)保留在细胞培养室中；相反，当磁性组件2670“远离”盒2610时，磁性组件距离盒2610足够远，使得施加在盒2610上的任何磁力基本上不影响在盒2610内发生的过程。在各种实施方案中，磁性组件2670的移动可以通过机械驱动器2672来促进。在各种实施方案中，机械驱动器2672可以包括螺丝套件(例如螺杆和相应的螺母)，并且可以通过使用螺杆运动(例如，螺杆或相应的螺母的旋转)或具有精细和/或精密控制的任何其他合适的机构来促进磁性组件2670的运动。在各种实施方案中，磁性组件2670可以包括永磁体、基于稀土金属的永磁体或电磁体，其可用于操纵生物反应器内的磁珠，例如选择性地将磁珠拉向生物反应器的底部。在各种实施方案中，根据本文所述的方法，磁性组件向盒2610的一个或多个组件(例如生物反应器)的接近可以导致颗粒(例如，磁珠和任何与之结合的物质，包括细胞)在一个或多个隔室内的保留。
在许多实施方案中，通过系统2600的接收元件2630接收盒2610/盒保持器2620可以导致盒2610的一个或多个入口和/或出口与一个或多个加压空气和/或流体组件2660形成物理连接。例如，盒2610/盒保持器2620可以沿着用作接收元件2630的一对杆滑动并且到达接收位置，该接收位置通过将一个或多个加压空气和/或流体组件2660的连接元件与盒2610/盒保持器2620的相应连接元件对准和连接来促进这种物理连接的形成。在各种实施方案中，加压空气和/或流体组件2660中的每一个可以包括阀和任选的一个或多个连接器(例如，管和/或相应的管连接器/接头)。在各种实施方案中，加压空气和/或流体组件2660还可以包括加压空气或流体的源(例如，包含加压空气或流体的储存器，其可连接到阀并由阀调节)。在各种实施方案中，物理连接可以包括将盒2610(或盒保持器2620)的一个或多个连接器(例如管连接器)2681偶联到仪器2686的一个或多个相对的连接器(例如管)2683，从而将CTMS2600的一个或多个空气和/或流体网络与盒2610的一个或多个隔室和/或流体网络连接。
在一些实施方案中，连接器2681、2683包括用于一根或多根单独管线(例如，空气管线、流体管线或电线(见下文))的连接件。在一些实施方案中，连接器2681、2683包括用于一个或多个歧管的连接件，以便一次连接多个单独的管线。在各种实施方案中，连接器2681、2683可以包括一个或多个一次性无菌连接歧管。在各种实施方案中，连接器2681、2683可以包括一个或多个一次性无菌连接件入口端口和/或一个或多个一次性无菌连接件出口端口。
在各种实施方案中，本文所述的控制系统受益于CTMS2600的各组件(例如，仪器2686、盒保持器2620和盒2610的组件)之间发生的电子通信。在各种实施方案中，一个或多个连接器2681可以是电子连接器。在各种实施方案中，盒保持器的第一部分2620a或盒保持器的第二部分2620b可以包括电子连接器。在各种实施方案中，盒2610可以包括电子连接器。在各种实施方案中，仪器2686可以包括相对的电子连接器。在各种实施方案中，连接器2681/2683中的一个或多个(例如，相对的连接器)的电子连接器可以提供CTMS2600的所描述的组件之间的电子通信。在各种实施方案中，通过系统2600的接收元件2630接收盒2610/盒保持器2620可以导致盒2610的一个或多个电组件(例如，电路和/或传感器)与系统控制器2605的一个或多个电组件和/或一个或多个辅助部件(2690)形成物理连接。例如，盒2610/盒保持器2620可以沿着用作接收元件2630的一对杆滑动并且到达接收位置，该接收位置通过将一个或多个电组件的连接元件与盒2610/盒保持器2620的相应连接元件对准和连接来促进这种物理连接的形成。在各种实施方案中，物理连接可以包括将盒2610(或盒保持器2620)的一个或多个连接器(例如插座)2681与仪器2686的一个或多个相对的连接器(例如插头)2683偶联，从而将CTMS2600的一个或多个电组件与盒2610的一个或多个电组件连接。
图23F示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统的各组件的另一个示例性配置。在各种实施方案中，用于加压空气或流体连接的连接管线可以直接通向盒2610，通向用于加压空气和/或流体组件2660的一个或多个阀。如图23F所示，根据一个或多个实施方案，盒2610与用于加压空气和/或流体组件2660的一个或多个阀之间的连接管线可通过盒保持器2620连接。根据各种实施方案，盒保持器2620可以包括用于与盒2610上的一个或多个连接器接合的歧管2621。根据各种实施方案，盒保持器2620可以包括歧管2623，用于与用于加压空气和/或流体组件2660的阀上的一个或多个连接器接合。根据各种实施方案，歧管2621可以在外部源与盒2610和/或盒保持器2620之间的连接中提供无菌性。根据各种实施方案，歧管2623可以在外部源与盒2610和/或盒保持器2620之间的连接中提供无菌性。在各种实施方案中，歧管2621、2623可以是一次性使用的歧管。在一些实施方案中，盒2610与用于加压空气和/或流体组件2660的一个或多个阀之间的连接管线可以通过歧管2623连接。在多于一种实施方案中，盒2610与用于加压空气和/或流体组件2660的一个或多个阀之间的连接管线可以通过歧管2623和盒保持器2620连接。
在各种实施方案中，如图23A所示，CTMS2600可以包括一些用于例如经由致动机构操纵盒2610和/或盒保持器2620的装置。在各种实施方案中，致动机构可经由致动组件2650(在本文中也被称为“致动机构2650”)操作，该致动组件2650可被配置成相对于CTMS2600移动、倾斜、摇动、振荡或以其他方式移动盒2610，并由此移动盒2610的一个或多个组件。在各种实施方案中，致动组件2650可以被设计成移动、倾斜、摇动和/或振荡盒2610，从而促进培养基和细胞在盒2610的生物反应器内的混合。在各种实施方案中，致动组件2950可以被设计成移动、倾斜和/或振荡盒2910，从而促进细胞在盒2910的生物反应器内的再悬浮。
如图23A进一步所示，在各种实施方案中，CTMS2600可以包括一个或多个阀，用于向盒2610供应加压空气和/或流体。例如，阀可以通过机械或旋转机构或通过气动致动来控制，例如由一个或多个泵(未示出)支撑的气动致动阀。图23D和23E示出了根据各种实施方案的CTMS2600的各组件的示例性配置。在各种实施方案中，细胞疗法制造系统2600可以包括仪器2686，用于组织系统2600的各个组件。在一些实施方案中，仪器2686可以是用于保持、组织、安装本文所述的任何组件或子组件和/或为其供电的任何装置(例如，面包板或工业设计)。在各种实施方案中，仪器2686包括一个或多个接收元件2630，用于将盒保持器2620安装到CTMS2600。在各种实施方案中，盒保持器可以包括盒保持器的第一部分2620a和第二部分2620b。在各种实施方案中，第一部分2620a和第二部分2620b可以包围盒2610。在各种实施方案中，盒保持器2620的第一部分2620a的窗口可以提供对所包围的盒2610的光学访问。在各种实施方案中，一个或多个窗口可以向一个或多个分析装置提供对盒的内容物(例如细胞)的访问。
如图23A进一步所示，CTMS2600可以任选地包括一个或多个温度控制和感测组件2680、2622(在本文中也被称为“热系统2680、2622”)并且可以被配置成能够实现盒2610内的一个或多个温度区或区域(例如，生物反应器的区)的温度调节。在各种实施方案中，温度控制和感测组件2622可以被配置成经由包括/嵌入在盒保持器2620中的一个或多个加热元件来调节温度。在各种实施方案中，温度控制和感测组件2680可以被配置成经由包括/嵌入在盒2610中的一个或多个加热元件来调节温度。在替代的实施方案中，温度控制和感测组件2680可以被配置成经由邻近盒2610的一个或多个区/区域放置的一个或多个加热元件来调节盒2610的一个或多个区/区域的温度。温度控制和感测组件2680可以为一个或多个指定区域/区维持预设的温度或温度范围。在各种实施方案中，加热元件可以包括电阻加热装置或热电加热装置，例如Peltier装置。在各种实施方案中，可通过可以包括液体或空气冷却的冷却机构来调节温度。
在各种实施方案中，CTMS2600还可以任选地包括辅助传感器组件2690，例如氧感测组件或氧传感器(未示出)，或者pH感测组件或pH传感器(也未示出)。例如，氧传感器可以被配置成感测盒2610或CTMS2600中的一个或多个组件中的任一个中存在的氧气量。例如，pH感测组件或pH传感器可以被配置成感测在盒2610或CTMS2600内所含的一种或多种流体的pH。在各种实施方案中，CTMS2600还可以包括非光学感测组件2690，其可以被配置用于操纵盒2610内的各种材料。在各种实施方案中，系统2600的一个或多个辅助传感器组件2690中的每一个可以由仪器2686或盒保持器2620所包括。
在各种实施方案中，CTMS2600还包括辅助组件2690以向盒2610的一项或多项功能提供支持。示例性辅助组件2690可以包括但不限于流体泵、真空或抽吸泵等，其中任何一个都可以由仪器2686或盒保持器2620所包括。在各种实施方案中，CTMS2600的辅助组件2690可以包括入口和/或出口端口，用于连接到含有用于培养的试剂和细胞的介质袋。
图23G示出了根据各种实施方案的没有盒2610的盒保持器2620的示例性配置。图23H示出了根据各种实施方案的其中包含有盒2610的盒保持器2620的示例性配置。图23I示出了根据各种实施方案的示例性盒2610和盒保持器2620a、2620b的分解视图。注意，图23G、23H和23I中描述的各种特征已在本文中详细讨论。
图23J示出了根据各种实施方案的图23A的CTMS的示例性配置。在各种实施方案中，CTMS配置可以包括盒保持器的第二部分2620b。在各种实施方案中，盒保持器2620(例如盒保持器2620b的第二部分)可以包括一个或多个开口2651，其被配置成提供对盒2610的一个或多个阀的访问。在各种实施方案中，来自CTMS系统2600/仪器2686的致动器可以被配置成与开口相互作用或通过开口以控制盒2610的多个阀之一。在各种实施方案中，致动器可以包括致动(例如，打开、关闭或重定向)一个或多个阀的驱动机构。驱动机构可以包括例如旋转元件，该旋转元件接触(例如插入)并旋转盒2610中的相应阀，从而打开、关闭或重定向通过阀的流体流动。
在各种实施方案中，盒保持器2620(例如盒保持器的第二部分2620b)可以包括电子触点2652。在各种实施方案中，电子触点2652可以提供盒2610的系统组件(例如，系统控制器2605和一个或多个组件(例如，一个或多个微流体芯片、传感器、阀等))之间的电通信。例如，盒保持器2620的电子触点2652可以向集成到盒2610中的一个或多个DEP配置的微流体芯片提供电通信和/或电力。图23J进一步示出了温度控制和感测组件2622，其可以包括温度元件2653，其被配置成例如加热和/或冷却或以其他方式调节如本文所述的盒2610内的隔室(例如生物反应器)的温度。温度控制元件2653可以包括例如电阻加热器或热敏电阻(例如，其可以是印刷电路板(PCB)的一部分)、peltier热电装置等。尽管在图23J中示出为位于盒保持器的第二(底部)部分2620b中，并且因此定位在盒2610的隔室(例如生物反应器)下方，但是温度元件2653可以位于盒保持器2620的第一(顶部)部分中，使得温度元件2653位于盒2610的隔室(例如生物反应器)上方。在其他实施方案中，盒保持器2620可以包括一对温度元件2653(例如，一个位于盒保持器的第一(顶部)部分2620a中，一个位于盒保持器的第二(底部)部分2620b中)，使得盒2610的组件(例如生物反应器)可相对于来自多个侧面(例如顶部和底部)的温度进行调节。
图23K示出了根据各种实施方案的与细胞疗法制造系统2600的各组件连接的外部(介质)袋的示例性配置。如图23K所示，介质容器2606(例如介质袋)可以包括流体隔室2607和空气隔室2608。通过用流体(即，空气或气体)填充或加压空气隔室2608，可以挤压流体隔室2607以泵出流体，例如试剂、生长或介质。如图23F进一步所示，通过使用沿着介质容器2606(例如，介质袋)和盒2610的入口(和/或经由盒2620和/或歧管2621)之间的连接管线的任选的流量控制器或流量限制器2609，可以调节或控制流体从流体隔室2607的流出以期望的流速流动。
图23L示出了根据各种实施方案的与细胞疗法制造系统的各组件连接的外部袋(例，介质容器2606)的示例性配置。在各种实施方案中，介质容器2606可以包括外隔室2611。在各种实施方案中，外隔室2611可以围绕空气隔室2608和流体隔室2607。在许多实施方案中，可以向空气隔室2608添加加压空气以在流体隔室2607上产生压力。在各种实施方案中，压力导致流体(例如介质)通过流体连接2614(例如出口)释放。在各种实施方案中，加压空气可以通过空气连接2613进入空气隔室2608。
图23M示出了根据各种实施方案的可以被配置成控制CTMS2600的系统控制器的示例性配置。在各种实施方案中，对于CTMS2600的每个组件或组件子集，可以接合一个或多个控制器以控制或促进CTMS2600的每个单独组件的各个方面和功能。下面参考图23M描述CTMS2600的组件的一个或多个控制器的进一步细节。
如图23M中所示，根据各种实施方案，CTMS2600可以经由被实施为与CTMS2600一起使用的系统控制器来控制。根据各种实施方式，CTMS 2600包括系统控制器2605，用于控制系统的各个组件并且用于与操作员或用户连接。在各种实施方案中，CTMS2600可以包括用于操作CTMS2600的用户界面(未示出)。
如图23M所示，系统控制器2605可以被配置成控制CTMS2600(或系统2600)，其中系统控制器2605可以包括用于CTMS2600的每个组件、多个组件或组件子集的控制器。在各种实施方案中，根据本文公开的各种实施方案，系统控制器2605可以包括用于接收元件的控制器2635、用于光学感测组件的控制器2645、用于致动组件的控制器2655、用于一个或多个加压空气和/或流体组件的控制器2665、用于磁性组件的控制器2675、用于温度控制和感测组件的控制器2685。
在各种实施方案中，用于接收元件2635的控制器用于操作或控制盒2610的接收元件2635(例如台或杆，参见图23B)并且用于将盒2610与CTMS2600和系统控制器2605的一个或多个组件接合。在各种实施方案中，用于接收元件2635的控制器可用于移动盒保持器2620，以沿着插入到盒2620的底座的孔中的一对杆移动。CTMS2600的操作员或用户可以能够使用用于接收元件2635的控制器来控制盒保持器2620的移动和定位，这又控制盒2610相对于CTMS2600内的一个或多个其他组件的移动和定位。这包括使盒2610和/或盒保持器2620相对于CTMS2600内的光学系统定位以实现OEP支持的过程。
在各种实施方案中，用于光学感测组件2645的控制器是用于与光学感测组件2640相互作用并且促进OEP支持的过程以及操纵盒2610内的各种材料的控制系统或模块。在各种实施方案中，CTMS2600的光学感测组件2640被配置成与集成在盒2610内的微流体装置或芯片一起工作。在各种实施方案中，微流体装置或芯片可以包括光致动的动电装置、具有光电镊子(OET)配置的装置、以及具有光电润湿(OEW)配置的装置。根据各种实施方案，集成在盒2610内的微流体装置或芯片的示例包括可以在其中放置、培养和/或监测生物微物体的坞。如本文所公开的，盒2610可以包括能够与CTMS2600的光学感测组件2640一起工作的一个或多个微流体装置或芯片。另外或替代地，盒2610可以包括一个或多个微流体装置或芯片，其能够与非光学感测组件2690一起工作以操纵盒2610内的各种材料。关于用于光学感测组件的控制器2645和光学感测组件2640或基于OEP的技术的进一步细节参考图1B和图1C进行描述，并且示例性光学设置参考图3B进行图示和描述。
在各种实施方式中，盒2610和/或盒保持器2620的定位或操纵例如可以经由用于致动组件的控制器2655来控制。该控制器2655允许操作者或用户相对于CTMS2600移动、倾斜、摇动、振荡或以其他方式移动盒2610中的一个或多个组件或盒2610本身。在各种实施方案中，用于致动组件的控制器2655还可用于移动、倾斜、摇动和/或振荡盒2610，从而促进盒2610的生物反应器内的培养基和细胞的混合。在各种实施方案中，用于致动组件的控制器2655的输入可以来自用户或操作员，或者输入可以基于预编程的动作组并基于例如来自CTMS2600的反馈。
在各种实施方案中，用于加压空气和/或流体组件的一个或多个阀的控制器2665使得操作者或用户能够配置对一个或多个阀(包括机械或旋转阀)或经由气动致动(例如，由一个或多个泵(未示出)支持的气动致动阀)的控制。在各种实施方案和实施方式中，用于加压空气和/或流体组件的一个或多个阀的控制器2665可以用于控制介质袋和盒2610的一个或多个入口和/或出口之间的流体流动(例如，空气或液体，包括试剂、培养物或生长培养基)。在各种实施方案中，如图23K中所示，用于加压空气和/或流体组件的一个或多个阀的控制器2665可以用于控制在介质袋与盒2610的一个或多个入口和/或出口(例如流体入口2612)之间的一个或多个部分处的连接管线中(包括沿着通过歧管2621和/或盒保持器2620连接的连接管线，具有或不具有一个或多个流量控制器或流量限制器2609)的流体流动。
在各种实施方案中，用于磁性组件的控制器2675使得操作者或用户能够配置盒2610内(例如盒2610的生物反应器内)的细胞和培养基的非接触式操纵。在各种实施方案中，如图23B和23D所示，用于磁性组件的控制器2675可以被配置成移动靠近或远离盒2610的一个或多个组件(例如生物反应器)。在各种实施方案中，磁性组件2670可经由控制器2675控制以相对于盒2610/盒保持器2620的底表面向上和/或向下移动。在各种实施方案中，可以通过利用精细和/或精密控制来控制螺杆或任何其他合适机构的旋转来促进磁性组件2670的移动。在各种实施方案中，通过控制磁性组件2670的移动，操作者或用户可以操纵生物反应器内的磁珠，例如以选择性地将磁珠拉向盒2610中的生物反应器的底部。在各种实施方案中，用于磁性组件的控制器2675可以与位置传感器2691电子通信，用于检测盒2610的位置。
在各种实施方案中，CTMS2600包括用于温度控制和感测组件的控制器2685，用于与温度控制和感测组件2680相互作用。在各种实施方案中，用于温度控制和感测组件的控制器2685可以被配置成能够对盒2610内的一个或多个温度区或区域进行温度调节。在各种实施方案中，用于温度控制和感测组件的控制器2685可以被配置成将一个或多个区、区域或组件维持在预设的温度。例如，盒2610可以由操作者或用户配置成维持包括生物反应器的暖区、包括OEP芯片的另一暖区(可能具有不同的温度设置)、包括一个或多个用于储存试剂等的储存器的一个或多个冷区以及对于一些储存器而言保持在室温或环境温度的一个或多个区。在各种实施方案中，用于温度控制和感测组件的控制器2685允许配置实验条件，使得盒2610中的每个区/区域/组件中的温度或温度范围可以单独地、独立于其他地、以两个、三个或四个为一组地或总共地针对每个区、每个区域或每个组件进行预设或维持。利用所公开的温度控制和感测组件2680及其控制器2685的能力，在某些区中维持某些温度同时在不同的区中保持不同的温度可以有助于CTMS2600在各自的最佳环境下维持试剂或细胞或实现细胞生长。
在各种实施方案中，系统控制器2095可以包括用于与各种辅助传感器组件2690相互作用的控制器(例如控制系统或模块)，所述辅助传感器组件包括例如氧感测组件或氧传感器或者pH感测组件或pH传感器。在各种实施方案中，pH感测组件或pH传感器可以位于CTMS2600或盒2610中。在各种实施方案中，pH传感器可以位于盒2610的生物反应器部分或其他部分中，并且流体偶联至需要pH测量的生物反应器或任何其他部分。在各种实施方案中，pH传感器可以被配置用于对生物反应器中的pH进行连续的、间歇的或定期的监测，其中周期性地对生物反应器的一部分流体进行采样。
在各种实施方案中，系统控制器2095可以包括用于与非光学感测组件2690相互作用以操纵盒2610内的各种材料的控制器(例如控制系统或模块)。
B.细胞疗法制造盒
现在参考图24A，其示出了根据各种实施方案的细胞疗法制造系统盒2700(在本文中也被称为“CTMS盒2700”或“盒2700”)的示意性框图。盒2700被设计用于制造适合配制为细胞治疗剂的细胞群。盒2700被设计成与诸如图23A的CTMS2600的系统一起工作，并且因此本文包含的对盒2610的任何描述也适用于盒2700，反之亦然。术语盒(cartridge)和盒(cassette)在整个本公开中可互换使用，因此，盒(cartridge)2700可以被称为盒(cassette)2700。在各种实施方案中，单个盒2700可以用于各种类型的细胞制造应用，包括例如但不限于T淋巴细胞、工程化的T细胞、CAR-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、干细胞等的细胞群的制造。对于盒2700的每种具体配置，细胞制造应用可以是不同的。在各种实施方案中，单个盒2700用于单个细胞制造应用。
如图24A所示，盒2700包括容纳多个组件的衬底2705，这些组件包括但不限于一个或多个流体网络2710(也被称为“多个流体网络2710”)、一个或多个导流器2720(也被称为“多个导流器2720”)、一个或多个储存器2730(也被称为“多个储存器2730”)、一个或多个细胞培养室2750(也被称为“多个生物反应器2750”)、一个或多个分析区域2770(也被称为“多个分析区域2770”)和/或多个端口2780(也被称为“端口2780”)。根据配置，盒2700可以包括图24A中所示的任何或所有组件。例如，图24B示出了盒2702，其具有大储存器2732、四个较小储存器2734、细胞培养室/生物反应器2752和一对分析区域2772、2774；流体网络2710和导流器2720未示出。
在各种实施方案中，盒2700的衬底2705(在本文中也被称为“框架2705”)可以由聚合物制成，例如Ultem或聚丙烯，或任何类似的材料。在各种实施方案中，盒2700可以包括两个或更多个层或组件。在这样的实施方案中，可以使用一个或多个连接器2696将两个或更多个层或组件保持为彼此靠近。盒连接器2696的非限制性示例可以包括螺纹、粘合剂、销或焊接。
在各种实施方案中，每个流体网络2710包括通往和离开盒2700的各组件或室(例如培养室、储存器或分析区域)的多个互连通道。在各种实施方案中，流体网络2710还包括多个导流器(例如阀)，其用于调节或操纵通道内通往和离开盒2700的各组件的流体流动。流体可以含有例如但不限于试剂、细胞等。在各种实施方案中，流体网络2710可以偶联到一个或多个用于将细胞样品(例如来自患者/受试者样品或源自其的样品)或介质(例如细胞培养基、洗涤缓冲液、配制介质)引入到盒2700中的入口和/或一个或多个用于将材料(例如废液(例如，来自洗涤或测定)、重悬的细胞(例如，培养的细胞群、扩增的细胞群、配制的细胞群等)等)从盒2700中去除的出口。
在各种实施方案中，每个流体网络2710包括两个或更多个通道(例如2至50个通道、3至45个通道、4至40个通道、5至35个通道、6至30个通道、7至25个通道、8至20个通道、10至15个通道，或落入由两个上述端点所定义的范围内的任何数目的通道)。在各种实施方案中，流体网络2710中的通道的内部横截面尺寸(例如直径)为约200微米至约1500微米。更具体地，流体网络2710中的通道的内部横截面尺寸(例如直径)可以为约300微米至约1300微米(例如约300微米至约1100微米、约350微米至约1000微米、约400微米至约950微米、约450微米至约900微米、约500微米至约850微米、约550微米至约800微米、约600微米至约750微米或落在由两个前述端点所定义的范围内的任何横截面尺寸)；或者，流体网络2710中的通道的内部横截面尺寸(例如直径)可以为约500微米至约1500微米(例如约550微米至约1450微米、约600微米至约1400微米、约650微米至约1350微米、约700微米至约1300微米、约750微米至约1250微米、约800微米至约1200微米、约850微米至约1150微米、约900微米至约1100微米或落在由两个前述端点所定义的范围内的任何横截面尺寸)。在各种实施方案中，流体网络2710中的通道的横截面积可以为约0.10mm2至约1.00mm2(例如约0.15mm2至约0.90mm2、约0.20mm2至约0.80mm2、约0.25mm2至约0.70mm2、约0.15mm2至约0.30mm2、约40mm2至约80mm2、约50mm2至约70mm2)。
在各种实施方案中，每个导流器2720可以包括一个或多个阀，包括但不限于旋转阀、2通阀、3通阀或4通阀、气动致动阀等。在各种实施方案中，盒2700可以包括两个或更多个导流器2720/阀(例如2至20个、3至18个、4至16个、5至14个、6至12个、8至10个导流器2720/阀，或落在由两个前述端点所限定的范围内的任何数目的导流器2720/阀)。在各种实施方案中，导流器2720与流体网络2710的通道结合可以操纵盒2700内的流体的流动。例如，导流器2720与流体网络2710的通道组合可以用于混合流体、隔离某些通道、疏通/清理某些通道、对某些通道进行消毒，并且在一些情况下，可以帮助减少流体网络2710的某些通道内的死体积(例如，通过使用气体推动一个或多个通道中的流体)。因此，导流器2720/阀可以被放置在盒中的任何位置，以促进其调节通过流体网络2710的流体流动的能力，而不干扰盒2700的其他组件(例如，储存器2730、细胞培养室/储存器2750、分析区域2770等)的功能。
在各种实施方案中，储存器2730可以包括用于储存试剂的室，其可以包括测定试剂，包括但不限于可用于对细胞进行染色的化合物(例如，吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、可以被标记(例如荧光标记)的抗体或其他蛋白质等)、测定缓冲液和/或颗粒(例如珠(例如，用于结合细胞分泌物，例如细胞因子分泌物))、细胞(例如，抗原呈递细胞、用于细胞杀伤测定的靶细胞等)等。在各种实施方案中，每个储存器2730与至少一个导流器2720和/或流体网络2710的一个或多个通道流体连通。在各种实施方案中，每个储存器2730的体积可以为至少2ml(例如体积为约2ml至约200ml、约2ml至约100ml、约2ml至约50ml、约2ml至约20ml、约2ml至约10ml、约2ml至约5ml、约5ml至约250ml、约5ml至约200ml、约5ml至约150ml、约5ml至约100ml、约5ml至约50ml、约5ml至约25ml、约5ml至约10ml、约10ml至约500ml、约10ml至约250ml、约10ml至约150ml、约10ml至约100ml、约10ml至约50ml、约10ml至约35ml、约10ml至约25ml、约25ml至约750ml、约25ml至约500ml、约25ml至约250ml、约25ml至约150ml、约25ml至约100ml、约25ml至约75ml、约25ml至约50ml、约50ml至约1000ml、约50ml至约750ml、约50ml至约500ml、约50ml至约250ml、约50ml至约150ml、约50ml至约100ml、约100ml至约1500ml、约100ml至约1000ml、约100ml至约750ml、约100ml至约500ml、约100ml至约250ml、约250ml至约2000ml、约250ml至约1500ml、约250ml至约1000ml、约250ml至约750ml或约250ml至约500ml。通常，每个储存器2730的体积将为约2ml至约20ml、约10ml至约50ml、约25ml至约150ml、约100ml至约500ml或约250ml至约1500ml。在各种实施方案中，试剂可以被储存在一个或多个储存器2730中，以在盒2700的操作期间使用。在各种实施方案中，试剂可以经由一个或多个端口2780(例如，入口端口)补充或添加到盒2700，所述端口直接连接到一个或多个试剂袋，或者例如经由参照图23A示出和描述的CTMS2600的一个或多个流体连接而间接连接。
在各种实施方案中，盒2700可包括细胞培养室2750(或生物反应器2750)，其被配置用于培养细胞。生物反应器2750可以包括多个开口(例如入口/出口开口)、底座、侧壁和盖。在某些实施方案中，盖可以是可移动的(例如，以减小生物反应器2750的体积并产生压力以驱动流体流出生物反应器2750)。在某些实施方案中，生物反应器的内部体积可以为至少20ml(例如至少50ml、75ml、100ml、125ml、150ml、175ml、200ml或更多)。
在各种实施方案中，生物反应器2750可以包括生物反应器2750的任何或所有表面内的功能化的表面。在各种实施方案中，功能化的表面包括化学功能化的表面、生物化学功能化的表面、生物功能化的表面和/或结构工程化的表面以及许多其他方法。在各种实施方案中，生物反应器2750的底座表面2754、2756、2758(例如具有最低重心的底板或表面)可以被功能化为具有多个凹入特征，例如凹坑或凹槽。凹入特征可以具有各种形状和纵横比，并且多个凹入特征中的单个凹入特征可以具有与多个凹入特征中的其他凹入特征相比不同的形状和/或纵横比。凹入特征的示例包括二等分球体(例如半球形空腔)、圆锥形空腔或细长空腔(例如二等分球形椭球体或二等分泪滴、二等分卵形或更一般地二等分长椭球体形状的凹槽)。图24B和24C中示出了生物反应器2752的示例，该生物反应器2752具有带有锥形空腔2755阵列的底座表面2754；图24D中示出了生物反应器的示例，该生物反应器具有带有细长空腔2757的阵列的底座表面2756。在各种实施方案中，多个凹入特征中的凹入特征是细长空腔，每个细长空腔的长轴基本上平行于多个凹入特征中的其他细长空腔的长通道。参见例如图24G。在各种实施方案中，每个细长空腔的特征在于最深点、具有第一端和第二端的长轴以及由室的底座的内表面与连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段限定的约45°至约90°的角度；在各种相关的实施方案中，每个细长空腔的特征在于由室的底座的内表面和连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段限定的小于45°的角度。在各种实施方案中，每个细长空腔的特征在于最深点、具有第一端和第二端的长轴以及连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段，该线段短于连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段。
在各种实施方案中，生物反应器2750/2752的表面(例如底座表面2754、2756、2758)可以用多个凹入特征功能化，其中每个凹入特征具有(即，被配置为容纳)约200纳升至约5微升的体积(例如约300纳升至约4.0微升、约400纳升至约3.0微升、约500纳升至约2.5微升、约500纳升至约1.5微升、约600纳升至约1.4微升、约700纳升至约1.3微升、约800纳升至约1.2微升、约900纳升至约1.1微升、约1.5微升至约2.5微升、约1.6微升至约2.4微升、约1.7微升至约2.3微升、约1.8微升至约2.2微升、约1.9微升至约2.1微升或落在由两个前述端点所限定的范围内的任何体积)。
在各种实施方案中，多个凹入特征中的每个凹入特征(例如圆锥形空腔)可以包括约1:2至约1.4(例如约1:2.5至约1:3.5或约1:3)的纵横比(即，细胞培养室的底座表面的开口的直径:凹入特征的深度)。在各种实施方案中，多个凹入特征中的每个凹入特征(例如细长空腔)包括约1:2至约1:5(例如约1:2.5至约1:4.5、约1:3至约1:4或约1:3.5)的纵横比(即，凹入特征最宽部分处的宽度:凹入特征的长度)。
在各种实施方案中，细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征(例如半球形或圆锥形空腔)包括约1500至4000个凹入特征(例如约1500至约3000个、约1750至约2750个、约2000至约2500个、约2200至约2400个、约2500至约4000个、约2750至约3750个、约3000至约3500个或约3200至约3300个凹入特征)。在各种实施方案中，细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征(例如细长空腔)包括约500至1500个凹入特征(例如约500至约1200个、约550至约1100个、约600至约1000个、约650至约900个、约700至约850个或约750至约800个凹入特征)。
在各种实施方案中，多个凹入特征中的所有凹入特征的总空腔体积为约1.5ml至约4.5ml(例如约2.0ml至约4.0ml、约2.0ml至约3.0ml、约2.25ml至约2.75ml、约3.0ml至约4.0ml或约3.25ml至约3.75ml)。在各种实施方案中，多个凹入特征中的所有凹入特征(例如细长空腔)的总空腔体积为约0.5ml至约3.0ml(例如约0.75ml至约2.5ml、约1.0ml至约2.0ml、约1.1ml至约1.9ml、约1.2ml至约1.8ml、约1.25ml至约1.75ml、约1.3ml至约1.7ml、约1.4ml至约1.6ml或约1.5ml)。
在各种实施方案中，生物反应器2750的表面(例如底座表面2754、2756、2758)的面积将为约100cm2至约500cm2(例如约150cm2至约400cm2、约200cm2至约350cm2、约225cm2至约300cm2或落在由两个前述端点所限定的范围内的任何面积)。在某些实施方案中，用多个凹入特征功能化的生物反应器2750的表面(例如底座表面2754、2756、2758)的合计空腔体积将为约1.0ml至约5.0ml(例如约1.5ml至约4.5ml、约2.0ml至约4.0ml、约2.5ml至约3.5ml、约1.0ml至约2.0ml、约1.25ml至约1.75ml、约2.0ml至约3.0ml、约2.25ml至约2.75ml、约3.0ml至约4.0ml、约3.25ml至约3.75ml，或落入由两个前述端点所限定的范围内的任何体积)，其中“合计空腔体积”被定义为多个凹入特征中的所有凹入特征的体积的总和)。一般而言，用具有较小体积(例如，约500纳升至约1500纳升的体积)的凹入特征功能化的生物反应器2750的表面(例如底座表面2754、2756、2758)将比用具有中等体积(例如约1.5微升至约2.5微升的体积)的凹入特征功能化的生物反应器2750表面(例如底座表面2754、2756、2758)具有更多的凹入特征；并且用具有中等体积(例如约1.5微升至约2.5微升的体积)的凹入特征功能化的生物反应器2750的表面(例如底座表面2754、2756、2758)将比用具有较大体积(例如约2.5微升至约3.5微升的体积)的凹入特征功能化的生物反应器2750表面(例如底座表面2754、2756、2758)具有更多的凹入特征；等等。
在某些实施方案中，盒2700的生物反应器2750可以具有至少50ml的体积和面积为约100cm2至约500cm2的内表面(例如，底座表面2754、2756、2758)，其包括合计空腔体积为约1.0ml至约5.0ml的多个凹入特征，其中多个凹入特征包括约2000至约4000个空腔(例如，半球形或圆锥形空腔)，每个空腔具有约500纳升至约1500纳升的体积。在其他实施方案中，盒2700的生物反应器2750可以具有至少50ml(例如至少100ml)的体积以及面积为约200cm2至约350cm2(或约225cm2至约300cm2)的内表面(例如底座表面2754、2756、2758)，其包括合计空腔体积为约2.0ml至约4.0ml(或约2.0ml至约3.0ml或约3.0ml至约4.0ml)的多个凹入特征，其中多个凹入特征包括约2000至约3500个空腔(例如半球形或圆锥形空腔)，每个空腔的体积为约500纳升至约1500纳升(或约800纳升至约1200纳升)。在其他实施方案中，盒2700的生物反应器2750可以具有至少50ml(例如至少100ml)的体积和面积为约100cm2至约500cm2的内表面(例如底座表面2754、2756、2758)，其包括合计空腔体积为约1.0ml至约2.5ml的多个凹入特征，其中多个凹入特征包括约400至约1000个空腔(例如细长空腔)，每个空腔的体积为约1.0微升至约3.0微升。在其他实施方案中，盒2700的生物反应器2750可以具有至少50ml(例如至少100ml的体积)和面积为约200cm2至约350cm2(或约225cm2至约300cm2)的内表面(例如底座表面2754,2756,2758)，其包括合计空腔体积为约1.0ml至约3.0ml(或约1.0ml至约2.0ml或约1.2ml至约1.8ml)的多个凹入特征，其中多个凹入特征包括约600至900个空腔(例如细长空腔)，每个空腔的体积为约1.0微升至约3.0微升(或约1.5微升至约2.5微升)。
在各种实施方案中，生物反应器2750的一个或多个功能化的表面可以用于激活T细胞。例如，一个或多个表面可以用如本文别处所述的包含T细胞激活剂的表面进行化学功能化(例如，用于抗原特异性或非抗原特异性激活)。在各种实施方案中，生物反应器2750的一个或多个功能化的表面可以用如本文别处所述的表面封闭配体和/或生物相容性聚合物功能化。在各种实施方案中，生物反应器2750可以经由多个入口/出口开口中的一个或多个流体偶联到流体网络2710。在各种实施方案中，生物反应器2750包括通向生物反应器2750的入口开口，用于将流体(例如，细胞样品、培养基、洗涤缓冲液、试剂、配制介质等)引入到生物反应器2750中。
在各种实施方案中，生物反应器2750可以包括可移动盖，其可通过例如气动致动器致动，以促进介质(例如试剂和细胞)流入和/或流出生物反应器2750。在各种实施方案中，生物反应器2750可以包括用于使用加压空气或气体以促进介质(例如试剂和细胞)流入和/或流出生物反应器2750的机构。
在各种实施方案中，分析区域2770可以包括血细胞计数器或者可以与基于光学的感测组件(例如CTMS2600的光学感测组件2640)或任何合适的基于光学的分析技术一起使用的微流体芯片或装置。在各种实施方案中，微流体芯片或装置可以包括流动区域和/或室，细胞可以加载到其中并进行分析。在各种实施方案中，微流体芯片或装置可以包括流动区域和从流动区域打开的一个或多个室(例如隔离坞)。流动区域可以包括一个或多个(例如多个)微流体通道。在各种实施方案中，一个或多个室(例如隔离坞)中的每一个都可以从微流体通道打开。流动区域、微流体通道、室和隔离坞可以如下面结合图2A-2G所描述的。
在各种实施方案中，微流体芯片或装置可以包括具有介电泳(DEP)电极区域的电极激活衬底。在各种实施方案中，如本文别处所述，DEP电极区域可以是光激活的(例如，光电晶体管或由光电晶体管开关控制的电极)。因此，在某些实施方案中，微流体芯片或装置能够执行基于光学的细胞操纵(例如光电定位(或OEP))，其中DEP力由基于光学的感测组件2640产生的结构光激活。下面参考图1B和1C进一步描述DEP力的基于OEP的控制的附加细节。无论是光激活还是其他方式，电极激活衬底的DEP电极区域都可以被选择性地激活，以允许将颗粒(例如珠和/或细胞)确定性地加载到包括隔离坞的室中。因此，作为在盒2700的分析区域2770中进行的测定的一部分，具有DEP配置的微流体芯片或装置可以用于移动颗粒(例如珠和/或细胞)。
在各种实施方案中，微流体芯片或装置不包括电极激活衬底，并且相应地，衬底将不具有DEP配置。
在各种实施方案中，分析区域2770可以包括血细胞计数器或者可以与CTMS2600的除基于光学的感测组件之外的感测组件2690一起使用的微流体芯片或装置。
i.生物反应器模块
如图24E所示，根据各种实施方案提供了生物反应器2750。在各种实施方案中，生物反应器2750可以流体连接到盒2700的流体网络2710。在各种实施方案中，生物反应器2750包括具有一个或多个入口开口3102a、3102b的无菌生物反应器隔室3100。在各种实施方案中，每个入口开口3102a、3102b可以连接到盒2700的流体网络2710。在其他实施方案中，每个入口开口3101a、3102b可以是直接连接到CTMS2600的流体网络的端口。
在各种实施方案中，入口开口3102a、3102b可以定位在预先选择的高度处。在各种实施方案中，入口开口3102a、3102b可以允许介质(例如细胞培养基、洗涤缓冲液、试剂、配制介质，其可以任选地包括颗粒(例如珠、细胞等))进入生物反应器2750并且促进本文所述的各种过程和方法(例如分选、T细胞激活、扩增)。在各种实施方案中，入口开口3102a、3102b可以包括或连接到调节流体进入生物反应器2750的流动的阀。
在各种实施方案中，一个或多个传感器3108、3110、3112可以被集成到生物反应器2750中或以其他方式连接到生物反应器2750。在各种实施方案中，可以将流体的等分试样从生物反应器2750内移出并引导至一个或多个传感器3108、3110、3112以进行分析。在替代实施方案中，一个或多个传感器3108、3110、3112可以与生物反应器2750的生物反应器隔室3100内的内容物(例如流体)直接流体接触或光学接触。在各种实施方案中，一个或多个传感器包括溶解氧传感器(例如传感器3108)。在各种实施方案中，一个或多个传感器包括pH传感器(例如传感器3110)。在各种实施方案中，一个或多个传感器包括压力传感器(例如传感器3112)。在各种实施方案中，一个或多个传感器包括温度传感器。在各种实施方案中，一个或多个传感器3108、3110、3112可以与CTMS2600的系统控制器2605电子通信。响应于环境条件或预定义的过程中的步骤，系统控制器2605可以激活例如温度控制和感测组件2680、致动组件2650(例如倾斜机构)、被配置成向盒2700提供加压空气和/或流体的一个或多个阀2660或系统2600的任何其他组件。
在各种实施方案中，流体可以通过一个或多个出口开口3104a、3104b、3104c、3104d离开生物反应器2750。在各种实施方案中，出口开口3104a、3104b、3104c、3104d可以包括或连接到调节流体离开生物反应器2750的流动的阀。根据本文所述的过程中的步骤，离开生物反应器2750的流体可以通过不同的出口开口3104a、3104b、3104c、3104d离开。例如，
在各种实施方案中，生物反应器2750可以包括访问端口3106。在某些实施方案中，访问端口3106可以允许在细胞制造过程期间(例如，如果在过程中遇到问题、盒2700或系统2600的运行或由于任何其他原因)或在细胞制造过程完成时从生物反应器2750提取细胞样品。
在各种实施方案中，生物反应器2750包括生物反应器壁3120。生物反应器壁3120可以采用能够形成生物反应器隔室3100的任何形状。在各种实施方案中，生物反应器壁3120包括表面3122(例如内表面)，其可以包括底座表面2758。在一些实施方案中，表面3122(或底座表面2758)的全部或一部分可以被功能化以产生刺激表面(例如，T细胞激活表面，其可以是抗原呈递表面，用于抗原依赖性激活/刺激，或非抗原依赖性激活表面)。
ii.在线QC测定模块
返回图24A，在各种实施方案中，分析区域2770可用于各种测定类型。在各种实施方案中，如在此和下文进一步详细描述的，盒2700的分析区域2770提供了用于促进在线质量控制测定(例如细胞计数、活力、身份和/或功能)的独特能力。执行在线QC测定的一个有利方面是CTMS2600和盒2700能够执行测定而无需从盒2700和/或系统2600中取出样本，以根据需要提供连续的、间歇的和/或定期的质量控制检查。
在各种实施方案中，端口2780包括用于将流体吸入到盒2700中的一个或多个输入端口和用于使流体从盒2700中流出的一个或多个输出端口。在各种实施方案中，盒2700的端口2780流体连接到系统的一个或多个管、储存器、泵等，例如针对图23A示出和描述的CTMS2600。
如图24F所示，根据各种实施方案，盒2700可以包括具有预设温度的一个或多个区、区域或隔室。例如，盒2700可以包括：包括生物反应器2750的暖区2700a、包括一个或多个测定区域2772、2774(例如微流体芯片或装置)的另一暖区2700b(其可以具有与暖区2700a相比相同的温度或不同的温度设定)、包括用于储存试剂等的一个或多个储存器2730(例如R1、R2、C1、C2、C3)的一个或多个冷区2700c以及用于一个或多个储存器2730(例如R3、C4、C5、C6)的保持在室温或环境温度的一个或多个区2700d。在各种实施方案中，盒2700中的每个区/区域/隔室的温度或温度范围可以单独地、独立于其他地、以两个、三个或四个为一组地或总共地针对每个区、每个区域或每个隔室进行预设或维持。在某些区中保持一定的温度同时在不同的区中保持不同的温度可以有助于在它们各自的最佳环境下维持试剂或细胞、实现细胞生长、进行测定等。
图24G示出了根据各种实施方案的盒2800的示例性配置。尽管在图24G的图示中示出了特定布局，但盒2800中图示的任何或所有组件的放置可以基于制造细胞产品中使用的过程的特定需要来设计。示例性盒已被指定为2800，但应当理解，这是盒2700的示例并且对盒2700的组件的描述完全适用于盒2800的相应组件。
如图所示，盒2800包括容纳多个组件的衬底2805，所述组件包括但不限于一个或多个流体网络2810(也被称为“流体网络2810”)、一个或多个导流器2820(也被称为“导流器2820”)、一个或多个储存器2830(也被称为“储存器2830”)、一个或多个生物反应器2850(也被称为“生物反应器2850”)、一个或多个分析区域2870(也被称为“分析区域2870”)和/或多个端口2880(也被称为“端口2880”)。
在各种实施方案中，流体网络2810包括通往或离开各组件的多个互连通道，所述组件例如一个或多个导流器2820、一个或多个储存器2830、生物反应器2850、一个或多个分析区域2870和/或一个或多个端口2880。
如图24G所示，导流器2820包括导流器2820-F1和2820-F2(示出了位置但未示出结构；在本文中统称为“2820-F”)和多个阀2820-V1、2820-V2、2820-V3、2820-V4、2820-V5、2820-V6、2820-V7和2820-V8(示出了位置但未示出结构；在本文中统称为“阀2820-V”)。在各种实施方案中，导流器2820-F可以是流量计或热流量传感器。在各种实施方案中，多个阀2820-V是被配置用于流体网络2810内的一个或多个通道的流量控制的旋转阀。在各种实施方案中，多个阀2820-V经由电机控制以旋转从而打开和关闭某些通道(特定阀与之流体连接)。在各种实施方案中，多个阀2820-V由PEEK、PTFE、Ultem或任何类似的合适的材料制成。
在各种实施方案中，储存器2830包括用于储存试剂的多个储存器2830。在各种实施方案中，多个储存器2830包括QC试剂储存器2830-C1、2830-C2、2830-C3、2830-C4、2830-C5和2830-C6(在本文中统称为“QC试剂储存器2830-C”)以及生物反应器试剂储存器2830-R1、2830-R2、2830-R3(在本文中统称为“生物反应器试剂储存器2830-R”)。在各种实施方案中，QC试剂储存器2830-C被配置成储存用于质量控制(QC)测定的试剂。在各种实施方案中，QC试剂储存器2830-C的储存体积为约0.01mL至约50mL、约0.1mL至约25mL或约1mL至约5mL，包括其间的任何储存体积范围。在各种实施方案中，QC试剂储存器2830-C被配置成在室温或在约0℃至约45℃、约2℃至约37℃或约4℃至约25℃的温度(包括其间的任何温度范围)下储存试剂。在各种实施方案中，生物反应器试剂储存器2830-R被配置成储存用于生物反应器2750的试剂。在各种实施方案中，生物反应器试剂储存器2830-R的储存体积为约0.01mL至约80mL、约0.1mL至约30mL或约1mL至约8mL，包括其间的任何储存体积范围。在各种实施方案中，生物反应器试剂储存器2830-R被配置成在约0℃至约45℃、约2℃至约37℃或约4℃至约25℃的温度(包括其间的任何温度范围)下储存试剂。在各种实施方案中，多个储存器2830由Ultem；COC、COP、聚碳酸酯或任何合适的材料制成。
在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成培养细胞(例如免疫细胞，如T细胞、干细胞等)。在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成生长，从而扩增其中所含的细胞数目(例如T细胞扩增)。在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成执行细胞分选过程(例如T细胞分选)。在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成执行细胞刺激过程(例如T细胞激活)。在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成执行分选激活过程(例如作为并行过程的T细胞分选和激活)。在各种实施方案中，生物反应器2850可以通过使用自动控制系统(例如，系统2600的系统控制器2605)来执行过程的步骤，用于引入和去除流体和/或热量，增加或减少流体内的溶解气体浓度和/或改变流体的pH，作为生物反应器2850的可控环境条件的非限制性示例。
在各种实施方案中，生物反应器2850被配置成在约18℃至约45℃、约21℃至约40℃或约25℃至约37℃(包括其间的任何温度范围)的温度下进行生化反应。
在各种实施方案中，分析区域2870用于进行QC测定。在各种实施方案中，分析区域2870包括一个或多个微流体芯片或装置，例如分析区域2870-1和2870-2，其可以与基于光学的感测组件(例如CTMS2600的光学感测组件2640)或任何合适的基于光学的分析技术一起使用，或者与CTMS 2600的非光学感测组件2690一起使用。无论使用何种技术，分析区域2870都被配置成执行与细胞制造相关的测定。在各种实施方案中，集成在盒2800的分析区域2870中的微流体芯片或装置可以包括或不包括微流体通道、室(例如隔离坞)和/或电极激活衬底。在各种实施方案中，分析区域2870被配置成在约0℃至约70℃、约10℃至约60℃、约18℃至约50℃或约25℃至约37℃的温度(包括其间的任何温度范围)下执行分析。
在各种实施方案中，多个端口2880包括用于流体吸入和/或流出的多个端口。如图24G所示，多个端口2880包括用于连接至气体源的端口2880-G1、2880-G2、2880-G3和2880-G4(在本文中统称为“端口2880-G”)，例如用于吸入气体以用于移动流体网络2810内的流体和/或介质或者盒2800内的任何其他组件。在各种实施方案中，多个端口2880包括注入端口2880-I，用于将盒2800中注入材料，包括细胞和/或流体(例如培养基、试剂、洗涤缓冲液、配制介质等)；最终端口2880-F，用于输出最终产物；废物端口2880-W，用于储存来自盒2800内的反应的废物；和/或端口2880-B1和2880-B2，用于连接待输入到盒2800中或从盒2800中输出的介质、流体和/或任何相关材料的袋。
V.示例性细胞疗法制造方法
在各种实施方案中，本节中描述的细胞疗法制造方法可以使用本文各节中描述的细胞疗法制造系统2600、盒2700以及适当的样品/细胞和试剂(参见图25A)来进行。复合系统已被指定为3300，但应当理解，对系统2600的组件、盒2700、2800、样品/细胞和试剂的前述描述完全适用于系统3300的相应组件。细胞疗法制造系统3300的各个过程可以针对接收细胞样品，然后处理样品或样品的一部分(例如培养)以生产产品(例如细胞疗法产品)。
参考图25B，公开了根据各种实施方案的通过细胞疗法制造系统3300的流动路径，用于将细胞(例如，免疫细胞，如T细胞、干细胞等)引入到细胞疗法制造系统中的过程。在各种实施方案中，细胞样品可以通过无菌地且流体地偶联到系统的流体网络3362的主入口引入。在各种实施方案中，例如，系统的流体网络3362可以将含有细胞样品的容器3310的内容物引导至生物反应器3399(也参见图24E的2750)。在各种实施方案中，细胞疗法制造系统3300包括由流体网络3362连接的各个室(例如包括室的生物反应器3399)和隔室的被围住的无菌系统。
在各种实施方案中，细胞样品可以包括来自受试者的细胞样品。细胞样品的非限制性示例可以包括全血或其部分(例如PBMC)。全血可以从受试者的抽血中获得，并且PBMC可以使用本领域已知的方法来制备。细胞样品的另一个非限制性示例可以包括组织样品(例如，解离的细胞样品，例如可以从肿瘤、骨髓或干细胞隔室的解离获得)。
将细胞输入到细胞疗法制造系统3300中的方法的非限制性示例可以包括将容器3310无菌地且流体地连接到细胞疗法制造盒(例如2700、2800)。在各种实施方案中，容器3310的无菌隔室可以储存来自受试者的细胞样品，其包括起始材料(例如，包括T细胞的介质)以经历细胞疗法制造方法的一个或多个过程。在各种实施方案中，容器3310可以是柔性容器，例如被配置成容纳流体的医药级袋。在各种实施方案中，容器3310可以流体地且无菌地连接到系统(例如2600)以进行处理，然后进入盒(例如2700、2800)。在各种实施方案中，容器3310可以直接流体地且无菌地连接到盒(例如2700、2800)。
如本文所述，细胞疗法制造系统3300的各种实施方案可以包括加压的流体源(例如用于液体或气体的加压的源3302、3304、3306、3308)。在各种实施方案中，使用气体源3304，气体源3304可以对流体网络3362加压，以移动容器3310的内容物通过细胞疗法制造系统。在各种实施方案中，流体网络3362包括阀3314、3316、3318、3320、3322、3324、3326和3328以及可由其他系统(例如，用于接收传感器数据以及致动系统组件例如导流器2720或阀的控制系统2605)控制的流量传感器3330和3332。在各种实施方案中，细胞样品可以使用附加或替代方式移动通过流体网络3362。例如，在一些实施方案中可以使用泵来移动细胞样品通过流体网络3362。根据各种实施方案，泵可以是蠕动泵。在各种实施方案中，重力可以驱动细胞样品通过流体网络3362。
各种环境因素都会影响细胞样品。例如，在设计和/或操作细胞疗法制造系统时可以考虑温度、介质组成和物理创伤。作为非限制性示例，可以通过维持细胞样品的最佳压力条件来减轻物理创伤影响细胞样品的可能性。在各种实施方案中，可以操作气体源3302、3304、3306、3308以在可以允许细胞样品内的细胞存活和在各种实施方案中增殖的压力范围内对流体网络3362或其一部分加压。可以调节压力以减轻细胞损伤。可以调节压力以消除细胞损伤。在各种实施方案中，可以选择低压。
在各种实施方案中，可以通过一个或多个阀(例如3316)将细胞样品引导到生物反应器3399的入口开口3350、3352。在各种实施方案中，可以将细胞样品引导到第二入口开口3352。在各种实施方案中，可以将细胞样品引导到第一入口开口3350。在各种实施方案中，入口开口3350、3352可以固定至生物反应器壁(例如3120)以允许细胞样品无菌地进入生物反应器3399。在各种实施方案中，通过生物反应器3399内的下部端口(例如第二入口开口3352)将细胞样品引入到下部位置可以在一些实施方案中防止细胞损伤。在各种实施方案中，在生物反应器3399中的下部位置处引入细胞样品可以减少生物反应器起泡。
在各种实施方案中，细胞样品可以使用第二入口开口3352进入生物反应器3399，直到流体达到指定水平。在各种实施方案中，控制系统3364可以致动阀3318，以在达到指定水平后将流体流动从生物反应器3399的第二入口端口3352重定向至生物反应器3399的第一入口开口3350。在各种实施方案中，可以使用液位传感器来确定生物反应器3399的液位。根据各种实施方案，液位传感器可以将液位信息传递给控制系统3364。然后控制系统3364可以将生物反应器3399的液位与指定的液位进行比较并确定是否致动阀3318。
在各种实施方案中，生物反应器3399包括有限的体积(先前讨论)。因此，当气体源3304引入加压气体以能够将细胞样品引入到生物反应器3399中时，需要排出过量的流体或气体。在各种实施方案中，流体/气体可以通过出口开口3354、3356、3358、3360排出。在各种实施方案中，当流体/气体通过一个或多个出口开口3354、3356、3358、3360释放时，可以通过第二入口开口3352将细胞样品引入到生物反应器3399中。根据各种实施方案，可以使用未被引入到生物反应器3399中的液体(例如细胞样品)浸没的出口开口来发生流体/气体释放。在各种实施方案中，出口开口3354、3356、3358、3360可以在它们被浸没时被关闭。在各种实施方案中，由液位传感器测量的液位可以确定出口开口3354、3356、3358、3360关闭的顺序。在各种实施方案中，引入到生物反应器3399中的流体可以在引入到细胞疗法制造系统中之前被量化，并且这些量可以被控制系统3364用来确定何时致动开口阀或盖。
在各种实施方案中，入口开口2750、3352和出口开口3354、3356、3358、3360可由于多种原因而被关闭或打开。在各种实施方案中，处理步骤(例如细胞样品引入、细胞刺激(例如T细胞激活)、扩增等)可以使用开口来确定包含介质和试剂的流体的流入和/或流出的发生和速率。在各种实施方案中，生物反应器3399内的环境条件(例如压力、液位、pH或溶解氧)可以确定介质和试剂的流入和/或流出。
根据各种实施方案，当流体(例如加压气体)离开出口开口3354、3356、3358、3360时，其可被引导通过阀3320。在各种实施方案中，流体流量传感器3332可以确定当流体离开生物反应器3399时流体的流速。在各种实施方案中，一个或多个额外的阀3326、3328可以将流体分别引导到废物容器3342、3344。在各种实施方案中，系统控制器3364可以从流体流量传感器3320接收流体流速的信息。在各种实施方案中，系统控制器3364可以致动气体源3304处的阀以增加或减少流体流速。
在各种实施方案中，废物容器3342、3344中的流体可以经历进一步的测试。在各种实施方案中，进一步的测试可以包括一个或多个生物学测定。在各种实施方案中，废物容器3342、3344可以包括由废物容器壁围绕的无菌隔室。
A.T细胞分选、激活和表面
各种实施方案可以包括使用细胞疗法制造系统3300的细胞分选过程作为T细胞激活过程的独立部分。在各种实施方案中，细胞分选过程和T细胞激活过程可以组合成单个步骤。组合的过程可以缩短细胞疗法制造方法。在各种实施方案中，可以将细胞分选过程、T细胞激活过程和扩增过程组合。
在各种实施方案中，本文所述的表面(例如T细胞激活表面，其可以是抗原呈递表面或非抗原呈递表面)可以适合于同时分选和激活T细胞。
i.T细胞分选技术
各种实施方案可以包括用于细胞分选的快速且自动化的系统和方法。在各种实施方案中，本文公开的细胞分选技术可用于选择性地耗尽或富集特定表型的细胞。在各种实施方案中，本文公开的细胞分选技术可以使用免疫磁性选择。传统的细胞分选技术是从现有的研究相关的仪器(例如流式细胞术)改编的。在细胞疗法制造工作流程中使用这些技术作为独立装置的缺点可能是它们包括开放系统，其中细胞样品污染可能导致工作流程中断，导致细胞疗法产品无法使用。其他造成的问题与当前危及细胞活力的分选系统有关。造成的问题具体与细胞受到苛刻的物理力(例如，流经流式细胞仪的流动池)有关。
因此，本文所述的封闭式细胞疗法制造系统解决了细胞疗法领域内的细胞分选污染挑战。在各种实施方案中，在当前公开的细胞疗法制造系统上进行的分选方法可以基于多个参数来纯化细胞。
图21A示出了根据各种实施方案的细胞样品分选过程2400的示意性流程图。根据各种实施方案，步骤2402提供细胞样品。在各种实施方案中，细胞样品可以经历各种预处理步骤。例如，当细胞样品包含全血时，可以在步骤2404之前使用采用一根或多根柱与离心步骤相结合的方法。在一些实施方案中，可以用缓冲液稀释细胞样品。在一些实施方案中，缓冲液可以包括PBS/EDTA。
根据各种实施方案，步骤2404将细胞样品与结合表面一起孵育。在各种实施方案中，细胞样品的T细胞可以结合到结合表面。在各种实施方案中，T细胞以外的分子不能结合到表面。在各种实施方案中，T细胞被特异性结合。在各种实施方案中，结合(例如，共价地)到结合表面的一种或多种捕获分子可以结合T细胞。在各种实施方案中，嵌入到T细胞的细胞表面中的T细胞受体(TCR)可以结合结合表面的捕获分子。在各种实施方案中，结合表面可以提供初级和共刺激信号。在各种实施方案中，结合表面可以包括CD3激动剂(例如抗CD3抗体)。在各种实施方案中，结合表面可以包括CD28激动剂(例如抗CD28抗体)和/或CD2激动剂(例如抗CD2抗体)。在各种实施方案中，结合表面可以包括与CD28激动剂(例如抗CD28抗体)和/或CD2激动剂(例如抗CD2抗体)组合的CD3激动剂(例如抗CD3抗体)。实施方案的各个方面包括特异性结合到抗CD3抗体的T细胞。实施方案的各个方面包括特异性结合到抗CD28抗体和/或抗CD2抗体的T细胞。实施方案的各个方面包括特异性结合到抗CD3抗体和抗CD28和/或抗CD2抗体的T细胞。在各种实施方案中，结合表面的捕获分子可以包括抗原。在各种实施方案中，抗原呈递表面可以包括与抗原结合的MHC I类分子。实施方案的各个方面包括结合到MHC I类分子的T细胞。
根据各种实施方案，在步骤2404中将细胞样品与结合表面一起孵育可以发生在细胞疗法制造系统内的多个位置。在各种实施方案中，表面可以位于仪器中流体可以流动的任何位置(例如流体网络或室)。在各种实施方案中，表面可以位于细胞疗法制造系统的盒(例如流体网络或生物反应器室)中。孵育时间的非限制性示例可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48或72小时以及这些的任何范围。
在各种实施方案中，可以操作与T细胞复合的珠用于细胞分选目的。例如，可以将珠与其他细胞和不溶性分子分选。例如，在一些实施方案中，可以使用过滤来分离和纯化珠-T细胞复合物。在各种实施方案中，可以使用光学操作来分离和纯化珠-T细胞复合物。在一些实施方案中，可以将珠-T细胞复合物离心成沉淀并且可以去除上清液。在各种实施方案中，珠可以被磁化。使用磁化珠的实施方案能够使珠-T细胞复合物在孵育和洗涤期间磁性固定至表面。
根据各种实施方案，步骤2406可以包括洗涤经孵育的细胞样品。本公开的各个方面包括用于洗涤结合至表面的T细胞的方法和系统。在各种实施方案中，一个或多个洗涤步骤可以通过分离T细胞来纯化细胞样品。根据各种实施方案，洗涤去除未结合的分子和细胞，同时保留T细胞。在各种实施方案中，洗涤可以去除细胞样品中的碎片、死细胞或其他不需要的分子或颗粒。例如，在各种实施方案中，未结合的分子或颗粒可以包括除T细胞之外的细胞、蛋白质、碳水化合物、核酸、离子、细胞废物等。
洗涤方法可以包括从细胞样品中去除一部分介质(例如液体悬浮液)。在各种实施方案中，可以在去除该部分介质期间或之后添加新的介质。在各种实施方案中，去除的介质包含未结合的分子。在各种实施方案中，T细胞在去除和添加步骤期间保持结合。在各种实施方案中，介质的去除和添加可以完成任何次数。例如，包括与表面结合的T细胞的细胞样品可以经历1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮的洗涤(例如，从细胞样品中去除一部分介质并向细胞样品中添加等量的介质)。洗涤步骤/轮次的数目可以通过纯度度量来确定。纯度度量可以包括T细胞与其他细胞的比例的百分比。纯度度量可以包括T细胞与其他非溶解分子的比例的百分比。
在步骤2408中，结合至表面的T细胞可以被再悬浮。一旦T细胞被分离和纯化，就可以将它们再悬浮在适合引入到细胞疗法制造方法的下一步的缓冲液中。在各种实施方案中，缓冲液可以包括PBS/EDTA缓冲液。
ii.系统上方法(仪器)
细胞疗法制造系统的各种实施方案可以包括根据本文公开的各种细胞分选方法在仪器上完成细胞样品分选过程2400。在各种实施方案中，细胞疗法制造系统可以包括仪器和盒。在各种实施方案中，盒可以包括可流体偶联到仪器的流体网络的模块化装置。在各种实施方案中，细胞样品分选过程2400可以在系统的仪器上进行。在各种实施方案中，细胞样品分选过程2400可以在细胞样品或其一部分进入盒之前发生。在各种实施方案中，细胞样品的T细胞可以在仪器内经历预分选过程(例如洗涤和/或纯化)。
细胞样品分选过程2400的各个方面可以使用一个或多个表面来进行。在各种实施方案中，细胞样品分选过程2400可以使用仪器内的一个或多个表面。例如，在各种实施方案中，表面可以位于仪器的流体网络内。在各种实施方案中，表面可以位于仪器的流体网络的一个或多个通道内。在另外的和替代的实施方案中，表面可以位于仪器的室或隔室内，其中室或隔室可以流体地且无菌地偶联到仪器的流体网络。
在各种实施方案中，步骤2402提供根据各种实施方案的细胞样品(例如白细胞单采物)。在各种实施方案中，细胞样品可以被无菌地储存在容器中。在各种实施方案中，可以使用一个或多个无菌连接器将容器无菌地连接到端口(例如，细胞疗法制造系统的用于接收样品的主端口)。
在各种实施方案中，储存细胞样品的容器可以定位在仪器外壳内。在各种实施方案中，容器可以定位在仪器外壳的外部并且主端口可以将容器连接到仪器的流体网络。
在各种实施方案中，一个或多个气体源可以对仪器的流体网络加压，以将细胞样品从容器移动到表面(例如细胞结合表面)。在各种实施方案中，可以使用控制器以致动仪器的一个或多个阀来控制细胞样品移动。在各种实施方案中，控制器可确定通向一个或多个表面的流动路径并致动适当的阀。在各种实施方案中，控制器可以从一个或多个流量传感器接收流速信息。然后可以使用流速信息来调节阀以实现期望的流速。
在各种实施方案中，步骤2404可以使用仪器内的一个或多个表面来进行。在各种实施方案中，细胞样品的T细胞可以贴附至一个或多个表面。
如先前所讨论的，该一个或多个表面可以包括抗原呈递表面或T细胞激活表面(例如，抗原非依赖性激活表面)，并且细胞样品的T细胞可以结合到仪器的一个或多个这样的表面。在一些实施方案中，如本文所述，T细胞可以结合到可磁化珠且可磁化珠可以磁性结合到仪器的一个或多个表面。在各种实施方案中，可以将细胞孵育指定量的时间以使T细胞结合到表面。一旦指定量的时间过去，可以使用洗涤孵育细胞样品过程2906在仪器上洗涤细胞样品(例如结合的T细胞)。如先前所讨论的，洗涤步骤(例如，添加和去除流体如洗涤缓冲液)可以发生一次或多次。
在各种实施方案中，在完成步骤2406之后，可以在仪器内开始再悬浮结合至表面的细胞的过程2408。在各种实施方案中，再悬浮可以包括使用控制器来致动一个或多个阀以产生用于引入再悬浮缓冲液(例如PBS/EDTA)的流动路径。
iii.系统上方法(盒)
细胞疗法制造系统的各种实施方案可以包括根据本文公开的各种细胞分选方法在盒上完成细胞样品分选过程2400。在各种实施方案中，细胞疗法制造系统可以包括仪器和盒。在各种实施方案中，盒可以包括可流体偶联到仪器的流体网络的模块化装置。在各种实施方案中，细胞样品分选过程2400可以在细胞样品或其一部分进入盒之后发生。在各种实施方案中，细胞样品的T细胞可以在盒上经历预分选过程(例如洗涤和/或纯化)。
在各种实施方案中，步骤2402可以通过主入口端口向细胞疗法制造系统提供细胞样品。在各种实施方案中，主入口端口可以直接流体地偶联至盒的流体网络。在各种实施方案中，主入口端口可以经由系统的仪器的流体网络流体地偶联到盒的流体网络。
在各种实施方案中，细胞样品分选过程2400的目的可以包括将分选的T细胞定位在盒的生物反应器中。根据各种实施方案，将T细胞定位在生物反应器内可以包括使用一个或多个阀将细胞样品通过流体网络引导到生物反应器。
在各个方面，可以根据步骤2404通过将细胞样品与表面(例如结合表面)一起孵育而将T细胞固定在盒的表面上。在各种实施方案中，表面可以位于流体网络内。在各种实施方案中，表面可以位于生物反应器内。
可以使用一个或多个洗涤步骤2406从细胞样品中去除细胞碎片和其他不需要的分子和颗粒。洗涤过程可以包括致动盒的一个或多个阀以提供用于使用加压气体源使洗涤流体移动通过系统的动力。在各种实施方案中，洗涤流体可以通过一个或多个入口端口进入生物反应器，并且流体(例如，来自细胞样品的流体、洗涤流体和加压气体)可以通过一个或多个出口端口离开生物反应器。洗涤过程可以涉及向生物反应器添加一种或多种流体的步骤以及从生物反应器移出一种或多种流体的步骤。
一旦T细胞达到期望的纯度水平，步骤2408就可以再悬浮结合至表面的T细胞。在各种实施方案中，当添加新介质时，T细胞可以保持与表面结合。在各种实施方案中，当添加新介质时，T细胞可以从表面释放。
iv.系统外方法
在各种实施方案中，可以在将细胞样品引入到细胞疗法和制造系统之前对其进行预分选。在各种实施方案中，T细胞捕获珠可以与细胞样品组合。在各种实施方案中，离心机可以对捕获珠:T细胞复合物施加力以在试管内产生沉淀。在各种实施方案中，可以去除细胞样品的上清液，并且可以将沉淀再悬浮在液体(例如缓冲液)中。在各种实施方案中，可以将细胞沉淀并再悬浮一次或多次，直到达到期望的纯度。
在各种实施方案中，可以使用荧光激活细胞分选(FACS)过程对细胞样品进行预分选。在各种实施方案中，T细胞可以被标记用于FACS分选。在各种实施方案中，T细胞可以结合至珠以用于分选。
在各种实施方案中，T细胞可以结合至可磁化珠。在各种实施方案中，可以激活表面以约束T细胞进行洗涤和再悬浮浮。
v.示例性细胞分选方法
可以使用图25A中所示的工作流程进行示例性细胞样品分选过程。在各种实施方案中，本文所述的各种工作流程(例如图25A-25I)中的任一种都可以在密封或封闭系统和/或无菌环境中进行。在各种实施方案中，本文所述的各种工作流程可以在单个封闭系统(例如台式系统)中进行。在各种实施方案中，本文所述的各种工作流程可以使用密封或封闭的盒、气密密封的盒和/或无菌的盒来进行。在各种实施方案中，可以将包含细胞样品的容器3310引入到细胞疗法制造系统中。在各种实施方案中，细胞样品可以通过无菌连接器通过主入口端口进入流体网络。在各种实施方案中，一个或多个阀3316、3318可以被致动至打开位置，允许流体流动通过细胞疗法制造系统。在各种实施方案中，气体源3304可以对流体网络加压并将细胞样品驱动至室。在各种实施方案中，室可以是生物反应器3399。
在各种实施方案中，从容器3310行进到室的细胞样品的流速可以通过流量传感器3330测量。流量传感器3330可以位于例如容器3310和室3399之间的流体网络中的任何位置。在各种实施方案中，流量传感器3330可以将流速电子地传送至控制系统3364。根据各种实施方案，控制系统3364可以致动一个或多个阀3316、3318以增加流速或减小流速。在各种实施方案中，用于将细胞样品引入到细胞疗法制造系统中的指定流速可以存储在控制系统3364中。在各种实施方案中，控制系统3364可以通过比较流速与指定流速这两者来基于指定流速来调节流速。
在各种实施方案中，T细胞可以在表面附近孵育，直到T细胞的一部分结合到表面。在各种实施方案中，T细胞可以直接结合至表面。在各种实施方案中，T细胞可以通过中介物(例如珠)结合。
在各种实施方案中，容器3312可以无菌地连接至细胞疗法和制造系统。在各种实施方案中，容器3312可以储存洗涤流体(例如缓冲液或介质)。在各种实施方案中，洗涤流体可以储存在一个或多个试剂储存器3346a、3346b、3346c中。
根据各种实施方案，一个或多个阀3314、3316、3318可以被致动以允许气体源3306对流体网络加压，从而将洗涤流体通过入口端口3350、3352输送到室。
在各种实施方案中，流体(例如，洗涤流体或细胞样品的液体/悬浮部分)可以通过一个或多个出口端口3354、3356、3358、3360离开生物反应器。在各种实施方案中，流体可以包括气体。在各种实施方案中，流体可以包括洗涤流体。在各种实施方案中，流体可以包含来自细胞样品的任何未结合的分子和/或颗粒(例如细胞)。在各种实施方案中，在离开一个或多个出口端口3354、3356、3358、3360之后，流体可以通过一个或多个阀3320、3326、3328行进至废物容器3344。在各种实施方案中，可以使用流量传感器3332来监测离开室的流体的流速。根据各种实施方案，流速传感器3332可以定位在室和废物容器3344之间的任何位置。在各种实施方案中，流量传感器可以将流量电子地传送至控制系统3364。在各种实施方案中，控制系统3364可以致动阀3320、3326、3328中的一个或多个以调节流速。
在各种实施方案中，可以在一个或多个步骤中将洗涤流体添加到室中。在各种实施方案中，可以在一个或多个步骤中将洗涤流体从室中去除。当T细胞结合时，可以多次添加和从室中移出液体，直至达到期望的T细胞纯度。
在各种实施方案中，控制系统3364可以包括用于一个或多个细胞分选方案的指令。在各种实施方案中，传感器可以将传感器数据(例如流速、pH、压力、溶解氧等)电子地传送至控制系统3364。在各种实施方案中，控制系统3364可以使用电子数据来调节流速和/或室内的环境条件。
在各种实施方案中，可以将经洗涤的细胞样品再悬浮。例如，可以将细胞样品的T细胞再悬浮在缓冲液中。在各种实施方案中，缓冲液可以包括PBS和EDTA。
vi.T细胞激活结构和表面
在各种天然系统中，来自患病细胞(例如癌细胞)的抗原可以被摄取并呈递到抗原呈递细胞(APC)的细胞表面上，然后APC可以激活T细胞，从而允许它们识别患病细胞。为了使细胞疗法制造系统有效，含有T细胞的细胞样品可以经历生物有机体中发生的类似过程。在各种实施方案中，细胞疗法制造系统可以包括使用APC来激活T细胞。在替代实施方案中，合成表面可以用于呈递抗原。
如本文所述，本文所述的表面(例如，在细胞样品分选过程和其他地方使用的表面)可以包括用于T细胞激活的激活分子。在各种实施方案中，可以在细胞样品分选过程完成之后进行激活。在各种实施方案中，T细胞激活过程或其一部分可以与细胞分选过程结合发生。
图21B示出了根据各种实施方案的与合成的抗原呈递表面3002结合的T细胞3008的T细胞受体3010。在各种实施方案中，合成的抗原呈递表面3002可包含结合至表面3004的抗原3006。在各种实施方案中，表面3004可以位于细胞疗法制造系统内。在一些实施方案中，表面3004可以位于系统的仪器的无菌流体网络内。在各种实施方案中，表面3004可以位于细胞疗法制造系统的盒的无菌部分内。在各种实施方案中，表面3004可以位于盒的室内。在各种实施方案中，室可以包括生物反应器。
适应性免疫应答系统的各种实施方案包含包括膜结合的TCR的T细胞。在各种实施方案中，适应性免疫应答包含用于提供共刺激信号的CD28。根据各种实施方案，T细胞受体(TCR)复合物3312被显示嵌入在T细胞膜3314中。在各种实施方案中，TCR复合物3312可以包含二硫键连接的膜锚定的异二聚体蛋白。在许多实施方案中，二硫键连接的膜锚定的异二聚体蛋白可以包含阿尔法(α)链3316和贝塔(β)链3318。在各种实施方案中，TCR复合物3312可以包含由伽马(γ)和德尔塔(δ)链形成的替代受体。在各种实施方案中，TCR复合物3312α链3316和β链3318形成抗原结合位点(例如pMHC结合位点3320)的结构。
在各种T细胞构象中，α链3316可以包括两个胞外结构域，包括可变区3322和恒定区3324。在各种实施方案中，β链3318可以包括两个胞外结构域，包括可变区3326和恒定区3328。在一些构象中，恒定区3324、3328可以邻近细胞膜3314。在各种构象中，可变区3322、3326可以形成pMHC结合位点3320并且可以结合pMHC。
TCR链3316、3318中的每一个都可以包括可变区3322、3326并且每个可变区3322、3326可以包含三个高变区或互补决定区(CDR)。在各种实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3可以非连续地排列在TCR复合物3312的可变区3322、3326的氨基酸序列上。在各种实施方案中，CDR3可以是用于识别pMHC的加工抗原肽的主要区域。
免疫应答的各个方面可能需要TCR复合物3312传播信号以引起T细胞激活(见图4)。在各种实施方案中，CD3分子3330、3332具有比α链3316和β链3318更长的胞质尾，以允许信号转导发生。在各种实施方案中，TCR复合物3312包含第一CD3分子3330，其包含与ε链结合的γ链。在各种实施方案中，TCR复合物3312包含第二CD3分子3332，其包含与ε链结合的δ链。
在各种实施方案中，TCR复合物3312的ζ链3334可以将肽识别与若干细胞内信号转导途径(包括T细胞激活)偶联。
适应性T细胞免疫应答的各个方面包括T细胞对肽(例如抗原)的识别。在各种实施方案中，抗原可以呈递在细胞疗法制造系统的合成表面上(例如，支撑结构、细胞疗法制造系统内的内壁、珠等)。在细胞疗法制造系统的各种实施方案中，主要组织相容性复合物(MHC)可结合至本文所述的一个或多个表面。
在各种实施方案中，pMHC可以结合至表面，从而形成细胞疗法制造系统的抗原呈递表面。在各种实施方案中，pMHC可以包含α链和β链。在一些实施方案中，pMHC可以包含可以充当抗原的肽。在各种实施方案中，α链和β链可以通过非共价键彼此结合。
在各种实施方案中，α链可以包含大约350个氨基酸并包括三个球状结构域。在各种实施方案中，三个球状结构域可以被指定为α1、α2和α3。
在各种实施方案中，α链的N端可以位于α1球状结构域中。在各种实施方案中，α1和α2可以延伸远离用于TCR结合的表面。在各种实施方案中，α1和α2可以各自包含大约90个氨基酸。在各种实施方案中，α2可以包括63个氨基酸的环并且可以由二硫键引起其形成。在各种实施方案中，α1和α2可以相互作用以形成pMHC的肽结合区。
在各种实施方案中，连接区域可以将pMHC锚定至表面。在各种实施方案中，连接区域可以包含共价键。在各种实施方案中，共价键可以在表面和pMHC的α3之间形成。在一些实施方案中，α3可以包含包围86个氨基酸的二硫键以形成环结构。在各种实施方案中，连接区域可以包含另外的化合物(例如，PEG、生物素、链霉亲和素、avid等)以促进pMHC表面结合。
在各种实施方案中，α3球状结构域可以与T细胞的CD8共受体相互作用。在一些实施方案中，α3-CD8相互作用可以将pMHC固定在适当的位置并且T细胞的细胞膜表面上的TCR可以结合α1-α2异二聚体配体。在一些实施方案中，α3-CD8相互作用可以允许α1-α2异二聚体配体查询MHC相关肽的抗原性。在各种实施方案中，α链的C端可以位于α3球状结构域中。在各种实施方案中，连接pMHC和表面的共价键可以连接α链的C端和表面上的部分。
CD8的胞质尾可以与Lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)相互作用，并且Lck可以磷酸化CD3的细胞质部分和TCR复合物的ζ链。CD3和ζ链的磷酸化可以导致多种转录因子(例如NFAT、NF-κB和AP-1)的激活，最终影响信号级联下游的某些基因的表达。
在各种实施方案中，pMHC的β链可以包含二硫键环。在各种实施方案中，β链可以与α3球状结构域非共价相互作用。
a.合成的T细胞激活表面
在各种实施方案中，提供了用于激活T淋巴细胞(T细胞)的抗原呈递合成表面，其包含：多个主激活分子配体和多个共激活分子配体，每个共激活分子配体包含T细胞受体(TCR)共激活分子或辅助TCR激活分子，其中根据各种实施方案，多个主激活分子配体和多个共激活分子配体中的每一个都特异性地结合到抗原呈递合成表面。每个主激活分子配体可以包括被配置成结合到T细胞的TCR的主要组织相容性复合物(MHC)分子。在各种实施方案中，MHC分子可以包括MHC 1类分子。在一些其他实施方案中，MHC分子可以包括MHC II类分子。在各种实施方案中，主激活分子配体包括抗原肽(例如共价或非共价结合至MHC分子)。在各种实施方案中，多个共激活分子配体包括多个TCR共激活分子和多个辅助TCR激活分子。在各种实施方案中，TCR共激活分子和辅助TCR激活分子存在的比例可以为约1:100至约100:1，例如约20:1至约1:20或者约10:1至约1:20。在各种实施方案中，多个共激活分子配体中的一个或多个是TCR共激活分子，其可以激活信号传导分子，例如转录因子核因子κB(NF kB)和激活的T细胞的核因子(NFAT)。在各种实施方案中，TCR共激活分子可以是CD28受体的激动剂，其通过磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt途径发出信号。在各种实施方案中，多个共激活分子配体中的一个或多个可以是TCR辅助激活分子，其可以例如通过TCR近端信号传导复合物的磷酸化来激活TCR近端信号传导。TCR辅助激活分子可以是例如CD2受体的激动剂。可以通过CD28和CD2受体激活的示例性途径(以及其他详细信息)如图4所示。根据各种实施方案，由抗原呈递合成表面激活的T细胞可以是初始T细胞。抗原呈递合成表面可以是抗原呈递珠、抗原呈递圆片、管(例如玻璃或聚合物管)的抗原呈递内表面或者微流体装置的抗原呈递内表面(例如细胞疗法制造系统内的表面)。在各种实施方案中，本文所述的任何表面可以包括抗原呈递表面并且可以包括本文所述的特征的任何组合。在各种实施方案中，盒可以包括一个或多个抗原呈递表面。在各种实施方案中，仪器可以包括一个或多个抗原呈递表面。
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面可以被配置成在体外激活T细胞(例如使用细胞疗法制造系统激活)。主激活分子配体可以包括具有氨基酸序列的MHC分子并且可以通过C端连接共价连接至抗原呈递合成表面的表面。MHC分子可以呈现远离表面取向的MHC分子的N端部分，从而促进MHC分子与布置在表面上的T细胞的TCR的特异性结合。MHC分子可以包括MHC肽。至少四个MHC分子的簇可以被布置在抗原呈递合成表面上的位置处，使得当表面暴露于水性环境时，可以形成MHC四聚体。
在细胞疗法制造系统的各种实施方案中，多个主激活分子配体中的每一个均可以通过接头共价连接至抗原呈递合成表面。在一些实施方案中，主激活分子配体的MHC分子可以通过共价连接连接至抗原呈递合成表面。例如，可以使用点击化学和适当的点击试剂对来形成共价连接。同样，本文所述的其他配体，例如共激活分子配体(包括TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子)、生长刺激分子配体和另外的刺激分子配体可以经由接头共价连接至抗原呈递合成表面的表面，并且可以使用点击化学和适当的点击试剂对形成连接。
在各种实施方案中，MHC分子可以通过偶联基团(CG)例如生物素/链霉亲和素结合对相互作用非共价连接至抗原呈递合成表面。在一些实施方案中，偶联基团的一个成员与表面共价结合(例如链霉亲和素)。偶联基团的进一步示例包括但不限于生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白和地高辛/抗地高辛。链霉亲和素、抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白代表生物素结合剂的示例。同样，本文所述的其他配体，例如共激活分子配体(包括TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子)、生长刺激分子配体和另外的刺激分子配体可以非共价偶联到抗原呈递合成表面，并且偶联基团可以包括生物素或地高辛。
在各种实施方案中，CG结合对的一个成员本身可以例如通过一个或多个接头共价结合至表面。与表面的共价连接可以通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长，或其间的任何数目的键长。在各种实施方案中，共价结合至表面的CG结合对的成员通过点击试剂对结合。这对于参与将本文所述的其他配体(例如共激活分子配体、TCR共激活分子、辅助TCR激活分子、生长刺激分子和另外的刺激分子)与表面结合的CG结合对成员来说可能也是正确的。此外，由于一些结合对成员例如链霉亲和素具有多个结合位点(例如在链霉亲和素中有四个)，因此主激活分子配体可以通过生物素/链霉亲和素/生物素连接偶联到抗原呈递合成表面。再次，这对于参与将本文所述的其他配体(例如共激活分子配体、TCR共激活分子、辅助TCR激活分子、生长刺激分子和另外的刺激分子)与表面结合的CG结合对成员来说可能也是正确的。
在各种实施方案中，CG结合对的第一成员与主激活分子配体共价结合，并且CG结合对的第二成员与表面非共价结合。例如，CG结合对的第一成员可以是与主激活分子配体共价结合的生物素；CG结合对的第二成员可以是与表面非共价结合的链霉亲和素(例如，通过另外的生物素，其中另外的生物素与表面共价结合)。在各种实施方案中，与表面共价结合的生物素通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长连接至表面。例如，与表面共价结合的生物素可以通过具有所描述的总长度的一系列一个或多个接头连接至表面。再次，这对于参与将本文所述的其他配体(例如共激活分子配体、TCR共激活分子、辅助TCR激活分子、生长刺激分子和另外的刺激分子)与表面结合的CG结合对成员来说可能也是正确的。与CG结合对的第二成员与表面共价结合的情况相比，CG结合对的第二成员(例如链霉亲和素)与表面非共价结合可以促进以更大的密度加载配体，例如主激活分子配体、共激活分子配体、TCR共激活分子和辅助TCR激活分子。
主激活分子配体(例如包含MHC分子)还可以包括抗原肽，所述抗原肽包含肿瘤相关的抗原。肿瘤相关的抗原可以与主激活分子配体(例如MHC分子)非共价结合。肿瘤相关的抗原可以由主激活分子配体(例如MHC分子)以可以启动T淋巴细胞激活的方向呈递。肿瘤相关的抗原可以是肽。肿瘤相关的抗原的一些非限制性示例包括用于黑色素瘤的MART1(肽序列ELAGIGILTV)、黑色素瘤和一些癌中涉及的NYESO1(肽序列SLLMWITQV)、SLC45A2、TCL1和VCX3A，但本公开内容不限于此。肿瘤抗原的另外的示例包括包含来自肿瘤细胞表面上表达的蛋白的氨基酸序列片段的肽，所述蛋白例如CD19、CD20、CLL-1、TRP-2、LAGE-1、HER2、EphA2、FOLR1、MAGE-A1、间皮素、SOX2、PSM、CA125、T抗原等。肽可以来自肿瘤相关的抗原的胞外结构域。如果抗原在肿瘤细胞上的表达水平高于在肿瘤细胞来源类型的健康细胞上的表达水平，则认为该抗原与肿瘤相关。识别该肿瘤相关的抗原的T细胞是抗原特异性T细胞。任何肿瘤相关的抗原均可用于本文所述的抗原呈递表面。在各种实施方案中，肿瘤相关的抗原是新抗原肽，例如由肿瘤细胞中的突变基因编码。对于新抗原肽的详细讨论，参见例如US2011/0293637，其出于所有目的通过引用完整并入本文。
抗原呈递合成表面可以包括多个共激活分子配体，每个配体均包含TCR共激活分子或辅助TCR激活分子。在各种实施方案中，多个共激活分子配体包括多个TCR共激活分子。在各种实施方案中，多个共激活分子配体包括多个辅助TCE激活分子。在各种实施方案中，多个共激活分子配体可以包含TCR共激活分子和辅助TCR激活分子。TCR共激活分子和辅助TCR激活分子彼此存在的比例为例如约100:1至1:100、10:1至1:20、5:1至1:5、3:1至1:3、2:1至1:2等。在各种实施方案中，多个共激活分子配体可以包括比例为约3:1至约1:3的TCR共激活分子和辅助TCR激活分子。
TCR共激活分子或辅助TCR激活分子可以包括蛋白，例如抗体或其片段。在各种实施方案中，TCR共激活分子可以是CD28结合分子(例如包括CD80分子)或其保留对CD28的结合能力的片段。在各种实施方案中，TCR共激活分子可以是CD28结合分子(例如包括CD80分子)或其与CD28特异性结合的片段。在一些实施方案中，TCR共激活分子可以是CD28结合分子(例如包括CD80分子)或其CD28结合片段。在各种实施方案中，TCR共激活分子可以包括抗CD28抗体或其片段(例如CD28结合片段)。
在各种实施方案中，多个共激活分子配体中的每一个均可以通过接头共价连接至抗原呈递合成表面。在其他实施方案中，多个共激活分子配体中的每一个均可以非共价结合至与抗原呈递合成表面共价结合的接头。TCR共激活分子或辅助TCR激活分子可以通过CG(例如生物素/链霉亲和素结合对相互作用)非共价连接至共价修饰的表面。例如，TCR共激活分子或辅助TCR激活分子还可以包含与链霉亲和素相互作用的位点特异性C端生物素部分，其可以与本文所述的表面共价或非共价结合。可以使用已知方法，例如使用生物素连接酶如BirA酶，将位点特异性C端生物素部分添加到TCR共激活分子或辅助TCR激活分子。参见例如Fairhead et al.,Methods Mol Biol 1266:171-184,2015，其出于所有目的通过引用完全并入本文。偶联基团的其他示例包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白和地高辛/抗地高辛。在各种实施方案中，CG结合对之一本身可以共价结合至表面，例如通过接头，如上文所述。对于示例性TCR共激活分子或辅助TCR激活分子，参见本文的实施例。
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面的共激活分子配体可以包括多个辅助TCR激活分子，例如包括本文所述的TCR共激活分子在内或代替本文所述的TCR共激活分子。在各种实施方案中，可以存在另外的共激活分子配体。在一些实施方案中，辅助TCR激活分子或另外的共激活分子配体包含CD2激动剂、CD27激动剂或CD137激动剂中的一种或多种。例如，辅助TCR激活分子可以是CD2结合蛋白或其片段，其中该片段保留与CD2的结合能力。在一些实施方案中，辅助TCR激活分子可以是CD58或其保留与CD2结合能力的片段。辅助TCR激活分子可以是CD2结合蛋白(例如CD58)或其片段，其中该片段特异性地结合CD2。辅助TCR激活分子可以是CD2结合蛋白(例如CD58)或其CD2结合片段。辅助TCR激活分子或另外的共激活分子配体可以各自是针对CD2、CD27或CD137的抗体，或者可以存在此类抗体的任何组合。或者，辅助TCR激活分子或另外的共激活分子配体可以各自包含针对CD2、CD27或CD137的抗体的片段或其任何组合。伐立鲁单抗(CDX-1127)是一种示例性抗CD27抗体。乌托鲁单抗(PF-05082566)是一种示例性抗CD137抗体。CD70或其胞外部分也可以用作CD27激动剂。TNFSF9，也称为CD137L，或其胞外部分也可以用作CD137激动剂。在各种实施方案中，辅助TCR激活分子包含CD2激动剂，例如抗CD2抗体。在各种实施方案中，每个辅助TCR激活分子均可以通过接头共价连接至表面。在各种实施方案中，每个辅助TCR激活分子均可以非共价结合至与表面共价结合的接头，例如通过CG，例如生物素/链霉亲和素结合对相互作用。例如，辅助TCR激活分子可以包含如上所述的与链霉亲和素相互作用的位点特异性C端生物素部分，链霉亲和素可以与本文所述的表面共价或非共价结合。偶联基团的其他示例包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白和地高辛/抗地高辛。在一些实施方案中，CG结合对之一本身可以例如通过接头共价结合至表面。
根据各种实施方案，抗原呈递合成表面还可以包括至少一种生长刺激分子配体。生长刺激分子配体可以是蛋白或肽。生长刺激蛋白或肽可以是细胞因子或其片段。生长刺激蛋白或肽可以是生长因子受体配体。生长刺激分子配体可以包含IL-21或其片段。在各种实施方案中，生长刺激分子配体可以通过共价接头连接至抗原呈递合成表面。在各种实施方案中，生长刺激分子配体可以通过CG(例如生物素/链霉亲和素结合对相互作用)连接至抗原呈递合成表面。偶联基团的其他示例包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)以及地高辛/抗地高辛。在各种实施方案中，CG结合对之一本身可以例如通过接头共价结合至表面。在其他实施方案中，生长刺激分子配体可以共价地或通过生物素/链霉亲和素结合相互作用连接至表面，其中该表面是与具有与其连接的MHC分子的抗原呈递合成表面不同的表面。例如，生长刺激分子配体所连接的表面可以是还包含第一抗原呈递合成表面的微流体装置的第二表面(例如，细胞疗法制造系统[例如，仪器或盒]内的表面)。
在各种实施方案中，可以存在另外的生长刺激分子配体，其可以是一种或多种细胞因子或其片段。在各种实施方案中，如上文针对生长刺激分子配体所讨论的，包括但不限于IL-2或IL-7的另外的刺激分子配体可以连接至抗原呈递合成表面或非抗原呈递合成表面的另一表面。
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面包含贴附刺激分子配体，其是包含ICAM蛋白序列的细胞贴附受体的配体。
另外的刺激分子配体和/或贴附刺激分子配体可以共价连接至表面或者可以通过CG(例如生物素/链霉亲和素结合对相互作用)非共价连接至表面。偶联基团的其他示例包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白和地高辛/抗地高辛。在各种实施方案中，CG结合对之一本身可以例如通过接头经由生物素/链霉亲和素结合相互作用共价结合至表面。
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面包含多个表面封闭分子配体，其可以包括接头和末端表面封闭基团。接头可以包括共价连接在一起的6个或更多个原子(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个原子)的直链。任选地，接头具有线性结构。末端表面封闭基团可以是亲水性部分、两亲性部分、两性离子部分或带负电部分。在各种实施方案中，末端封闭基团包含末端羟基。在一些实施方案中，末端封闭基团包含末端羧基。在各种实施方案中，末端封闭基团包含末端两性离子基团。多个表面封闭分子配体可以具有全部相同的末端表面封闭基团或者可以具有末端表面封闭基团的混合物。不受理论的束缚，表面封闭分子配体的末端表面封闭基团以及亲水性接头可以与围绕抗原呈递合成表面的水性介质中的水分子相互作用，以产生总体上更亲水的表面。这种增强的亲水性可以使得抗原呈递合成表面和细胞之间的接触更相容并且更类似于体内自然的细胞间相互作用和/或细胞-细胞外流体环境。接头可以包含例如聚合物。聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。多种含亚烷基醚的聚合物可以适于用在本文所述的表面上。一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)，其在本领域中已知是生物相容的。在各种实施方案中，PEG的Mw可以为约88Da、100Da、132Da、176Da、200Da、220Da、264Da、308Da、352Da、396Da、440Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、1500Da、2000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da，或者Mw可以落在由任何两个前述值限定的范围内在各种实施方案中，PEG聚合物具有约3、4、5、10、15、25个单元或其间的任何值的聚乙烯部分重复。在各种实施方案中，PEG是羧基取代的PEG部分。在各种实施方案中，PEG是羟基取代的PEG部分。在一些实施方案中，多个表面封闭分子配体中的每一个可以具有长度与该多个的其他配体的接头相同的接头。在各种实施方案中，多个表面封闭分子配体的接头可以具有不同的长度。在各种实施方案中，对于多个表面封闭分子配体中的每一个，表面封闭基团和连接体的长度可以相同。或者，表面封闭基团和接头的长度可以在多个表面封闭分子配体内变化，并且可以包括以任何组合选择的2、3或4个不同的表面封闭基团和/或2、3、4或更多个不同的长度。一般而言，表面封闭分子配体具有足够短的长度和/或结构，以便不会在空间上阻碍主激活分子配体和共激活分子配体的结合和/或功能。例如，在各种实施方案中，表面封闭分子配体的长度等于或小于结合至表面的其他接头(例如，连接偶联基团、主激活分子配体、共刺激分子配体或其他配体的接头)的长度。在一些实施方案中，表面封闭分子配体的长度比与表面结合的其他接头(例如，连接偶联基团、主激活分子配体、共刺激分子配体或其他配体的接头)的长度小约1埃或更多(例如，约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多埃)。在各种实施方案中，表面封闭分子配体的长度比结合到表面的其他接头的长度小约1至约100埃(例如约2至约75、约3至约50、约4至约40、或约5至约30埃)。当表面封闭分子配体的长度与结合到表面的其他接头的长度相同或稍短时，所得表面有效地以易于偶联细胞和/或与细胞相互作用的方式呈递连接到其他连接体的配体。关于抗原呈递珠，已发现包括表面封闭分子配体(例如亲水性聚合物，例如PEG或PEO聚合物和/或包含末端羟基或羧基的配体)，可以有益地减少抗原呈递珠通过疏水相互作用的聚集。如本文所公开的任何实施方案中所阐述的，表面封闭分子配体可以在上面讨论的主配体和其他(例如，共激活、辅助等)配体之后连接到表面，或者可以在任何激活或共激活物质连接到表面之前引入。
根据各种实施方案，抗原呈递合成表面可以包含玻璃、金属、聚合物或金属氧化物。在各种实施方案中，抗原呈递合成表面是具有任何种类的配置的圆片的表面、珠的表面、被配置成包含多个细胞的含流体回路的装置(例如微流体装置)的至少一个内表面或者管(例如玻璃或聚合物管)的内表面。在各种实施方案中，具有被配置成激活T淋巴细胞的抗原呈递合成表面的圆片的大小可被设计成适合标准48、96或384孔板的孔内。在各种实施方案中，具有被配置成激活T淋巴细胞的抗原呈递合成表面的珠可以被设置以在孔板内或在包含流体回路的装置内使用。在各种实施方案中，多个主激活分子配体在抗原呈递合成表面上(或在其所连接的每个部分或子区域中)的密度可以为每平方微米约50至约500个分子；每平方微米约4×102至约2×103个分子；每平方微米约1×103至约2×104个分子；每平方微米约5×103至约3×104个分子；每平方微米约4×102至约3×104个分子；每平方微米约4×102至约2×103个分子；每平方微米约2×103至约5×103个分子；每平方微米约5×103至约2×104个分子；每平方微米约1×104至约2×104个分子；或每平方微米约1.25×104至约1.75×104个分子。
在各种实施方案中，多个共激活分子配体在抗原呈递合成表面上(或在其所连接的每个部分或子区域中)的密度为每平方微米约20至约250个分子；每平方微米约2×102至约1×103个分子；每平方微米约500至约5×103个分子；每平方微米约1×103至约1×104个分子；每平方微米约5×102至约2×104个分子；每平方微米约5×102至约1.5×104个分子；每平方微米约5×103至约2×104个分子、每平方微米约5×103至约1.5×104个分子、每平方微米约1×104至约2×104、每平方微米约1×104至约1.5×104、约1.25×104至约1.75×104或每平方微米约1.25×104至约1.5×104。
b.示例性无图案平面
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面可以包括其上均匀分布有多个主激活分子配体的无图案(unpatterned)表面。根据各种实施方案，主激活分子配体可以包括MHC分子，其各自可以包括肿瘤相关的抗原。在各种实施方案中，无图案表面还可以包括在其上均匀分布的多个共激活分子配体(例如TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子)。共激活分子配体可以是任何组合的如上文针对抗原呈递表面所述的那些。在各种实施方案中，主激活分子配体和共激活分子配体的密度可以与本文针对抗原呈递表面所述的范围相同。根据各种实施方案，如上文针对抗原呈递表面所述，无图案抗原呈递合成表面还可以包括另外的生长刺激性、贴附性和/或表面封闭分子配体，其中每一个(如果存在)均可以均匀分布在无图案表面上。例如，无图案表面可以包括连接至表面的辅助刺激分子，例如IL-21。在各种实施方案中，如上文针对抗原呈递表面所述，主激活分子配体、共激活分子配体和/或另外的配体可以连接至表面。根据各种实施方案，本文所用的具有在其上“均匀分布”的配体的表面的特征在于，与表面的总表面积的平均配体浓度相比，没有任何大小为总表面积的10％或更大的表面部分具有统计学上显著更高的配体浓度。
c.示例性图案化平面
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面可以被图案化并且可以具有多个区域，每个区域包括多个包含MHC分子的主激活分子配体，其中多个区域可以被配置成基本上排除主激活分子配体的区域分开。抗原呈递合成表面可以是平面。在各种实施方案中，包括至少多个主激活分子配体的多个区域中的每一个还可以包括多个共激活分子配体，例如TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子。在各种实施方案中，共激活分子配体可以是本文所述的任何共激活分子配体以及任何组合。在各种实施方案中，如本文针对抗原呈递表面所述，主激活分子配体和/或共激活分子配体可以连接至表面。主激活分子配体和/或共激活分子配体在每个含有主激活分子配体和/或共激活分子配体的区域中的密度可以与本文针对抗原呈递表面所述的密度在相同的范围内。在一些实施方案中，包含至少多个主激活分子配体的多个区域中的每一个的面积为约0.10平方微米至约4.0平方微米。在其他实施方案中，多个区域中的每一个的面积可以为约0.20平方微米至约0.8平方微米。多个区域可以彼此分开约2微米、约3微米、约4微米或约5微米。多个区域中的每个区域与其相邻区域之间的间距可以为约2微米、约3微米、约4微米、约5微米或约6微米。参见图7A和7B，其示出了图案化表面的两个实施方案。
在各种实施方案中，被配置成基本上排除包含MHC分子的主激活分子配体的区域也可以被配置成基本上排除TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子。
在各种实施方案中，被配置成基本上排除主激活分子配体和任选的TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子的区域也可以被配置成包括表面封闭分子配体、生长刺激分子、另外的刺激分子和贴附刺激分子配体中的一种或多种。在各种实施方案中，生长刺激分子和/或另外的刺激分子包括细胞因子或其片段，并还可以包括IL-21或其片段。在各种实施方案中，被配置为基本上排除主激活分子配体和任选的TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子的区域还可以被配置为包括一个或多个支持部分。支持部分可以提供贴附基序以支持T淋巴细胞生长，或者可以提供亲水部分，从而为细胞生长提供总体支持性环境。提供贴附支持的部分可以包括含有RGD基序的肽序列。在各种实施方案中，提供贴附支持的部分可以是ICAM序列。提供亲水性的部分可以是诸如PEG部分或羧酸取代的PEG部分的部分。
d.珠
图25D示出了根据各种实施方案的包括表面3353的珠3352。在各种实施方案中，表面3353可以包括抗原呈递表面。在各种实施方案中，表面3353可以包括一个或多个抗原呈递分子3356a、3356b、3356c、3356d。在各种实施方案中，珠3352可以在细胞分选过程期间被引入到T细胞3354a、3354b、3354c、3354d中。在各种实施方案中，珠3352可以在T细胞激活过程期间被引入到T细胞3354a、3354b、3354c、3354d中。在各种实施方案中，珠3352可以在分选激活过程(例如，组合的细胞分选和T细胞激活过程)期间被引入到T细胞3354a、3354b、3354c、3354d中。
不受任何特定理论的束缚，某些实验已经表明，提供和使用具有相对限定的表面积/体积比的用于T细胞激活的珠可能是有利的。此类珠可以以更容易接近的方式呈递相关的配体(例如抗原)，以便它们在激活过程中与T细胞更有效地相互作用。根据各种实施方案，与具有更高表面积/体积比的珠相比，此类珠可以用更少的所需配体提供期望程度的T细胞激活和/或与具有更高表面积/体积比的珠相比，此类珠可以提供更高程度的T细胞激活或更多具有期望特征的T细胞(例如，本文所述的抗原特异性和/或标志物表型)。理想的球形固体具有尽可能低的表面积/体积比。因此，在各种实施方案中，珠表面积可以在相同大小(体积或直径)的球体表面积的10％以内，并且在本文中被称为“基本上球形”。例如，对于直径为2.8μm(半径为1.4μm)的珠，相应的理想球体的表面积为4πr2＝24.63μm2。因此，具有在相同体积或直径的理想球体的表面积的10％以内的表面积的基本上球形的2.8μm直径的珠将具有小于或等于27.093μm2的表面积。应当注意的是，据报道某些市售的珠具有更高的表面积；例如，Dynabeads M-270Epoxy在其产品文献中被描述为比表面积为2-5m2/g，直径为2.8μm，文献还表明1mg的珠为6-7×107个珠。将比表面积乘以1mg/6-7×107个珠，得出每个珠的表面积为28至83μm2/珠，这比直径为2.8μm的理想球体的表面积大10％以上。表面积比理想球体的表面积大10％以上的聚合物珠在本文中被称为“盘绕的珠(convolutedbead)”。在各种实施方案中，聚合物珠可以是基本上球形的或盘绕的。在一些实施方案中，聚合物珠不是盘绕的，而是基本上球形的。
参考图25A，珠可以在使用之前储存在一个或多个试剂储存器3346a、3346b、3346c中。在各种实施方案中，一个或多个阀3314、3316、3318可以由控制系统3364致动，用于从一个或多个试剂储存器3346a、3346b、3346c中释放珠3352。在各种实施方案中，可以通过使珠流过细胞疗法制造系统的流体网络来将珠引入到T细胞中。在各种实施方案中，来自气体源3306的加压气体可为珠提供动力。在替代实施方案中，一个或多个泵(例如蠕动泵(peristaltic jump))可以提供动力。在各种实施方案中，珠可以引起T细胞的激活。
在各种实施方案中，激活可以发生在细胞疗法制造系统的生物反应器3199内。在各种实施方案中，珠可以通过一个或多个入口端口3350、3352流入到生物反应器3199中。
vii.T细胞激活方法
在各种实施方案中，T细胞激活过程或方法可以在细胞疗法制造系统上进行。
激活T淋巴细胞的示例性方法包括使多个T淋巴细胞与包括多个主激活分子配体和多个共激活分子配体的抗原呈递合成表面接触，每个主激活分子配体包括被配置成结合至T细胞的T细胞受体的主要组织相容性(MHC)分子，每个共激活分子配体包括T细胞受体(TCR)共激活分子或辅助TCR激活分子，以及培养与抗原呈递合成表面接触的多个T淋巴细胞，从而将多个T淋巴细胞的至少一部分转化为激活的T淋巴细胞。抗原呈递表面可以是本文所述的任何抗原呈递表面。在一些实施方案中，MHC分子是MHC 1类分子。可以使用本文所述的任何抗原呈递合成表面。在各种实施方案中，多个MHC分子可以各自包括氨基酸序列，并且还可以通过该氨基酸序列的C端连接而连接至抗原呈递合成表面。或者，MHC分子可以通过非共价结合连接至抗原呈递合成表面。可以使用任何非共价结合，例如MHC的生物素化及其与表面上的链霉亲和素的结合。在各种实施方案中，MHC分子还可以包括抗原分子，例如肿瘤相关的抗原，例如本文所述的任何肿瘤相关的抗原。在各种实施方案中，抗原分子可以是MART1、NYESO1、SLC45A2、TCL1或VCX3A。
在各种实施方案中，如本文所述，共激活分子可以连接至抗原呈递合成表面。多个共激活分子中的T细胞受体(TCR)共激活分子或辅助TCR激活分子可以是本文所述的任何TCR共激活分子或任何辅助TCR激活分子，并且可以以本文所述的任何比例提供。
在各种实施方案中，该方法还可以包括使多个T淋巴细胞与多个生长刺激分子配体接触。在各种实施方案中，每个生长刺激分子配体可以包括生长因子受体配体。在各种实施方案中，使多个T淋巴细胞与多个生长刺激分子配体接触可以在至少一天的第一阶段培养之后进行。在各种实施方案中，多个生长刺激分子配体可以包括IL-21或其片段。在各种实施方案中，多个生长刺激分子配体可以连接至抗原呈递合成表面。在各种实施方案中，多个生长刺激分子配体可以连接至表面(例如珠的表面)，该表面是与包含生物分子(包括MHC分子)的抗原呈递合成表面不同的表面。在各种实施方案中，多个生长刺激分子配体可以连接至包括MHC分子的抗原呈递合成表面。
在各种实施方案中，在各种实施方案中，该方法可以包括使用珠上的抗原呈递表面。当使用具有抗原呈递表面的珠时，珠与T淋巴细胞的比例可为约1:1；约3:1；约5:1；约7:1或约10:1。珠可以具有以本文所述的任何方法连接于其上的抗原呈递MHC分子和抗CD28抗体。在各种实施方案中，IL-21还可以连接至珠的抗原呈递表面。在各种实施方案中，IL-21可以连接至第二珠，该第二珠具有IL-21作为唯一有助于激活的生物分子。
在各种实施方案中，可以使用可以图案化或无图案的平面来执行该方法。
在各种实施方案中，第一阶段培养可以进行4、5、6、7或8天。在第一阶段培养期间，可以将生长刺激分子如IL-21、IL-2和/或IL-7添加到溶液中或者可以添加到珠上以饲养T淋巴细胞。
在第一阶段培养结束时，细胞群可以包括未激活和激活的T淋巴细胞的混合物。可以使用多种细胞表面标志物进行流式细胞术来确定所分析细胞的激活程度和表型。
在各种实施方案中，可以进行第二阶段培养。如果抗原呈递表面是珠，则可以向T淋巴细胞提供第二等份的珠，例如通过添加到如本文所述的孔板、含有流体回路的室的装置或具有隔离坞的微流体装置，该第二等份的珠含有主激活分子配体，包括MHC分子，其包括肿瘤相关的抗原和共激活分子(例如TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子，例如分别为抗CD28抗体和/抗CD2抗体)。抗原呈递珠还可以包括与其连接的另外的生长刺激分子，例如IL-21。可以将抗原呈递珠以与细胞为约1:1；约3:1、约5:1或约10:1的比例添加到正在被培养的细胞中。在各种实施方案中，第二等份的IL-21可以作为其上连接有IL-21的第二组珠添加，或者进一步可以作为溶液添加。还可以在第二阶段培养期间添加IL-2和IL-7以激活另外数目的T淋巴细胞。
当使用图案化的或无图案的圆片、含有流体回路的装置的内表面、管的内表面或具有隔离坞的微流体装置的内表面时，可以通过继续与相同的抗原呈递表面接触进行培养来完成第二阶段培养。或者，可以使新的抗原呈递表面与第一阶段培养产生的T淋巴细胞接触。在各种实施方案中，抗原呈递珠，如上文所述或本文公开的任何实施方案中阐述的任何抗原呈递珠，可被添加到孔或含有流体回路的装置的内部室或微流体装置的隔离坞中。可以将生长刺激分子例如IL-21、IL-2、IL-7或其组合添加到溶液中或珠上。在一些实施方案中，添加IL-2和IL-7。
在第二培养阶段结束时，可以进行流式细胞术分析以确定激活的程度并确定当时存在的进一步激活的T淋巴细胞的表型。
在各种实施方案中，可以包括第三阶段培养。第三阶段可以具有本文针对第二阶段所述的任何特征。在各种实施方案中，第三阶段可以以与第二阶段相同的方式进行。例如，可以重复第二阶段培养中采用的所有动作，以进一步激活孔板的孔中、管中、或含有流体回路的装置的室中或具有隔离坞的微流体装置中的T淋巴细胞。
在各种实施方案中，被激活的T淋巴细胞包括CD8+T淋巴细胞，例如初始CD8+T淋巴细胞。在各种实施方案中，被激活的T淋巴细胞中富集CD8+T淋巴细胞，例如初始CD8+T淋巴细胞。或者，在各种实施方案中，被激活的T淋巴细胞包括CD4+T淋巴细胞，例如初始CD4+T淋巴细胞。在各种实施方案中，被激活的T淋巴细胞中富集CD4+T淋巴细胞，例如初始CD4+T淋巴细胞。例如，如果需要对II类限制性抗原具有特异性的T细胞，则可以使用CD4+T淋巴细胞。
在各种实施方案中，该方法产生激活的T淋巴细胞，其为CD45RO+。在各种实施方案中，该方法产生激活的T淋巴细胞，其为CD28+。在各种实施方案中，该方法产生激活的T淋巴细胞，其为CD28+CD45RO+。在各种实施方案中，该方法产生激活的T淋巴细胞，其为CD197+。在各种实施方案中，该方法产生激活的T淋巴细胞，其为CD127+。在各种实施方案中，该方法产生对CD28、CD45RO、CD127和CD197或者前述标记物中的三种的至少任何组合或者前述标记物中的两种的至少任何组合呈阳性的激活的T淋巴细胞。具有任何前述表型的激活的T淋巴细胞还可以是CD8+。在各种实施方案中，为CD28+的任何前述表型包括CD28高表型。
在各种实施方案中，该方法产生包含抗原特异性T细胞的T细胞群，其中至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的抗原特异性T细胞是CD45RO+/CD28高细胞，其中每个前述值都可以用“约”来修饰。或者或此外，在各种实施方案中，该方法产生T细胞群，其中至少1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的T细胞是抗原特异性T细胞；或者其中1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％或11％-12％的T细胞是抗原特异性T细胞，其中每个前述值都可以用“约”修饰。可以在与抗原呈递表面接触和任选的进一步的扩增步骤之后，即在富集或分离具有特定表型的产物T细胞之前/不富集或分离具有特定表型的产物T细胞，对该方法的“粗”产物测定T细胞群的含量。抗原特异性和/或T细胞标志物表型的测定可以排除死细胞。
在各种实施方案中，该方法提供T细胞群，其中抗原特异性T细胞的比例相对于起始群体增加。
B.T细胞修饰技术
根据各种实施方案，可以使用细胞疗法制造系统来进行细胞(例如T细胞)修饰过程。在各种实施方案中，基因转移系统和方法(例如转染或转导)可以用于编码具有核酸构建体的T细胞。在各种实施方案中，T细胞修饰可以使用病毒方法(例如转导)进行。在各种实施方案中，T细胞修饰可以使用非病毒方法(例如转染)进行。
根据各种实施方案，T细胞修饰可以发生在细胞进入细胞疗法制造系统之前，由此可以在将T细胞加载到细胞疗法制造系统中之前为扩增过程制备T细胞。在各种实施方案中，T细胞修饰可以发生在细胞疗法制造系统上。在各种实施方案中，T细胞修饰可以发生在细胞疗法制造系统的盒上。在各种实施方案中，T细胞修饰可以在T细胞进入盒之前发生在细胞疗法制造系统的仪器上。
T细胞修饰可以通过在细胞疗法制造系统上执行的多种方法进行。T细胞修饰的非限制性示例可以包括病毒转染、电穿孔、机械挤压和化学转染。根据各种实施方案，T细胞转导的各种方法可以包括组合细胞和病毒载体、混合细胞和病毒载体以及将细胞与病毒载体一起孵育。
i.“盒上”方法
图25F示出了根据各种实施方案的用于执行转导过程的系统。在各种实施方案中，可以提供用于细胞疗法制造方法的盒。在各种实施方案中，可以针对规定的细胞疗法制造方法对盒进行预先配置。根据规定的细胞疗法制造方法，可以将一种或多种试剂预加载到盒上。在各种实施方案中，可以将试剂(例如病毒载体、珠等)预加载到一个或多个试剂储存器3346a、3346b、3346c中。
在各种实施方案中，盒可以流体偶联到细胞疗法制造系统的仪器。在各种实施方案中，盒可以电子偶联到细胞疗法制造系统的仪器。在各种实施方案中，控制系统3364可以引导在细胞疗法制造系统上发生的一个或多个过程。
在各种实施方案中，可以提供动力，用于移动流体通过细胞疗法制造系统的流体网络。在一些实施方案中，动力可以由气体源3306提供。在替代实施方案中，动力可以由一个或多个泵提供。
在各种实施方案中，一个或多个阀3314、3316、3318可以被致动，以允许加压气体进入一个或多个试剂储存器3346a、3346b、3346c并促使其中包含的一种或多种试剂移动至生物反应器3399。在各种实施方案中，一种或多种试剂包含病毒载体。在各种实施方案中，T细胞可以在生物反应器3399中被转导。
C.T细胞扩增(生物反应器)
在各种实施方案中，一个或多个T细胞扩增过程可以在细胞疗法制造系统上进行。根据各种实施方案，T细胞扩增可以发生在盒的生物反应器(例如生物反应器3399)内。
i.生物反应器模块的基本描述
图25C示出了根据各种实施方案使用细胞疗法制造系统进行细胞培养(例如T细胞扩增)的工艺流程图。在各种实施方案中，包含用于细胞培养的成分(例如介质)的容器3312可以无菌地连接至细胞疗法制造系统的流体网络3362。在各种实施方案中，控制系统可以致动一个或多个阀3314、3316、3318以将成分引导至生物反应器3399。
在各种实施方案中，可以使用流量传感器3330来监测进入生物反应器3399的介质的流速。在各种实施方案中，控制系统3364可以接收流量测量结果。在各种实施方案中，阀3314、3316、3318可以被致动以基于与设定点相比的流速测量结果来调节流速。
在各种实施方案中，介质可以进入第二入口开口3352。在各种实施方案中，第二入口开口3352可以包括比第一入口开口3350更低的高度。
在各种实施方案中，气体源3306可以提供动力用于移动成分通过流体网络3362。在各种实施方案中，一个或多个泵可以提供动力用于移动成分通过流体网络3362。
在各种实施方案中，流体(例如气体或介质)可以离开一个或多个出口开口3354、3356、3358、3360。在各种实施方案中，气体可离开相对于其他出口开口3356、3358、3360具有更高高度的出口开口3354。在各种实施方案中，可以经由致动多个阀3320、3326、3328中的一个而打开通过流体网络3362的流动路径，从而将流体引导至废物容器3344。
ii.生物反应器表面
图24B-24D和24H-24I示出了根据各种实施方案的生物反应器的底座表面2754、2756、2758。在各种实施方案中，底座表面2754、2756、2758可以包括一个或多个凹入特征2755、2757。在各种实施方案中，凹入特征2755、2757可以包括底座表面2754、2756、2758中的形状像凹坑(例如，二等分球体，例如半球)或凹槽(例如细长凹槽，例如二等分球形椭球体或二等分长椭球体)的凹陷。在各种实施方案中，凹入特征2755、2757可以帮助生物反应器在本文所述的洗涤过程期间保留细胞。
在各种实施方案中，生物反应器2750可以倾斜(参见图24H)，以促进废液(例如，用过的培养基、洗涤缓冲液等，其可能含有死细胞、碎片和/或未结合的细胞)的去除。在各种实施方案中，靶细胞(例如T细胞)可以结合至磁珠，并且可以在本文所述的洗涤步骤期间施加磁力，使得靶细胞在洗涤后保留。
iii.细胞扩增监测和控制
在各种实施方案中，生物反应器3399可以包括能够直接询问生物反应器的隔室内的流体的传感器。图25I示出了询问生物反应器3399的流体的额外的和/或替代的系统和方法。在各种实施方案中，一个或多个阀3320、3326、3328可以被致动，以将等份流体从生物反应器3399引导到一个或多个传感器3338、3340。
a.传感器和探针
在各种实施方案中，一个或多个传感器3338、3340可以包括pH传感器。在各种实施方案中，一个或多个传感器3338、3340可以包括溶解氧传感器。在各种实施方案中，一个或多个传感器3338、3340可以包括压力传感器。
b.基于传感器反馈调节生物反应器条件
在各种实施方案中，生物反应器(例如生物反应器3399)的内部包括一组环境条件。在各种实施方案中，给定细胞培养物的T细胞在一组最佳环境条件下最佳地完成本文所述的过程。在各种实施方案中，一个或多个传感器检测生物反应器(例如生物反应器3399)的环境条件。在各种实施方案中，控制系统可以接收检测到的生物反应器的环境条件并将它们与最佳环境条件组进行比较。在各种实施方案中，控制系统可以操作硬件(例如阀)以将试剂、介质等引入到生物反应器中，从而将环境条件调节至最佳环境条件组。
D.在线质量控制测定
在各种实施方案中，可以在细胞疗法制造方法期间的任何步骤进行测定。测定的非限制性示例可以包括分选后测定、T细胞激活测定、转导测定、细胞计数测定和细胞毒性测定。
i.在线质量控制测定
业内众所周知，在细胞疗法制造方法中保持无菌很重要，但很难提供。保持无菌环境可以确保避免可能导致运行故障的污染物。因此，细胞疗法制造系统的各种实施方案允许在不离开系统或盒的无菌内部的情况下进行测定。
图25D示出了根据各种实施方案覆盖在细胞疗法制造系统上的分选后测定过程。
图25E示出了根据各种实施方案覆盖在细胞疗法制造系统上的激活测定过程。
图25G示出了根据各种实施方案覆盖在细胞疗法制造系统上的转导测定过程。
图25H示出了根据各种实施方案覆盖在细胞疗法制造系统上的细胞计数测定过程。
在各种实施方案中，分选后测定可以包括抽取等份的样品。
在各种实施方案中，测定可以在盒上的分析区域(参见例如图24A的2770、图25A的3334/3336)内进行，下面更详细地讨论。如本文所讨论的，区域可以包括OEP或非OEP功能，这取决于测定(例如，细胞因子分泌和细胞杀伤测定可能需要OEP，而细胞计数和细胞活力测量可能不需要)。
ii.示例性测定方法
在各种实施方案中，用于各种测定的试剂可以储存在一个或多个测定试剂储存器3348a、3348b、3348c、3348d、3348e、3348f中。在各种实施方案中，等份或微等份的包含T细胞的流体可以从生物反应器3399中移出并转移至分析区域3334、3336用于询问。在各种实施方案中，一个或多个阀3320、3326、3328可以被致动以产生流动路径。在各种实施方案中，一种或多种试剂可以进入分析区域3334、3336并且与包含T细胞的流体组合。在各种实施方案中，T细胞可在询问后从细胞疗法制造系统中移至废物容器3344。在各种实施方案中，T细胞可以被保存并重新引入到过程中。在各种实施方案中，可以使用本文所述的细胞毒性测定中的一种或多种来评估细胞疗法产品的效力。
VI.细胞疗法应用
T细胞疗法：根据各种实施方案，本文提供了治疗需要治疗的受试者的方法，包括从受试者获得包含T淋巴细胞的样品。在各种实施方案中，受试者患有癌症，并且T淋巴细胞具有对抗癌症的能力(例如，通过特异性攻击和/或杀死癌细胞)。癌症的特征可以是液体肿瘤(例如，血液癌症，如白血病或淋巴瘤)或实体瘤(例如，肉瘤或癌)。在各种实施方案中，方法的步骤可以包括将T淋巴细胞与样品中的其他细胞分离。在各种实施方案中，方法的步骤可以包括使T淋巴细胞与激活表面接触。激活表面可以包括抗原呈递合成表面，其可以包括呈递疾病相关的抗原(例如，对受试者的癌症特异的抗原)的MHC分子。或者或此外，激活表面可以包含一种或多种广谱T细胞激动剂，例如T细胞受体(TCR)信号传导激动剂(例如CD3激动剂)、TCR共激活分子(例如CD28激动剂)、辅助TCR激活分子(例如CD2激动剂)或其任何组合。在各种实施方案中，方法的步骤可以包括产生被激活且对受试者的疾病相关的抗原(例如癌症抗原)具有特异性的多个T淋巴细胞。在各种实施方案中，产生对疾病相关的抗原具有特异性的多个T淋巴细胞可以包括使从受试者获得的样品中的T淋巴细胞与核酸分子接触，该核酸分子编码嵌合抗原受体(CAR)、TCR或能够特异性结合疾病相关的抗原的等效分子并产生稳定表达CAR、TCR或等效分子的T淋巴细胞群。在各种实施方案中，方法的步骤可以包括将多个特异性激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离。在各种实施方案中，方法的步骤可以包括将多个特异性激活的T淋巴细胞引入到受试者体内。
本文还提供了用于治疗疾病例如癌症的多个特异性激活的T淋巴细胞。癌症的特征可以是液体肿瘤(例如，血液癌症，如白血病或淋巴瘤)或实体瘤(例如，肉瘤或癌)。在各种实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备多个特异性激活的T淋巴细胞：从受试者获得包含T淋巴细胞的样品；将T淋巴细胞与样品中的其他细胞分离；使T淋巴细胞与激活表面接触；产生被激活且对引起疾病的受试者细胞(例如癌细胞)具有特异性的多个T淋巴细胞；以及将多个特异性激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离。激活表面可以包括抗原呈递合成表面，其可以包括呈递疾病相关的抗原(例如，对受试者的癌症具有特异性的抗原)的MHC分子。或者或此外，激活表面可以包含一种或多种广谱T细胞激动剂，例如T细胞受体(TCR)信号传导激动剂(例如CD3激动剂)、TCR共激活分子(例如CD28激动剂)、辅助TCR激活分子(例如CD2激动剂)或其任何组合。在各种实施方案中，制备多个特异性激活的T淋巴细胞的方法可以包括使从受试者获得的样品中的T淋巴细胞与核酸分子接触，该核酸分子编码嵌合抗原受体(CAR)、TCR或能够特异性地结合疾病相关的抗原的等效分子并产生稳定表达CAR、TCR或等效分子的T淋巴细胞群。
本文还提供了多个特异性激活的T淋巴细胞在制造用于治疗疾病例如癌症的药物中的用途，其中多个特异性激活的T淋巴细胞通过包括以下步骤的方法制备：从受试者获得包含T淋巴细胞的样品；将T淋巴细胞与样品中的其他细胞分离；使T淋巴细胞与激活表面接触；产生被激活且对受试者的癌症具有特异性的多个T淋巴细胞；以及将多个特异性激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离。癌症的特征可以是液体肿瘤(例如，血液癌症，如白血病或淋巴瘤)或实体瘤(例如肉瘤或癌)。激活表面可以包括抗原呈递合成表面，其可以包括呈递疾病相关的抗原(例如，对受试者的癌症具有特异性的抗原)的MHC分子。或者或此外，激活表面可以包含一种或多种广谱T细胞激动剂，例如T细胞受体(TCR)信号传导激动剂(例如CD3激动剂)、TCR共激活分子(例如CD28激动剂)、辅助TCR激活分子(例如CD2激动剂)或其任何组合。在各种实施方案中，制备多个特异性激活的T淋巴细胞的方法可以包括使从受试者获得的样品中的T淋巴细胞与核酸分子接触，该核酸分子编码嵌合抗原受体(CAR)、TCR或能够特异性地结合疾病相关的抗原的等效分子并产生稳定表达CAR、TCR或等效分子的T淋巴细胞群。
还提供了治疗需要治疗的受试者(例如患有癌症的受试者)的方法，其中该方法包括将多个特异性激活的T淋巴细胞引入到受试者中，以及通过本文所述的方法产生多个特异性激活的T淋巴细胞。还提供了治疗需要治疗的受试者(例如患有癌症的受试者)的方法，其中该方法包括将本文所述的特异性激活的T淋巴细胞群引入到受试者体内。此类方法还可以包括将激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离。还提供了本文所述的特异性激活的T淋巴细胞群，其用于治疗受试者(例如需要治疗癌症的受试者)。还提供了多个特异性激活的T淋巴细胞在制造用于治疗需要治疗的受试者(例如患有癌症的受试者)的药物中的用途，其中所述多个特异性激活的T淋巴细胞是由本文所述的方法生产的。还提供了本文所述的特异性激活的T淋巴细胞群在制造用于治疗需要治疗的受试者(例如患有癌症的受试者)的药物中的用途。这样的多个或群体的特异性激活的T淋巴细胞可以进一步通过将激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离来制备。
在各种实施方案中，分离多个特异性激活的T淋巴细胞还可以包括检测特异性激活的T淋巴细胞的表面生物标志物。
在各种实施方案中，特异性激活的T淋巴细胞是自体的(即，源自它们将被施用的受试者)。在各种实施方案中，特异性激活的T淋巴细胞被工程化，例如以表达特异性识别靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在各种实施方案中，多个或群体的特异性激活的T淋巴细胞的方法或制备还可以包括快速扩增激活的T淋巴细胞以提供扩增的激活的T淋巴细胞群。在一些实施方案中，快速扩增可以在将特异性激活的T淋巴细胞与非激活的T淋巴细胞分离后进行。足够水平的T淋巴细胞的产生可以使用本文所述的或本领域已知的快速扩增方法来实现。参见例如下面的实施例；Riddell，US 5,827,642；Riddell等，US专利号6,040,177；以及Yee和Li，PCT专利申请公开号WO2009/045308A2。
T细胞在人类受试者治疗中的用途(例如，用于过继性细胞疗法)是本领域已知的。根据本文所述的方法制备的T细胞可以用于此类方法中。例如，使用肿瘤浸润淋巴细胞(包括MART-1抗原特异性T细胞)的过继性细胞疗法已经在临床中进行了测试(Powell等，Blood105:241-250，2005)。此外，Chang等，J.Clinical Oncology 21:884-890，2003中描述了与抗CD3单克隆抗体和IL-2共激活的T细胞的施用。以下文献中提供了用于癌症治疗的T细胞施用的其他示例和/或讨论：Dudley等，Science 298:850-854，2002；Roszkowski等，CancerRes 65(4):1570-76，2005；Cooper等，Blood 101:1637-44，2003；Yee，US专利申请公开号2006/0269973；Yee和Li，PCT专利申请公开号WO2009/045308A2；Gruenberg等，US专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg，US专利号4,690,915；和Alajez等，Blood 105:4583-89，2005。
在各种实施方案中，通过以下来配制细胞：首先从其培养基中收获细胞，然后在适合以治疗有效量施用的介质(“药学上可接受的”载体)中洗涤并浓缩细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格乳酸盐。输注介质中可以补充有人血清白蛋白。
在各种实施方案中，组合物中的细胞数目为至少10^9个，或至少10^10个细胞。在一些实施方案中，单个剂量可以包含至少1000万、1亿、10亿或100亿个细胞。所施用的细胞数目特定于适应症、特定于患者的(例如患者的体型)，并且还将随着所施用细胞的纯度和表型而变化。细胞数目将取决于组合物预期的最终用途以及其中包含的细胞的类型。例如，如果需要对特定抗原具有特异性的细胞，则群体可以包含大于50％，例如大于60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90-95％的此类抗原特异性细胞。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，例如750毫升或更少、500毫升或更少、250毫升或更少、或甚至100毫升或更少。因此，所需细胞的密度可以大于10^6个细胞/ml、大于10^7个细胞/ml、大于10^8个细胞/ml或甚至更高。临床相关数目的免疫细胞可以被分配到多次输注中，其累计等于或超过10^9、10^10甚至10^11个细胞。
在各种实施方案中，本文所述的或根据本文所述的本发明的方法制备的T淋巴细胞可用于赋予个体针对肿瘤或癌细胞的免疫力。“免疫”是指与针对淋巴细胞已被激活的抗原的癌细胞或肿瘤相关的一种或多种身体症状的减轻。细胞可以通过输注施用。在各种实施方案中，每次输注可以在至少10^5至10^10个细胞/m2的范围内，例如在至少10^5至10^6个细胞/m2、至少10^5至10^7个细胞/m2、至少10^5至10^8个细胞/m2、至少10^6至10^7个细胞/m2、至少10^6至10^8个细胞/m2、至少10^6至10^9个细胞/m2、至少10^7至10^8个细胞/m2、至少10^7至10^9个细胞/m2、至少10^7至10^10个细胞/m2、至少10^8至10^9个细胞/m2、至少10^8至10^10个细胞/m2或至少10^9至10^10个细胞/m2的范围内。克隆可以通过单次输注或在一定时间范围内多次输注来施用。然而，由于不同个体预期的反应性不同，因此输注细胞的类型和数目以及多次输注的输注次数和时间范围由主治医师决定，并且可以通过检查来确定。
在将细胞转移回患者体内后，可以采用一些方法通过用可能包括IL-21和IL-2的细胞因子治疗患者来维持其活力(Bear等，Cancer Immunol.Immunother.50:269-74，2001；和Schultze等，Br.J.Haematol.113:455-60，2001)。在另一个实施方案中，细胞在施用至患者之前在IL-21存在下培养。参见，例如Yee，US专利申请公开号2006/0269973。IL-21可以将包含激活的T细胞的群体中的T细胞频率增加到这样的水平：其对于扩增和过继性转移来说足够高，而无需进一步富集抗原特异性T细胞。因此，这样的步骤可以进一步减少治疗时间和/或消除进一步选择和/或克隆的需要。
VII.微流体装置的示例性合成抗原呈递表面
A.微流体装置
在各种实施方案中，根据任一前述实施方案，微流体装置包括具有多个区域的图案化的抗原呈递合成表面。虽然微流体装置的抗原呈递表面可以是本文所述的任何微流体(或纳米流体)装置，但本公开内容不限于此。其他类别的微流体装置，包括但不限于例如WO2014/153651、WO2016/115337或WO2017/124101中描述的包括微孔或微室的微流体装置，可以被修改以并入如本节中描述的抗原呈递表面，或者可以与本文所述的抗原呈递珠或抗原呈递圆片组合用于本公开所述的方法中。
在各种实施方案中，抗原呈递合成表面是包含一个或多个隔离坞和通道的微流体装置的内表面。一个或多个此类隔离坞内的至少部分表面可以包含多个主激活分子配体和多个共激活分子配体，例如包含TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子。主激活分子配体和共激活分子配体可以是上文针对抗原呈递表面描述的任何配体，并且可以以如上所述的任何浓度或组合存在。连接至微流体装置的表面的配体的性质可以是上文针对抗原呈递表面所描述的任何性质。在各种实施方案中，一个或多个此类隔离坞内的该表面还可以包含表面封闭分子配体、生长刺激分子配体、另外的刺激分子配体和贴附刺激分子配体中的一种或多种。通道的至少部分表面可以包含表面封闭分子配体，例如本文所述的被配置成基本上排除主激活分子配体的任何区域。在各种实施方案中，通道的表面包含表面封闭分子配体和任选的其他非刺激性配体，但基本上不含隔离坞表面上存在的其他配体，例如主激活分子配体和共激活分子配体。
B.细胞与表面贴附的调节
在各种实施方案中，调节细胞贴附到微流体装置内的表面的能力可能是有用的。具有基本上亲水特性的表面可能无法为需要贴附机械应力以适当生长和扩增的细胞提供锚定点。存在过量此类锚定部分的表面可能会阻止成功生长的贴壁细胞从隔离坞内输出到微流体装置外。在各种实施方案中，共价结合的表面修饰包含表面接触部分以帮助锚定贴壁细胞。本文所述表面的结构和制备它们的方法提供了选择特定用途可能期望的锚定部分的量的能力。可能需要非常小百分比的贴附型基序来提供充分的贴附增强环境。在各种实施方案中，在将细胞引入到微流体装置中之前制备贴附增强部分。或者，可以在引入细胞之前提供贴附增强修饰表面，并且可以进一步添加另一贴附增强部分，其被设计为共价或非共价地连接至第一修饰表面(例如，如在生物素/链霉亲和素结合的底座中)。
在各种实施方案中，贴附增强表面修饰可以以表面修饰配体的各个分子的随机图案修饰表面。在各种实施方案中，可以通过使用含有多个贴附增强基序(例如带正电荷的赖氨酸侧链)的聚合物引入贴附增强表面修饰的更集中的图案，其可以产生被表面其余部分包围的小表面修饰区域，其可以具有亲水性表面修饰以调节贴附增强。这可以通过使用具有多个贴附增强配体的树枝状聚合物来进一步阐述。树枝状聚合物型表面修饰化合物或试剂可以相对于仅具有亲水性表面接触部分的第二表面修饰以非常小的比例存在，同时仍提供贴附增强。此外，树枝状聚合物型表面修饰化合物或试剂本身可以具有一组混合的末端官能团，其可以另外调节整个表面的行为。
在各种实施方案中，可能期望提供表面的区域选择性引入。例如，在包括微流体通道和隔离坞的微流体装置的情况下，可能期望在微流体通道内提供第一类型的表面，同时在隔离坞内提供从通道开口的表面，该表面提供了以下能力：成功地培养贴壁型细胞，并在需要时轻松输出它们(例如使用介电泳或其他力)。在一些实施方案中，贴附增强修饰可以包括可裂解部分。可裂解部分可以在与在其中培养的细胞相容的条件下是可裂解的，使得在任何期望的时间点，可裂解部分可以被裂解，并且表面的性质可以改变为对贴附的增强较少。下面的裂解的表面可以是有用的非污染性的，使得此时的输出得以增强。虽然本文讨论的示例集中于调节贴附性和运动性，但是这些区域选择性修饰表面的用途不限于此。为了对其中培养的细胞的任何类型的益处的不同表面修饰可以被并入到具有根据本公开的第一和第二表面修饰的表面中。
可以使用的示例性贴附基序包括聚-L-赖氨酸、胺等，以及三肽序列RGD，其可作为生物素化试剂获得并且容易适用于本文所述的方法。可以使用的其他较大生物分子包括纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白等。具有如WO2017/205830中所定义的式XXVI的结构(包括聚谷氨酸表面接触部分)的表面修饰可以诱导贴壁细胞附着和存活生长。另一个可能有助于提供贴附位点的基序是弹性蛋白样肽(ELP)，其包括VPGXG的重复序列，其中X是可以调节基序效果的可变氨基酸。
在各种实施方案中，在包括微流体通道和隔离坞的微流体装置的情况下，流动区域(例如微流体通道)的表面可以用第一共价结合表面修饰来修饰，并且至少一个隔离坞的表面可以用第二共价结合表面修饰来修饰，其中第一和第二共价结合表面修饰具有不同的表面接触部分、不同的反应性部分或其组合。第一和第二共价结合表面修饰可以选自式XXX、式V、式VII、式XXXI、式VIII和/或式IX中的任一个，所有这些均如WO2017/205830中所定义。当第一和第二共价结合表面修饰均包括如WO2017/205830中所定义的式XXX、式V或式VII的功能化表面时，则选择正交反应化学来选择第一反应性部分和第二反应性部分。在各种实施方案中，流动区域的所有表面可以用第一共价表面修饰来修饰，并且至少一个隔离坞的所有表面可以用第二共价修饰来修饰。
VIII.制备合成抗原呈递表面的示例性方法
A.制备抗原呈递合成表面的方法；共价功能化的表面
图5A和5B显示了抗原呈递合成表面的结构，其由未修饰的表面构建而成，在一个或多个步骤中添加了激活、共激活和表面封闭分子配体。图5A显示了具有单个区域的抗原呈递合成表面的过程和结构，而图5B显示了具有两个区域的抗原呈递合成表面的各中间体和最终产物的过程和结构。
转向图5A，该示意图说明了从包含多个表面暴露部分(SEM)的合成反应性表面开始制备抗原呈递表面的示例性程序。如果在制备过程中此时添加反应性部分RM和表面封闭分子配体SB，则通过使SEM与适当的制备试剂反应来引入它们，从而提供中间反应性表面。引入到中间反应性表面的反应性部分RM可以是本文所述的任何反应性部分并且可以通过本文所述的任何接头连接至中间反应性表面。中间反应性表面至少包括反应性部分RM，并且在一些实施方案中，可以包括表面封闭分子配体SB，其可以是本文所述的任何表面封闭分子配体。
然后用包括结合部分BM的功能化试剂处理中间反应性表面，其中功能化试剂与反应性部分RM反应以引入结合部分BM配体。如此引入的结合部分可以是本文所述的任何结合部分BM。结合部分BM可以是链霉亲和素或生物素。在各种实施方案中，结合部分BM是链霉亲和素，其通过与反应性部分RM的反应，经由接头共价连接到共价功能化的表面。在各种实施方案中，共价功能化的表面可以以两部分结构非共价地引入链霉亲和素结合部分。这种两部分结构的引入是通过使中间反应性表面与第一功能化试剂接触以引入通过与反应性部分RM反应而经由接头共价连接的生物素部分。随后引入作为第二功能化试剂的链霉亲和素，提供共价功能化的表面，其中结合部分BM链霉亲和素非共价连接至生物素部分，该生物素部分本身共价连接至表面。表面封闭分子配体SB’可以在引入结合部分的同时引入，或者可以在引入结合部分之后引入到共价功能化的表面。表面封闭分子配体SB’可以是本文所述的任何表面封闭分子配体，并且如果存在表面封闭分子配体SB，则可以与表面封闭分子配体SB相同或不同。在一些实施方案中，可以存在表面封闭分子配体SB并且可以不存在表面封闭分子配体SB’。或者，可以存在表面封闭分子配体SB’，但不存在表面封闭分子配体SB。在一些实施方案中，表面封闭分子配体SB和SB’均存在。不受理论的束缚，共价功能化的表面上可能留下一些未反应的反应性部分RM，但存在的反应性部分RM的数量不足以阻止产物抗原呈递合成表面发挥作用。通过使共价功能化的表面的结合部分BM与适当的激活配体试剂反应来引入主激活配体MHC和共激活配体Co-A1和Co-A2，从而提供抗原呈递合成表面。Co-A1和Co-A2可以是相同或不同的共激活配体。例如，Co-A1和Co-A2可以包含TCR共激活分子和TCR辅助激活分子中的一种、另一种或两者。Co-A1和/或Co-A2可以是本文所述的TCR共激活分子和TCR辅助激活分子的任何组合。在各种实施方案中，在使共价功能化的表面与共激活配体Co-A1和/或Co-A2接触之前，可以将主激活配体MHC引入到共价功能化表面。在各种实施方案中，可以在引入共激活配体Co-A1和Co-A2的同时或随后将主激活配体MHC引入到共价功能化表面。在一些实施方案中，在图5A中未示出，在引入主激活配体MHC和共激活配体Co-A1和/或Co-A2之后，可以通过使表面封闭分子与仍然存在于抗原呈递合成表面上的剩余反应性部分RM反应将表面封闭分子配体SB引入到抗原呈递合成表面。还包括但未在图5A中示出的是次级配体SL的引入，它可以是一种或多种生长刺激分子配体和/或贴附刺激分子配体。次级配体SL可以是这些类别的配体中的任何一种。
图5B提供了从包含多个表面暴露部分(SEM)的合成反应性表面开始制备包含第一和第二区域的抗原呈递表面的示例性程序的示意图。如图6所示，区域1中的表面暴露部分SEM可以不同于区域2中的表面暴露部分SEM2，其中不同的材料可以存在于合成反应性表面的表面处。由于对SEM和SEM2中的每一个使用正交化学，反应性部分RM被引入到区域1中并且基本上不引入到区域2中，而反应性部分RM2被引入到区域2中并且基本上不引入到区域1中。例如，如图6所示，区域1的SEM可以与包含叠氮化物RM的烷氧基硅氧烷试剂反应，而区域2的SEM2可以与包含炔基RM的膦酸试剂反应。通过使SEM与适当的制备试剂反应(例如，对于类似图6的区域1的表面，该试剂将是包括表面封闭基团SB的烷氧基硅氧烷试剂)，将表面封闭分子配体SB1引入到区域1中，并且基本上不引入到区域2中。此过程产生具有差异化反应性部分的中间反应性表面。基于差异化反应性部分RM和RM2，进一步的正交化学可以将结合部分BM和表面封闭分子配体SB1’引入到区域1中且基本上不引入到区域2中，并且将表面封闭分子配体SB2引入到区域2中且基本上不引入到区域1中。因此，提供了具有两个不同区域的共价功能化的表面。SB1’可以与SB1相同或不同；SB1’可以与SB2相同或不同；并且SB2可以与SB1相同或不同。通过使结合部分BM与适当的激活配体试剂反应将主激活配体MHC和共激活配体Co-A1和Co-A2引入到区域1中，并且通过使RM与适当的试剂反应在区域2中形成次级配体SL，从而提供抗原呈递合成表面。次级配体SL可以是针对图5A所述的任何类别的分子配体。类似于针对图5A描述的过程，可以在引入共激活配体之前引入主激活配体MHC。Co-A1和Co-A2可以是相同或不同的共激活配体。例如，Co-A1和Co-A2可以包含TCR共激活分子和TCR辅助激活分子中的一种、另一种或两者。SEM、RM、SB、主激活配体MHC、共激活配体Co-A1和Co-A2以及次级配体SL中的每一个可以是本文所述的任何SEM、RM、SB、主激活配体MHC、共激活配体Co-A1和Co-A2以及第二配体SL。
B.制备抗原呈递合成表面的方法
提供了一种制备用于激活T淋巴细胞(T细胞)的抗原呈递合成表面的方法，其包括：使多个主激活分子与包含结合部分(例如生物素结合剂如链霉亲和素或者与生物素结合剂如链霉亲和素共价结合的生物素部分)的共价功能化的合成表面的第一多个结合部分反应，其中第一多个结合部分中的每一个均被配置用于结合主激活分子；以及使多个共激活分子(每个共激活分子包含：T细胞受体(TCR)共激活分子；或辅助TCR激活分子)与共价功能化的合成表面的第二多个结合部分反应，其中第二多个结合部分中的每一个均被配置用于结合共激活分子，从而在抗原呈递合成表面上提供多个特异性结合的主激活分子配体和多个特异性结合的共激活分子配体。
还提供了共价功能化的合成表面，其包含结合部分(例如，生物素结合剂如链霉亲和素，或者与生物素结合剂如链霉亲和素非共价结合的生物素部分)和至少第一多个表面封闭分子配体。就以下讨论描述共价功能化的合成表面的特征而言，其既适用于共价功能化的合成表面的实施方案，也适用于制备其中使用共价功能化的合成表面的抗原呈递表面的方法的实施方案。
共价功能化的合成表面可以是本文所述的任何表面类型，例如珠、圆片、微流体装置的内表面或管(例如玻璃或聚合物管)。表面材料可以包括例如金属、玻璃、陶瓷、聚合物或金属氧化物。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，并且可以具有特征的任何组合。珠可以是表面积在等体积或直径的球体表面积的10％以内的珠，如本文关于抗原呈递合成表面的部分中所讨论的。在一些实施方案中，珠可以是表面积超过等体积或直径的球体表面积的10％的珠，如本文针对抗原呈递表面所讨论的。在各种实施方案中，珠不是表面积超过等体积或直径的球体表面积的10％的珠，如本文针对抗原呈递表面所讨论的。
主激活分子和共激活分子各自可以是本文所述的任何此类分子，并且可以使用其任何组合。因此，主激活分子可以包括MHC分子和任选的抗原肽；并且共激活分子可以包括本文所述的任何TCR共激活分子或本文所述的任何辅助TCR激活分子。
在各种实施方案中，使多个主激活分子与包含结合部分的共价功能化的合成表面的第一多个结合部分反应包括在主激活分子与结合部分之间形成非共价结合。例如，主激活分子可以包括生物素且结合部分可以包括生物素结合剂如链霉亲和素(例如，其可以共价结合至表面或可以非共价结合至本身共价结合至表面的第二生物素)。在一些实施方案中，生物素结合剂如链霉亲和素通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长连接至表面。例如，生物素结合剂可以通过具有如上所述的选定长度的一系列一个或多个接头连接至表面。在另一个示例中，结合部分和主激活分子均可包含生物素，并且游离的多价生物素结合剂如链霉亲和素可以用作非共价连接剂。也可以使用任何其他合适的非共价结合对，例如本文别处描述的那些。
或者，使多个主激活分子与包含结合部分的共价功能化的合成表面的第一多个结合部分反应可以包括形成共价键。例如，叠氮化物-炔烃反应(例如本文别处描述的那些中的任一种)可用于形成共价键，其中主激活分子和结合部分分别包含叠氮化物和炔烃，或炔烃和叠氮化物。如本领域已知的，可以使用其他反应对，包括但不限于马来酰亚胺和硫化物。更一般地，可用于形成共价键的示例性官能团包括叠氮化物、羧酸及其活性酯、琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、酮、磺酰卤、磺酸、二苯并环辛炔、烯烃、炔烃等。技术人员熟悉使用此类部分形成共价键的适当组合和反应条件。
当共价功能化的合成表面包含共价结合的生物素时，该表面还可以包含非共价结合的生物素结合剂(例如链霉亲和素)，使得该表面可以与包含生物素部分的主激活分子和共激活分子反应。在一些实施方案中，制备抗原呈递合成表面的方法包括使包含共价结合的生物素的共价功能化的合成表面与生物素结合剂(例如链霉亲和素)反应，然后与包含以下生物素部分的主激活分子和共激活分子反应。在一些实施方案中，共价功能化的表面的生物素通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长与表面连接。
在各种实施方案中，反应在表面上提供任何本文所述的密度的主激活分子配体，例如每平方微米约4×102至约3×104、4×102至约2×103、约5×103至约3×104、约5×103至约2×104或约1×104至约2×104个分子。
在各种实施方案中，使多个共激活分子(每个共激活分子包含T细胞受体(TCR)共激活分子；或辅助TCR激活分子)与共价功能化的合成表面的第二多个结合部分反应包括在共激活分子和结合部分之间形成非共价结合。可以使用上文描述的或在本文公开的关于涉及非共价结合对(例如生物素和生物素结合剂(例如链霉亲和素))的主激活分子的任何实施方案中阐述的任何实施方案。
或者，使多个共激活分子与共价功能化的合成表面的第二多个结合部分反应可以包括形成共价键。例如，叠氮化物-炔烃反应(例如本文别处描述的那些中的任一种)可用于形成共价键，其中主激活分子和结合部分分别包含叠氮化物和炔烃，或者炔烃和叠氮化物。
在各种实施方案中，反应在表面上提供本文所述的任何密度的共激活分子配体，例如每平方微米约4×102至约3×104、4×102至约2×103、约5×103至约3×104、约5×103至约2×104或约1×104至约2×104个分子。
在各种实施方案中，反应以本文所述的任何比例在表面上提供TCR共激活分子和辅助TCR激活分子，例如100:1至1:100、10:1至1:20、5:1至1:5或3:1至1:3，其中前述值中的每一个都可以用“约”修饰。
在各种实施方案中，上文描述的或本文公开的任何实施方案中阐述的反应以本文所述的任何比例(例如约1:1至约2:1；约1:1；或约3:1至约1:3)在表面上提供主激活分子配体和共激活分子配体。
在各种实施方案中，制备抗原呈递表面的方法还包括使多个表面封闭分子与共价功能化的表面的第三多个结合部分反应，其中第三多个结合部分中的每一个均被配置用于结合表面封闭分子。可以使用本文别处描述的任何表面封闭分子。可以使用本文所述的用于形成非共价结合或共价键的任何反应方法。
在各种实施方案中，制备抗原呈递表面的方法还包括使多个贴附刺激分子配体(其中每个贴附刺激分子配体包括用于细胞贴附受体的配体，该细胞贴附受体包括ICAM蛋白质序列)与共价功能化的珠的第四多个结合配体反应，其中第四多个结合部分中的每一个均被配置用于与细胞贴附受体配体分子结合。可以使用本文所述的用于形成非共价结合或共价键的任何反应方法。
在各种实施方案中，制备抗原呈递表面的方法还包括产生中间反应性表面。这可以包括例如使设置在合成反应性表面的表面处的表面暴露部分的至少第一部分与包括反应性部分的多个中间制备分子反应，从而产生中间反应性表面。制备可用作中间反应性表面的共价功能化的表面的方法在本文别处详细描述。产生中间反应性表面可以包括本文关于制备共价功能化的表面的方法所描述的任何特征。
在各种实施方案中，该方法还包括调节细胞贴附至微流体装置内的表面的能力，例如通过为需要贴附机械应力以适当生长和扩增的细胞提供锚定点。这可以通过引入包含表面接触部分的共价结合的表面修饰来帮助锚定贴壁细胞来实现。可以使用本文别处描述的任何表面接触部分。
共价功能化的合成表面可以包含适用于本文所述的任何反应的部分。C.制备共价功能化的表面的方法
还提供了一种制备共价功能化的表面的方法，所述共价功能化的表面包括多个链霉亲和素或生物素官能团和至少第一多个表面封闭分子配体，其中所述方法包括：使中间反应性合成表面的反应性部分的至少第一子集与多个连接试剂反应，每个连接试剂包括链霉亲和素或生物素；以及使中间反应性合成表面的反应性部分的至少第二子集与多个表面封闭分子反应，从而提供包括至少多个链霉亲和素或生物素官能团和至少第一多个表面封闭分子配体的共价功能化的合成表面。通常，仅使用包括链霉亲和素的连接试剂或包括生物素的连接试剂中的一种或另一种。中间反应性合成表面可以是本文所述的任何表面类型，例如珠、圆片、微流体装置的内表面或管(例如玻璃或聚合物管)。表面材料可以包括例如金属、玻璃、陶瓷、聚合物或金属氧化物。抗原呈递微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，并且可以具有任何特征的组合。珠可以是表面积在等体积或直径的球体表面积的10％以内的珠，如本文中关于抗原呈递合成表面的部分中所讨论的。
在连接试剂包括生物素的实施方案中，该方法还可以包括将链霉亲和素与生物素非共价结合。在此类实施方案中，参考图5A，反应性部分RM向结合部分BM的转化可以包括通过与RM反应共价连接生物素(对应于上文描述中的另外的生物素)，然后将链霉亲和素与共价连接的生物素非共价结合。
在一些实施方案中，中间反应性合成表面的反应性部分通过一系列5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或在一些实施方案中更大数目的键连接至表面。例如，反应性部分可以通过一系列15个键连接，例如使用(11-(X)十一烷基)三甲氧基硅烷，其中X是反应性部分(例如，X可以是叠氮基)。对于包括生物素的连接试剂，然后可以使用连接试剂(例如具有通式结构DBCO-PEG4-生物素的连接试剂(可从BroadPharm商购获得))将生物素共价结合。在一些实施方案中，生物素通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长连接至表面。对于包括链霉亲和素的连接试剂，然后可以使用连接试剂(例如具有通式结构DBCO-PEG13-琥珀酰亚胺的连接试剂)将链霉亲和素共价结合，随后使链霉亲和素与琥珀酰亚胺反应。在一些实施方案中，链霉亲和素通过一系列约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长连接至表面。将部分连接至表面所通过的键的数目可以改变，例如通过使用与上述那些类似但具有不同长度的亚烷基和/或PEG链的试剂。
在各种实施方案中，中间反应性合成表面的至少第一区域的反应性部分包括叠氮化物部分。在一些实施方案中，共价键通过叠氮化物-炔烃反应形成，例如本文别处描述的任何叠氮化物-炔烃反应。
在各种实施方案中，共价功能化的合成表面包括第二区域，其中排除多个链霉亲和素官能团。在一些实施方案中，至少第一多个表面封闭分子配体被设置在共价功能化的合成表面的第二区域中。
在各种实施方案中，方法还包括使第二多个表面封闭分子与中间反应性合成表面的至少第一区域的反应性部分的第二子集反应。
在各种实施方案中，多个链霉亲和素官能团的反应和至少第一多个表面封闭分子的反应共价制备的包括反应性部分的合成表面的至少第一区域的多个子区域处进行。
在各种实施方案中，反应性合成表面的第二部分包括被配置成基本上不与多个主激活分子和共激活分子反应的表面暴露部分。
在各种实施方案中，方法还包括制备中间反应性合成表面，包括使包括叠氮化物反应性部分的至少第一表面制备试剂与设置在反应性合成表面的至少第一区域处的表面暴露部分反应。
在各种实施方案中，表面暴露部分是亲核性部分。在一些实施方案中，表面的亲核性部分是氢氧化物、氨基或硫醇。在一些其他实施方案中，表面的亲核部分可以是氢氧化物。
在各种实施方案中，表面暴露部分是可置换部分。
在使用两种修饰剂的各种实施方案中，第一修饰试剂与表面的反应和第二修饰试剂与表面的反应可以发生在表面上的随机位置。在其他实施方案中，第一修饰试剂的反应可以发生在表面的第一区域内，并且第二修饰试剂的反应可以发生在邻接第一区域的表面的第二区域内。例如，可以用第一表面修饰选择性地修饰微流体装置的通道内的表面，并且可以用第二不同的表面修饰选择性地修饰与通道内的表面邻接的隔离坞内的表面。
在各种实施方案中，第一修饰试剂的反应可以发生在至少一个表面上彼此分开的多个第一区域内，并且第二修饰反应的反应可以发生在围绕彼此分开的多个第一区域的第二区域处。
在各种实施方案中，可以在组装微流体装置之后对微流体装置的一个或多个表面进行修饰以引入第一表面修饰和第二表面修饰的组合。对于一个非限制性示例，可以在微流体装置组装之后通过化学气相沉积来引入第一和第二表面修饰。在另一个非限制性示例中，可以引入具有第一表面修饰和第二表面修饰的功能化的表面，第一表面修饰具有第一反应性部分，第二表面修饰具有第二正交反应性部分。随后可以差异转化为具有两种不同表面接触部分的两种不同表面修饰配体。
在各种实施方案中，第一和第二表面修饰的组合中的至少一个可以在组装微流体装置之前进行。在一些实施方案中，修饰至少一个表面可以在组装微流体装置之后进行。
在各种实施方案中，制备了包含结合剂的共价功能化的表面。在一些实施方案中，多个结合剂(例如，多个多价结合剂，例如四价结合剂，例如链霉亲和素官能团，其可以与共价结合的生物素共价结合或非共价结合)在共价功能化的合成表面上的分布在其所连接的每个区域中为每平方微米约6×102至约5×103个分子。在一些实施方案中，多个结合剂(例如，多个多价结合剂，例如三价结合剂)的分布在其所连接的每个区域中为每平方微米约1.5×103至约1×104、约1.5×103至约7.5×103或约3×103至约7.5×103个分子。在一些实施方案中，多个结合剂(例如，多个多价结合剂，例如二价结合剂)的分布在其所连接的每个区域中为每平方微米约2.5×103至约1.5×104、约2.5×103至约1×104或约5×103至约1×104个分子。在一些实施方案中，多个结合剂(例如，多个单价结合剂)的分布在其所连接的每个区域中为每平方微米约5×103至约3×104、约5×103至约2×104或约1×104至约2×104个分子。
在各种实施方案中，制备了包含结合剂的共价功能化的表面，其中多个结合剂(例如，链霉亲和素官能团，其可以与共价结合的生物素共价结合或非共价结合)在共价功能化的合成表面上的分布在其连接的每个区域中为每平方微米约1×104至约1×106个分子。
在各种实施方案中，提供了组合方法，其包括制备共价功能化的表面，然后制备抗原呈递合成表面。因此，可以使用用于制备共价功能化的表面的步骤和用于制备抗原呈递合成表面的步骤的任何合适的组合。
IX.表面制备和共价功能化的表面的其他方面
本文所述的制备表面的任何方法，包括制备抗原呈递合成表面的方法和制备共价功能化的表面的方法，可以还包括一个或多个以下方面。共价功能化的表面还可以包含适用于此类表面的以下方面中的一个或多个，例如反应性基团。
A.叠氮化物-炔烃反应
在各种实施方案中，共价键通过使炔烃(例如无环炔烃)与叠氮化物反应形成。例如，可以进行“点击”环化反应，其由铜(I)盐催化。当使用铜(I)盐来催化该反应时，反应混合物可以任选地包含可以提高反应速率或程度的其他试剂。当例如表面修饰试剂或功能化的表面的炔烃是环辛炔时，与相应的功能化的表面或表面修饰试剂的叠氮化物发生的“点击”环化反应可以是无铜的。因此，“点击”环化反应可用于将表面修饰配体偶联至功能化的表面以形成共价修饰的表面。
B.铜催化剂
可以使用任何合适的铜(I)催化剂。在一些实施方案中，碘化铜(I)、氯化铜(I)、溴化铜(I)或另一种铜(I)盐。在其他实施方案中，铜(II)盐可以与还原剂例如抗坏血酸盐组合使用以原位产生铜(I)物质。硫酸铜或乙酸铜是合适的铜(II)盐的非限制性示例。在其他实施方案中，还原剂例如抗坏血酸盐可以与铜(I)盐组合存在以确保在反应过程期间有足够的铜(I)物质。铜金属可用于在氧化还原反应中提供Cu(I)物质，也产生Cu(II)物质。可以使用铜的配位络合物，例如[CuBr(PPh3)3]、铜的硅钨酸盐络合物、[Cu(CH3CN)4]PF6或(Eto)3P CuI。在又一些实施方案中，可以采用二氧化硅负载的铜催化剂、铜纳米簇或铜/氧化亚铜纳米颗粒作为催化剂。
C.其他反应增强剂
如上文所述，可以使用还原剂例如抗坏血酸钠以允许在整个反应中保持铜(I)物质，即使没有严格地将氧排除在反应之外。反应混合物中可以包含其他辅助配体，以稳定铜(I)物质。可以使用含有三唑基的配体，包括但不限于三(苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲胺(TBTA)或3[三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)。另一类可用于促进反应的辅助配体是磺化的红菲咯啉，它也是水溶性的，并且可以在可以排除氧气时使用。本领域已知的其他化学偶联可用于将表面修饰试剂偶联至功能化的表面。
D.清洁表面
可以在修饰之前清洁待修饰的表面，以确保表面上的亲核性部分可自由地用于反应，例如，不被油或粘合剂覆盖。清洁可以通过任何合适的方法完成，包括用包括醇或丙酮的溶剂处理、超声处理、蒸汽清洁等。或者或此外，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁器中清洁(例如，在微流体装置的组件的情况下，对盖、微流体回路材料和/或衬底进行清洁)，这可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面处的氧化物，其可以如本文所述被共价修饰)。或者，液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如食人鱼溶液，其硫酸与过氧化氢的比例可以为约3:1至约7:1)可以用于代替氧等离子清洁器。这可以有利地在表面上提供更多的用于修饰的位点，从而提供更紧密堆积的经修饰的表面层。
E.微流体装置的组件
可以用作微流体装置的组件的材料的表面可以在其组装之前进行修饰。或者，可以修饰部分或完全构建的微流体装置，使得将接触包括生物分子和/或微物体(其可以包括生物微物体)的生物材料的所有表面同时被修饰。在一些实施方案中，即使在装置和/或设备内的不同表面处存在不同的材料，也可以修饰装置和/或设备的整个内部。该讨论也适用于本文所述的制备抗原呈递合成表面的方法。
当微流体装置的内表面与表面修饰试剂反应时，可以通过使表面修饰试剂的溶液流入并流过微流体装置来进行反应。
F.表面修饰试剂溶液和反应条件
在各种实施方案中，表面修饰试剂可用于液相表面修饰反应，例如，其中表面修饰试剂以溶液例如水溶液的形式提供。可以使用其他有用的溶剂，包括二甲基亚砜(DMSO)水溶液、DMF、乙腈或醇。例如，用甲苯磺酰基激活或用环氧基标记的表面可以在液相反应中进行修饰。将生物素或蛋白质(例如抗体、MHC或链霉亲和素蛋白)与结合部分偶联的反应也可以作为液相反应进行。
反应可以在室温或升高的温度下进行。在一些实施方案中，反应在约15℃至约60℃；约15℃至约55℃；约15℃至约50℃；约20℃至约45℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，将微流体装置的功能化的表面转化为共价修饰的表面的反应在约15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或约60℃的温度下进行。
或者，可以在气相表面修饰反应中使用表面修饰试剂。例如，可以在气相反应中对二氧化硅表面和其它包含羟基的表面进行修饰。在一些实施方案中，用等离子体处理表面(例如，硅表面)(例如，使用氧等离子体清洁器；参见示例性处理条件的实施例)。在一些实施方案中，表面例如经等离子体处理的表面和/或硅表面在真空下与制备试剂反应，所述制备试剂例如包含甲氧基硅烷和叠氮化物，例如(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷。制备试剂最初可以以液体形式提供在与表面分离的容器中，并且可以被蒸发以使其可用于与表面反应。还可以例如在另一个单独的容器中提供水源，例如水合盐，例如七水合硫酸镁。例如，真空反应器底部的箔船可以用作单独的容器。示例性的反应条件和程序包括使用真空泵将室抽至约750mTorr，然后将室密封。然后可以将真空反应器在高于环境温度下孵育适当长度的时间，例如，通过将其放置在110℃加热的烘箱中24-48小时。在反应期之后，可以使室冷却并且可以将诸如氩气的惰性气体引入到抽空的室中。可以用一种或多种合适的液体例如丙酮和/或异丙醇冲洗表面，然后在惰性气体例如氮气流下干燥。可以使用椭圆偏振法和接触角测角法等技术来确认引入经修饰的表面。
可以根据本公开采用的另外的修饰表面、表面修饰试剂和相关方法描述于2017年11月30日公开的WO2017/205830中，出于所有目的通过引用将该文献并入本文。
X.细胞和组合物
提供了通过本文所述的任何方法产生的激活的T淋巴细胞(例如T细胞)。具体地，T细胞。
在各种实施方案中，激活的T淋巴细胞可以是CD45RO+。在一些实施方案中，激活的T淋巴细胞可以是CD28+。在一些实施方案中，激活的T淋巴细胞可以是CD28+CD45RO+。在一些实施方案中，激活的T淋巴细胞可以是CD197+。在一些实施方案中，激活的T淋巴细胞可以是CD127+。在一些实施方案中，激活的T淋巴细胞可以对CD28、CD45RO、CD127和CD197、前述标志物中的至少三种的任何组合或前述标志物中的至少两种的任何组合呈阳性。具有任何前述表型的激活的T淋巴细胞还可以是CD8+。在一些实施方案中，为CD28+的任何前述表型包括CD28高表型。
在各种实施方案中，提供了通过本文所述的任何方法产生的包含激活的T细胞的T细胞群。该群体可以具有上文针对T细胞群所述的任何特征。
在各种实施方案中，提供了包含本文提供的T细胞群的微流体装置。微流体装置可以是本文所述的任何抗原呈递微流体装置或其他微流体装置(例如，用于进行抗原特异性细胞毒性测定)。
在各种实施方案中，提供了包含本文提供的T细胞群的药物组合物。药物组合物还可包含例如盐水、葡萄糖和/或人血清白蛋白。该组合物可以是水性组合物并且可以以冷冻或液体的形式提供。药物组合物可以作为单剂量提供，例如在注射器内，并且可以包含1000万、1亿、10亿或100亿个细胞。所施用的细胞数目是特定于适应症、特定于患者的(例如患者的体型)，并且还将随着所施用的细胞的纯度和表型而变化。
XI.细胞毒性测定
A.进行抗原特异性细胞毒性测定的方法
本文提供了一种进行抗原特异性细胞毒性测定的方法，其包括：
将一个或多个靶细胞加载到微流体装置的隔离坞中；
将一个或多个T细胞加载到隔离坞中，使得该一个或多个T细胞可以接触一个或多个靶细胞；
将靶细胞与标记凋亡细胞的可检测标志物接触；和
检测靶细胞是否发生凋亡。
微流体装置可以是本文所述的任何装置。包括在用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒中的微流体装置不需要包含抗原呈递合成表面。可以根据本文所述的用于产生或激活此类细胞的任何方法来产生或激活一个或多个T细胞。可以使用本文所述的任何类型的CD8+T细胞。在一些实施方案中，一个或多个T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，一个或多个T细胞不表达CAR。
靶细胞可以表达肿瘤抗原，例如本文所述的任何肿瘤抗原。在一些实施方案中，T细胞对靶细胞表达的抗原具有特异性。在一些实施方案中，靶细胞来自永生细胞系和/或源自癌症，例如黑色素瘤、乳腺癌或肺癌。
在各种实施方案中，将单个靶细胞和/或单个T细胞加载到隔离坞中。在一些实施方案中，将多个靶细胞和/或多个T细胞加载到隔离坞中。在一些实施方案中，多个T细胞是克隆群体。在一些实施方案中，将单个T细胞和多个靶细胞加载到隔离坞中。
可以使用重力将细胞加载到隔离坞中，例如，通过倾斜微流体装置，使得细胞在重力作用下被拉入到坞中。或者，对于具有介电泳(DEP)配置的微流体装置，DEP力可用于加载细胞。在一些实施方案中，DEP力由结构光激活。
可以使用标记凋亡细胞的任何合适的标志物。标记凋亡细胞的标志物包括那些可与活细胞区别地标记死细胞的标志物，例如不穿过活细胞膜但穿过受损的死细胞膜的染料，以及依赖于凋亡相关的蛋白或酶活性的标记物(例如凋亡相关的蛋白酶)的用于标记的标记物。在一些实施方案中，标志物包括核酸结合部分。在一些实施方案中，标志物是通过蛋白酶(例如凋亡相关的蛋白酶，例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)的切割而被激活的荧光或可切割标志物。在一些实施方案中，标志物包括结合剂(例如抗体)其特异性地结合至凋亡细胞和/或凋亡小体；结合剂还可以包含可检测部分，例如荧光团。
该方法可以包括检测靶细胞是否已发生凋亡一次或周期性地发生凋亡，例如两次、三次或更多次。该方法可以包括在使细胞与标志物和/或T细胞接触2小时或更长时间后检测靶细胞是否已经发生凋亡。
B.用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒
本文还提供了用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括微流体装置。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。在一些实施方案中，微流体装置如上文关于用于进行抗原特异性细胞毒性测定的方法的部分中所描述的或如本文所公开的任何实施方案中所阐述的。包括在用于进行抗原特异性细胞毒性测定的试剂盒中的微流体装置不需要包含抗原呈递合成表面。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测凋亡细胞的试剂。在一些实施方案中，用于检测凋亡细胞的试剂是如上文关于进行抗原特异性细胞毒性测定的方法的部分中所述或如本文公开的任何实施方案中阐述的标记凋亡细胞的可检测标志物。
XII.试剂盒
A.用于制备抗原呈递合成表面的试剂盒
还提供了用于制备用于激活T淋巴细胞(T细胞)的抗原呈递合成表面的试剂盒，其包括：a.如本文所述的任何共价功能化的合成表面，其包括多个非共价或共价结合的第一偶联剂；第一修饰试剂，其包括多个主要组织相容性复合物(MHC)I分子，其被配置成与T细胞的T细胞受体结合，并且进一步其中所述MHC分子被配置成与共价功能化的合成表面的多个非共价或共价结合的第一偶联剂的第一子集中的一个结合。在一些实施方案中，第一偶联剂可以是生物素结合剂。生物素结合剂可以是链霉亲和素。在一些实施方案中，多个MHC分子中的每一个还可以包括至少一个生物素官能团。可以使用本领域中已知的其他偶联化学，其中其他位点特异性蛋白标签可以连接至MHC蛋白，其被配置成共价连接至与珠连接的基于识别蛋白的物质。这些偶联策略可以提供与MHC分子的C端生物素化所提供的等效的MHC分子的位点特异性和特异性定向的连接。共价功能化的合成表面可以是圆片、珠、微流体装置的至少一个内表面或管。
试剂盒还可以包括包含多个共激活分子的试剂，每个共激活分子均被配置成结合共价功能化的合成表面的多个非共价或共价结合的生物素结合剂的第二子集中的一个。在各种实施方案中，多个共激活分子中的每一个均可以包括生物素官能团。每种共激活分子均可以包括T细胞受体(TCR)共激活分子、辅助TCR激活分子或其任何组合。在各种实施方案中，将试剂提供在含有T细胞受体(TCR)共激活分子和/或辅助TCR激活分子的单独容器中。或者，包括多个共激活分子的试剂可以提供在以约100:1至1:100的比例含有多个共激活分子配体的TCR共激活分子和/或辅助TCR激活分子的一个容器中。在各种实施方案中，包括多个共激活分子的试剂包括TCR共激活分子和辅助TCR激活分子的混合物，其中多个共激活分子配体的TCR共激活分子与辅助TCR激活分子的比例为100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中的每一个均由“约”修饰。在各种实施方案中，包括多个共激活分子的试剂以约20:1至约1:20的比例含有多个共激活分子配体的TCR共激活分子和辅助TCR激活分子。
在各种实施方案中，用于制备抗原呈递合成表面的试剂盒还可以包括含有贴附刺激分子的试剂，其中每个贴附刺激分子包括用于细胞贴附受体的配体，该配体包括被配置成与共价功能化的合成表面的多个非共价或共价结合的生物素结合剂官能团的第三子集反应的ICAM蛋白序列。在一些实施方案中，贴附刺激分子可以包括生物素官能团。
在各种实施方案中，用于制备抗原呈递合成表面的试剂盒还可以包括含有生长刺激分子的试剂，其中每种生长刺激分子均可以包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括细胞因子或其片段。在各种实施方案中，细胞因子可以包括IL-21或其片段。在各种实施方案中，生长刺激分子可以连接至共价修饰的珠。
在各种实施方案中，用于制备抗原呈递合成表面的试剂盒还可以包括含有一种或多种另外的生长刺激分子的试剂。在一些实施方案中，该一种或多种另外的生长刺激分子包括IL2和/或IL7或其片段。在各种实施方案中，生长刺激分子可以连接至共价修饰的珠。
B.用于激活T淋巴细胞的试剂盒
还提供了用于激活T淋巴细胞的试剂盒，其包括如本文所述的抗原呈递合成表面。该试剂盒还可以包含生长刺激分子，其中每种生长刺激分子均可以包括生长因子受体配体。生长刺激分子可以作为游离分子提供，连接至抗原呈递合成表面(在与主激活分子配体在相同或不同的区域中)或者连接至不同的共价修饰的合成表面。例如，试剂盒还可以包含多个包含辅助刺激分子的共价修饰的珠。在一些实施方案中，生长因子受体配体分子可以包括细胞因子或其片段。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括IL-21。在其他实施方案中，试剂盒可以包括一个或多种另外的(例如第二或者第二和第三)生长刺激分子。在一些实施方案中，一种或多种另外的生长刺激分子可以包括IL-2和/或IL-7或其片段。另外的生长刺激分子可以作为游离分子提供、连接至抗原呈递合成表面(与主激活分子配体在相同或不同的区域中)或者连接至不同共价修饰的合成表面，例如珠。
XIII.微流体装置结构、加载和操作的其他方面；相关的系统
本文所述的微流体装置及其用途可以具有任何以下特征，并且可以与下文所述的系统结合使用。在各种实施方案中，分析区域可以包括本节中描述的一个或多个微流体装置。
A.加载方法
如本文所述，生物微物体或微物体(例如但不限于珠)的加载可以涉及使用流体流动、重力、介电泳(DEP)力、电润湿、磁力或其任何组合。DEP力可以光学地产生，例如通过光电镊子(OET)配置和/或通过电产生，例如通过以时间/空间模式激活电极/电极区域。相似地，电润湿力可以光学地提供，例如通过光电润湿(OEW)配置和/或通过电提供，例如通过以时间空间图案激活电极/电极区域。
B.微流体装置和用于操作和观察此类装置的系统
图1A示出了可以用于维持、分离、测定或培养生物微物体的微流体装置100和系统150的示例。微流体装置100的透视图被示出为切除其盖110的一部分以提供微流体装置100内的局部视图。微流体装置100大体上包括微流体回路120，该微流体回路包括流动路径106，流体介质180可以流经该流动路径，任选地将一个或多个微物体(未示出)携带到微流体回路120中和/或经过微流体回路120。尽管图1A中示出了单个微流体回路120，但是合适的微流体装置可以包括多个(例如2或3个)这样的微流体回路。无论如何，微流体装置100可以被配置成纳米流体装置。如图1A所示，微流体回路120可以包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个隔离坞均可以具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。在图1A的装置的一些实施方案中，隔离坞可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构，即使当介质180流过流动路径106时也是如此。然而，在转向前述内容之前，提供对微流体装置100和系统150的简要描述。
如图1A中大体上所示，微流体回路120由外壳102限定。尽管外壳102可以以不同配置物理地构造，但在图1A中所示的示例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如底座)、微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以设置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以设置在微流体回路结构108上方。微流体回路结构108可以与支撑结构104和盖110一起限定微流体回路120的元件。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体回路120的底部，盖110可以位于其顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他定向配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，盖110可以位于其底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口均包括进入或离开外壳102的通道。通道的示例包括阀、闸门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件例如盖110中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体回路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体回路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底均电连接到电极(例如，所有半导体衬底或半导体衬底的子集可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板套件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这样的回路元件可以包括当微流体回路120填充有流体时可以流体地互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者可以是一个或多个流动通道)、室、坞、捕获器(trap)等。在图1A中所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。框架114可以是例如基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体回路材料116可以被图案化为具有空腔等，以限定微流体回路120的回路元件和互连。微流体回路材料116可以包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如，橡胶、塑料、弹性体、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可以组成微流体回路材料116的材料的其他示例包括模制玻璃、诸如聚硅氧烷的可蚀刻材料(例如，可光图案化的聚硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如SU8)等。在一些实施方案中，这样的材料(并且因此微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体回路材料116可以设置在支撑结构104上和框架114内部。
盖110可以是框架114和/或微流体回路材料116的整合部件。或者，如图1A所示，盖110可以是结构上不同的元件。盖110可以包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体回路材料116分开的结构，如图所示，或者是框架114或微流体回路材料116的整合部件。同样，框架114和微流体回路材料116可以是如图1A所示的单独结构，或相同结构的整合部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，定位在隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料接合的可变形材料。在一些实施方案中，盖110还可以包括一个或多个电极。一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，一个或多个电极可以是柔性电极，例如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合，其嵌入在诸如聚合物(例如PDMS)的可变形材料中。例如，在U.S.2012/0325665(Chiou等人)中已经描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用整体合并在本文中。在一些实施方案中，盖110可以被修饰(例如，通过调节面向内朝向微流体回路120的表面的全部或部分)以支持细胞贴附、活力和/或生长。修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可以包括至少一种可透气的材料(例如PDMS或PPS)。
图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置(并入在成像模块164内，并且在图1A中未明确示出)和倾斜装置(倾斜模块166的一部分，并且在图1A中未明确示出)。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置194(如下所述的成像模块164的一部分)可以包括用于捕获微流体回路120内部的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194还包括具有快帧速率和/或高灵敏度(例如用于弱光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激辐射和/或光束引导到微流体回路120中并收集从微流体回路120(或包含在其中的微型物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。发射的光束可以在可见光谱中并且可以例如包括荧光发射。反射的光束可以包括源自LED或宽谱灯(例如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯)的反射发射。如关于图3B所讨论的，成像装置194还可以包括显微镜(或光学系统)，其可以包括或不包括目镜。
系统150还包括倾斜装置190(如下所述的倾斜模块166的一部分)，其被配置成围绕一个或多个旋转轴旋转微流体装置100。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置成围绕至少一个轴支撑和/或保持包括微流体回路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体回路120)可以保持在水平方向(即，相对于x轴和y轴成0°)、垂直方向(即，相对于x轴和/或y轴成90°)或其间的任何方向。微流体装置100(和微流体回路120)相对于轴的方向在本文中被称为微流体装置100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平方向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力定义的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体回路120)相对于x轴和/或y轴倾斜大于90°的任何角度，或者使微流体装置100(和微流体回路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以便完全翻转微流体装置100(和微流体回路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体回路120)围绕由流动路径106或微流体回路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，微流体装置100被倾斜成垂直方向，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。本文在微流体装置的上下文中使用的术语“上方”表示流动路径106在由重力限定的垂直轴上位于高于一个或多个隔离坞的位置(即，流动路径106上方的隔离坞中的物体将具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。本文在微流体装置的上下文中使用的术语“下方”表示流动路径106在由重力限定的垂直轴上位于低于一个或多个隔离坞的位置(即，流动路径106下方的隔离坞中的物体将具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜到小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，但不直接位于隔离坞的上方或下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。
系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如容器、储存器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是位于微流体装置100外部且与微流体装置100分离的装置，如图1A所示。或者，介质源178可以全部或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的储存器。
图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的示例的简化框图。如图所示，这种控制和监测设备152的示例包括主控制器154，其包括用于控制介质源178的介质模块160、用于控制微流体回路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如介质液滴)的移动和/或选择的运动模块162、用于控制成像装置194(例如照相机、显微镜、光源或其任何组合)用于捕获图像(例如数字图像)的成像模块164和用于控制倾斜装置190的倾斜模块166。控制设备152还可以包括用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能的其他模块168。如图所示，设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，其被配置成根据作为非暂时性数据或信号存储在存储器158中的机器可执行指令(例如软件、固件、源代码等)进行操作。或者或此外，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以被类似地配置。因此，本文讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体装置执行的功能、过程动作、动作或过程步骤可以由上文所讨论配置的主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任何一个或多个来执行。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地偶联以发送和接收在本文所讨论的任何功能、过程、行为、动作或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102去除介质(例如通过出口端口(未示出))。因此，一种或多种介质可以选择性地输入到微流体回路120中以及从微流体回路120中移出。介质模块160还可以控制微流体回路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166导致倾斜装置190将微流体装置100倾斜至期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中并通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置成控制微流体回路120中的微物体(未示出)的选择、捕获和移动。如下文针对图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电泳(DEP)、光电子镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如光电晶体管)的激活以选择和移动流动路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收并处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕获的任何类型的信息(例如，微物体、介质液滴的存在或不存在，标记物如荧光标记物的积累等)。使用由成像装置194捕获的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内的物体(例如微物体、介质液滴)的位置和/或此类物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。或者或此外，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时间以优化微物体经由重力到一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地偶联，以接收描述微流体回路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体回路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体回路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微物体和/或介质液滴在微流体回路120中的位置。
在图1A所示的示例中，微流体回路120被示出为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是以其他方式被封闭，使得坞可以基本上将坞内部的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体隔离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面以提供外壳。坞通向微流体通道122的开口与流体介质180的流106成一定角度定向，使得流106不被引导到坞中。流可以与坞的开口的平面相切或正交。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地围拢微流体回路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，这些形状、表面和特征被优化以与DEP、OET、OEW、流体流和/或重力一起使用，如将在下面详细讨论和示出的。
微流体回路120可包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体回路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体回路120的微流体隔离坞124、126、128和130分别包括不同的特征和形状，其可以提供对于维持、隔离、测定或培养生物微物体有用的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔离坞。
在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以包含多个通道122，每个通道均被配置成包括流动路径106。微流体回路120还包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置成Z字形图案，由此流动路径106以交替方向行进穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体回路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿向前方向或反向方向中的至少一个流动。在一些情况下，多个隔离坞被配置(例如相对于通道122)使得隔离坞可以并行地加载有目标微物体。
在一些实施方案中，微流体回路120还包括一个或多个微物体捕获器132。捕获器132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以定位成与一个或多个微流体隔离坞124、126、128、130的开口相对。在一些实施方案中，捕获器132被配置成接收或捕获来自流动路径106的单个微物体。在一些实施方案中，捕获器132被配置成接收或捕获多个来自流动路径106的微物体。在一些情况下，捕获器132包括约等于单个目标微物体的体积的体积。
捕获器132还可以包括开口，该开口被配置成帮助目标微物体流入捕获器132。在一些情况下，捕获器132包括高度和宽度大约等于单个目标微物体的大小的开口，由此防止较大的微物体进入微物体捕获器。捕获器132还可以包括被配置成帮助将目标微物体保留在捕获器132内的其他特征。在一些情况下，捕获器132与微流体隔离坞的开口对齐，并且相对于微流体隔离坞的开口位于通道122的相对侧上，使得当围绕平行于微流体通道122的轴倾斜微流体装置100时，捕获的微物体以导致微物体落入隔离坞的开口的轨迹离开捕获器132。在一些情况下，捕获器132包括小于目标微物体的侧通道134，以便促进流过捕获器132并由此增加在捕获器132捕获微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)在流体介质180上(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)施加介电泳(DEP)力，以操纵、输送、分离和分选位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，DEP力被施加到微流体回路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中转移。此外，在一些实施方案中，使用DEP力选择性地从隔离坞中去除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，帮助限定流动路径和/或隔离坞的位置)来操纵、输送、分离和分选位于微流体回路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，OEW力被施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以便将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中转移。此外，在一些实施方案中，使用OEW力选择性地从隔离坞中去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。
在一些实施方案中，DEP和/或OEW力与其他力(例如流动力和/或重力)组合，以便操纵、输送、分离和分选微流体回路120内的微物体和/或液滴。例如，外壳102可以倾斜(例如，通过倾斜装置190)以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞上方，并且重力可以将微物体和/或液滴输送到坞中。在一些实施方案中，可以在其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，DEP和/或OEW力可以与其他力同时施加或者与其他力以交替的方式施加。
图1B、1C和2A-2H示出了可以在本公开的实施方案的实践中使用的微流体装置的各种实施方案。图1B描绘了其中微流体装置200被配置成光驱动动电装置的实施方案。多种光致动动电装置是本领域已知的，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。合适的OET配置的示例在以下美国专利文献中示出，每篇专利文献的全部内容通过引用并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等)(最初颁布为美国专利号7,612,355)；和美国专利号7,956,339(Ohta等)。OEW配置的示例在美国专利号6,958,132(Chiou等)和美国专利申请公开号2012/0024708(Chiou等)中示出，二者均通过引用整体并入本文。光致动动电装置的又一示例包括组合的OET/OEW配置，其示例在美国专利公开号20150306598(Khandros等)和20150306599(Khandros等)及其相应的PCT公开WO2015/164846和WO2015/164847中示出，所有这些均通过引用整体并入本文。
具有可以在其中放置、培养和/或监测生物微物体的坞的微流体装置的示例已被描述在例如US2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、US2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和US2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中，其中每一篇均通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447还描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌物的示例性方法。前述申请中的每一篇还描述了被配置成产生介电泳(DEP)力(例如光电镊子(OET))或被配置成提供光电润湿(OEW)的微流体装置。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中利用来选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的示例。
C.微流体装置运动配置
如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括用于选择和移动微流体装置的微流体回路中的物体(例如微物体或液滴)的运动模块。微流体装置可以具有多种运动配置，这取决于被移动的物体的类型和其他考虑因素。例如，介电电泳(DEP)配置可用于选择和移动微流体回路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上诱发DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体的组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的液滴上诱发EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴的组。
包括DEP配置的微流体装置200的一个示例在图1B和1C中示出。虽然为了简单起见，图1B和1C分别示出了具有区域/室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面视图和顶部截面视图，但是应当理解，区域/室202可以是具有更详细结构(例如生长室、隔离坞、流动区域或流动通道)的流体回路元件的一部分。此外，微流体装置200可以包括其他流体回路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100描述的那些。DEP配置可以被并入到微流体装置200的任何此类流体回路元件或其所选部分中。还应当理解的是，任何上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件可以被并入到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，如上所述的包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如在图1B中所见，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极激活衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，其中顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极激活衬底206限定区域/室202的相对表面。因此，包含在区域/室202中的介质180在顶部电极210和电极激活衬底206之间提供电阻连接。还示出了被配置成连接到底部电极204和顶部电极210并在电极之间产生偏置电压的电源212，如在区域/室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可以具有光致动的DEP配置。因此，可以由运动模块162控制的来自光源216的光218的改变图案可以选择性地激活和去活电极激活衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的改变图案。(具有DEP配置的微流体装置的区域214在下文中被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，被引导到电极激活衬底206的内表面208上的光图案218可以以图案例如正方形的方式照亮选择的DEP电极区域214a(以白色显示)。未照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)在下文中被称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极激活衬底206(即，从底部电极204向上到与流动区域106中的介质180接合的电极激活衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/室202中的介质180(即，从电极激活衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极激活衬底206的减小的相对阻抗，该阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/室202中的介质180的相对阻抗。
当电源212被激活时，前述DEP配置在被照亮的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这进而产生吸引或排斥流体介质180中附近的微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，吸引或排斥流体介质180中的微物体的DEP电极可以在区域/室202的内表面208处的许多不同的这种DEP电极区域214处被选择性地激活和去活。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电性质等参数。
图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的正方形图案220仅是一个示例。DEP电极区域214的任何图案都可以被投射到微流体装置200中的光218的图案照亮(并从而激活)，并且可以通过改变或移动光图案218来重复改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极激活衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在此类实施方案中，电极激活衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极激活衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(计算为100*氢原子的数目/氢和硅原子的总数)。a-Si:H的层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，DEP电极区域214可以在电极激活衬底206的内表面208上的任何地方并且以任何图案形成。因此，DEP电极区域214的数目和图案不需要是固定的，但可以对应于光图案218。具有包括如上所述的光电导层的DEP配置的微流体装置的示例已经在例如美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，电极激活衬底206可以包括衬底，该衬底包括形成半导体集成电路的多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和导电层，例如半导体领域中已知的。例如，电极激活衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管对应于DEP电极区域214。或者，电极激活衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，每个这样的电极对应于DEP电极区域214。电极激活衬底206可以包括这样的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列，如图2B中所示。或者，图案可以是形成六边形晶格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电回路元件都可以在电极激活衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且那些电连接(即光电晶体管或电极)可以由光图案218选择性地激活和去活。当不激活时，每个电连接可以具有高阻抗，使得通过电极激活衬底206(即，从底部电极204到与区域/室202中的介质180结合的电极激活衬底206的内表面208)的相对阻抗大于在相应的DEP电极区域214处通过介质180(即，从电极激活衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极激活衬底206的相对阻抗小于通过每个被照亮的DEP电极区域214处的介质180的相对阻抗，从而如上所述地激活对应的DEP电极区域214处的DEP电极。因此，吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极可以在区域/室202中的电极激活衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处以由光图案218所确定的方式被选择性地激活和去活。
在例如美国专利号7,956,339(Ohta等)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极激活衬底的微流体装置的示例(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等)中已经描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极激活衬底的微流体装置的示例(参见例如整个附图中示出的装置200、400、500、600和900及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极激活衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极激活衬底206和/或电极210中的一个或两者是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP配置的图1B-1C的微流体装置200，运动模块162可以通过将光图案218投射到微流体装置200中以围绕并捕获微型物体的图案(例如正方形图案220)激活电极激活衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极来选择区域/室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，运动模块162可以通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极来移动原位生成的捕获的微物体。或者，微流体装置200可以相对于光图案218被移动。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极激活衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置，例如，电极激活衬底206可以包括选择性地可寻址和可通电的电极，其被定位成与包括至少一个电极的表面(例如盖110)相对。开关(例如半导体衬底中的晶体管开关)可以被选择性地打开和关闭，以激活或去活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。根据诸如电源212的频率和区域/室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质等特性，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，区域/室202中的一个或多个微物体可以被捕获并在区域/室202中移动。图1A中的运动模块162可以控制这样的开关，从而激活和去活各个DEP电极，以选择、捕获和移动区域/室202周围的特定微物体(未示出)。包括选择性可寻址和可通电的电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的并且已经描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置或者可以位于微流体装置200的与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或介质上电润湿(EWOD)配置，这两种配置都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极激活衬底206。如下文所述，介电层可以包括疏水性材料和/或可以涂覆有疏水性材料。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水性涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一层或多层氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如氧化铝或氧化铪)。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kOhm至约50k Ohm的阻抗。
在一些实施方案中，向内面向区域/室202的介电层的表面涂覆有疏水性材料。疏水性材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的示例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如CYTOPTM)。构成疏水性材料的分子可以共价键合至介电层的表面。例如，疏水性材料的分子可以通过诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的接头共价键合至介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水性材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水性材料可以包含氟烷基封端的硅氧烷、氟烷基封端的膦酸或氟烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水性涂层具有约10nm至约50nm的厚度。在其他实施方案中，疏水性涂层具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水性材料(未示出)。疏水性材料可以是与用于涂覆支撑结构104的介电层的疏水性材料相同的疏水性材料，并且疏水性涂层的厚度可以与支撑结构104的介电层上的疏水性涂层的厚度基本上相同。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极激活衬底206。电极激活衬底206和盖110的介电层可以与电极激活衬底206和支撑结构104的介电层具有相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极激活衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述。因此，在某些实施方案中，电极激活衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)的层或由其组成。a-Si:H可以包括例如约8％至40％的氢(计算为100*氢原子的数目/氢和硅原子的总数)。a-Si:H的层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极激活衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置是本领域已知的和/或可以用本领域已知的电极激活衬底来构造。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极激活衬底。
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极激活衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极激活衬底206的如此激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖的介电层或其疏水性涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极激活衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，接触支撑结构104的内表面208的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)可以移动通过区域/室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极激活衬底206可以包括不依靠光来激活的选择性可寻址和可通电的电极。因此，电极激活衬底206可以包括这种电润湿(EW)电极的图案。例如，如图2B中所示，该图案可以是布置成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列。或者，该图案可以是形成六边形点阵的基本上六边形的EW电极的阵列。无论图案如何，EW电极都可以被电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去活)。通过选择性地激活和去活电极激活衬底206中的EW电极，与覆盖介电层或其疏水性涂层的内表面208接触的液滴(未示出)可以在区域/室202内被移动。图1A中的运动模块162可以控制这样的开关，从而激活和去活单独的EW电极，以选择和移动区域/室202周围的特定液滴。具有带有选择性可寻址和可通电电极的EWOD配置的微流体装置是本领域已知的，并且已经被描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，都可以使用电源212提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中提及的电源192或其组件相同。电源212可以被配置成向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)的频率范围和平均或峰值功率(例如电压或电流)范围，以如上所述地捕获和移动区域/室202中的单独的微物体(未示出)，和/或也如上所述地改变区域/室202中的支撑结构104的内表面208(即介电层和/或介电层上的疏水性涂层)的润湿特性。这样的频率范围和平均或峰值功率范围是本领域已知的。参见例如美国专利号6,958,132(Chiou等)、美国专利号RE44,711(Wu等)(最初颁布为美国专利号7,612,355)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等)、US2015/0306598(Khandros等)和US2015/0306599(Khandros等)。
D.隔离坞
通用隔离坞224、226和228的非限制性示例示出在图2A-2C中描绘的微流体装置230内。每个隔离坞224、226和228可以包括限定隔离区域240的隔离结构232和将隔离区域240流体连接至通道122的连接区域236。连接区域236可以包括至微流体通道122的近端开口234和至隔离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置成使得从微流体通道122流入隔离坞224、226、228的流体介质(未示出)流的最大穿透深度不延伸到隔离区域240中。因此，归因于连接区域236，设置在隔离坞224、226、228的隔离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以因此与微流体通道122中的介质流180隔离并且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔离坞224、226和228各自具有直接向微流体通道122开放的单个开口。隔离坞的开口从微流体通道122的侧向开放。电极激活衬底206位于微流体通道122和隔离坞224、226和228两者的下方。隔离坞的外壳内的电极激活衬底206的上表面形成隔离坞的底板，其设置在与形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板的微流体通道122(或者如果不存在通道则为流动区域)内的电极激活衬底206的上表面相同的水平或基本相同的水平处。电极激活衬底206可以是无特征的或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高高度到其最低凹陷的变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动区域)和隔离坞这两者的衬底上表面中的高度变化可以小于隔离坞的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然针对微流体装置200进行了详细描述，但这也适用于本文所述的任何微流体装置100、230、250、280、290。
因此，微流体通道122可以是扫过区域的示例，而隔离坞224、226、228的隔离区域240可以是未扫过区域的示例。如所注意到的，微流体通道122和隔离坞224、226、228可以被配置成含有一种或多种流体介质180。在图2A-2B所示的示例中，端口222连接至微流体通道122并允许流体介质180被引入到微流体装置230中或从其中去除。在引入流体介质180之前，可以用诸如二氧化碳气体的气体预填充微流体装置。一旦微流体装置230含有流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流动242。例如，如图所示，端口222可以被设置在微流体通道122的不同位置(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一端口222产生介质流242。
图2C示出了根据本公开的隔离坞224的示例的详细视图。还示出了微物体246的示例。
如已知的，微流体通道122中的流体介质180经过隔离坞224的近端开口234的流动242可以导致介质180的二次流动244流入和/或流出隔离坞224。为了将隔离坞224的隔离区域240中的微物体246与二次流动244隔离，隔离坞224的连接区域236的长度Lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应大于二次流动244进入连接区域236的穿透深度Dp。二级流动244的穿透深度Dp取决于在微流体通道122中流动的流体介质180的速度以及与微流体通道122和连接区域236向微流体通道122的近端开口234的设置相关的各种参数。对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的设置将是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流速242将是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别通道122中的流体介质180的流动242的最大速度Vmax，其确保二次流动244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。只要微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流动244就可以被限制到微流体通道122和连接区域236并且保持在隔离区域240之外。因此，微流体通道122中的介质180的流动242将不会将微物体246从隔离区域240中抽出。相反，位于隔离区域240中的微物体246将保留在隔离区域240中，而不管微流体通道122中的流体介质180的流动242如何。
此外，只要微流体通道122中的介质180的流动242的速率不超过Vmax，微流体通道122中的流体介质180的流动242就不会将各种颗粒(例如微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122中移动到隔离坞224的隔离区域240中。因此，使连接区域236的长度Lcon大于二次流动244的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离坞224被来自微流体通道122或另一隔离坞(例如图2B中的隔离坞226、228)的各种颗粒污染。
因为微流体通道122和隔离坞224、226、228的连接区域236会受到微流体通道122中介质180的流动242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫过(或流动)的区域。另一方面，隔离坞224、226、228的隔离区域240可以被认为是未扫过(或非流动)的区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入隔离区域240中的第二流体介质248而与隔离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，隔离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的成分从隔离区域240扩散通过连接区域236进入微流体通道122中的第一介质180而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，通过扩散进行的隔离坞的隔离区域和流动区域之间的流体介质交换的程度大于流体交换的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始是相同的，然后变得不同(例如，通过用隔离区域240中的一个或多个细胞调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。
如上文所述，由微流体通道122中的流体介质180的流动242引起的二次流动244的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的示例包括：微流体通道122的形状(例如，微流体通道可以将介质引导到连接区域236中、将介质转移离开连接区域236、或者将介质以基本上垂直于连接区域236的近端开口234的方向引导至微流体通道122)；微流体通道122在近端开口234处的宽度Wch(或横截面积)；以及连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon(或横截面积)；微流体通道122中的流体介质180的流动242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度等。
在一些实施方案中，微流体通道122和隔离坞224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流动242的矢量如下定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流动242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流动242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于微流体通道122中介质180的流动242。前述仅是示例，并且微流体通道122和隔离坞224、226、228的相对位置相对于彼此可以处于其他方向。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以是本文中对于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所确定的任何值。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。
如图2C所示，隔离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。因此，隔离区域240在远端开口238处的宽度可以是本文针对连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所确定的任何值。或者，隔离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度Wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，连接区域236可以使用各种不同的几何形状(例如，对连接区域进行削角、对连接区域进行斜切)在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域的邻近近端开口234的部分)。
图2D-2F描绘了含有微流体回路262和流动通道264的微流体装置250的另一个示例性实施方案，其是图1A的相应微流体装置100、回路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离坞266，其是上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228的另外变体。特别地，应当理解的是，图2D-2F中所示的装置250的隔离坞266可以替代装置100、200、230、280、290中的任何上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228。同样，微流体装置250是微流体装置100的另一种变体，并且可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290相同或不同的DEP配置以及本文所述的任何其他微流体系统组件。
图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中描绘的装置100的支撑结构104相同或大体上相似)、微流体回路结构256以及盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中描绘的装置100的盖122相同或大体上相似)。微流体回路结构256包括框架252和微流体回路材料260，其可以与图1A所示的装置100的框架114和微流体回路材料116相同或大体上相似。如图2D所示，由微流体回路材料260限定的微流体回路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多)，多个隔离坞266与该多个通道264流体地连接。
每个隔离坞266可以包括隔离结构272、隔离结构272内的隔离区域270以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到隔离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至隔离区域270。通常，根据对图2B和图2C的上述讨论，通道264中的第一流体介质254的流动278可以产生第一介质254从微流体通道264进入和/或离开隔离坞266的相应连接区域268的二次流动282。
如图2E所示，每个隔离坞266的连接区域268通常包括在通往通道264的近端开口274和通往隔离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度Lcon可以大于二次流动282的最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流动282将延伸到连接区域268中而不被重定向朝向隔离区270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268的长度Lcon可以小于最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流动282将延伸通过连接区域268并且被重新导向朝向隔离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度Lc1和Lc2之和大于最大穿透深度Dp，使得二次流动282不会延伸到隔离区域270中。无论连接区域268的长度Lcon是否大于穿透深度Dp，或者连接区域268的长度Lc1和Lc2之和是否大于穿透深度Dp，第一介质254在通道264中不超过最大速度Vmax的流动278都将产生具有穿透深度Dp的二次流动，并且隔离坞266的隔离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C所示的微物体246相同或大体上相似)将不会被通道264中的第一介质254的流动278从隔离区域270中抽出。通道264中的流动278也不会将各种材料(未示出)从通道264抽到隔离坞266的隔离区域270中。因此，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264中移动到隔离坞266的隔离区域270中的第二介质258中的唯一机制。同样，扩散是隔离坞266的隔离区域270中的第二介质258中的组分可以从隔离区域270中移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以一开始是相同的，然后变得不同，例如通过用隔离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。
如图2E所示，微流体通道264中微流体通道264的宽度Wch(即，横向于图2D中箭头278所示的流体介质流过微流体通道的方向)可以基本上垂直于近端开口274的宽度Wcon1，并因此基本上平行于远端开口276的宽度Wcon2。然而，近端开口274的宽度Wcon1和远端开口276的宽度Wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度Wcon1所定向的轴(未示出)与远端开口276的宽度Wcon2所定向的另一轴之间的角度可以不是垂直的，因此不是90°。可选的取向角度的示例包括以下角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。
在隔离坞(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，隔离区域(例如，240或270)被配置成包含多个微物体。在其他实施方案中，隔离区域可以被配置成仅包含一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对少数目的微物体。因此，隔离区域的体积可以是例如至少1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如122)在近端开口(例如234)处的宽度Wch可以是约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米或100-120微米。在一些其他实施方案中，微流体通道(例如122)在近端开口(例如234)处的宽度Wch可以是约200-800微米、200-700微米或200-600微米。前述仅是示例，并且微流体通道122的宽度Wch可以是上面列出的任何端点内的任何宽度。此外，微流体通道122的Wch可以被选择为在除了隔离坞的近端开口之外的微流体通道的区域中的这些宽度中的任何宽度内。
在一些实施方案中，隔离坞的宽度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约1×104–3×106平方微米、2×104–2×106平方微米、4×104–1×106平方微米、2×104–5×105平方微米、2×104–1×105平方微米或约2×105–2×106平方微米。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如122)在近端开口(例如234)处的高度Hch可以是在以下任何高度内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅是示例，并且微流体通道(例如122)的高度Hch可以是在上面列出的任何端点内的高度。微流体通道122的高度Hch可以被选择为在除了隔离坞的近端开口处之外的微流体通道的区域中的这些高度中的任何高度内。
在隔离坞的各种实施方案中，微流体通道(例如122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以是约500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅是示例，并且微流体通道(例如122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以是上面列出的任何端点内的任何面积。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如236)的长度Lcon可以是约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。前述仅是示例，并且连接区域(例如236)的长度Lcon可以是上面列出的任何端点内的任何长度。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如236)在近端开口(例如234)处的宽度Wcon可以是约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米或80-100微米。前述仅是示例，并且连接区域(例如236)在近端开口(例如234)处的宽度Wcon可以不同于前述示例(例如，上面列出的任何端点内的任何值)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如236)在近端开口(例如234)处的宽度Wcon可以至少与隔离坞期望用于的微物体(例如生物细胞，其可以是T细胞或B细胞)的最大尺寸一样大。前述仅是示例，并且连接区域(例如236)在近端开口(例如234)处的宽度Wcon可以不同于前述示例(例如上面列出的任何端点内的宽度)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域的近端开口的宽度Wpr可以至少与隔离坞期望用于的微物体(例如生物微物体，例如细胞)的最大尺寸一样大。例如，宽度Wpr可以是约50微米、约60微米、约100微米、约200微米、约300微米，或者可以是约50-300微米、约50-200微米、约50-100微米、约75-150微米、约75-100微米或约200-300微米。
在隔离坞的各种实施方案中，在近端开口234处的连接区域(例如236)的长度Lcon与连接区域(例如236)的宽度Wcon的比率可以大于或等于以下比率中的任一个：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。前述仅是示例，并且在近端开口234处的连接区域236的长度Lcon与连接区域236的宽度Wcon的比率可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、23、250、280、290的各种实施方案中，Vmax可以被设定在大约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14或15微升/秒。
在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的隔离区域(例如240)的体积可以是例如至少5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、1×107、5×107、1×108、5×108或8×108立方微米或更大。在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约5×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107、3×107、5×107或约8×107立方微米或更大。在一些其他实施方案中，隔离坞的体积可以是约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文讨论的任何实施方案中配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞、约1000至约3500个隔离坞、约2700至约7000个隔离坞、约5000至约10,000个隔离坞、约9,000至约15,000个隔离坞或约12,000至约20,000个隔离坞。隔离坞不需要全部具有相同的大小并且可以包括多种配置(例如，不同的宽度、隔离坞内的不同特征)。
图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G所示的微流体装置280是微流体装置100的程式化图。在实践中，微流体装置280及其组成回路元件(例如通道122和隔离坞128)将具有本文讨论的尺寸。图2G所示的微流体回路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280还包括从每个通道122开口的多个隔离坞。在图2G所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和隔离区域二者。因此，微流体回路120包括扫过区域(例如，在二次流动244的最大穿透深度Dp内的通道122和连接区域236的部分)和非扫过区域(例如，不在二次流动244的最大穿透深度Dp内的隔离区域240和连接区域236的部分)二者。
图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括设置成保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置的结构(“巢”)300。巢300可以包括插座302，该插座302能够与微流体装置320(例如，光致动动电装置100)接合并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置成向插座302提供偏置电压，使得当微流体装置320被插座302保持时，该偏置电压被施加到微流体装置320中的一对电极上。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。向微流体装置320施加偏置电压的能力并不意味着当微流体装置320由插座302保持时将始终施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏置电压，例如，仅在需要时施加，以促进在微流体装置320中生成电动力，例如介电泳或电润湿。
如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板套件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以安装在PCBA 322上并且电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 322上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置成放大从波形发生器接收的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果存在的话)可以被配置成测量提供给由插座302保持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器测量靠近微流体装置320(并且远离波形发生器)的位置处的波形，从而确保以更高的精度测量实际施加到装置的波形。从示波器测量获得的数据可以例如作为反馈提供给波形发生器，并且波形发生器可以被配置成基于这样的反馈来调节其输出。合适的组合的波形发生器和示波器的一个示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300还包括控制器308，例如用于感测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的示例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。可以使用控制器308来执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过接口310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，该电信号生成子系统304包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路放大由Red Pitaya单元生成的波形并将放大的电压传递至微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置成测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得在微流体装置320处测量的电压是期望的值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V功率供应，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3A所示，支撑结构300(例如巢)还可以包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置成调节由支撑结构300保持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置成与微流体装置320的至少一个表面接合的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液冷铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相反的表面)可以被配置成与这种冷却块的表面接合。冷却块可以连接至流体路径314，该流体路径314被配置成使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部储存器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314中并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部储存器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以安装在支撑结构300的外壳312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置成调节Peltier热电装置的温度，以便实现微流体装置320的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电功率供应(例如PololuTM热电功率供应(Pololu Robotics and Electronics Corp.)来实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是模拟分压器电路(未示出)，其包括电阻器(例如，电阻为1kOhm+/-0.1％，温度系数为+/-0.02ppm/C0)和NTC热敏电阻(例如，标称电阻为1kOhm+/-0.01％)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为板载PID控制回路算法的输入。来自PID控制回路算法的输出可以驱动例如PololuTM电机驱动器(未示出)上的定向信号引脚和脉冲宽度调变信号引脚以启动热电功率供应，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由接口310(未示出)与外部主控制器154通信。此外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、接口310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154通信。以这种方式，主控制器154尤其可以通过执行用于输出电压调节的缩放计算来辅助电信号生成子系统304。经由偶联到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置成分别绘制从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。或者或此外，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜器件(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，它们中的任一个都可以被配置成接收来自光源332的光并将接收到的光的子集传输到显微镜350的光学系统332中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自己的光的装置(并且因此省去对光源332的需要)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅上液晶(LCOS)器件、硅基铁电液晶器件(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。
在某些实施方案中，成像装置194还包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置成安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置成安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成组件。
在某些实施方案中，显微镜350还可以包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷偶联器件(CCD)、相机(例如数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快帧速率相机，而另一检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光学系统，该光学系统被配置成接收从微流体装置320反射和/或发射的光并且将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦在一个或多个检测器348上。显微镜的光学系统还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大倍数可以不同。
在某些实施方案中，成像装置194被配置成使用至少两个光源。例如，第一光源332可用于产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且第二光源334可用于提供非结构光。第一光源332可以产生用于光致动电运动和/或荧光激发的结构光，并且第二光源334可以用于提供明场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光学系统可以被配置成(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当装置由巢300保持时，将结构光聚焦在微流体装置(例如光致动动电装置)中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光学系统还可以被配置成接收来自第二光源的非结构光，并当装置由巢300保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一区域和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源334可以附加地或替代地包括激光器，其可以具有任何合适的光波长。图3B中所示的光学系统的图示仅是示意图，并且光学系统可以包括另外的滤光器、陷波滤光器、透镜等。当第二光源334包括用于明场和/或荧光激发以及激光照明的一个或多个光源时，光源的物理布置可以与图3B中所示的不同，并且激光照明可以在光学系统内的任何合适的物理位置引入。光源334和光源332/光调制子系统330的示意性位置也可以互换。
在图3B中，显示第一光源332向光调制子系统330供应光，该光调制子系统330向系统355(未示出)的显微镜350的光学系统提供结构光。显示第二光源334经由分束器336向光学系统提供非结构光。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336行进通过光学系统以到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此处通过物镜336向下反射到样品平面342。从样品平面342反射和/或发射的光然后向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并且到达二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光只有一部分穿过并到达检测器348。
在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但是不穿过二向色滤光器346。在该示例中，二向色滤光器346滤除具有长于495nm的波长的可见光。仅当从光调制子系统发射的光不包括任何短于495nm的波长时，这种对来自光调制子系统330的光的滤除才会完成(如图所示)。在实践中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光将穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332明显强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
E.涂覆溶液和涂覆剂
不希望受理论限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已被调节或涂覆以呈现一层有机和/或亲水性分子(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进生物微物体(例如生物细胞)在微流体装置(例如DEP配置和/或EW配置的微流体装置)内的保持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可携带性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极激活衬底的内表面、微流体装置的盖和/或电路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或修饰以产生所需的有机和/或亲水性分子层。
涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包括一种或多种涂覆剂的流体介质中被输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入微流体装置中之前，将微流体装置(例如DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“涂底漆”。
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂覆材料，该涂覆材料提供一层适合于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水性分子(例如，提供经调节的表面，如下面所描述的)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂覆材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如通道)、室或隔离坞或其组合的表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个用涂覆材料涂覆的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个均具有至少一个用涂覆材料涂覆的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂覆材料。
F.涂覆剂/溶液
可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。
G.基于聚合物的涂覆材料
至少一个内表面可以包括含有聚合物的涂覆材料。聚合物可以共价或非共价结合(或者可以非特异性贴附)至至少一个表面。聚合物可以具有多种结构基序，例如在嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中发现的，所有这些都可以适合于本文公开的方法。
聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。多种含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两亲性非离子嵌段共聚物，其包括不同比例和在聚合物链内位置的聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)亚单元的嵌段。聚合物(BASF)是这种类型的嵌段共聚物，并且本领域已知其适合在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw可以在约2000Da至约20KDa的范围内。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可具有大于约10(例如12-18)的亲水-亲油平衡值(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的具体/>聚合物包括/>L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或聚环氧乙烷(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG的Mw可以为约88Da、100Da、132Da、176Da、200Da、220Da、264Da、308Da、352Da、396Da、440Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、1500Da、2000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da，或者其Mw可以落在由前述值中的任何两个限定的范围内。
在其他实施方案中，涂覆材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸亚单元可以是含有烷基、烯基或芳族部分的亚单元。一个非限制性示例是聚乳酸(PLA)。在其他实施方案中，涂覆材料可以包括含有磷酸部分的聚合物，磷酸部分位于聚合物主链的末端或位于聚合物主链的侧链。在又一些实施方案中，涂覆材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸亚单元可以是含有烷基、烯基或芳族部分的亚单元。一个非限制性示例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。在另外的实施方案中，涂覆材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然聚胺聚合物或合成聚胺聚合物。天然聚胺的示例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在其他实施方案中，涂覆材料可以包括含有糖部分的聚合物。在非限制性示例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合形成可减少或防止微流体装置中的细胞贴附的材料。例如，大小约为3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂覆材料。
在其他实施方案中，涂覆材料可以包括含有核苷酸部分(即核酸)的聚合物，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸部分类似物，例如但不限于7-脱氮腺嘌呤、戊糖、膦酸甲酯或硫代磷酸部分。
在又一些实施方案中，涂覆材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其中任一种都可以包括肽、多肽或蛋白。在一个非限制性示例中，蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或作为涂覆剂的一种或多种其他类似的蛋白。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中存在的浓度为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或更多或其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中存在的浓度为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％或更多或其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂覆材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白以优化细胞贴附以促进细胞生长。可以包含在涂覆材料中的细胞基质蛋白可以包括但不限于胶原、弹性蛋白、含有RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂覆材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号物质。
在一些实施方案中，涂覆材料可以包括含有环氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中多于一种的聚合物。在其他实施方案中，聚合物调节的表面可以包括多于一种聚合物的混合物，每种聚合物具有环氧烷部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂覆材料中。
此外，在共价修饰的表面与涂覆剂结合使用的实施方案中，共价修饰的表面的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳中的流体介质(例如涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白的带电部分形成离子键)。图2H描绘了包括示例性共价修饰的表面298的微流体装置290的横截面视图。如图所示，共价修饰的表面298(示意性地示出)可以包括共价结合至微流体装置290的衬底286的内表面294和盖288的内表面292两者的密集堆积的分子的单层。共价修饰的表面298可以被设置在接近并且向内面向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上所述，包括用于限定微流体装置290内的回路元件和/或结构的微流体回路材料的表面(未示出)。在替代实施方案中，共价修饰的表面298可以被设置在微流体装置290的仅一个或一些内表面上。
在图2H示意性示出的实施方案中，共价修饰的表面298包括单层取代的硅氧烷分子，每个分子均通过甲硅烷氧基接头296共价键合至微流体装置290的内表面292、294。为了简单起见，示出了另外的氧化硅键连接至相邻的硅原子，但本发明不限于此。在一些实施方案中，表面修饰的配体298可以在其面向外壳的末端(即，表面修饰的配体298的单层的不结合到内表面292、294并且靠近外壳284的部分)包括本文所述的任何类型的非聚合分子(例如氟代烷基、含聚乙二醇的基团、含烷基的羧酸取代基)。虽然图2H被讨论为具有非聚合表面修饰配体，但聚合部分也可以是合适的表面接触部分和/或表面修饰配体，并且被并入到共价修饰的表面中，如本文所述。
在其他实施方案中，用于共价修饰微流体装置290的内表面292、294的表面修饰配体298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分或其任何组合。不希望受理论限制，通过在微流体回路120的外壳284的内表面处呈递阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，共价修饰的表面298的表面修饰配体可以与水分子形成强氢键，使得产生的水合水充当层(或“屏障”)，使生物微物体不能与非生物分子(例如衬底的硅和/或氧化硅)相互作用。
适当的涂覆处理和修饰的进一步细节可以在2016年4月22日提交的美国申请序列号15/135,707中找到，并且其全部内容通过引用并入。
H.用于维持微流体装置的隔离坞内的细胞活力的附加系统组件
为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的附加组件来提供有利于维持功能性细胞的环境条件。例如，此类附加组件可以提供营养物、细胞生长信号物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中去除废物。
XIV.实施例
实施例1.二氧化硅珠的共价修饰和功能化
1A.具有与链霉亲和素连接的共价PEG 3二硫化物生物素的二氧化硅珠。将球形二氧化硅珠(2.5微米，G biosciences目录号786-915，具有基本上简单的球形体积，例如，珠的表面积在通过关系式4πr2+/-不超过10％预测的范围内)分散在异丙醇中，然后干燥。将干燥的珠在氧等离子清洁器(Nordson Asymtek)中处理5分钟，使用100W功率、240mTorr压力和440sccm氧气流速。在真空反应器中，用在真空反应器底部的箔船中的(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷(300微升)，在真空反应器底部的单独箔船中的作为水反应物源的七水合硫酸镁(0.5g，Acros目录号10034-99-8)的存在下处理清洁的珠。然后使用真空泵将室抽至750mTorr，然后密封。将真空反应器放置在110℃加热的烘箱中24-48小时。这将共价修饰的表面引入到珠中，其中修饰的表面具有式I的叠氮化物功能化的结构：
在冷却至室温并将氩气引入到抽空的室中之后，将共价修饰的珠从反应器中取出。将具有用叠氮化物反应性部分功能化的共价修饰的表面的珠用丙酮、异丙醇淋洗，并在氮气流下干燥。将共价修饰的叠氮化物功能化的珠以1mg/20微升的浓度分散在二苄基环辛炔基(DBCO)S-S生物素修饰的PEG3(Broadpharm，目录号BP-22453)的5.7mM DMSO溶液中，然后在恒温混匀器中以90℃/2000RPM孵育18小时。将生物素修饰的珠在过量的DMSO中各洗涤3次，然后用PBS淋洗。将PBS中的生物素修饰的珠分散在含有约30微摩尔/700微升浓度的链霉亲和素的PBS溶液中。将反应混合物在恒温混匀器中以30℃/2000RPM摇动30分钟。在反应阶段结束时，将呈递链霉亲和素的共价修饰的珠在过量的PBS中洗涤3次。FTIR分析确定向表面添加了SAV(数据未显示)。如果需要从表面裂解，则含二硫化物的接头可能特别有用。二硫键易于被二硫苏糖醇裂解，其浓度被发现与T淋巴细胞活力相容(数据未显示)。
1B.用PEG5-羧酸表面封闭分子配体稀释的具有与链霉亲和素连接的共价PEG4生物素的二氧化硅珠。将如上面实施例1A中制备的具有式1的用叠氮化物反应性部分功能化的共价修饰的表面的珠用丙酮、异丙醇冲洗，并在氮气流下干燥。将共价修饰的叠氮化物功能化的珠以1mg/10微升的浓度分散在0.6mM二苄基环辛炔基(DBCO)修饰的PEG4-生物素(Broadpharm，目录号BP-22295)、5.4mM二苄基环辛炔基(DBCO)修饰的PEG5-羧酸(Broadpharm，目录号BP-22449)和100mM碘化钠的DMSO溶液中，然后在恒温混匀器中以30℃/1,000RPM孵育18小时。将生物素修饰的珠在过量的DMSO中各洗涤3次，然后用PBS淋洗。将PBS中的生物素修饰的珠分散在含有约10纳摩尔/1毫升浓度的链霉亲和素的PBS溶液中。将反应混合物在恒温混匀器中以30℃/1000RPM摇动30分钟。在反应期间结束时，将呈递链霉亲和素的共价修饰的珠在过量PBS中洗涤3次。FTIR分析确定向表面添加了SAV(数据未显示)。
实施例2.聚合物珠的抗原呈递表面的制备
将链霉亲和素功能化(共价偶联)的盘绕球形聚合物珠(例如，珠的实际表面积大于关系式表面积＝4πr2+/-不超过10％，DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D，珠储备为6.67e8/mL))递送(15微升；1e7个珠)至含有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL))；EDTA(1ml，终浓度2mM)；和BSA (5ml 5％，终浓度为0.1％)的1.5mL微量离心管中，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
将含有1.5微克生物素化单体MHC(HLA-A*02:01MART-1(MBL InternationalCorp.，目录号MR01008，ELAGIGILTV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到微量离心管中，并通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次将混合物用移液器上下吸取。将管脉冲离心并去除上清液，并将管放置在磁性架内以去除更多上清液而不去除珠。
将生物素化的抗CD28(Miltenyi Biotec，目录号130-100-144，22.5微升)在600微升洗涤缓冲液中的溶液添加到微量离心管中。通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。将珠在4℃下孵育30分钟，15分钟后再次通过移液器上下吸取而再悬浮。在孵育期结束时，将管短暂脉冲离心。放回到磁性架中并分离1分钟后，将缓冲溶液从功能化的珠上吸走。将MHC单体/抗CD28抗原呈递珠再悬浮于100微升缓冲洗涤液中，储存于4℃，无需进一步操作即可使用。1e7个直径为2.80微米的功能化的DynaBead具有约24e6平方微米的标称(球体的理想预测表面积)表面积，可用于与T淋巴细胞接触。然而，不一定能被T淋巴细胞接触到的此类聚合物珠的盘绕也在该方法中被功能化。总配体计数可能无法反映可用于接触和激活T淋巴细胞的数目。
MHC单体/抗CD28抗原呈递珠通过用Alexa Fluor 488缀合的兔抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二级抗体(Invitrogen目录号A-11059)和APC缀合的抗HLA-A2抗体(Biolegend目录号343307)染色进行表征，并通过流式细胞术进行表征。
实施例3.由抗原呈递珠激活CD8+T淋巴细胞与由树突细胞激活CD8+T淋巴细胞的比较
细胞：按照制造商针对EasySepTM人CD8阳性选择试剂盒II(来自StemCellTechnologies Canada Inc.的市售试剂盒(目录号17953))的使用说明，通过负选择在含有RPMI和10％胎牛血清(FBS)的培养基中从市售的PBMC中富集CD8+T淋巴细胞。
树突细胞：由自体PBMC产生。将自体PBMC(10-50e6)解冻到10mL预热的包括10％FBS的RPMI培养基中。通过以400xg离心5分钟沉淀细胞。将细胞再悬浮于RPMI中并计数。
根据制造商的说明，使用阴性珠分离(EasySepTM人单核细胞分离试剂盒，StemCellTechnologies，目录号19359)对细胞中的单核细胞进行富集。对所得单核细胞进行计数，得到约5％的产率，然后以每孔3mL 1.5-3e6个细胞铺板于含有17ng/mL IL-4和53ng/mL人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，ThermoFisher目录号PHC2013)的培养基(ThermoFisher目录号12055091)中。将细胞在37℃下总共孵育6天。在第2天和第4天，向每个孔中添加100微升饲养培养基(/>培养基加IL-4(167U/mL)和GM-CSF(540ng/mL))，并继续孵育。/>
第6天，向每个孔中添加0.5mL的成熟混合物。成熟混合物包含培养基中的10ng/mL TNF-α；2ng/mL IL-1B；1000U/mL IL-6、1000ng/mL PGE2；167U/mL IL-4和267U/mL GM-CSF。将细胞在37℃下再孵育24小时。然后从成熟培养基中收集成熟的DC，计数并准备进一步使用。DC通过染色来表征CD3(BD目录号344828)、DC-SIGN(CD209，Biolegend目录号330104)、CD14(Biolegend目录号325608)、CD86(BD目录号560359)、Fc Block(BioLegend目录号422302)和活力(BD目录号565388)；悬浮于FACS缓冲液中；并通过FACS流式细胞仪进行检查。
通过以2e6/mL的浓度在1％ HSA中铺板，并用抗原(MART1肽，Anaspec，定制合成，40微克/mL)和β2-微球蛋白(Sigma Aldrich目录号M4890，3微克/mL)脉冲，然后在搅动下培养4小时来制备呈递抗原的树突细胞。使用前，经脉冲的DC在FaxitronX射线细胞辐照器中辐照30分钟，目标剂量为50grey。
用于试剂添加的培养基和稀释剂：高级RPMI(ThermoFisher目录号12633020，500mL)；1x GlutaMAX(ThermoFisher目录号35050079，5mL)；10％人AB血清(zen-bio，目录号HSER-ABP 100mL，50mL)；和50nMβ-巯基乙醇(ThermoFisher目录号31350010，50nm储液，0.5mL，最终浓度50微摩尔)。
实验设置：对于每种激活物质，使用单个96孔组织培养处理板(VWR目录号10062-902)(孔板1(DC)；孔板2(抗原呈递珠))。将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到每个孔中。
在孔板1中的每个孔中以5e3添加经脉冲的DC，产生1:40比例的DC：CD8+T淋巴细胞。
将如实施例2中制备的呈递包括MART1和抗CD28抗体的pMHC的抗原呈递表面聚合物珠(2e5)添加到孔板2中的每个孔中。以1.5微克/1e7个珠加载pMHC。抗CD28抗体以三种不同水平加载到珠上：0.25微克/1e7个珠；0.75微克/1e7个珠；和2.25微克/1e7个珠。
每个孔板在37℃下培养。在第0天，将CTL培养基中的IL-21(150ng/毫升)添加到孔板1和2的每个孔中，从而在每个孔中提供30ng/mL的最终浓度。第2天，将IL21添加到孔板的每个孔中，至最终浓度为30ng/mL。培养继续至第7天。
第7天。对每个孔板的孔的子集分别进行染色，用于MHC四聚体(Tetramer PE，MBL目录号T02000，1微升/孔)、CD4(Biolegend目录号300530，0.5微升/孔)；CD8(Biolegend目录号301048，0.5微升/孔)；CD28(Biolegend目录号302906，0.31微升/孔)；CD45RO(Biolegend目录号304210，0.63微升/孔)；CCR7(CD197，Biolegend目录号353208，0.5微升/孔)；和活力(BD目录号565388，0.125微升/孔)。每个孔用150微升FACS缓冲液和10微升CountbrightTM珠(ThermoFisher目录号C36950)再悬浮。在FACSCelestaTM流式细胞仪(BDBiosciences)上进行FACS分析。图7显示了CD8/MART1表型的流式细胞术分析的斑马图。对于斑马图的每一行1010、1020、1030和1040，左手图是代表性的负孔，右手图是代表性的正孔。第1010行是来自DC刺激的孔板的孔。第1020、1030和1040行显示来自抗原呈递珠刺激的孔板的结果。第1020行显示了0.25微克/1e7个珠的抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。第1030行显示0.75微克/1e7个珠抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。第1040行显示2.25微克/1e7个珠抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。可以看出，当改变抗CD28抗体的水平时，抗原呈递珠以剂量/响应方式启动激活，并且加载有MART1的MHC肽足以与抗CD28加载组合以与DC类似的方式激活T淋巴细胞。
第7天。再刺激。将第二等份的经脉冲的DC或抗原呈递珠分别递送至孔板1和孔板2中的每个占用的孔中。将IL21添加到孔板的每个孔中至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第8天。向孔板1和孔板2中的每个孔中添加50微升的IL-2(50IU/mL)和IL-7(25ng/mL)，分别提供10IU/mL和5ng/mL的最终浓度。继续培养。
第9天。向孔板1和孔板2的每个占用的孔中添加50微升IL-21(150ng/mL)至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第14天。将每个孔板的第二个子集的孔单独染色并如针对第7天的分析所述进行FACS分选。流式细胞术结果如图8所示。对于每一行，1110、1120、1130、1140具有代表性的不太阳性的孔(每行的左手图)和高度阳性的孔(每行的右手图)。第1110行显示由DC激活产生的激活量。第1120、1130和1140行代表针对7天结果所讨论的抗CD28的增加量的结果。第1120行显示了0.25微克/1e7个珠的抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。第1130行显示了0.75微克/1e7个珠抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。第1140行显示了2.25微克/1e7个珠抗CD28抗体加载和1.5微克/1e7个珠的pMHC的结果。值得注意的是，对于具有增加量的共刺激配体的抗原呈递珠，不存在不具有抗原特异性T细胞的孔。特别是在0.75微克和2.25微克CD28抗体加载水平(第1130行和第1140行)下，存在比DC脉冲的孔(第1110行)更显著数目的抗原特异性T细胞。
图9显示了这些实验的表格结果。第1210行显示了第7天T细胞激活表征的图示。第1220行显示第14天的T细胞激活表征的图示。每行从左到右，y轴代表抗原特异性T细胞的百分比；抗原特异性T细胞的总数；抗原特异性T细胞倍数扩增；以及抗原特异性T细胞群中CD28高表达细胞的百分比。每幅图的x轴显示DC、0.25微克CD28加载珠、0.75微克CD28珠和2.25微克CD28加载珠中的每一个的数据集。抗原呈递珠刺激的激活最初似乎比DC刺激慢，但在第二个培养期结束时产量达到相同水平。表型结果显示使用抗原呈递珠的激活具有良好的特异性。图9显示了与DC刺激的实施例相比，抗原呈递珠启动的实施例中MART 1激活的T淋巴细胞的同等水平。然而，使用树突细胞作为激活物质，14天后存在没有激活的T淋巴细胞的孔。因此，抗原呈递珠激活比树突细胞提供更可控和可重复的激活。
第三培养期。在另一个实验中，如在前面紧邻段落中所述使用珠上的抗原呈递表面，但没有与DC进行比较，进行第三刺激和培养期。第14天到第21天。如上文对第7天至第14天所述在持续培养条件期间进行再刺激和饲养直至第21天。在第21天，如针对第7天的分析所述对每个孔板的最后一个子集的孔进行单独染色和FACS分选。对于延长的第三刺激顺序观察到额外的激活(数据未显示)。
实施例4.共价功能化的玻璃珠的制备
将二氧化硅珠(2.5微米，G biosciences目录号786-915，具有基本上简单的球形表面，例如，珠的表面积在由关系式4πr2+/-不超过10％预测的范围内)分散在异丙醇中，然后干燥。将干燥的珠在氧等离子清洁器(Nordson Asymtek)中处理5分钟，使用100W功率、240mTorr压力和440sccm氧气流速。在真空反应器中，用在真空反应器底部的箔船中的(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷(300微升)，在真空反应器底部的单独箔船中的作为水反应物源的七水合硫酸镁(0.5g，Acros目录号10034-99-8)的存在下处理清洁的珠。然后使用真空泵将室抽至750mTorr，然后密封。将真空反应器放置在110℃加热的烘箱中24-48小时。这将共价连接的表面呈递反应性叠氮化物部分引入到珠中，其中修饰的表面具有式I的结构。
在冷却至室温并将氩气引入到抽空的室中之后，将中间反应性叠氮化物呈递珠从反应器中取出，并用丙酮、异丙醇淋洗，并在氮气流下干燥。将叠氮化物呈递反应性珠(50mg)在剧烈涡旋/短暂超声处理下分散在500微升DMSO中。将珠沉淀，并从珠中吸出450微升DMSO。将在剩余的50微升DMSO中的沉淀剧烈涡旋以分散。添加具有PEG13接头的DBCO-SAV(52微升，10微摩尔浓度，化合物1)。通过尖端混合然后涡旋来分散珠。添加含有0.02％叠氮化钠溶液的398微升PBS，然后额外涡旋。将反应混合物在恒温混匀器上以30℃、1000RPM孵育过夜。
16小时后，向每个样品中添加10微升83.7mM DBCO-PEG5-酸，并将它们在30℃/1,000RPM下再孵育30分钟。将珠在PBS/叠氮化物中洗涤3次，然后悬浮在500微升相同溶液中。
这些共价功能化的珠被修饰以引入主激活分子和共激活分子，如下面实施例9中所述。
实施例5.共价功能化的聚苯乙烯珠的制备
将二乙烯基苯交联的聚苯乙烯珠粒(14-20微米，Cospheric目录号786-915)分散在异丙醇中，然后在玻璃培养皿中干燥。将干燥的珠在氧等离子清洁器(Nordson Asymtek)中处理40秒，使用100W功率、240mTorr压力和440sccm氧气流速。在真空烘箱中，用在烘箱架上的箔船中的(11-叠氮基十一烷基)三甲氧基硅烷(化合物5，900微升)，在位于同一烘箱架上的单独箔船中的作为水反应物源七水合硫酸镁(1g，Acros目录号10034-99-8)的存在下处理清洁的珠。然后使用真空泵将烘箱抽至250mTorr，然后密封。将烘箱在110℃加热18-24小时。这将共价修饰的表面引入到珠中，其中修饰的表面具有式I的结构：
在用泵吹扫烘箱3次之后，将共价修饰的珠从烘箱中取出并冷却。将共价修饰的叠氮化物功能化的珠以15mg/50微升的浓度分散在DMSO中。向其中添加浓度为9.9微摩尔的450微升DBCO标记的链霉亲和素(SAV)(化合物1)的溶液。然后将溶液在恒温混匀器中以30℃/1000RPM孵育18小时。将SAV修饰的珠在PBS中洗涤3次。FTIR分析确定SAV被添加到表面，如图10所示。
图10显示了随着共价功能化的表面的建立，功能化珠的叠加FTIR迹线。迹线1310显示了聚苯乙烯珠的原始未功能化的表面。迹线1320显示了引入叠氮化物功能化的表面(具有式I的结构)之后表面的FTIR。迹线1330显示了在聚苯乙烯珠上引入共价连接的PEG13-链霉亲和素表面之后表面的FTIR。迹线1320和1330显示FTIR吸收带的引入与逐步合成中每组化学物质的引入一致。
实施例6.具有抗CD28和抗CD2的珠的抗原呈递表面的制备
将链霉亲和素功能化(共价偶联)的DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D)，6.67e8/mL的珠储液，盘绕的(如上文所述)聚合物珠递送(15微升；1e7个珠)至具有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL)；EDTA(1ml，最终浓度为2mM)；和BSA(5ml 5％，最终浓度为0.1％)的1.5mL微量离心管中，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
将含有0.5微克生物素化单体MHC(HLA-A*02:01MART-1(MBL InternationalCorp.，目录号MR01008，ELAGIGILTV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到微量离心管中，并通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次将混合物用移液器上下吸取。将管脉冲离心并去除上清液，并将管放置在磁性架内以去除更多上清液而不去除珠。
将生物素化的抗CD28(Biolegend，目录号302904)在600微升洗涤缓冲液中的溶液添加到微量离心管中。溶液含有总共3微克的抗体。溶液含有：3微克的抗CD28和0微克的抗CD2，2.25微克的抗CD28和0.75微克的抗CD2，1.5微克的抗CD28和1.5微克的抗CD2，0.75微克的抗CD28和2.25微克的抗CD2，或者0微克的抗CD28和3微克的抗CD2。通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。将珠在4℃下孵育30分钟，15分钟后再次通过移液器上下吸取而再悬浮。在孵育期结束时，将管短暂脉冲离心。放回到磁性架中并分离1分钟后，将缓冲溶液从功能化的珠上吸走。将MHC单体/抗CD28抗原呈递珠再悬浮于100微升缓冲洗涤液中，储存于4℃，无需进一步操作即可使用。1e7个直径为2.80微米的功能化的DynaBead具有约24e6平方微米的标称表面积，可用于与T淋巴细胞接触，但如上文所述，这些盘绕的球形珠的实际表面积比标称表面积高超过10％。
实施例7.共价功能化的聚合物珠的制备。中间反应性合成表面的制备。
在制造过程的第一步中，使M-450环氧基功能化的顺磁盘绕聚合物珠(DynaBeadsTM，ThermoFisher目录号14011(盘绕具有与上文相同的含义))与叠氮化四丁基铵反应，制备呈递叠氮化物反应性部分的聚合物珠，该叠氮化物反应性部分能够与具有点击化学相容的反应性基团的功能化试剂反应。
实施例8.珠的共价功能化的合成表面的制备
然后使来自实施例7的叠氮化物制备的盘绕珠与二苯并环辛炔基(DBCO)偶联的链霉亲和素反应，以将链霉亲和素共价连接至聚合物珠。DBCO-链霉亲和素试剂是通过使链霉亲和素与胺反应性DBCO-聚乙二醇(PEG)13-NHS酯反应制备的，为每个链霉亲和素单元提供多个连接位点。
进一步与表面封闭分子反应。随后可以用DBCO功能化的表面封闭分子处理所得的呈递链霉亲和素官能团的共价功能化的聚合物珠，以与聚合物珠上任何剩余的叠氮化物反应性部分反应。在一些情况下，DBCO功能化的表面封闭分子可以包括PEG分子。在一些情况下，DBCO PEG分子可以是DBCO PEG5-羧酸。包括附加的PEG或PEG-羧酸表面封闭分子的链霉亲和素功能化的聚合物珠提供优异的物理行为，证明在水性环境中的分散性得到改善。此外，剩余叠氮化物部分的表面封闭防止了在该制备步骤或随后的制备步骤或激活步骤中存在的其他不相关/不期望的组分也共价结合至聚合物珠。最后，引入表面封闭分子配体可以防止T淋巴细胞上存在的表面分子接触反应性叠氮化物官能团。
进一步概括。可能期望用含有DBCO的配体分子的混合物来修饰实施例7的叠氮化物功能化的表面。例如，DBCO-聚乙二醇(PEG)13-链霉亲和素(化合物1)可以与DBCO-PEG5-COOH(表面封闭分子)以各种比例混合，然后与叠氮化物功能化的珠接触。在一些情况下，DBCO-链霉亲和素分子与DBCO-PEG5-COOH的比例可以为约1:9；约1:6、约1:4或约1:3。不希望受理论束缚，表面封闭分子配体防止链霉亲和素分子过度加载至珠表面，并通过提供额外的亲水性进一步提供增强的物理化学行为。表面封闭分子不限于PEG5-COOH，而是可以是本文所述的任何合适的表面封闭分子。
实施例9.共价修饰的抗原呈递珠的制备。肽-HLA和单克隆抗体共激活分子的缀合
材料：A.带有主要组织相容性复合物(MHC)I分子的抗原。生物素化的肽-人白细胞抗原复合物(pMHC)可商购自MBL、Immunitrack或Biolegend。生物素化的肽-HLA复合物包括与I类HLA分子的肽结合凹槽非共价结合的抗原肽，其在制造商处生产并折叠成HLA复合物。生物素化的肽-HLA复合物也与β2-微球蛋白非共价结合。该复合物在HLA的C端肽序列上的识别位置上由BirA酶引入的赖氨酸残基的侧链胺上进行共价生物素化，这也是由制造商进行的。
B.共激活分子。生物素化的抗体用于共刺激，并由鼠杂交瘤培养物的上清液产生。该抗体通过随机存在于抗体表面的赖氨酸的侧链的多个胺官能团与生物素缀合。生物素化的抗体是可商购的(Biolegend、Miltenyi或Thermo Fisher)。
可用于这些实验的生物素化的抗CD28是由克隆CD28.2、15e8或9.3产生的。
可用于这些实验的生物素化的抗CD2是由克隆LT2或RPA-2.10产生的。其他克隆也可以用于构建共价修饰的抗原呈递合成表面，例如这些聚合物珠。
主激活分子和共激活分子与珠的共价功能化的表面的缀合。MHC分子(含有抗原分子)和共激活分子与两步过程中产生的珠缀合。在各种实验中，共激活分子(在这种情况下为生物素化的抗CD28和生物素化的抗CD2)的比例可以在约100:1至约1:100；或约20:1至约1:20的范围内变化。在其他实验中，共激活分子的比例为约3:1至约1:3或约1:1。参见图11A-11D。
pMHC加载。将链霉亲和素功能化(共价偶联)的DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D)、6.67e8/mL的珠储液的盘绕的(如上文所述)聚合物珠用洗涤缓冲液(不含钙和镁的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；0.1％牛血清白蛋白；2mM乙二胺四乙酸)洗涤。将洗涤缓冲液移液到管中，并向其中添加链霉亲和素珠。通常，将约1e7个珠移液到1mL的洗涤缓冲液中。使用磁铁(例如DYNAL DynaMag-2，ThermoFisher目录号12-321-D)将珠收集在管壁上。珠迁移到管壁后，通过抽吸去除洗涤缓冲液，避开保持有珠的壁。该洗涤过程再重复两次。第三次洗涤后，将珠以1.67e7个珠/mL再悬浮在洗涤缓冲液中。
然后将珠与pMHC混合。将pMHC添加到洗涤缓冲液中的珠中，最终浓度为0.83微克pMHC/mL。通过涡旋将珠和pMHC充分混合，然后在4℃下孵育15分钟。将珠再次涡旋，然后在4℃下再孵育15分钟。
共激活分子加载。将pMHC功能化的珠再次通过磁铁捕获，并通过抽吸去除pMHC试剂混合物。然后将珠在洗涤缓冲液中达到1.67e7/mL。然后将生物素化的抗CD28和生物素化的抗CD2(如果使用的话)添加到珠中，终浓度为5微克/mL的总抗体。如果同时使用抗CD28和抗CD2，则每种抗体以2.5微克/mL添加。
通过涡旋将珠和pMHC充分混合，然后在4℃下孵育15分钟。将珠再次涡旋，然后在4℃下再孵育15分钟。
在生物素化的抗体修饰之后，通过磁铁捕获珠，并通过抽吸去除抗体混合物。将珠以1e8个珠/mL的最终密度再悬浮在洗涤缓冲液中。将珠直接使用，无需进一步洗涤。
表征。为了评估所得抗原呈递珠的加载程度和均质性，用结合珠上的pMHC和共激活CD28/CD2(如果存在的话)抗体的抗体对珠进行染色。然后通过流式细胞术对所得的染色抗体的量进行定量。然后根据制造商的说明使用分子定量试剂盒(Quantum SimplyCellular，Bangs Labs)测定珠上的pMHC和共刺激抗体的数目。
为了分析珠，将2e5个珠分别添加到装有1mL洗涤缓冲液的两个微量离心管中。pMHC定量和共刺激抗体定量在单独的管中进行。在每个单独的实验中，使用磁铁将珠收集在管壁上，并去除洗涤缓冲液。将珠再悬浮在各自管中的0.1mL洗涤缓冲液中，并短暂涡旋每个管以将珠与管壁分离。为了检测pMHC，将0.5微升与APC(克隆BB7.2，Biolegend)缀合的抗HLA-A添加到第一管中。再次短暂涡旋第一管以混合珠和检测抗体。为了检测共刺激抗体，将0.5微升与APC缀合的抗小鼠IgG添加到第二管中。根据所使用的共刺激抗体克隆，使用不同的抗小鼠抗体，例如，使用RMG1-1(Biolegend)来检测CD28.2(抗CD28)和RPA-2.10(抗CD2)。对于每个管，将检测抗体与珠在黑暗中在室温下孵育30分钟。
对于每个管，然后通过磁铁将珠捕获到管壁上，并通过抽吸去除染色溶液。向每个管中添加1mL洗涤缓冲液，然后抽吸以去除任何残留的染色抗体。将每个管中的珠再悬浮在0.2mL洗涤缓冲液中，然后将每个管中的珠转移到5mL聚苯乙烯管中，保持两组珠分开。
为了量化不同物质的加载，在流式细胞仪(FACS Aria或FACS Celesta，BDBiosciences)上分析珠。首先，收集带有未染色的产物抗原的珠的样品。门控单线态珠和双线态珠。双线态珠与单线态珠的区别在于其较高的前向和侧向散射幅度。通常，记录大约10,000个珠事件。然后在单独的实验中针对pMHC和共刺激抗体分析染色的珠。同样，对每个样品收集大约10,000个珠事件，并记录单线态珠事件的APC中值荧光强度(MFI)和APC MFI的变异系数(100×[MFI的标准偏差]/[MFI])。
为了确定每个珠的pMHC和共刺激抗体的数目，使用分子定量试剂盒。该试剂盒(Quantum Simply Cellular(Bangs Laboratories)包括一组具有特定抗体结合能力(由制造商确定)的珠。将这些珠用于捕获检测抗体。简而言之，将定量珠与饱和量的检测结合一起孵育，然后彻底清洗以去除过量的抗体。将具有不同结合能力的珠与阴性对照珠混合并再悬浮于洗涤缓冲液中。然后通过流式细胞术分析混合的珠。记录具有特定结合能力的每个珠的APC MFI，并生成MFI与结合能力的线性拟合。然后使用aAPC的MFI来确定每个aAPC结合的检测抗体的数目。该数目等于珠上(pMHC或共刺激)抗体的数目。下表显示了以下结果：
A.在实施例7-8中产生并在本实验中进行上述功能化的呈递抗原的盘绕聚合物珠。
B.实施例1B中产生的呈递抗原的基本上球形的二氧化硅珠。
实施例10.通过抗原呈递珠进行刺激
输入细胞群。为了增加每孔铺板的抗原特异性CD8+T细胞的数目，首先使用市售试剂从外周血单核细胞中分离CD8+T细胞。可以使用负选择(例如EasySepTM人CD8+T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies))或正选择(例如CliniMACS CD8试剂(MiltenyiBiotec))来分离细胞。根据制造商推荐的方案分离CD8+T细胞。或者，可以分离不同的T细胞亚群，例如，仅分离初始CD8+T细胞，或者可以进行不太严格的纯化，例如，通过CliniMACSCD14试剂(Miltenyi Biotec)去除单核细胞。或者，如果需要对II类限制性抗原具有特异性的T细胞，则可以通过相应的方法分离CD4+T细胞。
第一T细胞刺激期。将富集的CD8+T细胞以1e6/mL再悬浮于含有30纳克/mL IL-21的培养基中(R&D Systems)。用于T细胞的培养基是高级RPMI 1640培养基(ThermoFisher)，其中补充有10％人AB血清(Corning CellGro)和GlutaMax(Thermo Fisher)和50微摩尔Beta-Mercapto乙醇(Thermo Fisher)或ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基(StemCell Technologies)。
如实施例9中所述制备抗原呈递珠，其中以0.83微克pMHC/mL的最终浓度加载盘绕聚合物珠。将所得的全部珠分成五部分，按以下比例加载共刺激配体：
第1组：3.00微克/mL的CD28和零浓度的CD2。
第2组：2.25微克/mL的CD28和0.75微克/mL的CD2。
第3组：1.50微克/mL的CD28和2.25微克/mL的CD2。
第4组：0.75微克/mL的CD28和2.25微克/mL的CD2。
第5组：0.00微克/mL的CD28和3.00微克/mL的CD2。
对于培养基中的T细胞，将每组抗原呈递珠的等份添加到单独的孔中，直至最终浓度为每个细胞1个抗原呈递珠。将细胞和抗原呈递珠混合并接种到经过组织培养处理的圆底96孔微孔板中。向板的每个孔中添加0.2mL(2e5个细胞)，然后将其置于标准5％ CO2，37℃培养箱中。通常，每个板使用48-96个孔。两天后，将IL-21在培养基中稀释至150纳克/mL。将50微升在培养基中稀释的IL-21添加到每个孔中，并将板返回到培养箱中。
将细胞再培养5天(总共7天)后，分析细胞的抗原特异性T细胞扩增。或者，如以下段落所述在第二刺激期中刺激细胞以继续扩增抗原特异性T细胞。
第二T细胞刺激期。在第一个刺激期结束时，从上述孔板的每个孔中去除50微升培养基，小心不要扰乱孔底部的细胞沉淀。在新鲜培养基中将IL-21稀释至150ng/mL，并将上述产生的抗原呈递珠添加到IL-21/培养基混合物中，最终密度为4e6个抗原呈递珠/mL。将50微升的该IL-21/抗原呈递珠/培养基混合物添加到每个孔中，导致将额外的2e5个抗原呈递珠添加到每个孔中。任选地，可以将孔板以400xg离心5分钟，以将抗原呈递珠粒沉淀到细胞上。将孔板返回到培养箱中。
第二天(刺激实验开始后8天)，将孔板从培养箱中取出，并从每个孔中去除50微升培养基。将IL-2(R&D Systems)在新鲜培养基中稀释至50单位/mL。向其中添加含有IL-2、IL-7(R&D Systems)的培养基至最终浓度为25ng/mL。将50微升的该IL-2/IL-7/培养基混合物添加到每个孔中，并将孔板返回到培养箱中。
第二天(刺激实验开始后9天)，将孔板从培养箱中取出，并再次从每个孔中去除50微升培养基。将IL-21在新鲜培养基中稀释到150纳克/mL。将50微升的该IL-21/培养基混合物添加到每个孔中，并将孔板返回到培养箱中。
将细胞再培养5天(刺激实验开始后14天)后，通常对细胞进行抗原特异性T细胞扩增分析。然而，可以用更多的抗原呈递珠再次刺激细胞，进行如上所述的另一个培养期，以继续扩增抗原特异性T细胞。
抗原特异性T细胞刺激和扩增的分析。一旦进行了所需次数的T细胞刺激，就分析细胞的T细胞扩增，该T细胞对用于制备抗原呈递珠的pMHC复合物具有特异性。使用藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素检测抗原特异性T细胞，该链霉亲和素与4个pMHC复合物结合。这些复合物被称为四聚体。通常，使用与抗原呈递珠的pMHC中使用的相同的肽制造的四聚体来检测抗原特异性T细胞。
为了检测和表征抗原特异性T细胞，在FACS缓冲液(不含钙和镁的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；2％胎牛血清；5mM乙二胺四乙酸、10mM HEPES)中制备了PE四聚体(MBL，Intl)和对具有各种荧光团(例如FITC缀合的抗CD28、PerCP-Cy5.5缀合的抗CD8)的各种细胞表面标志物具有特异性的抗体的混合物。通过相对于标准细胞样品进行滴定来确定所用抗体的量。通常用于表征的表面标志物有：CD4、CD8、CD28、CD45RO、CD127和CD197。此外，添加活/死细胞区分染料，例如Zombie Near-IR(Biolegend)和Fc受体封闭试剂，例如人TruStainFcXTM(Biolegend)，以分别区分活细胞和防止培养物中任何Fc受体表达细胞的非特异性抗体染色。
通常，使用多通道微量移液器混合孔，并将50微升细胞从每个孔中转移至新鲜的、未经处理的圆底96孔微孔板中。通过向每个孔中添加0.2mL的FACS缓冲液来洗涤细胞。将细胞在室温下以400xg离心5分钟，并去除洗涤液。向每个孔中添加25微升四聚体、抗体、活/死、Fc封闭试剂混合物。将细胞在箔下在室温下染色30分钟。然后将细胞再次洗涤，最后用CountBright绝对计数珠(Thermo Fisher)再悬浮于FACS缓冲液中。然后通过流式细胞术(FACS Aria或FACS Celesta，BD Biosciences)分析细胞。通过首先对单个/活细胞进行门控，然后对CD8+/四聚体+细胞进行门控来确定抗原特异性T细胞的频率。根据对照染色确定适当的门控条件，例如没有已知特异性的阴性对照四聚体(MBL，Intl)或抗体同种型对照。在抗原特异性T细胞群中，确定了CD45RO+/CD28高细胞的频率以及表达CD127的细胞的数目。表达CD45RO的激活的T细胞继续表达高水平的CD28和CD127，已被证明包括记忆前体效应细胞。记忆前体细胞已被证明比不表达这些标志物的激活的T细胞分化程度更低，并且具有更高的复制潜力。
图11A：用指定量(以微克计)的抗CD28和/或抗CD2制备的抗原呈递珠刺激后7天，MART1特异性T细胞的频率(活细胞的百分比)。每个点代表96孔微孔板的一个孔。数据汇总自两个独立的实验。
图11B：用指定量(以微克计)的抗CD28和/或抗CD2制备的抗原呈递珠刺激7天后，MART1特异性T细胞的总数。每个点代表96孔微孔板的一个孔。数据汇总自两个独立的实验。
图11C：用指定量(以微克计)的抗CD28和/或抗CD2制备的aAPC刺激7天后，MART1特异性T细胞的倍数扩增。每个点代表96孔微孔板的一个孔。数据汇总自两个独立的实验。通过将第7天每个孔中MART1 T细胞的频率除以第0天样品中MART1 T细胞的频率来计算倍数扩增。
图11D：用指定量(以微克计)的抗CD28和/或抗CD2制备的aAPC刺激7天后，对CD45RO呈阳性并表达高水平CD28的MART1特异性T细胞的分数。每个点代表96孔微孔板的一个孔。数据汇总自两个独立的实验。通过将第7天每个孔中MART1 T细胞的频率除以第0天样品中MART1 T细胞的频率来计算倍数扩增。
据观察，用大范围比例的共刺激配体抗CD28和抗CD2可以产生抗原特异性T细胞。可以仅使用两种共刺激配体之一进行生产。然而，抗CD28和抗CD2的组合，包括抗CD28:抗CD2的比例为约3:1至约1:3，提供了每个上述特征的增加的测量值。
图12A-12E：对于如上所述刺激的T细胞，使用如上所述产生的抗原呈递珠中的SLC45A2抗原，示出了示例性流式细胞术图。图12A显示了刺激前T细胞的结果(“输入”)。代表性的经刺激的孔显示在下方的图中：负生长孔(图12B)；中间生长孔(图12C)；高生长孔(图12D)；和不相关的四聚体染色(图12E)。
图13：对于如上所述刺激的T细胞，使用NYESO1抗原，分别显示了单周期刺激后(7天，左栏)和如上所述的两周期刺激(14天，右栏)后对CD45RO呈阳性并表达高水平CD28的T细胞的频率。观察到抗原特异性激活T细胞的频率增加。
细胞毒性：使用SLC45A2抗原(DC，黑色条)或如上所述产生的抗原呈递珠(呈递SLC45A2抗原)(灰色阴影线条)脉冲的树突细胞扩增的SLC45A2特异性T细胞杀死靶肿瘤细胞和非靶肿瘤细胞。参见图14。通过靶细胞中Caspase-3的激活来测量杀死。MEL526肿瘤细胞表达SLC45A2并被使用DC和抗原呈递珠二者扩增的T细胞杀死。A375细胞不表达SLC45A2并且不会被使用DC或抗原呈递珠扩增的T细胞杀死。抗原呈递珠的表现与树突细胞一样好。
图15A-15C显示了树突细胞刺激的细胞产物和抗原呈递珠刺激的细胞产物之间的比较。图15A显示抗原呈递珠刺激实验中抗原特异性(AS)激活的T细胞的百分比较高。图15B显示，与树突细胞刺激的细胞产物相比，抗原呈递珠刺激实验的细胞产物具有更高百分比的所需CD45RO阳性/高度CD28阳性表型。图15C显示抗原呈递珠刺激实验产生的细胞产物中抗原特异性T细胞的实际数目较高。总体而言，抗原呈递珠刺激提供了更理想的细胞产物，并且是比使用树突细胞激活更可控且更具成本效益的激活T细胞的方法。
实施例11.具有蛋白片段共激活配体的抗原呈递珠的制备
11A.制备具有赖氨酸-生物素化的CD80和CD58的珠的抗原呈递表面。将链霉亲和素功能化的(共价偶联的、盘绕的(如上所述)聚合物)DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D，珠储液为6.67e8/mL)递送(15微升；1e7个珠)至含有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL)；EDTA(1ml，最终浓度2mM)；和BSA(5ml 5％，最终浓度0.1％)的1.5mL微量离心管，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液，随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
将含有0.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01SLC45A2(Biolegend，定制产品，SLYSYFQKV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到微量离心管中，并通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。对管进行脉冲离心并去除上清液，并将管放置在磁性架内以去除更多的上清液而不去除珠。
将生物素化的重组CD80蛋白(R&D Systems，定制产品)和生物素化的重组CD58(R&D Systems，定制产品)在600微升洗涤缓冲液中的溶液添加到微量离心管中。CD80被制造商制备为与人IgG1 Fc结构域的N端融合体，并在随机赖氨酸残基上进行生物素化。将CD58以相同的方式生物素化。该溶液总共含有4.5微克CD80和1.5微克CD58。通过移液器上下吸取使珠再悬浮。将珠在4℃下孵育30分钟，15分钟后再次通过移液器上下吸取而再悬浮。孵育期结束时，将管短暂脉冲离心。在放回到磁性架中并分离1分钟后，将缓冲溶液从功能化的珠上吸走。将MHC单体/CD80/CD58抗原呈递珠再悬浮于100微升洗涤缓冲液中，储存于4℃，无需进一步操作而使用。1e7个2.80微米直径的功能化的DynaBead具有可用于与T淋巴细胞接触的约24e6平方微米的标称表面积，如本文所述，其不反映pMHC和共刺激分子配体占据的总表面积。
11B.制备具有BirA生物素化的CD80和CD58的珠的抗原呈递表面。将链霉亲和素功能化的(共价偶联的、盘绕的(如上所述)聚合物)DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D，珠储液为6.67e8/mL)递送(15微升；1e7个珠)至含有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL)；EDTA(1ml，最终浓度2mM)；和BSA(5ml 5％，最终浓度0.1％)的1.5mL微量离心管中，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液，随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
将含有0.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01MART1(Biolegend，定制产品，ELAGIGILTV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到微量离心管中，并通过移液器上下吸取而使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。对管进行脉冲离心并去除上清液，并将管放置在磁性架内以去除更多的上清液而不去除珠。
将600微升洗涤缓冲液中的生物素化的重组CD80蛋白(BPS Biosciences，目录号71114)和生物素化的重组CD58(BPS Biosciences，目录号71269)的溶液添加到微量离心管中。重组蛋白被制造商制备为与人IgG1 Fc结构域的N端融合体，并具有最终的C端BirA生物素化位点，并被生物素化。该溶液总共含有1.5微克重组CD80和1.5微克重组CD58蛋白。通过移液器上下吸取使珠再悬浮。将珠在4℃下孵育30分钟，然后在15分钟后再次通过移液器上下吸取而再悬浮。孵育期结束时，将管短暂脉冲离心。在放回到磁性架中并分离1分钟后，将缓冲溶液从功能化的珠上吸走。将MHC单体/CD80/CD58抗原呈递珠再悬浮于100微升洗涤缓冲液中，储存于4℃，无需进一步操作而使用。1e7个2.80微米直径的功能化的DynaBead具有可用于与T淋巴细胞接触的约24e6平方微米的标称表面积，如本文所述，其不反映pMHC和共刺激分子配体占据的总表面积。实施例12.通过具有抗体共刺激的抗原呈递珠激活CD8+T淋巴细胞，与重组蛋白共刺激进行比较
细胞：按照制造商对EasySepTM人CD8+T细胞分离试剂盒(可商购自StemCellTechnologies Canada Inc.的试剂盒(目录号17953))的说明，通过负选择，在包括RPMI和10％胎牛血清(FBS)的培养基中，从市售的PBMC中富集CD8+T淋巴细胞。
用于试剂添加的培养基和稀释剂：高级RPMI(ThermoFisher目录号12633020，500mL)；1x GlutaMAX(ThermoFisher目录号35050079，5mL)；10％人AB血清(zen-bio，目录号HSER-ABP 100mL，50mL)；和50nMβ-巯基乙醇(ThermoFisher目录号31350010，50nm储液，0.5mL，最终浓度50微摩尔)。
实验设置：对于每种激活物质，使用单个96孔组织培养处理板(VWR目录号10062-902)：
孔板1.具有抗体共刺激的抗原呈递珠。
孔板2.具有随机生物素化的重组蛋白共激活的抗原呈递珠。
孔板3.具有BirA生物素化的重组蛋白共激活的抗原呈递珠。
将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到每个孔中。
将通过如实施例6中所述的类似制备方法制备的呈递包括MART1、抗CD28抗体和抗CD2抗体的pMHC的抗原呈递表面珠(2e5)添加到孔板1中的每个孔中。以0.5微克/1e7个珠加载pMHC。以1.5微克/1e7个珠加载抗CD28抗体。以1.5微克/1e7个珠加载抗CD2抗体。
将如实施例11A中制备的、呈递包括MART1、重组CD80和重组CD58的pMHC的抗原呈递表面珠(2e5)添加到孔板2中的每个孔中。以0.5微克/1e7个珠加载pMHC。以4.5微克/1e7个珠加载重组CD80。以1.5微克/1e7个珠加载重组CD58。
将如实施例11B中制备的、呈递包括MART1、BirA生物素化的重组CD80和重组CD58的pMHC的抗原呈递表面珠(2e5)添加到孔板3中的每个孔中。以0.5微克/1e7个珠加载pMHC。以1.5微克/1e7个珠加载重组CD80。以1.5微克/1e7个珠加载重组CD58。
将每个孔板在37℃下培养。在第0天，将CTL培养基中的IL-21(150ng/毫升)添加到孔板1和2的每个孔中，提供每个孔中30ng/mL的最终浓度。在第2天，将IL21添加到孔板的每个孔中，至最终浓度为30ng/mL。培养继续至第7天。
第7天。再次刺激。将具有抗体共刺激或重组蛋白共刺激的第二等份抗原呈递珠分别递送至孔板1、孔板2和孔板3中的每个占用的孔。将IL21添加到孔板的每个孔中至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第8天。向每个孔板的每个孔中添加50微升IL-2(50IU/mL)和IL-7(25ng/mL)以分别提供10IU/mL和5ng/mL的最终浓度。继续培养。
第9天。向每个孔板的每个占用的孔中添加50微升IL-21(150ng/mL)至最终浓度30ng/mL。继续培养。
第14天。对每个孔板的孔分别针对以下进行染色：MHC四聚体(Tetramer PE，MBL目录号T02000，1微升/孔)、CD4(Biolegend目录号300530，0.5微升/孔)；CD8(Biolegend目录号301048，0.5微升/孔)；CD28(Biolegend目录号302906，0.31微升/孔)；CD45RO(Biolegend目录号304210，0.63微升/孔)；CCR7(CD197，Biolegend目录号353208，0.5微升/孔)；和活力(BD目录号565388，0.125微升/孔)。用150微升FACS缓冲液和10微升CountbrightTM珠(ThermoFisher目录号C36950)再悬浮每个孔。在FACSCelestaTM流式细胞仪(BDBiosciences)上进行FACS分析。
图16A显示了每个孔中使用具有抗体或随机生物素化的重组蛋白配体的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的频率(所有活细胞的％)。图16B显示了每个孔中具有抗体或随机生物素化的重组蛋白配体的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的数目。图16C显示了表达高水平CD28的MART1 T细胞的频率，其是比较抗体刺激或随机生物素化的重组蛋白配体的记忆前体表型的指标。
图16D显示了每个孔中使用具有抗体或重组蛋白BirA配体的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的频率(所有活细胞的％)。图16E显示了每个孔中使用具有抗体或重组蛋白BirA配体的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的数目。图16F显示了表达高水平CD28的MART1 T细胞的频率，其是记忆前体表型的指标。可以看出，具有被BirA生物素化的重组蛋白配体的抗原呈递珠有效地扩增抗原特异性CD8+T细胞，并且许多扩增的细胞呈现在记忆前体表型上。相比之下，使用随机生物素化的蛋白配体不会导致显著的抗原特异性T细胞群，也不会为细胞提供记忆前体表型。实施例13.盘绕的聚合物珠与基本上球形的二氧化硅珠的加载和激活之间的比较
实施例13A.向聚合物和二氧化硅抗原呈递珠上加载激活物质的比较。测量了可以沉积到聚合物和二氧化硅珠上的pMHC和共刺激抗体的量。
将链霉亲和素功能化(共价偶联)的DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D，珠储液为6.67e8/mL)递送(15微升；1e7个珠)至含有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL)；EDTA(1ml，最终浓度2mM)；和BSA(5ml 5％，最终浓度0.1％)的1.5mL微量离心管中，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液，随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
首先通过将生物素功能化(共价偶联)的光滑二氧化硅珠保存在100微摩尔链霉亲和素中而将其用链霉亲和素包被。通过将大约5e6个珠稀释到微量离心管中的1毫升洗涤缓冲液中而对其进行洗涤，然后以1,000xg离心1分钟。通过抽吸小心地去除上清液，并将洗涤过程再重复两次。去除上清洗涤缓冲液。
为了制备抗原呈递珠，将含有0.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01SLC45A2(Biolegend，定制产品，SLYSYFQKV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到装有DynaBeads和二氧化硅珠的管中，并通过移液器上下吸取将珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。
使用含有1.5微克生物素化的抗CD28和1.5微克生物素化的抗CD2的洗涤缓冲液(600微升)来再悬浮每个珠样品，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使抗体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。最后，将珠再悬浮在100微升洗涤缓冲液中。
用洗涤缓冲液(1毫升)洗涤大约2e5个聚合物抗原呈递珠或1e5个二氧化硅抗原呈递珠的两个样品。将珠样品再悬浮于100微升洗涤缓冲液中，并通过添加1微升APC缀合的抗HLA-A(Biolegend，目录号343308)或1微升APC缀合的单克隆抗小鼠IgG1(Biolegend，目录号406610)进行染色。将珠与抗体混合并在黑暗中染色30分钟。染色后，将珠洗涤，再悬浮于洗涤缓冲液(200微升)中并转移至管中以通过流式细胞术进行分析。
然后制备一组量子简单细胞荧光定量珠(Bangs Labs，目录号815)以确定与每个抗原呈递珠样品结合的抗HLA-A抗体和抗小鼠IgG1抗体的数目。定量珠具有由制造商确定的抗体结合能力。将具有预定结合能力的每种珠的一滴放入装有50微升洗涤缓冲液的微量离心管中。向管中添加5微升APC缀合的抗HLA-A或APC缀合的抗小鼠IgG1并通过涡旋混合。将珠在黑暗中染色30分钟，使用与上述相同的方法洗涤。然后将具有不同结合能力的珠汇集到一个样品中并转移到单个管中。添加一滴空白珠(无抗体结合能力)，并通过流式细胞术分析珠。
通过流式细胞术(BD FACSCelesta，Becton Dickinson and Company)记录5,000个事件来分析定量珠。通过前向散射和侧向散射来识别定量珠，并记录每个珠的APC通道中的中值强度。该数据记录在制造商(Bangs)提供的专有Excel电子表格中，其计算APC强度相对于抗体结合能力的标准曲线。验证校准是线性的后，分析抗原呈递珠样品。通过前向和侧向散射来识别珠，并将APC通道中的中值强度记录在电子表格上。该电子表格计算每个抗原呈递珠上的APC抗HLA-A抗体或APC抗小鼠IgG1的数目。假设1个抗HLA-A抗体与抗原呈递珠上的一个pMHC结合，则该值代表每个珠上pMHC分子的数目。类似地，可以确定共刺激抗体的数目。
从每个抗原呈递珠的标称表面积，可以确定每种物质的密度(分子数/珠表面的平方微米)。二氧化硅微球上的pMHC总数经测定为大约800,000个pMHC/抗原呈递珠。共刺激抗体的总数被测定为大约850,000个抗体/珠。由于无法区分用于制备抗原呈递珠的抗CD28和抗CD2克隆(它们是相同的同种型)，因此假设两种抗体的比例为1:1。由于二氧化硅珠表面的规则性，可以从球体合理地模拟表面积。对于直径为4.08微米的微球，这对应于约52.3平方微米的表面积。由此，可以估计由二氧化硅抗原呈递珠呈递每平方微米珠表面约15,000个pMHC和15,000个共刺激抗体，如表1所示。对于每个配体类别，每个珠群的分布如图17A所示，其中对于每种类型的珠，每一行2010、2020和2030显示左图中pMHC的分布，以及右图中共刺激抗体的分布。行2010显示了2.8微米直径的盘绕的聚合物珠(Dynal)的配体分布。行2020显示了4.5微米直径的盘绕的聚合物珠(Dynal)的配体分布。行2030显示了实施例1B中制备的2.5微米直径的基本上球形的二氧化硅珠的配体分布。生产了严格控制的珠群，其中基本上球形的二氧化硅珠在整个群中具有更严格控制的配体分布，以及稍高的中值分布。因此，使用基本上球形的二氧化硅珠可以导致这些激活物质的生产更加可再现和可控。此外，与盘绕的聚合物珠配体分布不同，由于所有配体均可被T淋巴细胞接触，因此可以更有效地利用珍贵的生物配体(例如抗体)。
表1.盘绕的聚合物珠和基本球形的二氧化硅珠的配体定量和密度。
对于聚合物珠，盘绕的表面使得珠直径和表面积之间的关系不那么简单。从定量结果可以确定，基于M-280DynaBeads的聚合物抗原呈递珠在其表面上有约480,000个pMHC分子和425,000个共刺激抗体。对于半径为1.4微米的球体(等于M-280DynaBeads的标称半径)，这相当于每平方微米约20,000个pMHC和17,000个共刺激抗体，如表1所示。然而，由于聚合物珠的盘绕的表面，实际表面积可能更大，因此实际密度更低。然而，从图17E、17F和17G可以看出，这些珠可以用作抗原呈递珠衬底以扩增大量抗原特异性T细胞，其中扩增以与实施例13B中类似的方式进行。此外，从图17H中，这些抗原呈递珠产生大量具有CD28高表达的抗原特异性T细胞，表明记忆前体表型。
使用链霉亲和素修饰的M-450Epoxy DynaBead以相同的方式制备抗原呈递珠。从流式细胞术，由M-450珠制备的抗原呈递珠与用M-280DynaBead制备的抗原呈递珠具有大致相同数目的pMHC和共刺激抗体分子。由于M-450DynaBead比M-280珠大，这意味着M-450抗原呈递珠上的激活物质的密度比M-280抗原呈递珠上低约2-3倍。然而，从图17F中可以看出，当用于扩增SLC45A2 T细胞时，M-450抗原呈递珠产生阳性孔(其中SLC45A2特异性T细胞扩增至占孔中活细胞的0.5％或更多)。从图17G和17H可以看出，这些孔以高频率产生SLC45A2T细胞，并且SLC45A2 T细胞的数目与从M-280抗原呈递珠获得的数目相当。此外，从图17I，当使用M-280或M-450抗原呈递珠扩增SLC45A2 T细胞时，表达高水平CD28的SLC45A2 T细胞的分数是相当的。
实施例13B.使用聚合物与二氧化硅珠扩增抗原特异性T细胞。测试了使用二氧化硅抗原呈递珠扩增抗原特异性T细胞，并与盘绕的聚合物珠(聚苯乙烯)进行比较。
将链霉亲和素功能化(共价偶联、盘绕)的DynaBeadsTM(ThermoFisher目录号11205D，珠储液为6.67e8/mL)递送(15微升；1e7个珠)至含有1mL洗涤缓冲液(DPBS(无镁+2，无钙+2，244mL)；EDTA(1ml，最终浓度2mM)；和BSA(5ml 5％，最终浓度0.1％))的1.5mL微量离心管中，并使用磁性DynaBead架分离。重复用1mL洗涤缓冲液洗涤/分离，并添加另外200微升洗涤缓冲液，随后进行脉冲离心。去除上清洗涤缓冲液。
首先，通过将如实施例1B中制备的生物素功能化(共价偶联)的光滑二氧化硅珠储存在100微摩尔链霉亲和素中，将其用链霉亲和素包被。通过将大约5e6个珠稀释到微量离心管中的1毫升洗涤缓冲液中对其进行洗涤，然后以1,000xg离心1分钟。通过抽吸小心地去除上清液，并重复洗涤过程两次。去除上清洗涤缓冲液。
为了制备抗原呈递珠，将含有0.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01SLC45A2(Biolegend，定制产品，SLYSYFQKV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到装有DynaBead和二氧化硅珠的管中，并通过移液器上下吸取将珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。
使用含有1.5微克生物素化的抗CD28和1.5微克生物素化的抗CD2的洗涤缓冲液(600微升)再悬浮每个珠样品，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使抗体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。最后，将珠再悬浮在100微升洗涤缓冲液中。
细胞：按照制造商针对EasySepTM人CD8+T细胞分离试剂盒(来自StemCellTechnologies Canada Inc.的市售试剂盒(目录号17953))的说明，通过负选择，在包含RPMI和10％胎牛血清(FBS)的培养基中从市售的PBMC中富集CD8+T淋巴细胞。
用于试剂添加的培养基和稀释剂：高级RPMI(ThermoFisher目录号12633020，500mL)；1x GlutaMAX(ThermoFisher目录号35050079，5mL)；10％人AB血清(zen-bio，目录号HSER-ABP 100mL，50mL)；和50nMβ-巯基乙醇(ThermoFisher目录号31350010，50nm储液，0.5mL，最终浓度50微摩尔)。
实验设置：对于每种类型的抗原呈递珠(二氧化硅或聚合物，如本实施例中上面制备的)，使用单个96组织培养处理的孔板(VWR目录号10062-902)。将二氧化硅抗原呈递珠与CD8+T淋巴细胞以约1:2珠:细胞混合。将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到具有大约1e5个抗原呈递珠的每个孔中(孔板1)。将聚合物抗原呈递珠与CD8+T淋巴细胞以约1:1珠:细胞混合。将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到具有大约2e5个抗原呈递珠的每个孔中(孔板2)。
将每个孔板在37℃下培养。在第0天，将CTL培养基中的IL-21(150ng/毫升)添加到孔板1和2的每个孔中，提供每个孔中30ng/mL的最终浓度。在第2天，将IL21添加到孔板的每个孔中，至最终浓度为30ng/mL。培养继续至第7天。
第7天。再次刺激。将第二等份抗原呈递珠添加到孔板1和孔板2中的相应孔中。对于二氧化硅珠，添加大约1e5个珠(如本实施例中上面制备的二氧化硅珠)。对于聚合物珠，添加大约2e5个珠(如本实施例中上面制备的盘绕的聚合物珠)。将IL21添加到孔板的每个孔中至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第8天。向孔板1和孔板2中的每个孔中添加50微升IL-2(50IU/mL)和IL-7(25ng/mL)，分别提供10IU/mL和5ng/mL的最终浓度。继续培养。
第9天。向孔板1和孔板2的每个占用的孔中添加50微升IL-21(150ng/mL)至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第14天。对每个孔板的孔单独针对以下进行染色：MHC四聚体(Tetramer PE，MBL目录号T02000，1微升/孔)、CD4(Biolegend目录号300530，0.5微升/孔)；CD8(Biolegend目录号301048，0.5微升/孔)；CD28(Biolegend目录号302906，0.31微升/孔)；CD45RO(Biolegend目录号304210，0.63微升/孔)；CCR7(CD197，Biolegend目录号353208，0.5微升/孔)；和活力(BD目录号565388，0.125微升/孔)。将每个孔用150微升FACS缓冲液和10微升CountbrightTM珠(ThermoFisher目录号C36950)再悬浮。在FACSCelestaTM流式细胞仪(BD Biosciences)上进行FACS分析。
图17B显示了使用聚合物或二氧化硅抗原呈递珠扩增后阳性孔(其中SLC45A2特异性T细胞扩增至占孔中活细胞的0.5％或更多)的百分比。图17C显示了用聚合物或二氧化硅抗原呈递珠扩增后的SLC45A2 T细胞频率(每孔中活细胞的％)。图17D显示了每个孔中SLC454A2 T细胞的总数。图17E显示了孔中表达高水平CD28的SLC45A2 T细胞的百分比，表明分化成记忆T细胞的潜力。从这些图中可以看出，二氧化硅抗原呈递珠产生阳性孔，并且二氧化硅抗原呈递珠与聚合物抗原呈递珠一样好或更好地扩增SLC45A2 T细胞。此外，二氧化硅抗原呈递珠产生高表达CD28的细胞，表明它们支持记忆前体T细胞的形成，这是细胞产品所需的表型。
对于聚合物珠，盘绕的表面使得珠直径和表面积之间的关系不那么简单。从定量可以确定，基于M-280DynaBead的聚合物抗原呈递珠在其表面上具有约480,000个pMHC分子和425,000个共刺激抗体。对于半径为1.4微米的球体(等于M-280DynaBead的标称半径)，这相当于每平方微米约20,000个pMHC和17,000个共刺激抗体。然而，由于聚合物珠的盘绕的表面，实际表面积可能更大，因此实际密度更低。然而，从图17F、17G和17H可以看出，这些珠可以用作抗原呈递珠衬底以扩增大量抗原特异性T细胞。此外，从图17I可见，这些抗原呈递珠产生大量具有CD28高表达的抗原特异性T细胞，其表明记忆前体表型。
实施例14.具有确定的配体密度的抗原呈递珠的制备
实施例14A.1.链霉亲和素呈递珠的制备。制备了pMHC(HLA-A*02:01SLC45A2(Biolegend，定制产品，SLYSYFQKV)在洗涤缓冲液中的三倍系列稀释液。将20微升洗涤缓冲液添加到微量离心管中，以进行每次系列稀释。向第一个系列稀释管中添加10微升pMHC。通过涡旋混合稀释的pMHC。然后使用10uL稀释的pMHC混合物来制备随后的系列稀释液，总共七个稀释液。
为了确定pMHC在溶液中的浓度与沉积在珠上的密度(分子/单位面积)之间的关系，首先通过将如实施例1B中制备的生物素功能化(共价偶联)的光滑(例如，如上所述的基本上球形)的4微米单分散二氧化硅珠(目录号SiO2MS-1.8 4.08um-1g,Cospheric)储存在100微摩尔链霉亲和素中而将其用链霉亲和素包被。将大约1e7个珠稀释到微量离心管中的1毫升洗涤缓冲液中进行洗涤，然后以1,000xg离心1分钟。通过抽吸小心地去除上清液，并将洗涤过程再重复两次。洗涤后，将大约1e6个珠转移至八个微量离心管中，再次离心，并小心去除上清液。
实施例14A.2.制备具有一系列MHC浓度的珠。将含有4.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01SLC45A2(Biolegend，定制产品，SLYSYFQKV)的洗涤缓冲液(120微升)分配到其中一个微量离心管中，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。将未稀释的pMHC和pMHC的系列稀释液进一步稀释到洗涤缓冲液(120微升)中，并用于使珠再悬浮，从而使珠悬浮在每5e6个珠含有4.5、1.5、0.5、0.167、0.056、0.019、0.006或0.002微克pMHC单体的溶液中。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管离心，去除上清液，并将珠以大约5e7/毫升再悬浮。
用洗涤缓冲液(1毫升)洗涤用每个浓度的pMHC制备的大约1e5个珠。将珠样品再悬浮于100微升洗涤缓冲液中，并通过添加1微升APC缀合的抗HLA-A(Biolegend，目录号343308)进行染色。将珠与抗体混合并在黑暗中染色30分钟。染色后，将珠洗涤，再悬浮于洗涤缓冲液(200微升)中并转移至管中以通过流式细胞术进行分析。
然后制备一组量子简单细胞荧光定量珠(Bangs Labs，目录号815)以确定与每个抗原呈递珠样品结合的抗HLA-A抗体的数目。定量珠具有由制造商确定的抗体结合能力。将具有预定结合能力的每种珠的一滴放入装有50微升洗涤缓冲液的微量离心管中。向管中添加5微升APC缀合的抗HLA-A并通过涡旋混合。将珠在黑暗中染色30分钟，使用与上述相同的方法洗涤。然后将具有不同结合能力的珠汇集到一个样品中并转移到单个管中。添加一滴空白珠(无抗体结合能力)，并通过流式细胞术分析珠。
通过流式细胞术(BD FACSCelesta，Becton Dickinson and Company)记录5,000个事件来分析定量珠。通过前向散射和侧向散射来识别定量珠，并记录每个珠的APC通道中的中值强度。如实施例13A所述计算定量，使用定量珠制造商提供的专有方法。然后可以从抗原呈递珠标准品确定具有珠的溶液中pMHC的浓度，所述溶液产生具有目标pMHC密度的抗原呈递珠，例如每平方微米具有大约10,000、1,000或100个pMHC分子的珠，如图18A所示。
实施例14A.3.共刺激分子浓度变化。制备了生物素化的抗CD28和抗CD2在洗涤缓冲液中的三倍连续稀释液。将20微升抗CD28与20微升抗CD2在微量离心管中混合。然后将洗涤缓冲液(20微升)添加到微量离心管中，用于每次连续稀释。然后将抗CD28/抗CD2混合物(10微升)添加到第一个系列稀释管中。使用涡旋器混合溶液，然后使用10uL稀释的抗CD28/抗CD2混合物来制备随后的系列稀释液，总共七个稀释液。
为了对溶液中的共刺激抗体与沉积在珠上的密度(分子/单位面积)之间的关系进行定量，首先通过将如实施例14A.1中制备的具有链霉亲和素结合部分的大约1e7个基本上球形的4微米二氧化硅珠稀释到微量离心管中的1毫升洗涤缓冲液，然后以1,000xg离心1分钟以对其进行洗涤。通过抽吸小心地去除上清液，并将洗涤过程再重复两次。洗涤后，将大约1e6个珠转移至八个微量离心管中，再次离心，并小心去除上清液。
首先用洗涤缓冲液(1,200微升)中的1.0微克pMHC对珠进行功能化。洗涤后，将珠再悬浮在洗涤缓冲液(1,000微升)中。将100微升pMHC功能化的珠分散到八个微量离心管中。将珠离心，并小心地去除上清液。
将未稀释的混合的抗CD28和抗CD2以及抗CD28/抗CD2的连续稀释液进一步稀释到洗涤缓冲液(120微升)中并用于使珠再悬浮，从而使珠悬浮在每5e6个珠具有4.5、1.5、0.5、0.167、0.056、0.019、0.006或0.002微克混合的共刺激抗体单体的溶液中。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管离心，去除上清液，并将珠以大约5e7/毫升再悬浮。
用洗涤缓冲液(1毫升)洗涤用每种浓度的共刺激抗体制备的大约1e5个珠。将珠样品再悬浮于100微升洗涤缓冲液中，并通过添加1微升APC缀合的单克隆抗小鼠IgG1(Biolegend，目录号406610)进行染色。将珠与抗体混合并在黑暗中染色30分钟。染色后，将珠洗涤，再悬浮于洗涤缓冲液(200微升)中并转移至管中以通过流式细胞术进行分析。
然后制备了一组量子简单细胞荧光定量珠(Bangs Labs，目录号815)以确定与每个抗原呈递珠样品结合的APC抗小鼠IgG1抗体的数目。将具有预定结合能力的每种珠的一滴放入装有50微升洗涤缓冲液的微量离心管中。向管中添加5微升APC缀合的抗小鼠IgG1，并通过涡旋混合。将珠在黑暗中染色30分钟，使用与上述相同的方法洗涤。然后将具有不同结合能力的珠汇集到一个样品中并转移到单个管中。添加一滴空白珠(无抗体结合能力)，并通过流式细胞术分析珠。
通过流式细胞术(BD FACSCelesta，Becton Dickinson and Company)记录5,000个事件来分析定量珠。通过前向散射和侧向散射来识别定量珠，并记录每个珠的APC通道中的中值强度。使用定量珠制造商提供的专有方法，如实施例13A中所述进行定量。该定量方法计算每个抗原呈递珠上APC抗小鼠IgG1抗体的数目。假设1个抗小鼠IgG1抗体与抗原呈递珠上的一个共刺激抗体结合，则该值代表每个珠上的共刺激抗体的数目。然后可以从抗原呈递珠标准品确定具有珠的溶液中共刺激抗体的浓度，所述溶液产生具有目标共刺激抗体密度的抗原呈递珠，例如每平方微米具有约10,000、1,000或100个共刺激分子的珠，如图18B所示。
实施例14B.使用具有不同配体密度的抗原呈递珠扩增抗原特异性T细胞。通过使用pMHC和共刺激抗体浓度相对于所得抗原呈递珠上的密度的关系图(图18A)，确定应当使用什么浓度的每种pMHC来制备每平方微米珠表面具有约10,000、约1,000或约100个pMHC的抗原呈递珠。重复该过程以确定用于制备每平方微米珠表面具有约10,000、约1,000或约100个共刺激抗体的抗原呈递珠的抗CD28和抗CD2的浓度。
实施例14B.1.首先通过将如实施例14中制备的生物素功能化(共价偶联)的光滑二氧化硅珠储存在100微摩尔链霉亲和素中而将其用链霉亲和素包被。通过将大约5e7个珠稀释到微量离心管中的1毫升洗涤缓冲液中，然后以1,000xg离心1分钟而对其进行洗涤。通过抽吸小心地去除上清液，并将洗涤过程再重复两次。洗涤后，将大约5e6个珠转移至三个微量离心管中，再次离心，并小心去除上清液。
实施例14B.2.为了制备具有滴定的pMHC的抗原呈递珠，将含有0.5、0.056或0.006微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01MART-1(MBL International Corp.，目录号MR01008，ELAGIGILTV)的洗涤缓冲液(600微升)分配到三个微量离心管中，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。
使用含有1.0微克混合的生物素化的抗CD28和生物素化的抗CD2的洗涤缓冲液(600微升)来再悬浮每个珠样品，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使抗体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。最后，将珠再悬浮在100微升洗涤缓冲液中。通过流式细胞术分析并与定量珠比较，验证了珠加载有期望数量级的pMHC和抗体。
使用含有1.0微克抗CD28和抗CD2的洗涤缓冲液(600微升)再悬浮每个珠样品，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。最后，将珠再悬浮在100微升洗涤缓冲液中。通过流式细胞术分析并与定量珠比较，验证了珠加载有期望数量级的pMHC。
实施例14B.3.为了制备具有滴定的共刺激抗体的抗原呈递珠，将含有1.5微克生物素化的单体MHC(HLA-A*02:01MART-1(MBL International Corp.，目录号MR01008，ELAGIGILTV)的洗涤缓冲液(1,200微升)分配到来自实施例14.B.1的含有1.5e7个经洗涤的珠的微量离心管中，并通过移液器上下吸取使珠再悬浮。使单体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。
然后将珠再悬浮于洗涤缓冲液(900微升)中，并将300微升珠转移至3个微量离心管中。
将具有1.0微克混合的抗CD28和抗CD2、0.111微克混合的抗CD28和抗CD2或者0.012微克混合的抗CD28和抗CD2的洗涤缓冲液(300微升)混合到三个珠样品中，并且通过移液器上下吸取使珠充分混合。抗体在4℃下结合30分钟。15分钟后，再次用移液器上下吸取混合物。将管以1,000xg离心一分钟，并去除上清液。最后，将珠再悬浮在100微升洗涤缓冲液中。通过流式细胞术分析并与定量珠比较，验证了珠上加载有期望数量级的共刺激抗体。
实施例14B.4.刺激。细胞：按照制造商针对EasySepTM人CD8+T细胞分离试剂盒(来自StemCell Technologies Canada Inc.的市售试剂盒(目录号17953))的说明，通过负选择，在包含RPMI和10％胎牛血清(FBS)的培养基中从市售的PBMC中富集CD8+T淋巴细胞。
用于试剂添加的培养基和稀释剂：高级RPMI(ThermoFisher目录号12633020，500mL)；1x GlutaMAX(ThermoFisher目录号35050079，5mL)；10％人AB血清(zen-bio，目录号HSER-ABP 100mL，50mL)；和50nMβ-巯基乙醇(ThermoFisher目录号31350010，50nm储液，0.5mL，最终浓度50微摩尔)。
实验设置：对于每种激活物质滴定(pMHC或共刺激抗体)，使用单个96组织培养处理的孔板(VWR目录号10062-902)。将每平方微米珠表面具有约10,000、约1,000或约100个pMHC且每平方微米珠表面具有约10,000个共刺激抗体的抗原呈递珠(来自实施例14.B.2)与CD8+T淋巴细胞以约1:2珠:细胞混合。将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到具有大约1e5个抗原呈递珠的每个孔中(孔板1)。将每平方微米珠表面具有约10,000个pMHC且每平方微米珠表面具有约10,000、约1,000或约100个共刺激抗体的抗原呈递珠(来自实施例14.B.3)与CD8+T淋巴细胞以约1:2珠:细胞混合。将CD8+T淋巴细胞(2e5)(80-90％纯)添加到具有大约1e5个抗原呈递珠的每个孔中(孔板2)。
将每个孔板在37℃下培养。在第0天，将CTL培养基中的IL-21(150ng/毫升)添加到孔板1和2的每个孔中，提供每个孔中30ng/mL的最终浓度。在第2天，将IL21添加到孔板的每个孔中，至最终浓度为30ng/mL。培养持续至第7天。
第7天。再次刺激。将具有目标密度的pMHC或共刺激抗体的第二等份抗原呈递珠添加到孔板1和孔板2中的相应孔中。将IL21添加到孔板的每个孔中至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第8天。向孔板1和孔板2中的每个孔中添加50微升IL-2(50IU/mL)和IL-7(25ng/mL)，分别提供10IU/mL和5ng/mL的最终浓度。继续培养。
第9天。向孔板1和孔板2的每个占用的孔中添加50微升IL-21(150ng/mL)至最终浓度为30ng/mL。继续培养。
第14天。对每个孔板的孔分别针对以下进行染色：MHC四聚体(Tetramer PE，MBL目录号T02000，1微升/孔)、CD4(Biolegend目录号300530，0.5微升/孔)；CD8(Biolegend目录号301048，0.5微升/孔)；CD28(Biolegend目录号302906，0.31微升/孔)；CD45RO(Biolegend目录号304210，0.63微升/孔)；CCR7(CD197，Biolegend目录号353208，0.5微升/孔)；和活力(BD目录号565388，0.125微升/孔)。将每个孔用150微升FACS缓冲液和10微升CountbrightTM珠(ThermoFisher目录号C36950)再悬浮。在FACSCelestaTM流式细胞仪(BD Biosciences)上进行FACS分析。图18C显示了每个孔中使用具有各种密度的pMHC/平方微米的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的数目。图18D显示了来自图18C的MART1特异性T细胞上的CD127(记忆前体T细胞的标志物)的表达水平。从这些图中可以看出，当密度为约100个pMHC/平方微米或更高时，MART1特异性T细胞的数目以及这些细胞上CD127的表达对pMHC密度不敏感。
图18E显示了每个孔中使用具有各种密度的共刺激抗体/平方微米的抗原呈递珠扩增的MART1特异性T细胞的数目。图18F显示了来自图18E的MART1特异性T细胞上的CD127(记忆前体T细胞的标志物)的表达水平。从这些图中可以看出，MART1特异性T细胞的数目以及这些细胞上CD127的表达对共刺激抗体密度敏感。珠被制备为具有每平方微米约10,000个共刺激抗体，这几乎饱和了珠的生物素结合位点(参见图18B)，其产生了最高数目的抗原特异性T细胞，并且这些细胞表达最高水平的CD127。随着共刺激配体的数目减少到加载范围的下限，由pMHC产生的主要刺激没有有效地被共刺激，并且细胞产物的表型受到影响。
实施例15.微流体装置内抗原特异性细胞毒性测定的性能
实验设计：在芯片上T细胞杀伤测定中测试了从黑色素瘤细胞获得的包括Mel 526细胞和A375细胞的肿瘤细胞系。每个细胞系均根据标准程序在体外培养，然后用CellTraceTM Far Red染料(目录号C34572，ThermoFisher Scientific)进行标记，提供稳定的细胞内标记。使每个标记的肿瘤细胞群在补充有10uM荧光团Caspase-3底物(DEVD，绿色)(488，目录号10403，Biotium)的T细胞培养基(Adv.RPMI+10％人AB血清(目录号35-060-CI，Corning)+Gln+50uM 2-巯基乙醇(BME，目录号31350-010，Gibco，ThermoFisher Scientific)中流入到单个微流体芯片(Berkeley Lights,Inc.)中。通过倾斜微流控芯片并允许重力将肿瘤细胞拉到隔离坞中，将标记的肿瘤细胞的组(约2-10个)加载到两个微流体芯片(一个用于Mel 526细胞，一个用于A375细胞)中的每一个上的多个隔离坞中的每一个中，在时间＝0时提供5uM的Caspase-3底物的最终浓度，用于每个微流体芯片的测定。Caspase-3底物在裂解之前不提供荧光信号，因此在时间＝0时，由于该试剂，没有荧光信号。根据如上所述的内源性T细胞(ETC)方案，针对SLC45A2抗原扩增的T细胞流入到两个微流体芯片中的每一个中，并通过重力加载到每个相应芯片的肿瘤细胞的顶部。通常，在加载肿瘤细胞和T细胞后，每个隔离坞中每个T细胞含有0-5个肿瘤细胞。如每个时间点和分别含有SLC45A2特异性T细胞和Mel526肿瘤细胞(图19A)以及SLC45A2特异性T细胞和A375细胞(图19B)的每个微流体芯片的明场图像(BF)所示，存在细胞群。将补充有5uMCaspase-3底物(绿色)(来自Biotium的Nucview 488)的T细胞培养基(Adv.RPMI+10％人AB血清+Gln+50uM BME)灌注通过每个微流控芯片上的微流控通道，并且每30分钟拍摄一次隔离坞的图像(从T细胞加载结束开始)，持续7小时。CellTrace Far Red标记并裂解，现在使用不同的荧光立方体(分别为Cy5、FITC)对荧光Caspase-3标记物进行可视化。/>
Mel526黑色素瘤细胞系表达SLC45A2肿瘤相关的抗原，并且预计会被SLC45A2特异性T细胞靶向并杀死。A375黑色素瘤细胞系不表达SLC45A2肿瘤相关的抗原，并且预计不会被SLC45A2特异性T细胞靶向或杀死，因此被用作T细胞细胞毒性的阴性对照。
结果：Mel526肿瘤细胞(图19A)和A375肿瘤细胞(图19B)表现出CellTrace FarRed信号(Cy5荧光立方体)，但在1小时时间点没有表现出与Caspase-3底物的裂解相关的信号(绿色荧光信号，FITC荧光立方体)。随着时间的推移，与Caspase-3底物的裂解相关的绿色荧光信号在Mel526肿瘤细胞中增加(图19A，显示直至7小时时间点)，但在A375肿瘤细胞中则没有增加(图19B，显示直至7小时时间点)。结果表明Mel526肿瘤细胞被SLC45A2特异性T细胞有效地杀死，图19A中含有Mel526肿瘤细胞的8个隔离坞中的6个显示出高水平的Caspase-3底物裂解。图19C显示了在实验过程中抗原特异性Mel526肿瘤细胞杀伤程度与A375非靶向细胞的细胞杀伤程度的定量。对于A375非靶向细胞，观察到非常低量的SLC45A2特异性T细胞(分数)杀伤，而在同样的7小时时间段内SLC45A2特异性T细胞对Mel 526肿瘤细胞的靶向抗原特异性细胞杀伤接近0.25的分数杀伤。对于每个微流体芯片和每个时间点，每个荧光图像的曝光时间是相同的。对于任何一组细胞，经常会观察到来自Cell TraceFar Red染色的Cy5信号随着时间的推移而减少；观察到每种细胞类型的这种减少并不出人意料。
实施例16.珠刺激和细胞产物表征后抗原特异性T淋巴细胞的快速扩增
通常在完成前述实验中所述的抗原特异性T淋巴细胞激活后，在含有抗CD8-PerCPCy5.5(克隆RPA-T8，301032，Biolegend，San Diego，CA)、对抗原具有特异性的Tetramer-PE(MBL International，Woburn，MA)和用于排除死细胞的Zombie NIR(目录号423106，Biolegend，San Diego，CA)的FACS缓冲液(1XDPBS不含Ca2+Mg2+(目录号4190250，ThermoFisher)、5mM EDTA(目录号AM9260G，ThermoFisher)、10mM HEPES(目录号15630080，ThermoFisher)、2％ FBS)中室温染色30分钟之后，在FACSAria融合系统(BectonDickinson，San Jose，CA)上通过FACS对抗原特异性富集的T细胞进行分选。通过门控：大小、单个、活的、CD8阳性和四聚体阳性，将所需细胞纯度分选到含有2mM HEPES的CTL培养基中(高级RPMI(目录号12633020，ThermoFisher)，1x Glutamax(目录号35050079，ThermoFisher)，10％人血清(目录号MT35060CI，ThermoFisher)，50uM b-巯基乙醇(目录号31350010，ThermoFisher)。
然后，如Riddell，US 5,827,642中所述，在至少一轮快速扩增方案(REP)中扩增分选的抗原特异性T细胞。使用X射线辐照器，用100Gy辐照淋巴母细胞样细胞系细胞(LCL，LCL细胞系由Anderson癌症中心的Cassian Yee,M.D.赠送)，并用50Gy辐照来自3名供体的PBMC。经辐照的细胞在含有10％ FBS的RPMI中洗涤，并以1:5(LCL:PBMC)的比例混合。将这些经辐照的细胞添加到FACS分选的T细胞(用于第一个REP周期)，或以200至500倍过量添加到第一个REP周期的产物中。在补充有50U/mL IL-2(目录号202-IL，R&D Systems)和30ng/mL抗CD3抗体(目录号16-0037-85，ThermoFisher)的T细胞培养基(高级RPMI、10％人AB血清、GlutaMax、50uM b-巯基乙醇)中建立培养。在第2天、第5天和第10天用新鲜的IL-2饲养细胞，并根据其生长速度进行扩增。
在第一个REP周期中，扩增通常为1,000倍。REP1期间的扩增变化很大(316–7,800倍，数据未显示)。低输入细胞数目的不准确定量可能导致了这种可变性。图20A中显示的是第一个周期后第二个REP方案获得的倍数扩增(n＝20次实验，11个供体，12次STIM)。扩增范围为约200倍至约2000倍。然而，在这些实验中，特定细胞群的REP1和REP2的扩增程度之间没有明显的相关性。
在图20B中，显示了REP方案的20次实验的REP群中抗原特异性T细胞的百分比。观察到，在至少两个REP周期期间，保持了抗原特异性T细胞的高比例(％Ag+)，通常为约90％。相比之下，REP1后的低％Ag+导致REP2后的低％Ag+。
在图20C中，显示了在REP2完成后也表达共刺激受体CD27和CD28的抗原特异性T细胞的百分比。在图20D中，显示了在REP2完成后还表达CD127(中枢记忆表型的标志物，其可以预示体内持久性)的抗原特异性T细胞的百分比。虽然任何标志物的表达分布都不是紧密聚集的，并且一些单独的实验显示表达所需标志物的细胞很少(例如，百分之几)，但在每个这些实验中获得的细胞产物都证明了跨所有类别的足够阳性的表型，使它们成为体内引入的候选者。所看到的一些降低的值，例如CD28的表达，可能是由于在激活循环期间使用CD28配体的广泛刺激，导致这些表面标志物的表达降低。
在图20E中，显示了两轮REP后三个单独细胞群中每一个的抗原特异性细胞毒性测定的结果。如实施例15中所述进行测定，使用Mel526细胞作为靶癌细胞系并使用A375细胞作为非靶向细胞系，其中抗原特异性T细胞是SLC45A2特异性T细胞。在每个实验中，超过50％的靶向Mel526细胞表现出Caspase-3触发的荧光信号，而没有或只有百分之几的A375非靶向细胞表现出由Caspase-3底物的荧光裂解产物表明的凋亡行为。因此，激活的T细胞在经过所有轮次的激活和扩增后仍然表现出抗原特异性细胞杀伤行为。
因此，如本文所述的通过合成表面上的抗原呈递进行的激活过程可以提供适合用于免疫治疗的良好控制的、可再现的和可表征的细胞产品。与目前可用的实验过程相比，本文所述的抗原呈递表面为这些个体化疗法提供成本更低的制造。
实施例17.激活的T细胞和制剂的生产
分选和激活。PBMC的样品获自受试者，该受试者可以是患者。如果样品已被冷冻，则应将其解冻。将含有PBMC的管离心沉降，将细胞再悬浮于20ml RPMI培养基中，该培养基包含10％ FBS、25微克/ml DNaseI溶液(STEMCELL，目录号07900)，然后在室温下孵育10分钟。使用40微米50毫升管过滤器过滤混合物，并对活细胞进行计数。通常，这提供约1-6e7个细胞/ml并且活力大于约90-95％。将等份细胞离心沉降并再悬浮于50ml分离缓冲液中，并以3:1的DynaBeadsTM:细胞比例添加CD3/CD28磁性DynaBeadsTM珠(ThermoFisher)。例如，可以将6e8个DynaBeadsTM与2e8个细胞混合。将细胞/珠混合物引入到本文所述的盒的细胞培养室(例如生物反应器)中并在室温下搅动孵育30-40分钟。搅动可以包括例如来回摇动盒。在此孵育期间，CD3/CD28抗体包被的DynaBeadsTM与期望的T细胞群结合，而不与PBMC混合物的其他细胞类型结合，同时激活结合的T细胞。然后将磁体套件定位在盒的细胞培养室的底座表面附近约5分钟的时间，同时继续搅动盒(和相关联的细胞培养室)。磁体套件将DynaBeadsTM(以及与其结合的任何细胞)拉至细胞培养室的底座，然后从盒中取出上清培养基。将新等份(30-50ml)的分离缓冲液引入到细胞培养室中，并将珠:细胞混合物在持续搅动下孵育约5分钟。在此期间，磁体套件保持位于细胞培养室附近。在孵育后，在持续搅动下再次去除上清液。该洗涤过程重复总共10个循环：添加培养基、在磁体套件存在下搅动孵育，并吸出上清培养基。该程序提供了保留在盒中的高纯度的T细胞群(例如，具有大于约85％、约87％、约90％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的T细胞的群)。
模型盒富集。用简单的模型盒、具有凹坑表面的ulltem板和手动磁体应用(模型盒)富集PBMC群以获得期望的T细胞亚群的效率与使用标准台式涡旋和磁力下拉能力在管(Falcon管)中分选和激活(对照)进行了比较。纯度很重要，其中高百分比的CD3阳性T细胞和低百分比的不需要的细胞(例如CD19 B细胞、CD14单核细胞、CD56 NK细胞和CD235a红细胞)是理想的终点。如上所述制备的单个PBMC样品管被分成两部分。每个部分包含1e8个细胞。在模型盒中处理的样品按照前述段落中所述进行处理。对照样品的处理方式类似，但采用标准涡旋和磁力下拉。将对照样品用新鲜培养基洗涤四个循环，而不是对模型盒进行更广泛的洗涤。通过FACS检查模型盒和对照样品中存在的最终细胞群。从模型盒中分离的细胞群含有超过92％的T细胞，与使用标准台式管程序所获得的相比，这被认为是可接受的富集水平。
T细胞(％) B细胞(％) 单核细胞(％) NK/NKT(％)
起始供体细胞群 50.1144165 7.00228833 37.98627 4.89702517
对照(Falcon管) 99.009901 0.47590966 0.43452621 0.07966314
模型盒 92.0226131 1.5180067 5.77889447 0.68048576
作为该测试的一部分，还通过FACS检查了与洗涤液一起输出的细胞，以确定去除的不需要的细胞(B细胞、单核细胞、NK/NT)的比例以及期望的T细胞的损失程度。
对照样品洗涤液 T细胞(％) B细胞(％) 单核细胞(％) NK/NKT(％)
初始上清液 23.8496748 8.33534088 61.1900747 6.62490966
洗涤1 75.6039689 2.51294219 19.6289905 2.25409836
洗涤2 85.2314475 1.87887058 11.9659914 0.92369056
洗涤3 90.853047 1.80679354 5.17947483 0.55361903
洗涤4 92.669154 1.78481396 5.54603207 0
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使用此方法发现模型盒中T细胞的选择性保留。还发现来自洗涤的细胞损失是非限制性的，因为模型盒产生接近于使用标准台式方法获得的T细胞的80％。
对照细胞数目，分离后 模型盒细胞数目，分离后
28.7e6个细胞 22.7e6个细胞
盒上富集。在另一个实施例中，T细胞的富集和激活过程与上文类似地进行，但是使用本文所述的盒，其具有生物反应器室，该生物反应器室具有凹坑底座表面、流体和集成的微流体测定芯片。如上制备约2e8个PBMC，并与6e8个(3:1比例)CD3/CD28磁性DynaBeadsTM珠混合，输入到盒的生物反应器室中，并在旋转台上室温孵育。洗涤、搅动、施加磁力和输出按照上文针对模型盒实验所述进行，总共洗涤10次。每个等份的新培养基在120秒的期间内输入，上清液输出在180秒的期间内进行。通过FACS对供体细胞的初始群和最终富集的细胞产物进行分析，结果显示样品中T细胞富集高于97％。
T细胞(％) B细胞(％) 单核细胞(％)
初始供体细胞群 48.55156 6.257242 13.90498
盒内富集 97.65081 1.144734 0.746566
执行的洗涤总数可以是约5、6、7、8、9或更多，并且培养基输入和上清液输出的时间段可以根据需要变化。
激活。CD3CD28 DynaBeadsTM也在进行富集的同时激活。在如上所述富集的示例性细胞群中，通过FACS检查富集的T细胞群以评估表型。发现细胞具有CD28+、CD69+、CD45RO+和CD197+状态；CD28+/CD45RO+细胞占群的91％，CD197+细胞占群的90.6％，表明中枢记忆表型。因此，细胞被激活并适合扩增。
表现出CD8+表型的T细胞可能是一种有用的细胞疗法产品。或者，表现出CD4+表型的T细胞或CD8+和CD4+细胞的混合群可用作细胞疗法产品。CD4+/CD8+表型T细胞可以通过抗原特异性激活或引入外源基因(例如CAR或外源TCR)来进一步修饰。该工作流程可以支持CD3CD28包被的磁珠初始激活后的任何类型的附加激活或转导步骤。
扩增。富集的激活的T细胞在盒的生物反应器中扩增直至14天。扩增可以进行约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或更多天，同时维持激活状态并使耗尽的表型最小化。流体介质可以包括维持T细胞的健康和激活状态所必需的细胞因子或其他分子，同时防止过度刺激和耗尽的表型细胞的发育，该流体介质可以被定期递送至生物反应器(例如，每天、每隔一天、每3、4、5、6或7天一次，取决于细胞因子或其他分子)。扩增细胞的样品定期从生物反应器输出并在盒内递送至盒的测定部分(例如微流体芯片)。对样品进行细胞计数评估，可以每天、每隔一天进行或根据需要减少频率。细胞计数使用微流体芯片内的样品的光密度来测量，并且可以如本文所述在微流体芯片的大室或微流体通道内进行。T细胞在生物反应器中扩增以获得1e8、5e8、1e9或更多细胞的细胞群，其可能足以形成治疗剂量。
在一个实施例中，富集和激活的T细胞(从1e8细胞开始)在盒的生物反应器部分内扩增，如本文所述。培养基是CTL，其包括10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15以及PenStrep。通过从生物反应器中输出20ml上清液(生物反应器的总体积为40ml)并供应20ml新鲜培养基来替换去除的上清液来进行补料。在三天中的每一天重复此操作。从生物反应器中取出的小样品的每日细胞计数显示，活力维持在96％以上，并且在生物反应器内扩增的第四天结束时产生了5e8个细胞。
过程中分析。细胞计数/活力/表型。将样品从生物反应器输出并递送到盒(通常是微流体装置)的测定区域。微流体装置包括一个或多个通道，任选地具有从通道开口的隔离坞，以及允许成像的透明盖。这种微流体装置的非限制性示例在图1A-C和2A-H以及本文包含的相关描述中进行了描述。细胞在通道内输入时使用细胞计数算法进行计数。一种这样的有用算法在题为“微流体装置中微物体的自动检测和重新定位”的国际申请公开WO2018/102748中描述，其全部内容通过引用整体并入本文。该细胞计数用于计算生物反应器中的细胞密度/总细胞数。将细胞用从盒的试剂储存器输入到微流体装置中的吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)染色，以评估样品的活力。对于表型，输入细胞表面染色剂(例如，附接有荧光染料)来代替AO/PI。通过微流体装置的透明盖成像来进行检测，并确定表型。使用染色剂结合成像和细胞计数能力，可以确定表型特征的相对比例。
功能测定。来自生物反应器的样品被输出到盒(即微流体装置)的测定区域并测定杀死靶细胞的功能能力或评估感兴趣的细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL-2)的表达。将靶细胞从外部试剂源输入到微流体装置中，而不经过含有细胞产物的生物反应器。将执行细胞毒性和/或细胞因子测定的试剂类似地输入到微流体装置中，而不经过盒的生物反应器部分。例如，试剂可以储存在盒的试剂储存器中，并使用盒的流体网络的将试剂储存器连接到微流体装置的一部分输送到微流体装置。多重细胞因子释放测定和/或细胞毒性测定可以如题为“微流体装置中测定生物细胞的方法”的国际申请公开号WO2020/092975中所述进行，并且其内容通过引用整体并入本文。
其他测定。如果正在生产CAR工程化的T细胞，则根据需要进行其他测定，包括载体拷贝数测定。
制剂。在确定T细胞扩增是充分的和/或T细胞是有活力的并且具有有用的/期望的表型之后，将生物反应器中的扩增培养基更换为适合于储存或施用细胞产物的培养基。作为该配制过程的一部分，进行清洗以将饲喂成分或其他添加剂的水平降低至可接受的水平。可以调节细胞产物的浓度以适合储存/施用。然后，第一次将细胞产品从生物反应器中取出并从盒中输出，以根据需要进行储存/施用。
稀释/洗涤并不是获得最终制剂的唯一过程。对T细胞产物具有特异性并与金颗粒结合的抗体可以用于与期望的产物结合，并且可使用密度梯度将结合的细胞从盒中分离出来。可以使用市售系统，例如可从LevitasBio获得的系统。如本领域已知的，去除培养基、添加配制介质和建立期望的浓度或体积的其他方法可以在从盒中输出T细胞之后在盒外进行。
XV.本公开的一些实施方案的列举
1.一种用于制造细胞群的盒，其包括：具有入口端口和出口端口的密封外壳，其包括：连接到出口端口的第一流体网络；连接到第一流体网络的第一试剂储存器；连接到第一流体网络的第一分析区域；和用于培养细胞的室(例如生物反应器)，其中细胞培养室包括：用于将流体引入到室中的第一输入开口；用于从室中移出流体的第一输出开口；和用于从室中移出流体的第二输出开口；其中：细胞培养室通过第一流体网络连接至出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个；第一输出开口和第二输出开口位于细胞培养室内的不同垂直高度处；且细胞培养室的底座的内表面包括限定在其上的多个凹入特征。
2.如实施方案1所述的盒，其中细胞培养室是无菌的。
3.如实施方案1或2所述的盒，其中密封外壳是气密密封的和/或无菌的。
4.如实施方案1至3中任一项所述的盒，其中细胞培养室的第一输出开口位于细胞培养室的底座表面中或其附近，并且其中细胞培养室的第二输出开口位于底座表面上方。
5.如实施方案4所述的盒，其中第二输出开口位于或高于室中对应于室的垂直高度的15％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的位置。
6.如实施方案1至5中任一项所述的盒，其中第一流体网络包括多个通道，并且任选地，其中多个通道中的每个通道均具有约0.10mm2至约1.00mm2(例如约0.15mm2至约0.90mm2、约0.20mm2至约0.80mm2、约0.25mm2至约0.70mm2、约0.15mm2至约0.30mm2、约40mm2至约80mm2、约50mm2至约70mm2)的横截面积。
7.如实施方案6所述的盒，其中第一流体网络还包括一个或多个(例如多个)导流器(例如阀)。
8.如实施方案6或7所述的盒，其中第一流体网络包括连接至(例如经由中间通道)室的第一输出开口和/或第二输出开口并由此调节通过其中的流动的单个导流器(例如阀)，并且任选地，其中第一流体网络的单个导流器(例如阀)直接连接到室的第一输出开口和第二输出开口两者，并由此调节通过其中的流量。
9.如实施方案1至8中任一项所述的盒，其还包括：包括多个通道的第二流体网络，并且任选地，其中第二流体网络还包括一个或多个(例如多个)导流器(例如阀)。
10.如实施方案9所述的盒，其中第二流体网络连接至盒的入口端口和/或细胞培养室的第一输入开口。
11.如实施方案9或10所述的盒，其中第二流体网络连接到第一流体网络(例如，经由连接通道，并且任选地，其中通过连接通道的流动由一个或多个导流器(例如阀)调节)。
12.如实施方案1至11中任一项所述的盒，其还包括：用于细胞培养基的第一储存器，并且任选地，其中第一储存器连接至第二流体网络。
13.如实施方案12所述的盒，其中用于细胞培养基的第一储存器经由室的第一输入开口连接到细胞培养室。
14.如实施方案12或13所述的盒，其中用于细胞培养基的第一储存器包括位于盒内的第一隔室。
15.如实施方案12至14中任一项所述的盒，其中用于细胞培养基的第一储存器包括被配置成容纳流体的第一药物级袋，以及任选地，被配置成压缩所述第一药物级袋的套筒。
16.如实施方案1至15中任一项所述的盒，其还包括：用于收集废料的第二储存器，并且任选地，其中第二储存器连接至第一流体网络。
17.如实施方案16所述的盒，其中用于收集废物材料的第二储存器经由至少一个出口开口(例如，细胞培养室的第一出口开口、第二出口开口、或又一个出口开口)连接至细胞培养室。
18.如实施方案16或17所述的盒，其中用于收集废料的第二储存器包括位于盒内的第二隔室。
19.如实施方案16至18中任一项所述的盒，其中用于收集废料的第二储存器包括被配置成容纳流体的第二药物级袋。
20.如实施方案1至19中任一项所述的盒，其中室的底座表面上的多个凹入特征的每个凹入特征均具有(即，被配置成容纳)约200纳升至约5微升(例如约300纳升至约4.0微升、约400纳升至约3.0微升、约500纳升至约2.5微升、约500纳升至约1.5微升、约600纳升至约1.4微升、约700纳升至约1.3微升、约800纳升至约1.2微升、约900纳升至约1.1微升、约1.5微升至约2.5微升、约1.6微升至约2.4微升、约1.7微升至约2.3微升、约1.8微升至约2.2微升或约1.9微升至约2.1微升)的体积。
21.如实施方案1至20中任一项所述的盒，其中第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定半球形或圆锥形空腔。
22.如实施方案21所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:4(例如约1:2.5至约1:3.5或约1:3)的纵横比(即，细胞培养室的底座表面处的开口的直径:凹入特征的深度)。
23.如实施方案21或22所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约1500至4000个凹入特征(例如约1500至约3000、约1750至约2750、约2000至约2500、约2200至约2400、约2500至约4000、约2750至约3750、约3000至约3500或约3200至约3300个凹入特征)。
24.如实施方案21至23中任一项所述的盒，其中所述多个凹入特征的合计空腔体积为约1.5ml至约4.5ml(例如约2.0ml至约4.0ml、约2.0ml至约3.0ml、约2.25ml至约2.75ml、约3.0ml至约4.0ml或约3.25ml至约3.75ml)。
25.如实施方案1至20中任一项所述的盒，其中室的底座的内表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定细长空腔(例如，二等分的球形椭圆体或二等分的泪滴、二等分的卵或更一般地二等分的长椭球体形状的凹槽)，并且任选地，其中每个细长空腔的长轴基本上平行于多个凹入特征的每隔一个细长空腔的长入口。
26.如实施方案25所述的盒，其中每个细长空腔包括最深点，其中每个细长空腔的长轴包括第一端和第二端，其中由室的底座表面和连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度在45°至90°之间，并且其中由室的底座表面与连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度小于45°。
27.如实施方案25或26所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:5(例如约1:2.5至约1:4.5、约1:3至约1:4或约1:3.5)的纵横比(即，凹入特征的最宽部分处的宽度:凹入特征的长度)。
28.如实施方案25至27中任一项所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约500至1500个凹入特征(例如约500至约1200、约550至约1100、约600至约1000、约650至约900、约700至约850或约750至约800个凹入特征)。
29.如实施方案25至28中任一项所述的盒，其中所述多个凹入特征的合计空腔体积为约0.5ml至约3.0ml(例如约0.75ml至约2.5ml、约1.0ml至约2.0ml、约1.1ml至约1.9ml、约1.2ml至约1.8ml、约1.25ml至约1.75ml、约1.3ml至约1.7ml、约1.4ml至约1.6ml或约1.5ml)。
30.如实施方案1至29中任一项所述的盒，其中细胞培养室的底座表面和/或第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征被功能化(例如，被化学功能化)。
31.如实施方案30所述的盒，其中所述功能化包括聚合物(例如，亲水性聚合物，例如PEG聚合物、葡聚糖或其他生物相容性聚合物)。
32.如实施方案30或31所述的盒，其中所述功能化包括适合于激活T淋巴细胞(T细胞)的多肽。
33.如实施方案32所述的盒，其中所述多肽包含CD3激动剂(例如抗CD3激动剂抗体)。
34.如实施方案33所述的盒，其中所述多肽还包含TCR共激活分子(例如CD28激动剂，如抗CD28激动剂抗体)和/或TCR辅助激活分子(例如CD2激动剂，如抗CD2激动剂抗体)。
35.如实施方案30至34中任一项所述的盒，其中每个凹入特征的表面的仅一部分被功能化。
36.如实施方案35所述的盒，其中功能化的表面包括作为T细胞激活区域的第一区域和用表面封闭配体共价修饰的第二区域。
37.如实施方案36所述的盒，其中每个凹入特征的第一区域包括0.5mm2至1.0mm2的面积。
38.如实施方案1至37中任一项所述的盒，其中所述细胞培养室还包括用于控制室的内部体积的可移动盖。
39.如实施方案38所述的盒，其中室的可移动盖具有最大扩张位置，在此期间，室包括10立方厘米(cm3)至250cm3的体积(例如25cm3至225cm3、50cm3至200cm3、75cm3至175cm3或100cm3至150cm3的体积)。
40.如实施方案38或39所述的盒，其中室的可移动盖具有最小扩张位置，在此期间，室包括等于或小于50cm3(例如，等于或小于40cm3、30cm3、20cm3或10cm3)的体积。
41.如实施方案38至40中任一项所述的盒，其中可移动盖是气动致动的。
42.如实施方案1至41中任一项所述的盒，其中第一试剂储存器被配置成储存细胞因子(例如，L2、IL7、IL15或其任何组合)，并且任选地，其中第一试剂储存器具有约至少2ml的体积(例如约2ml至约20ml的体积)。
43.如实施方案1至42中任一项所述的盒，其还包括连接至第一流体网络的第二试剂储存器。
44.如实施方案43所述的盒，其中第二试剂储存器被配置成储存细胞因子(例如IL2、IL7、IL15或其任何组合)、用于转染/转化细胞的试剂(例如核酸试剂或与化学转染试剂配对的核酸试剂)或细胞染色试剂(例如荧光标记的化合物或用于评估细胞表型的抗体)，并且任选地，其中第一试剂储存器具有约至少2ml的体积(例如约2ml至约20ml的体积)。
45.如实施方案1至44中任一项所述的盒，其还包括三至八个试剂储存器，每个试剂储存器均可连接至第一流体网络或第二流体网络。
46.如实施方案1至45中任一项所述的盒，其中第一分析区域包括底座、盖以及设置在底座和盖之间的分析室，以及任选地，被配置成便于细胞计数(例如，以血细胞计数器的方式)的网格或基准。
47.如实施方案1至46中任一项所述的盒，其中第一分析区域被配置用于计数细胞和/或检测具有期望和/或不期望的表型的细胞。
48.如实施方案1至47中任一项所述的盒，其中第一分析区域包括微流体装置。
49.如实施方案1至48中任一项所述的盒，其中所述盒还包括第二分析区域。
50.如实施方案1至49中任一项所述的盒，其中第一流体网络连接至密封外壳的入口端口和密封外壳的出口端口两者。
51.如实施方案1至50中任一项所述的盒，其中细胞培养室是第一细胞培养室并且所述盒还包括第二细胞培养室，其中第二室包括：用于将流体引入到第二细胞培养室中的第一入口开口、用于从第二细胞培养室中移出流体的第一输出开口以及具有内表面的底座，其中第二细胞培养室的底座表面包括第二多个凹入特征。
52.如实施方案51所述的盒，其中第二细胞培养室的底座表面上的第二多个凹入特征中的每个凹入特征均缺乏T细胞激活表面。
53.如实施方案51或52所述的盒，其中第二细胞培养室还包括用于从第二细胞培养室中移出流体的第二输出开口，并且任选地，其中第二细胞培养室的第一输出开口和第二输出开口位于第二室内的不同垂直高度处。
61.一种用于制备细胞群的盒，其包括：具有入口端口和出口端口的密封的无菌外壳，其包括：连接到外壳的出口端口的第一流体网络；连接到第一流体网络的第一试剂储存器；连接到第一流体网络的第一分析区域；和用于培养细胞的室(例如生物反应器)，其中细胞培养室包括：用于将流体引入到细胞培养室中的第一输入开口；用于从细胞培养室中移出流体的第一输出开口；和用于从细胞培养室中移出流体的第二输出开口；其中：细胞培养室通过第一流体网络连接至出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个；第一输出开口和第二输出开口位于室内的不同垂直高度处；且室的底座的内表面包括限定在其上的多个凹入特征，其中第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定细长空腔(例如，二等分的球形椭球体或二等分的泪滴、二等分的卵或更一般地二等分的长椭球体形状的凹槽)，并且任选地，其中每个细长空腔的长轴基本上平行于多个凹入特征的每隔一个细长空腔的长入口。
62.如实施方案61所述的盒，其中每个细长空腔包括最深点，其中每个细长空腔的长轴包括第一端和第二端，其中由室的底座的内表面和连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度在45°至90°之间，并且其中由室的底座的内表面与连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度小于45°。
63.如实施方案61或62所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:5(例如，约1:2.5至约1:4.5、约1:3至约1:4或约1:3.5)的纵横比(即，凹入特征的最宽部分处的宽度:凹入特征的长度)。
64.如实施方案61至63中任一项所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约500至1500个凹入特征(例如约500至约1200、约550至约1100、约600至约1000、约650至约900、约700至约850或约750至约800个凹入特征)。
65.如实施方案61至64中任一项所述的盒，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约0.5ml至约3.0ml(例如约0.75ml至约2.5ml、约1.0ml至约2.0ml、约1.1ml至约1.9ml、约1.2ml至约1.8ml、约1.25ml至约1.75ml、约1.3ml至约1.7ml、约1.4ml至约1.6ml或约1.5ml)。
66.如实施方案61至65中任一项所述的盒，其中分析区域包括微流体装置。
67.如实施方案66所述的盒，其中微流体装置包括流动区域(例如，具有一个或多个微流体通道)，以及任选地，从流动区域打开的一个或多个隔离坞。
71.一种用于制造细胞群的盒，其包括：具有入口端口和出口端口的密封的无菌外壳，其包括：连接到外壳的出口端口的第一流体网络；连接到第一流体网络的第一试剂储存器；连接到第一流体网络的第一分析区域；和用于培养细胞的室(例如生物反应器)，其中细胞培养室包括：用于将流体引入到细胞培养室中的第一输入开口；用于从细胞培养室中移出流体的第一输出开口；和用于从细胞培养室中移出流体的第二输出开口；其中：细胞培养室通过第一流体网络连接至出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个；第一输出开口和第二输出开口位于室内的不同垂直高度处；且室的底座的内表面包括限定在其上的多个凹入特征，其中第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定半球形或圆锥形空腔。
72.如实施方案71所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:4(例如，约1:2.5至约1:3.5或约1:3)的纵横比(即，细胞培养室的底座表面处的开口的直径:凹入特征的深度)。
73.如实施方案71或72所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约1500至4000个凹入特征(例如，约1500至约3000、约1750至约2750、约2000至约2500、约2200至约2400、约2500至约4000、约2750至约3750、约3000至约3500或约3200至约3300个凹入特征)。
74.如实施方案71至73中任一项所述的盒，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约1.5ml至约4.5ml(例如，约2.0ml至约4.0ml、约2.0ml至约3.0ml、约2.25ml至约2.75ml、约3.0ml至约4.0ml或约3.25ml至约3.75ml)。
75.如实施方案71至74中任一项所述的盒，其中分析区域包括微流体装置。
76.如实施方案75所述的盒，其中微流体装置包括流动区域(例如，具有一个或多个微流体通道)，以及任选地，从流动区域打开的一个或多个隔离坞。
81.如前述实施方案中任一项所述的盒，其中细胞培养室包括适合于激活T淋巴细胞(T细胞)的抗原呈递表面(例如，底座表面和/或多个凹入空腔中的一个或多个(例如，基本上全部)凹入空腔的表面)，所述抗原呈递表面包括：多个主激活分子配体，其中每个主激活分子配体均包括主要组织相容性复合物(MHC)I类分子，其被配置成与T细胞的T细胞受体(TCR)结合；以及多个共激活分子配体，每个共激活分子配体均包括TCR共激活分子或辅助TCR激活分子，其中多个主激活分子配体和多个共激活分子配体中的每一个均特异性地结合至抗原呈递表面。
82.如实施方案81所述的盒，其中多个共激活分子配体包括TCR共激活分子和辅助TCR激活分子。
83.如实施方案81或82所述的盒，其中多个共激活分子配体的TCR共激活分子与辅助TCR激活分子的比例为约100:1至约1:100(例如，约10:1至约1:20、约10:1至约1:10、约3:1至约1:3、约2:1至约1:2或约1:1)。
84.如实施方案81至83中任一项所述的盒，其中多个主激活分子配体在其所附接的每个部分或子区域中以每平方微米约4×102至约3×104个分子(例如每平方微米约4×102至约2×103个分子、每平方微米约2×103至约5×103个分子、每平方微米约5×103至约2×104个分子、每平方微米约1×104至约2×104个分子或者每平方微米约1.25×104至约1.75×104个分子)的密度设置在抗原呈递表面的至少一部分上。
85.如实施方案84所述的盒，其中多个主激活分子配体以规定的密度设置在基本上所有抗原呈递表面上。
86.如实施方案81至85中任一项所述的盒，其还包括多个表面封闭分子配体。
87.如实施方案81至86中任一项所述的盒，其中辅助TCR激活分子被配置成提供贴附刺激。
88.如实施方案81至87中任一项所述的盒，其中多个共激活分子配体以每平方微米约5×102至约2×104个分子、每平方微米约5×102至约1.5×104个分子、每平方微米约5×102至约2×103个分子、每平方微米约2×103至约5×103个分子、每平方微米约5×103至约2×104个分子、每平方微米约5×103至约1.5×104个分子、每平方微米约1×104至约2×104个分子、每平方微米约1×104至约1.5×104个分子、每平方微米约1.25×104至约1.75×104个分子或者每平方微米约1.25×104至约1.5×104个分子的密度设置在抗原呈递表面的至少一部分上。
89.如实施方案88所述的盒，其中多个共激活分子配体以规定的密度设置在基本上所有抗原呈递表面上。
90.如实施方案81至89中任一项所述的盒，其中存在于抗原呈递表面上的主激活分子配体与共激活分子配体的比例为约1:10至约2:1、约1:5至至约2:1、约1:2至约2:1、约1:10至约1:1、约1:5至约1:1、约1:1至约2:1或约1:2至约1:1。
91.如实施方案81至90中任一项所述的盒，其中MHC分子还包括肿瘤特异性抗原。
92.如实施方案91所述的盒，其中肿瘤特异性抗原与MHC分子非共价结合。
93.如实施方案81至92中任一项所述的盒，其中TCR共激活分子包括蛋白。
94.如实施方案93所述的盒，其中TCR共激活蛋白分子包括CD-28结合蛋白或其保留与CD28的结合能力的片段。
95.如实施方案94所述的盒，其中CD28结合蛋白包括CD80分子或其片段，其中该片段保留与CD28的结合能力。
96.如实施方案94所述的盒，其中TCR共激活分子包括抗CD28抗体或其片段，其中该片段保留与CD28的结合活性。
97.如实施方案81至96中任一项所述的盒，其中辅助TCR激活分子配体包括CD2结合蛋白或其片段，其中该片段保留与CD2的结合能力。
98.如实施方案97所述的盒，其中辅助TCR激活分子配体包括CD58分子或其片段，其中该片段保留与CD2的结合活性。
99.如实施方案97所述的盒，其中辅助TCR激活分子包括抗CD2抗体或其片段，其中该片段保留与CD2的结合活性。
100.如实施方案86所述的盒，其中：
(i)多个表面封闭分子配体中的每一个均包括亲水性部分、两亲性部分、两性离子部分和/或带负电部分；
(ii)多个表面封闭分子配体中的每一个均包括接头和末端表面封闭基团，任选地，其中多个表面封闭分子配体的接头具有相同长度或不同长度；或者
(iii)多个表面封闭分子配体中的每一个均包括接头和末端表面封闭基团，其中末端表面封闭基团包含亲水性部分、两亲性部分、两性离子部分和/或带负电部分，任选地，其中多个表面封闭分子配体的接头具有相同长度或不同长度。
101.如实施方案81至90100所述的盒，其中：
(i)多个表面封闭分子配体均具有相同的末端表面封闭基团；或者
(ii)多个表面封闭分子配体具有末端表面封闭基团的混合物；
任选地，其中多个表面封闭分子配体中的每一个均包括聚乙二醇(PEG)部分、羧酸部分或其组合，还任选地，其中每个表面封闭分子配体的PEG部分具有约10个原子至约100个原子的主链线性链长。
102.如实施方案81至101中任一项所述的盒，其还包括多个生长刺激分子配体，其中每个生长刺激分子配体均包括生长因子受体配体。
103.如实施方案102所述的盒，其中生长因子受体配体包括细胞因子或其片段，其中该片段保留受体结合能力，任选地，其中细胞因子包括IL-21。
104.如实施方案81至103中任一项所述的盒，其中抗原呈递表面还包括第一部分和第二部分，其中多个主激活分子配体的分布和多个共激活分子配体的分布位于抗原呈递表面的第一部分中，并且第二部分被配置成基本上排除主激活分子配体。
105.如实施方案104所述的盒，其中至少一个多个表面封闭分子配体位于抗原呈递表面的至少一个内表面的第二部分中。
151.一种用于操作盒的系统(或仪器)，包括：能够容纳盒的接收元件；第一加热和冷却元件；多个空气流量调节器(例如，用于加压空气组分的阀)，每个调节器能够与盒接合并可控制地且独立地向盒提供加压气体；致动器，其用于致动(例如，振荡、倾斜和/或摇动)盒，从而搅动盒内存在的流体；以及与第一加热和冷却元件、多个空气流量调节器和致动器通信的控制器模块(例如系统控制器)；其中，控制器模块能够控制：加热和冷却元件的设置，从而调节盒的细胞培养室的温度；多个空气流量调节器中的每个调节器，从而控制盒内的流体操作；和致动器，从而可控制地搅动盒内存在的流体。
152.如实施方案151所述的系统(或仪器)，其中所述盒是如实施方案1至105中任一项所述的盒，并且任选地，其中所述系统还包括如实施方案1至105中任一项所述的盒。
153.如实施方案151或152所述的系统，其还包括被配置为与盒和接收元件接合的盒保持器。
154.如实施方案153所述的系统，其中盒保持器被配置成至少部分地包围所述盒。
155.如实施方案153或154所述的系统，其中第一加热和冷却元件由盒保持器包括或者位于盒保持器附近，以便当盒与盒保持器接合时靠近盒的细胞培养室。
156.如实施方案153至155中任一项所述的系统，其中接收元件包括多个杆，所述盒保持器能够可滑动地安装在所述多个杆上。
157.如实施方案153至156中任一项所述的系统，其中用于致动盒的致动器被配置成移动、倾斜、摇动或振荡盒保持器和/或接收元件，从而移动、倾斜、摇动或振荡所述盒。
158.如实施方案151至157中任一项所述的系统(或仪器)，其还包括成像模块，该成像模块适合于当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时使盒的分析区域中存在的细胞可视化。
159.如实施方案158所述的系统(或仪器)，其中成像模块包括检测器(例如相机，如数码相机)，以及任选的光学系统。
160.如实施方案151至159中任一项所述的系统(或仪器)，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当由处理器执行时，所述一系列指令使处理器执行自动计数和/或表征细胞(例如，当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时，盒的分析区域中存在的细胞)。
161.如实施方案151至160中任一项所述的系统(或仪器)，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当由处理器执行时，所述一系列指令使处理器检测细胞分泌和/或细胞-细胞相互作用，包括细胞激活、细胞扩增或细胞杀伤(例如，当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时，被盒的分析区域中存在的细胞杀伤)。
162.如实施方案151至161中任一项所述的系统(或仪器)，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当由处理器执行时，所述一系列指令激活电机以驱动接收元件以一定频率(例如共振频率)运动(例如，振荡、倾斜和/或摇动)，当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时，这导致在盒的细胞培养室(和/或第二细胞培养室)内生长的细胞再悬浮。
163.如实施方案151至162中任一项所述的系统(或仪器)，其还包括磁体套件(例如磁性组件，其可以包括支撑件和至少一个磁体)，当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时，所述磁体套件可以定位在盒的细胞培养室附近。
164.如实施方案163所述的系统(或仪器)，其中磁体套件可移动地安装在系统(或仪器)内，并且任选地，其中控制器模块(例如系统控制器)能够控制磁体套件的位置，从而控制磁体套件与盒的细胞培养室的接近。
201.一种制备适合配制为细胞治疗剂的细胞群的方法，该方法包括：将来自受试者的细胞样品引入到盒(例如，本文公开的盒)的入口端口中；将细胞样品从盒的入口端口输送至盒的细胞培养室(例如生物反应器)；在适合细胞增殖的条件下在盒的细胞培养室中孵育细胞样品；搅动盒以再悬浮增殖的细胞样品；将增殖的细胞样品的第一部分从盒的细胞培养室转移至盒的第一分析区域；分析增殖的细胞样品的第一部分的细胞计数和/或细胞特征；任选地，重复孵育、搅动、转移和分析步骤一次或多次以产生进一步增殖的细胞样品；以及从盒中输出增殖的(或进一步增殖的)细胞样品，其中引入细胞样品之后直到输出增殖的(或进一步增殖的)细胞样品的所有步骤均在盒内进行(即，无需从盒中取出细胞样品)。
202.如实施方案201所述的方法，其中所述盒是如实施方案1至105中任一项所述的盒。
203.如实施方案201或202所述的方法，其中细胞样品来自人类受试者。
204.如实施方案201至203中任一项所述的方法，其中细胞样品是PBMC样品。
205.如实施方案204所述的方法，其中细胞样品是富集了T细胞的分级的PBMC样品，并且任选地，其中T细胞富集至少部分地在盒上(例如，在盒的细胞培养室中)进行。
206.如实施方案201至205中任一项所述的方法，其中盒的细胞培养室的内部底座表面包括多个凹入特征。
207.如实施方案206所述的方法，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均限定半球形或圆锥形空腔。
208.如实施方案207所述的方法，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:4(例如，约1:2.5至约1:3.5或约1:3)的纵横比(即，细胞培养室的底座表面处的开口的直径:凹入特征的深度)。
209.如实施方案207或208所述的方法，其中多个凹入特征包括约1500至4000个凹入特征(例如，约1500至约3000、约1750至约2750、约2000至约2500、约2200至约2400、约2500至约4000、约2750至约3750、约3000至约3500或者约3200至约3300个凹入特征)。
210.如实施方案207至209中任一项所述的方法，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约1.5ml至约4.5ml(例如，约2.0ml至约4.0ml、约2.0ml至约3.0ml、约2.25ml至约2.75ml、约3.0ml至约4.0ml或者约3.25ml至约3.75ml)。
211.如实施方案206所述的方法，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均限定细长空腔(例如，二等分的球形椭圆体或二等分的泪滴、二等分的卵或更一般地二等分的长椭球体形状的凹槽)，并且任选地，其中每个细长空腔的长轴基本上平行于多个凹入特征的每隔一个细长空腔的长入口。
212.如实施方案211所述的方法，其中每个细长空腔均包括最深点，其中每个细长空腔的长轴包括第一端和第二端，其中由室的底座表面和连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度在45°至90°之间，并且其中由室的底座表面与连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度小于45°。
213.如实施方案211或212所述的方法，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:5(例如，约1:2.5至约1:4.5、约1:3至约1:4或约1:3.5)的纵横比(即，凹入特征的最宽部分处的宽度:凹入特征的长度)。
214.如实施方案211至213中任一项所述的方法，其中多个凹入特征包括约500至1500个凹入特征(例如，约500至约1200、约550至约1100、约600至约1000、约650至约900、约700至约850或者约750至约800个凹入特征)。
215.如实施方案211至214中任一项所述的方法，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约0.5ml至约3.0ml(例如，约0.75ml至约2.5ml、约1.0ml至约2.0ml、约1.1ml至约1.9ml、约1.2ml至约1.8ml、约1.25ml至约1.75ml、约1.3ml至约1.7ml、约1.4ml至约1.6ml或约1.5ml)。
216.如实施方案206至215中任一项所述的方法，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括功能化的表面，并且任选地，其中功能化的表面是T细胞激活表面。
217.如实施方案201至216中任一项所述的方法，其还包括将增殖的细胞的第一部分与测定试剂混合，任选地，同时将增殖的细胞的第一部分从细胞培养室转移至盒的第一分析区域。
218.如实施方案201至217中任一项所述的方法，其中分析增殖的细胞样品的第一部分包括检测第一部分中的T细胞的一种或多种细胞因子的分泌。
219.如实施方案201至218中任一项所述的方法，其中分析增殖的细胞样品的第一部分包括检测第一部分中由一个或多个T细胞产生的细胞杀伤。
220.如实施方案201至219中任一项所述的方法，其还包括用核酸构建体转染细胞样品。
221.如实施方案220所述的方法，其中核酸构建体编码CAR T分子或TCR。
222.如实施方案201至221中任一项所述的方法，其还包括在盒上对细胞样品进行分级以富集感兴趣的细胞。
223.如实施方案222所述的方法，其中感兴趣的细胞是T细胞。
224.如实施方案222或223所述的方法，其中分级包括使细胞样品与被配置成结合感兴趣的细胞的磁珠接触并洗掉未结合的细胞。
225.如实施方案222至224中任一项所述的方法，其中分级包括激活感兴趣的细胞(例如，使用同时结合感兴趣的细胞和刺激其激活的珠)。

Claims (56)

1.一种用于制备细胞群的盒，其包括：
具有入口端口和出口端口的密封外壳，其包括：
连接到出口端口的第一流体网络；
连接到第一流体网络的第一试剂储存器；
连接到第一流体网络的第一分析区域；和
用于培养细胞的室(例如生物反应器)，其中细胞培养室包括：
用于将流体引入到室中的第一输入开口；
用于从室中去除流体的第一输出开口；和
用于从室中移出流体的第二输出开口；
其中：
细胞培养室通过第一流体网络连接至出口端口、第一试剂储存器和第一分析区域中的每一个；
第一输出开口和第二输出开口位于细胞培养室内的不同垂直高度处；并且
细胞培养室的底座的内表面包括限定在其上的多个凹入特征。
2.如权利要求1所述的盒，其中所述密封外壳是无菌的。
3.如权利要求1所述的盒，其中细胞培养室的第一输出开口位于细胞培养室的底座表面中或邻近所述底座表面，其中细胞培养室的第二输出开口位于底座表面上方，并且其中第二输出开口位于室中对应于室的垂直高度的30％的位置处或其上方。
4.如权利要求1所述的盒，其中第一流体网络包括多个通道和一个或多个导流器。
5.如权利要求1所述的盒，其还包括：第二流体网络，其包括多个通道和一个或多个导流器，其中第二流体网络连接到盒的入口端口和/或细胞培养室的第一输入开口。
6.如权利要求5所述的盒，其还包括：用于细胞培养基的第一储存器，其中第一储存器连接到第二流体网络，并且其中用于细胞培养基的第一储存器经由室的第一输入开口连接到细胞培养室。
7.如权利要求1所述的盒，其还包括：用于收集废料的第二储存器，其中第二储存器连接至第一流体网络，并且其中用于收集废料的第二储存器经由细胞培养室的第一出口开口、第二出口开口、或又一个出口开口连接至细胞培养室。
8.如权利要求1所述的盒，其中室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均被配置成保持约500纳升至约2.5微升或者约900纳升至约2.1微升的体积。
9.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定半球形或圆锥形空腔。
10.如权利要求9所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:4的纵横比，所述纵横比由细胞培养室的底座表面处的开口的直径:凹入特征的深度限定。
11.如权利要求9所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约1500至4000个，或约2000至约3500个凹入特征。
12.如权利要求9所述的盒，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约1.5ml至约4.5ml。
13.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中室的底座的内表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均限定细长空腔，并且其中每个细长空腔的长轴基本上平行于多个凹入特征的每隔一个细长空腔的长入口。
14.如权利要求13所述的盒，其中每个细长空腔均包括最深点，其中每个细长空腔的长轴包括第一端和第二端，其中由室的底座表面和连接长轴的第一端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度在45°至90°之间，且其中室的底座表面与连接长轴的第二端与细长空腔的最深点的线段所限定的角度小于45°。
15.如权利要求13所述的盒，其中多个凹入特征中的每个凹入特征均包括约1:2至约1:5的纵横比，所述纵横比被定义为凹入特征的最宽部分处的宽度:凹入特征的长度。
16.如权利要求13所述的盒，其中细胞培养室的底座表面中的多个凹入特征包括约500至1500个，或约600至约1000个凹入特征。
17.如权利要求13所述的盒，其中多个凹入特征的合计空腔体积为约0.5ml至约3.0ml。
18.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中细胞培养室的底座表面和/或第一室的底座表面上的多个凹入特征中的每个凹入特征均被功能化。
19.如权利要求18所述的盒，其中功能化包括生物相容性聚合物。
20.如权利要求18所述的盒，其中功能化包括适合于激活T淋巴细胞(T细胞)的多肽。
21.如权利要求18所述的盒，其中每个凹入特征的表面的仅一部分被功能化，并且其中功能化的表面包括作为T细胞激活区域的第一区域和用表面封闭配体共价修饰的第二区域。
22.如权利要求21所述的盒，其中每个凹入特征的第一区域包括0.5mm2至1.0mm2的面积。
23.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中第一试剂储存器被配置成储存细胞因子。
24.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其还包括连接至第一流体网络的第二试剂储存器，其中第二试剂储存器被配置成储存细胞因子、用于转染/转化细胞的试剂或细胞染色试剂。
25.如权利要求24所述的盒，其还包括三至八个试剂储存器，每个试剂储存器均可以连接到第一流体网络或第二流体网络。
26.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中第一分析区域包括底座、盖以及设置在底座与盖之间的分析室，并且其中第一分析区域被配置用于对细胞进行计数和/或检测具有期望的和/或不期望的表型的细胞。
27.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中第一分析区域包括微流体装置。
28.如权利要求1至8中任一项所述的盒，其中所述盒还包括第二分析区域。
29.根据权利要求1至8中任一项所述的盒，其中细胞培养室是第一细胞培养室并且所述盒还包括第二细胞培养室，其中第二室包括：
用于将流体引入到第二细胞培养室中的第一入口开口、用于从第二细胞培养室中移出流体的第一输出开口以及具有内表面的底座，其中第二细胞培养室的底座表面包括第二多个凹入特征。
30.如权利要求29所述的盒，其中第二细胞培养室的底座表面上的第二多个凹入特征中的每个凹入特征均缺乏T细胞激活表面。
31.一种用于操作盒的系统，其包括：
能够接收盒的接收元件；
第一加热和冷却元件；
多个空气流量调节器(例如用于加压空气组分的阀)，每个调节器均能够与盒接合并可控制地且独立地向盒提供加压气体；
致动器，其用于致动(例如，振荡、倾斜和/或摇动)盒，从而搅动盒内存在的流体；以及
与第一加热和冷却元件、多个空气流量调节器和致动器通信的控制器模块(例如系统控制器)；其中控制器模块能够控制：
加热和冷却元件的设置，从而调节盒的细胞培养室的温度；
多个空气流量调节器中的每个调节器，从而控制盒内的流体操作；和
致动器，从而可控制地搅动盒内存在的流体。
32.如权利要求31所述的系统，其中盒是如权利要求8所述的盒。
33.如权利要求31或32所述的系统，其还包括盒保持器，所述盒保持器被配置成与盒和接收元件接合。
34.如权利要求33所述的系统，其中盒保持器被配置成至少部分地包围所述盒。
35.如权利要求33所述的系统，其中第一加热和冷却元件由盒保持器包括并且定位成当盒与盒保持器接合时邻近盒的细胞培养室。
36.如权利要求33所述的系统，其中接收元件包括多个杆，所述盒保持器能够可滑动地安装在所述多个杆上。
37.如权利要求33所述的系统，其中用于致动所述盒的致动器被配置成移动、倾斜、摇动或振荡盒保持器和/或接收元件，从而移动、倾斜、摇动或振荡所述盒。
38.如权利要求31或32所述的系统，其还包括成像模块，所述成像模块适合于当盒(或包含盒的盒保持器)已由接收元件接收时使盒的分析区域中存在的细胞可视化。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述成像模块包括检测器。
40.如权利要求31或32所述的系统，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当所述盒(或容纳盒的盒保持器)已被接收元件接收时，当由处理器执行时，所述一系列指令使处理器执行自动计数和/或细胞表征。
41.如权利要求31或32所述的系统，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当所述盒(或容纳盒的盒保持器)已被接收元件接收时，当由处理器执行时，所述一系列指令使处理器检测细胞分泌和/或细胞-细胞相互作用，包括细胞激活、细胞扩增或细胞杀伤。
42.如权利要求31或32所述的系统，其还包括非暂时性计算机可访问存储介质，其上存储一系列指令，当所述盒(或容纳盒的盒保持器)已被接收元件接收时，当由处理器执行时，所述一系列指令激活电机以驱动接收元件，驱动方式为导致在盒的细胞培养室内生长的细胞再悬浮。
43.如权利要求31或32所述的系统，其还包括磁体套件，当盒(或包含盒的盒保持器)已被接收元件接收时，所述磁体套件可以定位在盒的细胞培养室附近。
44.如权利要求43所述的系统，其中磁体套件可移动地安装在系统内，并且其中控制器模块能够控制磁体套件的位置，从而控制磁体套件与盒的细胞培养室的接近。
45.一种制备适合配制为细胞治疗剂的细胞群的方法，该方法包括：
将来自受试者的细胞样品引入到盒的入口端口中；
将细胞样品从盒的入口端口输送至盒的细胞培养室；
在适合细胞增殖的条件下在盒的细胞培养室中孵育细胞样品；
搅动盒以再悬浮增殖的细胞样品；
将增殖的细胞样品的第一部分从盒的细胞培养室转移至盒的第一分析区域；
分析增殖的细胞样品的第一部分的细胞计数和/或细胞特征；
任选地重复孵育、搅动、转移和分析步骤一次或多次以产生进一步增殖的细胞样品；以及
从盒中输出增殖的(或进一步增殖的)细胞样品，
其中引入细胞样品之后直到输出增殖的(或进一步增殖的)细胞样品的所有步骤均在盒内进行，而无需从盒中取出细胞样品。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述盒是如权利要求8所述的盒。
47.如权利要求45所述的方法，其中细胞样品来自人类受试者。
48.如权利要求45所述的方法，其中细胞样品是PBMC样品。
49.如权利要求48所述的方法，其中细胞样品是富集了T细胞的分级的PBMC样品，并且任选地，其中T细胞富集至少部分地在盒的细胞培养室中进行。
50.如权利要求45所述的方法，其还包括将增殖的细胞的第一部分与测定试剂混合。
51.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其中分析增殖的细胞样品的第一部分包括检测第一部分中的T细胞的一种或多种细胞因子的分泌。
52.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其中分析增殖的细胞样品的第一部分包括检测第一部分中由一个或多个T细胞导致的细胞杀伤。
53.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其还包括用核酸构建体转染细胞样品。
54.如权利要求53所述的方法，其中核酸构建体编码CAR T分子或TCR。
55.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其还包括在盒上对细胞样品进行分级以富集感兴趣的细胞，其中分级包括使细胞样品与被配置成结合所述感兴趣的细胞的磁珠接触并洗掉未结合的细胞。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞是T细胞，并且其中分级包括同时激活所述感兴趣的细胞。
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