CN117004765A - 一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明提供的引物探针组合物检测马尔堡病毒,具有较好的灵敏度和准确度,扩增效率高,且操作简便,快速省时。本发明利用一体化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、纯化、扩增和检测,解决病原体快速检测的问题,实现“样本进‑结果出”的POCT检测方案,取样后直接加入设备,纯化加扩增,60分钟内出结果。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。
背景技术
马尔堡病毒是马尔堡出血热的致病菌,而马尔堡出血热是一种严重的人类疾病,其平均死亡率约为50%。在以往的疫情中,病死率从24%至88%不等,取决于病毒株和病例管理情况。狐蝠科的北非果蝠被认为是马尔堡病毒的天然宿主。马尔堡病毒由果蝠传播给人类,并在人际间传播。疾病潜伏期(从获得感染到出现症状的时间间隔)从2天到21天不等。
随着全球化发展,方便、快捷的交通工具使得不同国家和地区的人员以及动物产品流动日益频繁,也给传染病的传播和流行创造了有利条件。如何在边境检验检疫中快速筛查相关病原体变得越来越重要。传统检测方法如病毒分离培养,其操作复杂,检测周期长;抗原检测和血清学检测等免疫法的特异性高,但灵敏度较低,且不能用于疾病的早期诊断。实时荧光定量PCR技术是目前应用最广泛的分子检测法,该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点。但是许多设备体积较大,并且样本通常需要前处理,对实验条件要求相对较高,不适合现场检测。
本申请人基于以上问题,经过数年研发,于在先申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备CarryOn P1000Q,该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”,可在60分钟内完成相关病原体的现场自动化核酸检测,能够实现“样品进,结果出”的快速检测。本申请即在该技术的基础上进一步研发出的,能够更好的配合该设备的试剂类发明,即检测马尔堡病毒的一体化微流控芯片试剂盒。
现有的检测试剂盒及方法操作时间长,且操作步骤繁琐,因此,亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的检测马尔堡病毒的试剂盒及其使用方法。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题,本申请提供了一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物可检测马尔堡病毒,具有较好的灵敏度和准确度,扩增效率高,且操作简便,快速省时。
为了实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
一方面,本发明提供了一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物,所述的引物探针组合物包括检测马尔堡病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。
具体地,所述的检测马尔堡病毒的引物探针组合物包括MARV引物探针组合物。
具体地,所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。
进一步具体地,
(1)所述的MARV引物探针组合物为:
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(2)所述的IPC引物探针组合物为:
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P:SEQ ID NO:6:5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。
具体地,所述的检测马尔堡病毒的引物探针组合物用于检测马尔堡病毒的GP基因。
具体地,所述探针的5'端标记有荧光报告基团,所述探针的3'端标记有淬灭基团;所述荧光报告基团为CY3、CY5、CY5.5、FAM、HEX、VIC、JOE或ROX中的一种或多种,所述淬灭基团为荧光淬灭基团。
进一步具体地,所述的检测马尔堡病毒的探针5’端荧光报告基团为FAM,3’端淬灭基团为BHQ1;所述的检测内参IPC的探针5’端荧光报告基团为CY5,3’端淬灭基团为BHQ3。
另一方面,本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测马尔堡病毒产品中的应用。
具体地,所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
又一方面,本发明提供了一种检测马尔堡病毒的产品,所述的产品包括上述引物探针组合物。
具体地,所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
具体地,所述的产品还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。
进一步具体地,所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠,所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100,所述的洗脱液包括Tris-HCl,所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5,所述的磁珠为干化磁珠。
进一步具体地,所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2%TritonX-100,所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。
又一方面,本发明还提供了一种检测马尔堡病毒的一体化微流控芯片试剂盒,所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。
具体地,所述的产品还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。
进一步具体地,所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠,所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100,所述的洗脱液包括Tris-HCl,所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5,所述的磁珠为干化磁珠。
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进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。
进一步具体地,所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。
具体地,所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。
具体地,所述的微流控芯片试剂盒可用于CarryOn P1000Q快速核酸检测设备。
又一方面,本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测马尔堡病毒中的应用。
又一方面,本发明提供了一种检测马尔堡病毒的方法,所述的方法为非疾病诊断和治疗方法,所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中马尔堡病毒进行检测。
具体地,所述的方法包括以下步骤:
(1)利用上述纯化试剂提取样本的RNA并进行纯化;
(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本RNA;
(3)对扩增结果进行分析。
进一步具体地,上述步骤采用CarryOn P1000Q快速核酸检测设备,在一体化微流控芯片上进行。
与现有技术相比,本发明提供的试剂盒具有如下有益效果:
(1)采用本发明提供的引物探针组合物可检测马尔堡病毒,具有较好的灵敏度和准确度,扩增效率高,且操作简便,快速省时。
(2)利用一体化芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题,实现“样本进-结果出”的POCT检测方案,取样后直接加入设备,集成核酸的提取、纯化、扩增和检测,60分钟内出结果。
附图说明
图1为试剂盒灵敏度检测结果图。
图2为试剂盒重复性检测结果图。
图3为试剂盒特异性检测结果图,其中,A为埃博拉病毒GP基因特异性检测结果,B为人基因组特异性检测结果,C为大肠杆菌基因组特异性检测结果。
图4为一体化微流控芯片正反面实物图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者,均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。
1.试剂及仪器
(1)本申请所用的试剂信息详见下表1。
表1试剂及厂家
BSA | 牛血清白蛋白 | Amresco | 0332-100G |
Trehalose | 海藻糖 | Sigma | T9531-10G |
Mannitol | 甘露醇 | Sigma | M9546-250G |
HP-β-CD | 2-羟丙基-β-环糊精 | aladdin | H108813-25g |
SE-15 | 消泡剂 | Sigma | A8582-100G |
Tween20 | 吐温20 | Sigma | P9416-50ML |
Tris Base | 三羟甲基氨基甲烷 | Sigma | 648310-500GM-M |
NaCl | 氯化钠 | Sigma | S3014-500G |
(2)本申请所用的仪器信息详见下表2。
表2仪器及厂家
仪器 | 厂家 | 型号 |
万分之一天平 | 梅特勒-托利多公司 | AL104 |
实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | ABI 7500 |
小型台式涡旋混匀仪 | 杭州米欧仪器有限公司 | MIX-28+ |
手掌型离心机 | 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 | LX-100 |
鼓风干燥箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | DHG-9030A |
真空冷冻干燥机 | 四环科仪(天津)科技有限公司 | LGJ-20 |
本申请所用的整体设备即PCR反应装置详见专利202110057507.0,用于核酸检测的芯片装置详见202110055537.8。
实施例1.一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物
所述的引物探针组合物包括检测马尔堡病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。
所述的检测马尔堡病毒的引物探针组合物为MARV引物探针组合物。
所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。
(1)所述的MARV引物探针组合物为:
F:SEQ ID NO:1:5'-GATTCACACTGAGTGGGCAA-3';
R:SEQ ID NO:2:5'-CCTGTCCTGAAAGCCCATC-3';
P:SEQ ID NO:3:5'-ATGCCTCCAAAGGGGAATCAGC-3';
(2)所述的IPC引物探针组合物为:
F:SEQ ID NO:4:5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3';
R:SEQ ID NO:5:5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3';
P:SEQ ID NO:6:5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。
本申请所述的马尔堡病毒的引物探针组合物用于检测马尔堡病毒的GP基因。
实施例2一种检测马尔堡病毒的一体化微流控芯片试剂盒
(1)包括实施例1所述的引物探针组合物,各引物浓度均为0.4μM,探针浓度均为0.2μM。
(2)还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。
1)所述的纯化试剂包括裂解液400μL和洗脱液850μL,磁珠15μL,所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2%Triton X-100,所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5),将纯化试剂加入芯片中的加样层,所述的磁珠干化方法见专利202110222434.6。
2)所述风干RT-qPCR反应试剂体系如下表3所示。
表3风干RT-qPCR反应试剂体系
成分 | |
4×Air-Dryable 1-Step RT-qPCR Mix | 12.5μL |
引物探针混合物 | 2.5μL |
将上述表3试剂加入一体化微流控芯片的反应仓中,将芯片放入鼓风干燥箱,按照Air-Dryable 1-Step RT-qPCR Mix说明书进行风干操作。
3)所述冻干IPC过程质控品包括IPC假病毒的制备和冻干试剂体系。
按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法,构建并得到IPC基因(SEQ ID NO:7)的假病毒。
所述冻干IPC试剂体系如下表4所示。
表4冻干IPC试剂体系
成分 | 终浓度 |
IPC假病毒 | 1×106copies/mL |
甘露醇Mannitol | 10% |
海藻糖Trehalose | 10% |
2-羟丙基-β-环糊精HP-β-CD | 0.1% |
牛血清白蛋白BSA | 0.5mg/mL |
消泡剂SE-15 | 0.009% |
Tris-HCl(pH 8.0) | 10mM |
NaCl | 50mM |
Tween20 | 0.05% |
将上述表4试剂每5μL滴到液氮中制成冻干球,放入西林瓶中按照表5的冷冻干燥机冻干程序进行冻干。
表5冻干程序
将冻干IPC过程质控品放入已风干反应试剂的芯片上,组装成一体化检测试剂盒。
实施例3马尔堡病毒检测试剂盒的使用方法
采用CarryOn P1000Q进行本申请所述的马尔堡病毒的检测,具体检测步骤如下表6所示。
表6
步骤 | 操作 | 时间 | 累计时间 | 环境 |
1.设备开机 | 人工 | 5秒 | 00:05 | 检疫现场 |
2.准备鼻咽拭子样品 | 人工 | 1分钟 | 01:05 | 检疫现场 |
3.取适量鼻咽拭子样品加入芯片中 | 人工 | 15秒 | 01:20 | 检疫现场 |
4.点击首页“检测”按钮 | 人工 | 5秒 | 01:25 | 检疫现场 |
5.扫描芯片二维码识别芯片并插入设备 | 人工 | 15秒 | 01:40 | 检疫现场 |
6.一键点击运行设备 | 人工 | 5秒 | 01:45 | 检疫现场 |
7.样品处理 | 自动 | 1分钟 | 02:45 | 芯片内 |
8.核酸提取纯化 | 自动 | 14分钟 | 16:45 | 芯片内 |
9.逆转录(含试剂复溶) | 自动 | 10分钟 | 26:45 | 芯片内 |
10.实时荧光PCR(45个循环) | 自动 | 31分钟 | 57:45 | 芯片内 |
11.结果判读,输出,上报 | 自动 | 0秒 | 57:45 | 芯片内 |
12.取出芯片,抛弃废物至生物安全废物桶 | 人工 | 10秒 | 57:55 | 检疫现场 |
13.设备复位,内部消毒,待检或关机 | 自动 | 20秒 | 58:15 | 设备内部 |
实时定量PCR反应程序为:55℃10min;95℃1min;(95℃10s,60℃20s),45cycles。
实验例1灵敏度检测
按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法,分别构建并得到包含MARV-CoV的GP基因片段(Genbank:NC_001608:5825-6325bp,SEQ ID NO:8)的假病毒,通过ddPCR对假病毒纯化后的RNA进行定量后,调整投入量为5×106copies、5×105copies、5×104copies、5×103copies、5×102copies,按照上述实施例1-3的体系和步骤对提取的核酸样品进行检测,其检测结果如下表7所示,检测曲线如图1所示。
表7
由上表7可知,本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的灵敏度,可对5×102copies/reaction的样品进行检测。
实验例2准确性检测
按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法,分别构建并得到包含MARV-CoV的GP基因片段(Genbank:NC_001608:5825-6325bp,SEQ ID NO:8)的假病毒,通过ddPCR对假病毒纯化后的RNA进行定量后,调整其浓度为每个反应(样本体积200μL)1×102copies,按照上述实施例1-3的体系和步骤对提取的核酸样品进行检测,重复检测六次,检测结果如下表8所示。
表8
样品 | MARV | IPC |
第一次 | 39.77 | 32.41 |
第二次 | 38.78 | 33.10 |
第三次 | 37.93 | 31.93 |
第四次 | 39.94 | 33.62 |
第五次 | 38.20 | 31.76 |
第六次 | 39.87 | 33.35 |
变异系数(CV) | 2.30% | 2.36% |
由表8可知,本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的重复性,且100拷贝的假病毒投入量也可以稳定检出,设备结果扩增曲线图见图2。
实验例3特异性检测
使用人全基因组,大肠杆菌全基因组和埃博拉病毒GP基因体外转录RNA对试剂盒做特异性测试。加样体积均为200μL。其中人基因组和大肠杆菌基因组投入量为1μg。埃博拉病毒的GP基因(Genbank:NC_002549:5900-8305bp)委托北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成,阳性质粒使用pET28a载体,使用Thermo Scientific TranscriptAid T7 HighYield Transcription Kit(货号K0441)进行体外转录实验,得到的RNA使用Qubit 4.0对单链RNA进行定量,特异性检测实验中埃博拉GP基因RNA投入量为5×105copies。
按照上述实施例1-3的体系和步骤对上述提取的样品进行检测,其检测结果如下表9所示。
表9
样品 | 内对照Ct值 | 靶标检测结果 |
埃博拉病毒GP基因体外转录RNA | 31.95 | 阴性 |
人基因组 | 30.99 | 阴性 |
大肠杆菌基因组 | 32.07 | 阴性 |
其中,埃博拉病毒GP基因体外转录RNA、人基因组和大肠杆菌基因组检测结果Ct值为内参扩增结果。本申请所述的马尔堡病毒引物探针组合物未扩增到产物。因此,其检测结果为阴性。
其检测结果图如图3所示,由上表9可知,本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的特异性。
以上仅为本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京中科生仪科技有限公司
<120> 一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gattcacact gagtgggcaa 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cctgtcctga aagcccatc 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atgcctccaa aggggaatca gc 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
agttgcagtg taaccgtcat gta 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
tcgacgagac tctgctgtta a 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
cagtaatctg cgtcgcacgt gtgca 25
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
agttgcagtg taaccgtcat gtaccagtaa tctgcgtcgc acgtgtgcac ctagtctaat 60
cacttatgac tcagataact taacagcaga gtctcgtcga 100
<210> 8
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gaagaacatt aattgctggg taaaagtgat taatttcttt aaatttgacc agaataatat 60
tttgtcagtg aatatattct catatcactt gattaaaaac agaaaattac cctaacatga 120
agaccacatg tttccttatc agtcttatct taattcaagg gacaaaaaat ctccccattt 180
tagagatagc tagtaataat caaccccaaa atgtggattc ggtatgctcc ggaactctcc 240
agaagacaga agacgtccat ctgatgggat tcacactgag tgggcaaaaa gttgctgatt 300
cccctttgga ggcatccaag cgatgggctt tcaggacagg tgtacctccc aagaatgttg 360
agtacacaga gggggaggaa gccaaaacat gctacaatat aagtgtaacg gatccctctg 420
gaaaatcctt gctgttagat cctcctacca acatccgtga ctatcctaaa tgcaaaacta 480
tccatcatat tcaaggtcaa a 501
Claims (10)
1.一种检测马尔堡病毒的引物探针组合物,其特征在于:所述的引物探针组合物包括检测马尔堡病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物;
所述的检测马尔堡病毒的引物探针组合物包括MARV引物探针组合物;
所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物;
所述的MARV引物探针组合物为:
F:SEQ ID NO:1:5'-GATTCACACTGAGTGGGCAA-3';
R:SEQ ID NO:2:5'-CCTGTCCTGAAAGCCCATC-3';
P:SEQ ID NO:3:5'-ATGCCTCCAAAGGGGAATCAGC-3';
所述的IPC引物探针组合物为:
F:SEQ ID NO:4:5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3';
R:SEQ ID NO:5:5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3';
P:SEQ ID NO:6:5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。
2.权利要求1所述的引物探针组合物在制备检测马尔堡病毒产品中应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述的产品包括独立试剂、芯片或试剂盒。
4.一种检测马尔堡病毒的产品,其特征在于:所述的产品包括权利要求1所述的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的产品,其特征在于:所述的产品还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。
6.根据权利要求5所述的产品,其特征在于:所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠,所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100,所述的洗脱液包括Tris-HCl,所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5,所述的磁珠为干化磁珠。
7.根据权利要求5所述的产品,其特征在于:所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQID NO:7;
所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒;
所述的冻干IPC过程质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。
8.根据权利要求5所述的产品,其特征在于:所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。
9.一种检测马尔堡病毒的一体化微流控芯片试剂盒,其特征在于:
所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物;
所述的试剂盒还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品;
所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠,所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100,所述的洗脱液包括Tris-HCl,所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5,所述的磁珠为干化磁珠;
所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7;
所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒;
所述的冻干IPC过程质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20;
所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中;
所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。
10.一种检测马尔堡病毒的方法,所述的方法为非疾病诊断和治疗方法,其特征在于:所述的方法包括利用权利要求1所述的引物探针组合物、权利要求4-8任一项所述的产品或权利要求9所述的试剂盒对待测样本中马尔堡病毒进行检测。
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