CN117003780A - 氟化硼络合二吡咯甲川衍生物、自组装荧光纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氟化硼络合二吡咯甲川衍生物、自组装荧光纳米探针及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域。所述氟化硼络合二吡咯甲川衍生物命名为化合物B4，具有式(I)所示的化学结构，同时本发明通过选择具有NIR荧光和PS双功能的化合物B4和产氧蛋白CAT作为纳米材料的核心，并通过超分子自组装策略制备了一种新型荧光纳米探针——CAT‑I‑BODIPYNPs。该荧光纳米探针可以利用FI技术可视化监测CAT‑I‑BODIPYNPs在乏氧肿瘤中的定位和富集。当达到最佳富集时，在体外给予特定的NIR激光激发PS释放1O2，实现PDT精准治疗，同时提高PDT的安全性。此外，该探针还可以在乏氧肿瘤环境中释放氧气，既可以改善肿瘤的乏氧环境，又可以提高1O2产率，从而进一步提高PDT的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种氟化硼络合二吡咯甲川衍生物、自组装荧光纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
不断攀升的癌症死亡率使得创新的癌症治疗方法的开发变得十分迫切。光动力疗法(PDT)已经成为一种很有前途的模式，其优点是微创、低毒和出色的时空选择性。在各种光敏剂(PSs)中，氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)衍生物由于其优越的光化学特性和作为生物成像和PDT的双重功能药剂的潜力，已经引起了相当大的关注。同时，确定最佳的治疗窗口在光疗中是至关重要的，因为荧光成像技术由于其高灵敏度、实时监测能力和无创性，可以实现光疗过程的可视化。然而，I型PSs需要足够的氧气供应，而这往往受到缺氧的肿瘤微环境的限制。此外，BODIPY固有的疏水性会导致分子聚集并降低治疗效果，突出了对创新PSs和策略的需求。
为了解决肿瘤缺氧问题，人们探索了各种策略，包括直接供氧、增强瘤内血流和原位产氧。过氧化氢酶(CAT)是一种具有良好生物相容性的天然酶，由于其能够从过氧化氢(H2O2)中产生氧气，是肿瘤供氧的理想选择。然而，大多数研究集中在修改CAT，这可能会损害其效率和催化能力。
因此，开发合适的策略，有效地整合蛋白质和PSs，以实现安全和高效的肿瘤治疗是本发明亟需解决的问题。
发明内容
本发明提供的一种氟化硼络合二吡咯甲川衍生物、自组装荧光纳米探针及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术充存在的问题。通过选择具有NIR荧光和PS双功能的BODIPY(Boron dipyrromethene，氟化硼络合二吡咯甲川)和产氧蛋白CAT(Catalase，过氧化氢酶)作为纳米材料的核心，并通过超分子自组装策略制备了一种新型荧光纳米探针
——CAT-I-BODIPY NPs。该荧光纳米探针可以利用FI技术可视化监测CAT-I-BODIPY NPs在乏氧肿瘤中的定位和富集。当达到最佳富集时，在体外给予特定的NIR激光激发PS释放1O2，实现PDT精准治疗，同时提高PDT的安全性。此外，该探针还可以在乏氧肿瘤环境中释放氧气，既可以改善肿瘤的乏氧环境，又可以提高1O2产率，从而进一步提高PDT的治疗效果。
为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
第一方面，本发明公开了一种氟化硼络合二吡咯甲川衍生物，所述氟化硼络合二吡咯甲川衍生物命名为化合物B4，具有如下式(I)所示的化学结构：
第二方面，本发明公开了一种如第一方面所述的氟化硼络合二吡咯甲川衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)氩气保护条件下，将2,4-二甲基吡咯和4-羟基苯甲醛溶解于二氯甲烷中，然后滴加三氟乙酸，在黑暗条件下搅拌反应，然后向反应液中加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，继续搅拌，将反应混合物用三乙胺处理后，滴加三氟化硼乙醚于混合液中，继续搅拌反应，纯化，得到化合物B1；
(2)将化合物B1和3-溴丙炔溶解于含有无水碳酸钾的丙酮中，回流条件下反应，纯化，得到化合物B2；
(3)将化合物B2和碘加入到无水乙醇溶液中，得到混合溶液，将碘酸溶解在水中，然后再加入到混合溶液中，搅拌反应，纯化，得到化合物B3；
(4)将化合物B3和4-甲氧基苯甲醛溶解于甲苯中，然后加入乙酸和哌啶，加热回流条件下反应，纯化，得到化合物B4。
第三方面，本发明公开了一种自组装荧光纳米探针，包括如第一方面所述的氟化硼络合二吡咯甲川衍生物及过氧化氢酶CAT，所述氟化硼络合二吡咯甲川衍生物通过分子间作用插入到过氧化氢酶CAT的特定部位，所述荧光纳米探针为球状，平均直径为100nm，水动力直径和多分散指数分别为118.2nm和0.171，所述过氧化氢酶CAT的特定部位包括382ARG,383VAL,385ASN,63HIS,387GLN,388ARG,389ASP,398GLN,397ASN,396ASP,395GLN,394MET,369ASN,372HIS,374PRO,377CYS,395GLN,394MET。
第四方面，本发明公开了一种如第三方面所述的自组装荧光纳米探针在在制备荧光探针试剂中的用途。
在本发明的较佳实施方式中，所述荧光探针试剂为用于诊断肿瘤的试剂。
进一步的，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
第五方面，本发明公开了一种如第三方面所述的自组装荧光纳米探针的制备方法，由CAT溶液和化合物B4溶液混合均匀得到。
在本发明的较佳实施方式中，所述CAT溶液和化合物B4溶液的摩尔浓度比为1-5:5-1。
优选的，所述CAT溶液和化合物B4溶液的摩尔浓度比为1：1。
进一步的，所述CAT溶液采用如下方法制备：称取1mg CAT溶于1mLpH＝7.4的PBS溶液中，得到高浓度的CAT原液，然后将0.275mL高浓度的CAT溶液溶于0.725mLPBS溶液中混匀即可；所述化合物B4溶液采用如下方法制备：称取1mg B4溶于1mLDMSO中，得到高浓度的B4原液，取0.009mL B4溶液溶于0.991mLDMSO中即可；所述自组装荧光纳米探针采用如下方法制备：取0.9mL CAT溶液与0.1mLB4溶液混合均匀。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过B4、CAT的亲疏水作用和CAT蛋白自身的氢键作用下，驱动这两个功能基元在多重超分子相互作用下发生一个有序的自组装，形成水溶性和生物相容性很好的CAT-I-BODIPYNPs，成功构建功能生物纳米材料，制备方法简单，在近红外激光照射下，通过荧光成像的实时可视化，可以指导治疗的最佳时间窗口。
本发明提出了利用过氧化氢酶(CAT)将肿瘤内的过氧化氢(H2O2)分解成氧气的策略，由于实体瘤内部存在高水平的H2O2，因此利用CAT的高效催化作用将其转化为氧气是一个吸引人的选择，本发明利用CAT作为补氧基元，能够在体内有效缓解肿瘤的缺氧，为光动力疗法等治疗提供更好的环境，实现了缓解肿瘤乏氧的同时提高了PDT效果。
创新的CAT-I-BODIPY纳米平台解决了传统PS的局限性，为非侵入性的缺氧肿瘤治疗提供了一个有前途的生物相容性策略。
本发明使用近红外化合物B4作为荧光探针，可以在体内成像指导治疗，这种成像方法具有很好的穿透深度，可以实现对肿瘤的精确定位和观察。
本发明结合了PDT和FI技术，对乏氧恶性肿瘤进行原位氧供给的同时实现了FI引导的增强PDT，可有效抑制肿瘤生长并延长生存时间；
本发明的纳米组合物候选物都具有内在的生物亲和力，具有良好的生物相容性，在体内的应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明的工作原理图。
图2为在日光和365nm紫外灯的照射下，DCM中B1、B2、B3和B4的图像。
图3为化合物B1的1H NMR。
图4为化合物B1的质谱。
图5为化合物B2的1H NMR。
图6为化合物B2的质谱。
图7为化合物B3的1H NMR。
图8为化合物B3的质谱。
图9为化合物B4的1H NMR。
图10为化合物B4的质谱。
图11为CIB NPs整个复合物的对接图。
图12为CIB NPs相互作用区域的放大图。
图13为CAT和B4摩尔浓度相同(CAT:B4＝1:1)的CIB NPs的透射电子显微镜(TEM)图像，比例尺为100nm，其中，插图显示了CAT和B4等浓度下的CIB NPs的动态光散射(DLS)测量(CAT：B4＝1：1)。
图14为不同组装条件下CAT和B4的荧光光谱。
图15为CIB NPs的组装动力学。
图16为通过DLS测量72小时内CIB NPs的颗粒大小和多分散指数(PDI)。
图17为CAT与CIB NPs产氧量的比较。
图18为光照后CIB NPs的溶解氧含量。
图19为用CCK-8检测CAT、B4、CIB NPs和BIB NPs对A549细胞活力的影响。
图20为用CCK-8检测CAT、B4、CIB NPs和BIB NPs在650nm光照射(300mW cm-2)15min后对A549细胞活力的影响。
图21为A549细胞在与CIB NPs孵育不同时期后获得CLSM图像。
图22为用CIB NPs培养不同时间后，测量图21中A549细胞的相对荧光强度。
图23为用CIB NPs处理后用SOSG染色，在650nm激光照射或不照射的情况下获得A549细胞的CLSM图像。
图24为图23中A549细胞的相对荧光强度是在用CIB NPs处理后用SOSG染色后测量的，有或没有650nm激光照射。
图25为显示了进行不同处理后用Calcein-AM和PI染色的A549细胞的CLSM图像。
图26为图25中不同处理后用Calcein-AM和PI染色的A549细胞相对荧光强度。
图27为不同处理的流式细胞仪检测。
图28为静脉注射CIB NPs后对A549肿瘤携带的裸鼠进行实时荧光成像。
图29为静脉注射CIB NPs后，对A549肿瘤携带的裸鼠进行体内荧光成像的相对荧光强度测量。
图30为治疗15天后从不同组的裸鼠身上收集的肿瘤图像。
图31为不同处理后比较裸鼠的肿瘤体积。数据以mean±SD表示，****P<0.0001。
图32为不同治疗组的裸鼠的肿瘤组织样本用H&E染色和TUNEL染色。比例尺为100μm。
图33为不同处理后测量裸鼠的体重。
图34为不同治疗组的裸鼠的主要器官组织样本用H&E染色。比例尺为200μm。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明，凡在本发明的主体设计思想上经过无创造性的替代或变换所获得的其他实施例，都在本发明的保护范围之内。
实施例1：化合物B4的合成
合成路线如下所示：
(1)合成化合物B1
B1是通过文献报道的方法合成的[1]。氩气保护，将2,4-二甲基吡咯(760mg，8mmol)和4-羟基苯甲醛(488mg，4mmol)在200ml干燥DCM(Dichloromethane，二氯甲烷)中溶解。加入4滴三氟乙酸，用锡纸包裹装有混合物的试剂瓶，在室温下持续缓慢搅拌4h。然后将2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(884mg，4mmol)加入溶液中，再搅拌20min。然后将反应混合物用三乙胺(6mL)处理5min，随后用注射器将三氟化硼乙醚(6.4mL)缓慢滴加入混合液中，继续反应40min。反应结束后，得到的深棕色混合物，用超纯水(3×20mL)和盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩，再经过硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/9，v/v)纯化，得到红色晶体B1(产率：32％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.12(d,J＝7.8Hz,2H),6.95(d,J＝7.8Hz,2H),5.98(s,2H),2.55(s,6H),1.44(s,6H)；HRMS m/z:C19H19BF2N2O[M+Na]+calcd for363.1645found 363.1609。
参考文献：
[1]Wang Q,Lu H,Gai L,et al.Emission ofboron dipyrromethene dyesthrough energy transfer to their S2 state frompolysilane S1 state[J].DyesPigments,2012,94(2):183-186.
(2)合成化合物B2
将B1(400mg，96mmol)和3-溴丙炔(205mg，140mmol)溶解于含有无水碳酸钾(132mg，77mmol)的丙酮(50mL)中，反应溶液在回流条件下反应40h。加入超纯水后，产物用DCM进行萃取，萃取物经过干燥后蒸发溶剂。以DCM/正己烷(3：2)作为洗脱剂，通过硅胶柱层析纯化粗品，得到红色固体B2(产率：50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19(d,J＝7.7Hz,2H),7.09(d,J＝7.5Hz,2H),6.16-5.97(m,2H),4.76(s,2H),2.63-2.55(m,7H),1.42(s,6H)；HRMS m/z:C22H21BF2N2O[M+H]+calcd for 379.1793found 379.1777.
(3)合成化合物I-BODIPY 3(B3)
将B2(215mg，0.57mmol)和碘(335mg，1.31mmol)加入到15mL无水乙醇溶液中，然后将碘酸(230mg，1.31mmol)溶解在1.5mL的水中，再加入到混合溶液中，于室温下搅拌反应。当所有起始物质消耗完毕后，加入饱和的硫代硫酸钠水溶液(10mL)，并将产物提取到有机相DCM(3×30mL)中。有机相中的萃取物经过干燥后，通过旋转蒸发仪将溶剂蒸发。接着，经过硅胶柱层析(DCM/正己烷＝1/3，v/v)纯化，得到红色固体B3(产率：70％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.16(d,J＝8.2Hz,2H),7.11(d,J＝8.2Hz,2H),4.78(s,2H),2.64(s,6H),2.57(s,1H),1.43(s,6H)；HRMS m/z:C22H19BF2I2N2O[M]+calcd for629.9648found629.9669.
(4)合成化合物I-BODIPY 4(B4)
将B3(200mg，0.32mmol)和4-甲氧基苯甲醛(173.2mg，1.27mmol)溶解于甲苯(29mL)中，加入乙酸(冰醋酸)(0.6mL，11.52mmol)和哌啶(0.9mL，7.8mmol)。将所得混合物加热回流数小时。然后，溶剂在减压下浓缩，残留物用超纯水(20mL)稀释后，用CDM进行萃取。萃取物使用无水硫酸钠干燥后将溶剂蒸发，再经过硅胶柱层析(DCM/正己烷＝1/1，v/v)纯化，得到绿色固体B4(产率：60％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.13(d,J＝16.6Hz,2H),7.71–7.52(m,6H),7.20(d,J＝8.7Hz,2H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H),4.79(s,2H),3.86(s,6H),2.58(t,J＝2.4Hz,1H),1.49(s,6H)；HRMS m/z:C38H31BF2I2N2O3[M+Na]+calcd for 889.0383found 889.0334.
实施例2：纳米复合材料-自组装荧光纳米探针(CAT-I-BODIPY NPs)的制备
CAT-I-BODIPYNPs是通过超分子自组装策略制备的。简而言之，将CAT溶液和B4溶液按不同的比例混合后进行自组装。首先，获取高浓度原液。具体操作：第1步，用万分之一天平分别称取1mg CAT溶于1mLPBS(pH＝7.4)溶液中，得到高浓度的CAT原液；称取1mg B4溶于DMSO(1mL)中，得到高浓度的B4原液。第2步，稀释原液。具体操作：将0.275mL高浓度的CAT溶液溶于0.725mLPBS溶液中混匀即可；取0.009mL B4溶液溶于DMSO(0.991mL)中即可。第3步，将CAT稀释后溶液与B4稀释后溶液按不同摩尔浓度比例混匀。本实验主要设置了4组不同比例，分别是：CAT：B4＝(5：1)、(1：1)、(1：5)、(1：10)。第4步，将4组组装溶液置于数控超声波清洗器内避光超声30min，水温0℃。第5步，将小磁子分别放入组装溶液内，在室温下将4组组装溶液瓶置于磁力搅拌器上缓慢搅拌2h，即可获得4组不同比例的自组装荧光纳米探针。将混合液放在4℃冰箱内避光保存，直到使用。
使用相同的方法将BSA(Bovine albumin，牛血清白蛋白)与B4进行自组装得到BSA-I-BODIPYNPs。
试验例1：纳米复合材料(CAT-I-BODIPY NPs)的特性
CAT作为一种强有力的酶，能够引发肿瘤中内源性H2O2的分解，从而产生氧气。为了解决肿瘤缺氧的问题，引入了天然蛋白CAT作为组装图案的重要组成部分，并首先用DLS测量了自由CAT的尺寸分布。CAT与PSs的结合不仅可以解决PSs的水溶性问题，还可以提高PDT的疗效。B4作为一种PSs，在与CAT的摩尔浓度比为1:1时，B4通过分子间作用插入到过氧化氢酶CAT的特定部位，具体包括插入到CAT氨基酸序列上的382ARG,383VAL,385ASN,63HIS,387GLN,388ARG,389ASP,398GLN,397ASN,396ASP,395GLN,394MET,369ASN,372HIS,374PRO,377CYS,395GLN,394MET(图11,12)。TEM显示球状NPs具有均匀的尺寸，平均直径约为100纳米，被称为CAT-I-BODIPY(CIB)NPs(图13)。水动力直径和多分散指数分别为118.2纳米和0.171(图13)。CIB NPs的荧光强度峰值是四组中最高的，表明其有序的组装保持了功能(图14)。当CAT的浓度与B4的浓度大致相等(CAT:B4＝1:1)时，发现最佳的组装条件。组装动力学(图15)和稳定性研究表明CIB NPs在水溶液中保持稳定达72小时(图16)。
对CAT及CIB NPs的产氧能力进行研究(图17)。结果发现，CIB NPs的产氧量高于CAT，表明了探针的有序排布更好地保持了CAT的酶活性。此外，研究了不同光照时间下CIBNPs中溶解氧的浓度(图18)。结果表明，在光照下，溶解氧浓度明显下降，证实I-BODIPY诱导的PDT是一个耗氧过程，并表明由于CAT的存在，激光照射15min应该是合适的，可以维持O2能力。
试验例2：纳米复合材料(CIB NPs)体外生物安全性和抗肿瘤特性
在乏氧、黑暗条件下，使用CCK-8试验对A549进行体外细胞毒性分析(图19)，发现CAT、B4、CIB NPs和BSA-I-BODIPY(BIB)NPs对细胞活力没有明显影响，表明其在PDT应用中具有优异的生物安全性。此外，在乏氧条件下，使用CCK-8试验对A549进行体外抗肿瘤特性分析(图20)，发现CIB NPs的抗肿瘤效果明显优于CAT、B4和BIB NPs，表明其在PDT应用中有显著的抗肿瘤效果。通过在37℃下将CIB NPs与A549细胞共同培养并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检查，评估了CIB NPs的细胞吸收和成像能力。在650nm激光激发下，CIB NPs发出位于A549细胞胞浆中的明亮的红色荧光，表明其具有可视化的潜力(图21)。不同孵化时间的细胞荧光变化显示，细胞亮度逐渐增加，在6小时达到最大值，表明在肿瘤细胞中富集的效果最佳(图21,22)。
活性氧(ROS)在PDT中至关重要，其中1O2是一种独特的、受激后产生的高活性ROS。在PDT中，1O2的产生是由PSs激活的，可以破坏肿瘤细胞。检测1O2产生的一个有效的荧光探针是SOSG，它在反应时产生强烈的绿色荧光。图21显示BIBNPs+laser组有明亮的绿色荧光，CIB NPs+激光组有更明亮的绿色荧光，表明1O2的存在。CIB NPs+laser组显示，肿瘤细胞中CAT产生的氧可以明显增强I-BODIPY分子的PDT效果，产生更多的1O2和更强的荧光(图23,24)。
通过使用Calcein-AM/PI双重染色法(绿色：活细胞；红色：死细胞)观察不同条件下的细胞形态变化，进一步研究CIB NPs对A549细胞的细胞毒作用和光敏性。结果显示，CIBNPs+laser组表现出强烈的红色荧光，细胞形状消失，表明CIB NPs有效地杀死了A549细胞(图25,26)。
Annexin V-FITC/PI双染色法被用来研究所设计的NPs的凋亡效果。Control组和Control+laser组的细胞凋亡率可以忽略不计，但用BIB NPs处理后细胞凋亡率增加(≈15.35％)(图27)。相比之下，CIB NPs的凋亡率最高(≈40.81％)，表明CIB NPs诱导了A549细胞的凋亡。
试验例3：纳米复合材料(CIB NPs)体内近红外成像引导下的PDT
为了研究使用CIB NPs进行体内肿瘤治疗的可行性，在裸鼠身上进行了实验，通过皮下注射A549细胞建立实体瘤模型。在不同的时间点测量体内荧光强度，显示CIB NPs很容易通过营养血管穿透肿瘤组织。图28表明，静脉注射后，肿瘤部位的荧光强度逐渐增加，在注射后18小时达到峰值。由于CIB NPs的代谢积累，肝脏显示出最亮的荧光强度，24小时后明显下降，表明在体内快速代谢降解。因此，PDT是在18小时的时间点进行的(图29)。为了评估CIB NPs对裸鼠肿瘤的PDT疗效，将肿瘤表面的血液洗净，用肉眼观察其形态和大小变化。图30显示，对照组在光照和不光照的情况下，肿瘤生长明显，而在BIB+laser组中，肿瘤生长略有下降，在CIB NPs+laser组中则明显下降。各组的肿瘤体积变化见图31。经过15天的多次PDT治疗，对照组的肿瘤体积迅速增加，而BIB NPs+laser组的肿瘤体积增加较慢，CIBNPs+laser组的肿瘤体积明显减少。各组的肿瘤质量显示CIB NPs+laser组的肿瘤质量明显减少。这些结果表明，CIB NPs+laser组中CAT的原位产氧明显增强了1O2的生成，抑制了肿瘤的生长，减少了肿瘤的大小。相比之下，BIB NPs+laser组由于缺氧环境，显示出较弱的抗肿瘤效果。对照组的快速肿瘤增殖消除了近红外辐射对肿瘤抑制的影响。
试验例4：体内生物安全性评估
通过对各组裸鼠肿瘤取样并进行H&E染色和TUNEL染色组织学分析，对治疗效果进行了显微镜评估(图32)。CIB NPs+laser组表现出大量死亡的肿瘤细胞，表明通过CIB NPs介导的PDT对肿瘤细胞的杀伤力明显增强。通过监测各组小鼠的体重变化(图33)来评估体内生物安全性。实验结果发现各组小鼠体重没有观察到明显异常变化，证实了CIB NPs的生物安全性和生物相容性。此外，各组主要器官的H&E染色(图34)显示没有细胞坏死或炎症病变，进一步强调了CIB NPs在体内应用中的生物安全性和生物相容性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种氟化硼络合二吡咯甲川衍生物，其特征在于，所述氟化硼络合二吡咯甲川衍生物命名为化合物B4，具有如下式(I)所示的化学结构：
2.一种如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)氩气保护条件下，将2,4-二甲基吡咯和4-羟基苯甲醛溶解于二氯甲烷中，然后滴加三氟乙酸，在黑暗条件下搅拌反应，然后向反应液中加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，继续搅拌，将反应混合物用三乙胺处理后，滴加三氟化硼乙醚于混合液中，继续搅拌反应，纯化，得到化合物B1；
(2)将化合物B1和3-溴丙炔溶解于含有无水碳酸钾的丙酮中，回流条件下反应，纯化，得到化合物B2；
(3)将化合物B2和碘加入到无水乙醇溶液中，得到混合溶液，将碘酸溶解在水中，然后再加入到混合溶液中，搅拌反应，纯化，得到化合物B3；
(4)将化合物B3和4-甲氧基苯甲醛溶解于甲苯中，然后加入乙酸和哌啶，加热回流条件下反应，纯化，得到化合物B4。
3.一种自组装荧光纳米探针，其特征在于，包括如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川衍生物及过氧化氢酶CAT，所述氟化硼络合二吡咯甲川衍生物通过分子间作用插入到过氧化氢酶CAT的特定部位，所述荧光纳米探针为球状，平均直径为100nm，水动力直径和多分散指数分别为118.2nm和0.171，所述过氧化氢酶CAT的特定部位包括382ARG,383VAL,385ASN,63HIS,387GLN,388ARG,389ASP,398GLN,397ASN,396ASP,395GLN,394MET,369ASN,372HIS,374PRO,377CYS,395GLN,394MET。
4.如权利要求3所述的自组装荧光纳米探针在在制备荧光探针试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述荧光探针试剂为用于诊断肿瘤的试剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为非小细胞肺癌。
7.一种如权利要求3所述的自组装荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：由CAT溶液和化合物B4溶液混合均匀得到。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述CAT溶液和化合物B4溶液的摩尔浓度比为1-5:5-1。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述CAT溶液和化合物B4溶液的摩尔浓度比为1：1。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述CAT溶液采用如下方法制备：称取1mg CAT溶于1mLpH＝7.4的PBS溶液中，得到高浓度的CAT原液，然后将0.275mL高浓度的CAT溶液溶于0.725mLPBS溶液中混匀即可；所述化合物B4溶液采用如下方法制备：称取1mgB4溶于1mLDMSO中，得到高浓度的B4原液，取0.009mLB4溶液溶于0.991mL DMSO中即可；所述自组装荧光纳米探针采用如下方法制备：取0.9mL CAT溶液与0.1mLB4溶液混合均匀。
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