CN116990415B - 一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法 - Google Patents
一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法，本发明首次基于麻痹性贝类毒素特征碎片离子提取技术建立了一种不同类型麻痹性贝类毒素的超高效液相色谱‑高分辨质谱检测方法，所述方法通过提取麻痹性贝类毒素高分辨特征碎片离子，实现样品中典型麻痹性贝类毒素的快速锁定，结合标准品二级质谱比对，最终实现麻痹性贝类毒素的非靶向筛查和准确鉴定，在食品安全领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于毒素分析检测领域，具体地，本发明涉及一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法。
背景技术
麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins，PSTs)是目前分布最广、危害最大的藻毒素，主要由亚历山大藻属(Alexandrium)中的一些藻株产生。PSTs会阻塞钠离子通道，并引起麻木、肌肉无力、呼吸麻痹等神经系统症状，严重时可能导致死亡。复杂样品中PSTs的检测鉴定一直是海洋毒素研究领域的热点工作，在海产品质量安全等领域具有重大意义。
PSTs的检测方法主要有生物学小鼠测定法、细胞毒性测试法、免疫测定法、高效液相色谱法(UHPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。其中HPLC-MS/MS技术因具有较高的灵敏度、重现性以及选择性而逐渐成为海洋生物毒素分析鉴定的主流技术。然而，目前的方法大多使用液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-TQMS)，建立目标毒素的靶向检测方法，灵敏度高，适于已知毒素的定量检测，但缺点在于覆盖度低，依赖于标准物质提前建立靶向多反应监测(MRM)方法，难以实现多种PSTs的同时筛查。
目前，关于PSTs的检测方法多采用靶向鉴定策略，虽然基于该方法能够实现目标化合物的灵敏、准确鉴定，但是由于该方法采用靶向鉴定策略，覆盖度低，仅仅能够实现目标物列表中目标化合物的鉴定，且依赖标准物质比对，无法实现PSTs毒素的高通量、非靶向筛查。因此，本领域亟需建立一套适用于贝肉样本中多种典型PSTs的非靶向筛查和准确鉴定的高效非靶向筛查方法。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术存在的不同类型PSTs难以实现非靶向筛查和准确鉴定的这一技术问题，本发明的目的在于提供一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法。
本发明建立了一套高效的、覆盖典型PSTs的非靶向筛查方法，能同时对贝肉样品中3大类PSTs(氨基甲酸基类、N-磺酰胺基甲酰基类、脱氨基甲酰基类)进行非靶向、高灵敏筛查，解决了现有检测技术覆盖度低，特别是难以实现典型PSTs毒素非靶向筛查的这一技术问题，首先，本发明采用含35％乙腈的0.1％甲酸水溶液对贝肉样本进行溶剂提取，经过振荡和超声10min后，离心取上清液进行Superclean Envi-Card固相萃取净化，使用20％乙腈的1％乙酸水溶液洗脱目标化合物，经过上述操作，对12种包括3大类典型PSTs的回收率在65％以上。将经过上述处理的样本注入超高效液相色谱-高分辨质谱仪(UHPLC-HRMS/MS)中进行分析，该方法具有高灵敏度、高覆盖度以及准确度可靠等优点，适用于贝肉样本中多种典型PSTs的非靶向筛查和准确鉴定。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法。
进一步，所述筛查方法包括如下步骤：
(1)溶剂提取：取贝肉样品，绞碎，称取1.0±0.02g样品，加入5.0mL 35％ACN/0.1％甲酸水溶液，涡旋振荡、超声、离心得到提取上清液；
(2)固相萃取：取步骤(1)中得到的提取上清液1.0mL，离心浓缩至干，使用1.0mL甲酸铵复溶得到待净化样品，分别用3.0mL乙腈/水/乙酸溶液、3.0mL甲酸铵平衡SupercleanEnvi-Card SPE柱，所述待净化样品以自然流速过柱，用2.0mL甲酸铵和1.0mL甲醇洗涤SPE柱，最后用1.0mL乙腈/水/乙酸溶液洗脱，收集洗脱液1.0mL，离心浓缩至干，用100μL乙腈/水溶液复溶，离心后得到待测上清液；
(3)超高效液相色谱-高分辨质谱检测：采用超高效液相色谱-高分辨质谱仪对步骤(2)中得到的待测上清液进行检测，所述超高效液相色谱-高分辨质谱仪的参数如下：
色谱条件：ACQUITY BEH amide色谱柱，柱温35℃，进样量5μL，流速0.3mL/min，进样体积2μL，流动相A为含0.16％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.0min，98％流动相B，1.0～20min，降低至50％流动相B，20～25min，保持50％流动相B，25～26min，升至98％流动相B，26～30min，保持98％流动相B；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)，毛细管电压为3.2kV；雾化气温度为350℃；离子传输管温度为325℃；鞘气压力为40arb；辅助气压力为5arb；质谱扫描方法为全扫描结合非靶向数据依赖二级质谱扫描模式；一级全扫描参数：扫描范围为m/z 100-700，质谱分辨率为60000；二级ddMS2扫描参数：选择一级质谱中响应前10的离子作为二级MS/MS采集的前体离子，前体离子隔离窗口为m/z 1.5，阶梯式归一化碰撞能量选择40，45，55，60以及65V，二级质谱分辨率为15000，色谱峰宽设置为10s，顶点触发选择30％。
进一步，步骤(1)中所述涡旋振荡的条件为2500rpm/min转速下涡旋振荡5min。
进一步，步骤(1)中所述超声、离心的条件为水浴超声10min，以9000rpm/min转速离心10min。
进一步，步骤(2)中所述离心浓缩的条件为在30℃下离心浓缩至干；
优选地，步骤(2)中所述甲酸铵的浓度为50mM；
优选地，步骤(2)中所述乙腈/水/乙酸溶液为乙腈/水/乙酸溶液(20:80:1v/v/v)。
进一步，步骤(2)中所述Superclean Envi-Card SPE柱的规格为250mg 3mL；
优选地，步骤(2)中所述乙腈/水溶液为50％乙腈/水溶液；
优选地，步骤(2)中所述离心后得到待测上清液的离心条件为15000rpm/min转速离心5min。
进一步，步骤(3)中所述ACQUITY BEH amide色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm。
进一步，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
优选地，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过对比实验验证发现，乙腈/0.1％甲酸水溶液(ACN/0.1％甲酸水溶液)作为提取溶剂，能够显著提高GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率，且显著优于本领域常用的其他类型的提取溶剂(1％乙酸(1％ AcOH)、0.1M HCl)，取得了预料不到的技术效果。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过对比实验验证发现，乙腈和0.1％甲酸水溶液的配比对不同类型PSTs的提取起到关键作用，乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为35％时，对14种PSTs的提取效率显著最优，回收率在65-123％之间，显著优于其他配比，取得了预料不到的技术效果。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过对比实验验证发现，Superclean Envi-Card固相萃取柱对不同类型PSTs的同时提取的效率最高，回收率最优，显著优于PRiME HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱、Bond-Elute-Si固相萃取柱，取得了预料不到的技术效果。
在本发明的具体实施方案中，步骤(3)还包括数据处理与分析这一步骤，使用质谱仪配套的Trace Finder 5.1软件采集数据，然后在Xcalibur 4.4中对数据进行处理，在MS2通道中分别提取不同类型PSTs高分辨特征碎片离子，实现典型PSTs的非靶向筛查和快速锁定，将筛查出的目标物二级质谱与标准品进行比对，实现目标物的准确鉴定。
在一些实施方案中，本发明所述离心浓缩可采用本领域技术人员熟知的任何方法进行，只要能够将目标溶液离心浓缩至干的方法均在本发明的保护范围内。在本发明的具体实施方案中，本发明采用离心浓缩仪将目标溶液在30℃下离心浓缩至干。
在一些实施方案中，本发明所述典型麻痹性贝类毒素并不局限于STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3，任何类型的麻痹性贝类毒素及其类似物均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，本发明所述待测贝肉的来源包括但不限于贻贝、蛤、牡蛎、扇贝、鸟蛤，任何含有或疑似含有麻痹性贝类毒素的待测贝肉均在本发明的保护范围内。
本发明的第二方面提供了一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的处理方法。
进一步，所述处理方法包括如下步骤：
(a)溶剂提取：取贝肉样品，绞碎，称取1.0±0.02g样品，加入5.0mL 35％ACN/0.1％甲酸水溶液，涡旋振荡、超声、离心得到提取上清液；
(b)固相萃取：取步骤(a)中得到的提取上清液1.0mL，离心浓缩至干，使用1.0mL甲酸铵复溶得到待净化样品，分别用3.0mL乙腈/水/乙酸溶液、3.0mL甲酸铵平衡SupercleanEnvi-Card SPE柱，所述待净化样品以自然流速过柱，用2.0mL甲酸铵和1.0mL甲醇洗涤SPE柱，最后用1.0mL乙腈/水/乙酸溶液洗脱，收集洗脱液1.0mL，离心浓缩至干，用100μL乙腈/水溶液复溶，离心后得到待测上清液。
进一步，步骤(a)中所述涡旋振荡的条件为2500rpm/min转速下涡旋振荡5min；
优选地，步骤(a)中所述超声、离心的条件为水浴超声10min，以9000rpm/min转速离心10min；
优选地，步骤(b)中所述离心浓缩的条件为在30℃下离心浓缩至干；
优选地，步骤(b)中所述甲酸铵的浓度为50mM；
优选地，步骤(b)中所述乙腈/水/乙酸溶液为乙腈/水/乙酸溶液(20:80:1v/v/v)；
优选地，步骤(b)中所述Superclean Envi-Card SPE柱的规格为250mg 3mL；
优选地，步骤(b)中所述乙腈/水溶液为50％乙腈/水溶液；
优选地，步骤(b)中所述离心后得到待测上清液的离心条件为15000rpm/min转速离心5min；
优选地，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
优选地，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
本发明的第三方面提供了如下任一方面应用：
(1)本发明第一方面所述的筛查方法在用于检测贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
(2)本发明第二方面所述的处理方法在用于检测贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
(3)本发明第一方面所述的筛查方法在用于检测食品、药品或日化产品中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
(4)本发明第二方面所述的处理方法在用于检测食品、药品或日化产品中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
(5)35％ ACN/0.1％甲酸水溶液在提取贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
(6)Superclean Envi-Card SPE柱在萃取贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
优选地，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
优选地，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
(1)本发明首次基于PSTs特征碎片离子提取技术建立了一种不同类型PSTs的超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS/MS)检测方法，通过提取PSTs高分辨特征碎片离子，实现样品中典型PSTs的快速锁定，结合标准品二级质谱比对，最终实现PSTs的非靶向筛查和准确鉴定，应用本发明建立的样品制备和UHPLC-HRMS/MS检测方法，可实现贝肉基质中多种典型PSTs的非靶向筛查；
(2)本发明提供的用于贝肉基质中多种典型PSTs的非靶向筛查方法不需要提前建立化合物MRM监测列表，基于特征碎片离子提取技术，可实现典型PSTs的快速锁定和非靶向筛查，具有覆盖度高、专属性好、灵敏度高、操作简单等优点，能够同时实现氨基甲酸基类、N-磺酰胺基甲酰基类以及脱氨基甲酰基类典型PSTs的非靶向筛查与准确鉴定，为PSTs的监测提供了技术支持；
(3)本发明通过对比实验验证，首次发现乙腈/0.1％甲酸水溶液作为提取溶剂，能够显著提高GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率，且显著优于本领域常用的其他类型的提取溶剂(1％ AcOH、0.1M HCl)，乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为35％时，对14种PSTs的提取效率显著最优，回收率在65-123％之间，显著优于其他配比，取得了预料不到的技术效果；
(4)本发明通过对比实验验证，首次发现Superclean Envi-Card固相萃取柱对不同类型PSTs的同时提取的效率最高，回收率最优，显著优于PRiME HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱、Bond-Elute-Si固相萃取柱，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中STX特征碎片离子60.0556、108.0556和138.0662和204.0880的提取离子色谱图，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：STX特征碎片离子60.0556在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.57min，强度5.05E4；b图：STX特征碎片离子108.0556在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.57min，强度3.18E4；c图：STX特征碎片离子138.0662在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.57min，强度3.90E4；
图2为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中STX二级质谱图和200ng/mL STX标准品二级质谱图谱图比较，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中STX二级质谱图；b图：200ng/mL STX标准品二级质谱图；
图3为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中GTX6特征碎片离子60.0556、108.0556、126.0662、238.0935和255.1200的提取离子色谱图，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：GTX6特征碎片离子60.0556在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.95min，强度4.83E5；b图：GTX6特征碎片离子84.0444在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.95min，强度8.59E5；c图：GTX6特征碎片离子138.0662在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.95min，强度2.28E4；d图：GTX6特征碎片离子298.1254在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝14.95min，强度1.29E4；
图4为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中GTX6二级质谱图和200ng/mL GTX6标准品二级质谱图谱图比较，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中GTX6二级质谱图；b图：200ng/mL GTX6标准品二级质谱图；
图5为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中dcNEO特征碎片离子108.0556、126.0662、238.0935和255.1200的提取离子色谱图，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：dcNEO特征碎片离子108.0556在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝13.15min，强度2.05E5；b图：dcNEO特征碎片离子126.0662在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝13.15min，强度2.00E5；c图：dcNEO特征碎片离子238.0935在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝13.15min，强度1.13E5；d图：dcNEO特征碎片离子255.1200在MS2通道的提取离子色谱图，RT＝13.15min，强度8.35E4；
图6为含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中dcNEO二级质谱图和200ng/mL dcNEO标准品二级质谱图谱图比较，横坐标为时间min，纵坐标为离子强度，其中，a图：含100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本中dcNEO二级质谱图；b图：200ng/mL dcNEO标准品二级质谱图；
图7为QCM样品分析的质量前沿碎片离子搜索(FISh)结果的屏幕截图，其中，左图：从FISh分析中提取的成分数量；右上图：FISh分析样品的总离子流图，三角形代表鱼检出的成分；右下图：所选组分的MS/MS谱图，质谱中的红色条表示FISH分析匹配的碎片离子；
图8为mzCloud在QCM中搜索组件96(316.1364的前体)的屏幕截图，其中，左图：mzCloud Library中匹配的化合物；右图：MS/MS谱图与mzCloud数据库条目的比较；
图9为STX特征碎片离子的提取离子色谱图、MS/MS谱图和结构解析，其中，左图：样品SM-04中的STX；右图：STX标准；
图10为mzCloud在SM-03(300.1414的前身)中搜索组件的屏幕截图，其中，左图：mzCloud Library中匹配的化合物；右图：MS/MS谱图与mzCloud数据库条目的比较；
图11为不同类型的提取溶剂和不同配比的提取溶剂和对贝类中14种典型PSTs的回收率，其中，a图：不同类型的提取溶剂对贝类中14种典型PSTs的回收率的影响；b图：不同配比的提取溶剂对贝类中14种典型PSTs的回收率的影响；
图12为4种固相萃取柱对目标化合物(14种不同类型PSTs)同时提取时回收率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1贝肉基质PSTs加标样本配制
1、实验材料
双壳贝类采购于当地超市；破壁粉碎机购于中国天喜公司；IKA涡旋振荡器购于Sigma-Aldrich公司；超纯水购于Merck公司。PSTs标准溶液购自加拿大NRC研究所，包括：STX，22.85μg/mL，NEO，20.51μg/mL；GTX1&4，22.53μg/mL和7.41μg/mL；GTX2&3，38.19μg/mL和16.19μg/mL；GTX5，20.33μg/mL；GTX6，5.22μg/mL；C1&2，44.59μg/mL和13.03μg/mL；dcSTX，16.73μg/mL；dcNEO，10.49μg/mL；dcGTX2&3，35.1μg/mL和8.0μg/mL。
2、实验方法
14种PSTs混合标准溶液：分别准确吸取43.8μL STX(22.85μg/mL)，48.8μL NEO(20.51μg/mL)，134.9μL GTX1&4(22.53μg/mL和7.41μg/mL)，61.8μL GTX2&3(38.19μg/mL和16.19μg/mL)，49.2μL GTX5(20.33μg/mL)，191.6μL GTX6(5.22μg/mL)，76.4μL C1&C2(44.59μg/mL和13.03μg/mL)，59.8μL dcSTX(16.73μg/mL)，95.3μL dcNEO(10.49μg/mL)，125μL dcGTX2&3(35.1μg/mL和8.0μg/mL)于1.5mL离心管，加入113.4μL超纯水定容，振荡混匀后静置30min，得到浓度为1.00μg/mL的PSTs混合物标准溶液(其中GTX1，GTX2，C1和dcGTX2的浓度分别为3.04，2.36，3.40和4.39μg/mL)。
贝肉基质加标样本：将购买的双壳贝类去壳、漂洗，然后绞碎得到匀浆，准确称取1.0g(精确至0.01g)样品于50mL聚丙烯离心管中。加入100μL 1.0μg/mL PSTs混标储备液，振荡混匀后静置30min，配制得到浓度为100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本(其中GTX1，GTX2，C1和dcGTX2的加标浓度分别为152，118，170和219.5μg/kg)。
3、实验结果
得到浓度为1.00μg/mL的PSTs混合物标准溶液(其中GTX1，GTX2，C1和dcGTX2的浓度分别为3.04，2.36，3.40和4.39μg/mL)。
得到浓度为100μg/kg贝肉基质PSTs加标样本(其中GTX1，GTX2，C1和dcGTX2的加标浓度分别为304，236，340和439μg/kg)。
实施例2样品前处理
1、实验材料
乙腈，超纯水购于Merck公司；甲酸、甲酸铵购于美国Sigma公司；SupercleanEnvi-Carb固相萃取柱(250mg，3mL)购于Supelco公司。
2、实验方法
溶剂提取：向1.0g贝肉基质PSTs加标样本中加入5.0mL 35％ ACN/0.1％甲酸水溶液，于2500rpm/min转速下涡旋振荡5min，水浴超声10min，然后以9000rpm/min转速离心10min。与常规技术通常使用的0.1M HCl以及1％乙酸溶液相比，本发明所使用的35％ ACN/0.1％甲酸水溶液显著提高了GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率。此外，本研究表明，乙腈和0.1％甲酸水溶液的配比对不同类型PSTs的提取起到关键作用，当乙腈与0.1％甲酸水的配比为35％时，对14种PSTs的提取效率最优。
固相萃取：使用离心浓缩仪将1.0mL提取上清液在30℃下离心浓缩至干，然后使用1.0mL 50mM甲酸铵复溶，待SPE净化。分别用3.0mL乙腈/水/乙酸溶液(20:80:1v/v/v)，3.0mL 50mM甲酸铵平衡Superclean Envi-Card SPE柱(250mg 3mL)，1.0mL待净化样品以自然流速过柱，用2.0mL 50mM甲酸铵和1.0mL甲醇洗涤SPE柱，最后用1.0mL乙腈/水/乙酸(20:80:1v/v/v)溶液洗脱，收集洗脱液1.0mL在30℃下离心浓缩至干，用100μL 50％乙腈/水溶液复溶，15000rpm/min转速离心5min，上清液用于UHPLC-HRMS/MS检测。
3、实验结果
分别比较了不同类型提取溶液(1％ AcOH，0.1M HCl和45％ ACN/0.1％甲酸水溶液)对贝肉中14种不同类型PSTs的提取回收率，结果显示，1％ AcOH和0.1M HCl对GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率为40-70％，使用45％ ACN/0.1％甲酸水溶液作为提取溶剂，显著提升了GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率，上升至61-103％(见图11a)。
此外，比较了乙腈和0.1％甲酸水溶液的不同配比(25％、35％、45％、55％、65％和75％)对贝肉中14种不同类型PSTs的提取回收率，结果显示，当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为25％时，STX，NEO和dcSTX回收率较低(＜45％)；当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为65％时，GTX1，dcSTX和dcGTX2回收率较低(＜45％)；当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为35％时，对14种添加PSTs的提取效率最优，回收率在65～123％之间(见图11b)。
在SPE净化时，对Supelco ENVI-Carb的SPE条件进行了改进，为了增加PSTs在固相萃取柱上的保留，在上样前将贝肉提取液样本的溶剂置换为50mM甲酸铵，此外使用1.0mL20％ACN/1％乙酸作为固相萃取洗脱液被证明足以洗脱全部14种PSTs。
实施例3液相色谱-质谱检测
1、实验材料
Orbitrap 240质谱仪购于美国Thermo Scientific公司，Vanquish A10液相色谱仪购于美国Thermo Scientific公司，Waters ACQUITY BEH amide色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)购于美国Waters公司，甲酸、甲酸铵购于美国Sigma公司，乙腈、超纯水购于德国Merck公司。
2、实验方法
色谱条件：ACQUITY BEH amide色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温35℃，进样量5μL，流速0.3mL/min，进样体积2μL，流动相A为含0.16％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.0min，98％流动相B，1.0～20min，降低至50％流动相B，20～25min，保持50％流动相B，25～26min，升至98％流动相B，26～30min，保持98％流动相B。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)，毛细管电压为3.2kV；雾化气温度为350℃；离子传输管温度为325℃；鞘气压力为40arb；辅助气压力为5arb；质谱扫描方法为全扫描结合非靶向数据依赖二级质谱扫描模式(Full scan-data dependent MS2 analysis,FS-ddMS2)；一级全扫描参数：扫描范围为m/z 100-700，质谱分辨率为60000；二级ddMS2扫描参数：选择一级质谱中响应前10的离子作为二级MS/MS采集的前体离子，前体离子隔离窗口为m/z1.5，阶梯式归一化碰撞能量选择40，45，55，60以及65V，二级质谱分辨率为15000，色谱峰宽设置为10s，顶点触发选择30％。
数据处理：Trace Finder 5.1软件采集数据后，在Xcalibur 4.4中对数据进行处理，在MS2通道中分别提取不同类型PSTs高分辨特征碎片离子(见表1)，可实现典型PSTs的快速锁定和非靶向筛查，将筛查出的化合物的二级质谱与标准品进行比对，可实现目标物的准确鉴定。
表1典型PSTs特征碎片离子
3、实验结果
测定结果：典型PSTs贝肉基质加标样本首先进行样品制备，然后采用超高效液相色谱-高分辨质谱仪在正离子模式、FS-ddMS2检测方法进行分析，在1.0g添加100μg/kgPSTs的贝肉样本中可同时实现氨基甲酸基类、N-磺酰胺基甲酰基类以及脱氨基甲酰基类典型PSTs的非靶向筛查与鉴定。
(1)使用Xcalibur 4.4软件进行数据分析中，在MS2通道提取氨基甲酸基类毒素STX的特征碎片离子60.0556(见图1a)，108.0556(见图1b)和138.0662(见图1c)，结果显示，STX的3个特征碎片离子的提取色谱图在14.57min处均有信号，通过查看对应保留时间处的MS/MS二级质谱，筛查出前体离子为300.1411的二级质谱(见图2a)，通过STX标准品的二级质谱图(见图2b)比对，从而实现样品中STX的非靶向筛查与鉴定。
(2)使用Xcalibur 4.4软件进行数据分析中，在MS2通道提取N-磺酰胺基甲酰基类毒素GTX6的特征碎片离子60.0556(见图3a)，84.0444(见图3b)、138.0662(见图3c)和298.1254(见图3d)，结果显示，GTX6的4个特征碎片离子的提取色谱图在14.95min处均有信号，通过查看对应保留时间处的MS/MS二级质谱，筛查出前体离子为396.0932的二级质谱(见图4a)，通过GTX6标准品的二级质谱图(见图4b)比对，从而实现样品中GTX6的非靶向筛查与鉴定。
(3)使用Xcalibur 4.4软件进行数据分析中，在MS2通道提取脱氨基甲酰基类毒素dcNEO的特征碎片离子108.0556(见图5a)，126.0662(见图5b)，238.0935(见图5c)和255.1200(见图5d)，结果显示，dcNEO的4个特征碎片离子的提取色谱图在13.15min处均有信号，通过查看对应保留时间处的MS/MS二级质谱，筛查出前体离子为273.1306的二级质谱(见图6a)，通过dcNEO标准品的二级质谱图(图6b)比对，从而实现样品中dcNEO的非靶向筛查与鉴定。
实施例4方法学验证
1、实验方法
根据FDA的《生物分析方法验证指南》(《行业生物分析方法验证指南》，2018)的指导方针，采用PST强化的贝类样品对该分析方法进行了特异性、线性、灵敏度、基质效应、重复性、准确性和精密度等参数的验证。
用于校准曲线和质量控制的样品的详细信息见表2和表3。通过对空白贝类样品的分析，评价了该方法的特异性。定量分析时，制备样品(为了建立校准曲线和确定检出限(LOD)，将适量的工作溶液加入到解冻的均质液中制备样品。浓度系列设为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、20、75、100、200μg·kg-1；用不含PST的贝类均质液制备质控样品，以验证该方法的重复性、精密度和回收率。设置QC-low(LQC)、QC-medium(MQC)和QC-high(HQC)样品的浓度分别为5.0、50和150μg·kg-1)，建立校准曲线。采用外部标准对贝类样品中加标物浓度的峰面积绘制基质加标校准曲线。采用相同的方法，用无矩阵标准图绘制了无矩阵校准曲线。检测限(LOD)确定为信噪比(S/N)大于3。定量下限(LLOQ)定义为S/N大于5，精密度在20％(％RSD)以内，准确度在标称浓度的20％以内的最低浓度。矩阵效应(Me％)用无矩阵校准溶液的校准图斜率(Ss)与矩阵匹配校准溶液的校准图斜率(Sm)的百分比来评估：
通过分析三个浓度水平下的6个重复QC样品来研究重复性。通过分析1天/连续3天内6个重复的三级QC样品，评价方法的日内/日间准确度和精密度。
表2不同浓度校准曲线样品中14种PST的浓度
表3质控样品中低、中、高浓度的14种PSTs进行重复性、精密度和回收率实验条件
2、实验结果
(1)选择性、线性度和灵敏度
结果显示，在所有基质空白样品中均未发现所有14种分析物的背景/干扰峰，表明该方法具有良好的选择性。该方法在0.5～878μg/kg线性关系良好，达到2～3个数量级，用表1中制备的样品进行评价，在信噪比(S/N)大于3的情况下，各分析物在强化贝类样品中的检测限为0.2～8.78μg/kg(见表4)。
表4贝类中添加的14种PST的方法验证
(2)基体效应、重复性、准确度和精密度
基质效应(Me％)以无基质校正溶液校正曲线斜率(Ss)与基质匹配校正溶液校正曲线斜率(Sm)的百分比表示。结果显示，所制备的贝类样品中各分析物的Me均不显著，范围为92.2％～120.9％，所有的加标PSTs几乎不受基质的影响。此外，在低、中、高浓度水平下，分析方法的重复性良好，RSD为0.30％～7.17％(见表4)。对LQC、MQC和HQC样品进行日内和日间准确度评价，结果显示，LQC的日内准确度为77.6～116.8％，MQC为88.8～117.3％，HQC为93.1～107.3％；LQC的日间准确度为87.49～108.97％，MQC为103.10～118.36％，HQC为90.05～111.29％。日内精密度的相对标准偏差(RSD)分别≤7.80％(LQC)、4.32％(MQC)、2.16％(HQC)。日间精密度分别为≤13.58％、12.37％、4.93％(见表5)。
表5贝类14种PST的准确性和精密度
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实施例5综合筛选策略的验证
为了评估靶向和非靶向筛选策略的能力，通过建立的综合筛选策略对MQC和HQC样本的数据进行处理。结果如表6所示。通过针对性筛选策略，贝类样品中加标的14种PSTs均被成功筛选出来。HQC样品中的所有化合物和MQC样品中14种化合物中的12种均通过内部建立的PSTs化合物数据库和PSTs谱库明确鉴定，包括精确质量(m/z)、RT、碎片离子(FI)、同位素图谱(IP)和MS/MS谱图。
作为比较，本实施例还使用特征碎片匹配分析处理相同的LC-HRMS/MS数据。FISh分析成功地分别在MQC和HQC样品中筛选出9个(共14个)和14个(共14个)PSTs。这些PSTs通过与化学标准品的数据比较或在线MS/MS谱库搜索(例如mzCloud)得到了进一步证实。以MQC中的NEO为例，经过非靶向筛选分析，筛选出组分96中的特征碎片离子60.0556、84.0444、108.0556、126.0662、138.0886、220.0829和298.1254作为潜在的PSTs或结构类似物(见图7)。使用mzCloud谱库搜索组分96的MS/MS谱图，结果表明NEO是最佳匹配的化合物，身份置信度为86.7，如图8所示。因此，使用特征碎片离子匹配策略可以对未知样品中的PST及其结构类似物进行回顾性非靶向筛选。
表6贝类中添加的14种PST的筛选鉴定结果
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实施例6方法应用
根据禁化武组织(禁止化学武器组织)第六次生物毒素分析演习样品制备报告制作的一组模拟样品，本发明所开发的方法能够成功应用于快速高效地分析这些样品，结果显示，即使是浓度最低的10ng/mL，所有阳性样本也被筛选出来(表S11)。例如，在靶向筛选模式下，SM-04筛选出STX，母离子和特征碎片离子质量误差均在5ppm以下，同位素图谱拟合度100％，RT误差更小，小于0.1分钟，并且MS/MS谱图与参考标准的谱图匹配良好(见图9)。此外，非靶向特征片段匹配策略也成功用于发现PSTs和相关结构类似物。以SM-03为例，通过碎片离子搜索(FISh)分析筛选出60.0556、84.0444、108.0556、125.0822和138.0886的特征碎片离子，然后通过在线mzCloud MS/MS库搜索鉴定为STX(见图10)。
表7禁化武组织第六次生物毒素分析演习模拟样品中加标化学品的筛选结果
此外，用该策略对从中国青岛沿海采集的12个真实贝类样品进行了分析，发现所有样品均不含PST，LOD为0.2-8.78μg/kg，这表明该策略在食品安全领域也具有广阔的应用前景。该方法还可以扩展应用到分析可疑食物中毒事件涉及的生物医学样本，这将为法医分析领域提供一个有前途的工具。
对比例1不同种类和配比的提取溶剂对贝肉中14种不同类型PSTs同时提取的对比研究
1、实验材料
在样品中目标化合物提取这一步骤中，提取溶剂的种类和配比对14种不同类型PSTs的同时高效率提取至关重要，本发明对比了不同类型和不同配比的提取溶剂对目标化合物(14种不同类型PSTs)同时提取时回收率的影响。
3种不同种类的提取溶剂：1％ AcOH，0.1M HCl和45％ ACN/0.1％甲酸水溶液。
6种不同配比的提取溶剂：乙腈和0.1％甲酸水溶液的不同配比分别为25％、35％、45％、55％、65％和75％。
2、实验方法
采用上述3种不同种类的提取溶剂、6种不同配比的提取溶剂分别通过如实施例2中所述的方法进行样品前处理并进行回收率的测定。
3、实验结果
分别比较不同类型提取溶剂(1％ AcOH，0.1M HCl和45％ ACN/0.1％甲酸水溶液)，对贝肉中14种不同类型PSTs的提取回收率，结果如图11a所示，结果显示，1％ AcOH和0.1M HCl对GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率为40-70％，使用45％ ACN/0.1％甲酸水溶液作为提取溶剂，显著提升了GTX4，C1，dcSTX和dcGTX3的提取回收率，上升至61-103％，取得了预料不到的技术效果。
分别比较乙腈和0.1％甲酸水溶液的不同配比(25％、35％、45％、55％、65％和75％)对贝肉中14种不同类型PSTs的提取回收率，结果如图11b所示，结果显示，当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为25％时，STX，NEO和dcSTX回收率较低(＜45％)；当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为65％时，GTX1，dcSTX和dcGTX2回收率较低(＜45％)；当乙腈与0.1％甲酸水溶液配比为35％时，对14种添加PSTs的提取效率显著最优，回收率在65-123％之间，取得了预料不到的技术效果。
对比例2不同种类的固相萃取柱对贝肉中14种不同类型PSTs同时提取的对比研究
1、实验材料
在样品中目标化合物提取这一步骤中，不同种类的固相萃取柱对14种不同类型PSTs的同时高效率提取同样至关重要，本发明对比了4种固相萃取柱对目标化合物(14种不同类型PSTs)同时提取时回收率的影响。所述4种固相萃取柱分别为：PRiME HLB(3cc,60mg,Waters)、Oasis MCX(3cc,60mg,Waters)、Bond-Elute-Si(3cc,500mg,AgilentTechnologies)、SupelcleanTM ENVI-CarbTM(3cc,250mg,Supelco Analytical)。
2、实验方法
采用上述4种固相萃取柱分别通过如实施例2中所述的方法进行样品前处理并进行回收率的测定。
3、实验结果
结果如图12所示，结果显示ENVI-Carb固相萃取柱对14种不同类型PSTs的同时提取的效率最高，回收率最优，取得了预料不到的技术效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (32)
1.一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的非靶向筛查方法，其特征在于，所述筛查方法包括如下步骤：
(1) 溶剂提取：取贝肉样品，绞碎，称取1.0±0.02 g样品，加入5.0 mL 35% ACN/0.1%甲酸水溶液，涡旋振荡、超声、离心得到提取上清液；
(2) 固相萃取：取步骤(1)中得到的提取上清液1.0 mL，离心浓缩至干，使用1.0 mL甲酸铵复溶得到待净化样品，分别用3.0 mL乙腈/水/乙酸溶液、3.0 mL甲酸铵平衡Superclean Envi-Card SPE柱，所述待净化样品以自然流速过柱，用2.0 mL甲酸铵和1.0mL甲醇洗涤SPE柱，最后用1.0 mL乙腈/水/乙酸溶液洗脱，收集洗脱液1.0 mL，离心浓缩至干，用100 μL乙腈/水溶液复溶，离心后得到待测上清液；
(3) 超高效液相色谱-高分辨质谱检测：采用超高效液相色谱-高分辨质谱仪对步骤(2)中得到的待测上清液进行检测，所述超高效液相色谱-高分辨质谱仪的参数如下：
色谱条件：ACQUITY BEH amide色谱柱，柱温35°C，进样量5 μL，流速0.3 mL/min，进样体积2 μL，流动相A为含0.16%甲酸和10 mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0~1.0 min，98%流动相B，1.0~20 min，降低至50%流动相B，20~25min，保持50%流动相B，25~26 min，升至98%流动相B，26~30min，保持98%流动相B；
质谱条件：电喷雾离子源（ESI+），毛细管电压为3.2 kV；雾化气温度为350℃；离子传输管温度为325℃；鞘气压力为40 arb；辅助气压力为5 arb；质谱扫描方法为全扫描结合非靶向数据依赖二级质谱扫描模式；一级全扫描参数：扫描范围为m/z 100-700，质谱分辨率为60000；二级ddMS2扫描参数：选择一级质谱中响应前10的离子作为二级MS/MS采集的前体离子，前体离子隔离窗口为m/z 1.5，阶梯式归一化碰撞能量选择40，45，55，60以及65V，二级质谱分辨率为15000，色谱峰宽设置为10 s，顶点触发选择30%；
所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(1)中所述涡旋振荡的条件为2500 rpm/min转速下涡旋振荡5 min。
3.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(1)中所述超声、离心的条件为水浴超声10 min，以9000 rpm/min转速离心10 min。
4.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心浓缩的条件为在30℃下离心浓缩至干。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲酸铵的浓度为50mM。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙腈/水/乙酸溶液为乙腈/水/乙酸溶液（20:80:1 v/v/v）。
7.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(2)中所述Superclean Envi-Card SPE柱的规格为250 mg 3 mL。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙腈/水溶液为50%乙腈/水溶液。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心后得到待测上清液的离心条件为15000 rpm/min转速离心5 min。
10.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，步骤(3)中所述ACQUITY BEH amide色谱柱的规格为2.1 mm×100 mm，1.7 μm。
11.一种贝肉中典型麻痹性贝类毒素的处理方法，其特征在于，所述处理方法包括如下步骤：
(a) 溶剂提取：取贝肉样品，绞碎，称取1.0±0.02 g样品，加入5.0 mL 35% ACN/0.1%甲酸水溶液，涡旋振荡、超声、离心得到提取上清液；
(b) 固相萃取：取步骤(a)中得到的提取上清液1.0 mL，离心浓缩至干，使用1.0 mL甲酸铵复溶得到待净化样品，分别用3.0 mL乙腈/水/乙酸溶液、3.0 mL甲酸铵平衡Superclean Envi-Card SPE柱，所述待净化样品以自然流速过柱，用2.0 mL甲酸铵和1.0mL甲醇洗涤SPE柱，最后用1.0 mL乙腈/水/乙酸溶液洗脱，收集洗脱液1.0 mL，离心浓缩至干，用100 μL乙腈/水溶液复溶，离心后得到待测上清液；
所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
12.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中所述涡旋振荡的条件为2500 rpm/min转速下涡旋振荡5 min。
13.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中所述超声、离心的条件为水浴超声10 min，以9000 rpm/min转速离心10 min。
14.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述离心浓缩的条件为在30℃下离心浓缩至干。
15.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述甲酸铵的浓度为50mM。
16.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述乙腈/水/乙酸溶液为乙腈/水/乙酸溶液（20:80:1 v/v/v）。
17.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述Superclean Envi-Card SPE柱的规格为250 mg 3 mL。
18.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述乙腈/水溶液为50%乙腈/水溶液。
19.根据权利要求11所述的处理方法，其特征在于，步骤(b)中所述离心后得到待测上清液的离心条件为15000 rpm/min转速离心5 min。
20.权利要求1-10中任一项所述的筛查方法在用于检测贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
23.权利要求11-19中任一项所述的处理方法在用于检测贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物。
25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
26.权利要求1-10中任一项所述的筛查方法在用于检测食品、药品或日化产品中典型麻痹性贝类毒素中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
29.权利要求11-19中任一项所述的处理方法在用于检测食品、药品或日化产品中典型麻痹性贝类毒素中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物。
31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
32.35% ACN/0.1%甲酸水溶液在提取贝肉中典型麻痹性贝类毒素中的应用；
所述典型麻痹性贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、麻痹性贝类毒素类似物；
所述麻痹性贝类毒素包括STX、NEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、GTX6、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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