CN116973568A - 受体联合分析对hr+her2+乳腺癌分子亚型及预后的影响 - Google Patents

受体联合分析对hr+her2+乳腺癌分子亚型及预后的影响 Download PDF

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Abstract

本发明涉及受体联合分析对HR+HER2+乳腺癌分子亚型及预后的影响，提供了一种通过检测和比较ERBB2mRNA的表达水平和ESR1mRNA的表达水平或者通过检测和比较HER阳性细胞比例和ER阳性细胞比例来鉴别HER2富集亚型乳腺癌或者HER2富集样亚型乳腺癌的方法、试剂盒和装置，以及相应检测剂用于鉴别HER2富集亚型乳腺癌或者HER2富集样亚型乳腺癌的用途。

Description

受体联合分析对HR+HER2+乳腺癌分子亚型及预后的影响
技术领域
本发明涉及乳腺癌分子亚型鉴定及预后，特别涉及鉴别HR+/HER2+乳腺癌患者。
背景技术
激素受体阳性和人表皮生长因子受体2阳性(HR+/HER2+)乳腺癌约占所有乳腺癌的5-10％。然而，缺乏对HR+/HER2+乳腺癌异质性的认识仍然是制约精准治疗的障碍。
人表皮生长因子受体2(HER2)在约20％的乳腺癌病例中过表达[Guarneri V etal.,(2010)Cancer Treat Rev 36Suppl 3:S62-66.doi:10.1016/S0305-7372(10)70022-0]。大约50％的HER2+乳腺癌也表达激素受体(HR)[Cancer Genome Atlas Network(2012),Nature 490:61-70.doi:10.1038/nature11412]。HR+/HER2+患者比HR-/HER2+患者有更多的治疗选择。目前，转移性HR+/HER2+疾病的标准一线治疗为化疗联合抗HER2治疗[SlamonDJ et al.,(2001)N Engl J Med 344:783-792.doi:10.1056/NEJM200103153441101；Marty M et al.,(2005)J Clin Oncol 23:4265-4274.doi:10.1200/JCO.2005.04.173]。最近，一些研究表明内分泌治疗联合抗HER2治疗也可以使一些转移性HR+/HER2+患者在豁免化疗的情况下同样获益[Huober J et al.,(2012)Breast 21:27-33.doi:10.1016/j.breast.2011.07.006；Tolaney SM et al.,(2020)Lancet Oncol 21:763-775.doi:10.1016/S1470-2045(20)30112-1]。2021年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会报告了SYSUCC-002研究结果，其显示了内分泌治疗联合抗HER2治疗相对于化疗联合抗HER2治疗作为HR+/HER2+转移性乳腺癌的一线治疗的非劣效性[Zhongyu Yuan JH et al.,(2021)Journal ofClinical Oncology 39:15_suppl:1003-1003.doi:10.1186/1471-2407-12-602]。
尽管取得了重大进展，但肿瘤异质性对HR+/HER2+乳腺癌的影响却被低估了。新出现的证据支持肿瘤异质性对临床结果和药物敏感性的影响。首先，所有四种主要的PAM50内在亚型都在HR+/HER2+疾病中表现出来[Cejalvo JM et al.,(2018)Cancer Treat Rev67:63-70.doi:10.1016/j.ctrv.2018.04.015；Zhao S et al.,(2019)Theranostics 9:4935-4945.doi:10.7150/thno.35730]。Liminal亚型患者被认为具有更好的预后和更强的对内分泌治疗的应答[Prat A et al.,(2016)JAMA Oncol 2:1287-1294.doi:10.1001/jamaoncol.2016.0922；Ciruelos E et al.,(2020)Clin Cancer Res 26:5820-5829.doi:10.1158/1078-0432.CCR-20-0844]。HER2富集亚型患者对抗HER2治疗高度敏感[SchettiniF et al.,(2020)Cancer Treat Rev 84:101965.doi:10.1016/j.ctrv.2020.101965；PratA et al.,(2020)J Natl Cancer Inst 112:46-54.doi:10.1093/jnci/djz042]。
此外，HR+/HER2+乳腺癌的异质性可分为肿瘤间异质性和肿瘤内异质性，且随着ERBB2及ESR1表达的多样性而增强。据观察，在免疫组织化学定义的HER2+群体中，HER2的水平并不均匀，ERBB2 mRNA和蛋白水平随免疫组化评分逐渐升高[Griguolo G et al.,(2020)Cancers(Basel)12.doi:10.3390/cancers12071902]。此外，同一肿瘤不同区域的不同HER2状态存在肿瘤内异质性[MarchiòC et al.,(2021)Semin Cancer Biol 72:123-135.doi:10.1016/j.semcancer.2020.02.016]。重要的是，这些异质性与抗HER2治疗在新辅助及晚期患者中的疗效显著相关。[Hou Y et al.,(2017)Breast Cancer Res Treat166:447-457.doi:10.1007/s10549-017-4453-8；Hurvitz SA et al.,(2019)J ClinOncol 37:2206-2216.doi:10.1200/JCO.19.00882]
目前，我们对HR+/HER2+乳腺癌肿瘤异质性的理解相对有限。缺乏可行和可重复的指标来描述肿瘤异质性限制了这一概念的进一步临床应用。因此，需要一种指标来方便快捷的描述并鉴别HR+/HER2+乳腺癌患者异质性。
发明内容
本发明人发现使用ERBB2和ESR1表达的组合分析能有助于鉴别HR+/HER2+乳腺癌中特定亚型的患者。本发明人通过以下方式从多个方面描述HR+/HER2+乳腺癌的肿瘤异质性：1)确定PAM50内在亚型的分布，2)比较HER2富集和非HER2富集亚型的DNA突变谱和RNA表达特征，和3)使用多重免疫荧光(mIF)同时确定HER2和雌激素受体(ER)状态来显示异质性。我们建立了一种新的指标来鉴别HR+/HER2+乳腺癌患者中的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型。
在一个方面，本发明提供了一种有助于预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型乳腺癌的方法，包括：
测量或获得受试者的生物学样品中ERBB2 mRNA水平以及ESR1 mRNA水平和/或受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例以及ER阳性细胞数/比例，以及计算如下的指标rH/E和/或prH/E，
rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]，其中FPKMERBB2是以每百万映射读取每千碱基转录物的片段(FPKM)表示的ERBB2 mRNA水平，以及FPKMESR1是以FPKM表示的ESR1 mRNA水平，
prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
相对于单独分析ERBB2或ESR1 mRNA水平，rH/E更能区分HER2富集亚型和非HER2富集亚型，rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。指标prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例(例如，所述细胞比例是相对于视野中总体肿瘤细胞数的比例，通过在每例患者的mIF染色片中随机选择10个高倍镜视野(×400倍)计数并取平均值得出)，当prH/E≥1.5时，指示所述受试者乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了检测ERBB2 mRNA的检测剂和检测ESR1 mRNA的检测剂和/或检测HER2阳性细胞的检测剂和检测ER阳性细胞的检测剂在制备用于预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒中的用途。
在一个方面，本发明提供了一种预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒，其包含检测ERBB2 mRNA的检测剂和检测ESR1 mRNA的检测剂和/或检测HER2阳性细胞的检测剂和检测ER阳性细胞的检测剂。
在一个方面，本发明提供了检测ERBB2 mRNA的检测剂和检测ESR1 mRNA的检测剂和/或检测HER2阳性细胞的检测剂和检测ER阳性细胞的检测剂，用于预测预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌的用途。
在一个方面，本发明提供了一种治疗乳腺癌受试者的方法，包括测量或获得受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例以及ER阳性细胞数/比例，计算指标prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例(例如通过在每例患者的mIF染色片中随机选择10个高倍镜视野(×400倍)计数并取平均值)，当prH/E≥1.5时，指示所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌并且可考虑给所述受试者施用抗HER2强化治疗。
在一个方面，本发明提供了一种预测预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌的装置，包含：
-测量或接收受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例的部件，
-测量或接收受试者的生物学样品中ER阳性细胞数/比例的部件，和
-计算指标prH/E的部件，其中prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例(例如通过在患者的mIF染色片中随机选择10个高倍镜视野(×400倍)计数并取平均值)：
-任选包含，如果prH/E值≥1.5，指示所述受试者患有预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的部件。
附图说明
图1：TCGA队列(A)和METABRIC队列(B)中HR+/HER2+乳腺癌患者的PAM50内在亚型的分布。
图2：TCGA队列中HR+/HER2+乳腺癌的HER2富集亚型和非HER2富集亚型的分子特征。A：TCGA队列中HER2富集亚型和非HER2富集亚型中热点体细胞突变的瀑布图显示HER2富集亚型患者的TP53和ERBB3突变率显著高于非HER2富集亚型(48％vs.24％,P<0.01；15％vs.1％,P<0.001)，而HER2富集型ER+HER2+乳腺癌患者的PIK3CA突变率显著低于非HER2富集型(15％vs.42％,P<0.001)；B：TCGA队列中HER2富集亚型和非HER2富集亚型差异表达基因热图显示HER2富集亚型高表达G2/M检查点、E2F转录因子及mTOR复合物1信号通路相关基因，而低表达上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)、ER及通过NF-κB介导的肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)信号通路相关基因。TCGA：癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)；mTORC1：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1)；TNF-α：肿瘤坏死因子α；EMT：上皮间充质转换(epithelial mesenchymal transition)；HER2-E：HER2富集亚型；non-HER2-E：非HER2富集亚型；***p<0.001；**p<0.01。
图3：ERBB2和ESR1的组合分析是预测HER2富集亚型的更好标志物。A：TCGA队列中ERBB2在不同PAM50内在亚型中的表达水平；B：TCGA队列中ESR1在不同PAM50内在亚型中的表达水平；C：区分TCGA队列中HER2富集亚型和非HER2富集亚型的不同标志物的ROC曲线显示；D：METABRIC队列中ERBB2在不同PAM50内在亚型中的表达水平；E：METABRIC队列中ESR1在不同PAM50内在亚型中的表达水平；F：区分METABRIC队列中HER2富集亚型和非HER2富集亚型的不同标志物的ROC曲线。TCGA：癌症基因组图谱；METABRIC：国际乳腺癌协会的分子分类数据库(Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium)；AUC：曲线下面积；ROC：受试者工作特征曲线；HER2-E：HER2富集亚型。
图4：多重免疫荧光显示CAMS队列中HR+/HER2+乳腺癌患者中4种不同类型肿瘤细胞。IHC结果：ER＝80％,PR＝10％,HER2＝3+。mIF结果：ER+HER2+细胞＝64.4％,ER+HER2-细胞＝5.2％,ER-HER2+细胞＝16.4％,以及ER-HER2-细胞＝14％。A：H&E图像。B：ER IHC图像。C：PR IHC图像。D：HER2 IHC图像。E：细胞核IF图像。F：HER2 IF图像。G：ER IF图像。H：HER2和ER mIF图(1：ER+HER2-(显微镜下细胞核为蓝色，细胞核内可见的红色荧光，细胞膜上无绿色荧光)；2：ER-HER2+(显微镜下细胞核为蓝色，细胞核内无红色荧光，细胞膜上可见绿色荧光)；3：ER-HER2-(显微镜下细胞核为蓝色，细胞核内无红色荧光，细胞膜上无绿色荧光)；4：ER+HER2+(显微镜下细胞核为蓝色，细胞核内可见的红色荧光，细胞膜上可见绿色荧光))。H&E：苏木精-伊红染色法；IHC：免疫组织化学；IF：免疫荧光；HER2：人表皮生长因子受体2；ER：雌激素受体；PR：孕激素受体。
图5：4种类型肿瘤细胞反映了HR+/HER2+乳腺癌中的肿瘤内异质性。A：CAMS队列中每名患者中4种类型肿瘤细胞的分布；B：含有2、3或4种肿瘤细胞类型的患者的比例；C：4种类型肿瘤细胞间的Spearman’s相关性分析。****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；NS：未示出；HER2：人表皮生长因子受体2；ER：雌激素受体。
图6：HER2富集亚型患者与非HER2富集亚型患者相比，无病生存率显著降低。
具体实施方式
虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。
除非特别限定，本文使用的所有技术和学术术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。本文所述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的方法进行，例如见Sambrook et al.Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
所有4种主要PAM50内在分子亚型的存在清楚证明了HR+/HER2+乳腺癌中显著的肿瘤间异质性。已报道的这4种亚型的分布在各研究中是变化的。与一些研究一致[Carey LAet al.,(2016)J Clin Oncol 34:542-549.doi:10.1200/JCO.2015.62.1268]，本发明显示：Liminal B亚型占最高比例，而HER2富集和Liminal A亚型的比例相似。相反，其它研究报道：HER2富集亚型在HR+/HER2+肿瘤中是主要的[Tolaney SM et al.,(2019)J ClinOncol 37:1868-1875.doi:10.1200/JCO.19.00066；Llombart-Cussac A et al.,(2017)Lancet Oncol 18:545-554.doi:10.1016/S1470-2045(17)30021-9]。
本发明证实了在HR+/HER2+乳腺癌中存在相当的肿瘤间和肿瘤内异质性。我们观察到在HER2富集和非HER2富集亚型间DNA突变和基因表达谱的显著差异。除了ERBB2表达，ESR1表达的多样性也影响了肿瘤异质性。ERBB2对ESR1的相对表达可以有助于鉴别HER2富集亚型的患者。组合分析ERBB2和ESR1表达可能提供了鉴别这个群体中具有特异亚型的患者的更简单更成本有效的方法。本发明发现ERBB2相对于ESR1表达的水平能够比单独的ERBB2表达更准确地预测HER2富集亚型。
本发明提供了一种用于预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌的指标rH/E，其如下计算：rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]，其中FPKMERBB2是以每百万映射读取每千碱基转录物的片段(FPKM)表示的ERBB2 mRNA水平，以及FPKMESR1是以FPKM表示的ESR1mRNA水平。rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)，所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。
本发明提供了一种用于预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的指标prH/E，其如下计算：prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。当prH/E≥1.5时，所述乳腺癌是具有不良预后的HER2富集样亚型。相应地，可以给患有所述预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的患者施用抗HER2强化治疗以治疗乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了一种预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌的方法，包括：
测量或获得受试者的生物学样品中ERBB2 mRNA水平以及ESR1 mRNA水平，以及
计算指标rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]，其中FPKMERBB2是以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平，以及FPKMESR1是以FPKM表示的ESR1 mRNA水平，rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了一种预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的方法，包括：
测量或获得受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例以及ER阳性细胞数/比例，任选测量或获得所述生物学样品中的总体肿瘤细胞数(例如10个视野的平均值)，其中所述比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例，以及
计算指标prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，当prH/E≥1.5时，指示所述受试者乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌。
Perou和Sorlie等学者采用先基因检测技术(前者通过微阵列基因表达数据的多层次聚类分析，后者通过基因表达cDNA微阵列)将乳腺癌在分子层面分为5种不同的亚型，包括Luminal A亚型、Luminal B亚型、HER2富集亚型、基底细胞样亚型及正常乳腺样亚型(Perou CM et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature，2000，406(6797):747-752.DOI:10.1038/35021093)。
如本文所用，术语“HER2富集亚型乳腺癌”是指通过高通量二代测序技术基于基因表达差异划分出的一种乳腺癌亚型，其特征是高频率的ERBB2扩增(约>80％)、TP53突变(约72％)、PIK3CA突变(约39％)和细胞周期蛋白D1扩增(约38％)以及较低频率的PIK3R1突变(约4％)。
如本文所用，术语“HER2富集样亚型乳腺癌”是指根据本发明指标prH/E≥1.5的乳腺癌亚型。该HER2富集样亚型乳腺癌与HER2富集亚型乳腺癌特征相似，均为HER2驱动为主。
如本文所用，术语“ERBB2”是指位于17号染色体上的原癌基因(GenBankAccession Number为NM_004448)，编码人表皮生长因子受体2(HER2)，参与增殖途径的激活并影响分化、侵袭和生存。
如本文所用，术语“ESR1”是指位于6号染色体的基因(GenBank Accession Number为NM_000125)，编码雌激素受体(ER)。ESR1是一种重要的标志物以及Liminal亚型的驱动物，其在部分HR+/HER2+疾病患者中高表达。然而，ESR1表达对于肿瘤异质性的作用是不清楚的。
如本文所用，术语“HER2”是指人表皮生长因子受体-2(Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2，GenBank Accession Number为NP_004439)，为ERBB2(GenBankAccession Number为NM_004448.4等)编码产物。HER2是一种185kD的跨膜精蛋白，简称p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。HER2蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于EGFR家族成员之一。蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，没有已知的配体，HER2蛋白主要通过与家族成员包括EGFR(HERl/erbB1)、HER3/erbB3、HER4/erbB4形成同源或异源二聚体，二聚化后构象发生改变，激活胞内的酪氨酸激酶活性，继而再激活下游通路，从而发挥相应的生理作用。HER2蛋白介导的信号转导途径主要有Ras/Raf/分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途径，磷脂酰肌醇3羟基激酶(PI3K)/Akt途径，信号转导及转录激活(STAT)途径和PLC通路等。之前研究主要关注的HER2表达的强度和位置具有显著的预后和预测作用[MarchiòC et al.,(2021)SeminCancer Biol 72:123-135.doi:10.1016/j.semcancer.2020.02.016；Hou Y et al.,(2017)Breast Cancer Res Treat 166:447-457.doi:10.1007/s10549-017-4453-8；Baselga J et al.,(2016)Clin Cancer Res 22:3755-3763.doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-2499；Perez EA et al.,(2019)BMC Cancer 19:517.doi:10.1186/s12885-019-5687-0]。
如本文所用，术语“ER”是指雌激素受体中的主要类型ERα(GenBank AccessionNumber为NP_000116)，定位于细胞核，雌二醇与其配体结合区域结合时，可导致ER发生构象变化，从而募集共调节蛋白来调节基因转录，促进肿瘤细胞的生长、增殖和存活。在一个实施方案中，所述ER是人ER。
如本文所用，FPKM是RNA-seq技术中常用的描述基因表达的数值，其如下计算：FPKM基因A＝某个样本映射到基因A的外显子上的所有读取(reads)/(某个样本的所有读取总和(百万)×基因A的外显子长度的总和(kB))。在一个样本中一个基因的RPKM等于落在这个基因上的总的读取数(总外显子读取)与这个样本的总读取数(映射的读取(百万))和基因长度(外显子长度(kB))的乘积的比值。
测定一个样本中某个特定基因的FPKM值在本领域技术人员的能力范围内，本领域已知测定FPKM的方法和工具，包括例如但不限于聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)、二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)等。
在一个实施方案中，使用任何合适的检测剂测量以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平或ESR1 mRNA水平，例如引物、探针等。在一个实施方案中，使用引物测量所述ERBB2 mRNA水平或ESR1 mRNA水平。
如本文所用，HER2阳性细胞是指具有可检测HER2蛋白表达的细胞，其可以通过本领域已知的任何方法检测，例如免疫组织化学、荧光、放射性、发光、化学、酶标记、原位杂交或基于与细胞表达的HER2蛋白的特异性结合的其它检测剂的测定方法等。
在一个实施方案中，检测HER2阳性细胞的方法可以如下步骤：将生物学样品与特异性结合HER2蛋白的第一分子(例如抗体)接触，其中任选所述第一分子是标记的，例如是荧光、放射性、发光、酶标记的，然后测量HER2阳性细胞数/比例。
在一个实施方案中，检测HER2阳性细胞的方法可以如下步骤：将生物学样品与特异性结合HER2蛋白的第一分子(例如一抗)接触，然后将HER2蛋白与第一分子的复合物与特异性结合HER2蛋白、所述第一分子或所述复合物的第二分子(例如二抗，如抗IgG抗体)接触，任选所述第二分子是标记的，例如是荧光、放射性、发光、酶标记的，然后测量HER2阳性细胞数/比例。
如本文所用，ER阳性细胞是指具有可检测ER蛋白表达的细胞，其可以通过本领域已知的任何方法检测，例如免疫组织化学、荧光、放射性、发光、化学、酶标记、原位杂交或基于与细胞表达的ER蛋白的特异性结合的其它检测剂的测定方法等。
在一个实施方案中，检测ER阳性细胞的方法可以包括如下步骤：将生物学样品与特异性结合ER蛋白的第三分子(例如抗体)接触，其中所述第三分子是标记的，例如是荧光、放射性、发光、酶标记的，然后测量ER阳性细胞数/比例。
在一个实施方案中，检测ER阳性细胞的方法可以包括如下步骤：将生物学样品与特异性结合ER蛋白的第三分子(例如一抗)接触，然后将ER蛋白与第三分子的复合物与特异性结合ER蛋白、所述第三分子或所述复合物的第四分子(例如二抗，如抗IgG抗体)接触，任选所述第四分子是标记的，例如是荧光、放射性、发光、酶标记的，然后测量ER阳性细胞数/比例。
在一个实施方案中，可以如下测量HER2阳性细胞或ER阳性细胞：将从受试者生物学样品获得的组织或细胞与荧光标记的抗体(例如不同荧光标记的HER2抗体或ER抗体)接触，然后通过显微镜同时观察HER2阳性细胞数/比例或ER阳性细胞数/比例。
本文所述“抗体”、“抗原结合片段”或“免疫原性部分”均具有本领域技术人员通常已知的含义。“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物。抗体标记可以是放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素基团标记。“抗原结合片段”是指通过例如重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用并入本文。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和包含抗体的至少一部分以足以具有抗原特异性结合能力的多肽。
抗体或其片段其制备及使用是熟知的。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述：Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,CSH Press,1988；Ward et al.,Nature 341(1989)544；Bird et al.,Science 242(1988)423；Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999；WO94/02602；US5,223,409；US5,877,293；WO93/01288。
如本文所用，“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。提及抗体与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用，本文所用术语“特异性结合”或“特异性识别”指所述相互作用取决于结合配偶体上特定氨基酸序列或结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换句话说，抗体优先结合或识别结合配偶体，即使结合配偶体存在于其他分子或生物体的混合物中。结合可以通过共价或非共价相互作用或两者的组合来介导。换句话说，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指抗体与抗原决定簇或表位是特异性免疫反应性的，而与其他抗原决定簇或表位不是免疫反应性的。特异性或免疫特异性结合抗原的抗体可以低亲和力结合具有其他肽或多肽，如通过例如放射免疫测定(“RIA”)、酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、BIACORE或本领域已知的其他测定所确定。特异性结合抗原的抗体或其片段可与携带相同表位的相关抗原交叉反应。优选地，与抗原特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应。
特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离平衡常数(KD)表示。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。解离平衡常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10-8M，例如小于约10-8M、10-9M、10-10M或10-11M或更小的KD结合该抗原。在某些实施方案中，当KD≤10×10-8M时，本发明的抗体或其抗原结合片段被认为特异性地结合HER2或ER蛋白。本领域技术人员可以获得HER2蛋白和ER蛋白的特异性抗体。
如本文所用，HER2阳性细胞比例和ER阳性细胞比例是指相对于总体肿瘤细胞数的比例，例如相对于一个计数区域(例如一个组织切片或者显微镜视野)中的总体肿瘤细胞数或者多个计数区域(例如多个例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个组织切片或者显微镜视野)中的总体肿瘤细胞平均数，HER2阳性细胞的比例以及ER阳性细胞的比例。在一个实施方案中，所述比例是多个样品或区域(例如10个高倍镜视野(×400倍))的平均值。
总体肿瘤细胞数可以通过本领域已知的任何合适方法确定。在一个实施方案中，可以计数生物学样品中的总体肿瘤细胞数，例如血细胞计数器方法、通过染色例如使用台盼蓝等。
本文所述“受试者”指任何生物。在一些实施方案中，受试者是动物，非限制性例子包括人、其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，优选医学受试者，更优选癌症患者。在一个实施方案中，所述受试者患有乳腺癌。
如本文所用，所述“生物学样品”是来自被测受试者的任意生物学样品，尤其是包括核酸或者多肽的样品，例如组织、器官，特别地是肿瘤组织样品。在本发明的方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，例如以保护核酸或蛋白质的方式收集。还可以预处理所述样品以增加靶分子的可接近性，如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶标记等等)。如本文所使用，术语“样品”还涵盖受试者的组织和/或细胞和/或体液已取自受试者并且例如已经置于显微镜载片上，并且在载片上执行请求保护的方法。
在一个实施方案中，所述生物学样品是乳腺癌组织样品，例如乳腺癌组织切片。
在一个实施方案中，所述方法如下步骤：
测量或获得乳腺癌组织切片上的总体肿瘤细胞数，
测量或获得所述切片上的HER2阳性细胞数以及ER阳性细胞数，例如通过免疫荧光特别是多重免疫荧光方法，以及
计算所述prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
在一个实施方案中，所述方法通过多重免疫荧光方法确定所述HER2阳性细胞数以及ER阳性细胞数，例如使用HER2抗体和ER抗体。
在一个实施方案中，所述测量HER2阳性细胞和测量ER阳性细胞在样本的同一切片上进行。例如，使用针对HER2和ER蛋白之一的一抗与切片孵育以结合靶蛋白，再使用二抗(例如是标记的，如酶标记的，特别是辣根过氧化物酶标记的)孵育，然后通过适当手段检测阳性细胞(例如检测标记发出的信号，或者加入酶底物并检测相应产物或显色)；然后，使用针对HER2和ER蛋白另一个的一抗与同一切片孵育以结合靶蛋白，再使用二抗(例如是标记的，如酶标记的，特别是辣根过氧化物酶标记的)，然后通过适当手段检测阳性细胞(例如检测标记发出的信号，或者加入酶底物并检测相应产物或显色)。
优选地，确定阳性细胞数/比例包括使用计算机实现的图像分析技术来分析相同切片第一测量和第二测量的至少一个图像例如数字图像或第一测量的切片和第二测量的切片的图像例如数字图像。借助于计算机实现的图像分析技术，可以以基本上自动化的，特别是更客观的方式执行量化。
在一个实施方案中，所述方法包括将抗HER2一抗加到乳腺癌组织切片上并孵育，然后将与HRP偶联的二抗加到切片上并孵育，将第一显色溶液(例如FITC 488,Thermo)加到切片上并孵育；抗原修复后，将抗ER一抗加到切片上并孵育，然后将HRP偶联的二抗加到切片上并孵育，将第二显色溶液(例如Alexa 594，Thermo)加到切片上并孵育；抗原修复后，封片(例如用含DAPI的中性树脂)，最后观测染色结果。
在一个实施方案中，所述方法包括将抗ER一抗滴加到乳腺癌组织切片上并孵育，然后将与HRP偶联的二抗加到切片上并孵育，将第一显色溶液(例如Alexa 594，Thermo)加到切片上并孵育；抗原修复后，将抗HER2一抗加到切片上并孵育，然后将与HRP偶联的二抗加到切片上并孵育，将第二显色溶液(例如FITC 488,Thermo)加到切片上并孵育；抗原修复后，封片(例如用含DAPI的中性树脂)，最后观测染色结果。
所述第一显色溶液和第二显色染液可以是任何合适的染色溶液，只要其显色结果可以区分HER2和ER蛋白。切片的染色结果可以使用本领域已知的任何方法观测，例如共聚焦显微镜。
新的标志物rH/E和prH/E具有潜在的临床应用。分子亚型分型和疾病预后以及药物敏感性之间存在强关联性。Liminal亚型患者比非Liminal亚型患者具有更好的结果[Prat A et al.,(2016)JAMA Oncol 2:1287-1294.doi:10.1001/jamaoncol.2016.0922]。另外，HER2富集肿瘤是对基于抗HER2的治疗最敏感的[Schettini F et al.,(2020)CancerTreat Rev 84:101965.doi:10.1016/j.ctrv.2020.101965]。然而，由于基因检测并未成为常规诊断方法，开发技术上任意的且成本有效方法来鉴别特异亚群患者是有临床价值的。在本发明中，根据ROC曲线的AUC值，相对于单独分析ERBB2或ESR1表达，rH/E和prH/E更能区分HER2富集亚型和非HER2富集亚型。在来自CAMS的43名HR+/HER2+患者中通过mIF检测了HER2和ER并且鉴定了HER2富集样亚群。该亚群中的患者具有更不良的预后，提示可能对这些HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型的患者需用更强效的抗HER2疗法治疗。
在一个方面，本发明提供了检测HER2阳性细胞的检测剂以及检测ER阳性细胞的检测剂在制备用于预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒中的用途。在一个方面，本发明提供了检测HER2阳性细胞的检测剂以及检测ER阳性细胞的检测剂用于预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的用途。
在一个方面，本发明提供了检测以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平的检测剂和检测以FPKM表示的ESR1 mRNA水平的检测剂在制备用于预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌的试剂盒中的用途。在一个方面，本发明提供了检测以FPKM表示的ERBB2mRNA水平的检测剂和检测以FPKM表示的ESR1 mRNA水平的检测剂用于预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌的用途。
如本文所用，所述“检测以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平的检测剂”和“检测以FPKM表示的ESR1 mRNA水平的检测剂”是能够检测和定量以FPKM表示的ERBB2mRNA水平或ESR1mRNA水平的任何合适分子或化合物，例如通过Northern印迹、选择性杂交、使用包被寡核苷酸探针的基材例如核酸分子阵列、DNA芯片、引物、探针等进行。在一个实施方案中，所述能够检测和定量ERBB2 mRNA水平或ESR1 mRNA水平的检测剂是引物。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含说明书，计算rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]，rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。
如本文所用，术语“检测HER2阳性细胞的检测剂”和“检测ER阳性细胞的检测剂”是能够检测HER2阳性细胞以及ER阳性细胞的分子或化合物(例如HER2蛋白和ER蛋白的抗体或者其缀合物)，例如可以包括但不限于多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义RNA、重组蛋白质、抗体或者其缀合物、配体、适配体、引物、探针、融合蛋白等。
在一个实施方案中，所述检测剂是特异性结合HER2蛋白或ER蛋白的分子或化合物，其可以是被标记的，例如是荧光、放射性、发光、酶标记的，从而可以检测被检测剂结合的细胞。
在一个实施方案中，所述检测剂是HER2蛋白和ER蛋白的抗体或其抗原结合片段。例如，可以用于本发明的针对HER2蛋白的抗体包括但不限于HER2/ErbB2(29D8)兔源性抗体、HER2/ErbB2(44E7)鼠源性抗体、HER2/ErbB2(D8F12)兔源性抗体，以及针对ER蛋白的抗体包括但不限于Estrogen Receptorα(D6R2W)兔源性抗体、Estrogen Receptorα(D8H8)兔源性抗体。
可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示或者分析样品中的HER2阳性细胞以及ER阳性细胞，例如利用HER2或ER蛋白特异性抗体或者片段或者抗体衍生物，优选HER2或ER蛋白的特异性抗体或者这类抗体的片段(如Fab，Fab'，CDR等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体，ScFv)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含说明书，其中指明当prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5时，表示所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含检测总体肿瘤细胞数的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含的检测剂仅是用于检测以FPKM表示的ERBB2mRNA水平以及ESR1 mRNA水平的分子或化合物，例如针对ERBB2和ESR1的引物组，和/或仅是用于检测HER2阳性细胞以及ER阳性细胞的分子或化合物例如HER2蛋白和ER蛋白的抗体或其抗原结合片段以及任选包含检测总体肿瘤细胞数的试剂。
在一个方面，本发明提供了一种预测预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒，其包含本文所述的用于检测以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平以及ESR1mRNA水平的检测剂和/或能够检测HER2阳性细胞的检测剂以及ER阳性细胞的检测剂。所述试剂盒还可以包含进行检测所需的任何其它合适物质，例如检测总体肿瘤细胞数的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含的检测剂仅是用于检测以FPKM表示的ERBB2mRNA以及ESR1 mRNA的检测剂和/或检测HER2阳性细胞以及ER阳性细胞的检测剂例如HER2蛋白和ER蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含可以测量总体肿瘤细胞数的试剂，以确定样品中的总体肿瘤细胞数。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含说明书，其中指明计算rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]，rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含已知非HER2富集亚型乳腺癌的参考rH/E。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包含说明书，其中指明当prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5时，表示所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
在一个方面，本发明提供了一种治疗乳腺癌受试者的方法，包括测量或获得受试者的乳腺癌组织样品中以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平以及ESR1 mRNA水平和/或HER2阳性细胞数比/例以及ER阳性细胞数/比例、任选包括测量或获得所述样品中的总细胞数(例如使用本文所述的试剂盒或装置)，并且计算本发明所述的指标rH/E，当rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]越大和/或prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5时(其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例)，指示所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型，并且建议考虑给所述受试者施用抗HER2强化治疗或者给所述受试者施用抗HER2强化治疗。
如本文所用，术语“治疗”指缓解癌症的至少一种症状。该术语包括向对象应用一种或多种药物以提供癌症的管理或治疗。用于本公开目的的“治疗”可以但不必须提供治愈；而是指，“治疗”可以是病症的管理形式。如本文所用，“治疗”患有癌症的对象是指对象的癌症部分或完全消除，或者在治疗后保持稳定不再进展。治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在癌症发生和/或防止癌症恶化或癌症的进展，防止癌症发生包括减轻或消除导致癌症发生的一或多种风险因子。当本文用于处理有害的增殖细胞(包括癌)时，“治疗”包括部分或完全破坏所述有害的增殖细胞，但对正常细胞的破坏影响最小。
如本文所用，抗HER2强化治疗是指在曲妥珠单抗抗HER2治疗的基础上，加大治疗强度(即曲妥珠单抗同步联合帕妥珠单抗双靶治疗)，或延长治疗时间(即曲妥珠单抗序贯来那替尼治疗)。
在一个实施方案中，本发明所述生物学样品是肿瘤组织样品，优选乳腺癌组织样品，例如肿瘤(乳腺癌)组织切片。
在一个方面，本发明提供了一种包括数字处理器的装置，所述数字处理器被配置为执行本发明所述的预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌或治疗乳腺癌受试者的方法。
在一个方面，本发明提供了一种存储指令的非暂时存储介质，所述指令可由数字处理设备执行以执行本发明所述的预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型乳腺癌或治疗乳腺癌受试者的方法。
在一个方面，本发明提供了一种计算机程序，包括程序代码模块，用于当数字处理设备运行所述计算机程序时，使数字处理设备执行本发明所述的预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌或治疗乳腺癌受试者的方法。
在一个方面，本发明提供了一种预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌的装置，包含：
-测量或接收受试者的生物学样品中以FPKM表示的ERBB2 mRNA水平的部件，
-测量或接收受试者的生物学样品中以FPKM表示的ESR1 mRNA水平的部件，和
-计算指标rH/E＝log2(FPKMERBB2+1)/[log2(FPKMESR1+1)+1]的部件：
-任选还包含显示rH/E计算结果的部件，rH/E越大(例如与已知非HER2富集亚型乳腺癌的rH/E相比)，所述受试者越倾向于预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了一种预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的装置，包含：
-测量或接收受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例的部件，
-测量或接收受试者的生物学样品中ER阳性细胞数/比例的部件，
-任选包含测量或接收受试者的生物学样品中总体肿瘤细胞数的部件，和
-计算指标prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)的部件，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例：
-任选包含，如果prH/E≥1.5，指示所述受试者患有预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的部件，例如给出特定信号(如声音、可视化信息等)的部件，如电子显示屏等。
在一个实施方案中，所述生物学样品是肿瘤组织样品，优选乳腺癌组织样品，例如肿瘤(乳腺癌)组织切片。
在一个实施方案中，预测预后不佳的HER2富集亚型和/或HER2富集样亚型乳腺癌的装置包含经配置以计算如本文所述指标rH/E和/或prH/E的数字处理器。
受试者的生物学样品中HER2和ER阳性细胞数或比例可以使用本文所述的试剂盒测量，或者可以得自其它合适的测量方法或手段。所述测量或接收受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例的部件或测量或接收受试者的生物学样品中ER阳性细胞数/比例的部件可以包含用于测量生物学样品中HER2和ER阳性细胞数/比例的材料和工具(例如本文所述检测剂、试剂盒等)或者接收来自其它来源的关于HER2和ER阳性细胞数/比例的数据。
在一个实施方案中，计算如本文所述rH/E和/或prH/E的非临时性存储介质存储可由数字处理设备执行以执行如本文所述方法的指令。所述非临时性存储介质可以是计算机可读取的存储介质，诸如硬盘驱动器或其它磁性存储介质、光盘或其它光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、闪速存储器、或其它电子存储介质、网络服务器等等。数字处理设备可以是手提式设备(例如，个人数据助手或智能电话)、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、遥控网络服务器等等。
在一个实施方案中，计算本文所述rH/E和/或prH/E的计算机程序包含当所述计算机程序在数字处理设备上运行时，用于引起数字处理设备执行如本文所述方法的程序代码装置。数字处理设备可以是手提式设备(例如，个人数据助手或智能电话)、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、遥控网络服务器等等。
在一个实施方案中，所述装置可以通过和数字处理设备(例如个人数据助理或智能电话、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、远程网络服务器等)连接，从而给患者或相关人员相关提示。
如本文所用，显示测量结果的部件可以将测量结果(例如大于或小于、或者具体数值等)以任何合适方式(例如提示音、数字信号、联网讯息等)告知对象或相关医务人员，包括例如显示屏等。
所述装置可以与其它系统互联，包括但不限于智能手机、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。
本文描述的装置和方法的实施方案可以在各种系统中实现，包括但不限于智能手机、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。例如，部分操作可以发生在一个设备中，而其他操作可以发生在远程位置，例如一个或多个远程服务器。例如，数据的收集可以在智能手机处进行，数据分析可以在服务器或云计算资源处进行。任何单个计算设备或计算设备的组合都可以执行所述方法。
如本文所用，“任选存在的”或“任选”意味着随后描述的事件或情况发生或不发生，以及所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。
如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在某些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％或5％。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方案的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1：
本研究包括3个HR+/HER2+乳腺癌患者队列。第一个队列包括141名癌症基因组图谱(TCGA)患者。TCGA队列的临床数据提取自University of California Santa Cruz(UCSC)Xena(http://xena.ucsc.edu/)。
第二个队列招募了来自国际乳腺癌协会的分子分类(METABRIC)的104名患者。METABRIC队列的数据获自European Bioinformatics Institute并且存储在EuropeanGenome-Phenome Archive(http://www.ebi.ac.uk/ega/)，登录号EGAS00000000083。
第三个队列是2012-2016年间在中国医学科学院(CAMS)肿瘤医院治疗的43名早期HR+/HER2+乳腺癌患者的回顾性观察队列。CAMS队列根据如下标准招募：1)进行了根除性手术以及完整1年曲妥珠单抗治疗的I-III期原发性单侧乳腺癌女性患者；2)乳腺癌是第一个且唯一的恶性癌症诊断；3)所有患者都具有福尔马林固定的石蜡包埋的手术样本、临床数据和随访数据；4)患者具有HR+/HER2+表型的浸润性导管癌；和5)得到了CAMS肿瘤医院医学伦理委员会的批准。排除标准如下：1)男性患者，2)双侧原发性乳腺癌，3)合并了其它恶性肿瘤，和4)没有相应临床及随访数据。
通过IHC分析或原位杂交确定ER、孕激素受体(PR)和HER2状态。截断值≥1％的阳性肿瘤细胞用来定义ER和PR阳性，HR阳性是指ER和/或PR阳性，根据最新的ASCO/CAP指南定义HER2状态。随访在2020年5月8日完成，中值随访时间为64个月(四分位距，20-101个月)。本研究已被CAMS的独立伦理委员会/机构审查委员会批准(20/272–2468)。
实施例2：生物信息学分析
体细胞突变分析
TCGA队列的体细胞突变数据提取自UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)，并且鉴定了HER2+乳腺癌中最常见的突变的癌症相关基因。使用“maftools”R软件包比较了HER2富集和非HER2富集型(Liminal A型，Liminal B型，基底细胞样型及正常乳腺样型)中体细胞突变的差异[Mayakonda A et al.,(2018)Genome Res 28:1747-1756.doi:10.1101/gr.239244.118]。
RNA-seq分析
TCGA队列的RNA-seq数据(level 3)提取自UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)并且将归一化的基因表达测量为每百万映射读取每千碱基转录物的片段(fragments perkilobase of transcript per million mapped reads，FPKM)。将所有值加上恒定值1后，FPKM值进行log2转化。使用“limma”R软件包检测统计学上显著差异表达的基因。“genefu”R软件包用于给每名患者进行PAM50分型[Parker JS et al.,(2009)J Clin Oncol 27:1160-1167.doi:10.1200/JCO.2008.18.1370]。
多重免疫荧光(mIF)
mIF用于检测ER和HER2的表达：细胞核中的红色荧光表示ER阳性，以及细胞膜中的绿色荧光表示HER2阳性。使用Image-Pro Plus(Version 7.0.1.658,Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)图像处理和分析软件分析不同肿瘤细胞类型的数量和比例。
多重IF染色技术用于以单细胞分辨率观察ER和HER2表达。首先，将患者组织切片脱蜡并用组织修复溶液(Thermo，MA，USA)使用高压微波煮沸15分钟。然后将切片冷却至20℃，用封闭溶液(Thermo)处理>30分钟，并在4℃与稀释的HER2一抗(1:400，CST，MA，USA)孵育过夜。接下来，切片在20℃用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(Thermo)处理2小时，然后用显色溶液(FITC 488,Thermo)处理6分钟。显色后，切片在摇床上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次5分钟，再次用组织修复液(Thermo)高压煮沸15分钟，冷却至20℃。然后将切片在20℃用封闭溶液(Thermo)处理>30分钟，与ER一抗(1:200,CST)在4℃孵育过夜，并用HRP偶联二抗(Thermo)在20℃处理2小时。与显色溶液(Alexa 594，Thermo)孵育6分钟后，将切片在摇床上用PBS洗涤3次5分钟并用含DAPI的中性树脂封片。然后在1周内使用共聚焦显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)观察染色切片。
不同颜色的荧光对应不同的激发波长。在这项研究中，ER阳性由细胞核中的红色荧光指示，而HER2阳性由细胞膜中的绿色荧光指示。为量化ER+HER2+、ER+HER2-、ER-HER2+和ER-HER2-肿瘤细胞的比例，我们随机选择了肿瘤中的10个高倍视野(400×)(每个视野>100个肿瘤细胞)用于使用Image-Pro Plus(IPP)软件进行处理和分析。平均值用于统计学分析。
统计学分析
使用SPSS 24.0版本进行统计学分析。(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)、GraphPadPrism(Version 8.0,GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)、X-tile软件(Version3.6.1,Yale University School of Medicine,New Haven,CT，USA)和R软件(3.6.0版本)。正态分布的定量数据使用均值和标准差进行描述，t检验用于组间比较，而具有偏态分布的定量数据使用中位数和四分位距进行描述，秩和检验用于组间比较。使用数字和百分比描述分类变量，并使用Pearson卡方检验进行组间比较。使用Pearson相关性分析正态分布数据，使用Spearman相关性分析非正态分布数据。无病生存期(DFS)被用作预后评估指标，定义为从手术到首次局部、区域或远端肿瘤复发或死亡的时间。使用X-tile软件确定prH/E的最佳截断值，并使用Kaplan-Meier生存分析比较两组之间的DFS差异。进行单变量和多变量Cox回归分析确定重要的预后因素，并通过计算Harrell一致性指数来评估预后模型的性能[Harrell FE Jr et al.,(1996)Stat Med 15:361-387.doi:10.1002/(SICI)1097-0258(19960229)15:4<361::AID-SIM168>3.0.CO；2-4]。P值<0.05被认为表明有统计学意义。
结果
HR+/HER2+乳腺癌的PAM50内在亚型的分布
TCGA和METABRIC数据集都包含四种PAM50内在亚型。Liminal B亚型是最常见的(42％(图1A)；47％(图1B))，HER2富集(27％(图1A)；31％(图1B))和Liminal A亚型(28％(图1A)；20％(图1B))约占两个数据集的三分之一。在TCGA和METABRIC数据集中，只有极少数患者分别被归类为基底样或正常亚型(3％(图1A)；2％(图1B))。
HR+/HER2+乳腺癌中HER2富集和非HER2富集亚型的分子特征的比较
为了更好地了解肿瘤间异质性，我们通过分析体细胞突变和RNA表达数据确定了HER2富集和非HER2富集亚型之间的差异。HER2富集亚型的特征在于比非HER2富集亚型显著更高的TP53(48％vs.24％，p<0.01)和ERBB3(15％vs.1％，p<0.001)以及显著更低的PIK3CA突变频率(15％vs.42％，p<0.001)。(图2A)
而且，TCGA的RNA-seq数据显示：与非HER2富集亚型相比，在HER2富集亚型中，G2/M细胞周期检查点、E2F通路和雷帕霉素复合体1信号通路相关基因表达显著更高，而上皮间质转化、雌激素应答和NF-κB介导的肿瘤坏死因子-α信号通路相关基因表达显著更低。(图2B)
rH/E更好地预测HER2富集亚型
在TCGA和METABRIC数据集中，HER2富集亚型的特征在于比非HER2富集亚型显著更高的ERBB2和降低的ESR1 mRNA表达(图3A、B、D、E)。然而，通过ERBB2或ESR1的表达不能容易地区分HER2富集亚型和非HER2富集亚型(图3C、F)。
基于上述结果，我们构建了一个新的标志物，称为rH/E，其如下计算：ERBB2表达量/(ESR1表达量+1)，其中所述表达量以Log2(FPKM+1)表示。因此，rH/E反映了每名患者中ERBB2对ESR1的相对表达。为确定HER2富集亚型的最佳预测器，我们比较了ERBB2表达、ESR1表达和rH/E的曲线下面积(AUC)值。rH/E在TCGA(AUC＝0.918，95％置信区间[CI]：0.874-0.963)和METABRIC(AUC＝0.746，95％CI：0.648-0.845)数据集中具有最高的AUC值(图3C、F)。
4种肿瘤细胞亚型的存在反映了HR+/HER2+乳腺癌中的肿瘤内异质性
为进一步评估HR+/HER2+乳腺癌中的肿瘤异质性，我们在CAMS(CAMS队列)的43名进行了手术随后进行化疗和1-年辅助曲妥珠单抗治疗的HR+/HER2+乳腺癌患者中使用mIF同时测试了HER2和ER蛋白的表达。
CAMS队列的特征性特征示于表1。19名患者具有淋巴结转移。仅有2名患者没有接受辅助内分泌治疗。在最终随访中，6名患者经历了肿瘤复发或进展。在具有和不具有复发的患者间没有检测到临床病理学特征的显著差异。
表1：43名双阳性乳腺癌患者的临床病理学特征
NS:未示出
令人感兴趣的，mIF显示，基于HER2和ER表达可以将HR+/HER2+乳腺癌肿瘤细胞分为4种类别：ER+HER2+，ER+HER2-，ER-HER2+和ER-HER2-。图4显示具有ER 80％+、PR 10％和HER2 3+乳腺癌的患者的mIF图像。
另外，我们发现，在患者间4种肿瘤细胞亚型的分布是独特的。总共7％、7％和86％的患者分别具有2、3和4种肿瘤细胞类型(图5B)。ER-HER2+肿瘤细胞的比例与ER+HER2-和ER-HER2-肿瘤细胞的比例负相关，以及ER-HER2-肿瘤细胞的比例与ER+HER2-肿瘤细胞的比例正相关(图5A、C)。
CAMS队列中prH/E的潜在临床意义
使用mIF时，rH/E调整为prH/E，计算方法为：
HER2阳性细胞(ER+HER2+和ER-HER2+)百分比×100/(ER阳性细胞[ER+HER2+和ER+HER2-]百分比×100+1)。
在CAMS队列中，我们评估了这4种肿瘤细胞类型的临床相关性。令人感兴趣的，prH/E而非肿瘤细胞表型，显示显著预后相关性。TNM分期和prH/E是DFS的独立风险因子(表2)。
表2：单变量和多变量Cox回归分析
缩写：HER2：人表皮生长因子受体2；ER：雌激素受体；HR：激素受体或风险比；CI：置信区间
prH/E和TNM分期的组合相比单独的TNM分期显著增加了预后预测效力(表3)。X-tile软件确定了prH/E最佳截断值为1.5。根据prH/E水平，我们将43名患者分为HER2富集样亚群(n＝9)和非HER2富集样亚群(n＝34)。具有更高prH/E的HER2富集样亚群比非HER2富集样亚群显示显著降低的5-年DFS(67％vs.91％,log-rank p＝0.046)(图6)。
表3：有或无rH/E的TNM分期的预后预测效力
缩写：CI：置信区间。

Claims (10)

1.检测以每百万映射读取每千碱基转录物的片段(FPKM)表示的ERBB2 mRNA的检测剂和检测以FPKM表示的ESR1 mRNA的检测剂和/或检测HER2阳性细胞的检测剂以及检测ER阳性细胞的检测剂在制备用于预测预后不佳的HER2富集亚型乳腺癌和/或HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述检测剂是特异性结合HER2蛋白或ER蛋白的检测剂，例如抗体或其抗原结合片段，任选地，所述试剂盒包含说明书，指出当prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5时，所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌。
3.一种预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的试剂盒，其包含检测HER2阳性细胞的检测剂以及检测ER阳性细胞的检测剂，优选所述检测剂是特异性结合HER2蛋白或ER蛋白蛋白的检测剂，例如抗体或其抗原结合片段，任选地，所述试剂盒包含说明书，指出当prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5时，所述乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
4.一种预测预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的装置，包含：
-测量或接收受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例的部件，
-测量或接收所述生物学样品中ER阳性细胞数/比例的部件，
-任选包含测量或接收所述生物学样品中总体肿瘤细胞数的部件，和
-计算prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)的部件，
其中所述细胞比例是相对于样品中总体肿瘤细胞数的比例：
-任选包含，如果rH/E≥1.5，显示所述受试者患有预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌和/或推荐给所述受试者施用抗HER2强化治疗的部件。
5.权利要求4的装置，其中所述生物学样品是乳腺癌组织样品，例如乳腺癌组织切片。
6.一种预测受试者的乳腺癌是否是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌的方法，包括：
测量或获得受试者的生物学样品中HER2阳性细胞数/比例
测量或获得所述生物学样品中ER阳性细胞数/比例，
任选包括测量或获得所述生物学样品中的总体肿瘤细胞数，以及
计算prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例，
当prH/E≥1.5时，指示所述受试者乳腺癌是预后不佳的HER2富集样亚型乳腺癌。
7.一种治疗乳腺癌受试者的方法，包括测量或获得受试者的生物学样品中的HER2阳性细胞数/比例和ER阳性细胞数/比例，如果prH/E＝HER2阳性细胞比例×100/(ER阳性细胞比例×100+1)≥1.5，则推荐给所述受试者施用抗HER2强化治疗或者给所述受试者施用抗HER2强化治疗，其中所述细胞比例是相对于总体肿瘤细胞数的比例。
8.一种包括数字处理器的装置，所述数字处理器被配置为执行权利要求6或7所述的方法。
9.一种存储指令的非暂时存储介质，所述指令可由数字处理设备执行以执行权利要求6或7所述的方法。
10.一种计算机程序，包括程序代码模块，用于当数字处理设备运行所述计算机程序时，使数字处理设备执行权利要求6或7所述的方法。
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