CN116966322A - 一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用 - Google Patents

一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用，该纳米材料中框架纳米材料中同时负载有格列本脲和超氧化物歧化酶；其中，按质量百分比计，所述纳米材料中负载有至少30％以上的格列本脲和至少30％以上的超氧化物歧化酶。本发明首次提出了使用共轭有机框架负载GLB及超氧化物歧化酶并用于治疗脑卒中导致的脑水肿、神经炎症和继发性脑损伤，并通过在小鼠大脑中动脉栓塞模型及体外氧糖剥夺模型验证了该纳米材料对于神经细胞的保护作用及潜在分子机制，实现了对于脑卒中的新的治疗思路和治疗手段。

Description

一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用
技术领域
本发明属于医用纳米材料技术领域，具体涉及一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用。
背景技术
脑卒中是一种急性脑血管疾病，其是由于脑血管的突然阻塞或者破裂导致的急性脑组织损伤。在过去数十年里，脑卒中已成为全球首位的致死及致残病因，其中急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)占脑卒中发生的70-80％左右。即使经过积极的内科治疗，大部分幸存的脑卒中患者仍留有不同程度的神经功能缺损，这给对个人、社会及经济发展造成了巨大的负担。
AIS的治疗原则是在时间窗内及时进行血管再通，迅速恢复缺血区的氧气和能量供应，尽可能维持缺血区的神经元存活。目前FDA批准可在临床上使用的有效治疗手段包括静脉溶栓和血管内治疗，但两种治疗手段均受限于狭窄的时间窗。
格列本脲(Glibenclamide，GLB)是2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2,T2DM)治疗中应用广泛的磺脲类药物。近年来的研究发现格列本脲对中枢神经系统损伤有保护作用。不同于在外周干预胰腺β细胞KATP通道产生的促胰岛素释放作用，格列本脲在中枢神经系统损伤中，主要靶点是磺脲类受体1-瞬时受体电位4(Sulfonylurea receptor 1-Transient receptor potential M4，SUR1-TRPM4)通道。临床上，针对格列本脲神经保护作用的IIb期临床研究发现格列本脲能够减轻大面积脑梗死患者的脑水肿导致中线移位，降低血浆MMP-9水平，但对于临床结局没有明显改善。这可能与格列本脲在脑内的快速代谢以及作用靶点单一有关。
缺血再灌注介导的脑损伤病理生理机制复杂，除了原发的缺血缺氧导致的广泛细胞坏死，还涉及氧化应激、炎症反应、兴奋性毒性等等。脑梗死后复杂的损伤瀑布链很可能需要多靶点同时干预才能发挥临床转化级别的保护作用。活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)在脑缺血后迅速产生，并在缺血再灌注后由于炎症等反应进一步促进其生成，是缺血再灌注损伤的重要介质。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可通过催化超氧阴离子与过氧化氢的歧化反应清除ROS，但SOD在循环中的半衰期很短(约6min)，并且在BBB的渗透性较差，通过外源性递送原生形式的SOD来中和ROS往往是无效的。
共价有机框架化合物(Covalent organic framework，COF)纳米材料是一种结晶性多孔有机聚合物，由有机单体间通过可逆的共价键连接而形成。近年来，COF因其可调节的孔隙、低密度、高比表面积和高热稳定性而受到极大的关注。此外，COFs通常由轻质原子如H、C、B、N和O组成，具有良好的生物相容性。
本发明旨在构建一种装载GLB及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的COF纳米材料(SOD/GLB@COF)，从而有效克服上述问题，实现对于缺血再灌注后脑损伤的有效治疗，降低脑卒中对于人体的危害性并提供了新的临床治疗思路。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种装载格列本脲及超氧化物歧化酶的纳米材料及其应用。本发明中的纳米材料为共轭有机框架纳米材料，其同时负载有格列本脲和超氧化物歧化酶。在本发明中，发明人发现通过小鼠大脑中动脉栓塞及体外氧糖剥夺模型有效验证了该纳米材料能够有效保护神经细胞，并明显减轻缺血性脑卒中(脑梗死)后的神经功能缺损症状，对于脑梗死的治疗提供了新的思路。
本发明的第一个方面，提供一种共轭有机框架纳米材料(SOD/GLB@COF，简写为S/G@COF)，所述共轭有机框架纳米材料中同时负载有格列本脲和超氧化物歧化酶。其中，按质量百分比计，所述共轭有机框架纳米材料中负载有至少30％以上的格列本脲和至少30％以上的超氧化物歧化酶。
本发明中首次提出通过纳米技术装载格列本脲和超氧化物歧化酶治疗卒中后脑损伤，通过共轭有机框架可以增加难溶性药物的溶解度，提高药物在体内的稳定性并延长半衰期。而且靶向修饰纳米技术装载药物可以帮助药物穿过血脑屏障，并在所需部位实现积累，以避免非特异性分布。靶向修饰也可以帮助纳米药物主要由特定细胞吸收。
在本发明的一些实施方式中，按质量百分比计，所述共轭有机框架纳米材料中负载有35％～45％的格列本脲和35％～45％的超氧化物歧化酶。
在本发明的一些实施方式中，按质量百分比计，所述共轭有机框架纳米材料中负载有40％的格列本脲和40％的超氧化物歧化酶。
在本发明的一些具体实施方式中，发明人通过对制得的共轭有机框架纳米材料进行分析，发现每mg的GLB/SOD@COF含有约0.4mg GLB和0.4mg SOD。
在本发明的一些实施方式中，所述共轭有机框架纳米材料的颗粒直径大小在100-150nm之间呈现均匀分布。
在本发明的一些实施方式中，所述共轭有机框架纳米材料的zeta电位约为+9.2mV。
在本发明的一些实施方式中，所述共轭有机框架纳米材料具有较好的ROS清除能力。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的共轭有机框架纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)共轭有机框架载体的制备：将1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈混合后于搅拌反应10～14h，然后加入苯甲醛，离心取沉淀，乙腈洗涤后得到共轭有机框架载体；
(2)将共轭有机框架载体、格列本脲和超氧化物歧化酶混合后，持续搅拌18～26h，离心，沉淀即为所述共轭有机框架纳米材料。
在本发明的一些实施方式中，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈的加入量比例为90～100mg：80～90mg：95～110mg：2～8mL：90～110mL。
在本发明的一些实施方式中，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈的加入量比例为98.4mg：85.4mg：100mg：5mL：100mL。
在本发明的一些实施方式中，所述搅拌反应的时间为12～14h。
在本发明的一些实施方式中，所述搅拌反应的时间为12h。
在本发明中，所述苯甲醛用于淬灭反应。
在本发明的一些实施方式中，所述苯甲醛的加入量为1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈总体系的0.002～0.004v/v％。
在本发明的一些实施方式中，所述苯甲醛的加入量为2～5μL。
在本发明的一些实施方式中，所述苯甲醛的加入量为4μL。
在本发明的一些实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)共轭有机框架载体的制备：将1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈混合后于搅拌反应10～14h，然后加入苯甲醛，持续搅拌1～2h以淬灭反应，离心取沉淀，乙腈洗涤后得到共轭有机框架载体；
(2)将共轭有机框架载体、格列本脲和超氧化物歧化酶混合后，室温下持续搅拌18～26h，离心取沉淀，用水洗涤后冷冻干燥，即得。
本发明的第三个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中含有本发明第一个方面所述的共轭有机框架纳米材料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物中还含有其他药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物中，所述共轭有机框架纳米材料的有效浓度大于等于1mg/mL。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的共轭有机框架纳米材料在制备治疗神经元损伤的药物中的应用。
在本发明中，发明人发现通过使用该共轭有机框架纳米材料能够有效抑制或缓解缺血和/或低氧造成的神经元损伤。
在本发明的一些实施方式中，所述神经元损伤是由脑梗死引发的。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中还含有其他药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中，所述共轭有机框架纳米材料的有效浓度大于等于1mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中的共轭有机框架纳米材料的治疗有效量为5μg/kg体重～10μg/kg体重。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药方式包括皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射和静脉滴注。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的的给药频率为：每1～3天使用1次。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的使用频率为：每天1～3使用1～3次。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的使用频率为：每1天使用1次。
在本发明中，发明人发现通过使用该共轭有机框架纳米材料能够有效抑制或缓解神经炎症，表现为小胶质细胞增生减少。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的共轭有机框架纳米材料在制备预防、改善或减缓继发性脑损伤的药物中的应用。
在本发明中，发明人发现通过使用该共轭有机框架纳米材继发性脑损伤，发现其明显减轻急性期的脑梗死体积及清除氧自由基，减少小胶质细胞及星形胶质细胞增生，从而具有显著的继发性脑损伤治疗效果。
在本发明的一些实施方式中，所述继发性脑损伤是由脑梗死引发的。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中还含有其他药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中，所述共轭有机框架纳米材料的有效浓度大于等于1mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述药物中的共轭有机框架纳米材料的治疗有效量为5μg/kg体重～10μg/kg体重。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药方式包为静脉注射。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的的给药频率为：每1～3天使用1次。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的使用频率为：每天1～3使用1～3次。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的使用频率为：每1天使用1次。
本发明的有益效果是：
1.本发明首次提出了使用共轭有机框架负载GLB及超氧化物歧化酶构建S/G@COF纳米材料，并通过在小鼠大脑中动脉栓塞模型及体外氧糖剥夺模型验证了该纳米材料对于神经细胞的保护作用及潜在分子机制，实现了对于脑卒中的新的治疗思路和治疗手段。
2.本发明中的S/G@COF纳米材料相较于常规GLB具有更好的神经保护作用，可以通过单次静脉给药明显减轻缺血性脑卒中(脑梗死)后的神经功能缺损症状，有效提高了临床上对于脑卒中的治疗成功率。
附图说明
图1为实施例1中的S/G@COF颗粒的扫描电镜图。
图2为实施例1中动态光散射法测量S/G@COF的水合直径及其分布。
图3为实施例1中的S/G@COF的Zeta电位。
图4为实施例1中的S/G@COF的粉末X射线衍射(PXRD)图谱。
图5为实施例1中的S/G@COF的傅里叶红外光谱图。
图6为实施例1中的S/G@COF的X射线光电子能谱(XPS)图。
图7为实施例1中的S/G@COF清除活性氧能力测定。
图8为试验例1中利用免疫荧光检测神经元摄取S/G@COF能力。
图9为试验例1中利用CCK8对S/G@COF药物毒性的检测。
图10为试验例1中的S/G@COF清除活性氧能力的测定。
图11为试验例1中免疫印迹检测S/G@COF减轻凋亡相关蛋白表达水平的能力。
图12为试验例1中TUNEL染色检测S/G@COF减轻OGD介导的神经元凋亡的能力。
图13为试验例2中TTC对S/G@COF减轻脑梗死体积能力的测定。
图14为试验例2中利用干湿重法对S/G@COF减轻脑水肿能力的测定。
图15为试验例2中对S/G@COF清除海马区活性氧能力的测定。
图16为试验例2重IBA1染色检测小胶质细胞增生。
图17为试验例2中对S/G@COF减少星形胶质细胞增生能力的测定。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
实施例1装载GLB及超氧化物歧化酶的COF纳米材料(GLB/SOD@COF)的合成
在本实施例中，提供了一种装载GLB及超氧化物歧化酶的COF纳米材料的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)取98.4mg的1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、85.4mg的2,5-二甲氧基对苯二甲醛、100mg的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Mw＝8000)和5mL冰醋酸以及100mL乙腈混合均匀，在25℃下搅拌反应12个小时。然后加入4μL苯甲醛，持续搅拌1小时，以淬灭反应。10000rpm离心10分钟，去除上清。用乙腈洗涤沉淀3次，得到100mg共轭有机框架(Covalent OrganicFrameworks,COF)沉淀。将100mg COF沉淀分散到80mL去离子水中得到80mL COF悬浮液。
取10mL溶于50wt％的DMSO的GLB溶液(GLB浓度为1mg/mL)和10mL 1mg/mL的SOD水溶液加入至COF悬浮液中，室温下持续搅拌24小时，10000rpm离心10分钟，取沉淀物并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后得到GLB/SOD@COF(固体)。
在本实施例中，制得的每mg的GLB/SOD@COF含有约0.4mg GLB和0.4mg SOD。
对实施例中制备得到的GLB/SOD@COF进行表征。
(1)使用透射电子显微镜观察SOG/GLB@COF(简写为S/G@COF)纳米颗粒形态，结果如图1所示。
(2)利用动态光散射法测量未载药的COF，单载GLB的药物GLB@COF(简写为G@COF)，S/G@COF纳米粒子的水合直径及其分布。结果如图2所示，可以发现S/G@COF粉末颗粒直径大小在100-150nm之间呈现均匀分布。
(3)利用电泳法对未载药的COF，G@COF，S/G@COF三者的zeta电位进行检测，结果如图3所示。发现三者的zeta电位分别为+31.3、+11.1和+9.2mV。
(4)利用X射线衍射表征负载药物前后COF晶体结构的主要晶面参数，结果如图4所示。从结果中可以确定GLB和SOD负载前后COF的晶体结构未发生变化。结果提示COF何S/G@COF在6.1°处出现同样的衍射峰，说明该框架在合成过程中的稳定性。
(5)利用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱中对COF，S/G@COF内部化学键进行测定，结果如图5所示。在1617cm-1处的C＝N拉伸振动表明，COF和S/G@COF中存在亚胺键。在GLB加载后，S/G@COF中-CH在2900cm-1处的特征拉伸振动表明，GLB被共价有机框架宿主框架成功封装。
(6)X射线光电子能谱(XPS)(图6)显示，COF和S/G@COF在C、N、O元素组成上相一致。
(7)利用SOD活性检测试剂盒分析S/G@COF对ROS清除功能，具体检测方法为：将20μL不同浓度的S/G@COF分散液与200μL WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2-氢四唑盐、二钠盐)工作溶液。加入20μL黄嘌呤氧化酶溶液开始反应。在37℃下孵育20分钟后，通过离心分离S/G@COF，测量上清液紫外-可见吸收光谱。结果如图7所示。可见S/G@COF具有较好的ROS清除能力。
对比例1装载GLB的COF纳米材料(G/SOD@COF)的合成
在本实施例中，提供了一种装载GLB的COF纳米材料的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)取98.4mg的1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、85.4mg的2,5-二甲氧基对苯二甲醛、100mg的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Mw＝8000)和5mL冰醋酸以及100mL乙腈混合均匀，在25℃下搅拌反应12个小时。然后加入4μL苯甲醛，持续搅拌1小时，以淬灭反应。10000rpm离心10分钟，去除上清。用乙腈洗涤沉淀3次，得到100mg共轭有机框架(Covalent OrganicFrameworks,COF)沉淀。将100mg COF沉淀分散到80mL去离子水中得到80mL悬浮液。
取10mL溶于50wt％的DMSO的GLB溶液(GLB浓度为1mg/mL)加入至COF悬浮液中，室温下持续搅拌24小时，10000rpm离心10分钟，取沉淀物并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后得到GLB@COF(固体)。
在本实施例中，制得的每mg的GLB@COF含有约0.4mg GLB。
试验例1体外评估GLB/SOD@COF对神经元细胞的毒性以及细胞对药物的摄取及代谢情况
取分离自C57BL/6小鼠皮层的原代神经元进行体外培养，构建氧糖剥夺(OGD)模型。
具体构建方法为：
将麻醉孕C57BL/6小鼠后颈椎脱臼处死，使用70％乙醇对皮肤进行消毒，切开腹部皮肤并暴露子宫，取出所有胎鼠，移入含冰冻分离液的培养皿中。快速剪取胎鼠头部，去除脑膜，清洗并分离皮层组织，将皮层组织移入另一含冰冻分离液的培养皿中。剪碎皮层脑组织，将组织混悬液自培养皿中吸出，移至15mL离心管中，静置30s，使组织从混悬液中沉淀，将上层分离液倒掉。用原代神经元培养液(含Neurobasal培养液、2％ B27补充物、0.5％FBS、0.5mmol/L L-谷氨酰胺和25mmol/L谷氨酸)重悬组织细胞，用巴氏吸管轻轻吹打培养液20～30次，静置30s，用巴氏吸管吸取上层细胞混合液，用尼龙滤网过滤混合液，得到大脑皮层单细胞悬液。最后将得到的神经元移入已包被过的培养皿中置细胞培养箱中静置培养。每隔3d全量更换无FBS的神经元培养液一次，培养至12d可用于其它实验。使用流式细胞术分选缺血缺氧后肿胀的神经元细胞。
对分筛出的神经元细胞进行OGD造模，具体方法为：
将细胞接种于孔板，培养24小时使细胞贴壁。造模前将培养的细胞用PBS洗涤两次，加入不含葡萄糖的DMEM培养基，在37℃充满95％ N2和5％ CO2的培养箱中且培养3小时。对照组细胞在正常培养基及正常培养箱的条件下(37℃，5％ CO2)培养相同时间。缺氧条件下培养3小时后，用正常高糖DMEM培养基更换OGD组和对照组的培养基，在正常条件下继续培养24小时(37℃，5％ CO2)。24小时之后分别留取细胞及培养基。
利用罗丹明B对药物S/G@COF进行荧光标记，随后在荧光显微镜下观察神经元对药物的摄取情况。
利用CCK8存活实验检查药物毒性，具体步骤为：
将原代神经元以1×104个细胞/孔接种于96孔培养皿中，培养24小时后贴壁。然后加入不同浓度的药物，孵育24h后，每孔加入10μL CCK-8，37℃培养2小时，在450nm波长下吸光度值。
DCFA-DH探针检测ROS水平，具体步骤为：
细胞生长到70％时更换培养基PBS清洗1遍，用20μM DCFH-DA染液以每孔600μL进行探针装载，37℃培养箱孵育20min，除去染液，用PBS洗涤2遍。造模后酶标仪进行荧光强度检测。
免疫印迹Western blotting检测凋亡蛋白表达水平，具体步骤为：
造模后弃去培养液，用PBS洗涤2遍，向培养皿中加入一定量的蛋白裂解液(依据细胞量的多少来决定)，然后用刮刀将细胞刮下来，将细胞转移至1.5mL离心管中，冰上静置30min，期间旋涡振荡2-3次以充分裂解细胞。测定每个蛋白样品的蛋白浓度。按配比制备10％分离胶和5％浓缩胶。根据待测样品蛋白浓度计算含30-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。电压设定为80V，恒定电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行下一步转膜。转膜需要准备6张7.0-8.3cm的滤纸和1张与凝胶大小形状相似的PVDF膜。将加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜，成“三明治”转膜夹。将转膜夹置于转膜槽当中，加入转膜液，电流设定200mA，(最大蛋白分子量，每kDa一分钟)。恒定电流转膜。转膜时会产热，在转膜槽两边放置冰块降温。封闭+一抗孵育+洗膜+二抗孵育：封闭使用5％脱脂奶粉，室温封闭2小时，在摇床上缓慢摇动。一抗用一抗稀释液稀释(1：1000的一抗anti-Bax，anti-Bcl2，anti-Caspase-3和1:5000anti-β-actin)，4度摇床过夜。二抗选择根据一抗的种属确定，脱脂奶粉稀释，稀释比为1:5000，室温孵育1小时。洗膜采用TBST溶液，每次10分钟，3次。将ECL发光液A液和B液两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1分钟后将膜蛋白面朝下与混合液充分接触；使用化学发光成像系统拍摄，根据曝光后条带的清晰度调整曝光时间。存储图像。
TUNEL免疫荧光染色对神经元凋亡进行评估，具体步骤为：
取出制备好的细胞贴壁良好的培养板，用PBS洗涤一次。多聚甲醛室温固定30分钟。用PBS洗涤1次。用PBS按照1:100的比例稀释Proteinase K(2mg/ml)，使其终浓度为20μg/ml。在样本上滴加适量Proteinase K，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育5分钟。配置TUNEL检测液：计算好样本数量，即用即配，注意避光。50ul体系配置：5μl TdT Enzyme(10x)+45μl FITC-12-dUTP Labeling Mix。孵育：在样本上滴加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。洗涤：PBS或HBSS洗涤2-3次。DAPI染核后显微镜下观察。
免疫荧光检测药物摄取结果如图8所示，给药后30分钟神经元能够对药物进行有效摄取。CCK8药物毒性检测结果如图9所示，可以发现S/G@COF在50ug/mL的浓度内对神经元无明显细胞毒性。基于DCFA-DH探针的ROS清除检测结果如图10所示，可以发现S/G@COF能明显减轻OGD后活性氧的产生。免疫印迹Western blotting染色检测OGD后原代神经元凋亡相关蛋白水平结果如图11所示，可以发现抗凋亡相关蛋白(Bax)表达上调，促凋亡相关蛋白(Bcl2)及凋亡执行蛋白(Caspase-3)表达明显下调。TUNEL检测神经元凋亡水平结果如图12所示，可以发现S/G@COF能明显减轻OGD介导的凋亡神经元比例。综上所述，可以发现，GLB/SOD@COF在体外能明显减轻OGD诱导的神经元凋亡，具有治疗OGD的潜力。
试验例2体内评估S/G@COF对缺血再灌注后神经损伤的治疗效果
在本实施例中，发明人通过构建小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)模型，以探究上述实施例中制备得到的GLB/SOD@COF对缺血再灌注后神经损伤的作用及分子机制。
短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)小鼠模型的构建：
动物的术前准备及麻醉：所有小鼠在造模前一晚禁食，自由饮水。称量小鼠体重以选择线栓型号，将小鼠放入气体麻醉诱导盒，通入3.5％异氟烷诱导麻醉，然后将富氧空气面具罩于小鼠口鼻，并通入1.5％异氟烷维持麻醉状态。麻醉成功后以仰卧姿势固定于加热垫上，使小鼠体温维持在37℃。备皮及切口：小鼠固定后剃除其颈部毛发并用碘伏消毒皮肤。使用眼科剪做颈部正中切口，长约1cm，其后在体视显微镜下用眼科镊分离皮肤下腺体及气管旁组织，暴露右侧颈总动脉，用拉钩充分暴露视野。分离动脉：使用显微镊进行后续操作，分离颈总动脉，避开迷走神经及气管，用6号缝合线在颈总动脉上打一活结。沿颈总动脉向上分离出颈外动脉，用电凝器电凝颈外动脉内侧较大的分支甲状腺上动脉，以免后续操作导致出血。在颈外动脉远心端打一死结，并用此线轻轻拉直颈外动脉，再在其近心端靠近颈动脉分叉处打一活结，最后在颈外动脉中段打一活结。
插入线栓：用显微剪在颈外动脉远端两结中间斜45°剪口，大小约为血管直径的1/3，选择与小鼠体重相符的线栓，插入动脉剪口处，并打紧中段结以固定线栓。此时松开颈动脉分叉处线结，插入线栓后再次打紧。离断颈外动脉远心端，翻转颈外动脉使其与颈内动脉位于同一直线上。缓慢向前插入线栓，遇到阻力时立即停止，扎紧颈外动脉残端线结，以固定线栓防止脱出，开始计时1h。假手术组小鼠进行相同手术操作，但不插入线栓和诱导脑缺血损伤。拔出线栓：1h后依次松开线结，轻轻拔出线栓，结扎颈外动脉残端，松开颈总动脉线结恢复血流。逐层缝合创口，待小鼠清醒后放回鼠笼，自由饮食饮水。术中使用激光多普勒监测脑血流变化，将激光探头固定于小鼠颅骨表面大脑中动脉灌注区域(颅骨顶中线后方1mm，右侧顶骨中线旁开5mm处)。记录3个时间点的局部血流变化：线栓插入前，线栓插入后和再灌注后。小鼠手术侧脑血流在插栓后下降幅度超过基线值的75％，且再灌注后几乎完全恢复，提示缺血-再灌注成功。
动物随机分组：造模前将小鼠随机分为COF组、S@COF治疗组、G@COF治疗组、S/G@COF治疗组。分别给予COF、S@COF、G@COF、S/G@COF等干预，S@COF与G@COF的合成途径与S/G@COF一致，缺血1小时再灌注24小时后进行后续实验操作。
氯化三苯基四氮唑(TTC)染色计算脑梗死体积，具体步骤为：
可麻醉后直接取脑或经生理盐水灌注后取脑。-20℃冰箱中速冻20分钟左右，置于脑槽中便于切片。每隔2mm切一片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。(可参考：张均田，主编.现代药理试验方法)。如果需计算面积的话，应切得均匀或用专门的脑槽。将切片置于2％TTC中，用锡箔纸盖住后，放入37C温箱15～30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。取出切片后观察拍照。
干湿重法测定脑组织含水量，具体步骤为：
将缺血再灌注24h后的小鼠麻醉后断头后取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，分离左右大脑半球，立即称湿重，然后放入110℃电烤箱中24h烤干，再迅速称脑组织干重。
计算脑含水量，计算公式为：
活性氧荧光探针DHE探针检测ROS水平，具体步骤为：
准备待测的厚度为10-20μm的未经固定处理的冰冻切片。室温下，小心加上200μL清洗液工作液，铺满整个切片表面，静置3-5分钟。小心吸除清洗液。滴加100-200μL染色探针工作液，在37℃培养箱避光孵育20-60分钟。移除染色液。用PBS洗涤切片2-3次。用含有DAPI的封片剂封片。荧光显微镜检测。
IBA1、GFAP免疫荧光检测星形胶质细胞细胞增生，具体步骤为：取出冰冻切片，并回温至室温。使用免疫组化笔在脑片周围划圈，滴入4％多聚甲醛，室温固定30分钟，PBS清洗3次，每次3分钟。滴入0.5％ Triton 10分钟，PBS清洗3次，每次3分钟。5％ BSA室温封闭1小时。孵育小鼠来源的一抗mouse anti-IBA1(1:200)或anti-GFAP(1:200)，4℃过夜。PBS清洗3次，每次5分钟。使用FITC goat anti-mouse(1:500)二抗孵育。37℃恒温箱中孵育1小时。PBS清洗3次，每次5分钟。滴加DAPI防淬灭封片剂，盖玻片封片。Olympus荧光倒置显微镜观察并拍摄。
S/G@COF的检测结果如图13～17所示。其中，TTC检测急性期梗死体积如图13所示，可以发现S/G@COF能够明显减轻急性期的梗死体积。利用干湿重法检测脑水肿的结果如图14所示，提示S/G@COF能明显减轻梗死侧的水肿体积。活性氧荧光探针检测ROS水平如图15所示，提示S/G@COF能明显减轻梗死侧海马区活性氧产生。IBA1染色检测小胶质细胞增生结果如图16所示，提示S/G@COF能明显减轻梗死侧小胶质细胞增生。GFAP染色检测皮层星形胶质细胞增生如图17所示，可以发现S/G@COF减少梗死侧皮层星形胶质细胞增生。
上述结果表明，在小鼠MCAO模型中，S/G@COF能明显减轻急性期的脑梗死体积及清除氧自由基，减少小胶质细胞及星形胶质细胞增生，且药物效果优于G@COF，也说明了GLB/SOD@COF中双负载的GLB和SOD具有极好的协同配合效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种共轭有机框架纳米材料，其特征在于，所述共轭有机框架纳米材料中同时负载有格列本脲和超氧化物歧化酶；其中，按质量百分比计，所述共轭有机框架纳米材料中负载有至少30％以上的格列本脲和至少30％以上的超氧化物歧化酶。
2.根据权利要求1所述的共轭有机框架纳米材料，其特征在于，按质量百分比计，所述共轭有机框架纳米材料中负载有35％～45％的格列本脲和35％～45％的超氧化物歧化酶。
3.权利要求1或2所述的共轭有机框架纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)共轭有机框架载体的制备：将1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯、2,5-二甲氧基对苯二甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸和乙腈混合后于搅拌反应10～14h，然后加入苯甲醛，离心取沉淀，乙腈洗涤后得到共轭有机框架载体；
(2)将共轭有机框架载体、格列本脲和超氧化物歧化酶混合后，持续搅拌18～26h，离心，沉淀即为所述共轭有机框架纳米材料。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1或2所述的共轭有机框架纳米材料。
5.权利要求1或2所述的共轭有机框架纳米材料在制备治疗神经元损伤的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经元损伤是缺血和/或低氧造成的神经元损伤。
7.权利要求1或2所述的共轭有机框架纳米材料在制备预防、改善或减缓继发性脑损伤的药物中的应用。
8.根据权利要求5或7任一项所述的应用，其特征在于，所述神经元损伤和继发性脑损伤是由脑梗死引发的。
9.根据权利要求5或7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物中的共轭有机框架纳米材料的治疗有效量为5～10μg/kg体重。
10.根据权利要求5或7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括腹腔注射、静脉注射。
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