CN116949018A - 一种耐碱木聚糖酶及其制备方法 - Google Patents

一种耐碱木聚糖酶及其制备方法 Download PDF

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CN116949018A CN202310975811.2A CN202310975811A CN116949018A CN 116949018 A CN116949018 A CN 116949018A CN 202310975811 A CN202310975811 A CN 202310975811A CN 116949018 A CN116949018 A CN 116949018A
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何珍勇
高波良
孙俊如
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Abstract

本申请涉及一种耐碱木聚糖酶及其制备方法，所述耐碱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用硫酸铵沉淀、硅胶柱层析及离子交换柱方法从DX‑THS3菌株中分离纯化出所述耐碱木聚糖酶。所述耐碱木聚糖酶在pH为5.0～11.0范围内，常温条件下放置24h仍能够保留80％以上的酶活性，并且在pH为10、11和12的强碱缓冲液中，常温条件下放置5天，残存酶活仍达40％，可见所述耐碱木聚糖酶不仅活性高、稳定性强、对金属离子和化学试剂的耐受性强，而且在碱性条件下具有很强的耐受性。

Description

一种耐碱木聚糖酶及其制备方法
技术领域
本申请涉及蛋白质技术领域，具体涉及一种耐碱木聚糖酶及其制备方法。
背景技术
目前，化石资源枯竭导致了一系列引人注目的全球问题，但化石资源仍然是我们日常所需的燃料和大多数碳基产品的主要来源。木质纤维素类生物质被认为是有机碳唯一的可用能源，其具有替代化石燃料生产碳基材料、化学品和燃料等。木质纤维素是一种可再生的有机材料，是所有植物的主要结构成分。主要组份组成：纤维素，半纤维素和木质素。
木聚糖主要由木糖通过β-1,4-糖苷键组成，是半纤维素的主要成分，也是农业生产中残留物最丰富的生物聚合物之一。在自然界中含量丰富，不仅可以从自然界获取，还可以从多种工业、农业废渣(造纸厂废水、锯木厂废物、食品加工废物、农业废物等)中获得。不同来源的木聚糖在医疗保健、化妆品、食品和其他行业中有不同的应用。如：阿拉伯木聚糖可以提高免疫、减少胆固醇吸收，是一种重要的膳食纤维。
木聚糖酶的包括所有能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶。来源十分广泛，主要包括细菌、真菌、昆虫、植物、动物和原生动物等。通常，细菌来源的木聚糖酶对极端条件有耐受性，真菌来源的木聚糖酶具有更高活性。因此真菌来源的木聚糖酶对于构建工程菌较有利，可提高产酶效率。利用木聚糖酶将木聚糖分解后的产物不仅广泛应用于畜牧、食品、造纸，在能源转化中的应用也存在着很大的潜力。
虽然，在自然界中，存在许多能够产生大量的胞外木聚糖酶的微生物，但大多数的木聚糖酶最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间，在弱酸或中性pH环境中具有较好的耐受性，而在碱性环境中，尤其是在pH>10的强碱条件下，耐受性差，酶活半衰期很短，仅为几分钟，且不耐高温。目前来看，大多数预处理策略依赖高温和极端pH，在酶水解前，还需等待降温、调节pH等，这既增加了人力成本又增加了试剂成本，还耗时费力。然而，近年来还未找到性能好、酶活高、可以投入工业生产的商业酶。因此，筛选性能好、酶活高、稳定性高的催化酶成为当前瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种耐碱木聚糖酶及其制备方法，能够提升木聚糖酶对强碱环境的耐受性，尤其在pH为11或12的条件下，酶活半衰期超过3天，而且对温度、金属离子以及化学试剂很强的耐受能力，并具有很强的底物专一性。
本发明采取的一种技术方案是：一种耐碱木聚糖酶，所述碱稳定性木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述碱稳定性木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明采取的另一种技术方案是：一种耐碱木聚糖酶的制备方法，用于制备上述技术方案所述的耐碱木聚糖酶，包括如下步骤：
S1：将球毛壳菌用PDA斜面培养基在4℃条件下进行保存，每两个月活化一次；所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏编号为CCTCCNO：M2016005；
S2：用无菌接种环从PDA斜面培养基上挑取适量DX-THS3菌株菌丝，转接入PDB培养基进行培养，作为种子培养液备用；
S3：将水稻秸秆用球磨机粉碎成粉末，加水并进行加热灭菌，冷却至室温用于制备固态发酵培养基，将DX-THS3菌株种子液接种入固态培养基中进行培养，培养完毕后向固态培养基中加水并摇晃，经纱布过滤后使用台式冷冻高速离心机进行离心收集上清液制备胞外粗酶液；
S4：利用硫酸铵沉淀、硅胶柱层析及离子交换柱方法，分离纯化所述耐碱木聚糖酶。
进一步地，所述步骤S3中，向水稻秸秆粉末粉末中加水时，水的体积与水稻秸秆粉末重量的比例为2：1～5：1；向固态培养基中加水时，水的体积与固态培养基重量的比例为10：1～40：1。
进一步地，所述硫酸铵沉淀方法的具体方法为：将胞外粗酶液置于AKTA纯化蛋白纯化系统中进行纯化，对胞外粗酶液中的蛋白质进行超滤浓缩，随后将硫酸铵缓慢加入到含所述耐碱木聚糖酶的浓缩物中，搅拌至55％饱和，在4℃条件下保存4h。离心除去沉淀的蛋白质后，增加硫酸铵的加入量至75％饱和，在4℃条件下保存过夜；随后，在4℃，12000rpm条件下离心20min，获得含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀。
进一步地，所述硅胶柱层析方法的具体方法为：用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液重悬含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀，然后用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液平衡后进行Sephadex G-150凝胶过滤层析，流速保持在0.2mL/min，并在280nm处读取吸光度监测。
进一步地，所述离子交换柱方法的具体方法为：对Sephadex G-150凝胶过滤层析所得的活性组分经deaecellude52柱进一步纯化；采用pH＝8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液对层析柱进行预平衡，并使用相同的缓冲液洗涤，用1mol/L的NaCl溶液进行0～100％的梯度洗脱，流速为0.4mL/min；将收集的馏分进行汇集和浓缩，并作为纯化的耐碱木聚糖酶；为鉴定所述纯化的耐碱木聚糖酶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对所述纯化的耐碱木聚糖酶进行纯度检测和分子量测定。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所述的耐碱木聚糖酶，记作Xyn5.1158，最适温度为50℃，最适pH为6，在40℃下孵育180min后，剩余相对酶活可达79％，在60℃下孵育20min，剩余相对酶活仍接近50％；而且所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158还具有对金属离子以及化学试剂的高耐受能力，并具有很强的底物专一性，在食品精加工及木质纤维素生物炼制中具有应用价值；
(2)所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在pH值为10、11和12的强碱缓冲液中，常温条件下放置5天，残留的酶活还能达到40％，具有很强的耐碱性可以在造纸用工业中可以得到广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例制得的耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的SDS-PAGE分析结果示意图，图中M为蛋白Marker；1为表达耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的发酵液；2为纯化后的耐碱木聚糖酶Xyn5.1158；其中，(A)为胞外粗酶液的SDS-PAGE分析结果示意图，(B)为分离纯化后的耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的SDS-PAGE分析结果示意图；
图2为本发明实施例中对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的最适温度、最适pH、温度稳定性和pH稳定性的测试结果示意图；其中，(A)为耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的最适温度测试结果示意图；(B)为耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的最适pH测试结果示意图；(C)为耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的温度稳定性测试结果示意图；(D)和(E)为耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的pH稳定性测试结果示意图；
图3为本发明实施例中金属离子A和化学试剂B对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的影响效果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
本发明实施例提供了一种耐碱木聚糖酶，所述碱稳定性木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
Met Val Ser Phe Thr Ser Leu Leu Leu Ala Val Ser Ala Ala Val Gly ValCys Ala Asn ProVal Pro Pro Thr Ile Glu Glu Met Arg Glu Thr Phe Leu Gln LysArg Gly Gly Thr Pro Ser Ala Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Tyr Phe Ser Trp TrpThr Asp Asn Gln Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Lys Gly Gln Tyr Ser IleThr Trp Ser Gly Asn Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser AsnArg Asn Ile Thr Tyr Thr Ala Gln Tyr Arg Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala ValTyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Val Glu Asn Phe Gly ThrTyr Asp Pro Ser Ser Gln Ala Ser Arg Lys Gly Thr Ile Asn Val Asp Gly Ser SerTyr Thr Val Ala Gln Ser Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Arg ThrPhe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Ser Ser Gly Thr Val Asp IleLys Ala His Phe Asp Ala Trp Ser Ala Gln Gly Met Lys Leu Gly Thr His Asp TyrGln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ser Thr Val Thr Val Ser。
核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：
atggtctcgt tcacgtccct cctcctggcc gtctcggccg ccgtcggcgt ctgcgccaacccggtgccgc ccaccatcga ggagatgcgg gagacgttcc tgcagaagcg cggcggcacg cccagcgctacgggcacgca cgacggcttc tacttctcgt ggtggaccga caaccaggcc caggccacgt acaccaacgggcccaagggc cagtacagca tcacgtggtc cggcaacggc aacctcgtgg gcggcaaggg ctggaaccccggcagcaaca ggaacatcac ctacaccgcc cagtaccgtc ccaacggcaa cagctacctg gccgtgtacggctggacgcg caacccgctg gtcgagtact acgtggtgga gaactttggc acctacgacc ccagctcgcaggcctcgcgc aagggcacca tcaacgtcga cgggtccagc tacacggtgg cccagtcgac gcgcgtcaaccagccgtcca tcgagggcac ccgcaccttc cagcagtact ggtccgtccg ccagcagaag cggtcgagcggcaccgtcga catcaaggcc cactttgacg cctggtccgc ccagggcatg aagctcggca cccacgactaccagatcgtc gccactgagg gctacttcag cagcggctcg tccaccgtga ccgtgagctag。
还提供了一种耐碱木聚糖酶的制备方法，用于制备上述技术方案所述的耐碱木聚糖酶，包括如下步骤：
S1：将球毛壳菌用PDA斜面培养基在4℃条件下进行保存，每两个月活化一次；所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3(下文简称为DX-THS3菌株)，保藏编号为CCTCCNO：M2016005，于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号。
S2：用无菌接种环从PDA斜面培养基上挑取适量DX-THS3菌株菌丝，转接入PDB培养基进行培养，作为种子培养液备用；
S3：将水稻秸秆用球磨机粉碎成粉末，以水的体积与水稻秸秆粉末重量为2：1～5：1，单位为毫升/克的比例向水稻秸秆中加水并进行加热灭菌，冷却至室温用于制备固态发酵培养基，将DX-THS3菌株种子液接种入固态培养基中进行培养，培养完毕后向固态培养基中以水的体积与固态培养基重量为10；1～40：1，单位为毫升/克的比例加水并摇晃，经纱布过滤后使用台式冷冻高速离心机进行离心收集上清液制备胞外粗酶液；
S4：利用硫酸铵沉淀、硅胶柱层析及离子交换柱方法，分离纯化所述耐碱木聚糖酶。
所述硫酸铵沉淀方法的具体方法为：将胞外粗酶液置于AKTA纯化蛋白纯化系统中进行纯化，对胞外粗酶液中的蛋白质进行超滤浓缩，随后将硫酸铵缓慢加入到含所述耐碱木聚糖酶的浓缩物中，搅拌至55％饱和，在4℃条件下保存4h。离心除去沉淀的蛋白质后，增加硫酸铵的加入量至75％饱和，在4℃条件下保存过夜；随后，在4℃，12000rpm条件下离心20min，获得含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀。
所述硅胶柱层析方法的具体方法为：用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液重悬含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀，然后用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液平衡后进行Sephadex G-150凝胶过滤层析，流速保持在0.2mL/min，并在280nm处读取吸光度监测。
所述离子交换柱方法的具体方法为：对Sephadex G-150凝胶过滤层析所得的活性组分经deaecellude52柱进一步纯化；采用pH＝8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液对层析柱进行预平衡，并使用相同的缓冲液洗涤，用1mol/L的NaCl溶液进行0～100％的梯度洗脱，流速为0.4mL/min；将收集的馏分进行汇集和浓缩，并作为纯化的耐碱木聚糖酶；为鉴定所述纯化的耐碱木聚糖酶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对纯化GUS进行纯度检测和分子量测定。
下面结合具体实施例说明所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的制备方法以及对所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158理化性质和活力的测定方法与结果。
(1)耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的制备
将DX-THS3菌株用PDA斜面培养基在4℃条件下进行保存，每两个月活化一次。用无菌接种环从PDA斜面培养基上挑取适量DX-THS3菌株菌丝，转接入含有200mL马铃薯葡萄糖液体培养基，即PDB培养基的烧瓶中进行培养，在28℃、160rpm的条件下培养3天，作为种子培养液备用。将水稻秸秆在50℃的干燥箱中洗涤干燥，然后用球磨机粉碎，得到粒径为3mm的颗粒。固态发酵在500mL烧瓶中进行，每个烧瓶含有4g的水稻秸秆颗粒，以水的体积与水稻秸秆粉末重量为3：1，单位为毫升/克的比例向水稻秸秆中加水，即加入12mL水，使得秸秆初始含水量为70％，并将烧瓶用高压灭菌器在121℃条件下灭菌20min，自然冷却到室温后，按20％的接种量接种培养3天的种子培养液。随后，将含有DX-THS3菌株的培养基在28℃条件下培养12天，并在每个每个烧瓶中以水的体积与固态培养基重量为25：1，单位为毫升/克的比例加入50mL蒸馏水，在室温下200rpm摇匀30min。混合溶液经8层120目纱布过滤，使用台式冷冻高速离心机在4℃，12000rpm条件对滤液离心15min，收集上清液作为胞外粗酶液。
(2)耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的分离纯化
利用硫酸铵沉淀、硅胶柱层析及离子交换柱方法，分离纯化所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158，具体方法如下：
所述硫酸铵沉淀方法的具体方法为：将胞外粗酶液置于AKTA纯化蛋白纯化系统中进行纯化，对胞外粗酶液中的蛋白质进行超滤浓缩，分子量截止值为10kDa。随后将硫酸铵缓慢加入到含所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的浓缩物中，搅拌至55％饱和，在4℃条件下保存4h。离心除去沉淀的蛋白质后，增加硫酸铵的加入量至75％饱和，在4℃条件下保存过夜；随后，在4℃，12000rpm条件下离心20min，获得含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀。
所述硅胶柱层析方法的具体方法为：采用Sephadex G-150凝胶过滤层析，用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液重悬含所述耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的蛋白沉淀，然后用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液平衡后进行Sephadex G-150凝胶过滤层析，流速保持在0.4mL/min，并在280nm处读取吸光度监测。
所述离子交换柱方法为DEAE-纤维素DE-52离子交换色谱法，具体方法为：对Sephadex G-150凝胶过滤层析所得的活性组分经deaecellude52柱进一步纯化；采用pH＝8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液对层析柱进行预平衡，并使用相同的缓冲液洗涤，用1mol/L的NaCl溶液进行0～100％的梯度洗脱，流速为0.4mL/min；将收集的馏分进行汇集和浓缩，并作为纯化的耐碱木聚糖酶Xyn5.1158；为鉴定所述纯化的耐碱木聚糖酶Xyn5.1158，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对纯化GUS进行纯度检测和分子量测定。
(3)耐碱木聚糖酶Xyn5.1158酶活测定
将每毫升粗酶液每分钟释放1μmol还原糖的量，定义为1个酶活力单位，单位为U/mL。
取六支25mL比色管，三支加入0.2mL粗酶液，另外三支加入0.2mL灭活粗酶液。再分别吸取1.8mL 1％耐碱木聚糖酶Xyn5.1158溶液，在50℃下水浴保温30min，加入2mL二硝基水杨酸试剂混匀，沸水浴10min后冷却至室温，加入10mL蒸馏水，混匀，用酶标仪检测OD540值，每组重复三次上述操作。
(4)耐碱木聚糖酶Xyn5.1158理化性质及活力测定
1、最适温度测定
通过测量30～70℃的温度范围内酶的相对活性来确定温度对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158活性的影响，其他实验条件遵循标准分析方案，最佳温度下的活性为100％。实验结果如图2(A)所示，最适温度为50℃。
2、最适pH测定
耐碱木聚糖酶Xyn5.1158活性的最适pH是在50℃条件下使用四种缓冲体系：即50mM，pH为3～5的柠檬酸钠缓冲液、50mM，pH为6～8的磷酸盐缓冲液、50mM，pH为9的Tris-HCl缓冲液和50mM，pH为10～11的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液进行测定的，最大活性被认为100％，并用作在不同pH值下确定相对活动的参考。实验结果如图2(B)所示，最适pH为5。
3、温度稳定性测定
耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的温度稳定性是通过在没有底物的情况下，分别在40℃、50℃和60℃条件下孵育0～180min后测定酶的剩余活性来确定的，未孵育活性为100％。实验结果如图2(C)所示，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在60℃下孵育20min，剩余相对酶活<50％；在50℃下孵育60min后，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158酶活降低至51.90％，在40℃下孵育180分钟，酶活还可达到79.20％，说明耐碱木聚糖酶Xyn5.1158虽不耐高温，但对温度还是具有一定的耐受性的。
4、pH稳定性测定
为了测定pH的稳定性，将耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在pH为3.0～11.0的缓冲液中分别孵育1、3、5、7、9、12、24和48h。实验结果如图2(D)所示，当pH为3和4时，酶活在很短的时间内就降低到了20％左右，说明耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的耐酸性差。相反地，当耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在弱酸、中性、弱碱以及碱性条件下，展示出了很强的耐受性。尤其在碱性条件下，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158还保留了很高的酶活。在pH为11的缓冲溶液中，0～8h内耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的相对酶活都是大于100％的，而且在48h，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158还保存了66.03％的活力，这表明耐碱木聚糖酶Xyn5.1158具有一定的耐碱性。
将耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在pH为8.0～12.0的缓冲液中孵育1～10天，实验结果如图2(E)所示。在pH为8的条件下，常温放置1天后，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158活性出现了明显上升，可到达122.86％；从第2天开始，酶活开始下降；直到第4天，酶活降到50％左右；第5天～第8天，酶活一直保持在40％以上。当pH为9时，常温放置1天后，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158活性也有一定的升高，但比pH为8时上升幅度小了很多，为103.49％。在pH为10、11和12的强碱缓冲液中，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158在常温条件下放置5天，剩余酶活分别为46.54％、44.28％和41.92％，残留的酶活均在40％以上，说明耐碱木聚糖酶Xyn5.1158具有很强的耐碱特性。
5、金属离子、化学试剂对Xyn5.1158酶活影响
在1mM和10mM两种不同浓度的金属离子，例如Al3+，Mn2+，Na+，Zn2+，Fe2+，K+，Ca2+，Cu2+的存在下，在标准条件下测定酶活，实验结果如图3(A)所示。低浓度的Na+、Zn2+、Fe2+对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158有一定的促进作用，高浓度的金属离子Al3+、Mn2+、Na+、Zn2+、Fe2+对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158也有促进作用，尤其是Zn2+、Mn2+、Fe2+，而且在这些金属离子中，不论是高浓度还是低浓度均未发现对耐碱木聚糖酶Xyn5.1158有明显抑制作用。
在0.05％和0.5％两种不同浓度的有机试剂，例如：乙二胺四乙酸、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、吐温80、吐温X-100，β-巯基乙醇下测量酶活，实验结果如图3(B)所示。可以看出，耐碱木聚糖酶Xyn5.1158对化学试剂也表现出了很强的耐受性。
6、耐碱木聚糖酶Xyn5.1158酶促动力学测定
酶的动力学参数由1％～7％不同浓度的山毛榉木聚糖在50℃，pH为5的条件下，与耐碱木聚糖酶Xyn5.1158纯酶孵育30s确定。米氏常数Km和最大反应速率Vmax值由Michaelis-Menten的非线性回归拟合确定，实验结果如表1所示。耐碱木聚糖酶Xyn5.1158的Vmax值为3169.44U/mg，Km值为0.79mg/mL。
表1重组木聚糖酶Xyn5.1158酶促动力学分析
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种耐碱木聚糖酶，其特征在于，所述碱稳定性木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种耐碱木聚糖酶，其特征在于，所述碱稳定性木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种耐碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1或2所述的耐碱木聚糖酶，包括如下步骤：
S1：将球毛壳菌用PDA斜面培养基在4℃条件下进行保存，每两个月活化一次；所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏编号为CCTCCNO：M2016005；
S2：用无菌接种环从PDA斜面培养基上挑取适量DX-THS3菌株菌丝，转接入PDB培养基进行培养，作为种子培养液备用；
S3：将水稻秸秆用球磨机粉碎成粉末，加水并进行加热灭菌，冷却至室温用于制备固态发酵培养基，将DX-THS3菌株种子液接种入固态培养基中进行培养，培养完毕后向固态培养基中加水并摇晃，经纱布过滤后使用台式冷冻高速离心机进行离心收集上清液制备胞外粗酶液；
S4：利用硫酸铵沉淀、硅胶柱层析及离子交换柱方法，分离纯化所述耐碱木聚糖酶。
4.根据权利要求3所述的一种耐碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，向水稻秸秆粉末粉末中加水时，水的体积与水稻秸秆粉末重量的比例为：1～5：1；向固态培养基中加水时，水的体积与固态培养基重量的比例为10：1～40：1。
5.根据权利要求3所述的一种耐碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀方法的具体方法为：将胞外粗酶液置于AKTA纯化蛋白纯化系统中进行纯化，对胞外粗酶液中的蛋白质进行超滤浓缩，随后将硫酸铵缓慢加入到含所述耐碱木聚糖酶的浓缩物中，搅拌至55％饱和，在4℃条件下保存4h。离心除去沉淀的蛋白质后，增加硫酸铵的加入量至75％饱和，在4℃条件下保存过夜；随后，在4℃，12000rpm条件下离心20min，获得含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀。
6.根据权利要求5所述的一种耐碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析方法的具体方法为：用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液重悬含所述耐碱木聚糖酶的蛋白沉淀，然后用0.02mol/L，pH＝6.0的醋酸-乙酸铵缓冲液平衡后进行Sephadex G-150凝胶过滤层析，流速保持在0.2mL/min，并在280nm处读取吸光度监测。
7.根据权利要求6所述的一种耐碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述离子交换柱方法的具体方法为：对Sephadex G-150凝胶过滤层析所得的活性组分经deaecellude52柱进一步纯化；采用pH＝8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液对层析柱进行预平衡，并使用相同的缓冲液洗涤，用1mol/L的NaCl溶液进行0～100％的梯度洗脱，流速为0.4mL/min；将收集的馏分进行汇集和浓缩，并作为纯化的耐碱木聚糖酶；为鉴定所述纯化的耐碱木聚糖酶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对所述纯化的耐碱木聚糖酶进行纯度检测和分子量测定。
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