CN116947890A - 一种wee1抑制剂的三环化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种WEE1抑制剂的三环化合物及其制备方法和用途，化合物的结构如式一所示，
Description
技术领域
本发明属于WEE1抑制剂领域，特别涉及一种WEE1抑制剂的三环化合物及其制备方法和用途。
背景技术
细胞周期由一系列依赖于细胞周期蛋白调控的序贯的、复杂的细胞进程组成。在细胞周期的不同时期，细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinases,CDKs)相互作用，驱动着细胞周期的运转。细胞周期的主要事件发生在DNA复制的S期和M期。这两个时期之间通过G1期和G2期来连接，在此期间，细胞可通过修改其转录活性来准备合成后续事件所需的分子。这种有序的进展中，细胞周期检查点协助使得DNA能够正确复制，染色体能够正确分配。细胞周期检查点是一种负反馈调节，这些检查点是细胞周期进程中很有利的质量控制措施。当DNA损伤或DNA复制受阻时，细胞周期检查点的激活能够延迟细胞周期向下一阶段的进程，为DNA损伤修复提供必要的时间以应对细胞内外的应激。在G1期对DNA损伤点进行检查中，多数肿瘤细胞存在p53基因缺失，导致细胞周期G1检查点缺陷。对于那些G1检查点被p53突变所导致G1检查点直接通过的肿瘤，DNA修复可能只依赖于G2检查点。
酪氨酸激酶WEE1是DNA损伤反应通路上的关键激酶，在细胞周期进程和基因组稳定中发挥着重要作用。WEE1是一种细胞周期调节蛋白，在细胞G2/M期，WEE1能调控CDK1的磷酸化状态，使CDK1的Tyr15位点磷酸化，抑制CDK1的活性，使得CDK1/Cyclin B复合物失活，进而抑制细胞周期进入有丝分裂期。因此，WEE1是G2/M期阻滞的关键基因，起着重要的监测作用。研究表明，WEE1在很多恶性肿瘤中过表达，比如肝癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤及脑瘤等。抑制或下调WEE1激酶均能引发有丝分裂灾难，因此WEE1激酶抑制剂在抗癌治疗中发挥关键作用，其小分子抑制剂具有广阔的发展空间。
专利WO2007126128，WO2009054332，WO2013012681，WO2013130461，WO2014167347，WO2015092431，WO2019169065，WO2020182159，WO2020210375等中描述了具有WEE1激酶抑制活性的小分子化合物。目前最领先的化合物是AZD1775，已经进入临床II期试验，显示出良好的癌症治疗效果。
为了更好的达到预防或者治疗肿瘤的目的，满足市场及患者的需求，新的疗效好的骨架多样性的WEE1抑制剂仍需被开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，
其中，
表示单键或双键；
n为0、1、2或3；
Q选自N或CH；
M选自NH、CH2、NR4、CHR4、O或S；
X、Y或Z各自独立地选自CH2、CHR5、CO、NH、NR5、O、S或不存在；
R1选自烷基、烯基或炔基，其中烷基、烯基或炔基各自独立地被选自卤素或氰基的取代基取代；
R2选自芳基、杂芳基或其中，环A选自苯基或5-6元杂芳基；环B选自5-7元环烷基或5-7元杂环基；其中，R2任选地被一个或多个选自如下的取代基取代：卤素、烷基、烷氧基、羟基、羟基取代的烷基、氰基、硝基、环烷基、环烷氧基、羧基、卤代烷基、烷氧烷基、氨基、烷氨基、卤代烷氧基或杂环基；
R3选自H、卤素、烷基、卤代烷基、羟基取代的烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、氰基、氨基、烷氨基、杂环基、羟基、硝基、烷氨烷基或杂环基；
R4或R5各自独立地选自烷基、烷氨酰基、烷酰基、杂环基或环烷基。
在本发明的另一方案中，表示单键；优选地，R1为烯基，优选地，R1为/>
在本发明的另一方案中，R2为杂芳基，所述杂芳基被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；优选地，R2为优选地，R2为苯基；优选地，所述苯基被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；优选地，R2为/>
在本发明的另一方案中，R2为优选地，环A为苯环或吡啶环；优选地，环A为吡啶环；优选地，环B为环戊烷、环己烷、四氢呋喃环、四氢吡咯环或哌啶环；优选地，环B为环戊烷；优选地，环B被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；优选地，环B被一个或多个选自烷基或羟基的取代基取代。
在本发明的另一方案中，R3为H；优选地，Q为N；优选地，M为NR4；优选地，R4为烷基。
在本发明的另一方案中，Z为NH、NR5、CH2、CO或O，Y为CO、O或CH2，X为CH2或不存在；优选地，R5选自烷基；优选地，Z为NH或NR5，Y为CO，X不存在；优选地，Z为CH2或CO，Y为O，X为CH2。
典型的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，包括但不限于以下化合物：
本发明另一方面提供一种制备式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括如下步骤：
a.中间体1与R2卤化物反应生成中间体2；
b.中间体2经氧化反应后生成中间体3；
c.中间体3与中间体4发生加成反应生成式一所示的化合物；
反应方程式如下：
其中，n、Q、M、X、Y、Z、R1至R3如上所定义。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其含有治疗有效剂量的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供一种制备上述药物组合物的方法，其包括将式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或赋形剂相混合。
本发明进一步提供式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物，其作为药物的用途。
本发明进一步提供式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物，在制备蛋白激酶抑制剂中的用途，具体为作为WEE1抑制剂的用途。
本发明进一步提供式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物，在制备用于治疗或预防肿瘤相关疾病的药物中的应用；优选地，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤、脑瘤、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌、胃癌或白血病；优选地，所述肿瘤为小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌或卵巢癌。
本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的作为WEE1抑制剂的式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物。
可将作为活性成分的式一所示的三环化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐制成适合于通过任何适当途径给药的形式，其中，活性成分优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本发明活性成分或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、颗粒剂、膏剂、锭剂、栓剂或液体制剂等。
本发明治疗方法中所用的化合物或组合物的剂量通常将随患者的体重、疾病的病症程度、化合物的相对功效而改变。本发明通用的化合物单位剂量为0.1-1000mg。
本发明的药物组合物除活性成分外，可含有一种或多种载体或赋形剂，所述载体或赋形剂选自以下成分：填充剂、崩解剂、粘合剂、润湿剂或润滑剂等。根据给药方法的不同，药物组合物可含有0.1-99重量％的活性成分。
含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、混悬液或糖浆剂等。可按照本领域任何已知方法制备口服组合物。其中，口服组合物中的片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂包括活性成分和用于混合的适宜制备上述口服组合物的可药用的赋形剂，这些赋形剂可以是填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂；口服组合物还可含有以下载体：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以改善口感提高稳定性。
混悬液含有活性物质和用于适宜制成混悬液的赋形剂。此类赋形剂包括混悬剂、分散剂和湿润剂。混悬液还可以包括防腐剂、着色剂或矫味剂等。
本发明的药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。赋形剂可包括水、甘油、氯化钠等溶剂、防腐剂或增溶剂等。
本发明的药物组合物可用于直肠给药的栓剂形式给予。栓剂所包括的赋形剂包括基质、增稠剂、抗氧化剂、硬化剂等。
发明的详细说明
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基，烷基的非限制性实施例包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基。
术语“烯基”是指含有至少1个碳碳双键的直链、支链或者环状烃基。其中可以存在1-3个碳碳双键，优选存在1个碳碳双键。烯基的非限制性实施例包括：乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基或环己烯基等。
术语“炔基”是指含有至少1个碳碳三键的直链、支链或者环状烃基。其中可以存在1-3个碳碳三键，优选存在1个碳碳三键。炔基的非限制性实施例包括：乙炔基、丙炔基、1-丙炔-3-基、丁炔基和3-甲基丁炔基。
术语“CO”是指
术语“氰基”是指-CN。
术语“芳基”是指任何稳定的单环或多环芳香族基团，例如：苯基或萘基等。
术语“杂芳基”是指包含1-4个杂原子、5至10个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自O、S和N。杂芳基的非限制性实施例包括：咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、异噁唑基或异噻唑基等，优选为吡啶基。
术语“烷氧基”是指具有“W-O-”结构的基团，其中W为烷基，烷氧基的非限制性实施例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或叔丁氧基等。
术语“羟基”是指-OH。
术语“羟基取代的烷基”是指具有“OH-W-”结构的基团，其中W为烷基，羟基取代的烷基的非限制性实施例包括：羟甲基、羟乙基或羟基异丙基等。
术语“硝基”是指-NO2。
术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的环状烃基，组成环烷基的碳原子数可为3-15个，例如3-6个，环烷基的非限制性实施例包括：环丙基、环丁基、环戊烷或环己基等。
术语“环烷氧基”是指具有“Cyc-O-”结构的基团，其中Cyc为环烷基，环烷氧基的非限制性实施例包括：环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基或环己氧基等。
术语“羧基”是指-COOH。
术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素取代的烷基，卤代烷基的非限制性实施例包括：三氟甲基、三氟乙基、1,3-二氟异丙基或三氟丙基等。
术语“烷氧烷基”是指具有“W-O-W”结构的基团，其中W为烷基，烷氧烷基的非限制性实施例包括：甲氧甲基、甲氧乙基或乙氧甲基等。
术语“氨基”是指-NH2。
术语“烷氨基”是指具有“W-NH-”或结构“(W)2-N-”的基团，其中W为烷基，烷氨基的非限制性实施例包括：甲氨基、二甲氨基、乙氨基或二乙氨基等。
术语“卤代烷氧基”是指被一个或多个卤素取代的具有“W-O-”结构的基团，其中W为烷基，卤代烷氧基的非限制性实施例包括：三氟甲氧基、三氟乙氧基、1,3-二氟异丙氧基或三氟丙氧基等。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自N、O或S的杂原子，其余环原子为碳；优选包含3至12个环原子，其中1-4个是杂原子；最优选包含3-8个环原子，最优选包含3-6个环原子，其中1-2是杂原子；杂环基的非限制性实施例包括二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或四氢呋喃基等。
术语“烷氨烷基”是指具有“W-NH-W-”或“W2-N-W-”结构的基团，其中W为烷基，烷氨烷基的非限制性实施例包括：甲氨甲基、乙氨甲基或二甲氨甲基或二乙氨甲基等。
术语“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。
术语“任选地”是指意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如“R2任选地被一个或多个选自如下的取代基取代：卤素”是指卤素等取代基可以但不必须存在，该说明包括R2被卤素取代的情形和R2不被卤素取代的情形。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“可药用盐”是指本发明化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
本发明提供的三环化合物对WEE1具有很高的抑制活性，可以用于治疗或预防例如肝癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤、脑瘤、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌、胃癌或白血病等肿瘤，优选可以用于治疗小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌或卵巢癌。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
实施例一：8-(2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0496)的合成
步骤1：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
依次将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(3g,1.0mmol,1eq)、2-(6-溴吡啶-2-基)丙烷-2-醇(2.91g,1.0mmol,1eq)、碘化亚铜(2.57g,1.0mmol,1eq)、无水碳酸钾(3.73g,2.0mmol,2eq)和N,N-二甲基乙二胺(1.19g,1mmol,1eq)加入到1,4-二氧六环(30mL)中，在氮气氛围下，将反应体系升温至100℃并搅拌过夜。将反应体系冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到化合物2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(1g)，棕色固体，产率为20.7％。
LCMS m/z(ESI)：358.2(M+H)+.
步骤2：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚砜基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将间氯过氧苯甲酸(725mg,4.2mmol,3eq)加入到2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg,1.4mmol,1eq)的二氯甲烷(30mL)溶液中，反应体系在室温下搅拌1小时。减压浓缩除去二氯甲烷得到化合物2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚砜基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(1.2g,粗品)，白色固体。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：374.1(M+H)+.
步骤3：3-甲氧羰基-4-(4-(甲氧基羰基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
将4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(10g,0.05mol,1eq)和3-甲氧羰基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(12.31g,0.05mmol,1eq)溶于乙腈溶液(100mL)中，常温下加入三乙胺(10.16g,0.1mol,2eq)，80℃搅拌过夜。浓缩后用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/90)得到化合物3-甲氧羰基-4-(4-(甲氧基羰基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(15g)，黄色油状物，产率为66.93％。
LCMS m/z(ESI)：446.0(M+Na)+.
步骤4：8-甲氧羰基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯的合成
将化合物3-甲氧羰基-4-(4-(甲氧基羰基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(15g,0.035mol,1eq)溶于甲醇(90mL)中，向其中加入150mg钯碳，在氢气氛围下(1atm)室温搅拌3小时。将混合物过滤，减压浓缩后用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝50/50)得到8-甲氧羰基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(10g)，黄色油状物，产率为78.1％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：362.0(M+H)+.
步骤5：3-叔丁氧羰基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸的合成
将8-甲氧羰基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(5g,0.0138mol,1eq)溶于甲醇/水＝5:1溶液(100mL)中，加入氢氧化锂(1.66g,0.069mol,5eq)，在50℃搅拌2小时。将混合物减压浓缩并用水稀释。0℃下加入1N盐酸水溶液调节pH至3-4，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物3-叔丁氧羰基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸(4.8g)，黄色固体，产率为99％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：370.0(M+Na)+.
步骤6：8-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯的合成
将化合物3-叔丁氧羰基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸(2.5g,0.007mol,1eq)溶于甲苯(30mL)中，加入叠氮磷酸二苯酯(5.88g,0.021mol,3eq)和三乙胺(2.12g,0.021mol,3eq)，在氮气氛围下，室温搅拌1小时。后加入苯甲醇(1.53g,0.014mol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。浓缩后用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝75/25)得到8-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(1.96g)，黄色固体，产率为50.9％。
LCMS m/z(ESI)：453(M+Na)+.
步骤7：(5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯的合成
将8-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(1.96g,0.0043mol,1eq)加入三氟乙酸(3mL)的二氯甲烷(30mL)溶液中，在室温下搅拌2小时。反应液0℃下加入饱和氢钠水溶液调节pH至7-8，过滤，滤液用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤；滤饼用二氯甲烷/甲醇＝10/1洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到化合物(5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(1.4g)，黄色固体，产率为92.10％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：353.0(M+H)+.
步骤8：(3-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯的合成
将化合物(5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(1.4g,0.0039mol,1eq)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入37％甲醛水溶液(0.63g,0.0078mol,2eq)，氰基硼氢化钠(1.23g,0.0195mol,5eq)，在室温搅拌1小时。将混合物减压浓缩并用饱和碳酸氢钠溶液稀释，乙酸乙酯萃取，浓缩，浓缩后用硅胶柱纯化(乙酸乙酯100％)得到化合物(3-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(0.75g)，黄色固体，产率为51.7％。
LCMS m/z(ESI)：367.0(M+H)+.
步骤9：8-氨基-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮的合成
将化合物(3-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(100mg,0.2629mmol,1eq)溶于甲醇(3mL)中，向其中加入100mg钯碳，在氢气氛围下(1atm)，室温搅拌1小时。将混合物过滤，减压浓缩得到化合物8-氨基-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(50mg)，黄色固体，产率为69.5％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：247.0(M+H)+.
步骤10：8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0496)的合成
将8-氨基-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(70mg,0.3014mmol,1eq)溶于甲苯(3mL)中，加入2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(112.55mg,0.3014mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(194.76mg,1.5070mmol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。加饱和氯化铵溶液萃灭，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0496,7mg)，黄色固体，产率为4.1％。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ8.80(s,1H),7.93(t,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.25(s,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.70(m,1H),5.03(d,J＝10.4Hz,1H),4.92(s,1H),4.81(d,J＝6.0Hz,2H),3.69(d,J＝11.6Hz,1H),3.52(dd,J＝10.8,3.2Hz,1H),3.43(d,J＝11.6Hz,1H),3.07(d,J＝11.6Hz,1H),2.84(d,J＝3.2Hz,1H),2.48(s,3H),2.40–2.28(m,2H),1.56(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：542.0(M+H)+.
实施例二、实施例三：(R)-8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GLX0541)和(S)-8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GLX0542)的合成
将8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮经手性拆分得到化合物(R)-8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GLX0541)和(S)-8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GLX0542)。将其任意的指定绝对立体化学。
峰1：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.80(s,1H),7.93(t,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.25(s,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.70(m,1H),5.03(d,J＝10.4Hz,1H),4.92(s,1H),4.81(d,J＝6.0Hz,2H),3.69(d,J＝11.6Hz,1H),3.52(dd,J＝10.8,3.2Hz,1H),3.43(d,J＝11.6Hz,1H),3.07(d,J＝11.6Hz,1H),2.84(d,J＝3.2Hz,1H),2.48(s,3H),2.40–2.28(m,2H),1.56(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：542.0(M+H)+.
峰2：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.80(s,1H),7.93(t,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.25(s,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.70(m,1H),5.03(d,J＝10.4Hz,1H),4.92(s,1H),4.81(d,J＝6.0Hz,2H),3.69(d,J＝11.6Hz,1H),3.52(dd,J＝10.8,3.2Hz,1H),3.43(d,J＝11.6Hz,1H),3.07(d,J＝11.6Hz,1H),2.84(d,J＝3.2Hz,1H),2.48(s,3H),2.40–2.28(m,2H),1.56(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：542.0(M+H)+.
实施例四：8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0495)的合成
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步骤1:8-甲氧羰基-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯的合成
将8-甲氧羰基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(5.5g,0.0152mol,1eq)溶于四氢呋喃溶液(90mL)中，0℃下加入氢化钠(0.73g,0.0182mol,1.2eq)，室温搅拌10min；然后0℃下加入碘甲烷(3.24g,0.0228mol,1.5eq)，室温搅拌16小时。加水萃灭，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，浓缩后用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝85/15)得到8-甲氧羰基-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(3.9g)，黄色固体，产率为61.2％。
LCMS m/z(ESI)：398.0(M+Na)+.
步骤2：3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸的合成
将8-甲氧羰基-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(3.9g,0.0104mol,1eq)溶于甲醇/水＝5:1溶液(100mL)中，加入氢氧化锂(1.25g,0.052mol,5eq)，在50℃搅拌16小时。将混合物减压浓缩并用水稀释。0℃下加入1NHCl水溶液调节pH至3-4，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸(3.5g)，黄色固体，产率为83.6％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：384.0(M+Na)+.
步骤3：8-(((苄氧基)羰基)氨基)-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯的合成
将化合物3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-羧酸(2.2g,0.0061mol,1eq)溶于甲苯(30mL)中，加入叠氮磷酸二苯酯(5.04g,0.0183mol,3eq)和三乙胺(1.85g,0.0183mol,3eq)，在氮气氛围下，室温搅拌1小时。后加入苯甲醇(1.32g,0.0122mol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。浓缩后用硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝75/25)得到8-(((苄氧基)羰基)氨基)-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(2g)，黄色固体，产率为63.9％。
LCMS m/z(ESI)：489.1(M+Na)+.
步骤4：(6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯的合成
将8-(((苄氧基)羰基)氨基)-6-甲基-5-氧代-1,2,4,4a,5,6-六氢-3H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-3-羧酸叔丁酯(2g,0.0043mol,1.0eq)加入三氟乙酸(4mL)的二氯甲烷(20mL)溶液中，在室温下搅拌2小时。反应液0℃下加入饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至7-8，过滤，滤液用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤；滤饼用二氯甲烷/甲醇＝10/1洗涤。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物(6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(1.3g)，黄色固体，产率为74.4％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：367.0(M+H)+.
步骤5：(3,6-二甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯的合成
将化合物(6-甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(1.3g,0.0035mol,1eq)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入37％甲醛水溶液(0.57g,0.0070mol,2eq)和氰基硼氢化钠(1.10g,0.0175mol,5eq)，在室温搅拌1小时。将混合物减压浓缩并用饱和碳酸氢钠溶液稀释，乙酸乙酯萃取。浓缩后用硅胶柱纯化(乙酸乙酯100％)得到化合物(3,6-二甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(0.7g)，黄色固体，产率为48.6％。
LCMS m/z(ESI)：381.0(M+H)+.
步骤6：8-氨基-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮的合成
将化合物(3,6-二甲基-5-氧代-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-8-基)氨基甲酸苄酯(100mg,0.2629mmol,1eq)溶于甲醇(3mL)中，向其中加入100mg钯碳，在氢气氛围下(1atm)，室温搅拌1小时。将混合物过滤，减压浓缩得到化合物8-氨基-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(50mg)，黄色固体，产率为69.5％。无需进一步纯化即可使用。
LCMS m/z(ESI)：247.0(M+H)+.
步骤7：8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0495)的合成
将8-氨基-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(50mg,0.2030mmol,1eq)溶于甲苯(3mL)中，加入2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(75.81mg,0.203mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(131.18mg,1.0150mmol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。加饱和氯化铵溶液萃灭，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物8-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,6-二甲基-2,3,4,4a-四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]喹喔啉-5(6H)-酮(GXL0495,40mg)，淡绿色固体，产率为31.9％。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ8.82(s,1H),7.94(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(m,2H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),5.70(m,1H),5.02(d,J＝10.4Hz,1H),4.91(s,1H),4.76(d,J＝6.0Hz,2H),3.64(d,J＝11.6Hz,1H),3.45(m,2H),3.22(s,3H),3.05(d,J＝11.2Hz,1H),2.87–2.79(m,1H),2.45(s,3H),2.31(m,2H),1.56(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：556.0(M+H)+.
实施例五：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GXL0497)的合成
步骤1：4-甲基哌嗪-2-甲醇的合成
将化合物3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(5g,0.02mol,1eq)溶于四氢呋喃溶液(60mL)中，0℃下加入氢化铝锂(3.7g,0.09mmol,4eq)，升至70℃反应2小时。加过量四氢呋喃稀释后，0℃滴加与氢化铝锂同质量的水，再加入3V体积的15％氢氧化钠水溶液，砂芯漏斗抽滤，无水硫酸钠干燥，旋干得4-甲基哌嗪-2-甲醇(2.8g)，白色固体，产率为63.64％。
LCMS m/z(ESI)：131.0(M+H)+.
步骤2：3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮的合成
将4-甲基哌嗪-2-甲醇(2.4g，0.018mol，1eq)、2-氟-5-硝基苯甲酸甲酯(4.30g，0.0216mol,1.2eq)和三乙胺(1.81g，0.054mol,3eq)溶于四氢呋喃(30mL)中，在氮气氛围下，于65℃下搅拌48小时。将混合物过滤，减压浓缩后用硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝18/1)得到化合物3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(1.8g)，绿色固体，产率为55.75％。
LCMS m/z(ESI)：278.0(M+H)+.
步骤3：(2-(2-羟甲基-4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)甲醇的合成
将3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(1g，0.0036mol)溶于四氢呋喃(50mL)溶液中，在氮气保护下，于0℃滴加硼氢化锂(0.1572g，0.0072mol)溶液。滴完后将反应混合物升至25℃并搅拌6小时。在反应液中缓慢加入氯化铵溶液至不再冒泡，用二氯甲烷/水萃取，过滤并减压浓缩，得到化合物(2-(2-羟甲基-4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)甲醇(470mg)，黄色固体，产率为47％。
LCMS m/z(ESI)：282(M+H)+.
步骤4：3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓的合成
将(2-(2-羟甲基-4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)甲醇(100mg，0.355mmol)溶于10mL超干二氯甲烷中,在0℃及氮气环境下滴加50％硫酸(34.8mg，0.355mmol)。搅拌5min后将反应混合物在油浴80℃下搅拌6小时。反应液通过二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥浓缩后用硅胶柱纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝20/1)得到化合物3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓(50mg)，黑色固体，产率为53％。
LCMS m/z(ESI)：264(M+H)+.
步骤5：3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺的合成
将化合物3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓(50mg,0.1894mmol,1eq)和钯碳(20mg，0.1894mmol)溶于5mL甲醇中，在氢气氛围下(1atm)，于25℃搅拌12小时。过滤并减压浓缩后冻干得到化合物3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(34mg)，白色固体，产率为77.27％。
LCMS m/z(ESI)：234.0(M+H)+.
步骤6：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GXL0497)的合成
将化合物3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(30mg,0.1286mmol,1eq)溶于甲苯(3mL)中，加入2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(35.2mg,0.1286mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(33.22mg,0.2571mmol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。加饱和氯化铵溶液萃灭，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GXL0497,1.98mg)，白色固体，产率为2.8％。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ8.81(s,1H),7.98(t,J＝7.9Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,2H),7.51(d,J＝8.6Hz,1H),6.95(d,J＝8.6Hz,1H),5.76–5.66(m,1H),5.03(d,J＝10.9Hz,2H),4.92(s,1H),4.82(d,J＝6.0Hz,4H),4.60–4.53(m,2H),3.78(d,J＝10.4Hz,1H),3.55(d,J＝12.6Hz,1H),2.95(d,J＝11.4Hz,1H),2.83(t,J＝9.8Hz,2H),2.55(t,J＝10.9Hz,1H),2.41(s,3H),1.57(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：543.0(M+H)+.
实施例六、实施例七：(S)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0564)和(R)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0565)的合成
将2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮经手性拆分得到化合物(S)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0564)和(R)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0565)。将其任意的指定绝对立体化学。
峰1：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.23(s,1H),8.85(s,1H),7.98(t,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.61(d,J＝7.6Hz,1H),7.49(d,J＝6.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),5.72–5.59(m,1H),5.33(s,1H),4.98(dd,J＝10.4,1.4Hz,1H),4.88–4.74(m,2H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),4.56(d,J＝12.0Hz,1H),3.73–3.52(m,2H),3.23–3.08(m,2H),2.96–2.85(m,1H),2.71(d,J＝10.8Hz,1H),2.61(d,J＝9.2Hz,1H),2.30–2.16(m,5H),1.47(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：543.0(M+H)+.
峰2：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.23(s,1H),8.85(s,1H),7.98(t,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.61(d,J＝7.6Hz,1H),7.49(d,J＝6.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),5.72–5.59(m,1H),5.33(s,1H),4.98(dd,J＝10.4,1.4Hz,1H),4.88–4.74(m,2H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),4.56(d,J＝12.0Hz,1H),3.73–3.52(m,2H),3.23–3.08(m,2H),2.96–2.85(m,1H),2.71(d,J＝10.8Hz,1H),2.61(d,J＝9.2Hz,1H),2.30–2.16(m,5H),1.47(s,6H).
LCMS m/z(ESI)：543.0(M+H)+.
实施例八：9-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(GXL0498)的合成
步骤1：9-氨基-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮的合成
将化合物3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(200mg,0.7220mmol,1eq)和钯碳(40mg，0.3610mmol)溶于10mL甲醇中，在氢气氛围下(1atm)，于25℃搅拌12小时。过滤并减压浓缩后冻干得到9-氨基-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(170mg)，白色固体，产率为85.12％。
LCMS m/z(ESI)：248.1(M+H)+.
步骤2：9-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(GXL0498)的合成
将9-氨基-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(80mg,0.3238mmol,1eq)溶于甲苯(5mL)中，加入2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(120.8mg,0.3238mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(83.95mg,0.6476mmol,2eq)，在氮气氛围下，110℃搅拌2小时。加饱和氯化铵溶液萃灭，乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物9-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-7-酮(GXL0498,18.8mg)，白色固体，产率为10.4％。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ8.83(s,1H),8.30(s,1H),8.04(t,J＝7.9Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,2H),7.04(d,J＝8.7Hz,1H),5.71-5.66(m,1H),5.03(d,J＝10.2Hz,1H),4.91(s,1H),4.82(d,J＝6.2Hz,2H),4.41(dd,J＝13.4,4.1Hz,1H),4.17(d,J＝13.5Hz,1H),3.25(s,2H),3.13(s,2H),3.00-2.91(m,2H),2.57-2.49(m,1H),2.43(s,3H),2.39–2.31(m,1H),1.56(d,J＝3.8Hz,6H).
LCMS m/z(ESI)：557.26(M+H)+.
实施例九：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(3-甲基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0566)的合成
步骤1：2-(2-氟-4-硝基苯基)-4-甲基哌嗪-2-基乙烷-1-醇的合成
将化合物2-(4-甲基哌嗪-2-基)乙烷-1-醇(300mg,1.66mmol,1eq)和1,2-二氟-4-硝基苯(246mg，1.66mmol，1eq)溶于乙腈溶液(10mL)中，室温加入DIPEA(642mg，4.98mmol，3eq)。然后，反应液升温到80℃搅拌16h。将反应液减压旋干，粗产物通过硅胶柱纯化(PE/EA＝3/1)，旋干得化合物2-(2-氟-4-硝基苯基)-4-甲基哌嗪-2-基乙烷-1-醇(60mg)，浅黄色固体，产率为11.48％。
LCMS m/z(ESI)：284.1(M+H)+.
步骤2：3-甲基-9-硝基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓的合成
将2-(2-氟-4-硝基苯基)-4-甲基哌嗪-2-基乙烷-1-醇(50mg，0.17mmol，1eq)溶于DMF(2ml)中,在0℃加入氢化钠(8.47mg,0.35mmol,2eq)，反应液升温到60℃搅拌1h。将H2O(1ml)在0℃滴加到反应液中，然后用乙酸乙酯萃取(10ml×2)，有机相合并，用饱和食盐水洗涤(20ml×2)；有机相无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后用TLC纯化(PA/EA＝2/1)得到化合物3-甲基-9-硝基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓(35mg)，浅黄色油状物，产率为56.9％。
LCMS m/z(ESI)：264.0(M+H)+.
步骤3：3-甲基-9-氨基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓的合成
将3-甲基-9-硝基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓(35mg，0.11mmol)溶于甲醇(4mL)溶液中，加入钯碳(10mg),在30℃和氢气球环境下搅拌16h。反应液过滤，滤液减压浓缩得到3-甲基-9-氨基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓(20mg)，浅棕色固体，产率为：60.23％。
LCMS m/z(ESI)：234.1(M+H)+.
步骤4：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(3-甲基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0566)的合成
将3-甲基-9-氨基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓(10mg，0.04mmol，1eq)和2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(16.0mg，0.04mmol，1eq)溶于甲苯(1mL)中，室温下加入DIPEA(16.6mg，0.12mmol，3eq)，反应液升温到40℃搅拌4h。反应液减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(3-甲基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0566)(6.4mg)，浅黄色固体，产率为27.9％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),8.85(s,1H),8.00(t,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(dd,J＝7.7,1Hz,1H),7.32(s,1H),7.26(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.67(ddt,J＝6.0Hz,1H),5.34(s,1H),4.99(dd,J＝10.4,1.2Hz,1H),4.82(dd,J＝17.2,1.3Hz,1H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),4.44(td,J＝10.7,1.8Hz,1H),4.13(dt,J＝8.5,3.9Hz,1H),3.14–2.96(m,3H),2.71–2.58(m,1H),2.55–2.52(m,1H),2.35–2.19(m,4H),2.18–2.08(m,1H),2.08–1.84(m,2H),1.46(s,6H).
LCMS M/Z(ESI):(M+H)+.
实施例十：2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
步骤1：2-烯丙基-6-(甲硫基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg,2.250mmol,1.0eq.)和2-溴吡啶(533.1mg,3.374mmol,1.5eq.)溶于1,4二氧六环溶液(5.0mL)中，室温加入碳酸钾(466.4mg,3.374mmol,1.5eq.)，碘化亚铜(428.4mg,2.250mmol,1.0eq.)和N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(297.3mg,3.374mmol,1.5eq.)。95℃N2下搅拌18小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和氨水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝1:1)，得到化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(390mg)，固体，产率51.12％。
LCMS M/Z(ESI):300.08(M+H)+.
步骤2：2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(451mg,1.507mmol,1.0eq.)和间氯过氧苯甲酸(260.0mg,1.658mmol,1.1eq.)溶于5.0mL二氯甲烷中，在冰浴下搅拌30分钟。恢复室温搅拌1.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝0:1)，得到化合物2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(320mg)，固体，产率60.62％。
LCMS M/Z(ESI):(M+H)+.
步骤3：2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0649)的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(27.03mg,0.0857mmol,1.0eq.)和3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(19.99mg,0.0857mmol,1.0eq.)溶于甲苯(2.0mL)中，室温加入N,N-二异丙基乙胺(27.69mg,0.2143mmol,2.5eq.)。100℃N2下搅拌1.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝10:1)，得到化合物2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯[e]并吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0649，12.26mg)，黄色固体，产率38.74％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.27(s,1H),8.86(s,1H),8.54(dd,J＝4.8,1.0Hz,1H),8.06–7.96(m,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.67(s,1H),7.49(d,J＝7.4Hz,1H),7.40(dd,J＝6.6,5.0Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,1H),5.75–5.58(m,1H),5.01(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),4.89–4.72(m,2H),4.58(dd,J＝21.2,8.5Hz,3H),3.66(td,J＝13.4,3.7Hz,2H),3.17(dd,J＝27.2,10.5Hz,2H),2.90(s,1H),2.82–2.59(m,2H),2.29(d,J＝29.4Hz,5H).
LCMS M/Z(ESI):485.3(M+H)+.
实施例十一：2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0650)的合成
步骤1：2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg,2.250mmol,1.0eq.)和化合物2-溴-6-甲基吡啶(580.5mg,3.37mmol,1.5eq.)溶于1,4二氧六环溶液(5.0mL)中，室温加入碳酸钾(466.4mg,3.374mmol,1.5eq.)、碘化亚铜(428.4mg,2.250mmol,1.0eq.)和N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(218mg,2.250mmol,1.5eq.)。95℃N2下搅拌18小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和氨水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝1:1)，得到化合物2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(270mg)，固体，产率34.47％。
LCMS M/Z(ESI):314.10(M+H)+.
步骤2：2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(270mg,0.8616mmol,1.0eq.)和间氯过氧苯甲酸(163.6mg,0.9478mmol,1.1eq.)溶于3.0mL二氯甲烷中，在冰浴下搅拌30分钟。恢复室温搅拌1.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝0:1)纯化，得到化合物2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(320mg)，固体，产率99.74％。
LCMS M/Z(ESI):330.0(M+H)+.
步骤3：2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0650)的合成
将化合物2-烯丙基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-6-(甲亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(28.23mg,0.0857mmol,1.0eq.)和3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(19.99mg,0.0857mmol,1.0eq.)溶于甲苯(2.0mL)中，室温加入N,N-二异丙基乙胺(27.69mg,0.2143mmol,2.5eq.)。100℃N2下搅拌1.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝15:1)，得到化合物2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0650，20.7mg)，黄色固体，产率47.14％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.19(s,1H),8.84(s,1H),7.89(t,J＝7.8Hz,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(d,J＝7.6Hz,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),5.73–5.61(m,1H),5.01(dd,J＝10.4,1.1Hz,1H),4.92–4.84(m,1H),4.77(d,J＝11.8Hz,1H),4.57(dd,J＝29.0,8.3Hz,3H),3.73–3.57(m,2H),3.16(dd,J＝26.8,10.5Hz,2H),2.89(s,1H),2.67(d,J＝45.2Hz,1H),2.49(s,3H),2.25(s,5H).
LCMS M/Z(ESI):499.3(M+H)+.
实施例十二：6-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(GLX0657)的合成
步骤1：6-(2-烯丙基-6-(甲硫基))-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(300mg,1.345mmol,1.0eq.)和化合物2-溴-6-甲基吡啶(370.5mg,2.024mmol,1.5eq.)溶于1,4二氧六环溶液(5.0mL)中，室温加入碳酸钾(279.8mg,2.024mmol,1.5eq.)、碘化亚铜(257.0mg,1.350mmol,1.0eq.)和N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(130.8mg,1.485mmol,1.1eq.)。95℃N2下搅拌18小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和氨水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝1:1)，得到化合物6-(2-烯丙基-6-(甲硫基))-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(200mg)，固体，产率36.55％。
LCMS M/Z(ESI):325.1(M+H)+.
步骤2：6-(2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈的合成
将化合物6-(2-烯丙基-6-(甲硫基))-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(200mg,0.6166mmol,1.0eq.)和间氯过氧苯甲酸(117.1mg,0.6783mmol,1.1eq.)溶于3.0mL二氯甲烷中，在冰浴下搅拌30分钟。恢复室温搅拌2小时。薄层色谱监测显示反应完成。浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝0:1)，得到化合物6-(2-烯丙基-6-甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(160mg)，固体，产率61.00％。
LCMS M/Z(ESI):341.1(M+H)+.
步骤3：6-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(GLX0657)的合成
将化合物6-(2-烯丙基-6-甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(40mg,0.1175mmol,1.0eq.)和3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(27.41mg,0.1175mmol,1.0eq.)溶于甲苯(2.0mL)中，室温加入N,N-二异丙基乙胺(37.96mg,0.2938mmol,2.5eq.)。100℃N2下搅拌0.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝15:1)，得到化合物6-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶甲腈(GLX0657，41.55mg)，黄色固体，产率67.91％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.36(s,1H),8.88(s,1H),8.22(d,J＝7.4Hz,2H),8.00(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(dd,J＝14.2,5.7Hz,2H),6.97(d,J＝8.6Hz,1H),5.69(dd,J＝17.0,10.3Hz,1H),5.03(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),4.94(dd,J＝17.0,1.3Hz,1H),4.78(d,J＝11.8Hz,1H),4.58(dd,J＝13.0,9.0Hz,3H),3.64(dd,J＝15.0,3.5Hz,2H),3.22–3.11(m,2H),2.91(s,1H),2.73(s,1H),2.67–2.59(m,1H),2.24(s,5H).
LCMS M/Z(ESI):510.2(M+H)+.
实施例十三：2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙烷-2-基)苯基)-6-(3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并吡嗪基[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0658)的合成
步骤1：2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg,2.250mmol,1.0eq.)和化合物2-(3-溴苯基)丙烷-2-醇(725.8mg,3.374mmol,1.5eq.)溶于1,4二氧六环溶液(5.0mL)中，室温加入碳酸钾(466.36mg,3.374mmol,1.5eq.)、碘化亚铜(428.4mg,2.250mmol,1.0eq.)和N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(218mg,2.474mmol,1.1eq.)。95℃N2下搅拌18小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和氨水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝1:1)，得到化合物2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(150mg)，固体，产率14.97％。
LCMS M/Z(ESI):357.1(M+H)+.
步骤2：2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成
将化合物2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(140mg,0.3928mmol,1.0eq.)和间氯过氧苯甲酸(74.56mg,0.4321mmol,1.1eq.)溶于3.0mL甲苯中，在冰浴下搅拌30分钟。恢复室温搅拌2小时。薄层色谱监测显示反应完成。浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝0:1)，得到化合物2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(100mg)，固体，产率54.68％。
LCMS M/Z(ESI):373.13(M+H)+.
步骤3：2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0658)的合成
将化合物2-烯丙基-1-(3-(2-羟基丙基-2-基)苯基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(66mg,0.1772mmol,1.0eq.)和3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(41.34mg,0.1772mmol,1.0eq.)溶于甲苯(3.0mL)中，室温加入N,N-二异丙基乙胺(57.25mg,0.443mmol,2.5eq.)。100℃N2下搅拌2小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝15:1)，得到化合物2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0658，40.38mg)，黄色固体，产率41.87％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.12(s,1H),8.82(s,1H),7.58(d,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝5.0Hz,3H),7.37(d,J＝2.7Hz,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,1H),5.68(dt,J＝11.8,5.4Hz,1H),5.17(s,1H),5.07(dd,J＝10.4,1.0Hz,1H),4.90(d,J＝17.2Hz,1H),4.72(d,J＝11.8Hz,1H),4.47(d,J＝11.8Hz,1H),4.27(s,2H),3.59(ddd,J＝26.8,13.0,3.8Hz,2H),3.19–3.05(m,2H),2.86(d,J＝5.6Hz,1H),2.74(d,J＝8.0Hz,1H),2.62(d,J＝9.4Hz,1H),2.25(s,5H),1.44(s,6H).
LCMS M/Z(ESI):542.3(M+H)+.
实施例十四：2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0676)的合成
将化合物3-甲基-1,2，3，4，4a，5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(5mg,0.0125mmol,1eq)溶于甲苯(0.5mL)中，加入2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(3mg,0.0125mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(2mg,0.015mmol,2eq)，在氮气氛围下，60℃搅拌16小时。加饱和NH4Cl溶液萃灭，二氯甲烷萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(1.97mg)，黄色固体，产率16％，产物为一对不可分离的非对映异构体(2:1d.r.,由HNMR测定)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(s,0.5H),8.82(s,1H),7.82–7.66(m,3H),7.57–7.30(m,7H),6.89(t,J＝6.6Hz,2H),5.75–5.61(m,2H),5.04(dd,J＝22.3,10.9Hz,4H),4.97–4.77(m,4H),4.74–4.46(m,4H),3.90–3.70(m,2H),3.61–3.42(m,4H),3.39–2.98(m,10H),2.94–2.77(m,4H),2.75–2.51(m,8H),2.46–2.32(m,3H),2.30–2.13(m,4H),2.10–1.91(m,7H),1.92–1.75(m,5H),0.98(t,J＝7.4Hz,6H).
SFC:d.r.＝4:5(214nm)and d.r.＝4:5(254nm).
LCMS M/Z(ESI):569.25(M+H)+.
实施例十五：2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-(((R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0677)的合成
步骤1：(R)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓的合成
将3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓经手性拆分得到化合物(R)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓和(S)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓。
(S)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓
SFC:ee value:100％(214nm)and 100％(254nm).
(R)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓
SFC:ee value:100％(214nm)and 100％(254nm).
步骤2：(R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺的合成
将化合物(R)-3-甲基-9-硝基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓(88mg,0.334mmol,1eq)和钯碳(36mg,0.334mmol,1eq)溶于7mL甲醇中，在氢气氛围下(1atm)，于25℃搅拌16小时。过滤并减压浓缩后冻干得到化合物(R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(86mg)，白色固体，产率为93.75％。
LCMS(ESI):234.0(M+1)+.
步骤3：2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-(((R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(GLX0677)的合成
将化合物(R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(35mg,0.15mmol,1.2eq)溶于甲苯(10mL)中，加入2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-(甲基亚磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(50mg,0.125mmol,1eq)和N,N-二异丙基乙胺(20mg,0.15mmol,1.2eq)，在氮气氛围下，60℃搅拌16小时。加饱和NH4Cl溶液萃灭，二氯甲烷萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，粗产品用半制备液相色谱纯化，得到化合物2-烯丙基-1-((R)-7-乙基-7-羟基-6,7-二氢-5H-环戊烷[b]吡啶-2-基)-6-(((R)-3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(9.52mg,黄色固体，产率13％).
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,1H),7.68(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(s,1H),7.47(s,2H),6.88(d,J＝8.6Hz,1H),5.76–5.61(m,1H),5.11(d,J＝11.3Hz,1H),5.02(d,J＝10.2Hz,1H),4.95–4.80(m,2H),4.69(dd,J＝15.8,6.7Hz,1H),4.57(d,J＝11.3Hz,1H),3.97–3.74(m,2H),3.62–3.16(m,5H),3.14–3.01(m,1H),3.00–2.77(m,4H),2.48–2.33(m,1H),2.28–2.16(m,1H),2.09–1.93(m,1H),1.91–1.77(m,1H),1.38–1.29(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
SFC:de value:100％(214nm)and de value:100％(254nm).
LCMS M/Z(ESI):569.2(M+H)+.
实施例十六：3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-N-甲基苯甲酰胺(GLX0678)的合成
步骤1：3-(2-烯丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯的合成
将化合物2-烯丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg,2.250mmol,1.0eq.)和化合物3-(甲氧基羰基)苯基)硼酸(688.2mg,3.824mmol,1.7eq.)溶于氯仿溶液(5.0mL)中，室温加入吡啶(20.0mL)和醋酸铜(402.9mg,2.024mmol,0.9eq.)。室温搅拌48小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和氨水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝1:1)，得到化合物3-(2-烯丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(470mg)，固体，产率49.83％。
LCMS M/Z(ESI):357.09(M+H)+.
步骤2：3-(2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯的合成
将化合物3-(2-烯丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(470mg,1.32mmol,1.0eq.)和间氯过氧苯甲酸(250.3mg,1.45mmol,1.1eq.)溶于3.0mL二氯甲烷中，在冰浴下搅拌30分钟。恢复室温搅拌2小时。薄层色谱监测显示反应完成。浓缩后用硅胶柱纯化(PE/EA＝0:1)纯化，得到化合物3-(2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(430mg)，固体，产率74.43％。
LCMS M/Z(ESI):373.08(M+H)+.
步骤3：3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯的合成
将化合物3-(2-烯丙基-6-(甲基亚磺酰基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(430mg,1.155mmol,1.0eq.)和3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-胺(269.4mg,1.155mmol,1.0eq.)溶于甲苯(4.0mL)中，室温加入N,N-(373.1mg,2.887mmol,2.5eq.)。100℃N2下搅拌2小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝15:1)，得到化合物3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(310mg)，固体，产率42.13％。
LCMS M/Z(ESI):542.24(M+H)+.
步骤4：3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸的合成
将化合物3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸甲酯(200mg,0.3693mmol,1.0eq.)溶于甲醇(4.0mL)中，室温加入氢氧化锂(17.69mg,0.7386mmol,2.0eq.)。25℃N2下搅拌3小时。薄层色谱监测显示反应完成。向体系中加水淬灭，用1M HCl将pH调节至3-4，用乙酸乙酯萃取3次，每次3mL，用盐水(3mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后得到化合物3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸(200mg)，固体，产率82.13％。
LCMS M/Z(ESI):528.23(M+H)+.
步骤5：3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-N-甲基苯甲酰胺(GLX0678)的合成
将化合物3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)苯甲酸(100mg,0.1947mmol,1.0eq.)和甲胺(12.94mg 0.42mmol,2.14eq.)溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液(3.0mL)中，室温加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(26.17mg,0.2142mmol,1.1eq.)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(50.33mg,0.4mmol,2.0eq.)，室温搅拌1.5小时。薄层色谱监测显示反应完成。用乙酸乙酯和水萃取3次，每次2.0mL，用盐水(2.0mL)冲洗合并的有机层，并加入无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝15:1)，得到化合物3-(2-烯丙基-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a,5-六氢-7H-苯并[e]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-N-甲基苯甲酰胺(GLX0678，13.82mg)，黄色固体，产率6.57％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),8.86(s,1H),8.62(d,J＝4.6Hz,1H),7.90(dd,J＝15.8,13.3Hz,2H),7.67–7.64(m,2H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(s,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,1H),5.74–5.63(m,1H),5.09(dd,J＝10.4,1.1Hz,1H),4.93(dd,J＝17.2,1.3Hz,1H),4.72(d,J＝11.8Hz,1H),4.46(d,J＝11.2Hz,1H),4.32(s,2H),3.60(qd,J＝13.2,3.9Hz,2H),3.22–3.08(m,3H),2.88(s,1H),2.82(d,J＝4.4Hz,3H),2.78(d,J＝4.6Hz,1H),2.68(s,1H),2.31(d,J＝18.2Hz,5H).
LCMS M/Z(ESI):541.26(M+H)+.
生物学测试评价
实验例一WEE1活性检测实验
1.实验检测条件
(1)试剂/设备及耗材信息：
(2)反应条件：
1)缓冲液配制(1×)：Hepes buffer 50mM，MgCl2 10mM，EDTA 1mM，Brij-350.01％，DTT 2mM。
2)反应终浓度：
a)阳性参考化合物最高浓度500nM，4倍稀释，8个梯度；
b)待测化合物最高浓度1000nM，4倍稀释，8个梯；
c)WEE1激酶2nM，Poly-Lys,Tyr 4:1底物0.1mg/mL，ATP 15μM。
2.化合物配制
(1)阳性参考化合物：
阳性参考化合物AZD1775用100％DMSO溶解成10mM存储液。对存储液进行稀释，配制成含1％DMSO的(5×)最高浓度2500nM，4倍稀释，8个梯度工作液。
(2)待测化合物：
待测化合物用100％DMSO溶解成20mM存储液。对存储液进行稀释，配制成含1％DMSO的(5×)最高浓度5000nM，4倍稀释，8个梯度工作液。
3.实验方法
(1)取1uL配制的5×阳性参考化合物和待测化合物的梯度溶液加在实验孔中；取1uL含1％DMSO的缓冲液加在100％和0％抑制参照孔中。
(2)用缓冲液配制2.5×WEE1和Poly-Lys,Tyr 4:1底物的工作混合液，以2uL/孔加在化合物孔和0％抑制参照孔中。用缓冲液配制只含2.5×Poly-Lys,Tyr 4:1底物工作混合液，以2uL/孔加在100％抑制参照孔中。以1000转/分钟离心1分钟。
(3)用缓冲液配制2.5×ATP工作混合液，以2uL/孔加在所有孔中。以1000转/分钟离心1分钟。放置在30℃培养箱中反应60分钟。
(4)以5uL/孔的ADP-Glo试剂加在所有孔中，以1000转/分钟离心1分钟。放置在25℃培养箱中反应40分钟。
(5)以10uL/孔的激酶检测试剂加在所有孔中，以1000转/分钟离心1分钟。放置在25℃培养箱中反应30分钟后，酶标仪读取发光信号值。
4.统计分析
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，将未加WEE1激酶的RLU作为100％抑制对照(100％I)，将加WEE1激酶未加化合物的RLU作为0％抑制对照(0％I)，不同浓度抑制百分比(％I)计算：
％I＝(0％抑制RLU-不同浓度RLU)/(0％抑制RLU-100％抑制RLU)
运用非线性回归分析绘制％I与对应不同浓度曲线，方程式为:
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))，Y＝抑制百分比，Top＝最小抑制百分比，Bottom＝最大抑制百分比，X＝化合物浓度，HillSlope＝斜率因子，IC50＝半数最大抑制百分比化合物浓度。结果见表1。
表1化合物对WEE1抑制活性检测结果
从上表可以看出，本发明提供的化合物对WEE1激酶具有非常好的抑制活性。
实验例二：细胞学增殖实验
采用人小细胞肺癌细胞NCIH446和NCIH2171、宫颈癌细胞系C33A细胞、卵巢癌细胞系TOV-21G和OVCAR3细胞、非小细胞肺癌细胞系A427细胞和结肠癌细胞系WiDr细胞开展，用于评估WEE1抑制剂的细胞学活性。
将指数生长期的细胞计数、铺到384孔培养板中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。次日，使用梯度稀释的化合物处理细胞，待测化合物浓度范围1.5nM-10000nM，继续培养。待化合物处理72小时后，使用Cell Titer-Glo试剂(Promega,G7572)检测细胞活性。
用GraphPad Prism软件对数据进行分析，将20μM Staurosporine(Selleck,AM-2282)处理的作为100％抑制对照，将DMSO处理作为0％抑制对照(0％I)，不同浓度抑制百分比(％I)计算：
％I＝(0％抑制RLU-不同浓度RLU)/(0％抑制RLU-100％抑制RLU)
运用非线性回归分析绘制％I与对应不同浓度曲线，方程式为:
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))，Y＝抑制百分比，Top＝最小抑制百分比，Bottom＝最大抑制百分比，X＝化合物浓度，HillSlope＝斜率因子，IC50＝半数最大抑制百分比化合物浓度。检测结果见表2。
表2细胞细胞增殖实验结果
NA表示没有活性。
从表中可以看出，本发明提供的化合物对多种细胞株都有非常好的抑制活性。
实验例三：小鼠体内的药代动力学检测
溶媒配制：20％HP-β-CD水溶液配制过程：称取约20g HP-β-CD至合适容器中，准确量取100mL的纯水缓慢加入，用磁力搅拌器搅拌至澄明，配制成澄清透明的20％HP-β-CD水溶液，常温放置备用。
供试品溶液的配制：称取适量药物，加入一定体积的20％HP-β-CD水溶液，涡旋混匀，配制得到6mg/mL的供试品溶液，备用。
实验动物信息：选取6-8周，体重为20-30g的ICR品系的小鼠，SPF级。
饲养条件：ICR小鼠饲养于SPF级动物房(动物使用许可证：SYXK(苏)2020-0018)。昼夜明暗交替时间：12h/12h，最小换气次数：≥15次/h，温度：20～26℃，最大日温差：≤4℃，相对湿度40～70％。小鼠使用笼盖上的食槽饲喂，持续供给，自由采食，饮水则通过笼具内设置的饮水嘴自由摄取。
动物分组及剂量：
样本采集：将供试品溶液分别按照上述两个组别进行给药。于小鼠适宜静脉取全血约0.03mL至含有EDTA-K2的采血管中，分别于给药后0.25,0.5,1,2,4,6,8,24h进行采样，采血后轻轻摇晃使血液与抗凝剂充分混匀，暂置湿冰中，采集后0.5h内于4℃，4000g条件下，离心5min，取血浆立即转移至-75±15℃保存。
症状观察：动物分组后每天至少观察2次，观察动物的精神状态、一般状况和死亡情况。
数据处理和统计分析：采用LC-MS/MS定量检测ICR小鼠基质中药物浓度。利用Microsoft office Excel(2013版)对原始数据进行统计，包括均值(Mean)，标准差(SD)以及变异系数(CV％)；样本中药物浓度与时间数据用WinNonLin(8.3版)软件进行药代动力学参数计算。结果见表3。
表3小鼠体内的药代动力学参数实验结果
从上表中可以看出，本发明提供的化合物具有非常好的药代动力学性质。
Claims (10)
1.一种式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，
其中，
表示单键或双键；
n为0、1、2或3；
Q选自N或CH；
M选自NH、CH2、NR4、CHR4、O或S；
X、Y或Z各自独立地选自CH2、CHR5、CO、NH、NR5、O、S或不存在；
R1选自烷基、烯基或炔基，其中烷基、烯基或炔基各自独立地被选自卤素或氰基的取代基取代；
R2选自芳基、杂芳基或其中，环A选自苯基或5-6元杂芳基；环B选自5-7元环烷基或5-7元杂环基；其中，R2任选地被一个或多个选自如下的取代基取代：卤素、烷基、烷氧基、羟基、羟基取代的烷基、氰基、硝基、环烷基、环烷氧基、羧基、卤代烷基、烷氧烷基、氨基、烷氨基、卤代烷氧基或杂环基；
R3选自H、卤素、烷基、卤代烷基、羟基取代的烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、氰基、氨基、烷氨基、杂环基、羟基、硝基、烷氨烷基或杂环基；
R4或R5各自独立地选自烷基、烷氨酰基、烷酰基、杂环基或环烷基。
2.根据权利要求1所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，表示单键；优选地，R1为烯基，优选地，R1为
3.根据权利要求1或2所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，R2为杂芳基，所述杂芳基被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；
优选地，R2为
优选地，R2为苯基；
优选地，所述苯基被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；
优选地，R2为
4.根据权利要求1-3中任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，R2为
优选地，环A为苯环或吡啶环；
优选地，环A为吡啶环；
优选地，环B为环戊烷、环己烷、四氢呋喃环、四氢吡咯环或哌啶环；
优选地，环B为环戊烷；
优选地，环B被一个或多个选自卤素、烷基、烷氧基、羟基或羟基取代的烷基取代；
优选地，环B被一个或多个选自烷基或羟基的取代基取代。
5.根据权利要求1-4任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，R3为H；
优选地，Q为N；
优选地，M为NR4；
优选地，R4为烷基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，Z为NH、NR5、CH2、CO或O，Y为CO、O或CH2，X为CH2或不存在；
优选地，R5为烷基；
优选地，Z为NH或NR5，Y为CO，X不存在；
优选地，Z为CH2或CO，Y为O，X为CH2。
7.根据权利要求1-6任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐，其中，式一所示的化合物选自如下化合物：
8.一种制备权利要求1-7任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.中间体1与R2卤化物反应生成中间体2；
b.中间体2经氧化反应后生成中间体3；
c.中间体3与中间体4发生加成反应生成式一所示的化合物；
反应方程式如下：
其中，n、Q、M、X、Y、Z、R1至R3如权利要求1所定义。
9.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效剂量的权利要求1-7中任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐和可药用的载体或赋形剂。
10.根据权利要求1-7任一项所述的式一所示的化合物或其消旋体、互变异构体、对映异构体、非对映异构体或其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤、脑瘤、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌、胃癌或白血病；优选地，所述肿瘤为小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌或卵巢癌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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