CN116940371A - 用于癌症免疫疗法的包含细菌的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了免疫原性组合物，其包含：(a)包含选自金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌的至少三种致病性细菌种类的细菌群体，其中所述细菌是包含完整细菌细胞壁的灭活细菌；和(b)一个或多个肿瘤抗原决定簇。还提供了包含所述免疫原性组合物的药物组合物及其在有需要的受试者中预防或治疗肿瘤的用途。

Description

用于癌症免疫疗法的包含细菌的组合物

技术领域

本发明涉及癌症免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及用于癌症治疗的包含细菌种类的组合的免疫原性组合物。

背景技术

恶性肿瘤是现代医学面临的主要挑战之一。人们普遍认为，常规疗法例如手术、化疗和放疗在许多常见类型和阶段的癌症中疗效有限。

免疫疗法是一个不断发展的研究领域，也是治疗某些类型癌症的额外选项。尽管癌细胞呈递抗原并且存在可能对肿瘤细胞产生反应的免疫细胞，但已发现在许多情况下，免疫系统针对肿瘤未被很好激活或肯定受到抑制。这种现象的关键是肿瘤能够发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。免疫疗法的基本原理是，免疫系统可能被刺激以识别肿瘤细胞，并靶向它们进行破坏。

在此种意义上，一种传统的方法是使用灭活细菌作为治疗性疫苗来治疗恶性肿瘤。例如，Coley的疫苗(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的组合)长期以来被认为有助于治疗肉瘤和淋巴瘤，而BCG(牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))疫苗治疗据报道对治疗几种类型的癌症有效。

最近，已经探索了其他类型的免疫疗法。例如，使用单克隆抗体(mAb)阻断免疫检查点分子例如程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，已经取得了一些成功，突出了免疫疗法在肿瘤学领域的潜力。此外，直接使用免疫细胞效应物例如活化的自然杀伤细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和负载肿瘤抗原的树突状细胞的策略，已被用于增强抗肿瘤免疫。然而，尽管期望很高且有时获得有希望的结果，但事实是临床结果往往不一致，并且肿瘤可以找到脱逸的途径，甚至可以长期转移。

从上文可以清楚地看出，需要替代的免疫治疗方法来增强宿主抗肿瘤免疫并靶向肿瘤细胞进行破坏。

发明内容

本发明人发现，当与源自于肿瘤细胞的抗原接触时，无活性致病性细菌的组合能够产生特异性抗肿瘤免疫应答。本申请表明，所述免疫应答有效地减缓所述抗原来源的特定肿瘤的生长速率。本申请还表明，含有所述细菌群和源自于肿瘤细胞的抗原的本发明的免疫原性组合物甚至可以实现肿瘤的消失，引起针对抗肿瘤的新挑战/复发的完全缓解和记忆应答。

因此，本发明的第一方面提供了一种免疫原性组合物，其包含：(a)包含选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、黄奈瑟氏菌(Neisseria flava)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的至少三种致病性细菌种类的细菌群体，其中所述细菌是灭活细菌，和(b)肿瘤抗原决定簇。

不希望受到理论束缚，本发明人设定肿瘤抗原通过引导由所述细菌群体产生的非特异性免疫应答而起作用。据推测，由位于细菌细胞中的模式识别受体触发的介导先天免疫的白细胞的活化，将增强对来自于肿瘤的抗原的摄取，将最初产生的先天免疫应答转向针对该肿瘤的特异性适应性免疫应答。在这个意义上，本发明人还发现，当群体中的细菌保持其结构完整性时，即当细菌是完整细菌时，所述免疫应答增强。针对肿瘤的免疫应答也被本发明的免疫原性组合物中包含的细菌种类的特定群体增强。

此外，本发明人还已发现，本发明的免疫原性组合物还产生针对肿瘤的记忆免疫应答，有效地阻止复发和/或转移(参见下文的实施例)。

第二方面提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将一种或多种肿瘤抗原决定簇与包含选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的至少三种致病性细菌种类的细菌群体接触，其中所述细菌是灭活细菌。

本发明的免疫原性组合物可以通过将所述细菌群体与从肿瘤获得/衍生的抗原决定簇接触而在原位制备。在这种情况下，方便的是所述细菌群体容易获得，例如作为悬液或冻干制剂获得。因此，本发明的第三方面提供了一种细菌群体，其包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌是灭活细菌并包含完整细胞壁。

本发明的免疫原性组合物也可以被提供成随时可给药到有需要的受试者的药物组合物。因此，本发明的第四方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的所述第一方面中所定义的免疫原性组合物或根据本发明的第三方面的细菌群体以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

本发明的第五方面提供了一种套装试剂盒，其包含：(a)所述第三方面中所定义的细菌群体，和任选的(b)其在制备所述第一方面的免疫原性组合物中使用的说明书。

第六方面提供了本发明的第三方面的细菌群体或本发明的第五方面的套装试剂盒的用途，其用于制备本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物。

第七方面提供了一种本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物用作药物的用途。这可以被重新表述为本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物的用途，其用于制备药物。本发明还公开了一种预防和/或治疗有需要的受试者的方法,所述方法包括给药本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物。

本发明的第八方面提供了一种本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤的方法中的用途。这可以被重新表述为本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物的用途，其用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。本发明还公开了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物。

在第九方面中，本发明提供了一种本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物在与手术、辐射或抗肿瘤剂的联合疗法中的用途，其用于预防和/或治疗肿瘤。这一方面也可以被表述为本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物的用途，其用于制备在与手术、辐射或抗肿瘤剂的联合疗法中用于预防和/或治疗肿瘤的药物。这一方面也可以被表述为一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括与手术、辐射或抗肿瘤剂联合，向有需要的受试者给药本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或本发明的第四方面中所定义的包含所述免疫原性组合物的药物组合物。

此外，本发明人已令人吃惊地发现，由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成的细菌群体在治疗结肠肿瘤中有效，其中所述细菌是灭活细菌。因此，本发明的第十方面提供了一种由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成的细菌群体用于预防和/或治疗胃肠道、神经系统、造血系统、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、大脑、眼、睾丸、肌肉、骨骼或乳腺的肿瘤的用途，其中所述细菌是灭活细菌。这一方面也可以被表述为一种由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成的细菌群体(其中所述细菌是灭活细菌)的用途，其用于制备药物，所述药物用于预防和/或治疗胃肠道、神经系统、造血系统、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、大脑、眼、睾丸、肌肉、骨骼或乳腺的肿瘤。这一方面也可以被表述为一种预防和/或治疗胃肠道、神经系统、造血系统、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、大脑、眼、睾丸、肌肉、骨骼或乳腺的肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)组成的细菌群体，其中所述细菌是灭活细菌。

本发明的第十一方面涉及一种所述第三方面中所定义的细菌群体或所述第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤中的用途，其中所述预防和/或治疗包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇。这可以被重新表述为一种所述第三方面中所定义的细菌群体或所述第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物的用途，其用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，其中所述药物在治疗间隔内与一种或多种肿瘤抗原决定簇同时、顺序或单独给药。本发明还公开了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药与一种或多种肿瘤抗原决定簇结合的治疗有效量的所述第三方面中所定义的细菌群体或所述第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物，其中所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇在治疗间隔内同时、顺序或单独给药。

附图说明

图1.A：皮下植入到12周龄Balb/c小鼠中的CT-26肿瘤的体积的测量。示出了所测试的4个实验组(n＝5只小鼠/组)：第1组-对照，第2组-细菌群体，第3组-免疫原性组合物，第4组-免疫原性组合物和葡萄糖。B：在第3和4实验组(n＝5只小鼠/组)中观察到的抗肿瘤活性的详情。

X-轴示出了变量“时间”，指示了从治疗开始起流逝的天数。Y轴示出了变量“肿瘤尺寸”，指示了肿瘤从治疗开始起获得的体积(cm³)。

具体实施方式

除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语均应以它们在本领域中已知的普通含义理解。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并旨在统一地应用于整个本说明书和权利要求书中，除非另有明确阐述的定义提供了更广泛的定义。

本文所使用的“癌症”是指不具有任何生理功能的任何不想要的细胞生长。一般来说，癌细胞已脱离其正常的细胞分裂控制，即在细胞环境中生长不受普通生物化学和物理影响调控的细胞。因此，“癌症”是以异常的不受控制的细胞生长为特征的疾病的总称。在大多数情况下，癌细胞增殖以形成良性或恶性的无性系细胞。产生的肿块或细胞团块或“肿瘤”通常能够入侵并破坏周围的正常组织。“恶性肿瘤”意指任何细胞类型或组织的异常生长，其在具有所述异常生长的生物体中具有有害影响。术语“恶性”或“癌症”包括技术上良性但具有变成恶性的风险的细胞生长。肿瘤细胞可能在一个被称为“转移”的过程中通过淋巴系统或血流从它们的原始部位扩散到身体的其他部分，引起“继发性肿瘤”，导致“转移性癌症”疾病。

“免疫原性组合物”是当在给药到受试者时直接或间接地在所述受试者中引发或能够引发免疫应答的组合物。

“训练免疫”是一个新兴的概念，定义了先天免疫系统产生免疫记忆并提供抵御病原体的长期保护的能力。它暗示了先天免疫过程通过涉及参与先天免疫系统的细胞的表观遗传学变化的机理在实际先天免疫记忆中的适应(Saeed等，Science 2014)。据称，训练免疫通过(i)提高先天免疫细胞(例如单核细胞/巨噬细胞)的非特异性效应应答和(ii)利用树突状细胞的激活状态增强对特异性和非相关(旁观)抗原的适应性T细胞应答来提供保护。在本发明的情形中，本发明的包含来自于所选细菌种类的病原体相关分子模式和特定肿瘤的抗原决定簇两者的组合物引发这种训练免疫应答，以靶向特定类型的肿瘤。

“病原体相关分子模式”是微生物表面的小分子基序，其被宿主的模式识别受体识别，从而激活宿主的先天免疫应答。

在本发明的意义上，“包含完整细菌细胞壁的细菌”被理解为是“完整的”细菌，这意味着它们保持其细胞壁的完整性，其中含有病原体相关分子模式。在整个本公开中，表述“包含完整细菌细胞壁的细菌”和“完整的”细菌可互换使用。相反，“裂解细菌”是那些不保持细胞壁完整性的细菌，即被破坏的细菌。

“抗原”是通常存在于细胞表面的分子或分子结构，其能够与免疫系统的抗原识别分子特异性相互作用，引发免疫应答。术语“抗原决定簇”也被称为“表位”，是被抗原识别分子识别的抗原的部分。

“佐剂”是用于以非特异性方式提高免疫应答的药剂。

术语“疫苗”是指配以足够赋形剂和/或载体的免疫原性组合物，其在给药到受试者时，直接或间接地引发或能够引发针对其所设计的病原体的保护性免疫应答。

本文所使用的术语“受试者”或“宿主”意指本发明的免疫原性组合物将要给药到的有需要的目标个体，尤其是容易用本发明的组合物治疗的人类、哺乳动物、牲畜或任何其他动物种类。在本发明的大多数实施方案中，受试者是人。

本文所使用的表述“治疗有效量”是指本发明的免疫原性组合物在给药时足以阻止它所针对的疾病的一种或多种症状的发展或在某种程度上缓解所述症状的量。根据本发明给药的药剂的具体剂量当然将由围绕病例的特定情况来确定，包括给药的药剂量、给药途径、待治疗的特定病症以及类似的考虑因素。

表述“药物组合物”涵盖了旨在用于人类以及用于非人类动物(即兽医组合物)的组合物两者。

表述“药学上可接受的载体或赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载体。每种组分在与药物组合物中的其他成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它还必须适合于与人类和非人类动物的组织或器官接触使用，而没有过度毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

当在本公开中指示百分率时，它们通常是指每单位重量的重量百分率(％w/w)，除非所述组合物是液体，在这种情况下，百分率是指每单位体积的重量百分率。组分的％w/w或％w/v是指单一组分相对于组合物的总重量或体积的量。

正如上文提到的，本发明人已发现本发明的第一方面中所公开的免疫原性组合物对肿瘤的预防和治疗有效。据推测，当给药到癌症患者时，选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的无活性细菌的明智组合产生相关的先天免疫应答，其在肿瘤抗原决定簇存在下被方便地定位到肿瘤细胞。这种训练免疫抵消了允许肿瘤细胞脱逸免疫系统的免疫调节机制，以便靶向肿瘤细胞进行破坏。

细菌群体

本发明人已发现了包括在所述免疫原性组合物中的致病性细菌的最佳组合。在本发明的意义上，细菌种类的选择对充分刺激免疫系统来说是非常重要的。已知病原体在其表面上含有被宿主中的模式识别受体识别的病原体相关分子模式。然而，获得信号的最佳组合并不是一项容易的任务。

在本发明的第一方面的某些实施方案中，所述细菌群体包含选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的至少四种或至少五种细菌种类。在其他实施方案中，所述细菌群体包含选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的至少三种或至少四种种类。

在一个特定实施方案中，所述细菌群体包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)全部五者。在另一个特定实施方案中，所述细菌群体由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成。

所述细菌群体的配比也是相关的。尽管在某种程度上可变，但所述细菌群体中每种种类的比例可能影响免疫应答，并且本发明人已发现了获得所需效果的最佳配比。在本发明的第一方面的某些实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、15至70％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、1至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和1至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

在本发明的第一方面的某些实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、1至20％的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、15至50％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、10至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和5至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

在其他实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：10至20％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、5至15％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、20至40％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、15至25％的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、5至15％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和10至20％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。在特定实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和15％的卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)。

此外，本发明人已发现，在本发明中，使用保持细胞的结构完整性的完整细菌细胞与使用裂解细菌细胞相比实现更好的结果。因此，在特定实施方案中，所述灭活细菌包含完整细菌细胞壁。在另一个实施方案中，所述灭活细菌维持细菌细胞壁的结构完整性。灭活致病性细菌同时保留细菌细胞的结构完整性的方法在本领域中是已知的。这些灭活方法的非限制性实例是酚处理、辐照和福尔马林或甲醛处理(Fan等，J Food Prot 2017；Levinson等，JAMA 1944；Hankaniemi等，Antiviral Research2019)。在特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物中存在的细菌细胞已通过苯酚处理灭活。这可以例如通过用0.5％(w/v)苯酚在室温下处理细菌12h来实现。

本发明的某些方面涉及所述细菌群体本身，其是必不可少的并被特别设计用于制备本发明的第一方面的免疫原性组合物。在特定实施方案中，所述细菌群体中的细菌是完整细菌。在特定实施方案中，所述细菌群体中的细菌已通过酚处理灭活。在特定实施方案中，所述组合中的细菌维持细胞壁的结构和完整性。

此外，在特定实施方案中，所述细菌群体包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的完整无活性细胞。在特定实施方案中，所述细菌群体由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的完整无活性细胞组成。在特定实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、15至50％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、10至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和5至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100，并且所述细菌细胞是完整且无活性的。在其他特定实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：10至20％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、5至15％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、20至40％的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、15至25％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、5至15％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和10至20％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌群体中种类的百分率之和为100，并且所述细菌细胞是完整且无活性的。在特定实施方案中，所述细菌群体具有下述组成：15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和15％的卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)，其中所述细菌细胞是完整且无活性的。

所述细菌群体可以被提供成例如悬液或脱水制剂。脱水可以通过冻干过程来进行。在某些实施方案中，所述细菌群体是冻干制剂。在其他实施方案中，所述细菌群体被提供成悬液。

此外，可以向所述细菌群体添加添加剂或其他额外化合物，以保护所述细菌细胞免于损伤。因此，本发明还涉及一种细菌组合物，其包含如上所述的细菌群体。适合于所述细菌组合物的添加剂是防腐剂、佐剂、加工助剂、冷冻保护剂、抗氧化剂等。同样，所述细菌组合物可以被提供成脱水(例如冷冻干燥)组合物或悬液。在一个实施方案中，所述细菌组合物被冻干并含有冷冻保护剂例如甘油、蔗糖或海藻糖。

所述细菌群体可以通过将适合比例的所需种类混合来制备。所述细菌种类可以公开获得。例如，所述细菌种类可以从专业化公司或保藏机构获得。所需的细菌群体也可以由专业化商业来源交付(以所需的比例)。诸如Diater的公司是适合的商业来源。细菌群体的其他可能的商业来源是Roxall、Inmunotek和Allergy Therapeutics。

本发明还提供了一种套装试剂盒，其包含如上所述的细菌群体或细菌组合物。在特定实施方案中，所述试剂盒还含有其在第一方面的免疫原性组合物的制备中使用的说明书。上文为细菌群体或细菌组合物提到的所有实施方案也适用于所述套装试剂盒。

本发明还提供了如上所述的细菌群体或细菌组合物或套装试剂盒的用途，其用于制备本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物。

抗原决定簇

根据本发明的第一方面的免疫原性组合物含有来自于肿瘤的抗原决定簇。在大多数实施方案中，所述肿瘤是恶性肿瘤。所述抗原决定簇可以被包含在纯的分离的抗原中或肿瘤细胞中。在某些实施方案中，所述抗原决定簇采取肿瘤细胞的形式。这具有的优点是所述免疫原性组合物可以含有不仅一个、而且几个某种类型的肿瘤特有的抗原决定簇，从而提高靶向该特定类型的肿瘤的免疫激活的机会。

所述肿瘤细胞可以通过进行肿瘤活检来提供。所述肿瘤细胞可以源自于仅仅一个受试者(一个肿瘤)或源自于同一类型肿瘤的活检细胞的合并物。所述肿瘤细胞也可以从肿瘤细胞系获得。

在某些实施方案中，所述免疫原性决定簇采取完整肿瘤细胞的形式。这被理解为含有完整细胞膜的肿瘤细胞，特别是保持细胞膜的结构完整性的细胞。这可能具有增强与抗原呈递细胞的相互作用的优点。在这种情况下，所述细胞必须通过不破坏细胞的结构完整性的方法灭活(参见上文)。在其他实施方案中，所述免疫原性决定簇采取肿瘤细胞裂解物的形式。这具有确保肿瘤细胞不增殖以及易于使用的优点。用于细胞裂解的非限制性方法是温度处理(即冻融和/或热处理)、高压处理、超声处理、机械处理，所有这些方法在本领域中都是公知的。例如，肿瘤裂解物可以通过对肿瘤细胞进行由冷冻(-80℃)和融化(37℃)的3个循环组成的程序来获得。其他非限制性方法是基于将细胞悬浮在低渗溶液中(渗透裂解)和/或通过使用可以与细胞壁的某些组分相互作用并允许内部组分通过细胞壁泄漏的化学品(例如抗生素、螯合剂、去污剂和/或溶剂)。

所述抗原决定簇也可以采取纯的分离的抗原或纯的分离的抗原的组合的形式。这具有更高的通用性和可量测性的优点。相关的肿瘤相关抗原已被公开在例如Novellino等，Cancer Immunol Immunother 2005中。训练免疫应答可以针对所选的一种或多种抗原占主导地位的几种类型的肿瘤。所述免疫原性组合物也可以包含来自于几种肿瘤的所选抗原的混合物，从而允许使用同一免疫原性组合物治疗不同肿瘤。这需要鉴定主导抗原。例如，在一个实施方案中，所述免疫原性组合物可以含有选自AFP、CEA、HER-2、p53、WT1的抗原及其组合。

佐剂

本发明的免疫原性组合物可以含有其他化合物。在特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物还可以含有选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合。正如在下面的实施例中所示，本发明人发现，补充本发明的免疫原性组合物增强免疫原性应答，从而提高治疗的有效性(更大程度地减小肿瘤尺寸/根除肿瘤并实质阻止转移)。据推测，这些化合物是允许单核细胞和巨噬细胞被激活的营养物，并具有足够的能量资源来启动由所述免疫原性组合物诱导的先天免疫应答。这些化合物可以被认为是佐剂。

上述化合物的非限制性实例是葡萄糖、果糖、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸及其组合。在特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含选自葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合。在另一个特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含葡萄糖。

本申请还公开了一种作为免疫原性佐剂的化合物，其选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯及其组合。还公开了选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合在制备疫苗或免疫原性组合物中的用途。还公开了选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合的用途，其用于刺激抗原呈递细胞的活性。还公开了选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合的用途，其用于在受试者中增强训练免疫应答。特别地，所述化合物选自葡萄糖、果糖、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸及其组合，例如葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯及其组合。特别地，所述化合物是葡萄糖。

本发明的免疫原性组合物或药物组合物中如上所定义的化合物例如葡萄糖的量可以是0.5至10％。在某些实施方案中，所述量是1至10％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％。在特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物或药物组合物中所述化合物的量是5％。

本发明的免疫原性组合物也可以含有传统佐剂。在本发明的免疫原性组合物中使用的非限制性佐剂是无机化合物例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝和碱式磷酸钙、矿物油例如石蜡油、类毒素、角鲨烯、去污剂例如Quil A、细胞因子例如IL-1、IL-2、IL-12、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。

免疫原性组合物的制备

正如上文提到的，本发明的免疫原性组合物可以通过将所述细菌群体与来自于肿瘤的抗原决定簇接触进行原位制备。在例如其中免疫原性组合物含有从待治疗的受试者获得的肿瘤细胞或细胞裂解物的自体治疗时，情况可能如此。在这种情况下，方便的是所述细菌群体可以容易地作为例如悬液或冻干制剂获得。

所述抗原决定簇可以如上所公开。例如，在某些实施方案中，所述制备免疫原性组合物的方法涵盖提供从患者的肿瘤或几位患者的同一类型的肿瘤(肿瘤细胞的合并物)或肿瘤细胞系获得的肿瘤细胞；和灭活所述肿瘤细胞。因此，在一个实施方案中，制备本发明的免疫原性组合物的方法包括下述步骤：(i)灭活肿瘤细胞，和(ii)将步骤(i)的灭活肿瘤细胞与如上所定义的细菌群体接触。在某些实施方案中，所述细胞通过维持细胞膜的结构完整性的方法例如辐照或酚处理来灭活。在某些实施方案中，所述制备免疫原性组合物的方法考虑了提供肿瘤细胞裂解物。适合于裂解细胞的方法已在上文公开。例如，可以通过对从肿瘤组织或细胞系获得的样品进行由冷冻(-80℃)和融化(37℃)的3个循环组成的程序，来获得肿瘤裂解物。在特定实施方案中，所述制备免疫原性组合物的方法包括添加其他化合物，例如选自葡萄糖、果糖、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的化合物及其组合，例如葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯及其组合，特别是葡萄糖。

在又一个实施方案中，所述免疫原性组合物可以通过将纯的分离的肿瘤抗原与如上所定义的细菌群体接触，并任选地添加选自葡萄糖、果糖、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的化合物及其组合，例如葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯及其组合，特别是葡萄糖，来制备。

所述接触步骤可以在室温下进行，并保持在冰上直至使用。所述接触可以通过轻柔混合，例如通过移液来进行。在一个特定实例中，所述免疫原性组合物可以通过在室温下移液混合抗原决定簇(例如从裂解大约0.5x10e6个肿瘤细胞获得的肿瘤裂解物)与50uL左右的细菌群体(10e8/mL)来获得。

药物组合物

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上所定义的免疫原性组合物以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。本申请还公开了药物组合物，其包含治疗有效量的如上所定义的细菌群体以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。本发明的药物组合物可以被认为是疫苗。因此，这一方面也可以被表述为一种疫苗，其包含治疗有效量的如上所定义的免疫原性组合物以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。还公开了疫苗，其包含治疗有效量的如上所定义的细菌群体以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

本发明的药物组合物中细菌群体、免疫原性决定簇、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可根据所治疗的受试者的身份、体重和/或状况并进一步根据所述组合物将要给药的途径变化。

在药物组合物的制备中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、黏合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。根据配方设计师的判断，赋形剂例如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂可以存在于所述组合物中。

含有本发明的免疫组合物的药物组合物可以以任何剂型例如固体或液体存在，并且可以通过任何适合的途径例如口服、肠胃外、直肠、局部、鼻内或舌下途径给药，为此它们将包括配制所需剂型例如局部制剂(软膏、霜剂、脂凝胶、水凝胶等)、滴眼剂、气溶胶喷剂、注射溶液、渗透泵等所必需的药学上可接受的赋形剂。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉状糖及其组合。

示例性成粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、乙醇酸淀粉钠、黏土、藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐或酯、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮)(交聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(乙醇酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预明胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维酸钙、硅酸铝镁(Veegum)、月桂基硫酸钠、季铵化合物及其组合。

示例性黏合赋形剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)、明胶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)、天然和合成树胶(例如阿拉伯树胶、藻酸钠、角叉菜提取物、潘沃胶(panwar gum)、茄替胶、车前籽胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、纤维素乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝(Veegum)和落叶松阿拉伯半乳聚糖、藻酸盐或酯、聚环氧乙烷、聚乙二醇、无机钙盐、硅酸、聚甲基丙烯酸酯、蜡、水、醇及其组合。

示例性防腐剂可以包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇类防腐剂、酸性防腐剂和其他防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、油酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、单硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四酸二钾、乙二胺四甲酸、延胡索酸、苹果酸、磷酸、乙二胺四乙酸钠、酒石酸和乙二胺四乙酸三钠。

示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸二钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸二钾、磷酸一钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸二钠、磷酸一钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇及其组合。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物是肠胃外组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是真皮内组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是透皮组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是静脉内组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是舌下组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是皮下组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是口服组合物。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是鼻咽组合物。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含10e7至10e12个灭活细菌细胞/剂。在一个实施方案中，所述药物组合物包含10e8至10e11个灭活细菌细胞/剂，例如10e8、10e9或10e10个灭活细菌细胞/剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含佐剂。在特定实施方案中，本发明的药物组合物包含选自葡萄糖、果糖、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的化合物及其组合。在其他特定实施方案中，本发明的药物组合物包含选自葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合。在特定实施方案中，本发明的药物组合物包含葡萄糖。

治疗性用途

本发明的第八至第十一方面涉及本发明的组合物在预防和/或治疗肿瘤中的治疗性用途。在大多数实施方案中，所述待治疗的肿瘤是恶性肿瘤。因此，本申请本质上涉及癌症的预防和/或治疗。

正如上文提到的，假设介导由位于细菌细胞中的模式识别受体引发的先天免疫的白细胞的激活增强了来自于肿瘤的抗原的摄取，将最初产生的先天免疫应答转向针对该肿瘤的特异性适应性免疫应答。所述介导先天免疫的白细胞包括抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、郎格汉斯细胞、肥大细胞、中性白细胞、NK和NKT细胞。

还公开了本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物在引发针对肿瘤的训练先天免疫应答中的用途。这可以被重新表述为本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在有需要的受试者中引发针对肿瘤的训练先天免疫应答。还公开了一种引发针对肿瘤的训练先天免疫应答的方法，所述方法包括在有需要的受试者中给药本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物。

本申请还公开了本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物在提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答中的用途。这可以被重新表述为本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答。还公开了一种提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或本发明的第四方面中所定义的药物组合物。在某些实施方案中，所述介导免疫的白细胞选自抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、郎格汉斯细胞、肥大细胞、中性白细胞、NK和NKT细胞，特别地它们选自单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

本申请还公开了第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物在引发针对肿瘤的训练先天免疫应答中的用途，其中引发训练先天免疫应答包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇。这可以被重新表述为第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于引发针对肿瘤的训练先天免疫应答，其中所述药物在治疗间隔内与一种或多种肿瘤抗原决定簇同时、顺序或单独给药。本发明还公开了一种引发针对肿瘤的训练先天免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物以及一种或多种肿瘤抗原决定簇，其中所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇在治疗间隔内同时、顺序或单独给药。

本申请还公开了第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物在提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答中的用途，其中提高非特异性效应物应答包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇。这可以被重新表述为第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答，其中所述药物在治疗间隔内与一种或多种肿瘤抗原决定簇同时、顺序或单独给药。本发明还公开了一种提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的包含所述细菌群体的药物组合物以及一种或多种肿瘤抗原决定簇，其中所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇在治疗间隔内同时、顺序或单独给药。

可以使用本发明的免疫原性组合物预防或治疗的肿瘤没有特别限制，只要来自于所述肿瘤的肿瘤细胞或抗原可以获得即可。在本发明的意义上可以预防或治疗的非限制性肿瘤的类型是癌、肉瘤和血液瘤。癌是主要的癌症，是上皮细胞或覆盖器官、腺体或其他身体结构(例如皮肤、子宫、肺、乳腺、前列腺、胃、肠)的外表面或内表面的细胞的癌症，并倾向于转移。癌可以是腺癌例如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱的腺癌和鳞状细胞癌。肉瘤源自于结缔组织或支持性组织(例如骨骼、软骨、肌腱、韧带、脂肪和肌肉)。肉瘤可能是骨肉瘤或骨原性肉瘤(骨骼)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜质衬里)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(大脑中存在的神经源性结缔组织)、黏液肉瘤(原始胚胎结缔组织)或间充质或混合性中胚层肿瘤(混合结缔组织类型)。血液肿瘤源自于骨髓和淋巴组织。血液肿瘤可能是起源于骨髓的浆细胞的骨髓瘤；白血病，其可能是“液体瘤”，并且是骨髓的肿瘤，并且可能是髓源性或粒细胞性白血病(髓系和粒细胞性白细胞)、淋巴性、淋巴细胞性或成淋巴细胞白血病(淋巴系和淋巴细胞性白细胞)或真性红细胞增多症或红细胞增多症(各种血细胞产物，但以红细胞为主)；或淋巴瘤，其可能是实体肿瘤，并且在淋巴系统的腺体或淋巴结中发展，并且可能是霍奇金或非霍奇金淋巴瘤。此外，也存在混合型肿瘤例如腺鳞状细胞癌、混合中胚层肿瘤、癌肉瘤或畸胎癌。在本发明的意义上考虑到了所有这些类型的肿瘤以及专业技术人员显而易见的其他肿瘤。

可以通过本发明的免疫组合物治疗的肿瘤也可以根据它们起源的器官即“原发部位”来命名，例如乳腺、脑、肺、肝、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、宫颈、子宫等的肿瘤或癌症。即使所述肿瘤转移到不同于原发部位的另一个身体部位，这种命名通常也保留。在这个意义上，在本发明的第八至第十方面中设想的肿瘤可以是但不限于胃肠道、呼吸系统、神经系统、造血系统、上皮、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、脑、眼、睾丸、肌肉、骨骼或乳腺的肿瘤。在特定实施方案中，在本发明的第八至第十方面中设想的肿瘤是胃肠道、呼吸系统、造血系统、上皮、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、肌肉、骨骼或乳腺的肿瘤。在特定实施方案中，所述肿瘤是结肠、肺、肝或乳腺的肿瘤。

本发明的免疫原性组合物和包含它的药物组合物的上文描述的所有实施方案，包括用于其所有组分的实施方案，也适用于本部分中描述的治疗性用途。例如，在特定实施方案中，所述细菌是完整灭活细菌，并且所述组合包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)或由它们组成。

在某些实施方案中，所述预防或治疗是自体的。这意味着所述免疫原性组合物中包含的抗原决定簇源自于所治疗的同一受试者。在这种情况下，所述免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物用于预防或治疗肿瘤的方法中，其中所述预防和/或治疗方法包括下述步骤：(i)灭活从受试者获得的肿瘤细胞，(ii)将所述无活性肿瘤细胞与所述细菌群体接触，以产生免疫原性组合物，(iii)将所述免疫原性组合物给药到获得所述肿瘤细胞的同一受试者。应该理解，所述方法的步骤(i)和(ii)是在体外。

在其他实施方案中，所述治疗不是自体的而是同种异体的。这意味着所述抗原决定簇源自于不是所治疗的受试者的一个或多个受试者。在这种情况下，本发明的第一方面中所定义的免疫原性组合物或第三方面中所定义的细菌群体或第四方面中所定义的药物组合物用于预防或治疗肿瘤的方法中，其中所述预防和/或治疗方法包括下述步骤：(i)灭活从受试者或一组受试者获得的相同类型肿瘤的肿瘤细胞，(ii)将所述无活性肿瘤细胞与所述细菌群体接触，以产生免疫原性组合物，(iii)将所述免疫原性组合物给药到患有与(i)中相同类型肿瘤的患者。应该理解，所述方法的步骤(i)和(ii)是在体外。

在一个实施方案中，获得所述肿瘤细胞的受试者与接受者HLA匹配(同种异体治疗)。在其他实施方案中，所述肿瘤细胞来自于不一定与接受者HLA匹配的一个或多个不同受试者(异源治疗)。

正如上文提到的，所述肿瘤细胞可以通过活检从所述一个或多个受试者提取。当肿瘤细胞不是自体的时，可以从活检肿瘤细胞的合并物或肿瘤细胞系获得所述细胞。然后将所述肿瘤细胞灭活以产生完整的灭活细胞或细胞裂解物，然后将其与所述细菌群体接触以产生免疫原性组合物，然后将所述免疫原性组合物给药到所述患者。

给药途径可以是肠胃外。在一个实施方案中，给药途径是真皮内。在另一个实施方案中，给药途径是皮下。在另一个实施方案中，给药途径是透皮。在另一个实施方案中，给药途径是静脉内。在另一个实施方案中，给药途径是舌下。在另一个实施方案中，给药途径是口服。

正如在下文的实施例中所示，本发明的免疫原性组合物能够阻止恶性肿瘤的生长、减小恶性肿瘤的尺寸和甚至消除恶性肿瘤。因此，本发明的第八至第十方面的一个实施方案是用于阻止恶性肿瘤的生长。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于预防癌症。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于治疗恶性肿瘤。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于治疗癌症。

重要的是，下文的实施例还表明所述免疫原性组合物有效阻止转移。因此，本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于防止继发肿瘤的生长。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于预防转移。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于治疗继发性肿瘤。本发明的第八至第十方面的另一个实施方案是用于预防转移癌。

当在联合疗法中使用时，所述联合可以是与抗肿瘤药剂、放疗或手术联合。更具体来说，本发明的免疫原性组合物或细菌群体在治疗有效间隔内与抗肿瘤药剂、放疗或手术以任何顺序单独施用。在特定实施方案中，所述联合疗法包括手术。在另一个特定实施方案中，所述联合疗法包括辐射。在特定实施方案中，所述联合疗法包括抗肿瘤药剂。所述抗肿瘤药剂可以是细胞毒性剂例如烷化剂、抗代谢药包括叶酸拮抗剂、嘌呤和嘧啶类似物、抗生素和其他天然产物包括蒽环类和长春花生物碱，以及提高特异性的抗体。所述抗肿瘤药剂也可以是激素类药剂或信号转导抑制剂。在特定实施方案中，所述联合疗法包括化疗。所述联合疗法也可以包括不同的免疫疗法。例如，在特定实施方案中，所述联合可以是与阻断免疫检查点分子的单克隆抗体、活化的自然杀伤细胞、(CAR)T-细胞、浸润肿瘤的淋巴细胞或负载有肿瘤抗原的树突状细胞的联合。

出于完整性原因，本发明也阐述在以下编号的实施方案中：

1.一种免疫原性组合物，其包含：

(a)包含选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、黄奈瑟氏菌(Neisseria flava)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)的至少三种致病性细菌种类的细菌群体，其中所述细菌是灭活细菌，和

(b)一种或多种肿瘤抗原决定簇。

2.根据实施方案1所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含所述细菌种类中的至少四者。

3.根据实施方案2所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含所述细菌种类中的至少五者。

4.根据实施方案1-3中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。

5.根据实施方案4所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成。

6.根据实施方案5所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

15至70％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

1至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

1至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

7.根据前述实施方案中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

15至50％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

10至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

5至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

8.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含：

10至20％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

5至15％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

20至40％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

15至25％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

5至15％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

10至20％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

9.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含：

15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

15％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。

10.根据前述实施方案中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述灭活细菌包含完整细菌细胞壁。

11.根据前述实施方案中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述灭活细菌维持细菌细胞的结构完整性。

12.根据实施方案1-9中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述灭活细菌是裂解的细菌。

13.根据前述实施方案中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原决定簇为灭活肿瘤细胞的形式。

14.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述灭活肿瘤细胞包含完整细胞膜。

15.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述灭活肿瘤细胞保持细胞膜的结构完整性。

16.根据实施方案13所述的免疫原性组合物，其中所述灭活肿瘤细胞是裂解的细胞。

17.根据实施方案1-12中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原决定簇为分离的抗原的形式。

18.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述分离的抗原选自AFP、CEA、HER-2、p53、WT1及其组合。

19.根据实施方案1-18中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原决定簇来自于恶性肿瘤。

20.根据实施方案1-19中的任一项所述的免疫原性组合物，其包含超过一种抗原决定簇，并且其中所述超过一种抗原决定簇来自于同一肿瘤。

21.根据实施方案1-19中的任一项所述的免疫原性组合物，其包含超过一种抗原决定簇，并且其中所述超过一种抗原决定簇来自于不同肿瘤。

22.根据实施方案1-21中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物额外地包含选自单糖、氨基酸、脂肪酸、三羧酸循环的底物或代谢产物、β-葡聚糖、酮体、乳酸盐或酯、甘油醛、甘油、谷氨酸盐或酯的化合物及其组合。

23.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物选自葡萄糖、果糖、乳酸盐或酯、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸及其组合。

24.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物选自葡萄糖、果糖、谷氨酰胺、精氨酸、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯及其组合。

25.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物是葡萄糖。

26.根据实施方案22-25中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物的量为0.5至10％。

27.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物的量为2至8％。

28.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物，其中所述额外的化合物的量为5％。

29.一种细菌群体，其包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，其中所述细菌是灭活细菌。

30.根据前述实施方案所述的细菌群体，其由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成。

31.根据前述实施方案所述的细菌群体，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

15至70％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

1至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

1至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

32.根据前述实施方案所述的细菌群体，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

15至50％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

10至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

5至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

33.根据前述实施方案所述的细菌群体，其中所述细菌群体包含：

10至20％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

5至15％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

20至40％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

15至25％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

5至15％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

10至20％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

34.根据前述实施方案所述的细菌群体，其中所述细菌群体包含：

15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

15％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。

35.根据实施方案29-34中的任一项所述的细菌群体，其中所述灭活细菌包含完整细菌细胞壁。

36.根据实施方案29-35中的任一项所述的细菌群体，其中所述灭活细菌维持细菌细胞的结构完整性。

37.一种制备免疫原性组合物的方法，其包括将一种或多种肿瘤抗原决定簇与实施方案29-36中的任一项所述的细菌群体接触。

38.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(i)灭活肿瘤细胞，和

(ii)将所述步骤(i)的灭活肿瘤细胞与所述细菌群体接触。

39.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞通过保持细胞膜的结构完整性的方法来灭活。

40.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞通过选自酚处理、辐照和福尔马林或甲醛处理的方法来灭活。

41.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方，其中所述肿瘤细胞通过酚处理来灭活。

42.根据实施方案38-41中的任一项所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞来自于同一类型的肿瘤。

43.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞从受试者或一组受试者获得。

44.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞从同一受试者获得。

45.根据实施方案42所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞来自于肿瘤细胞系。

46.根据实施方案38所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤细胞通过裂解来灭活。

47.根据实施方案37所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤抗原决定簇为分离的抗原的形式。

48.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述分离的抗原选自AFP、CEA、HER-2、p53、WT1及其组合。

49.根据实施方案37-48所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。

50.根据实施方案37-49中的任一项所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述方法包括添加实施方案22-25中的任一项中所定义的化合物的其他步骤(iii)。

51.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述额外的化合物以总免疫原性组合物的0.5至10％的量添加。

52.根据前述实施方案所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述额外的化合物以总免疫原性组合物的2至8％、例如总免疫原性组合物的5％的量添加。

53.一种药物组合物，其包含治疗有效量的实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物或实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

54.根据前述实施方案所述的药物组合物，其中所述组合物包含10e7至10e12个灭活细菌细胞/剂量。

55.根据前述实施方案所述的药物组合物，其中所述组合物包含10e9至10e11个灭活细菌细胞/剂量。

56.根据实施方案53-55中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是真皮内、透皮、皮下、舌下、静脉内、鼻咽或口服组合物。

57.根据前述实施方案所述的药物组合物，其中所述药物组合物是真皮内组合物。

58.根据实施方案56所述的药物组合物，其中所述药物组合物是舌下组合物。

59.根据实施方案53-58中的任一项所述的药物组合物，其还包含佐剂。

60.实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物或实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体或实施方案53-59中的任一项中所定义的药物组合物作为药物的用途。

61.实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物或实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体或实施方案53-59中的任一项中所定义的药物组合物在引发针对肿瘤的训练先天免疫应答的用途。

62.实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物或实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体或实施方案53-59中的任一项中所定义的药物组合物在提高介导先天免疫的白细胞的非特异性效应物应答中的用途。

63.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中抗原呈递细胞选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其组合。

64.实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物或实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体或实施方案53-59中的任一项中所定义的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤的方法中的用途。

65.根据实施方案61-64中的任一项所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。

66.根据实施方案61-65中的任一项所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤是继发性肿瘤。

67.根据实施方案61-66中的任一项所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤来自于呼吸系统、胃肠道、神经系统、造血系统、生殖系统(例如宫颈、卵巢、子宫、阴道和外阴)、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、脑、眼、睾丸、肌肉、骨骼或乳腺，特别地所述肿瘤来自于呼吸系统、胃肠道、造血系统、生殖系统、泌尿道、内分泌系统、皮肤、心脏、肌肉、骨骼或乳腺。

68.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。

69.根据实施方案67所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤来自于胃肠道。

70.根据实施方案67所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤来自于结肠。

71.根据实施方案60-70中的任一项所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述灭活细菌细胞包含完整细菌细胞壁。

72.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述细菌群体包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。

73.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述细菌群体由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)组成。

74.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

1至20％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

15至50％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

10至30％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

5至25％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

75.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述细菌群体包含：

10至20％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

5至15％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

20至40％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

15至25％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

5至15％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

10至20％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

76.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述细菌群体包含：

15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，

10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，

30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，

20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，

10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，和

15％的卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。

77.根据实施方案61-76中的任一项所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述预防和/或治疗方法包括下述步骤：

(i)灭活从受试者获得的肿瘤细胞，

(ii)将所述灭活的肿瘤细胞与所述细菌群体接触，以产生免疫原性组合物，

(iii)将所述免疫原性组合物给药到获得所述肿瘤细胞的同一受试者。

78.根据前述实施方案所述的免疫原性组合物、细菌群体或药物组合物的用途，其中所述预防和/或治疗方法包括向所述免疫原性组合物添加实施方案22-25中的任一项中所定义的化合物的另一个步骤。

79.一种套装试剂盒，其用于制备实施方案1-28中的任一项中所定义的免疫原性组合物，所述试剂盒包含：(a)实施方案29-36中的任一项中所定义的细菌群体。

80.根据前述实施方案所述的套装试剂盒，其还包含：(b)一种或多种免疫原性决定簇。

81.根据实施方案79-80中的任一项所述的套装试剂盒，其还包含：(c)实施方案22-25中的任一项中所定义的化合物。

在整个说明书和权利要求中，词语“包含”及其变化形式并不旨在排除其他技术特点、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”涵盖了“由……组成”的情况。对于本领域技术人员来说，本发明的附加目的、优点和特点将在审查说明书后变得显而易见，或者可以通过本发明的实践学会。下述实施例和附图是以说明的方式提供，它们不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖了本文描述的特定和优选实施方案的所有可能的组合。

实施例

实施例1.包含完整细菌细胞壁的细菌群体和肿瘤裂解物的组合诱导特异性抗肿 瘤免疫应答

本研究旨在评估用肿瘤裂解物引发的灭活致病性细菌的特定组合(“细菌群体”)诱导先天免疫应答的能力，以便随后产生针对实体肿瘤的特异性免疫应答。

在本实施例中使用的细菌群体具有下述组成：15％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，10％的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，30％的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，20％的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，10％的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和15％的卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)。所述组合由Laboratorios Diater S.A.提供。所述细菌群体通过酚处理来灭活。

CT26.CL25细胞从CRL-2639^TM获得。这些细胞是源自小鼠的细胞(小鼠(Mus musculus)，谱系Balb/c)，其具有贴壁生长的成纤维细胞形态。这些细胞源自于通过转化T-抗原SV40病毒的能力诱导结肠癌的Balb/c小鼠。CT-26细胞一旦在注射到Balb/c小鼠中，其就能够诱导具有与它们所源自的肿瘤相似的特征的实体肿瘤。因此，CT-26细胞通常被用作模型来测试免疫疗法方案以及研究宿主免疫应答的发生。

葡萄糖从Sigma-Aldrich获得(G8270)。

通过对0.5x10e6个CT26.CL25细胞(CRL-2639^TM)的药丸进行三轮冷冻(-80℃)和融化(37℃)，制备了CT26.CL25细胞裂解物。

通过在室温下移液混合50uL(10e8/mL)酚灭活的细菌与源自于0.5x10e6个CT26.CL25细胞的裂解物制备免疫原性组合物，并将其置于冰上直至使用。

将CT-26细胞皮下接种(0.5x10e6/小鼠)到12周龄雄性Balb/c小鼠中。16天后，注入的细胞产生皮下肿瘤，其显示出5x5mm的尺寸。此时，将小鼠分成下述4个实验组：

第1组.-对照：在肿瘤的对侧给药50uL盐水。

第2组.-细菌群体：在肿瘤的对侧给药50uL(10e8/mL)细菌群体。

第3组.-免疫原性组合物：在肿瘤的对侧给药50uL细菌群体(10e8/mL)以及肿瘤裂解物(从0.5x10e6个CT-26细胞获得)。

第4组.-免疫原性组合物合葡萄糖：在肿瘤的对侧给药50uL细菌群体(10e8/mL)以及肿瘤裂解物(从0.5x10e6个CT-26细胞获得)+5％葡萄糖。

随后，如图1A中所示，每周测定包括在不同实验组中的小鼠中诱导的皮下肿瘤的尺寸。

得到的结果表明，在肿瘤的对侧上给药所述细菌群体(第2组)不能诱导针对由皮下给药CT-26细胞诱导的肿瘤的免疫应答，因为其生长速率与对照组(接受盐水，第1组)相近。接受所述细菌群体与CT-26细胞肿瘤裂解物的组合的小鼠(第3组)能够阻止植入肿瘤的生长(详见图1A)，包括在该组中的5只小鼠中的2只显示出完全缓解。细菌群体与增补有5％葡萄糖的CT-26细胞肿瘤裂解物的组合的给药(第4组)被证明甚至更加有效(详见图1A)，因为它们与第3组相比显示出更小的肿瘤尺寸，并且包括在该组中的5只小鼠中的3只显示出完全缓解。

另一方面，为了评估具有产生免疫记忆应答的能力的特异性抗肿瘤应答的产生，在实验组3和4中，将CT-26肿瘤细胞系(每只小鼠0.5x10e6个细胞)重新注射到注射初始肿瘤的对侧上。在包括在这两个实验组中的小鼠中未观察到新生肿瘤(继发性肿瘤)的产生，表明这些小鼠已对肿瘤产生特异性记忆应答，因此受到保护以对抗这种类型的肿瘤的新挑战。

实施例2.包含完整细菌细胞壁的细菌群体和肿瘤裂解物的组合预防肿瘤的发育

此外，我们测试了CT-26细胞肿瘤裂解物以及实施例1中所定义的酚灭活的细菌群体产生针对该肿瘤的预防性免疫应答(疫苗接种)的能力。为此，将雄性balb/c小鼠分成下述实验组：

第1组.-细菌群体：皮下给药50uL(10e8 cfu/mL)细菌群体。

第2组.-肿瘤裂解物对照：皮下给药从0.5x10e6个CT-26细胞获得的肿瘤裂解物。

第3组.-免疫原性肿瘤接种：皮下给药50uL细菌群体(10e8 cfu/mL)与肿瘤裂解物(从0.5x10e6个CT-26细胞获得)。

在给药细菌群体(第1组)、肿瘤裂解物(第2组)或免疫原性组合物(第3组)后两周，将所有实验组用0.5x10e6个CT-26细胞皮下接种，以便诱导肿瘤。得到的结果显示，在接种肿瘤细胞两周后，包括在实验组1和2中的小鼠出现直径大于1cm的尺寸的皮下肿瘤，而第3组没有观察到任何肿瘤形成。这些结果表明，肿瘤裂解物与灭活细菌的组合能够保护由用于获得所述肿瘤裂解物的细胞产生的肿瘤的后续发育，这表明了肿瘤接种效果，并因此增强了在第一批实验中已经证实的记忆免疫应答的进行。

实施例3.包含完整细菌细胞壁的细菌群体与肿瘤裂解物的组合在狗中引发特异 性抗肿瘤免疫应答

在第三系列实验中，我们测试了肿瘤裂解物与实施例1酚灭活的细菌群体的组合用于在狗中治疗乳腺肿瘤的功效。为此，从两只不同的狗的手术切除的乳腺癌获得了独立的活检样品(直径为大约2,5cm)。为了产生肿瘤裂解物，对所述活检样品进行三轮冷冻(-80℃)和融化(37℃)。在最后一轮冷冻-融化后，获得1.5mL肿瘤裂解物，将其冷冻在3个独立的等分试样中，每个等分试样含有0.5mL肿瘤裂解物。

将三剂免疫原性组合物通过皮下注射给药到受体动物，每剂之间间隔2周。在给药之前，通过融化500ul等分试样并将它与500uL(10e8cfu/mL)酚灭活的细菌群体合并，来制备每一剂。每只动物接受用从它自己的乳腺癌活检的肿瘤细胞制备的免疫原性组合物(自体治疗)。在肿瘤裂解物与灭活细菌的组合的皮下注射期间或在每次给药后的随后几天，没有观察到不良反应。6个月后，这两只动物仍未发生乳腺癌。

总之，得到的结果表明：

1.包含完整细菌细胞壁的细菌群体能够产生特异性抗肿瘤免疫应答，只要与源自于肿瘤的抗原组合即可(参见第3和4组的结果，图1)。来自于肿瘤裂解物的肿瘤抗原将通过引导由细菌群体产生的非特异性免疫应答来发挥作用。

2.给药单独的细菌群体不能产生抗肿瘤应答(参见第2组的结果，图1)。

3.含有细菌群体和肿瘤裂解物的免疫组合物的葡萄糖(5％)的补充增强了由细菌群体+肿瘤裂解物产生的特异性抗肿瘤应答(参见第4组的结果，图1)。据推测，在将要启动抗肿瘤免疫应答的环境中添加葡萄糖将有助于它的发生，这要归功于能量对那些该过程涉及的细胞(主要是代谢非常活跃并在吞噬过程和用于呈递给免疫系统特定细胞的抗原加工期间需要大量能量的抗原呈递细胞)的贡献。

4.细菌疫苗与肿瘤裂解物的组合(在存在或不存在葡萄糖的情况下)能够产生针对肿瘤的记忆应答(参见第3和4组的结果，图2)。

5.细菌群体与肿瘤裂解物的组合引发针对肿瘤的预防性免疫应答。因此，所述组合作为肿瘤疫苗是有效的。

6.细菌群体与肿瘤裂解物的组合在狗中产生特异性抗肿瘤应答。

文献列表

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Claims (18)

1.一种免疫原性组合物，其包含：

(a)包含选自金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌的至少三种致病性细菌种类的细菌群体，其中所述细菌是包含完整细菌细胞壁的灭活细菌；和

(b)一种或多种肿瘤抗原决定簇。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体选自(a)包含金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌的群体，和(b)由金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌组成的群体。

3.根据权利要求1-2中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述细菌群体包含：

5至25％的金黄色葡萄球菌，

1至20％的酿脓链球菌，

15至70％的肺炎链球菌，

1至30％的流感嗜血杆菌，

1至20％的肺炎克雷伯氏菌，和

1至25％的卡他莫拉菌，

其中所述细菌群体中所述种类的百分率之和为100。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原决定簇为无活性肿瘤细胞的形式。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物额外地包含选自葡萄糖、果糖、乳酸盐或酯、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的化合物及其组合，特别地，所述组合物额外地包含葡萄糖。

6.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-5中的任一项中所定义的免疫原性组合物以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

7.权利要求1-5中的任一项中所定义的免疫原性组合物或权利要求6中所定义的药物组合物在肿瘤的预防和/或治疗中的用途。

8.一种细菌群体，其包含金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌，其中所述灭活细菌包含完整细菌细胞壁。

9.根据权利要求8所述的细菌群体，其中所述群体由金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌和卡他莫拉菌组成。

10.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求8-9中的任一项中所定义的细菌群体以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

11.权利要求8-9中的任一项中所定义的细菌群体或权利要求10中所定义的药物组合物在肿瘤的预防和/或治疗中的用途，其中所述预防和/或治疗包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药所述细菌群体和一种或多种肿瘤抗原决定簇。

12.根据权利要求11所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述预防和/或治疗包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药所述细菌群体和无活性肿瘤细胞。

13.根据权利要求11-12中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述预防和/或治疗还包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药选自葡萄糖、果糖、乳酸盐或酯、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的化合物及其组合，特别地，所述预防和/或治疗还包括在治疗间隔内同时、顺序或单独给药葡萄糖。

14.根据权利要求11-13中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述给药是同时的。

15.根据权利要求11-14中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述预防和/或治疗的方法包括下述步骤：

(i)灭活从受试者获得的肿瘤细胞，

(ii)将所述无活性肿瘤细胞与权利要求8-9中的任一项中所定义的细菌群体接触，以提供免疫原性组合物，

(iii)任选地向步骤(ii)的免疫原性组合物添加选自葡萄糖、果糖、乳酸盐或酯、甘油醛、乳酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、草酸盐或酯、苹果酸盐或酯、谷氨酸盐或酯、延胡索酸盐或酯、α-酮戊二酸盐或酯、琥珀酸盐或酯、柠檬酸盐或酯、甘油、谷氨酰胺、精氨酸、酮体、β-葡聚糖、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的化合物及其组合，特别是葡萄糖，和

(iv)将步骤(ii)或(iii)的免疫原性组合物给药到获得所述肿瘤细胞的同一受试者。

16.根据权利要求7所述的免疫原性组合物或药物组合物的用途或根据权利要求11-15中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述给药是系统性的。

17.根据权利要求7所述的免疫原性组合物或药物组合物的用途或根据权利要求11-15中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述给药是通过选自肠胃外、真皮内、皮下、透皮、静脉内、舌下和口服的途径。

18.根据权利要求7、16或17所述的免疫原性组合物或药物组合物的用途或根据权利要求11-17中的任一项所述的细菌群体或药物组合物的用途，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。