CN116925284A - 聚合物及其制备方法、基因测序芯片中的应用、测序芯片 - Google Patents

聚合物及其制备方法、基因测序芯片中的应用、测序芯片 Download PDF

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CN116925284A
CN116925284A CN202310940524.8A CN202310940524A CN116925284A CN 116925284 A CN116925284 A CN 116925284A CN 202310940524 A CN202310940524 A CN 202310940524A CN 116925284 A CN116925284 A CN 116925284A
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polymer
transition metal
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chip
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李汉东
成昌梅
肖育劲
张桂锋
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Zhuhai Dadao Sequencing Biotechnology Co ltd
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Zhuhai Dadao Sequencing Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请涉及一种聚合物及其制备方法、基因测序芯片中的应用、测序芯片。聚合物具有如下结构：R1为H或R2为或R3为或x选自1～10000的整数，y选自1～1000的整数，z选自1～1000的整数，且x、y以及z的比值为1:(0.015～0.05):(0.045～0.10)；n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8以及n9各自独立地选自1～10的整数。

Description

聚合物及其制备方法、基因测序芯片中的应用、测序芯片
技术领域
本申请涉及基因测序技术领域，特别是涉及一种聚合物及其制备方法、基因测序芯片中的应用、测序芯片。
背景技术
聚合物涂层的基材可应用于许多技术应用中，例如，可植入的医疗装载可以涂覆生物相容性高的聚合物，或可应用于基因测序领域。近年来，基因测序技术受到越来越广泛的关注，通过基因测序技术，能够从血液或者人体附属物中分析测定基因序列，预测患多种疾病的可能性，如癌症或白血病等，聚合物涂层在基因测试方法中发挥着重要作用。例如，在某些测序方法中，依赖于核酸链与表面聚合物涂层的连接；又例如，在某些测序方法中，流动池的一个或多个表面涂覆有可接枝核酸的聚合物，通过将聚合物涂覆在流动池通道中并孵育固定时间，形成稳定、可靠的涂层，能够支持所有下游生化步骤，包括扩增及测序。目前在基因测序中用于与核酸连接的聚合物存在若干限制，例如：1.需要依赖于硅烷偶联剂对基材表面做功能化修饰后，再进行共价连接，结构不稳定；2.某些聚合物对空气较敏感，长时间暴露空气中会导致性能下降；3.聚合物的使用成本较高，需要在较高浓度下涂覆，且一般不能重复使用。
发明内容
基于此，本申请提供一种性质稳定、不易变质、可重复利用的聚合物及其制备方法，利用所述聚合物能在基材表面形成稳定、可靠的涂层，聚合物涂层与核酸连接后可获得稳定的表面结构，能够进行多种扩增反应及支持测序。
进一步地，本申请还提供了上述聚合物在制备基因测序芯片中的应用、基因测序芯片。
本申请一实施例提供一种聚合物，具有如下结构：
R1为H或
R2为
R3为
x选自1～10000的整数，y选自1～1000的整数，z选自1～1000的整数，且x、y以及z的比值为1:(0.015～0.05):(0.045～0.10)；
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8以及n9各自独立地选自1～10的整数。
在其中一个实施例中，所述聚合物的重均分子量为1000～1000000。
在其中一个实施例中，所述R1为H，所述R2为所述R3为
在其中一个实施例中，所述n3为5～7，所述n9为3～5。
在其中一个实施例中，所述聚合物的结构为：
本申请一实施例还提供了一种如上述任一实施例中所述的聚合物的制备方法，包括如下步骤：
将主单体、膦酸功能单体以及叠氮功能单体混合，并进行聚合反应；
所述主单体的结构式为：
所述膦酸功能的结构式为：
所述叠氮功能单体的结构式为：
在其中一个实施例中，所述主单体包括丙烯酰胺，所述膦酸功能单体包括(6-丙烯酰胺己基)膦酸，所述叠氮功能单体包括N-(14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂环丁烷)丙烯酰胺。
在其中一个实施例中，进行聚合反应的步骤包括：
将所述主单体、所述膦酸功能单体以及所述叠氮功能单体于溶剂中混合，形成混合液；
在保护性气体氛围下，将所述混合液加热，并加入催化剂和引发剂，进行自由基聚合。
本申请一实施例还提供了如上述任一实施例中所述的聚合物在制备基因测序芯片中的应用。
在其中一个实施例中，包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，所述核酸负载物含有修饰基团，所述修饰基团包括炔基；
将所述过渡金属修饰芯片基材浸泡于含有所述聚合物的溶液中，使所述聚合物通过膦酸基团与所述过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合，制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材；
将所述聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材浸泡于含有所述核酸负载物的溶液中，所述聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材通过叠氮基团与所述核酸负载物的修饰基团中的炔基连接。
在其中一个实施例中，包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于所述芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，所述核酸负载物含有修饰基团，所述修饰基团包括炔基；
将所述核酸负载物与所述聚合物混合，所述核酸负载物的修饰基团中的炔基与所述聚合物上的叠氮基团反应，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物；
将所述核酸负载物接枝于聚合物上的复合物涂覆在所述过渡金属修饰芯片基材的表面，所述核酸负载物接枝于聚合物上的复合物通过膦酸基团与所述过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合。
在其中一个实施例中，所述修饰基团由炔烃、二苯并环辛炔以及双环[6.1.0]壬炔中的至少一种化合物引入。
在其中一个实施例中，所述过渡金属氧化物为二氧化钛、二氧化锆以及二氧化铪中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述核酸负载物为引物核酸。
本申请一实施例还提供了一种基因测序芯片，由上述任一实施例中所述的应用制备得到。
本申请提供的聚合物是一种含有膦酸基团和叠氮基团的聚合物，性质稳定、不易变质，利用膦酸基团对过渡金属的特异性修饰可以实现对芯片基材表面化学处理，与此同时，利用叠氮基团与含有修饰基团的核酸进行化学连接后可以成功将核酸固定在芯片基材的表面，从而形成基因测序芯片，聚合物可多次反复使用并可满足扩增及测序要求，具有良好的稳定性及更低的使用成本。
附图说明
图1为一实施例中聚合物与含有炔基修饰基团的核酸负载物的反应过程示意图；
图2为实施例1制备得到的聚合物的化学结构示意图；
图3为实施例1制备得到的聚合物的水相GPC表征结果；
图4为实施例2进行滚环扩增(RCA)反应后，使用sybr gold染色在倒置荧光显微镜200x视野下使用488nm激发光观察拍照结果；
图5为实施例2进行滚环扩增(RCA)反应后，使用gendow测序仪跑10个cycle后测序仪拍照结果；
图6为实施例3进行滚环扩增(RCA)反应后，使用sybr gold染色在倒置荧光显微镜200x视野下使用488nm激发光观察拍照结果；
图7为实施例4进行桥式PCR后，使用gendow测序仪跑10个cycle后测序仪拍照结果；
图8为实施例5不同浓度的引物固定于芯片表面后Cy3互补荧光测试强度变化；
图9为实施例5采用终浓度为10μM的引物得到的基因测序芯片进行桥式PCR后，使用gendow测序仪跑10个cycle后测序仪拍照结果；
图10为实施例6聚合物经不同次数重复使用后制备得到的基因测序芯片Cy3互补荧光测试强度变化。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将结合实施例和附图对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本申请所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本申请所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请一实施例提供一种聚合物，具有如下结构：
R1为H或
R2为
x选自1～10000的整数，y选自1～1000的整数，z选自1～1000的整数，且x、y以及z的比值为1:(0.015～0.05):(0.045～0.10)；
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8以及n9各自独立地选自1～10的整数。
本申请提供的聚合物是一种含有膦酸基团和叠氮基团的聚合物，性质稳定、不易变质，利用膦酸基团对过渡金属的特异性修饰可以实现对芯片基材表面化学处理形成稳定、可靠的聚合物涂层，与此同时，利用叠氮基团与含有修饰基团的核酸进行化学连接后可以成功将核酸固定在芯片基材的表面形成稳定的表面结构，能够进行多种扩增反应并支持测序。
优选地，x选自2000～4000的整数。进一步优选地，x选自3000。
优选地，y选自1～100的整数。进一步优选地，y选自60。
优选地，z选自100～200的整数。进一步优选地，z选自150。
在其中一个实施例中，聚合物的重均分子量为1000～1000000。优选地，聚合物的重均分子量为100000～200000。
在其中一个实施例中，R1为H，R2为R3为
在其中一个实施例中，n3为5～7，n9为3～5。
在其中一个实施例中，聚合物的结构为：
本申请一实施例还提供了一种如上述任一实施例中的聚合物的制备方法，包括如下步骤：
将主单体、膦酸功能单体以及叠氮功能单体混合，并进行聚合反应；
主单体的结构式为：
膦酸功能的结构式为：
叠氮功能单体的结构式为：
本申请提供的聚合物的制备方法中，主单体中包含有丙烯酰胺基团，其作用是作为聚合物的骨架，能够为聚合物提供良好的生物相容性及抗污性；膦酸功能单体中的一端包含有不饱和基团，另一端包含有膦酸基团，其作用是在聚合物的结构中引入膦酸基团，利用膦酸基团与芯片基材表面的过渡金属的键合作用，将聚合物固定至芯片基材表面形成稳定可靠的聚合物涂层；叠氮功能单体的一端包含有不饱和基团，另一端包含有叠氮基团，其作用是在聚合物的结构中引入叠氮基团，利用叠氮基团与炔基能够发生点击化学反应的机理实现聚合物与核酸负载物的连接，从而可以将核酸负载物稳定地固定至芯片基材的表面，形成具有稳定结构的基因测序芯片，能够进行多种扩增反应及支持测序。利用上述方法制备的聚合物种类选择较多，可以通过调整R1、R2、R3的结构组合引入多种不同结构的单体，实现对聚合物分子量的调控。
可以理解地，根据R1基团的不同，主单体中可以是包含有PEG修饰或未修饰的丙烯酰胺基团；根据R2基团的不同，膦酸功能单体的一端包含的不饱和基团可以为丙烯酰胺基团或乙烯基团；根据R3基团的不同，叠氮功能单体的一端包含的不饱和基团也可以为丙烯酰胺基团或乙烯基团。
在其中一个实施例中，主单体包括丙烯酰胺，膦酸功能单体包括(6-丙烯酰胺己基)膦酸，叠氮功能单体包括N-(14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂环丁烷)丙烯酰胺。
在其中一个实施例中，主单体、膦酸功能单体以及叠氮功能单体的物质的量之比为1：(0.015～0.05)：(0.045～0.10)。
在其中一个实施例中，进行聚合反应的步骤包括：
将主单体、膦酸功能单体以及叠氮功能单体于溶剂中混合，形成混合液；
在保护性气体氛围下，将混合液加热，并加入催化剂和引发剂，进行自由基聚合。
在其中一个实施例中，溶剂为水。
在其中一个实施例中，形成混合液的步骤包括：
将主单体溶于第一部分溶剂中，形成主单体溶液；
将膦酸功能单体溶于第二部分溶剂中，形成膦酸功能单体溶液；
将叠氮功能单体溶于第三部分溶剂中，形成叠氮功能单体溶液；
将主单体溶液、膦酸功能单体溶液以及叠氮功能单体溶液混合并定容，形成混合液。
在其中一个实施例中，保护性气体为氮气。
在其中一个实施例中，进行自由基聚合的催化剂为N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、亚硫酸钠以及硫代硫酸钠中的一种或多种。
在其中一个实施例中，进行自由基聚合的引发剂为过硫酸钾(KPS)、硫酸铵(APS)以及偶氮类引发剂中的一种或多种。可选地，偶氮类引发剂例如可以的但不限于是2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)。
在其中一个实施例中，进行自由基聚合的温度为4℃～60℃。
在其中一个实施例中，进行自由基聚合的反应时间为1h～3h。
在其中一个实施例中，聚合物的制备方法还包括反应结束后终止聚合的步骤：
将反应后的产物暴露在空气中，搅拌，猝灭自由基。
进一步地，搅拌的时间为30min～60min。
在其中一个实施例中，聚合物的制备方法还包括收集产物的步骤：
将反应后的产物在沉淀剂中进行沉淀，收集沉淀物，烘干。
进一步地，沉淀剂例如可以但不限于是异丙醇。
在其中一个实施例中，上述方法制备得到的聚合物为了便于使用，可将聚合物溶于水中配制成溶液后使用。
本申请一实施例还提供了如上述任一实施例中的聚合物在制备基因测序芯片中的应用。
本申请所提供的聚合物包含有膦酸基团和叠氮基团，其中，膦酸基团可以与过渡金属进行配位，从而实现对表面覆盖有过渡金属的芯片基材进行特异性修饰，利用膦酸对过渡金属的键合作用，可以形成单齿、双齿或三齿的键合结构，从而将聚合物固定至芯片基材的表面；叠氮基团可以与由炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)等化合物引入的含炔基修饰基团的核酸负载物通过点击化学反应进行连接，进而可以实现将核酸负载物固定至芯片基材表面的目的。
基于本申请所提供的聚合物的结构特性，本申请提供了两种利用上述聚合物制备基因测序芯片的方法：
第一种方法为：先利用膦酸基团对覆盖在芯片基材表面的过渡金属进行特异性修饰，将聚合物接枝于过渡金属的表面，使芯片基材表面布满叠氮基团，叠氮基团可以与由炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)等化合物引入的含炔基的修饰基团进行点击化学反应，从而实现将含有炔基修饰基团的核酸负载物固定至芯片基材表面的目的，制备得到基因测序芯片。
第二种方法为：先利用核酸负载物上由炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)等化合物引入的含炔基的修饰基团与聚合物上的叠氮基团与进行点击化学反应，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物，使得复合物上含有膦酸基团，再通过膦酸基团与过渡金属修饰芯片基材的表面的过渡金属进行键合，从而将核酸负载物固定在芯片基材表面，制备得到基因测序芯片。
通过上述两种方法可以得到在过渡金属修饰的芯片基材表面固定有高密度核酸分子的基因测序芯片，基因测序芯片可以进行多种扩增反应。
具体地：
对应于上述第一种方法，在其中一个实施例中，基因测序芯片的制备包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，核酸负载物含有修饰基团，修饰基团包括炔基；
将过渡金属修饰芯片基材浸泡于含有聚合物的溶液中，使聚合物通过膦酸基团与过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合，制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材；
将聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材浸泡于含有核酸负载物的溶液中，聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材通过叠氮基团与核酸负载物的修饰基团中的炔基连接。
对应于上述第二种方法，在其中又一个实施例中，基因测序芯片的制备包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，核酸负载物含有修饰基团，修饰基团包括炔基；
将核酸负载物与聚合物混合，核酸负载物的修饰基团中的炔基与聚合物上的叠氮基团反应，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物；
将核酸负载物接枝于聚合物上的复合物涂覆在过渡金属修饰芯片基材的表面，核酸负载物接枝于聚合物上的复合物通过膦酸基团与过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合。
在其中一个实施例中，修饰基团由炔烃、二苯并环辛炔以及双环[6.1.0]壬炔中的至少一种化合物引入。
在其中一个实施例中，过渡金属氧化物为二氧化钛、二氧化锆以及二氧化铪中的一种或多种。
在其中一个实施例中，核酸负载物为引物核酸。
可以理解地，芯片基材例如可以但不限于包括塑料、硅、二氧化硅、氮化硅、石英、陶瓷、树脂、聚合物、共聚物等材料中的一种或多种。
可以理解地，过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材可以来源于自制，也可以来源于商购。可以理解地，自制过渡金属修饰芯片基材的方法可以为本领域的常规方法，例如可以是原子层沉积、磁控溅射等镀膜方法，又例如还可以是原位生成等化学合成方法等，在此不作特别限定。
可以理解地，包含有炔基等修饰基团的核酸负载物可以来源于自制，也可以来源于商购。
图1示出了其中一个实施例中，核酸负载物为引物，且修饰基团中的炔基由炔烃引入时，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物的反应示意图。可以理解地，当核酸负载物为其他负载物，和/或，修饰基团中的炔基由二苯并环辛炔(DBCO)或双环[6.1.0]壬炔(BCN)等其他化合物引入时，反应示意图类似，在此不再赘述。
进一步地，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物的过程中，还加入了催化剂。优选地，催化剂为一价铜离子。进一步地，一价铜离子可以通过如下方式得到：CuSO4与THPTA形成配体，在抗坏血酸钠的存在下还原成一价铜。
可以理解地，在上述两种制备方法中，所涉及的溶液中的溶剂可以为水、乙醇、甲醇以及四氢呋喃以及它们的混合等等。具体所采用的溶剂和浓度可以根据聚合物溶解度进行选择。溶剂介电常数越低，膦酸聚合物对过渡金属修饰的缺陷越少；膦酸聚合物浓度越高，作用时间越长，过渡金属修饰芯片基材表面接枝的聚合物密度越高。
本申请一实施例还提供了一种基因测序芯片，由上述任一实施例中的应用制备得到。
以下通过具体实施例对本申请进一步详细的说明。以下实施例较为具体，可以理解地，在其他实施例中，不限于此。在以下具体实施例中，所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
核酸负载物：购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，具有以下序列的引物核酸：
第一引物：
SEQ 1：5`CHCH-Spacer18-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。
第二引物：
SEQ 2：5`CHCH-Spacer18-CAAGCAGAAGACGGCATACGA。
第三引物：
SEQ 3：5`CHCH-Spacer18-AATGATACGGCGACCACCGATCTACAC。
过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材：购买于钛霓科技有限公司，芯片基材的材质为二氧化硅，过渡金属氧化物为TiO2。
实施例1
制备聚合物：
1、称取主单体丙烯酰胺(500mg，7.03mmol)，溶于2mL超纯水中，充分溶解并混匀；
2、称取膦酸功能单体(6-丙烯酰胺己基)膦酸(33mg，0.14mmol，占主单体物质的量的2％)，溶于2mL超纯水中，充分溶解并混匀；
3、称取叠氮功能单体N-(14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂环丁烷)丙烯酰胺(N3-PEG-Acrylamide，111mg，0.35mmol，占主单体物质的量的5％)，溶于2mL超纯水中，充分溶解并混匀；
4、将步骤1、步骤2以及步骤3制备的溶液混合并定容至10mL，使用0.22μm滤膜过滤，持续通氮气30min；
5、将水浴锅预热至40℃，将步骤4得到的混合溶液转移至水浴锅中的三口烧瓶中，转速200rpm，持续通氮气；
6、向步骤5得到的混合溶液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED，18μL，0.15mmol)，充分混匀；
7、向步骤6得到的混合溶液中加入过硫酸钾(KPS，5mg，0.02mmol)，开始引发反应；
8、将步骤7的反应物料在40℃的条件下持续反应2h；
9、将步骤8的反应后的物料暴露空气中搅拌30min，猝灭自由基，结束反应；
10、将步骤9所得的反应产物采用大量异丙醇进行沉淀，搅拌30min，收集沉淀，真空烘干，得聚合物；
11、对步骤10得到的聚合物进行定量，并使用纯化水按聚合物质量与水体积为0.1g：1mL的比例配制成10％(w/v)的聚合物溶液，4℃保存。
其中，主单体丙烯酰胺的化学结构式为：
膦酸功能单体(6-丙烯酰胺己基)膦酸的化学结构式为：
叠氮功能单体N-(14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂环丁烷)丙烯酰胺的化学结构式为：
制备聚合物的聚合反应过程为：
对实施例1制备得到的聚合物进行结构表征：
对实施例1制备得到的聚合物通过1HNMR(D2O)进行表征，结合图2，表征结果如下：
1.28ppm处出现D、E、F、G标记位的-CH2-的特征吸收峰；1.43ppm～1.66ppm处出现B、H标记位的-CH2-的特征吸收峰；2.08ppm～2.21ppm处出现A标记位的-CH-特征吸收峰和M标记位的-CH2-的特征吸收峰；3.53ppm～3.60ppm处出现I、C标记位的-CH2-的特征吸收峰；3.60ppm～3.96ppm处出现K、J、L标记位的-CH2-的特征吸收峰。
图3示出了实施例1制备得到的聚合物进行水相GPC表征结果。经GPC测试得出，实施例1制备得到的聚合物的数均分子量Mn为59169，重均分子量Mw为171873，分子量分布D为2.90478。
实施例2
将引物固定至芯片基材表面制备得到基因测序芯片，进行RCA扩增；
基因测序芯片的制备方法为：先制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材，再将引物与聚合物连接。
步骤一：提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材。
步骤二：制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材
1、取100μL实施例1制备得到的10％的聚合物溶液，加入9.9mL纯化水，充分混匀，配制成聚合物工作液；
2、将步骤一提供的过渡金属修饰芯片基材在异丙醇溶液中浸泡2min，取出后用氮气吹干，再用等离子体清洗3min；
3、将步骤2清洗干净的过渡金属修饰芯片基材浸泡在步骤1配制的聚合物工作液中，室温下放置15h；
4、取出步骤3处理后的芯片基材，使用纯化水反复冲洗，氮气吹干。
步骤三、将引物与聚合物连接
1、配制以下溶液：
200mM的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)：称取8.69mg的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺，加入纯化水配制成100μL的溶液；
100mM的硫酸铜(CuSO4)：称取159.6mg的硫酸铜，加入纯化水配制成10mL的溶液；
100mM抗坏血酸钠：称取19.81mg的抗坏血酸，加入纯化水配制成1mL的溶液；
THPTA/CuSO4配体：将200mM的THPTA与100mM的CuSO4溶液按照1：1的体积比混合；
100μM的第一引物(SEQ 1)：加入NF水进行溶解并配制。
2、引物与聚合物连接并进行RCA扩增
(1)取50μL 100μM的第一引物，加入50μL NF水，充分混匀；
(2)取2μL THPTA/CuSO4配体加入步骤(1)的溶液中，充分混匀；
(3)取3μL 100mM的抗坏血酸钠加入步骤(2)的溶液中，充分混匀，配制得到反应液；
(4)将步骤(3)的反应液注入经步骤二处理后的芯片基材中，室温反应1h；
(5)使用纯化水冲洗芯片，4℃保存；
(6)使用步骤(5)得到的芯片进行滚环扩增(RCA)反应。
实施例3
将引物固定至芯片基材表面制备得到基因芯片，进行RCA扩增；
基因测序芯片的制备方法为：先将引物与聚合物混合并反应，制备引物接枝于聚合物上的复合物，然后将复合物固定在过渡金属修饰芯片基材的表面。
步骤一：提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材。
步骤二：制备引物接枝于聚合物上的复合物
1、配制以下溶液：
200mM的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)：称取8.69mg的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺，加入纯化水配制成100μL的溶液；
100mM的硫酸铜(CuSO4)：称取159.6mg的硫酸铜，加入纯化水配制成10mL的溶液；
100mM抗坏血酸钠：称取19.81mg的抗坏血酸，加入纯化水配制成1mL的溶液；
THPTA/CuSO4配体：将200mM的THPTA与100mM的CuSO4溶液按照1：1的体积比混合；
100μM的第一引物(SEQ 1)：NF水进行溶解并配制。
2、制备引物接枝于聚合物上的复合物
(1)取50μL实施例1制备得到的10％的聚合物溶液，加入800μL纯化水，混合均匀，得聚合物工作液；
(2)向步骤(1)的聚合物工作液中加入100μL 100μM的第一引物，混合均匀；
(3)取20μL THPTA/CuSO4配体加入步骤(2)的溶液中，混合均匀；
(4)取30μL 100mM的抗坏血酸钠加入步骤(3)的溶液中，混合均匀得反应液；
(5)步骤(4)的反应液进行室温反应1h，得引物接枝于聚合物上的复合物，4℃保存；
步骤三、将复合物固定在过渡金属修饰芯片基材的表面
1、将步骤二制备得到的引物接枝于聚合物上的复合物涂覆在步骤一提供的过渡金属修饰芯片基材表面，室温反应15h；
2、反应结束，采用纯化水清洗基因芯片三次，4℃保存；
3、使用步骤2得到的基因测序芯片进行滚环扩增(RCA)扩增。
实施例4
将引物固定至芯片基材表面制备得到基因测序芯片，进行桥式PCR扩增；
基因测序芯片的制备方法为：先制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材，再将引物与聚合物连接。
步骤一：提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材。
步骤二：制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材
1、取100μL实施例1制备得到的10％的聚合物溶液，加入9.9mL纯化水，充分混匀，配制成聚合物工作液；
2、将步骤一得到的过渡金属修饰芯片基材在异丙醇溶液中浸泡2min，取出后用氮气吹干，再用等离子体清洗3min；
3、将步骤2清洗干净的过渡金属修饰芯片基材浸泡在步骤1配制的聚合物工作液中，室温下放置15h；
4、取出步骤3处理后的芯片基材，使用纯化水反复冲洗，氮气吹干。
步骤三、将引物与聚合物连接
1、配制以下溶液：
200mM的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)：称取8.69mg的三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺，加入纯化水配制成100μL的溶液；
100mM的硫酸铜(CuSO4)：称取159.6mg的硫酸铜，加入纯化水配制成10mL的溶液；
100mM抗坏血酸钠：称取19.81mg的抗坏血酸，加入纯化水配制成1mL的溶液；
THPTA/CuSO4配体：将200mM的THPTA与100mM的CuSO4溶液按照1：1的体积比混合；
100μM的第二引物(SEQ 2)：加入NF水进行溶解并配制；
100μM的第三引物(SEQ 3)：加入NF水进行溶解并配制。
2、引物与聚合物连接并进行桥式PCR扩增
(1)取50μL 100μM的第二引物，加入50μL 100μM的第三引物，充分混匀；
(2)取2μL THPTA/CuSO4配体加入步骤(1)的溶液中，充分混匀；
(3)取3μL 100mM的抗坏血酸钠加入步骤(2)的溶液中，充分混匀，配制得到反应液；
(4)将步骤(3)的反应液注入经步骤二处理后的芯片基材中，室温反应1h；
(5)使用纯化水冲洗芯片，4℃保存。
(6)使用步骤(5)的芯片加入桥式PCR试剂进行簇生成。
图4示出了采用实施例2的方法制备基因测序芯片并进行滚环扩增(RCA)反应后，使用sybr gold染色，在倒置荧光显微镜200x视野下使用488nm激发光观察拍照结果；图5示出了采用实施例2的方法制备基因测序芯片并进行滚环扩增(RCA)反应后，使用gendow测序仪跑10个cycle后，测序仪拍照结果；图6示出了采用实施例3的方法制备基因测序芯片并进行滚环扩增(RCA)反应后，使用sybr gold染色，在倒置荧光显微镜200x视野下使用488nm激发光观察拍照结果；图7示出了采用实施例4的方法制备基因测序芯片并进行桥式PCR后，使用gendow测序仪跑10个cycle后测序仪拍照结果。由图4～图7可见，利用实施例2～实施例4的方法均能够将高密度引物稳定地固定至芯片基材表面并进行扩增反应。
实施例5
步骤一：与实施例4相同。
步骤二：与实施例4相同。
步骤三：
1、配制以下溶液：与实施例4相同。
2、引物与聚合物连接：
(1)参照实施例4配制得到反应液，反应液中第二引物和第三引物的终浓度分别为1μM、10μM、20μM、30μM、40μM；
其中：
第二引物和第三引物在反应液中终浓度为1μM时，各试剂添加量包括：1μL100μM的第二引物+1μL 100μM的第三引物+93μL NF水+2μL THPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠；
第二引物和第三引物在反应液中终浓度为10μM时，各试剂添加量包括：10μL 100μM的第二引物+10μL 100μM的第三引物+75μL NF水+2μL THPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠；
第二引物和第三引物在反应液中终浓度为20μM时，各试剂添加量包括：20μL 100μM的第二引物+20μL 100μM的第三引物+55μL NF水+2μL THPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠；
第二引物和第三引物在反应液中终浓度为30μM时，各试剂添加量包括：30μL 100μM的第二引物+30μL 100μM的第三引物+35μL NF水+2μL THPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠；
第二引物和第三引物在反应液中终浓度为40μM时，各试剂添加量包括：40μL 100μM的第二引物+40μL 100μM的第三引物+15μL NF水+2μL THPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠；
(2)将步骤(1)配制得到的第二引物和第三引物的终浓度为1μM、10μM、20μM、30μM、40μM的反应液分别注入经步骤二处理后的芯片基材中，室温反应1h；
(3)使用纯化水冲洗芯片，4℃保存。
对反应液中第二引物和第三引物的终浓度分别为1μM、10μM、20μM、30μM、40μM，对应步骤(3)形成的芯片通过荧光进行表面核酸密度测定，测试方法包括如下步骤：
(1)向各芯片中分别加入3μM的Cy3标记的寡核苷酸，溶剂为2x SSC缓冲液，该寡核苷酸与被固定至芯片表面的引物核酸反向互补。将芯片放置于40℃的烘箱中进行杂交反应约30分钟，反应结束后将芯片放置至室温后使用1mL的2x SSC缓冲液将每个芯片流道清洗2次。
(2)使用gendow测序平台检测各芯片的表面核酸密度。通过检测互补链上的Cy3荧光，以拍照视野中的整体平均亮度来评价各芯片表面的核酸密度。统计面积为110×110μm的每个拍摄视野中的平均荧光强度。通过拍摄中间区域的50个视野下的荧光值，取平均值得到该流道的平均亮度。
如图8所示，随着反应液中引物核酸的终浓度的提升，荧光强度也不断增强，说明被固定接枝在芯片表面的核酸密度随反应液中引物核酸的终浓度的提高而提高，荧光强度与固定接枝在芯片表面的核酸密度呈正相关，可通过荧光强度的变化反应核酸在芯片表面的接枝情况。
荧光测试结束后，使用甲酰胺去除带荧光的杂交链，将反应液中第二引物和第三引物终浓度为10μM，对应步骤(3)形成的芯片加入桥式PCR试剂进行簇生成，其中一条流道在gendow测序仪拍照获得的检测结果如图9所示，由图9可见，该实施例成功将高密度引物稳定地固定在了芯片基材表面并支持扩增。
实施例6
步骤一：与实施例4相同。
步骤二：与实施例4相同。
步骤三：
1、配制以下溶液：与实施例4相同。
2、引物与聚合物连接：
(1)参照实施例4配制得到反应液，反应液中第二引物和第三引物的终浓度分别为10μM，各试剂添加量包括：10μL 100μM的第二引物+10μL 100μM的第三引物+75μL NF水+2μLTHPTA/CuSO4配体+3μL 100mM的抗坏血酸钠。
(2)将步骤(1)配制得到的反应液注入经步骤二处理后的芯片基材中，室温反应1h。
(3)使用纯化水冲洗芯片，4℃保存。
(4)回收使用过的聚合物工作液，用于下一次基因测序芯片的制备。
测试使用分别经过0、5、10、15、20、25、30次回收后的聚合物工作液制备的得到的基因测序芯片上的表面核酸密度，表面核酸密度参照实施例5通过荧光强度的变化进行评价，测试结果如图10所示。
由图10可见，使用经过25次回收后的聚合物用于制备基因测序芯片，所得测序芯片的荧光强度仍可达到初次使用的聚合物制备得到的芯片的荧光强度的90％以上，说明聚合物性质稳定、可重复使用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (15)

1.一种聚合物，其特征在于，具有如下结构：
R1为H或
R2为
R3为
x选自1～10000的整数，y选自1～1000的整数，z选自1～1000的整数，且x、y以及z的比值为1:(0.015～0.05):(0.045～0.10)；
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8以及n9各自独立地选自1～10的整数。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述聚合物的重均分子量为1000～1000000。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物，其特征在于，所述R1为H，所述R2为所述R3为/>
4.根据权利要求3所述的聚合物，其特征在于，所述n3为5～7，所述n9为3～5。
5.根据权利要求4所述的聚合物，其特征在于，所述聚合物的结构为：
6.一种如权利要求1～5任一项所述的聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将主单体、膦酸功能单体以及叠氮功能单体混合，并进行聚合反应；
所述主单体的结构式为：
所述膦酸功能的结构式为：
所述叠氮功能单体的结构式为：
7.根据权利要求6所述的聚合物的制备方法，其特征在于，所述主单体包括丙烯酰胺，所述膦酸功能单体包括(6-丙烯酰胺己基)膦酸，所述叠氮功能单体包括N-(14-叠氮-3,6,9,12-四氧杂环丁烷)丙烯酰胺。
8.根据权利要求6～7任一项所述的聚合物的制备方法，其特征在于，进行聚合反应的步骤包括：
将所述主单体、所述膦酸功能单体以及所述叠氮功能单体于溶剂中混合，形成混合液；
在保护性气体氛围下，将所述混合液加热，并加入催化剂和引发剂，进行自由基聚合。
9.权利要求1～5任一项所述的聚合物在制备基因测序芯片中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，所述核酸负载物含有修饰基团，所述修饰基团包括炔基；
将所述过渡金属修饰芯片基材浸泡于含有所述聚合物的溶液中，使所述聚合物通过膦酸基团与所述过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合，制备聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材；
将所述聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材浸泡于含有所述核酸负载物的溶液中，所述聚合物接枝于过渡金属氧化物表面的芯片基材通过叠氮基团与所述核酸负载物的修饰基团中的炔基连接。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
提供过渡金属氧化物覆盖于所述芯片基材表面的过渡金属修饰芯片基材；
提供核酸负载物，所述核酸负载物含有修饰基团，所述修饰基团包括炔基；
将所述核酸负载物与所述聚合物混合，所述核酸负载物的修饰基团中的炔基与所述聚合物上的叠氮基团反应，制备核酸负载物接枝于聚合物上的复合物；
将所述核酸负载物接枝于聚合物上的复合物涂覆在所述过渡金属修饰芯片基材的表面，所述核酸负载物接枝于聚合物上的复合物通过膦酸基团与所述过渡金属氧化物中的过渡金属原子键合。
12.根据权利要求10～11任一项所述的应用，其特征在于，所述修饰基团由炔烃、二苯并环辛炔以及双环[6.1.0]壬炔中的至少一种化合物引入。
13.根据权利要求10～11任一项所述的应用，其特征在于，所述过渡金属氧化物为二氧化钛、二氧化锆以及二氧化铪中的一种或多种。
14.根据权利要求10～11任一项所述的应用，其特征在于，所述核酸负载物为引物核酸。
15.一种基因测序芯片，其特征在于，由权利要求10～14任一项所述的应用制备得到。
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