CN116908429A - 犬尿氨酸：急性covid-19和长期covid的有用生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测由急性COVID‑19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外方法，其中测定体液中犬尿氨酸的水平，并且其中将待诊断患者中测量的犬尿氨酸的值与从未患有任何所述疾病的可比人群中获得的平均值进行比较，其中患者中犬尿氨酸的值是增加的。

Description

犬尿氨酸：急性COVID-19和长期COVID的有用生物标志物
技术领域
本发明涉及用于检测由急性COVID-19感染、COVID或PIMS引起的炎症的体外方法，犬尿氨酸在检测炎症中的用途，以及用于实施该方法的测试试剂盒。
背景技术
宿主防御病原体之间的联系似乎是由多种产生的病原体相关分子模式(PAMPs)和与损伤相关分子模式(DAMPs)的产生和出现相关的任何有害的非致病因素介导的初始组织损伤。
有证据表明，在组织损伤的中心，无论其来源是感染、中毒、物理或其他有害事件，活性氧物质ROS都起着主导作用。口腔牙龈上皮细胞和气道上皮细胞被预先设置为检测病原体和非致病因子并启动宿主先天防御反应的前哨系统。
先天免疫反应和相关细胞类型在COVID-19病的临床症状和严重性中起着至关重要的作用。这一假设与之前对严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV的研究一致，SARS-CoV与COVID-19的病原体SARS-CoV-2最接近，主要感染气道和肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞。已经表明，SARS-CoV触发了多种先天识别和应答途径。
疾病康复后的短期和长期后遗症表明，这些综合征导致慢性亚临床全身性炎症的加速状态，这种炎症通常见于衰老，称为炎症衰老(inflammaging)，导致年龄相关疾病的增加和恶化，包括甚至在年轻个体中的虚弱。这些发现在临床上与不同的器官有关，如大脑、心脏、血管系统、肾脏和肌肉。
普遍的证据表明，患有严重COVID-19病的患者似乎有先天免疫系统的过度反应，表现出由细胞因子风暴引起的炎症水平加剧。
在这一早期阶段，支撑COVID-19的机制仍然受到严格的审查，该疾病造成的长期精神健康后果尚不清楚。激活但未成功下调的先天免疫反应与细胞因子风暴事件一起或单独可能导致长期COVID或PIMS的风险增加。这些综合征的背景表现为持续的亚临床炎症，不易检测，可能是由于免疫抑制治疗类型选择不当或不成功。
犬尿氨酸
犬尿氨酸是一种芳香族、非蛋白原氨基酸，是色氨酸代谢的代谢产物。在色氨酸代谢中，犬尿氨酸途径(KP)在以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的形式产生细胞能量方面起着关键作用。因为在免疫反应期间能量需求显著增加，所以KP是免疫系统的关键调节因子。这种关键调节因子非常重要，尤其是在先天免疫激活的第一道防线中。
犬尿氨酸在响应免疫激活时由色氨酸双加氧酶和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO-1)合成，色氨酸双加氧酶主要在肝脏中产生，吲哚胺-2,3-双加氧酶在许多组织中产生(图1)。
COVID-19的背景
冠状病毒疾病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的高度传染性疾病。COVID-19的常见症状包括发烧、咳嗽、疲劳、呼吸急促以及丧失嗅觉和味觉。大多数病例会导致轻微的症状，但是，一些病例会发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其特征是细胞因子风暴、多器官衰竭、脓毒性休克和血凝块。
虽然只有一些个体发展为严重呼吸系统疾病的机制仍未完全阐明，但许多研究表明，病情严重到需要住院治疗的患者往往是患有多种疾病(包括高血压、糖尿病和/或肥胖症)的老年人。
住院患者的疾病严重程度以与明显炎症反应相关的严重肺炎为特征，炎症反应以高C-反应蛋白、CRP和白细胞介素-6(IL-6)、低白蛋白、高沉降率、低嗜酸性粒细胞和淋巴细胞减少为特征。住院患者的乳酸脱氢酶(LDH)也有所增加，LDH是细胞死亡的标志物，通常与凝血功能改变有关。高LDH、低淋巴细胞计数和高水平的高敏CRP可提前10天以上预测个体患者的死亡率，准确率超过90％。
因此，过去几个月发表的大量研究表明，SARS-CoV-2感染释放了强大的、显然不受控制的炎症反应，这很可能加剧了向COVID-19潜在病理发展的已经由病毒感染引起的组织损伤。
值得注意的是，虽然严重的COVID-19对老年人的影响不成比例，但在所有年龄组的患者中均可检测到SARS-CoV-2感染引起的全身性炎症，包括在儿童中发现的具有Kawasaki病特征的严重多系统炎症综合征。
PIMS的背景
小儿炎性多系统综合征(PIMS)是一种罕见的全身性疾病，涉及儿童接触SARS-CoV-2后的持续发热和极度炎症。这种综合征也被称为儿童多系统炎症综合征(MIS-C)或COVID-19全身炎症综合征(SISCoV)。它可以迅速导致医疗紧急情况，如全身血液流动不足，这种情况被称为休克。可能发生一个或多个器官的衰竭。警告信号是接触COVID-19后出现不明原因的持续发热伴随严重症状。
受影响的儿童始终表现出过度炎症的实验室证据。炎症的显著生物标志物通常包括红细胞沉降率、ESR、C-反应蛋白、CRP、降钙素原、铁蛋白和IL-6的显著升高。血小板计数低和凝血功能受损也很常见，伴有D-二聚体和纤维蛋白原水平升高。
临床特征可能与Kawasaki病相似，Kawasaki病是一种罕见的疾病，通常影响幼儿。Kawasaki病的不同之处包括经常出现胃肠道症状，如呕吐、腹泻和腹痛。神经系统的参与似乎也相对频繁。Kawasaki病通常不会出现的特征性实验室检查结果，包括非常高水平的心室利钠肽(心力衰竭的标志)，以及稍低的血小板计数、较低的绝对淋巴细胞计数和较高的CRP水平。
发病机制尚不完全清楚，可能涉及多种因素。SARS-CoV-2可能具有以下多种作用之一：它可以通过某种方式为不同的触发因素铺平道路，直接或间接地充当该病症的环境触发因素。。
理解病理生理学是一个关键的研究重点。关于暴露于SARS-CoV-2后导致疾病的潜在分子机制的问题包括识别任何遗传易感性因素；与特定病毒变体的任何关联；任何能够引发自身免疫/自身炎症反应的分子模式。另一个关键问题是，在患有PIMS的儿童和患有严重COVID-19的成人中触发自身免疫/自身炎症反应的分子机制(包括诱导高浓度的IL-6)是相似的还是不同的。
长期COVID的背景
长期COVID是一种以在COVID-19的典型恢复期之后持续存在或出现长期后果为特征的病况。这是全球受感染人口及其卫生系统面临的一个日益得到承认的问题。长期COVID也称为后COVID-19综合征、后COVID-19病况、后COVID-19急性后遗症(PASC)或慢性COVID综合征(CCS)。
短语“长期COVID”通常描述那些在诊断后经历症状超过28天的COVID-19患者，无论是实验室确认的还是临床确认的。症状与急性COVID-19中所见的症状一样具有明显的异质性，可以是恒定的、波动的，或者以不同的频率出现并被与其他系统相关的症状所替代。虽然许多患有长期COVID的人将在初级保健中得到管理，但其他人将需要康复医学专家的更多投入。
越来越多的患者报告了急性COVID-19感染后的多器官症状。它们的范围从咳嗽和呼吸急促到疲劳、头痛、心悸、胸痛、关节痛、身体受限、抑郁和失眠，并影响不同年龄的人。长期COVID是一个新兴的健康问题，现在需要采取行动来解决它。
迫切需要大规模的长期群组研究来帮助更好地理解导致COVID-19的长期健康后果的发展轨迹、并发症和生物学机制。尽管疫苗接种已成为许多国家疫情应对措施的当务之急，但当各国开始考虑结束疫情时，绝不能忘记或忽视长期COVID患者。
因此，越来越需要了解疾病机制，确定与SARS-CoV-2感染相关的药物靶点和炎症过程，特别是在长期COVID中。
发明内容
本发明的目的是确定犬尿氨酸是否能够描述COVID-19急性期的炎症情况。此外，犬尿氨酸是否还能够描述长期COVID和/或PIMS患者的亚临床炎症情况。
本发明公开了一种检测和监测急性COVID-19、长期COVID和/或PIMS的方法。
在第一个方面，本发明涉及通过测定体液中犬尿氨酸的水平来检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外方法。
在第二个方面，本发明涉及犬尿氨酸作为生物标志物在由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外检测中的用途。
在第三个方面，本发明涉及一种测试试剂盒，利用该试剂盒，通过使用本发明的方法来测定体液中犬尿氨酸的水平。
具体实施方式
下面将结合附图更详细地描述本发明及其实施方案。
本发明涉及犬尿氨酸途径，KP。色氨酸是一种必需氨基酸，其可以通过不同的途径代谢，一种主要途径是犬尿氨酸途径。这一途径如图1所示。该途径的第一种酶，吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO-1)受到炎性分子，特别是干扰素-γ的强烈刺激。因此，当免疫反应被激活时，犬尿氨酸途径通常被系统性地上调。生物学意义是色氨酸的消耗和犬尿氨酸的产生在免疫反应中起着关键的调节作用。令人惊讶地发现，在体液中测量的犬尿氨酸水平可用于检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症。
如上所述，IDO-1，是一种IFN-γ诱导的细胞内酶，催化犬尿氨酸途径中必需氨基酸色氨酸降解的第一步和限速步骤。IDO-1的免疫调节作用表现为预防T细胞增殖、促进T细胞凋亡、诱导T细胞无知、能量和产生T调节细胞。
KP是哺乳动物中色氨酸(TRP)降解的主要代谢途径；它负责人脑中95％以上的TRP分解代谢。这种代谢级联产生的代谢物称为犬尿氨酸，参与许多生理过程，包括神经传递和免疫反应。KP还涉及神经毒性和神经保护性代谢物，其微妙平衡的改变已在多种病理过程中得到证实。
本文使用的术语“犬尿氨酸”指色氨酸/犬尿氨酸途径的所有代谢物。因此，犬尿氨酸和/或其衍生物包括在所述术语中。
应当注意，术语“包括”不排除其他元件或步骤，并且单数术语“一个”不排除复数情况。此外，结合不同实施方案描述的元件可以组合。
还必须注意，已经参考不同的主题描述了本发明的各个方面。特别地，已经参考方法类型权利要求描述了一些方面，而其他方面则分别参考用途类型权利要求和/或产品类型权利要求进行了描述。然而，本领域技术人员将从以上和以下描述中了解到，除非另有说明，否则除了属于一种类型主题的特征之间的任何组合之外，与不同类型主题相关的特征之间的任何组合也被认为与本文一起公开。特别地，涉及方法类型权利要求的特征和涉及用途类型权利要求和/或产品类型权利要求的特征之间的组合被认为是公开的。
KP的中心中间体是L-犬尿氨酸(L-KYN)，在该处代谢途径分为两个不同的分支。L-KYN或通过犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)转化为神经保护性犬尿喹啉酸(KYNA)或转化为3-羟基-L-犬尿氨酸(3-OH-KYN)。3-OH-KYN在一系列酶促步骤中进一步代谢，最终产生NAD+(如图1所示)。
本发明提供了一种用于检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外方法，其中确定了体液中犬尿氨酸的含量。本发明还提供了用于实施该诊断方法的测试试剂盒形式的方法和手段。当使用唾液作为样品时，这些测试可以由个体或患者自己在这种测定似乎是合适的任何给定的时间容易地进行。
本发明的方法基于发明人的惊人发现，即特别地，唾液中的犬尿氨酸水平与血清样品中测定的犬尿氨酸水平成比例地非常一致(图2)。因此，本发明的方法优选用唾液进行。
在本发明的方法中，测定了体液中犬尿氨酸的水平。尽管在本发明的方法中优选测定L-犬尿氨酸的水平，但是也可以测定N-甲酰基犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的水平。
取决于检测方法，可以在不同的中间体之间进行测定。然而，也可以使用与不同中间体反应的测定试验。犬尿氨酸的测定优选定量或半定量进行，因为检测正常范围之外的犬尿氨酸水平的变化是重要的。特别有利的是，当使用唾液作为样品时，体外方法可以在没有医生或受过医学训练的人的情况下进行。
利用本发明的方法，可以确定血清和唾液中犬尿氨酸水平之间的可靠关系(图2)。血清和唾液中犬尿氨酸的测量值之间存在线性相关(R2＝0.902)。关系是3，3(血清):1(唾液)。这一观察结果证明，犬尿氨酸在唾液中以显著和有意义的水平存在，这与许多其他蛋白质的情况不同。
利用这一观察结果，本发明提供了一种可靠的方法和测试试剂盒，用于通过测定体液中犬尿氨酸的水平来检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症。
本发明的主题在独立权利要求中定义。
本发明的优选实施方案在相应的从属权利要求中定义。
根据本发明，提供了用于检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外方法，其中测定体液中犬尿氨酸的水平，并且其中将待诊断患者中测量的犬尿氨酸的值与从未患有任何所述疾病的可比较人群中获得的平均值进行比较，其中患者中犬尿氨酸的值是增加的。
根据优选的实施方案，体液中犬尿氨酸的测定用于治疗控制。
根据另一个优选的实施方案，体液中犬尿氨酸的测定用于监测急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS和/或患者的恢复。
根据又一个优选实施方案，体液是血清、唾液或脑脊液(CSF)。在一个特别优选的实施方案中，体液是唾液。
此外，根据一个优选的实施方案，患者中犬尿氨酸的水平至少比对照组高两倍。更优选地，患者血清中犬尿氨酸的水平至少为3μM，唾液中至少为1μM，CSF中至少为1μM。甚至更优选地，患者血清中犬尿氨酸的水平为4μM至25μM，甚至更优选5μM至17μM，还更优选5.5μM至12μM，还更优选6μM至9μM。更优选地，唾液中犬尿氨酸的水平为1.5μM至4μM。更优选地，CSF中犬尿氨酸的水平为1.5μM至4μM。
根据另一个优选的实施方案，急性COVID-19感染是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的传染性疾病。
在另一个优选的实施方案中，长期COVID是一种以在COVID-19病的典型恢复期之后持续存在或出现的长期后果为特征的疾病。
根据另一个优选的实施方案，PIMS是一种全身性儿科疾病，涉及暴露于SARS-CoV2后的持续发热和极度炎症。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，本文所述的方法是用唾液进行的。因此，可以在不需要侵入性措施的情况下检测炎症。患者可以通过使用他的唾液容易地进行测试，并且本文提供的测试试剂盒允许指示治疗中的潜在风险。
根据另一个优选的实施方案，体外方法是ELISA测试，或侧流免疫层析分析，或微流控测试，或比色测试，或免疫印迹。
本文公开的方法应该与临床参数一起使用。犬尿氨酸的相对值可以优选与其他临床参数一起解释。本发明实质上有助于诊断的预后值。本发明的方法通过将待诊断患者体内测得的犬尿氨酸值与从未患该疾病的可比较人群中获得的平均值进行比较而得到改进。
在另一个实施方案中，本发明提供了犬尿氨酸作为生物标志物在由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外检测中的用途。
根据另一个优选的实施方案，作为炎症生物标志物的犬尿氨酸的水平在血清中为至少3μM，在唾液中为至少1μM，在CSF中为至少1μM。
在另一个主题中，本发明提供了测试试剂盒，利用该试剂盒，通过使用本发明的方法来确定体液中犬尿氨酸的水平。这种测试试剂盒包括用于实施本发明方法的合适工具，其可以不同的原理工作。可以使用检测犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生物的存在的特定的有色试剂。或者，试剂盒可以包含至少一种或优选两种特异性结合犬尿氨酸的抗体。优选地，当使用两种抗体时，这些抗体不结合相同的表位，以允许形成由第一抗体、犬尿氨酸或其衍生物和第二抗体形成的夹心。
根据一个优选的实施方案，测试试剂盒是ELISA测试试剂盒，或侧流免疫层析分析测试试剂盒，或微流控测试试剂盒，或比色测试试剂盒或免疫印迹测试试剂盒。
根据另一个优选的实施方案，测试试剂盒中使用的体液是血清、唾液或CSF。在一个特别优选的实施方案中，所述体液是唾液。
本文公开的体外方法可以基于不同的原理。一种优选的原理被称为侧流免疫层析分析。当唾液用作样品时，这种侧流免疫层析分析可以由患者容易地进行，而无需医生或其他受过医学训练的人的帮助。
侧流测试，也称为侧流免疫层析分析，是简单的装置，用于检测目标分析物样品的存在(或不存在)，而不需要专门和昂贵的设备，尽管存在许多由读数设备支持的基于实验室的应用。通常，这些测试用于家庭测试、床旁测试或实验室使用的医学诊断。广泛普及和众所周知的应用是家庭怀孕测试。该技术基于一系列毛细管床，如多片多孔的纸或烧结聚合物。这些元件中的每一个都具有自发输送流体(例如唾液)的能力，第一元件(样品垫)充当海绵并容纳过量的样品流体。一旦被浸透，流体就迁移到第二元件(结合物垫)，在该第二元件中，制造商已经储存了所谓的结合物，其是存在于盐-糖基质中的干燥形式的生物活性颗粒，该基质包含一切物质以保证靶分子和已经固定在所述颗粒表面上的其化学伴侣之间的优化的化学反应。当样品流体溶解所述盐-糖基质时，它也溶解所述颗粒，并且在一个组合输送动作中，样品和结合物在流过多孔结构时混合。以这种方式，分析物结合到颗粒上，同时进一步迁移通过第三毛细管床。这种材料有一个或多个区域(通常称为条带)，其中制造商已经固定了第三种分子。当样品-结合物混合物到达这些条带时，分析物已经结合在颗粒上，并且第三“捕获”分子结合复合物。一段时间后，当越来越多的液体通过条带时，颗粒会积聚，条带区域会变色。通常至少有两个条带：一个(对照)捕获任何颗粒，从而显示反应条件和技术工作良好，第二个包含特定的捕获分子，并且仅捕获那些其上已经固定了分析物分子的颗粒。在通过这些反应区之后，流体进入最终的多孔材料，即芯材，其仅是充当废物容器。侧向流动测试可作为竞争性或夹心分析进行操作。
原则上，可以使用任何有色的颗粒，然而，乳胶(蓝色)或纳米大小的金颗粒(红色)是最常用的。由于局部表面等离子体共振，金颗粒呈红色。也可以使用荧光或磁性标记的颗粒，但是这些需要使用电子阅读器来评估测试结果。
样品首先遇到有色颗粒，这些颗粒用针对目标分析物的抗体标记。测试线也将包含针对相同目标的抗体，尽管它可能结合到分析物上的不同表位。在阳性样品中，测试线将显示为一条有色条带。虽然不是严格必需的，但是大多数测试试剂盒优选地结合了第二条线，该线包含结合游离乳胶/金的抗体，以便确认测试已经正确操作。
在一个优选的实施方案中，侧流分析的单个组分以这样一种方式进行调整，即只有当样品中存在超过一定阈值的犬尿氨酸时，才表明犬尿氨酸的存在。
在另一个实施方案中，本发明的体外方法作为ELISA，酶联免疫吸附测定来进行。已知有不同的ELISA测试配置。ELISA类型有直接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA和/或反向ELISA。
通常，进行所谓的夹心ELISA。在这样的ELISA测试中，与分析物特异性结合的化合物被固定在固体表面上(例如，微量滴定孔的底部)。非特异性结合位点被饱和(例如，用脱脂奶粉)以避免非特异性结合。通常，几个微量滴定孔涂有该组分，以允许容易地稀释样品，用于测定分析物的含量。
分析物与相关孔的结合通常用另一种抗体检测，然而，该抗体与目标分子的另一区域结合，以避免结合的负面干扰。这种抗体通常与信号产生工具偶联，该信号产生工具可以是例如类似辣根过氧化物酶的酶。然后，通过添加前体分子可以观察到待检测的分析物的存在，该前体分子被信号产生分子转化为具有不同特性的另一种分子。当例如在一个孔中存在犬尿氨酸时，抗体与该分子结合，并且在信号产生工具(例如辣根过氧化物酶)的作用下产生颜色信号，其强度与结合的靶分子的量成比例。可以定量地测量反应，并且可以精确地确定体液中待检测的分析物的量。
优选的测试试剂盒由以下成分组成:
1.样品垫—吸收垫，测试样品被施加到其上
2.结合物或试剂垫—这包含对与有色颗粒(通常为胶体金颗粒或乳胶微球)结合的目标分析物有特异性的抗体
3.反应膜—通常为疏水性硝酸纤维素或醋酸纤维素膜，抗目标分析物抗体被固定到所述膜上，成为横跨膜的线，作为捕获区或测试线(也可能存在对照区，其含有对结合抗体特异的抗体)
4.芯材或废物贮器—另一吸收垫，其被设计用于通过毛细管作用将样品吸过反应膜并收集它。
条带的组分通常固定在惰性背衬材料上，并且可以以简单的试纸条形式提供或置于具有样品口和显示捕获区和对照区的反应窗口的塑料壳内。
在本发明的另一个实施方案中，通过显色反应进行犬尿氨酸或其衍生物的测定。在测定犬尿氨酸或其衍生物的含量之前，必须去除可能对正确和精确的测试结果产生负面影响的成分。可能干扰正确测试结果的所述不需要的样品成分优选通过沉淀去除。这种沉淀可以优选通过使用三氯酸来进行。然而，除了使用三氯酸之外，还可以使用其他方法来对样品组分进行脱蛋白。通过沉淀去除样品中的干扰成分后，可能需要通过离心分离各相。然后，优选使上清液与显色试剂反应，该显色试剂优选为Ehrlich试剂。显色后，通过测量合适波长的吸光度来测量样品。优选地，该测试以定量或半定量的方式进行。在测试方法中，可以使用校准曲线，或者在测试试剂盒中固定某个阈值，以避免假阳性结果。
在又一个实施方案中，所述体外测试方法是微流控测试。所述测试可用于在纸上进行ELISA或LFA测试。该测试包括两个部分：包含活性感测区域的滑动条，和围绕滑动条的结构，该结构容纳储存的试剂，如缓冲液、抗体和酶底物，并分配流体。进行所述测试包括加入体液和水的样品，在预定的时间移动滑动条，并以目测方式或使用平板扫描仪分析感测区域中产生的颜色。
在另一个实施方案中，所述体外测试方法是免疫印迹。免疫印迹的基本原理是将确定的抗原空间分离地固定(印迹)在由塑料或玻璃纤维制成的易于处理的载体基质上，施加样品并检测针对相应抗原的结合的、特异性的抗体。抗原通常根据大小分别使用。免疫印迹最古老的形式是蛋白质印迹，其中抗原预先通过电泳分离，然后转移到膜上。此外，点印迹和槽印迹作为一种免疫印迹进行。
在实践中，已经建立了免疫印迹，其中通过工业印刷过程将确定的抗原量施加到塑料条上，其可以在实验室中立即用于抗体检测。这种类型的免疫印迹也被称为线印迹。线印迹的优点,除了检测特异性抗体结合之外，还在于通过应用对照抗原控制工作步骤，并可以检测针对典型非特异性结合蛋白的反应。完全不同的病原体的抗原也可以出现在线印迹上(多重方法)，因此能够同时检测。
另一种形式的免疫印迹用于快速测试程序(床旁测试，POCT)，其中抗原固定在吸收基质上，样品(同时还有用于抗体结合的检测试剂)通过毛细管力移动通过固定的抗原(免疫层析(ICT)、侧流测试(LFT)或侧流分析(LFA))。
附图说明
图1显示了犬尿氨酸途径的示意图，这是高等真核生物中色氨酸降解的主要途径。酶用斜体表示。
图2显示了唾液(x轴)或血清(y轴)中以μM为单位测量的犬尿氨酸浓度的相关性。
图3显示了正常对照(n＝302)与在早期急性期的COVID-19患者(第1周，n＝85)的犬尿氨酸水平。差异非常显著(p<0.001)。
图4显示了的不同感染实体与长期COVID疾病的比较。各种感染(包括肺炎、尿路感染和严重伤口感染)与长期COVID早期患者之间存在显著差异(p<0.027)。接受免疫抑制药物治疗的肾移植后CMV再激活/疾病患者(n＝34)也显示犬尿氨酸水平升高，但与长期COVID患者相比显著降低。
图5显示了正常对照(n＝302)和急性COVID-19感染患者(n＝9)的血清和唾液中犬尿氨酸的测量结果。COVID-19+中的两个值(血清和唾液)都显著更高(p<0.001)。
图6显示了COVID-19+患者随访中血清中犬尿氨酸的比较，其中有(n＝9)或没有(n＝28)现存的长期COVID。患有该综合征的患者目前正在接受治疗管理。
图7显示了在COVID-19感染后和患有长期COVID的患者中CRP测量的随访。可以看出，CRP不是患有长期COVID的患者随访的有用生物标志物。
图8显示了在阳性PCR检测后第3个月在血清中测量的犬尿氨酸水平：治愈或患有长期COVID综合征3个月或超过5个月。犬尿氨酸仍然显著升高，而治愈患者的值在正常范围内。
图9显示了研究中包括的三组不同患者(A、B和C)的人口统计学和生物化学数据。群组A代表未被SARS-CoV-2感染的正常对照患者。群组B代表处于疾病急性期的长期COVID患者，其在感染病房或ICU接受治疗。群组C代表诊断为长期COVID疾病的患者。所有三个群组在年龄和性别分布上具有可比性。犬尿氨酸在正常对照与急性COVID-19和长期COVID患者之间存在显著差异。
N＝接受测试的人数
n.s.＝无显著差异
n.a.＝不可用
n.d.＝未确定
通过以下实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例不限制本发明的范围。
实施例1
用于检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的犬尿氨酸测试。
1.1比色分析的通用技术
通过几十年来已知的颜色反应，可以在生物流体中定量测定通过犬尿氨酸产生的色氨酸代谢物。通常，通过形成有色反应产物的检测方法可以通过标准方法进行。
酶标仪是被设计用于检测微量滴定板中样品的生物、化学或物理事件的实验室仪器。它们广泛用于制药和生物技术行业及学术组织的研究、药物发现、生物测定验证、质量控制以及制造过程。可以在6-1536孔格式微量滴定板中分析样品反应。学术研究实验室或临床诊断实验室中使用的最常见的微孔板形式是96孔(8×12矩阵)，每个孔的典型反应体积在100和200μL之间。
微孔板分析的常见检测模式有吸光度、荧光强度、发光/时间分辨荧光和荧光偏振。吸光度检测在酶标仪中使用已有30多年的历史，用于ELISA分析、蛋白质和核酸定量或酶活性分析等分析。光源使用特定波长(由滤光器或单色仪选择)照射样品，位于孔另一侧的光检测器测量有多少初始(100％)光透过样品：透过的光量通常与目标分子的浓度有关。
1.2.测试的说明
本测试是作为一种改良方法开发的。
通常在每周一、周三和周五上午7:00至8:00点之间抽取患者(n＝9)的唾液用于检测COVID-19抗体的PCR分析。测量抗体后，将剩余的唾液储存在-30℃下，并作为纵向整体犬尿氨酸测量的集合。
制备了显色试剂，还制备了犬尿氨酸标准溶液的稀释液。用产生黄色的所谓的“Ehrlich-Reagenz”进行颜色反应。包含溶解在20％ HCl中的2重量％二甲基氨基苯甲醛的溶液被命名为“Ehrlich-Reagenz”。所述显色剂也用于检测伯氨基、吡咯和吲哚衍生物。用单色光进行浓度的比色测定。用L-犬尿氨酸硫酸盐制备犬尿氨酸标准溶液。
将等量的样品与100μl三氯乙酸(30％)充分混合。离心后，测量上清液。将每个样品在492nm处的吸光度与同一样品在650nm或690nm处的吸光度进行比较。然后从每个孔的吸光度中减去对照(5个孔的平均值)的吸光度。通过绘制标准曲线，可以确定每个样品中犬尿氨酸的浓度。
实施例2
血清犬尿氨酸的值测定如下：
用于患者常规监测的血液通常在每周一、三、五上午7:00至8:00抽取。常规参数测量后，剩余的血清储存在-30℃，作为纵向整体犬尿氨酸测量的集合。
血清中犬尿氨酸水平的测定如实施例1.2所述进行。
如前所示，在血清和唾液中犬尿氨酸的测量之间存在线性相关性。关系是3，3(血清):1(唾液)(图2)。
统计分析：
使用描述性数据分析和方差分析方法来表征数据。所有的p值都是双侧的，被认为是描述性的。对于描述性显著性的正式声明，假设名义I型误差水平为α＝0.05(双侧)。
进行精确的Mann-Whitney U检验用于具有非正态分布的连续变量的两组的比较。
结果：
在一项试点研究中，分析了群组(A)正常对照患者(n＝302，年龄范围：18-75岁，平均47.1岁；性别144女/158男)，和第二群组(B)患者(n＝85，年龄范围：19-90岁，平均63.1岁；性别27女/58男)，其在感染病房(n＝67)或ICU(n＝18)接受治疗。
第三群组(C)患者(n＝66，年龄范围:17-90岁，平均66.6岁；性别22女/44男)在ICU(n＝6)或普通病房(59)接受治疗。这组患者主要作为研究长期COVID的概念证明的一部分进行研究。患者PCR阴性，在ICU(n＝6)或普通病房(n＝59)正在撤除呼吸机(weaning)。
在一组n＝85的感染COVID-19的患者中，(平均年龄52.8+30岁)，本发明人首先评估了血清中的犬尿氨酸，随后也评估了唾液中的犬尿氨酸(n＝9)。与正常对照组(群组A，n＝302)相比，COVID-19患者(群组B，n＝85)的犬尿氨酸显著升高(10.81+8.8μM vs.2.5+0.4μM；p<0.001)(图3)。群组B中的样本在开始治疗的第一周采集。为了更好的图示说明，排除了COVID-19+组(58和43M)的两个结果，其具有过度炎症综合征。
与其他类型的感染相比，如巨细胞病毒(CMV)、再活化/疾病或细菌感染，每个实体都有典型的犬尿氨酸升高范围。所有范围都有显著差异。CMV和COVID-19这两种类型的病毒感染都显示出犬尿氨酸水平的显著上升，在COVID-19组中更加明显。仅在COVID-19患者中发现了具有异常高水平犬尿氨酸的过度炎症图片(高达57.91μM，为了更好的图示说明，未显示)(图4)。
不仅在血清中测量犬尿氨酸。在图5中，发明人比较了在血清或唾液中测量的正常对照和COVID-19+患者(n＝9)的犬尿氨酸的测量值。其可以表明，与没有SARS-CoV-2感染的个体(正常对照)中的犬尿氨酸水平相比，COVID-19+患者的血清和唾液中的犬尿氨酸水平都增加了。
在对诊断为长期COVID的初始患者组(n＝9)的随访中，发明人可以证明从第2个月到第4个月，与正常对照组相比，犬尿氨酸水平持续升高(图6)。这在CRP中没有发现(图7)。比较了9名具有长期COVID体征的患者和28名COVID-19+感染后没有长期COVID体征的患者。此外，超过5个月后，长期COVID患者的犬尿氨酸水平仍然升高(图8)。
文献中描述的CRP是COVID-19患者的一个良好的生物标志物，但在本研究中并不能用于确定长期COVID。COVID-19阳性检测后2个月的CRP接近正常(正常范围>5mg/L或5μg/ml)(图7)。
COVID-19+患者(n＝9)中的犬尿氨酸可以在唾液中另外测量，并显示出可比较的结果(图5)。受病毒感染影响的患者的犬尿氨酸水平具有可比性(CMV vs.COVID-19)(图4)。
总之，本发明可以证明，犬尿氨酸可用作COVID-19病症的生物标志物，因此，它是检测由急性COVID-19、长期COVID和/或PIMS引起的炎症并对其进行监测的有用生物标志物。犬尿氨酸能够描述SARS-CoV-2病的炎症和过度炎症特征。本发明进一步表明，犬尿氨酸能够检测在长期COVID中观察到的慢性亚临床全身性炎症。这也表明犬尿氨酸可用于治疗监测。
此外，如本发明所示的与急性COVID-19感染、长COVID和PIMS有关的唾液中的犬尿氨酸的测量，首次为病人的自我监测和一种治疗控制提供了机会。

Claims (15)

1.一种用于检测由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外方法，其中测定体液中犬尿氨酸的水平，并且其中将待诊断患者中测量的犬尿氨酸的值与从未患有所述疾病的可比人群中获得的平均值进行比较，其中患者中的犬尿氨酸的值是增加的。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其中体液中犬尿氨酸的测定用于治疗控制。
3.根据权利要求1所述的体外方法，其中体液中犬尿氨酸的测定用于监测急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS和/或患者的恢复。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其中所述体液为血清、唾液或脑脊液(csf)。
5.根据权利要求4中任一项所述的体外方法，其中所述体液是唾液。
6.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其中患者中犬尿氨酸的水平比对照组中高至少两倍。
7.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，急性COVID-19感染是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的传染性疾病。
8.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，长期COVID是一种以在COVID-19病的典型恢复期之后持续存在或出现的长期后果为特征的疾病。
9.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，PIMS是一种全身性儿科疾病，涉及暴露于SARS-CoV2后的持续发热和极度炎症。
10.根据前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述体外方法是ELISA测试，或侧流免疫层析分析，或微流控测试，或比色测试，或免疫印迹。
11.犬尿氨酸作为生物标志物在由急性COVID-19感染、长期COVID和/或PIMS引起的炎症的体外检测中的用途。
12.权利要求11所述的犬尿氨酸的用途，其中犬尿氨酸的水平在血清中为至少3μM，在唾液中为至少1μM，在CSF中为至少1μM。
13.一种测试试剂盒，使用所述测试试剂盒通过使用根据权利要求1至10中任一项所述的方法测定体液中犬尿氨酸水平。
14.根据权利要求13所述的测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒是ELISA测试试剂盒，或侧流免疫层析分析测试试剂盒，或微流控测试试剂盒，或比色测试试剂盒或免疫印迹测试试剂盒。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的测试试剂盒，其中所述体液为血清、唾液或脑脊液(csf)。
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