CN116904575A - 与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途。本发明首次发现弧菌属Vibrio可作为矽肺患者体能衰退的诊断标志物，具有较好的诊断效能，AUC值高达0.938，具有准确性高、敏感性高、特异性高等优点，可用于矽肺患者体能衰退的早期诊断或辅助诊断中。

Description

与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学和分子生物学技术领域，具体而言，涉及与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途。
背景技术
矽肺是尘肺的一种常见类型，是一种与职业有关的纤维化肺疾病，通常是职业暴露于可吸入的晶体二氧化硅和有害粉尘引起的。晶体二氧化硅是沙土的一种常见成分，所以职业暴露主要发生在建筑和石材加工行业。当可吸入的晶体二氧化硅被吸入时，会引发炎症过程并产生活性氧，从而导致纤维化和癌变。矽肺具有进行性、不可逆、不可治愈的特点，重症矽肺的治疗选择仍然十分有限，这给医疗领域造成了巨大的医疗负担。
体能衰退是矽肺的主要症状，它严重影响患者的工作效率和生活质量，已成为全球范围内严重的职业病健康危害。因为矽肺患者的体能衰退可能是由于肺功能程度、气体交换障碍或放射学改变的程度造成的。因此，区分有体能衰退的矽肺患者和无体能衰退的患者对于矽肺患者病程以及后续的针对性治疗都具有重要的意义。
生物标志物是生物体内产生的具有特定特征或变化的物质，可以用作诊断、预测、监测和评估生物体的生理状态或疾病风险的指标。生物标志物可以是分子、细胞、组织、细菌、真菌或整个生物体产生的物质，其变化可以与疾病发展、治疗效果、药物代谢等相关联，因此可以用于诊断和监测疾病，评估治疗效果，并指导个体化的治疗策略。已有研究表明，肺细菌和真菌在维持肺内稳态中的重要作用，它们在矽肺的发展中也可能是至关重要的，但是目前还未有细菌群或真菌群与矽肺患者有无体能衰退症状的相关性的报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途，本发明的微生物标志物预测矽肺患者体能衰退的灵敏性好，只需要获取微生物标志物的相对含量，作为协助诊断，指导微生物环境的调整，改善矽肺患者体能衰退状态。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了检测样本中生物标志物丰度的试剂在制备用于诊断矽肺患者体能衰退的产品中的应用，其中微生物标志物包括弧菌属Vibrio。
在一些实施例中，上述样本为支气管肺泡灌洗液(BALF)。
在一些实施例中，上述试剂包括16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测样本中生物标志物的含量或丰度的试剂。
在一些实施例中，上述试剂包括对生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体。
在一些实施例中，上述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。
第二方面，本发明还提供了用于预测或诊断矽肺患者体能衰退的产品，诊断产品包括检测受试者样本中生物标志物的含量或丰度的试剂，生物标志物包括弧菌属Vibrio。
在一些实施例中，上述试剂包括16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测受试者样本中生物标志物的含量或丰度的试剂。
在一些实施例中，上述试剂包括对生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体。
在一些实施例中，上述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。
第三方面，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的药物组合物，该药物组合物中包含能够降低弧菌属Vibrio含量或丰度的物质。
第四方面，本发明还提供了一种筛选预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物的方法，其包括如下步骤：
用待筛选物质处理表达或含有弧菌属Vibrio的体系，检测体系中弧菌属Vibrio的含量或丰度，其中，若待筛选物质可以降低弧菌属Vibrio的含量或丰度，则表明该待筛选物质为预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物。
第五方面，本发明还提供了生物标志物弧菌属Vibrio在筛选预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现微生物标志物弧菌属Vibrio可作为矽肺患者体能衰退的诊断标志物，具有较好的诊断效能，AUC值高达0.938，具有准确性高、敏感性高、特异性高等优点，可用于矽肺患者体能衰退的早期诊断或辅助诊断中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为有无体能衰退的矽肺患者的BALF细菌群概况(体能衰退vs未体能衰退，n＝81)；A-E:α多样性分析；图1A：Chao指数、图1B：ACE指数、图1C：Sobs指数、图1D：Shannon指数、图1E：Simpson指数；图1F:门水平的Venn分析；图1G:属水平的Venn分析；图1H:门水平的Circus分析；图1I:属水平的Circus分析；图1J:属水平的PCA分析；图1K:属水平的PCoA分析；图1L:从门到属的LEfSe分支图；图1M:门水平的LEfSe分析；图1N:属水平的LEfSe分析。
图2为有无体能衰退的矽肺患者的BALF菌群分布图(体能衰退vs未体能衰退，n＝100)；A-E:α多样性分析；图2A ：Chao指数、图2B：ACE指数、图2C：Sobs指数、图2D：Shannon指数、图2E：Simpson指数、图2F：门水平的Venn分析；图2G：属水平的Venn分析；图2H：门水平的Circus分析；图2I：属水平的Circus分析；图2J：属水平的PCA分析；图2K：属水平的PCoA分析；图2L：LEfSe从门到属的分支图；图2M：LEfSe在门水平的分析；图2N：LEfSe在属水平的分析。
图3为PICRUSt2对有无体能衰退的矽肺患者的预测分析(体能衰退与无体能衰退，n＝81)；PICRUSt2是一个从标记基因(一般为16S rRNA)测序数据预测功能丰度的软件。所做图形为小提琴图，可以用来展示多组数据的分布状态及概率密度，由内部的箱线图与外部的核密度图组成，某区域图形的面积越大即代表某个值附近分布的概率越大。图中红色代表有体能衰退患者，绿色代表无体能衰退患者。横坐标分别为β-葡糖苷酶、NADPH及NADH。
图4为根据ROC分析，与体能衰退有关的特定细菌标记(g-vibrio)的分类能力；ROC曲线图反映了敏感性与特异性之间的关系，横坐标为特异性，纵坐标为敏感度。X值越大Y值越大准确率越好。曲线下方的面积称为AUC，用于表示预测的准确性，AUC值越高代表预测的准确性越好。图4曲线非常靠近左上角，说明与体能衰退有关的特定细菌标记(g-vibrio)具有较强的分类能力。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在临床上，矽肺患者的体能衰退是由患者主观陈述，临床医生根据专业量表判定，由于量表的结果会受病人情绪、所处社会、家庭、医疗等环境以及医生的人为判定等因素影响，容易波动，不太稳定，所以其判定的结果会存在误差，因此亟需提供一种稳定可靠且客观的判断方法用以辅助医生判断患者的体能衰退的严重程度，进而对患者进行针对性的治疗。
本发明的发明人在试验过程中发现，矽肺体能衰退患者和矽肺非体能衰退患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细菌和真菌群会改变β多样性，特别是弧菌属Vibrio，其在矽肺体能衰退患者和矽肺非体能衰退患者中呈现显著性差异，说明弧菌属Vibrio可作为矽肺患者体能衰退症状的预测因子。
基于此，本发明提供了检测样本中生物标志物丰度的试剂在制备用于诊断矽肺患者体能衰退的产品中的应用，具体地，该生物标志物为弧菌属Vibrio。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本发明中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明所用的术语“支气管肺泡灌洗液”是指利用纤维支气管镜，对肺段和肺亚段灌洗后所采集到的肺泡表面衬液。收集后可行细胞学、可溶性物质、微生物和寄生虫的检查，以及生物化学和免疫检测，对下呼吸道疾病的诊断、病情观察和预后判断有重要价值。
本发明所用的术语“丰度”是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。一般通过分子方法，典型地通过例如荧光原位杂交(FISH)、定量聚合酶链反应(qPCR)或PCR/焦磷酸测序测定目标微生物的16S rRNA基因拷贝数，进行细菌定量。
在本发明中，检测受试者样本中生物标志物的含量或丰度的试剂可以是引物，利用引物的序列扩增的方法可以是例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、降落PCR、热启动PCR、巢式PCR、增效PCR、实时PCR、差示PCR、cDNA末端快速扩增、反向聚合酶链式反应、载体介导PCR、热不对称交错PCR、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制、目标碱基序列的选择性扩增反应。
在本发明中，术语“引物”是能够形成与模板链互补的碱基对，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。
在本发明中，检测受试者样本中生物标志物的含量或丰度的试剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA，enzyme linkedimmunosorbentasay)、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation assay)、补体结合分析法(ComplementFixation Assay)、荧光活化细胞分选器(FACS，Fluorescence activatedcell sorter)、蛋白芯片(protein chip)等，上述方法只是对抗体-抗原免疫反应的说明，本发明不限于上述方法。
本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的矽肺体能衰退。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例为筛选与矽肺体能衰退相关的菌群
1、研究对象和样本收集
本实施例的研究人群包括经《职业性尘肺诊断》(GBZ70-2015)临床指南确诊为矽肺的男性，主要来自四川核心区。
本实施例参与者的纳入标准为：1)医生诊断为矽肺的成年男性工人；2)计划进行肺灌洗治疗。
本实施例参与者的排除标准为：1)在4周内使用过抗生素或；2)构建的文库不适合测序，则排除该参与者。
本实施例采用问卷调查的方式来收集参与者的基本信息和健康状况。将2019至2020年全国唯一的三级职业病医院-华西第四医院的连续10例矽肺患者纳入了本实施例。其中一半的患者出现了体能衰退，而另一半则没有。
体能衰退的诊断标准：参考文献Jacobson DNO,Lowing K,Tedroff K.Health-related quality of life,pain,and fatigue in young adults with cerebralpalsy.Dev Med Child Neurol 2020；62:372-8。
纳入标准：患者明确诊断为矽肺体能衰退，符合以上诊断标准。
本实施例中不包含非矽肺对照组的原因在于，在健康人中进行肺灌洗的申请在这项试点研究中并未获得伦理批准。此外，矽肺是由吸入工业硅尘引起的间质性肺疾病。全肺灌洗是清除肺部外源性灰尘、炎症因子和促炎细胞的有效治疗方法。其他由药物、自身免疫、放射治疗(射线)引起的间质性肺疾病，并非由外源性粉尘引起，因此很少采用全肺灌洗。同时，其他种类的BALF样本可能不是来自大容量肺灌洗液(20L)。如果作为本研究的对照，由于肺灌洗操作的差异，其可比性不强。
而采用10例矽肺患者获得BALF标本共100份的原因是：在微生物群研究中，同质性对于帮助控制混杂因素并提高结果的精确度非常重要，因此在本实施例中尽量选择同质的、同一阶段的慢性矽肺患者。换而言之，没有多少同质性矽肺患者能够满足纳入和排除要求。
四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院伦理委员会批准了本研究(IRB号:HXSY-EC-2020073)。所有的受试者在肺灌洗前已签署知情同意书。机构审查委员会放弃了对于本次研究的书面知情同意书要求。参与者信息已被充分匿名化。患者之间和其他人都无法知晓患者。从华西第四医院连续采集10例符合纳入要求的矽肺患者的BALF标本共100份。患者基本信息见表1、2、3。
表1患者基本信息与症状
表2患者血常规鉴定结果
表3患者血生化鉴定结果
注：1,wofatigue:矽肺患者没有体能衰退；2、fatigue:矽肺患者体能衰退；3:all:十个病人；4,秩和检验,当P值<0.05。
从每个样品中随机选择了30,981个和67698个合格的读数进行细菌区系和真菌区系分析。最终获得2509461(30981读数/样本×81)和6769800(67698读数/样本×100)个扩增子序列变异体(ASV)用于细菌和真菌群分析。
将患者全身麻醉后，由专科医生进行肺灌洗。每肺用1L无菌生理盐水于37℃条件下冲洗10轮。每轮从左肺收集600mL灌洗液。将样品置于冰上并在一小时内运送到实验室。每份样品在50mL离心管中于4℃条件下以13,000g离心2min。然后将沉淀物储存于-80℃条件下。
2、DNA提取
按照制造商的说明，使用Zymo细菌/真菌DNA Mini Prep试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA，USA)提取总基因组DNA样品，并储存于-80℃条件下待下一步分析。分别使用NanoDropND-1000分光光度计(ThermoFisher Sciential,Waltham,MA,USA)和琼脂糖凝胶电泳测定提取的DNA的数量和质量。
3、细菌、真菌菌群的文库构建、测序与分析
用条形码338F:5'-actcctacggggaggcagca-3'和806R:5'-ggactachvggggtwtctaat-3'扩增16SrRNA基因。用条形码ITS1扩增ITS1基因5F:5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'和ITS12R:5'-gctgctttctcatcgatgc-3'。根据先前的研究构建DNA文库。扩增子在Illumina Novaseq PE250(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)平台上汇集和测序。用集成管道处理测序数据以用于生物信息学分析。
4.生物信息学分析
(1)下机数据清理及注释
数据处理：
使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7)软件进行拼接：
(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；
(2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
使用UPARSE软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva16S rRNA数据库(version 138)，设置比对阈值为70％。
(2)物种组成分析
物种组成是指构成一个群落的所有物种。生物的变异是由结合引起的，如基因重组及染色体的结合。一个新的物种是通过组合发生的，相同的物种组成种群，而不同的物种组成在一起就成了群落，所以物种组成是区别不同群落的重要特征。组合始终贯穿于整个生物进化的过程中，物种的形成离不开组合，组合创造了物种。本研究物种组成分析包括Venn图、物种相对丰度柱形图等。Venn图(Venn diagram)用于展示不同事物群组之间的联系，通过统计多个样品中所共有和独有的OTU数目，可以比较直观地表现环境样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。分析时一般使用97％相似度的OTU，R语言工具统计和作图。
根据物种丰度表和物种注释表，选取丰度最高的物种分类，进行相对丰度计算，获得相对丰度文件，绘制丰度比较的柱状图，该柱状图以堆叠柱状图的形式呈现，可以更直观地进行样品丰度的比较。结果图横轴为样品名称，纵轴代表某分类的相对丰度，不同颜色对应同一层次的不同物种，通过柱状图可以明析每个样本高表达物种组成，同时也可以观察组内物种表达趋势。
(3)α多样性分析(Alpha diversity analysis)
阿尔法多样性(α-多样性)是指在一个区域尺度内不同地点或生境中物种的平均多样性。这个术语是由Robert Harding Whittaker创造的。他同时创造了如β多样性(β-多样性)和γ多样性(γ-多样性)等其他相关术语。阿尔法多样性被认为是分析社区调查的一种基础方法，因为有许多扰动可以影响阿尔法多样性。在微生物生态学方面，分析扩增子测序数据的α多样性是常见的评估微生物环境差异的第一步。物种丰富度即一个地区存在的物种或操作分类单位的数量，是α多样性的最简单的衡量标准。使用八度曲线图时，分布的丰富度是清晰明显。α多样性已经被几个生态学家给出了不同的定义。这些不同的定义可能受到不同物种多样性假设的影响。这就是为什么大多数研究人员一直在利用一个以上的多样性指数的原因。
Chao Index有两种类型：Chao 1和Chao 2。Chao 1是基于丰度的估计量。因此需要涉及属于某一类别的单个样本的丰度的数据。而Chao 2是基于关联度的估计量，因此需要指定样品中物种的存在或不存在的数据。Simpson指数是个体被划分成类时集中程度的量度。Simpson指数等于从感兴趣的数据集中随机取出的两个实体代表相同类型的概率，或者等于微生物NGS中α多样性度量的使用和类型。Shannon index也称为香农多样性指数或香农熵，是生态学文献中流行的多样性指数之一。这个度量的思路是，存在的不同字母越多，并且它们在感兴趣的字符串中的比例丰度越相等，预测哪个字母将是字符串中的下一个字母就越困难。香农多样性指数量化了从数据集中随机抽取的个体在预测物种身份时的不确定性。ACE指数是基于丰度的覆盖率估计，是一种多样性度量，其涉及任意丰度阈值，用Sabun标记丰度分类群的数量，用Srare标记稀有分类群的数量。Good's Coverage Index是另一种alpha多样性估计量。
(4)β多样性分析(Beta diversity analysis)
主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)是用于多元分析的两种主要数学程序或排序技术。PCA和PCoA可用于导出个体的2维或3维散点图。图中个体间的几何距离以最小失真度反映了个体间的遗传距离。在这样一个图中，个体的聚集将揭示基因相似个体的集合。PCA被定义为“一种数据简化的方法，以澄清两个或多个特征之间的关系，并将原始特征的总方差划分为有限数量的不相关的新变量”。这使得个体之间的差异变得可视化，并确定可能的群体。这些减少是通过将原始变量线性转换为一组新的不相关的变量，即主成分来实现的。主成分分析的第一步是计算特征值，它定义了在PC轴上分布的总变化量。第一个PC总结了原始数据中相对于所有剩余PC的大部分变化。第二个PC解释了第一个PC没有总结的大多数，与第一个PC没有关联，以此类推。由于每个PC是正交的，相互独立的，每个PC揭示了原始数据的不同性质，因此可以独立解释。这样，原始数据集的总变化就可以被分解成累积的组件。每个PC所占的变化比例就表示为特征值除以特征值的和。特征向量定义了PC与原始数据轴之间的关系。
可以对两种类型的数据矩阵执行PCA：方差-协方差矩阵和相关矩阵。对于不同尺度的特征，优选标准化原始数据集的相关矩阵。如果特征是相同尺度的，则可以使用方差-协方差矩阵。在使用这两种类型的矩阵时，必须考虑到方差-协方差矩阵可以研究个体之间的绝对变化。但是，对于相关矩阵，只有相对于标准化数据的差异才能解释。
主成分分析也可以用来确定研究中的最佳聚类数。在这种情况下，目标是最大化每个聚类的第一个PC所解释的变异。第二特征值可以被设置为0.75，以确定第一PC解释了大部分变化，PCoA是一种标度或排序方法，其从一组个体之间的相似性或相异性矩阵开始，旨在产生一个低的将数据进行三维图形化处理，使图中点之间的距离接近原始的离散度，因此，PCoA的相似性或不相似性的起始点矩阵不同于PCA，PCA是从初始数据矩阵开始的(例如，在分子标记数据中等位基因的存在与不存在)。当存在相对较少的字符并且没有缺失数据时，PCA和PCoA的输出将是相似的。然而对缺失数据的处理，PCoA比PCA更令人满意。在PCA中，当计算分析输入矩阵时，每个缺失值只会简单地用相应字符或标记的平均值代替。因此，使用PCA时，具有大量缺失数据的个体可以更接近于组的质心而被分组。为了克服PCA中缺失数据的问题，两个个体之间的系数应单独计算，而仅使用已记录的两个个体的特征。当有大量缺失数据以及当个体数少于字符数且当前两个或三个主成分解释了大部分变异时，主成分分析和主坐标分析就成为通过散点图表示对个体进行分组的有用技术。在主成分分析或主坐标分析中，当原始数据不是高度相关时，前几个主成分通常不能解释原始变异的很多内容。在这种情况下，根据前两个或三个主成分来评估遗传关系可能导致误导性解释。为了避免这种失真，个体间遗传关系的分析应基于能解释最大原始数据变异量的最佳PC数。PC的特征值可用作确定应使用多少PC的标准。特征值〉1.0的PC被认为比单独的任何单个原始变量具有更多的内在信息。
(5)组间物种差异分析
LEfSe(Linear discriminant analysis EffectSize,线性判别分析)即LDAEffect Size分析，是一种发现和解释高纬度数据生物标识(分类单元、通路、基因)的分析工具，可以实现两个或多个分组之间的比较，同时也能进行分组内部亚组之间的比较分析，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种，该分析先使用非参数Kruskal-Wallis秩和检验不同分组间丰度差异显著的物种，再使用Wilcoxon秩和检验分析上一步的差异物种在不同组间子分组中的差异一致性，最后采用线性回归分析(LDA)来估算每个组分丰度对差异效果的影响大小。LDA值分布柱状图中的颜色一般代表对应的分组，柱状图的长度代表差异物种的贡献度大小(LDA score)。
(6)关联分析
本实施例采用Spearman相关性分析法分析菌群多样性与环境因子之间的相关性。Spearman秩相关系数是利用两变量的秩次大小作线性相关分析，对原始变量的分布不做要求，属于非参数统计方法，适用范围十分广泛。若数据无重复值且两个变量完全单调相关时，Spearman秩相关系数则为+1或-1。Spearman相关系数即使出现异常值，由于异常值秩次通常变化不大，对相关性系数的影响也非常小。对于样本容量为n的样本，n个原始数据被转换成等级数据，相关系数ρ为：
5.统计分析
使用R软件(Version 4.1.1,R Core Team,Vienna,Austria)和SPSS(V23.0,SageIBM,Armonk,NY,USA)进行主要统计分析。分类变量采用卡方分析和Fisher精确检验，连续变量采用t检验和Wilcoxon秩和检验。所有试验均为双侧试验，当P值<0.05时被认为有统计学意义。此外，在细菌区系和真菌区系分析中，根据错误发现率(FDR)对P值进行调整。
6、质量控制
样品中的完整核苷酸碱基由测序仪确定，测序仪生成文库中每个片段的短序列或读段。现代测序技术仅在一次实验中生成大量的序列读段，但所有这些都有技术限制。下一代测序会受到文库制备和测序过程中的因素的影响。这可能会对原始数据的质量产生负面影响。每个测序程序都会产生不同数量的错误，例如读取不正确的核苷酸和偏离最佳文库片段大小。例如，宏基因组学处理来自肠道微生物群落的大量文库；因此，一个错误将极大地影响蛋白质功能和特定基因代谢途径的分析。对于有意义的下游应用，序列的质量控制寻求确定和消除错误。这一步帮助研究人员保存了时间，精力和资源。
质量控制方案的程序应在数据处理的不同时间点执行，包括对结果的正确解释，以确保进行的研究有意义。而评估原始测序数据质量和深度、读取重复率和对齐质量是为了提高结果的准确性。快速鉴定质量不佳的样品依赖于控制原始数据的质量。这意味着从一开始就要付出额外的努力，以节省以后分析的时间。校准质量对于识别通过原始数据质量控制检查的低质量样本以及成功的变异检测都是至关重要的。在大多数外显子组测序研究中，对单核苷酸多态性(SNP)读数进行质量控制可以识别不良样品并减少假阳性SNP调用的数量。
例如，NGS数据的质量控制对于不同的实验室来说可能很困难，这些实验室的资源各不相同(例如缺乏执行程序的专业知识)。因此，涉及质量控制的NGS工作流程的标准化和简化是一个核心要求。每个检查点对应于对环境、方案、结果和试剂的谨慎检查。
在测序项目中，有两种不同的设备专门用于QC。首先是毛细管凝胶电泳，研究片段大小分布的调查和最终的文库质量评估。第二个最常用的是荧光计，用于荧光定量。为了在特定的工作流程步骤中准确地定量DNA/RNA并确定最终的文库数量，推荐使用定量PCR(qPCR)或数字液滴PCR(ddPCR)等系统。
在宏基因组学中常见的序列组装和基因表达研究需要高质量的数据。NGS技术支持对样本进行深入分析；然而，它们仍然可能引入误差和偏差的来源。淡化这些来源或进行不良的质量控制可能导致严重的问题，如混淆分析结果和样品污染；这可能削弱任何索赔，并增加生物结果的确定性。
7、结果
针对不同的BALF采样时段分析，然后将第1-10轮BALF样本分为10组。根据本实施例规定的测序深度，共有81份细菌样本及100份真菌样本。
7.1α多样性与群落组成分析
在细菌区系中，体能衰退患者与非体能衰退患者在α多样性方面没有显示出显著差异(图1A-1E)。这两个类群共有31门685属(图1F和1G)。两组具有相同水平的独特门(4对3，图1F)和独特属(309对213，图1G)。Circos分析表明，在门(图1H)和属(图1I)水平上，体能衰退患者和非体能衰退患者的细菌群落组成没有明显差异。
在真菌群中，体能衰退患者与非体能衰退患者在α多样性方面没有显示出显著差异(图2A-2E)。这两个类群共有12门344属(图2F和2G)。两组具有相同水平的独特门(0对1，图2F)和独特属(124对156，图2G)。Circos分析显示，在门(图2H)和属(图2I)水平上，体能衰退患者和非体能衰退患者的真菌群落组成没有明显差异。
7.2β多样性分析
PCA(P＝0.07，图1J)和PCoA(P＝0.001，图1K)。结果表明，有体能衰退和无体能衰退矽肺患者的细菌群落部分分离。PCA(P＝0.02，图2J)和PCoA(P＝0.001，图2K)在真菌群的β多样性分析中也得到了类似的结果。
7.3LEfSe分析
与无体能衰退的矽肺患者相比，体能衰退组中弧菌、粪杆菌和Dialister(图1N)明显富集，梭杆菌(图1M)和红球菌(图1N)明显减少。在真菌群中，有体能衰退和无体能衰退的矽肺病人P-mucoromycota(图2M)、G-ustilaginoidea、G-archeorhizomyces和G-unclassified-F-ceratobasidiaceae(图2N)有显著差异。
7.4功能预测
在京都基因和基因组百科全书(KEGG)分类中，有体能衰退和无体能衰退的矽肺患者之间没有观察到显著差异。然而，在酶学分析中，我们发现体能衰退组β-葡萄糖苷酶(46，842.51±16，170.78比33，881.42±14，172.59)，谷氨酸合成酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，42830.8±8，178.7对36，980.5±12，895.0)和谷氨酸合成酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，42830.8±8，178.7对36980.5±12895.0)高于无体能衰退组(图3)。在真菌群中，有体能衰退和无体能衰退的矽肺患者之间没有观察到酶分析的显著性差异。
7.5受试者工作特征(ROC)分析
为了探讨BALF细菌群在预测体能衰退中的作用，进行了随机森林构建和ROC分析(其中随机从样本中选择50％作为训练集，另50％作为测试集)。
如图4的结果所示，仅弧菌属的丰度就可以区分有体能衰退和无体能衰退的矽肺患者，当弧菌属vibrio作为生物标志物时，其ROC曲线下面积[AUC]＝0.938，95％置信区间[CI]0.870-1.000。证明弧菌属vibrio能够有效区分有体能衰退和无体能衰退的矽肺患者。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物丰度的试剂在制备用于诊断矽肺患者体能衰退的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括弧菌属Vibrio。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本为支气管肺泡灌洗液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测样本中所述生物标志物的含量或丰度的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括对所述生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。
6.一种用于预测或诊断矽肺患者体能衰退的产品，其特征在于，所述诊断产品包括检测受试者样本中生物标志物的含量或丰度的试剂，所述生物标志物包括弧菌属Vibrio。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂包括16S测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列或PCR-ELISA检测受试者样本中所述生物标志物的含量或丰度的试剂；
优选地，所述试剂包括对所述生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体；
优选地，所述产品包括试剂盒、试纸、或芯片。
8.一种用于预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含能够降低弧菌属Vibrio含量或丰度的物质。
9.一种筛选预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：用待筛选物质处理表达或含有弧菌属Vibrio的体系，检测所述体系中弧菌属Vibrio的含量或丰度，其中，若所述待筛选物质可以降低弧菌属Vibrio的含量或丰度，则表明该待筛选物质为预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物。
10.生物标志物弧菌属Vibrio在筛选预防和/或治疗矽肺患者体能衰退的候选药物中的应用。
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