CN116904139A - 植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用，该方法包括马来酰化壳聚糖的制备、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖、加入光引发剂制备植物源壳聚糖基生物粘合剂；应用时将该生物粘合剂注射至生物体伤口出血部位，施加紫外光照射，其迅速交联形成水凝胶，发挥止血和组织封闭功能。本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂上的邻苯二酚基团在生理环境下发生自氧化，无需外来氧化剂作用，可与生物体组织的官能团、与壳聚糖上氨基、羟基及其自身形成各种共价或非共价相互作用，使生物粘合剂的粘附性能和内聚强度提升，具有良好的湿态粘附能力和组织封闭效果。该生物粘合剂还兼具优异的抗菌止血效果、生物相容性以及可生物降解性。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用。
背景技术
在军事、事故或外科手术等的伤口止血应用中，传统缝合线或缝合钉无法覆盖如内脏，骨科，血管等部位出血场景的止血；且传统的外科手术缝合不但复杂费时，缝合材料还容易引起组织发炎、感染化脓、结节增生、创缘裂开或缺血坏死、术后瘢痕等；伤口感染、裂开会增加患者痛苦，影响伤口的愈合，增加患者的经济负担。
生物粘合剂是一种用于止血、防止组织粘连、手术中防止空气和体液泄漏的生物医学材料。发明专利(申请号为CN 200810017038.4)公开了一种生物粘合剂及其应用，该粘合剂的溶质是叠氮苯甲酰基化的生物大分子化合物，溶剂是水、注射用水、生理盐水、林格氏液冲洗液、甘露醇冲洗液、葡萄糖冲洗液、洗必泰冲洗液、庆大霉素生理盐水冲洗液、甘氨酸冲洗液、甲硝唑冲洗液或生理平衡液，该粘合剂可用于生理组织间的粘合。但是，该生物粘合剂的溶质为叠氮苯甲酰基化的化合物，具有不稳定、不易保存的问题，且在制备粘合剂的过程中存在一定的危险性，限制了该种类生物粘合剂的推广和应用。
另外，由于生物医学粘合剂通常在存在水和体液(如血液和汗液)的情况下使用，一些现有的商业粘合剂在湿态环境下常常发生粘附失效的问题。而目前基于邻苯二酚基团设计的生物粘合剂，在应用时，存在因为氧化剂的使用带来细胞毒性问题，以及过度氧化交联使得粘合剂不能在生物体内完全降解的问题。
水凝胶材料是一种性能优于纱布的凝胶材料，主要由亲水性高分子通过物理或化学作用交联形成，作用于创面时，起到清创、吸收创面渗出液、提供湿性愈合环境以加快创面愈合的作用。近年来，水凝胶材料常被用作止血材料，促进伤口的愈合。
有鉴于此，有必要设计一种改进的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用，采用马来酸酐对壳聚糖改性，并接枝多巴胺，得到具有大量邻苯二酚基团的植物源壳聚糖基生物粘合剂，该生物粘合剂上的邻苯二酚基团在生理条件下可发生自氧化，使邻苯二酚与生物体组织上的官能团、与壳聚糖上氨基、羟基及其自身形成各种共价或非共价相互作用，使生物粘合剂粘附性能和内聚强度提升，具有良好的湿态粘附能力和组织封闭效果。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、马来酰化壳聚糖的制备
S11、将壳聚糖溶液与马来酸酐溶液均匀混合得到，混合溶液，缓慢升温至50～60℃，反应20～26h后得到马来酰化壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液与所述马来酸酐溶液的溶剂为同种非质子极性溶剂；
S12、将步骤S11得到的所述马来酰化壳聚糖溶液置于碳酸氢钠水溶液中，调节溶液pH为8～9，再置于丙酮中，静置得到沉淀；将所述沉淀采用去离子水进行透析，并进行离心处理，得到上清液，对所述上清液进行冷冻干燥得到固态马来酰化壳聚糖；
S2、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖
S21、将步骤S12得到的所述固态马来酰化壳聚糖溶解于pH为4～6的磷酸盐缓冲溶液中，升温至30～35℃，加入催化剂Ⅰ反应10～20min，再加入催化剂Ⅱ反应50～70min，最后加入盐酸多巴胺盐，反应10～15h；
S22、将步骤S21反应结束后的溶液采用去离子水进行透析，并进行离心处理得到多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖溶液，将溶液进行冷冻干燥后得到固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖；
S3、植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备
将步骤S2制备的固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中，加入光引发剂，进行避光保存，得到所述植物源壳聚糖基生物粘合剂。
作为本发明的进一步改进，在步骤S11中，所述混合溶液中，壳聚糖与马来酸酐的质量比为1:(2～5)；所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.005～0.2g/mL，所述马来酸酐溶液的质量浓度为0.2～0.5g/mL。
作为本发明的进一步改进，在步骤S21中，所述盐酸多巴胺盐的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为1:(0.9～1.2)。
作为本发明的进一步改进，在步骤S21中，所述固态马来酰化壳聚糖在所述磷酸盐缓冲溶液中的质量体积浓度为0.003～0.007g/mL。
作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，所述固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中后，得到质量百分浓度为3％～10％的溶液。
作为本发明的进一步改进，在步骤S11中，所述非质子极性溶剂包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种。
作为本发明的进一步改进，在步骤S11中，制备所述壳聚糖溶液采用的壳聚糖为植物源壳聚糖。
作为本发明的进一步改进，在步骤S12中，所述碳酸氢钠水溶液的物质的量浓度为0.1mol/L；所述丙酮的体积为所述马来酰化壳聚糖溶液、碳酸氢钠水溶液总体积的1.5～2.5倍。
作为本发明的进一步改进，在步骤S21中，所述催化剂Ⅰ为N-羟基琥珀酰亚胺，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.6～0.7):1；所述催化剂Ⅱ为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.9～1.2):1。
作为本发明的进一步改进，在步骤S12或步骤S22中，采用去离子水进行透析的工艺为采用截留分子量为8000～14000Da的透析膜，将待处理的沉淀或溶液在去离子水中透析，每隔5～7h更换去离子水，进行8～10次后完成透析；所述离心处理的转速为10000～12000rpm，时间为8～12min；所述冷冻干燥的工艺为先在-30～-50℃下冷冻20～26h，再在-50～-80℃下冷冻干燥24～72h。
一种由上述任一项所述的制备方法制备的植物源壳聚糖基生物粘合剂的应用，将所述植物源壳聚糖基生物粘合剂通过注射器注射至生物体伤口出血部位，施加紫外光照射，使所述植物源壳聚糖基生物粘合剂交联形成水凝胶，发挥其止血和组织封闭功能。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用，制备方法包括马来酰化壳聚糖的制备、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖、加入光引发剂得到植物源壳聚糖基生物粘合剂；应用时，将该生物粘合剂注射至生物体伤口出血部位，施加紫外光照射，使其迅速交联形成水凝胶，发挥止血和组织封闭功能。本发明通过马来酸酐对壳聚糖改性，并接枝多巴胺，得到具有大量邻苯二酚基团的植物源壳聚糖基生物粘合剂，该生物粘合剂采用马来酸酐接枝改性，引入了碳碳双键，在光引发剂作用下，可在紫外光照下对伤口处原位成型而封堵伤口，无需施加外力压迫；且邻苯二酚基团可在生理条件下可发生自氧化，邻苯二酚与生物体组织上的官能团、与壳聚糖上氨基、羟基及其自身形成各种共价或非共价相互作用，提升了生物粘合剂粘附性能和内聚强度，使其具有良好的湿态粘附能力和组织封闭效果。
2、本发明植物源壳聚糖基生物粘合剂上的邻苯二酚基团在生理环境下，与生物体组织的羟基、氨基、硫醇等官能团反应，形成众多的非共价键和共价键牢固的粘附在伤口组织上，增强了生物粘合剂的粘附强度；同时邻苯二酚也与壳聚糖上未反应的羟基和氨基、以及其自身之间通过氢键、π-π堆积、阳离子-π等非共键形成相互作用，形成了除马来酸酐引入的碳碳双键交联外的第二重交联网络；另外邻苯二酚在血液中Fe3+作用下发生氧化，氧化的邻苯二酚可以与Fe3+形成配位键，起到优异的止血效果，也可以与壳聚糖的氨基形成共价键，从而提高了该粘合剂的内聚力，增强了粘合剂的强度；因此本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂可以在伤口处快速建立起有效的止血物理屏障，封闭出血口；无需外来氧化剂作用，就能实现良好的粘附和封闭组织的能力。
3、本发明由于无外来氧化剂氧化邻苯二酚，使得生物粘合剂上保留了大量邻苯二酚基团，因邻苯二酚基团对红细胞与血小板具有聚集和活化作用，壳聚糖具有抗菌止血效果，使得植物源壳聚糖基生物粘合剂具有良好的伤口止血和抗菌能力。
4、本发明选用的壳聚糖为植物源壳聚糖，避免了动物源壳聚糖可能存在的免疫原性问题，同时由于避免了外加氧化剂使用带来的毒性和过度氧化交联，使得该粘合剂具有良好的生物相容性和可生物降解性。
附图说明
图1为本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂的合成原理示意图。
图2为实施例1制备的MCS和DMCS的粘附性能测试结果图。
图3为实施例1的MCS和DMCS的振荡时间扫描测试图。
图4为实施例1的MCS和DMCS在未加光引发剂条件下的流变性能测试结果图。
图5为实施例1的MCS和DMCS进行大鼠股动脉损伤应用时的具体应用模型图及过程图。
图6为实施例1的MCS和DMCS进行大鼠肝脏穿孔损伤应用时的具体应用模型图及测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，该粘合剂的合成原理示意图如图1所示，制备方法具体包括以下步骤：
S1、马来酰化壳聚糖的制备
S11、将壳聚糖(CS)溶液与马来酸酐(MA)溶液均匀混合，搅拌1h得到混合溶液，缓慢升温至50～60℃，反应20～26h后得到马来酰化壳聚糖(MCS)溶液；混合溶液中，壳聚糖与马来酸酐的质量比为1:(2～5)；壳聚糖溶液的质量浓度为0.005～0.2g/mL，马来酸酐溶液的质量浓度为0.2～0.5g/mL；壳聚糖溶液与马来酸酐溶液的溶剂为同种非质子极性溶剂，由于马来酸酐在水性条件下容易发生水解，选用非质子极性溶剂是为了避免马来酸酐与壳聚糖反应时自身发生水解，影响改性效果；
S12、将步骤S11得到的马来酰化壳聚糖溶液置于碳酸氢钠水溶液中，调节溶液pH为8～9，再置于丙酮中，静置得到沉淀；将沉淀采用去离子水进行透析，并进行离心处理，得到上清液，对上清液进行冷冻干燥得到固态马来酰化壳聚糖；
S2、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖
S21、将步骤S12得到的固态马来酰化壳聚糖溶解于pH为4～6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，升温至30～35℃，加入催化剂Ⅰ反应10～20min，再加入催化剂Ⅱ反应50～70min，最后加入盐酸多巴胺盐(Dopa)，反应10～15h；
其中，盐酸多巴胺盐的加入量与固态马来酰化壳聚糖的质量比为1:(0.9～1.2)，以保证多巴胺在壳聚糖上的最大接枝效果；固态马来酰化壳聚糖在磷酸盐缓冲溶液中的质量体积浓度为0.003～0.007g/mL；通过将固态马来酰化壳聚糖置于磷酸盐缓冲溶液中，以对其羧基基团进行活化，有利于多巴胺在马来酰化壳聚糖上的接枝；
S22、将步骤S21反应结束后的溶液采用去离子水进行透析，并进行离心处理得到多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖溶液，将溶液进行冷冻干燥后得到固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖(DMCS)；
S3、植物源壳聚糖基生物粘合剂
将步骤S2制备的固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中，得到质量百分浓度为3％～10％的溶液，向该溶液中加入光引发剂，进行避光保存，得到植物源壳聚糖基生物粘合剂。
特别地，本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂上的邻苯二酚基团在生理环境下，与生物体组织的羟基、氨基、硫醇等官能团反应，形成众多的非共价键和共价键牢固的粘附在伤口组织上，增强了生物粘合剂的粘附强度；同时邻苯二酚也与壳聚糖上未反应的羟基和氨基、以及其自身之间通过氢键、π-π堆积、阳离子-π等非共键形成相互作用，形成了除马来酸酐引入的碳碳双键交联外的第二重交联网络；另外因为该粘合剂通过接枝多巴胺使其负载大量邻苯二酚基团，其邻苯二酚基团极易被氧化，可在生理pH下与血液中Fe3+作用下发生氧化，氧化的邻苯二酚可以与Fe3+形成配位键，起到优异的止血效果，也可以与壳聚糖的氨基形成共价键，从而提高了该粘合剂的内聚力，增强了粘合剂的强度；因此本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂可以在伤口处快速建立起有效的止血物理屏障，封闭出血口；无需外来氧化剂作用，就能实现良好的粘附和封闭组织的能力。
具体的，制备壳聚糖溶液采用的壳聚糖为植物源壳聚糖。选用植物源壳聚糖，避免了动物源壳聚糖可能存在的免疫原性问题，同时由于避免了外加氧化剂使用带来的毒性和过度氧化交联，使得该粘合剂具有良好的生物相容性和可生物降解性。
在一些具体的实施方式中，植物源壳聚糖为从蘑菇、藻类或高等植物中提取得到。
具体地，在步骤S21中，催化剂Ⅰ为N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺的加入量与固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.6～0.7):1；催化剂Ⅱ为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的加入量与固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.9～1.2):1。
在步骤S12中，非质子极性溶剂包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种，优选为二甲基亚砜；碳酸氢钠水溶液的物质的量浓度为0.1mol/L；马来酰化壳聚糖溶液与碳酸氢钠水溶液的体积比为1:(2～2.5)，丙酮的体积为马来酰化壳聚糖溶液、碳酸氢钠水溶液总体积的1.5～2.5倍。
在一些具体的实施方式中，壳聚糖溶液的制备方法为取1.0g壳聚糖粉末加入到250mL的三口烧瓶中，再加入100mL的二甲基亚砜，在25℃下搅拌1小时，得到壳聚糖溶液。
在步骤S12或步骤S22中，采用去离子水进行透析的工艺为采用截留分子量为8000～14000Da的透析膜，将待处理的沉淀或溶液在去离子水中透析，每隔5～7h更换去离子水，进行8～10次后完成透析；离心处理的转速为10000～12000rpm，时间为8～12min；冷冻干燥的工艺为先在-30～-50℃下冷冻20～26h，再在冷冻干燥机中、-50～-80℃的条件下冷冻干燥24～72h。
在一些具体的实施方式中，在步骤S11或步骤S21中，缓慢升温的升温制度为1℃/min。
在一些具体的实施方式中，在步骤S3中，光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2,2-二甲氧基-苯基乙酮中的一种。
本发明制备的植物源壳聚糖基生物粘合剂由于无外来氧化剂氧化邻苯二酚，使得生物粘合剂上保留了大量邻苯二酚基团，因邻苯二酚基团对红细胞与血小板具有聚集和活化作用，壳聚糖具有抗菌止血效果，使得植物源壳聚糖基生物粘合剂具有良好的伤口止血能力。
一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的应用，该植物源壳聚糖基生物粘合剂通过注射器注射至生物体伤口出血部位，然后施加紫外光照射，使植物源壳聚糖基生物粘合剂交联形成水凝胶，发挥其止血和组织封闭功能。该植物源壳聚糖基生物粘合剂采用马来酸酐接枝改性，引入了碳碳双键，在光引发剂作用下，可在紫外光照下对伤口处原位成型而封堵伤口，无需施加外力压迫，使其在应用时更加便捷，应用范围更广。
实施例1
本实施例提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、马来酰化壳聚糖的制备
S11、取1.0g的CS加入到250mL的三口烧瓶中，再加入100mL的二甲基亚砜，在25℃下搅拌1小时，得到CS溶液；将3.5g马来酸酐溶解在10mL的二甲基亚砜中得到MA溶液；将MA溶液加入三口烧瓶中与CS溶液混合，搅拌1小时后得到混合溶液，再缓慢升温至53℃，反应24h后得到马来酰化壳聚糖(MCS)溶液；
S12、将步骤S1得到的马来酰化壳聚糖溶液置于物质的量浓度为0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(250mL)中，调节溶液pH为8～9，再将调好pH的溶液置于500mL的丙酮中，静置过夜，使MCS完全沉淀；将沉淀进行抽滤，使用截留分子量为8000～14000Da的透析膜在去离子水中进行为期2天的透析，每6个小时更换一次去离子水；透析结束后，用11000rpm的转速离心MCS溶液10分钟；将离心后的上清液倒入一次性塑料培养皿中，在零下40℃的冰箱冷冻一天，再用冷冻干燥机(冷阱温度为-55℃，板层温度为15℃)冷冻干燥48h，得到固态MCS；
S2、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖
S21、取0.5g步骤S12得到的固态MCS加入至250mL的三口烧瓶中，再向其中加入100mL的磷酸盐缓冲溶液(pH＝5.0)，在25℃下，磁力搅拌，直至MCS在PBS溶液中完全溶解；缓慢升温至30℃，再加入0.32g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15分钟后，加入0.5g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，再反应1小时后，加入0.5g酸盐多巴胺盐(Dopa)，最后在30℃下，反应12小时；
S22、将步骤S21反应结束后的溶液采用截留分子量为8000～14000Da的透析膜在去离子水中透析反应溶液，每6个小时更换一次去离子水，2天后将DMCS溶液用11000rpm的转速离心10分钟，再倒入一次性塑料培养皿中，在零下40℃的冰箱冷冻一天，再冷冻干燥机(冷阱温度为-55℃，板层温度为15℃)冷冻干燥48h，得到固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖(DMCS)；
S3、植物源壳聚糖基生物粘合剂
将步骤S2制备的固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中，得到质量百分浓度为5％的溶液，加入光引发剂，进行避光保存，得到植物源壳聚糖基生物粘合剂。
将实施例1制备得到的MCS和DMCS进行粘附性能的测试，采用搭接剪切试验与爆破压力测试，具体操作步骤如下：
搭接剪切试验：本实验使用前端涂有明胶的玻璃片模拟生物组织，将0.3mL的DMCS溶液或MCS溶液均匀涂抹在一片明胶玻璃片(尺寸长为7cm，宽为2.5cm)的前端1×2.5cm2区域面积上，接着将另一片明胶玻璃片轻轻盖上，其粘附面积为2.5cm2在波长365nm，光强30mW/cm2的紫外光下照射60s，形成凝胶；最后在万能试验机上以1mm/min的拉伸速率进行搭接剪切试验，每组样品测试10个平行样。需要说明的是，搭接剪切试验以及下文中爆破压力测试中采用的DMCS溶液或MCS溶液的溶剂均为去离子水，且浓度相同。
爆破压力测试：向猪皮切片直径为5mm的孔洞里注射0.3mL的DMCS溶液或MCS溶液，接着使用紫外光(波长为365nm，光强为30mW/cm2)光照60s；然后使用自主搭建的爆破压力测试装置测试，装置使用数字压力表来检测测试过程压力数值，通过注射器以5mL/min的速率推动空气来施加持续压力，记录水凝胶粘合剂破裂前数字压力表显示的最大压力为最大爆破压力，每组样品3个平行样。
搭接剪切试验与爆破压力测试得到的结果如图2所示，其中(a)为搭接剪切强度，(b)为爆破压力。由图2可知，在对MCS进行多巴胺接枝后得到的DMCS搭接剪切强度和爆破压力均远超于MCS，说明成功的制得了具有较强粘附性能的生物粘合剂。
对实施例1制备的MCS和DMCS测试其流变性能，具体为在25℃下，利用20mm铝制平行板进行测试，测试间隙设置为1000μm，进行以下测试：
振荡时间扫描：测试在25℃下进行，采用振幅应变为1％，振荡频率为1Hz的测试条件，我们设置在振荡时间100s时开启紫外光(波长＝365nm)，光照时间设置为200s。
振荡频率扫描：设定应变为1％，频率从0.1Hz扫描到10Hz，研究了频率改变对光照成型后的水凝胶的储能模量和损耗模量影响。
请参阅图3所示，为实施例1的MCS和DMCS的粘合剂振荡时间扫描测试图，其中(a)为MCS，(b)为DMCS。从图3可知，相较于MCS的19s凝胶时间，邻苯二酚基团的引入，使得DMCS具有极短的凝胶时间，紫外光照2s内就可以凝胶。
请参阅图4所示，为实施例1的MCS和DMCS在未加光引发剂条件下的流变性能测试结果图，其中(a)为振荡时间扫描，(b)为震荡频率扫描。由图4可知，在没有加入光引发剂LAP的情况下，随着避光静置的时间延长，MCS还是溶液状态，而DMCS的储能模量G'逐渐高于损耗模量G”，该结果说明DMCS的前驱溶液在没有紫外光引发交联的条件下，邻苯二酚发生了自氧化，与壳聚糖上的氨基交联，导致DMCS从溶胶向凝胶转变。
将实施例1制备的MCS和DMCS进行大鼠股动脉损伤的应用，其具体应用模型图及过程图如图5所示，其中(a)为股动脉损伤模型示意图，(b)为DMCS、MCS、明胶海绵(Gelatinsponge)及纱布(Gauze)的止血过程图。从图中可以看出，将DMCS注射至损伤部位，并进行10s的紫外光照射后，DMCS在伤口处原位成型封堵伤口，起到快速止血的效果；MCS在紫外光照射10s时仍有血液流出，而30s后也成功得对出血部位进行封闭。明胶海绵和纱布虽然可以短暂的起到止血的效果，但是移开后立刻有血液流出，难以对伤口进行封闭止血。
将实施例1制备的MCS和DMCS进行大鼠肝脏穿孔损伤的应用，其具体应用模型图及测试结果如图6所示，其中(a)为肝脏穿孔损伤模型示意图，(b)为DMCS、MCS、明胶海绵(Gelatin sponge)及纱布(Gauze)的止血时间和出血量结果。从图中可以得出，DMCS应用于大鼠肝脏穿孔损伤时具可在最短时间内实现止血，并使其具有最少的出血量；MCS因为采用马来酸酐对壳聚糖进行改性，也具有一定的粘合剂性能，其止血时间和出血量虽比MCS效果差，但也优于传统的明胶海绵和纱布。
对比例1
对比例1提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S21中，采用二氢咖啡酸代替多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例2
对比例2提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S11中，采用去离子水代替二甲基亚砜制备壳聚糖溶液与马来酸酐溶液，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例3
对比例3提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S21中，采用去离子水代替磷酸盐缓冲溶液，即向装有固态MCS的三口烧瓶中加入去离子水，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例4
对比例4提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S21中，未加入N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例5
对比例5提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S11中，采用马来酰亚胺代替马来酸酐，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
将对比例1～5最终制备的植物源壳聚糖基生物粘合剂进行大鼠肝脏穿孔损伤的应用，得到的结果如下表1所示。
表1实施例1及对比例1～5的生物粘合剂的应用结果
| 止血时间(s) | 出血量(g) | |
| 实施例1 | 15 | 0.78 |
| 对比例1 | 29 | 1.36 |
| 对比例2 | - | - |
| 对比例3 | 32 | 1.58 |
| 对比例4 | 31 | 1.48 |
| 对比例5 | 35 | 1.68 |
由表1可知，对比例1～6中，对比例2由于马来酸酐在改性过程中发生水解，使得粘合剂无法在紫外光照下形成凝胶，导致止血失败。相较于实施例1，对比例1，3～5的粘合剂止血时间更长，出血量更大；主要原因是：对比例1中使用二氢咖啡酸，邻苯二酚基团取代度不高，原因在于壳聚糖上氨基数量本来不多，马来酸酐的加入已经反应了大量氨基，影响后续多巴胺的接枝；对比例4中在接枝多巴胺的过程中失去了酸性的磷酸盐缓冲液的保护，多巴胺在水溶液中反应时溶液发生氧化交联，导致多巴胺取代度较低，影响制备的生物粘合剂的止血效果；对比例5中未加入偶联剂EDC和NHS，在该实验条件下，多巴胺难以与羧基反应，导致多巴胺未成功接枝到MCS上。
实施例2
实施例2提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S11中，将5g马来酸酐溶解在10mL的二甲基亚砜中得到MA溶液，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例6
对比例6提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S11中，将1g马来酸酐溶解在10mL的二甲基亚砜中得到MA溶液，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例7
对比例7提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S11中，将2g马来酸酐溶解在10mL的二甲基亚砜中得到MA溶液，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例8
对比例8提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S21中，加入0.2g酸盐多巴胺盐，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例9
对比例9提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，在步骤S21中，加入1g酸盐多巴胺盐，其余大致与实施例1相同，在此不再赘述。
将实施例2及对比例6～9最终制备的植物源壳聚糖基生物粘合剂进行大鼠肝脏穿孔损伤的应用，得到的结果如下表1所示。
表2实施例2及对比例6～9的生物粘合剂的应用结果
由表2可知，与实施例1相比，实施例2增大马来酸酐投料量，但实施例1中马来酸酐投料量已经过量，增大投料并不能显著提高马来酸酐的取代度，导致止血效果提升不大。对比例6减少马来酸酐投料量至1g，导致接枝上的马来酸酐过少，无法形成凝胶，止血失败；对比例7中马来酸酐的投料量为2g，导致马来酸酐取代度降低，止血时间变长，出血量变大；对比例8，降低了盐酸多巴胺盐的投料量，导致多巴胺取代度的下降，止血时间变长和出血量更大；对比例9，增大了盐酸多巴胺盐的投料量，使得过多的羧基被反应，导致DMCS在水中无法溶解，未能成功制得生物粘合剂。
综上所述，本发明提供了一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法与应用，制备方法包括马来酰化壳聚糖的制备、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖、加入光引发剂得到植物源壳聚糖基生物粘合剂；应用时，将该生物粘合剂通过注射器注射至生物体伤口出血部位，施加紫外光照射，使其迅速交联形成水凝胶，发挥止血和组织封闭功能。本发明植物源壳聚糖基生物粘合剂上的邻苯二酚基团在生理环境下，与生物体组织的羟基、氨基、硫醇等官能团反应，形成众多的非共价键和共价键牢固的粘附在伤口组织上，增强了生物粘合剂的粘附强度；同时邻苯二酚也与壳聚糖上未反应的羟基和氨基、以及其自身之间通过氢键、π-π堆积、阳离子-π等非共键形成相互作用，形成除马来酸酐引入的碳碳双键交联外的第二重交联网络；另外邻苯二酚在血液中Fe3+作用下发生氧化，氧化的邻苯二酚可以与Fe3+形成配位键，起到优异的止血效果，也可以与壳聚糖的氨基形成共价键，从而提高了该粘合剂的内聚力，增强了粘合剂的强度；因此本发明的植物源壳聚糖基生物粘合剂可以在伤口处快速建立起有效的止血物理屏障，封闭出血口；无需外来氧化剂作用，就能实现良好的粘附和封闭组织的能力。该植物源壳聚糖基生物粘合剂具有良好的湿态粘附能力、组织封闭效果、抗菌止血效果、生物相容性以及可生物降解性，应用前景和应用范围广阔。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、马来酰化壳聚糖的制备
S11、将壳聚糖溶液与马来酸酐溶液均匀混合，得到混合溶液，缓慢升温至50～60℃，反应20～26h后得到马来酰化壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液与所述马来酸酐溶液的溶剂为同种非质子极性溶剂；
S12、将步骤S11得到的所述马来酰化壳聚糖溶液置于碳酸氢钠水溶液中，调节溶液pH为8～9，再置于丙酮中，静置得到沉淀；将所述沉淀采用去离子水进行透析，并进行离心处理，得到上清液，对所述上清液进行冷冻干燥得到固态马来酰化壳聚糖；
S2、多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖
S21、将步骤S12得到的所述固态马来酰化壳聚糖溶解于pH为4～6的磷酸盐缓冲溶液中，缓慢升温至30～35℃，加入催化剂Ⅰ反应10～20min，再加入催化剂Ⅱ反应50～70min，最后加入盐酸多巴胺盐，反应10～15h；
S22、将步骤S21反应结束后的溶液采用去离子水进行透析，并进行离心处理得到多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖溶液，将该溶液进行冷冻干燥后得到固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖；
S3、植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备
将步骤S2制备的固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中，加入光引发剂，进行避光保存，得到所述植物源壳聚糖基生物粘合剂。
2.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S11中，所述混合溶液中，壳聚糖与马来酸酐的质量比为1:(2～5)；所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.005～0.2g/mL，所述马来酸酐溶液的质量浓度为0.2～0.5g/mL。
3.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S21中，所述盐酸多巴胺盐的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为1:(0.9～1.2)；所述固态马来酰化壳聚糖在所述磷酸盐缓冲溶液中的质量体积浓度为0.003～0.007g/mL。
4.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述固态多巴胺接枝改性马来酰化壳聚糖置于去离子水中后，得到质量百分浓度为3％～10％的溶液。
5.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S11中，所述非质子极性溶剂包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种。
6.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S11中，制备所述壳聚糖溶液采用的壳聚糖为植物源壳聚糖。
7.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S12中，所述碳酸氢钠水溶液的物质的量浓度为0.1mol/L；所述丙酮的体积为所述马来酰化壳聚糖溶液、碳酸氢钠水溶液总体积的1.5～2.5倍。
8.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S21中，所述催化剂Ⅰ为N-羟基琥珀酰亚胺，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.6～0.7):1；所述催化剂Ⅱ为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量与所述固态马来酰化壳聚糖的质量比为(0.9～1.2):1。
9.根据权利要求1所述的植物源壳聚糖基生物粘合剂的制备方法，其特征在于，在步骤S12或步骤S22中，采用去离子水进行透析的工艺为采用截留分子量为8000～14000Da的透析膜，将待处理的沉淀或溶液在去离子水中透析，每隔5～7h更换去离子水，进行8～10次后完成透析；所述离心处理的转速为10000～12000rpm，时间为8～12min；所述冷冻干燥的工艺为先在-30～-50℃下冷冻20～26h，再在-50～-80℃下冷冻干燥24～72h。
10.一种由权利要求1～9中任一项所述的制备方法制备的植物源壳聚糖基生物粘合剂的应用，其特征在于，将所述植物源壳聚糖基生物粘合剂注射至生物体伤口出血部位，施加紫外光照射，使所述植物源壳聚糖基生物粘合剂交联形成水凝胶，发挥其止血和组织封闭功能。
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