CN116897206A - 靶向pcsk9的反义缀合物的口服递送 - Google Patents

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CN116897206A CN202180092111.8A CN202180092111A CN116897206A CN 116897206 A CN116897206 A CN 116897206A CN 202180092111 A CN202180092111 A CN 202180092111A CN 116897206 A CN116897206 A CN 116897206A
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Abstract

本公开提供了用于口服递送的药物组合物，所述药物组合物包含反义寡核苷酸(例如，CIVI 008)和诸如5‑CNAC的口服递送剂。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含CIVI 008和5‑CNAC以及任选的他汀类的干共混物。

Description

靶向PCSK9的反义缀合物的口服递送
相关申请的交叉引用及以引用方式并入
本PCT申请要求2020年12月11日提交的美国临时申请号63/124,581、2021年1月7日提交的美国临时申请号63/134,884、2021年4月22日提交的美国临时申请号63/178,340和2021年9月22日提交的美国临时申请号63/261,505的优先权权益，这些美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的以电子方式提交的ASCII文本文件序列表(名称4009-021PC04_Sequence_listing_ST25.txt；大小：26,230字节；并且创建日期：2021年12月9日)的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及反义寡核苷酸缀合物的口服制剂，所述反义寡核苷酸缀合物靶向细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)mRNA，从而导致PCSK9的表达减少。PCSK9表达的减少有益于一系列医学疾患，诸如高胆固醇血症和相关疾患。
背景技术
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)已显现为用于降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的治疗靶标。PCSK9增加LDL受体的降解，从而导致具有高PCSK9活性的个体中的高LDL-C。Lindholm等人，Molecular Therapy(2012)；20 2,376-381报道了一种靶向PCSK9的LNA反义寡核苷酸，所述LNA反义寡核苷酸产生非人灵长类动物中LDL-C的持续降低。所使用的化合物是名为SPC5001的14聚体，其也公开于国际申请公开号WO2011/009697中。由于严重的肾毒性和急性肾损伤，这种化合物在临床试验期间被停用。参见例如，vanPoelgeest等人(2013),American Journal of Kidney Disease,62(4):796-800。
药理活性剂的口服递送通常是首选的递送途径，因为其方便、相对容易且通常无痛，从而相对于其他递送模式，患者依从性更高。然而，生物、化学和物理屏障，诸如胃肠道中不同的pH、强大的消化酶、以及活性剂不可渗透的胃肠膜，使得向哺乳动物口服递送一些药理活性剂(例如治疗性核酸(诸如反义寡核苷酸)的口服递送)成问题。因此，需要开发允许治疗性核酸(诸如反义寡核苷酸)的口服递送的系统。
发明内容
本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含反义寡聚物(例如，反义寡核苷酸，ASO)和口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)，其中所述反义寡聚物的长度为16至22个连续核苷酸，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体(gapmer)，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA。在一些方面中，RNA是前mRNA、前mRNA的剪接变体、成熟mRNA或其等位基因变体或突变体。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向外显子内的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向内含子内的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向包含外显子与内含子之间的接合部的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向在编码PCSK9的开放阅读框的5'端上游的序列(例如，5'UTR)。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向在编码PCSK9的开放阅读框的3'端下游的序列(例如，3'UTR)。
在一些方面中，LNA是氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-5LNA、5'-甲基-LNA、ENA、cET、cMOE或其组合。在一些方面中，LNA是β-D-构型或α-L构型的立体异构体。在一些方面中，所述反义寡聚物包含至少一个cET单元。在一些方面中，所述反义寡聚物包含2、3、4、5、6或7个LNA单元。在一些方面中，所述反义寡聚物中的每个LNA单元都是相同构型的立体异构体。在一些方面中，所述反义寡聚物中的每个LNA单元都是β-D-氧基LNA单元。在一些方面中，所述反义寡聚物中的每个LNA单元都是α-L-氧基-LNA单元。
在一些方面中，所述反义寡聚物的序列包含至少一个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)核苷间键(internucleosidelinkage)。在一些方面中，所有核苷间键都是硫代磷酸酯。在一些方面中，所述核苷间键中的一个或多个核苷间键包含R构象和/或S构象的手性中心。在一些方面中，所有手性中心都处于R构象。在一些方面中，所有手性中心都处于S构象。在一些方面中，反义寡聚物和SEQID NO:31的寡聚物可形成双链体，所述双链体相对于包含不含LNA的对应反义寡聚物的对应双链体具有增加的热稳定性。
本公开还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含反义寡核苷酸缀合物和口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC、或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)，其中所述反义寡核苷酸缀合物包含：
(i)为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，以及
(ii)至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，
其中所述反义寡核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA，例如mRNA。
在一些方面中，如上文所公开，RNA是前mRNA、前mRNA的剪接变体、成熟mRNA、或其等位基因变体或突变体。
在一些方面中，非核苷酸或非多核苷酸部分是附接到反义寡聚物的5'末端或3'末端的靶向肝脏的部分。在一些方面中，所述靶向肝脏的部分经由接头连接至反义寡聚物。在一些方面中，靶向肝脏的部分包括碳水化合物缀合物部分，所述碳水化合物缀合物部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物：半乳糖、乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖、甘露糖-6-磷酸以及其组合。
在一些方面中，所述碳水化合物缀合物部分不是直链碳水化合物聚合物。在一些方面中，所述碳水化合物缀合物部分是包含1、2、3或4个碳水化合物部分的碳水化合物基团。在一些方面中，所有碳水化合物部分是相同的。在一些方面中，至少一个碳水化合物部分与其他碳水化合物部分不同(不相同)。在一些方面中，碳水化合物缀合物部分包含至少一个靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分。在一些方面中，靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分包含单价、二价、三价或四价GalNAc簇。在一些方面中，GalNAc簇中的每个GalNAc经由间隔基(spacer)附接到分支点基团。在一些方面中，分支点基团包含肽，例如二赖氨酸。在一些方面中，间隔基包括PEG间隔基。在一些方面中，接头包括C6至C12氨基烷基基团或包含介于1至6个之间的核苷酸的生物可切割磷酸核苷酸接头。在一些方面中，三价GalNAc簇包含GalNAc缀合物部分Conj 1、Conj 2、Conj 1a或Conj 2a。在一些方面中，非核苷酸或非多核苷酸部分经由共价键共价附接至反义寡聚物。
本公开还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如图18A中所示的SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19的反义寡核苷酸缀合物和口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)，其中所述反义寡核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA。在一些方面中，RNA是前mRNA、前mRNA的剪接变体、成熟mRNA或其等位基因变体或突变体。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向外显子内的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向内含子内的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向包含外显子与内含子之间的接合部的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向在编码PCSK9的开放阅读框的5'端上游的序列。在一些方面中，所述反义寡聚物靶向在编码PCSK9的开放阅读框的3'端下游的序列。
在一些方面中，本文所公开的药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合。在一些方面中，所述至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合选自由以下组成的组：pH调节剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、芳香剂、保湿剂、张力调节剂(tonicifier)、着色剂、表面活性剂、增塑剂、润滑剂、助流剂、压缩助剂、增溶剂、赋形剂、稀释剂、磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、乙二醇、分散剂、交聚维酮、聚维酮或它们的任何组合。在一些方面中，本文所公开的药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的治疗剂：他汀类、胆汁螯合树脂、烟酸、纤维酸衍生物、普罗布考、新霉素、右旋甲状腺素、植物甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂、英普他派、胆汁酸转运蛋白抑制剂、肝CYP7a调节剂、雌激素替代治疗剂、抗炎剂，或它们的组合。在一些方面中，他汀类选自由以下组成的组：洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀以及其组合。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的本文所公开的药物组合物，例如，包含本公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)的组合物，其中施用所述药物组合物降低受试者中血清PCSK9水平和/或降低受试者中血清LDL胆固醇水平。在一些方面中，PCSK9是(i)PCSK9等位基因变体；(ii)PCSK9突变体；或者(iii)PCSK9剪接变体。在一些方面中，PCSK9突变体是PCSK9功能获得性突变体。
在一些方面中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)。在一些方面中，血脂异常是家族性高脂血症(FCHL)或获得性高脂血症。在一些方面中，高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症(familiar hypercholesterolemia)或耐他汀类高胆固醇血症。
在一些方面中，本文所公开的治疗方法进一步包括施用选自由以下组成的组的治疗剂：他汀类、胆汁螯合树脂、烟酸、纤维酸衍生物、普罗布考、新霉素、右旋甲状腺素、植物甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂、英普他派、胆汁酸转运蛋白抑制剂、肝CYP7a调节剂、雌激素替代治疗剂、抗炎剂，或它们的组合。在一些方面中，他汀类选自由以下组成的组：洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀以及其组合。
在一些方面中，本文所公开的药物组合物是口服施用的。在一些方面中，所述药物组合物是作为单剂量施用的。在一些方面中，所述药物组合物作为多剂量施用。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者中选自由以下组成的组的疾患的方法：动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)或冠心病(CHD)，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的药物组合物，例如，包含本公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送增强剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)的组合物。
本公开还提供了一种降低细胞中PCSK9的表达水平和/或活性的体外或体内方法，所述体外或体内方法包括向所述细胞施用有效量的本文所公开的药物组合物，例如，包含本公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送增强剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)的组合物。
还提供了一种降低有需要的受试者中的PCSK9表达水平和/或PCSK9活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的药物组合物，例如，包含本公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送增强剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)的组合物。
本公开还提供了一种降低有需要的受试者中胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的药物组合物，例如包含本公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送增强剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)的组合物。
还提供了一种制造药物组合物的方法，所述方法包括掺混以下物质：(i)长度为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包括与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA；和(ii)口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)。
本公开还提供了一种制造药物组合物的方法，所述方法包括掺混以下物质：(i)缀合物，所述缀合物包含(a)为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，和(b)至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，其中所述反义寡聚核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA；和(ii)口服递送剂(例如，SNAC、C10、5-CNAC，或其盐、水合物或溶剂化物，或其组合)。
在一些方面中，所述反义寡聚物的序列包含或由SEQ ID NO:26(即与SEQ ID NO:31 100％互补的具有与SEQ ID NO:31相同长度的序列)组成。在一些方面中，反义寡聚物的序列包含或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3(即，具有SEQ ID NO:26的碱基序列，但具有特定模式的碱基和主链修饰的序列)组成。在一些方面中，反义寡聚物缀合物包含或由SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19(即，与GalNAc2部分缀合的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)组成。
在本公开的药物组合物和方法的一些方面中，所述口服递送剂包括例如辛酸(C8)、癸酸(C10)、其衍生物、其药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或其任何组合。在一些方面中，药学上可接受的盐是钠盐、钾盐或其组合。在一些方面中，药物组合物是固体。
在一些方面中，所述药物组合物是片剂或胶囊剂的形式。在一些方面中，胶囊剂是液体胶囊剂。在一些方面中，药物组合物是肠溶包衣的。在一些方面中，片剂或胶囊剂是肠溶包衣的。在一些方面中，片剂或胶囊剂的重量在5mg与1000mg之间、在10mg与500mg之间、在10mg与250mg之间、在100mg与200mg之间、或在250mg与500mg之间。在一些方面中，片剂或胶囊剂中的反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物的量在1mg至100mg、5mg至100mg、10mg至100mg、20mg至100mg、20mg和50mg的范围内。
在一些方面中，所述口服递送剂是N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐、水合物或溶剂化物，或它们的组合。在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任何组合。在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是单钠盐(沙波立沙钠(Salcaprozatesodium)203787-91-1,SNAC，8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠)。在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是二钠盐。
在一些方面中，所述口服递送剂是N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐、水合物或溶剂合物，或它们的组合。在一些方面中，所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任何组合。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是单钠盐(5-SNAC)。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是二钠盐。
在一些方面中，口服递送剂是癸酸(C10)的盐、水合物或溶剂合物，或组合。在一些方面中，癸酸(C10)的盐选自由以下组成的组：癸酸(C10)的钠盐、钾盐和钙盐，以及它们的任何组合。在一些方面中，癸酸(C10)的盐是癸酸钠。
在一些方面中，所述药物组合物在饭前约5分钟至约60分钟施用。在一些方面中，所述药物组合物在饭前至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟或至少约60分钟施用。
在一些方面中，所述药物组合物进一步包含pH敏感包衣。在一些方面中，所述pH敏感包衣是pH敏感聚合物。在一些方面中，所述pH敏感聚合物包括纤维素、丙烯酸、其衍生物、或其组合。在一些方面中，所述pH敏感包衣包含pH敏感水凝胶、pH活化的药物递送系统、pH敏感脂质体、胶束或脂质纳米粒子、pH敏感微球体、pH敏感纳米粒子，或它们的任何组合。
本公开还提供了一种丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含(GalNAc)3-氨基-六亚甲基-5'硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧鸟苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基十六烷钠盐；和口服递送剂，所述口服递送剂选自由以下组成的组：SNAC、C10、5-CNAC、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合。
本公开还提供了丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含如图18B所示的CIVI 008，以及口服递送剂，所述口服递送剂选自由以下组成的组：SNAC、C10、5-CNAC、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合。在一些方面中，所述丸剂或胶囊剂包含CIVI 008和SNAC。在一些方面中，所述丸剂或胶囊剂包含CIVI 008和C10。在一些方面中，所述丸剂或胶囊剂包含CIVI008和5-CNAC。
在本文所公开的组合物和方法的一些方面中，所述口服递送剂是
其中
R1、R2、R3、和R4独立地为氢、-OH、-NR6R7、卤素、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基；
R5是取代或未取代的C2-C16亚烷基，取代或未取代的C2-C16亚烯基、取代或未取代的C1-C12烷基(亚芳基)、或取代或未取代的芳基(C1-C4亚烷基)；并且
R6和R7独立地为氢、氧或C1-C4烷基。
在本文所公开的组合物和方法的一些方面中，所述口服递送剂选自由以下组成的组：N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸(SNAC)、N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)、N-(10-[2-羟基苯甲酰基]氨基)癸酸(SNAD)、4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸(4-CNAB)、N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸(4-MOAC)、8-(4-羟基苯氧基)辛酸(4-HPO)、4-间甲苯氧基丁酸(4-m-toIyloxybutyric acid，3-TBA)、4-(3-羟基苯硫醇基)丁酸(3-HPSB)、5-苯基戊酸(5-PPA)、8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺(2-HPOD)、(4-异丙基苄氧基)乙酸(4-IBOA)、2-(5-戊酸)-5-(2-羟基苯基)-l,3,4-噁二唑(2-PHOD)、7-氧代-7-苯基庚酸(7-OPHA)、4-(3-氟苯基硫醇基)丁酸(3-FPSB)，或它们的任何组合。
在一些方面中，所述口服递送剂是N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的二钠盐。
在一些方面中，所述口服递送剂是N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐、水合物或溶剂合物，或它们的组合。在一些方面中，所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任何组合。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰)-8-氨基辛酸的盐是单钠盐。在一些方面中，N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是二钠盐。
本公开还提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物。在一些方面中，包含CIVI 008的组合物和包含5-CNAC的组合物处于干共混物中。在一些方面中，所述胶囊剂是明胶胶囊剂。在一些方面中，所述凝胶胶囊剂是硬壳明胶胶囊剂。在一些方面中，所述胶囊剂是肠溶包衣的。在一些方面中，所述胶囊剂包含在5mg与30mg之间的CIVI 008和在100mg与200mg之间的5-CNAC。在一些方面中，所述胶囊剂包含约5mg、约10mg、约20mg、约25mg或约30mg的CIVI 008。在一些方面中，其中所述胶囊剂包含：10mg的CIVI 008和100mg的5-CNAC；20mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；5mg的CIVI008和200mg的5-CNAC；10mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；25mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；或30mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC。在一些方面中，所述胶囊剂含有他汀类。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中选自由动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)或冠心病(CHD)组成的组的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用胶囊剂，所述胶囊剂包含(i)包含CIVI008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物。本公开还提供了一种降低有需要的受试者中PCSK9表达水平和/或活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用胶囊剂，所述胶囊剂包含(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物。还提供了一种降低有需要的受试者中胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用胶囊剂，所述胶囊剂包含(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物。还提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含：(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物，所述胶囊剂用于治疗选自由动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)、或冠心病(CHD)组成的组的疾患。还提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含：(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物，所述胶囊剂用作用于降低受试者中PCSK9的表达水平和/或活性的药物。本公开还提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含：(i)包含CIVI 008的组合物和(ii)包含5-CNAC的组合物，所述胶囊剂用作用于降低受试者中胆固醇水平的药物。还提供了一种制造胶囊剂的方法，所述胶囊剂含有包含CIVI 008的组合物和包含5-CNAC的组合物，所述方法包括：(i)干共混包含CIVI 008的第一组合物和包含5-CNAC的第二组合物；以及(ii)将步骤(i)所得的干共混物封装在胶囊中。
附图说明
图1A、图1B、和图1C示出了可在本文所公开的口服组合物中使用的三-GalNAc缀合物的示例。缀合物1至缀合物4示出了四种合适的GalNAc缀合物部分，并且缀合物1a至缀合物4a是指具有附加接头部分(Y)的相同缀合物，所述附加接头部分用于将缀合物连接至寡聚物(区域A或生物可切割接头，诸如区域B)。波浪线表示与寡聚物的共价连接。
图2示出了可在本文所公开的口服组合物中使用的胆固醇和生育酚缀合物部分的示例。缀合物5a和6a是指具有附加接头部分(Y)的相同缀合物，所述附加接头部分用于将缀合物连接至寡聚物(区域A或生物可切割接头，诸如区域B)。波浪线表示与寡聚物的共价连接。
图3示出了特定LNA化合物。β-D-氧基LNA由字母后的上标L标识，下标s代表硫代磷酸酯键，大写字母C前的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图4示出了可在本文所公开的口服组合物中使用的LNA化合物的胆固醇缀合物的示例。β-D-氧基LNA由字母后的上标L标识，下标s代表硫代磷酸酯键，o下标代表磷酸二酯键，大写C前的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图5A示出了可在本文所公开的口服组合物中使用的LNA化合物的GalNAc缀合物的示例。缀合物基本上对应于图1中的Conj2a，其中波浪线被LNA寡聚物取代。β-D-氧基LNA由字母后的上标L标识，下标s代表硫代磷酸酯键，大写字母C前的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图5B示出了SEQ ID NO 18的详细结构。
图5C示出了SEQ ID NO 19的详细结构。
图6呈现了FAM缀合物基团的示例。
图7示出具有和不具有可切割磷酸二酯键的LNA-FAM缀合物。β-D-氧基LNA由字母后的上标L标识，下标s代表硫代磷酸酯键，o下标代表磷酸二酯键，大写C前的上标Me代表5-甲基胞嘧啶LNA，非LNA核苷酸是DNA核苷酸(无上标L)。
图8示出了根据体外效力排名的抗PCSK9缺口聚体。
图9示出了根据体外效力排名的选定抗PCSK9缺口聚体。
图10示出了选定抗PCSK9化合物的体外效力和IC50数据。
图11示出了选定抗PCSK9缀合物的体内丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。
图12示出核苷间键L可以是例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯，诸如磷酸二酯。PO是磷酸二酯键。化合物(a)具有带单个DNA(或RNA)的区域B，第二区域与第一区域之间的键是PO。化合物(b)具有两个通过磷酸二酯键连接的DNA/RNA(例如DNA)核苷。化合物(c)具有三个通过磷酸二酯键连接的DNA/RNA(例如DNA)核苷。在一些方面中，区域B可以通过另外的磷酸二酯DNA/RNA(诸如DNA核苷)进一步延伸。缀合物基团(在本文中标记为X，以其他方式为区域C)被示出在每种化合物(例如胆固醇、GalNAc、Conj1至Conj4、1a至4a和5或6)的左侧上，并且可以任选地经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、氨基磷酸酯、或甲基膦酸酯)共价附接至区域B的末端核苷，或者可以经由替代键，例如三唑键(参见化合物d、e和f中的L)连接。
图13示出了使用图12中呈现的命名法，化合物在第三(缀合物)区域(X)与第二区域(区域B)之间包含任选的接头(Y)的情况。合适的接头在本文中公开，并且包括例如烷基接头，诸如C6接头。在化合物a)、b)和c)中，X与区域B之间的接头经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、氨基磷酸酯、或甲基膦酸酯)附接至区域B，或者可以经由替代键，例如三唑键(Li)连接。在这些化合物中，Lii代表第一区域(A)与第二区域(B)之间的核苷间键。化合物d)、e)和f)进一步包含在区域B与缀合物基团之间的接头(Y)，并且区域Y可以经由例如磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯)或在一些方面中三唑键连接至区域B。另外或替代地，X可以是活化基团或反应性基团。X可以经由磷核苷键基团(诸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯)共价附接至区域B，或者可以经由替代键(例如三唑键)连接。
图14示出了在施用胆固醇-缀合物后PCSK9 mRNA的体内沉默。向小鼠注射单剂量的10mg/kg未缀合的LNA-反义寡核苷酸(#40)或等摩尔量的用不同接头缀合至胆固醇的LNA反义寡核苷酸，并在投配后第1天、第3天、第7天和第10天处死。从肝脏和肾脏中分离出RNA，并经受PCSK9特异性RT-qPCR。小图A示出将来自肝脏样品的PCSK9 mRNA的定量归一化为BACT，并示出为等效盐水对照的平均值的百分比。小图B示出将来自肾脏样品的PCSK9 mRNA的定量归一化为BACT，并示出为等效盐水对照的平均值的百分比。
图15示出了来自大鼠安全性研究的Kim-1表达(参见实施例5)。
图16示出了来自用0.5mg/kg/周或1.5mg/kg/周的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18注射四次(一次注射/周)的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
图17示出了来自用0.5mg/kg/周或1.5mg/kg/周的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:19注射四次(一次注射/周)的食蟹猴的样品中的血清PCSK9和LDL胆固醇。
图18A示出了SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的反义寡核苷酸缀合物的示意性结构。
图18B示出了反义寡核苷酸缀合物CIVI 008(cepadacursen)的详细化学结构和全名。
图19示出了示例性口服递送剂的化学结构。
图20示出了实施例9中呈现的临床试验的设计。
图21示出在有或没有SNAC的情况下施用后CIVI 008的血浆浓度水平。
图22示出了实施例9的研究的SQ(皮下)组(P0001、P0002、P0901和P0902)和PO(口服)组(P0301、P0302、P0303、P1201、P1202、P1203、P0401、P0402、P0403、P1301、P1302、P1303、P0501、和P1401)中的血浆AUC水平。
图23示出了实施例9中呈现的研究的SQ组和PO组中的CIVI 008的肝脏浓度水平。
图24示出了在口服CIVI 008施用后第35天和第42天PCSK9表达水平相对于基线水平的平均变化。
图25A和图25B示出了在施用一颗或两颗CIVI 008胶囊后(图25A)或在对照条件下(图25B)血浆LDL胆固醇水平相对于基线的变化。
图26示出了在实施例9中呈现的研究期间血浆LDL胆固醇水平相对于基线的变化。
图27示出了实施例11中呈现的研究的示意图。
图28示出了在施用5-CNAC后CIVI 008的血浆浓度水平。
图29示出了与包含SNAC或5-CNAC的CIVI 008胶囊剂的施用对应的药代动力学参数(平均AUC0-5和平均C最大)之间的比较。
图30示出了与以4号胶囊(A组)或0号胶囊(B组)施用CIVI 008与5-CNAC对应的血浆浓度水平和药代动力学参数(平均AUC0-5和平均C最大)。
图31示出了在施用以5-CNAC配制的5mg至30mg的CIVI 008的猴子中，在第1天和第3天的平均AUC和平均C最大。
图32A和图32B示出了通过干共混(图32A)或冷冻干燥(图32B)制备的胶囊剂中施用类似剂量的CIVI 008的猴子中，在第1天和第3天的平均药代动力学参数的比较。
图33示出了在投配22天后PCSK9和血浆LDL相对于基线的降低。
图34示出了在施用以SNAC或5-CNAC配制的CIVI 008的猴子中相对于基线的LDL降低％。
具体实施方式
本公开提供了用于口服递送的药物组合物，所述药物组合物包含反义寡聚物(例如，反义寡核苷酸)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂(例如，C10、SNAC、或5-CNAC)。在一些方面中，反义寡聚物的长度为16至22个连续核苷酸，并且其序列包含与SEQ ID NO:31的PCSK9靶序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA。
在一些方面中，寡聚物包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的序列。在一些方面中，所述反义寡核苷酸缀合物包含(i)长度为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物部分，其中其序列包含与SEQ ID NO:31的PCSK9靶序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA；和(ii)与寡聚物的5'末端缀合的GalNAc部分。在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物是CIVI 008，如图18B中所描绘。
例如丸剂或胶囊剂形式的本文所公开的口服药物组合物，例如包含CIVI 008的组合物，包含至少一种口服递送剂，所述至少一种口服递送剂在通过胃肠道(例如，通过胃和小肠的上部部分)期间保护有效负载(例如，CIVI 008)。在一些方面中，口服递送剂是以下物质的盐(例如钠盐)：脂肪酸，诸如辛酸(辛酸(caprylic acid/octanoic acid)，C8)、癸酸(癸酸(capric acid/decanoic acid/decylic acid)，C10)、它们的衍生物(例如，8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸、SNAC或5-CNAC)，或它们的组合。在特定方面中，口服递送剂是盐，例如SNAC的钠盐或5-CNAC的钠盐。
还提供了制造本文所公开的药物组合物的方法。本公开还提供治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用本文所公开的口服药物组合物。
定义
为了更容易理解本说明书，首先定义某些术语。贯穿详细描述阐述了附加定义。
需注意的是，术语“一”或“一个(种)”实体是一个(种)或多个(种)该实体；例如，“核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一”(或“一个(种)”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。
此外，本文所用的“和/或”应被视为对两个指定特征或部件中的每一者在有或没有另一者的情况下的具体公开。因此，本文中如在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解的是，无论在何处在本文中用语言“包含”来描述各方面，也以其他方式提供了在术语“由......组成”和/或“基本上由......组成”中描述的类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所关于的领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，《生物医学与分子生物学简明词典(ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology)》，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRCPress；《细胞和分子生物学词典(Dictionary of Cell and Molecular Biology)》，第3版，1999，Academic Press；和《牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology)》，修订版，2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的术语中的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(Système International de Unites,SI)认可形式表示。数值范围包含限定该范围的数值。除非另有说明，否则核苷酸序列以5'到3'取向从左到右书写。氨基酸序列以氨基到羧基取向从左到右书写。本文提供的小标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过参考整个说明书来获得。因此，下面直接定义的术语通过参考整个说明书来更充分地定义。
术语“约”在本文中用于意指大约、大致、……左右或在...的区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到所叙述的数值之上和之下来修饰该范围。通常，术语“约”可以通过例如10％、向上或向下(更高或更低)的变化修饰高于和低于所述值的数值。例如，如果叙述反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)在施用寡聚物或缀合物后使细胞中PCSK9蛋白的表达降低至少约60％，则暗示PCSK9表达水平降低了50％至70％的范围。
术语“寡聚物”或“寡核苷酸”在本公开的上下文中可互换使用，并且是指由两个或更多个核苷酸的共价键形成的分子。在本文中，单个核苷酸(单元)也可被称为单体或单元。
如本文所用的术语“衍生物”是指在结构上与本文公开的化合物相关的化合物(例如，C10、SNAC或5-CNAC)，例如具有相同碳骨架但经化学修饰以在一个或多个位置引入例如本文公开的侧链或基团的化合物，并且其中衍生物具有与实体或分子的生物活性基本上相似的生物活性(作为口服递送剂发挥作用的能力)其为衍生物。
如本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价接头团(键基团)(诸如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷间键基团)的糖苷，并且涵盖天然存在的核苷酸(诸如DNA或RNA)和包含经修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸(其在本文中也称为“核苷酸类似物”)两者。在本文中，单个核苷酸可被称为单体或单元。在某些方面中，术语“核苷酸类似物”是指具有经修饰的糖部分的核苷酸。本文别处公开了具有经修饰的糖部分的核苷酸的非限制性示例(例如，LNA)。在其他方面中，术语“核苷酸类似物”是指具有经修饰的核碱基部分的核苷酸。具有经修饰的核碱基部分的核苷酸包括但不限于5-甲基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些方面中，术语“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。应当认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基(诸如A、T、G、C或U，以及它们的类似物)的序列。
如本文所用的术语“核苷”用于指包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且因此可以在提及核苷酸单元时使用，所述核苷酸单元通过本文所公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)的核苷酸之间的核苷间键共价连接。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用于指代核酸单体或单元。在本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)的上下文中，术语“核苷酸”可以指单独的碱基，即包含胞嘧啶(DNA和RNA)、鸟嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)的核碱基序列，其中糖主链和核苷间键的存在是固有的。同样，特别是在寡核苷酸中的核苷间键基团中的一个或多个核苷间键基团经修饰的情况下，术语“核苷酸”可以指“核苷”。例如，即使在指定核苷之间的键的存在或性质时，也可以使用术语“核苷酸”。
在一些方面中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。应当认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基(诸如A、T、G、C或U)的序列。
复数术语“核酸”或“核苷酸”旨在涵盖复数个核酸。在一些方面中，术语“核酸”或“核苷酸”是指体内或体外的靶序列，例如前mRNA、mRNA或DNA。当所述术语是指靶序列中的核酸或核苷酸时，核酸或核苷酸可以是细胞内天然存在的序列。在其他方面中，“核酸”或“核苷酸”是指本公开的寡聚物或缀合物中的序列。当所述术语指本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)中的序列时，核酸或核苷酸可以是非天然存在的，即化学合成的、酶法产生的、重组产生的、或它们的任何组合。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)中的核酸或核苷酸是合成或重组产生的，而不是天然存在的序列或其片段。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)中的核酸或核苷酸不是天然存在的，因为它们含有至少一种在自然界中非天然存在的核苷类似物。
如本文所用的术语“反向互补的”、“反向互补”和“反向互补性”与术语“互补的”、“互补”和“互补性”可互换。
术语“互补”意指当一个序列可以以反向平行方式与另一序列结合时，所述两个序列是互补的，其中每个序列的3'末端与另一序列的5'末端结合，并且随后将一个序列的每个A、T(U)、G和C分别与另一个序列的T(U)、A、C和G进行比对。通常，寡核苷酸的互补序列与所定义的序列具有至少90％，优选地95％，最优选地100％的互补性。
术语“对应的核苷酸类似物”和“对应的核苷酸”旨在表示核苷酸类似物中的核苷酸与天然存在的核苷酸相同。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接到腺嘌呤时，“对应的核苷酸类似物”包含连接到腺嘌呤的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。核碱基的示例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些方面中，核碱基可独立地选自由以下组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶。在一些方面中，核碱基可独立地选自由以下组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。在一些方面中，本公开的寡聚物中存在的核碱基中的至少一个核碱基是选自由以下组成的组的经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
“核苷酸类似物”是借助于糖和/或碱基部分的修饰获得的天然核苷酸(诸如DNA或RNA核苷酸)的变体。在寡核苷酸的情境下，类似物原则上可以仅对天然核苷酸“沉默”或与天然核苷酸“等同”，即，对寡核苷酸工作以抑制靶基因表达的方式没有功能影响。然而，如果例如所述“等同”类似物被更容易或更便宜地制造，或对存储或制造条件更稳定，或代表标签或标记，则此类“等同”类似物仍然是有用的。
如本文所用，术语“PCSK9”是指前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型，是由人类1号染色体上的PCSK9基因编码的酶。PCSK9基因驻留于1号染色体的1p32.3带上。它是活化其他蛋白质的前蛋白转化酶家族蛋白质的第9个成员。跨许多物种都发现了类似的基因(直向同源物)。PCSK9的解析结构揭示了预处理的蛋白质中的四个主要部件：信号肽(残基1-30)；N末端前结构域(残基31-152)；催化结构域(残基153-425)；和C末端结构域(残基426-692)，所述C末端结构域进一步分为三个模块。N末端前结构域具有灵活的晶体结构，并且负责通过与催化结构域相互作用并封闭催化结构域来调节PCSK9功能，否则催化结构域会结合LDLR的表皮生长因子样重复序列A(EGF-A)结构域。虽然之前的研究表明C末端结构域不参与结合LDLR，但最近的研究已表明C末端结构域确实结合LDLR。PCSK9的分泌很大程度上依赖于信号肽和N末端前结构域的自动切割，但是N末端前结构域保留了其与催化结构域的缔合。特别地，N末端前结构域中的残基61-70对于其自动加工至关重要。
术语“其天然存在的变体”是指天然存在于所定义的分类群内的核酸序列的PCSK9多肽的变体，所述分类群为诸如哺乳动物，诸如小鼠、猴，并且优选地人。通常，当提及多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还可涵盖通过染色体易位或复制获得的在4号染色体、4C7处存在的编码PCSK9的基因组DNA的任何等位基因变体，以及RNA，诸如从其衍生的mRNA。“天然存在的变体”还可包括衍生自PCSK9 mRNA的可变剪接的变体。例如，当提及特定的多肽序列时，该术语还包括蛋白质的天然存在形式，因此所述蛋白质的天然存在形式可以通过例如共翻译修饰或翻译后修饰(例如，信号肽切割、蛋白水解切割或糖基化)进行加工。
如本文所用，“2'-F”是指在2'位置处包含氟基团的糖。
如本文所用，“2'-OMe”或“2'-OCH3”或“2'-O-甲基”各自是指包含糖的核苷，所述糖包含在糖环的2'位置处的含-OCH3基团。
如本文所用的术语“核苷酸长度”是指给定序列中核苷酸(单体)的总数。正如本领域普通技术人员将认识到的，寡核苷酸的5'末端核苷酸不包含5'核苷间键基团，尽管其可以包含5'末端基团。
本文所述的化合物可以包含几个不对称中心并且可以以光学纯对映异构体、对映异构体(例如外消旋体)的混合物、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体、或非对映异构外消旋体的混合物的形式存在。在一些方面中，不对称中心可以是不对称碳原子。术语“不对称碳原子”意指具有四个不同取代基的碳原子。根据Cahn-Ingold-Prelog法则，不对称碳原子可为“R”或“S”构型。
如本文所用，术语“双环糖”是指包含4至7元环的经修饰的糖部分，所述4至7元环包含桥，所述桥连接所述4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环结构。在一些方面中，该桥连接核苷的核糖环的C2'和C4'(即，2'-4'桥)，如在LNA核苷中所观察到的。
如本文所用，“编码区”、“编码序列”或“开放阅读框”是多核苷酸的一部分，所述部分由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不会被翻译成氨基酸，但其可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“UTR”)等不是编码区的一部分。编码区的边界通常由5'末端处的起始密码子和3'末端处的翻译终止密码子确定，所述起始密码子编码所得多肽的氨基末端，所述翻译终止密码子编码所得多肽的羧基末端。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)可以靶向编码PCSK9蛋白的核酸(例如RNA)的PCSK9编码区。
如本文所用的术语“非编码区”是指不是编码区的核苷酸序列。非编码区的示例包括但不限于启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“UTR”)、非编码外显子等。外显子中的一些外显子可以是每个转录物的5'非翻译区(5'UTR)或3'非翻译区(3'UTR)的全部或一部分。非翻译区对于转录物的有效翻译并且对于控制翻译速率和转录物的半衰期很重要。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)可以靶向编码PCSK9蛋白的核酸(例如RNA)的PCSK9非编码区。
术语“区域”当在核苷酸序列的上下文中使用时是指该序列的某一区段。例如，短语“核苷酸序列内的区域”或“核苷酸序列的互补序列内的区域”分别是指比所述核苷酸序列更短，但比位于特定核苷酸序列或所述核苷酸序列的互补序列内的至少10个核苷酸更长的序列。术语“子序列(sub-sequence/subsequence)”还可以指核苷酸序列的某一区域。
当提及核苷酸序列时，术语“下游”是指位于参考核苷酸序列的3'端的核酸或核苷酸序列。在某些方面中，下游核苷酸序列涉及在转录起点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)可以靶向编码PCSK9蛋白的核酸(例如，RNA)的在PCSK9开放阅读框(ORF)下游的区域。
术语“上游”是指位于参考核苷酸序列的5'端的核苷酸序列。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)可以靶向编码PCSK9蛋白的核酸(例如，RNA)的在PCSK9开放阅读框(ORF)上游的区域。
如本文所用，术语“调控区”是指位于编码区上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关联的编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译。调控区可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、UTR和茎环结构。如果编码区旨在在真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3'端。在一些方面中，本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)可以靶向调控区。
如本文所用的术语“转录物”可以指通过DNA转录合成并在加工后成为信使RNA(mRNA)的初级转录物，即信使RNA前体(前mRNA)，以及经加工的mRNA本身。术语“转录物”可与“前mRNA”和“mRNA”可互换使用。在DNA链转录为初级转录物后，将新合成的初级转录物以多种方式进行修饰以转化为其成熟的功能形式，从而产生不同的蛋白质和RNA，诸如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等。因此，术语“转录物”可包括外显子、内含子、5'UTR和3'UTR。
如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物，例如RNA或多肽的过程。所述过程包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)以及将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如，通过基因转录产生的信使RNA)，或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化或剪接)的核酸、或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚基缔合、或蛋白水解切割)的多肽。
在两个或更多个核酸的上下文中的术语“相同”或“同一性”百分比是指在在不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分的情况下比较并比对(如果需要的话，引入缺口)以获得最大对应性时，两个或更多个序列是相同的或者有特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或者通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件是本领域中已知的。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到必须引入以实现两个序列的最佳比对的添加或缺失(即，空位)的情况下，在比较窗口上由所述序列共享的相同匹配位置的数量。匹配位置是在靶序列和参考序列两者中存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。靶序列中存在的空位不被计数，因为空位不是核苷酸或氨基酸。同样，参考序列中存在的空位不被计数，因为计数的是靶序列核苷酸或氨基酸，而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸。
序列比对算法的一个此类非限制性示例是在Karlin等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中描述，如在Karlin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所改进，并且并入到NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)中的算法。在某些方面中，Gapped BLAST可以如在Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的其他公开可得的软件程序。在某些方面中，使用GCG软件包中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在某些替代方面，结合Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些方面中，使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可以使用ALIGN程序(版本2.0)并使用带有残基表、空位长度罚分为12并且空位罚分为4的PAM120来确定百分比同一性。本领域技术人员可以通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些方面中，使用比对软件的默认参数。
本领域技术人员应理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的产生不限于完全由一级序列数据驱动的二元序列-序列比较。序列比对可以源自多重序列比对。一种生成多重序列比对的合适程序是可从www.clustal.org获得的ClustalW2。另一种合适的程序是可从www.drive5.com/muscle/获得的MUSCLE。ClustalW2和MUSCLE替代地可从例如EBI(欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute))获得。
还应理解的是，序列比对可以通过将序列数据与来自异质源的数据整合来生成，所述来自异质源的数据为诸如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变位置)、或系统发生数据。整合异质数据以生成多重序列比对的合适程序是T-Coffee，其可在www.tcoffee.org获得，并且替代地可从例如EBI获得。还应当理解的是，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动策划。
在某些方面中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的同一性百分比“X”计算为100×(Y/Z)，其中Y是在第一序列和第二序列的比对中被评分为相同匹配的氨基酸残基的数目(如通过目视检查或特定序列比对程序比对)，并且Z是第二序列中残基的总数。如果第一序列的长度比第二序列长，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
与多核苷酸参考序列比对的单个多核苷酸靶序列内的不同区域可以各自具有其自身的序列同一性百分比。需注意，序列同一性百分比值被四舍五入到最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入为80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入为80.2。还需注意的是，长度值将始终是整数。
在确定本公开的寡聚物(或其区域)与靶区域(诸如本文公开的那些)之间的“互补性”程度时，“互补性”(也称为“同源性”或“同一性”)程度被表示为寡聚物(或其区域)的序列同与其最佳比对的靶区域(或靶区域的反向互补序列)的序列之间的同一性百分比(或同源性百分比)。所述百分比是通过以下方式计算的：对两个序列之间相同的比对碱基的数量进行计数，除以寡聚物中连续单体的总数，然后乘以100。在此类比较中，如果存在空位，则优选的是此类空位仅是错配处，而不是空位内的单体数量在本公开的寡聚物与靶区域之间不同的区域。
如本文所用，术语“抑制”和“降低”例如PCSK9基因转录物的表达和/或PCSK9蛋白水平或PCSK9活性是指本文中公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)减少细胞、组织或受试者中PCSK9基因转录物的表达和/或降低细胞、组织或受试者中PCSK9蛋白水平和/或活性。
在一些方面中，术语“抑制”和“降低”是指对PCSK9基因转录物或PCSK9蛋白水平和/或活性的完全抑制(100％抑制或不可检测的水平)。在其他方面中，术语“抑制”和“降低”是指对细胞、组织或受试者中的PCSK9基因转录物和/或PCSK9蛋白表达和/或活性的例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少99％抑制。
多核苷酸变体可包含编码区、非编码区或两者中的改变。在一个方面中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码的多肽的性质或活性的改变。在另一方面中，由于遗传密码的简并性，通过沉默取代产生核苷酸变体。在其他方面中，变体中的5-10、1-5或1-2个氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为其他，例如细菌宿主，诸如大肠杆菌(E.coli))。
天然存在的变体被称为“等位基因变异”，并且是指占据生物体染色体上的给定基因座的基因的几种替代形式之一(Genes II,Lewin,B.,编辑,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上发生变化，并且被包括在本公开中。或者，可以通过诱变技术或通过直接合成产生非天然存在的变体。
如本文所用，术语“连接至”或“缀合至”可互换使用并且是指在第一部分和第二部分(例如，本公开的寡聚物(例如，反义寡核苷酸)与缀合物部分(例如，GalNAc))之间形成的共价或非共价键。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指任何需要诊断、治疗或疗法的哺乳动物受试者，尤其是人类。本文所述的组合物和方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些方面中，受试者是哺乳动物，而在其他方面中，受试者是人。如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人类、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，奶牛、绵羊、猪、马等)和实验动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。
术语“药物组合物”是指这样的制备物，所述制备物的形式允许使活性成分的生物活性有效，并且所述制备物不含对要施用所述组合物的受试者具有不可接受毒性的附加组分。这种组合物可以是无菌的。术语“口服药物组合物”是指可以口服施用的药物组合物。口服施用是通过口腔服用物质的施用途径。缩写为P.O.的“Per os”有时用作口服药物的指示。许多药物都是口服的，因为它们旨在具有全身效应，例如经由血流到达身体的不同部位。
如本文所用的术语“递送剂”是指可用于递送本公开的治疗剂的载体化合物或载体分子。如本文所用的术语“口服递送剂”是指可用于口服递送本公开的治疗剂的载体化合物或载体分子。
在一些方面中，本公开的药物组合物是口服施用的。如本文所用的术语“口服”及其语法变体(例如，口服地)包括任何种类的口服递送途径(包括经颊、唇下和舌下途径)。用于口服施用的药物可以有多种形式，包括口服固体剂型(OSD)形式(例如，用于吞服、咀嚼或溶于水中或舌下的片剂；胶囊剂和可咀嚼的胶囊剂，例如带有可在胃或肠道中溶解以在所述胃或肠道中释放药物的包衣；缓释(time-release/sustained-release)片剂和胶囊剂，所述缓释片剂和胶囊剂逐渐释放药物；粉末剂；或颗粒剂)，以及口服液体剂型(例如，茶、滴剂、液体药物、混悬剂或糖浆剂)。
如本文所用，“施用”意指经由药学上可接受的途径(例如，口服)向受试者给予组合物，例如包含本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)的口服药物组合物。例如包含本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)的口服药物组合物的“有效量”是足以实现特定说明的目的的量。“有效量”可以凭经验并以常规方式根据所说明的目的来确定。
如本文所用，“治疗(treat/treatment/treating)”是指例如降低疾病或病症的严重性；缩短病程的持续时间；改善或消除与疾病或病症相关联的一种或多种症状；向患有疾病或病症的受试者提供有益效应，但不一定治愈所述疾病或病症。该术语还包括预防或防止疾病或病症或其症状。
如本文所用，“预防”或“防止”是指减少或降低特定结局的发生或严重性。在一些方面中，预防某一结局是通过预防性治疗来实现的。在一些方面中，将包含本文公开的寡聚物(例如，反义寡聚物，ASO)或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)的口服药物组合物预防性地施用于受试者。在一些方面中，受试者处于发展例如高胆固醇血症或心脏病的风险下。
I.口服药物组合物
本公开提供了用于口服施用的药物组合物，即口服药物组合物或制剂，所述药物组合物包含反义寡聚物和口服递送剂。在一些方面中，其中所述反义寡聚物的长度为16至22个连续核苷酸，其中所述反义寡聚物的序列包括与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA。在一些方面中，所述反义寡聚物可以缀合至能够靶向特定组织(例如，肝脏)的部分。因此，在一些方面中，本公开提供了一种用于口服施用的药物组合物，即口服药物组合物或制剂，所述药物组合物包含反义寡核苷酸缀合物和口服递送剂，其中所述反义寡核苷酸缀合物包含例如(i)为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，和(ii)至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，其中所述反义寡聚核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA。在一些方面中，寡聚物可以是本公开的第II小节中公开的任何寡聚物。在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物可以是本公开的第III小节中公开的任何寡核苷酸缀合物。
在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物是图18A中呈现的SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19所示的分子。在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物是(GalNAc)3-氨基-六亚甲基-5'硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧鸟苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基十六烷钠盐，即CIVI 008。还参见图18B上CIVI 008的详细化学式。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物包含本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂，所述口服递送剂选自由以下组成的组：SNAC、C10、5-CNAC、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合。在一些方面中，可用于本公开的口服递送剂可包括例如这样的药剂，所述药剂为例如在美国专利号5,866,536中公开的123种经修饰的氨基酸中的任何一种或为例如在美国专利号5,773,647,中描述的193种经修饰的氨基酸中的任何一种，或它们的任何组合。上述美国专利号5,773,647和5,866,536的内容据此通过引用方式以其全文并入本文。
在一些方面中，口服递送剂包含单一化合物(例如，C8、C10、SNAC或5-CNAC)。在其他方面中，口服递送剂包含化合物的组合(例如，C8、C10、SNAC或5-CNAC的任何组合)。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC、5-CNAC、4-CNAB、4-MOAC、SNAD、4-HPO(8-(4-羟基苯氧基)辛酸)、5-PPA(5-苯基戊酸)、2-PHOD(8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺)、3-TBA(4-间甲苯氧基丁酸)、2-HPOD(2-(5-戊酸)-5-(2-羟基苯基)-l,3,4-噁二唑)、7-OPHA(7-氧代-7-苯基庚酸)、3-HPSB(4-(3-羟基苯硫醇基)丁酸)、4-IBOA((4-异丙基苄氧基)乙酸)、3-FPSB(4-(3-氟苯基硫醇基)丁酸)，或它们的任意组合。参见例如，图22。
在一些方面中，SNAC可以任选地用类似的化合物，诸如SNAD(10-N-(2-羟基苯甲酰基)氨基癸酸钠)替代。SNAD的结构与SNAC的结构的不同之处仅在于脂肪酸部分的长度。在本公开的一些方面中，SNAC可以任选地被类似的化合物替代，其中SNAC的辛酸部分被长度至少6个碳原子，例如长度为6至20个碳原子，任选地长度为6至18个碳原子、任选地长度为6至16个碳原子、任选地长度为6至14个碳原子，任选地长度为6至12个碳原子并且任选地长度为6至10个碳原子的另一脂肪酸部分替代。脂肪酸部分可以是饱和的(例如，如SNAC中的辛酸和SNAD中的癸酸)或不饱和的(即，包含至少一个不饱和碳-碳键)。
在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸，如下所示。
在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任何组合。
在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任何组合。在一些方面中，N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是二钠盐。在一些方面中，所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是单钠盐(沙波立沙钠203787-91-1,SNAC，8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠)，如下所示。
在一些方面中，口服递送剂包含5-CNAC(N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸)，如下所示
在一些方面中，口服递送剂包含N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐。在一些方面中，口服递送剂包含N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任何组合。
在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任意组合。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是二钠盐。在一些方面中，N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是单钠盐。
在一些方面中，口服递送剂包含4-CNAB(4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸；Salclobuzate)，如下所示
在一些方面中，口服递送剂包含4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐。在一些方面中，口服递送剂包含4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任意组合。
在一些方面中，4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐选自由以下组成的组：4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任意组合。在一些方面中，4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐是钠盐。在一些方面中，4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐是二钠盐。在一些方面中，4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸的盐是单钠盐。
在一些方面中，口服递送剂包含4-MOAC(N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸)，如下所示
在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐、水合物或溶剂合物，或它们的任意组合。
在一些方面中，N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任意组合。在一些方面中，N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐是二钠盐。在一些方面中，N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸的盐是单钠盐。
在一些方面中，口服递送剂包含SNAD(N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸)，如下所示
在一些方面中，口服递送剂包含N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐。在一些方面中，口服递送剂包含N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任意组合。
在一些方面中，N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐选自由以下组成的组：N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任意组合。在一些方面中，N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐是钠盐。在一些方面中，N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐是二钠盐。在一些方面中，N-(10-[2-羟基苯甲酰基]-氨基)癸酸的盐是单钠盐。
在一些方面中，口服递送剂包含图22中呈现的化合物。在一些方面中，口服递送剂包含图22中呈现的化合物的盐。在一些方面中，口服递送剂包含图22中呈现的化合物的溶剂化物。在一些方面中，口服递送剂包含图22中呈现的化合物的水合物。在一些方面中，口服递送剂包含图22中呈现的化合物的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任意组合。
在一些方面中，图22中呈现的化合物的盐选自由以下组成的组：图22中呈现的化合物的钠盐、钾盐、钙盐，以及它们的任意组合。在一些方面中，图22中呈现的化合物的盐是钠盐。在一些方面中，图22中呈现的化合物的盐是二钠盐。在一些方面中，图22中呈现的化合物的盐是单钠盐。
参见US5650386A、US6399798B2、US7384982B2、US7659311B2、US8003697B2、US8207227B2、US8658695B2、US7544833B2、US7659311、US8003697、US8207227、US8658695、US7384982、US9278123B2、US10086047B2、US20180360918A1、US20110092426A1、US20150283212A1、US8435946B2、US8748383B2、US7569539B2，所有这些专利或专利申请通过引用方式以其全文并入本文。
在一些方面中，口服递送剂包含下式的化合物
其中
R1、R2、R3、和R4独立地为氢、-OH、-NR6R7、卤素、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基；
R5是取代或未取代的C2-C16亚烷基，取代或未取代的C2-C16亚烯基、取代或未取代的C1-C12烷基(亚芳基)、或取代或未取代的芳基(C1-C4亚烷基)；并且
R6和R7独立地为氢、氧或C1-C4烷基。
在一些方面中，口服递送剂包含如上所述的式化合物，其中所述化合物是游离酸或钠盐，例如单钠盐或二钠盐。在一些方面中，所述化合物是水合物或溶剂化物。在一些方面中，所述化合物是醇溶剂化物。在一些方面中，所述醇溶剂化物是乙醇溶剂化物。在一些方面中，所述乙醇溶剂化物是盐的溶剂化物。在一些方面中，所述乙醇溶剂化物是单钠盐的乙醇溶剂化物。在一些方面中，所述乙醇溶剂化物是二钠盐的乙醇溶剂化物。在一些方面中，所述化合物是水合物。在一些方面中，所述水合物是盐的水合物。在一些方面中，所述水合物是单钠盐的水合物。在一些方面中，所述水合物是二钠盐的水合物。
在一些方面中，可用于本公开的口服递送剂可包括中链脂肪酸(MCFA)，诸如C8(辛酸)、C10(癸酸)或C12(月桂酸)、其衍生物、其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，或它们的任意组合。
在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的溶剂化物。如本文所用的术语“溶剂化物”包括但不限于溶剂的分子或离子与递送剂化合物或其盐、或其水合物或溶剂化物的分子或离子的分子或离子复合物。
在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的水合物。如本文所用的术语“水合物”包括但不限于(i)含有以分子形式结合的水的物质；和(ii)含有一个或多个结晶水分子的结晶物质或含有游离水的结晶材料。
在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的溶剂化物，其中所述盐是钠盐、钾盐、钙盐，或它们的组合。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的溶剂化物，其中所述盐是钠盐。
在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CAN的盐的溶剂化物，其中所述盐是单钠盐。在一些方面中，口服递送剂包含C8的钠盐，例如癸酸单钠。在一些方面中，口服递送剂包含C10的钠盐，例如辛酸单钠。在一些方面中，口服递送剂包含SNAC的钠盐，例如SNAC单钠。在一些方面中，口服递送剂包含5-CNAC的钠盐，例如5-CNAC单钠。
在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的醇溶剂化物，其中所述盐是钠盐。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的醇溶剂化物，其中所述盐是单钠盐。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的水合物，其中所述盐是钠盐。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的水合物，其中所述盐是单钠盐。在一些方面中，口服递送剂包含C8、C10、SNAC或5-CNAC的盐的水合物，其中所述盐是钠盐，并且所述水合物是一水合物。
制备钠盐、醇溶剂化物和水合物的方法描述于例如国际公开案WO 00/059863中，该国际公开案的全文以引用方式并入本文。例如，可以通过本领域已知的方法蒸发或干燥乙醇溶剂化物以形成无水钠盐，从而从乙醇溶剂化物制备钠盐。干燥通常在约80℃至约120℃、例如约85℃至约90℃的温度下进行。在一些方面中，干燥在约85℃下进行。干燥步骤通常在约660mm Hg(8.8kPa)或更大的压力下进行。基于100％总重量的无水钠盐，无水钠盐通常含有小于约5重量％的乙醇，优选地小于约2重量％的乙醇。
本文公开的口服递送剂的钠盐还可以通过将递送剂在水中制成浆料并添加含水氢氧化钠、醇钠等来制备。合适的醇钠包括但不限于甲醇钠、乙醇钠以及它们的组合。制备钠盐的又一方法是通过使递送剂与氢氧化钠反应以产生钠盐。
通过真空蒸馏将含有钠盐的溶液浓缩成浓稠糊状物，可以将钠盐作为固体分离。可以将这种糊状物在真空烘箱中干燥以获得作为固体的递送剂的钠盐。还可以通过将二钠盐的水溶液进行喷雾干燥来分离固体。本文公开的口服递送剂可以通过本领域已知的方法制备，例如，如上所述，通过美国专利号5,773,647和5,866,536中描述的方法来制备，该美国专利通过引用方式以其全文并入本文。
本文公开的口服递送剂分子(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)的乙醇溶剂化物包括但不限于乙醇溶剂的分子或离子与递送剂的钠盐的分子或离子的分子或离子复合物。通常，对于递送剂的钠盐的每个分子，乙醇溶剂化物含有约一个乙醇分子或离子。
递送剂的钠盐的乙醇溶剂化物可以通过将递送剂溶解在乙醇中来制备。然后，使递送剂/乙醇溶液与相对于递送剂摩尔过量的含钠盐(例如含单钠的盐)反应(即，对于每摩尔递送剂，存在多于一摩尔的钠阳离子)，从而得到乙醇溶剂化物。合适的单钠盐包括但不限于：氢氧化钠；醇钠，诸如甲醇钠和乙醇钠；以及前述的任意组合。通常，反应在混合物的回流温度或低于该回流温度下(诸如在环境温度)执行。然后通过本领域已知的方法回收乙醇溶剂化物，诸如在常压蒸馏下浓缩所得浆料，冷却浓缩的浆料并过滤出固体。然后可以将回收的固体真空干燥以获得乙醇溶剂化物。
递送剂的钠盐的水合物可以通过将乙醇溶剂化物干燥以形成如上所述的无水二钠盐，以及使所述无水钠盐水合来制备。在一些方面中，形成钠盐的一水合物。由于无水钠盐是非常吸湿的，因此在暴露于大气水分时会形成水合物。通常，水合步骤在约环境温度至约50℃、优选环境温度至约30℃下且在具有至少50％相对湿度的环境中执行。或者，无水钠盐可以用蒸汽水合。
本公开的口服药物组合物通常含有有效量的本文公开的递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)中的一种或多种递送剂，即足以递送活性剂(例如，CIVI 008)以达到期望的效应的量。通常，口服递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)以约2.5重量％至约99.4重量％的量存在。在一些方面中，口服递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)以约15重量％至约75重量％的量存在。在一些方面中，口服递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)以至少约25重量％、至少约30重量％或至少约35重量％，但等于或小于约60重量％或约70重量％的量存在。因此，在一些方面中，口服递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)以至少约25重量％、至少约30重量％、至少约35重量％，至少约40重量％、至少约45重量％、至少约50重量％、至少约55重量％、至少约60重量％、至少约65重量％、或至少约70重量％的量存在。在一些方面中，口服递送剂(例如，C8、C10、SNAC、5-CNAC或其任意组合)以约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％或约70重量％的量存在。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物作为单剂量施用。术语“单剂量”意指根据本发明的包含本文所公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和选自由SNAC、C10或5-CNAC、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合组成的组的口服递送剂的口服药物组合物，例如以口服单位剂量形式，以单剂量施用于人类或动物患者。
在一些方面中，本公开的药物组合物作为多剂量施用。术语“多剂量”意指根据本发明的包含本文所公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和选自由SNAC、C10或5-CNAC、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合组成的组的口服递送剂的口服药物组合物，例如以口服单位剂量形式，根据适合于该组合物的投配间隔以至少两个剂量施用于人或动物患者。
如本文所用，术语“口服单位剂量形式”是指如本领域已知的适合于人类和动物食用且单独包装的物理离散单位。出于本公开的目的，预期包含治疗有效量的本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂的剂型可包括一个或多个单位剂量(例如，片剂、胶囊剂)以实现治疗效应。
本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)的口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)可以在饭前约5分钟至约60分钟施用。本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)的口服剂型可以在饭前约30分钟至约60分钟施用。本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)的口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)可以在饭前约45分钟至约90分钟施用。本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)的口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)可以在饭前约60分钟(1小时)至约120分钟(2小时)施用。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)可以在饭前至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约60分钟、至少约65分钟、至少约70分钟、至少约75分钟、至少约80分钟、至少约85分钟、至少约90分钟、至少约95分钟、至少约100分钟、至少约105分钟、至少约110分钟、至少约115分钟、或至少约120分钟施用。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)可以在饭前约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、或约120分钟施用。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)在饭前至少约30分钟施用。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)在饭前至少约45分钟施用。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)在饭前至少约60分钟施用。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)在摄入食物前至少约2小时施用。
本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)可以以固体形式提供。在一些方面中，所述固体形式是胶囊剂，例如软凝胶胶囊剂或液体填充胶囊剂(液体胶囊剂)。本公开的口服药物组合物还可以作为片剂、囊片或其他固体口服剂型提供，所有这些都可以通过本领域众所周知的方法制备。
在一些方面中，口服剂型(例如片剂或胶囊剂)的重量可在约5mg与约1000mg之间、在约10mg与约500mg之间、在约10mg与约250mg之间、在约100mg与约200mg之间、或在约250mg与约500mg之间。在一些方面中，口服剂型(例如片剂或胶囊剂)的重量为约5mg、约10mg、约20mg、约25mg、约50mg、约100mg、约200mg、约250mg、约375mg、约500mg、约750mg、或约1000mg。
在一些方面中，口服剂型(例如片剂或胶囊剂)中反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物(例如CIVI 008)的量在约1mg至约100mg、约5mg至约100mg、约10mg至约100mg、约20mg至约100mg、或约20mg和约50mg的范围内。
在本公开的一些方面中，CIVI 008被配制为胶囊剂形式，其中所述胶囊剂是硬壳明胶胶囊剂。在一些方面中，胶囊剂是0号胶囊剂(闭合长度21.7mm×外径7.6mm)。在一些方面中，胶囊剂是4号的胶囊剂(闭合长度14.3mm×外径5.05mm)。在一些方面中，胶囊剂含有在约5mg与约30mg之间的CIVI 008(cepadacursen sodium)，例如约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg或约30mg的CIVI 008。在一些方面中，胶囊剂含有约100mg或约200mg的5-CNAC，例如约100mg、约125mg、约150mg、约175mg或约200mg的5-CNAC。在一些方面中，胶囊剂的填充物通过干共混各成分(即，干CIVI 008和干5-CNAC)制造。在一些方面中，胶囊剂的填充物通过冷冻干燥共溶的成分混合物(即，CIVI 008和5-CNAC)制造。在一些方面中，胶囊剂包含约10mg的CIVI 008和约100mg的5-CNAC。在一些方面中，胶囊剂包含约20mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC。在一些方面中，胶囊剂包含约5mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC。在一些方面中，胶囊剂包含约25mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC。在一些方面中，胶囊剂包含约30mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC。
在一些，本公开提供了一种药物组合物，例如胶囊剂形式的药物组合物，所述药物组合物包含例如约10mg的CIVI 008和约100mg的5-CNAC、约20mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、约5mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、约25mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、或约30mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC，其中将所述药物组合物施用于受试者导致平均AUC0-50相对于当将包含SNAC而不是5-CNAC的对应药物组合物施用于受试者时测量的平均AUC0-50增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。在一个具体方面中，平均AUC0-50相对于当将包含SNAC而不是5-CNAC的对应药物组合物施用于受试者时测量的平均AUC0-50的增加为约80％。
如本文所用的术语“包含SNAC而不是5-CNAC的对应药物组合物”是指包含与测试药物组合物相同的组分的参考药物组合物，其中参考药物组合物与测试药物组合物之间的唯一不同在于是用5-CNAC取代参考药物组合物中存在的SNAC。例如，如果测试药物组合物是含有10mg的CIVI 008和100mg的5-CNAC的4号胶囊剂形式，则对应的参考药物组合物也会是4号胶囊剂形式并且含有10mg的CIVI 008和100mg的SNAC。
在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，例如胶囊剂形式的药物组合物，所述药物组合物包含例如约10mg的CIVI 008和约100mg的5-CNAC、约20mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、约5mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、约25mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC、或约30mg的CIVI 008和约200mg的5-CNAC，其中将所述药物组合物施用于受试者导致平均C最大相对于当将包含SNAC而不是5-CNAC的对应药物组合物施用于受试者时测量的平均C最大增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、或至少约150％。在一个具体方面中，平均C最大相对于当将包含SNAC而不是5-CNAC的对应药物组合物施用于受试者时测量的平均C最大的增加为约110％。
在一些方面中，口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)中反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物(例如CIVI 008)的量为约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg、约40mg、约41mg、约42mg、约43mg、约44mg、约45mg、约46mg、约47mg、约48mg、约49mg、约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg、约61mg、约62mg、约63mg、约64mg、约65mg、约66mg、约67mg、约68mg、约69mg、约70mg、约71mg、约72mg、约73mg、约73mg、约75mg、约76mg、约77mg、约78mg、约79mg、约80mg、约81mg、约82mg、约83mg、约84mg、约85mg、约86mg、约87mg、约88mg、约89mg、约90mg、约91mg、约92mg、约93mg、约94mg、约95mg、约96mg、约97mg、约98mg、约99mg、或约100mg。
在一些方面中，除了本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂(例如，SNAC、C10、或5-CNAC)之外，本公开的口服药物组合物还可包含至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合。在一些方面中，例如通常采用的量的至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合选自由以下组成的组但不限于：pH调节剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、芳香剂、润湿剂、张力调节剂、着色剂、表面活性剂、增塑剂、润滑剂(诸如硬脂酸镁)、助流剂、压缩助剂、增溶剂、赋形剂、稀释剂(诸如微晶纤维素(例如，Avicel PH 102))，或它们的任意组合。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合))包含微晶纤维素。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合))包含磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、二醇类、其他分散剂，或它们的任意组合。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合))可包含稀释剂，例如如微晶纤维素(例如，Avicel(微晶纤维素))和润滑剂(例如硬脂酸镁)。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)与口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的组合)可包含聚维酮和/或交聚维酮。交聚维酮可以是任何交聚维酮。交聚维酮是N-乙烯基-2-吡咯烷酮(也称为1-乙烯基-2-吡咯烷酮)的合成交联均聚物，分子量为1,000,000或更高。市售的交聚维酮包括可从ISP获得的Polyplasdone XL(交聚维酮XL)、Polyplasdone XL-10(交聚维酮XL-10)、Polyplasdone INF-10(交聚维酮INF-10)，可从BASF Corporation获得的Kollidon CL(聚乙烯吡咯烷酮CL)。在一些方面中，交聚维酮是Polyplasdone XL。聚维酮是由直链1-乙烯基-2-吡咯烷酮基团组成的合成聚合物，分子量通常在2,500与3,000,000之间。市售的聚维酮包括可从BASF Corporation获得的KollidonK-30(聚乙烯吡咯烷酮K-30)、Kollidon K-90F(聚乙烯吡咯烷酮K-90F)和可从ISP获得的Plasdone K-30(聚维酮K-30)和Plasdone K-29/32(聚维酮K-29/32)。如上所述，交聚维酮和聚维酮是市售的。或者，它们可以通过已知方法合成。交聚维酮、聚维酮或其组合可以相对于整个口服药物组合物的总重量为0.5重量％至50重量％，例如相对于口服药物组合物的总重量为约2重量％至约25重量％、或约5重量％至约20重量％的量存在于本公开的口服药物组合物中。
在一些方面中，包含本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)和口服递送剂(诸如SNAP或C10)以及任选的他汀类)的口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)可包含包衣，例如肠溶包衣和/或pH敏感包衣，并且任选地包含酶抑制剂。因此，在一些方面中，固体口服剂型在胃中基本上不崩解或溶解，但在肠中基本上崩解或溶解。在一些方面中，本公开的口服药物组合物(例如，反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)和口服递送剂(诸如SNAP、C10或5-CNAC)以及任选的他汀类)可进一步包含一种或多种酶抑制剂，所述一种或多种酶抑制剂防止药物制剂中的活性剂(例如，反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI008)和/或任选的治疗剂(诸如他汀类))在胃或上肠中酶促降解。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物或本文公开的口服剂型(例如片剂或胶囊剂)是肠溶包衣的以延迟在胃中崩解。肠溶衣包括但不限于羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯)、以及它们的组合。在又一方面中，口服药物制剂可配制为从口服剂型的表面侵蚀，而不是崩解。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物或本文公开的口服剂型(例如，片剂或胶囊剂)进一步包含pH敏感包衣，例如，pH敏感聚合物，所述pH敏感包衣保护口服药物组合物或其口服剂型免受胃中酸性环境的影响。在一些方面中，pH敏感聚合物包括纤维素、丙烯酸或其衍生物。在一些方面中，所述pH敏感包衣包含pH敏感水凝胶、pH活化的药物递送系统、pH敏感脂质体、胶束或脂质纳米粒子、pH敏感微球体、pH敏感纳米粒子，或它们的任何组合。
下面更详细地描述例如在液体或凝胶胶囊剂中使用的肠溶(抗胃)包衣、pH敏感包衣、酶抑制剂和基于明胶的制剂。
在一些方面中，除了本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)之外，本公开的口服药物组合物还可包含第二治疗活性化合物(治疗剂)，所述第二治疗活性化合物选自由以下组成的组：他汀类(例如，洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀或其组合)、依泽替米贝、胆汁螯合树脂、烟酸、纤维酸衍生物、普罗布考、新霉素、右旋甲状腺素、植物甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂、英普他派、胆汁酸转运蛋白抑制剂、肝CYP7a调节剂、雌激素替代治疗剂、以及抗炎剂。通常，除了本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)和口服递送剂(例如，SNAC、C10、或5-CNAC)之外，本公开的口服药物组合物还可包含在本领域中用于治疗与PCSK9表达和/或PCSK9活性增加相关的疾病或病症的第二治疗活性化合物。
在一些方面中，本公开提供了一种降低细胞中PCSK9的表达水平和/或活性的体外方法，所述方法包括施用有效量的本公开的口服药物组合物，所述口服药物组合物包含例如本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)、口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)和任选的第二治疗剂(诸如他汀类)。
本公开还提供了一种降低有需要的受试者中PCSK9表达水平和/或PCSK9活性水平的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的口服药物组合物的药物组合物，所述口服药物组合物包含例如本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)、口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)和任选的第二治疗剂(诸如他汀类)。还提供了一种降低有需要的受试者中胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的口服药物组合物，所述口服药物组合物包含例如本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)、口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)和任选的第二治疗剂(诸如他汀类)。
本发明的口服药物组合物可以通过常规方法制备，例如通过将一种或多种活性剂、口服递送剂和其他成分的混合物共混，捏合，并填充到胶囊剂中，或代替填充到胶囊剂中，成型之后进一步压片或压缩成型以得到片剂。另外，可以通过已知方法形成固体分散体，然后进一步加工以形成片剂或胶囊剂。在一些方面中，本公开的口服药物组合物的成分在整个固体剂型中均质地或均匀地混合。
如本文所用的术语“胶囊剂”旨在意指包含硬壳或软壳(例如，明胶壳)的药物制备物，所述硬壳或软壳通常容纳有单剂量的活性物质(例如，CIVI 008)。在一个方面中，胶囊剂旨在用于口服施用。在一些方面中，胶囊剂壳(也称为胶囊剂主体)将在摄入(例如，吞咽)后在胃中崩解以释放胶囊剂内容物(例如，本文公开的包含例如CIVI 008和5-CNAC的干共混物)。
如本文所用，术语“干共混”意指在不存在液体介质的情况下将几种组分(例如，CIVI 800和5-CNAC)彻底混合在一起。在一些方面中，干共混物的组分(例如，CIVI 800、5-CNAC或两者)可以是粉末形式。在一些方面中，干共混物的组分(例如，CIVI 800和5-CNAC)可以是微粒形式，例如粒状的。
在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含10mg的CIVI008(cepadacursen)和100mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含20mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含5mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含10mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含25mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含30mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。
在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂(例如，肠溶包衣的硬壳明胶胶囊剂)，所述胶囊剂包含10mg的CIVI 008(cepadacursen)和100mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含20mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含5mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含10mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含25mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含30mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含10mg的CIVI 008(cepadacursen)和100mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂(例如，肠溶包衣的硬壳明胶胶囊剂)中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含20mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含5mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含10mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含25mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含30mg的CIVI 008(cepadacursen)和200mg的5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。
在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40或1:50的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:5的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:10的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:20的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:40的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。
在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含比率为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40或1:50的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含比率为1:5的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含比率为1:10的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含比率为1:20的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。在一些方面中，本公开提供了一种胶囊剂，所述胶囊剂包含比率为1:40的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40或1:50的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:5的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:10的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:20的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的高表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含比率为1:40的CIVI 008(cepadacursen)和5-CNAC，其中这两种组分均在干共混物中，并且任选地其中所述组分在胶囊剂中。
本公开还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的口服药物组合物(例如，包含CIVI 008和口服递送剂例(诸如SNAC或5-CNAC))和书面使用说明，所述书面使用说明指示例如口服药物组合物可以在进食前服用。
在一些方面中，本公开的口服药物组合物包含反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物包含：长度为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQ ID NO:31(或本文公开的另一合适的PCSK9靶区)的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体(例如，3-10-3缺口聚体)；以及至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，靶向肝脏的部分，诸如GalNAc)，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，其中所述反义寡聚核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA。
在一些方面中，所述反义寡核苷酸缀合物包含或由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成。在一些方面中，所述反义寡核苷酸缀合物是本文公开的反义寡核苷酸缀合物(例如，SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的反义寡核苷酸缀合物)的药学上可接受的盐。在一些方面中，所述盐是钠盐。在一些方面中，所述反义寡核苷酸缀合物每核苷酸单元包含一个钠离子。因此，在一个特定的方面中，本公开的反义寡核苷酸是指定为CIVI 008的SEQ ID NO:19钠盐，其是SEQ ID NO:19的反义寡核苷酸缀合物的十六钠盐，如图18B所描绘。
本公开的口服药物组合物中可用于靶向编码PCSK9蛋白的核酸(例如，RNA)的寡核苷酸缀合物的类型不限于反义寡核苷酸(ASO)。在一些方面中，如下文更详细描述的，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡聚物可以是siRNA、shRNA、适体、或能够调节PCSK9的表达和/或活性的任何核酸。在一些方面中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡聚物可以是单体或多聚体，例如，本公开的寡聚物的多个串联单元，例如衍生自SEQ ID NO:26的寡聚物，例如SEQID NO:2或SEQ ID NO:3。因此，在一些方面中，寡聚物包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多个串联拷贝，可切割接头插置在多聚寡聚物(multimeric oligomer)中的各个ASO单元之间。在一些方面中，本公开的寡聚物可以是单链的或双链的。
在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向RNA，例如前mRNA、前mRNA的剪接变体或成熟mRNA。在一些方面中，RNA，例如前mRNA、前mRNA的剪接变体或成熟mRNA，对应于正常PCSK9基因的等位基因变体。在一些方面中，RNA，例如前mRNA、前mRNA的剪接变体或成熟mRNA，对应于正常PCSK9基因的突变体。在一些方面中，突变体是功能获得性突变体。在一些方面中，可能期望抑制功能获得性突变体的表达和/或活性以降低PCSK9活性。然而，在一些方面中，如果突变形式的表达可能是有害的或导致突变或无活性PCSK9蛋白的沉积物积累，则可能期望抑制功能丧失突变体的表达。
在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向PCSK9外显子内的序列。在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向PCSK9内含子内的序列。在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向包含外显子与内含子之间的接合部的序列。在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向在编码PCSK9的开放阅读框的5'端上游的序列。在一些方面中，本文公开的寡聚物或寡核苷酸缀合物可以靶向在编码PCSK9的开放阅读框的3'端下游的序列。
第II小节(反义寡核苷酸)和第III小节(寡核苷酸缀合物)提供了可在本公开的口服药物组合物中使用的寡聚物(例如，反义寡核苷酸，ASO)和寡核苷酸缀合物(例如，反义寡核苷酸缀合物)。因此，应当理解的是反义寡聚物(例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的寡聚物)和/或反义寡核苷酸缀合物(例如，SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的寡核苷酸缀合物)中的任一者可以与本文公开的至少一种口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)组合以产生本公开的口服药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和SNAC或5-CNAC的丸剂或胶囊剂)。此类口服药物组合物还可包含本文公开的或本领域已知的药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。例如，WO2007/031091提供了合适的药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂、合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、以及可在本公开的口服药物组合物中使用的前药制剂。
本文公开的口服反义药物组合物可用于治疗由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症。因此，本公开提供了治疗有需要的受试者中由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的口服药物组合物(例如，包含反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的口服药物组合物)，其中所述药物组合物的施用降低所述受试者中血清PCSK9的水平和/或降低所述受试者中血清LDL胆固醇的水平。
在一些方面中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、高胆固醇血症(例如，家族性高胆固醇血症或抗他汀类高胆固醇血症)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如，家族性高脂血症(FCHL)或获得性高脂血症)、冠状动脉疾病(CAD)、和冠心病(CHD)。因此，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中选自由以下组成的组的疾病或病症的方法：动脉粥样硬化、高胆固醇血症(例如，家族性高胆固醇血症或抗他汀类高胆固醇血症)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如，家族性高脂血症(FCHL)或获得性高脂血症)、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)，所述方法包括施用有效量的本文公开的口服药物组合物(例如，包含反义寡核苷酸缀合物(诸如CIVI 008)和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)的口服药物组合物)。
本公开还提供了一种制造口服药物组合物的方法，所述方法包括掺混：(i)本文公开的反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)；和(ii)口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)。
在一些方面中，所述口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)直接或经由接头或接头的组合共价附接至本文所公开的反义寡聚物或反义寡核苷酸缀合物(例如，CIVI 008)，其中所述接头或接头的组合可包括可切割接头。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)直接或经由间隔基共价附接至寡聚物部分。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)直接或经由接头、间隔基或其组合共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物的非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，GalNAc部分CIVI 008)。因此，在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)或其组合附接至例如包含可切割接头的GalNAc缀合物部分。可切割接头或其组合的切割可以从缀合物中释放GalNAc和口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)两者。在其他方面中，GalNAc部分和口服递送剂经由两个单独的可切割接头附接，所述两个单独的可切割接头可以相同或不同。在一些方面中，所述两个可切割接头可以根据相同机制切割(例如，两个pH敏感接头)。在其他方面中，每个可切割接头可以根据不同的机制切割(例如，某一接头可以是pH敏感接头，并且第二接头可以被酶促切割，例如通过酯酶进行酶促切割)。
在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以共价附接至本文公开的寡聚物部分的5'。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以共价附接至本文公开的寡聚物部分的3'。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以直接共价附接至本文公开的寡聚物部分的5'或3(例如，至5'或3'核苷酸)。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以经由接头、间隔基或其组合间接地共价附接至本文公开的寡聚物部分的5'或3'，例如附接至5'或3'核苷酸。
在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物的寡聚物部分。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物的非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，GalNAc部分)。
在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以经由接头、间隔基或其组合共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以经由接头、间隔基或其组合共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物的寡聚物部分。在一些方面中，口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)可以经由接头、间隔基或其组合共价附接至本文公开的反义寡核苷酸缀合物的非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，GalNAc部分)。
在一些方面中，本文公开的寡聚物部分或本文公开的反义寡核苷酸缀合物可以共价附接至多于一种本文公开的口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)。在一些方面中，本文公开的寡聚物部分或本文公开的反义寡核苷酸缀合物可以具有在不同位置共价附接的多于一种本文公开的口服递送剂(例如，SNAC、C10或5-CNAC)(例如，附接至寡聚物的口服递送剂和附接至GalNAc部分的口服递送剂)。
II.寡聚物
在一些方面中，本公开的寡聚物是长度在16-20个核苷酸之间的LNA缺口聚体并且包含与SEQ ID NO:31的对应长度互补的16个核苷酸的连续序列。还公开了包含选自由以下组成的组的连续序列的寡聚物：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:44。本公开的反义寡聚物或缀合物靶向PCSK9，并且因此它们能够下调PCSK9(诸如人或表达PCSK9的细胞中的PCSK9)的表达和/或抑制PCSK9。在一些方面中，本公开的寡聚物的长度可为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。在一些方面中，本公开的寡聚物的长度大于14个核苷酸。在一些方面中，与SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:45的对应长度互补的10-16个核苷酸的连续序列的核苷间键可以是硫代磷酸酯键。
在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)包含、由或基本上由选自由以下组成的组的连续序列组成：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)包含10-16个连接硫代磷酸酯的核苷。在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)包含多于14个连接硫代磷酸酯的核苷。在一些方面中，寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)的长度为15、16、17、18、18、19、20、21或22个核苷酸。
在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)是LNA缺口聚体，所述LNA缺口聚体包含大于14个核苷酸(例如15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸)的连续序列，所述连续序列与SEQ ID NO:31的对应长度互补，其中所述连续序列包含核苷酸类似物。在特定方面中，所述寡聚物的长度为16个核苷酸。在一个方面中，本公开的寡聚物包含亲和力增强的核苷酸类似物。在一些方面中，核苷酸类似物是经糖修饰的核苷酸，诸如独立或依赖性地选自由以下组成的组的经糖修饰的核苷酸：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元和2'-氟-DNA单元。
在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)是LNA缺口聚体寡核苷酸。在一些方面中，LNA缺口聚体在每侧(5'和3')上包含2至4个核苷酸类似物、优选地LNA类似物的翼。在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，与SEQ ID NO:31互补的寡聚物)可以任选地包含另外1至6个核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸)，所述核苷酸可以形成或构成生物可切割的核苷酸区域，诸如磷酸核苷酸接头。在一些方面中，所述生物可切割的核苷酸区域由生理学上不稳定的一小段核苷酸(例如1、2、3、4、5或6个核苷酸)形成。这可以通过用DNA/RNA核苷使用磷酸二酯键来实现，或者如果可以维持生理稳定性，则可以使用其他核苷。生理不稳定性可以使用肝脏提取物来测量，例如，如实施例6中所说明。
在一些方面中，本公开的寡聚物包含16个核苷酸的连续序列，所述连续序列与SEQID NO:31的对应长度(第一区域，或区域A)互补。本公开的寡聚物可包含另外的核苷酸区域。在一些方面中，所述另外的核苷酸区域包含生物可切割的核苷酸区域，诸如磷酸核苷酸序列(第二区域，区域B)，所述生物可切割的核苷酸区域可将区域A共价连接至非核苷酸部分，诸如缀合物基团(第三区域，或区域C)。在一些方面中，本公开的寡聚物的连续核苷酸序列(区域A)直接共价连接至区域C。在一些方面中，区域C是生物可切割的。
在一些方面中，寡聚物由长度为16-22个核苷酸(诸如16、17、18、19、20、21或22个核苷酸)、诸如长度为16个核苷酸的连续核苷酸序列组成，或包含所述连续核苷酸序列。因此，在一些方面中，寡聚物可指区域A和区域B的组合长度，例如来自区域A的16-22个核苷酸(诸如16个核苷酸)和例如来自区域B的1至6个核苷酸的组合长度。
在一些方面中，本公开的寡聚物不包含RNA(单元)，例如，在一些方面中，所述寡聚物可以仅包含DNA单元。在一些方面中，本公开的寡聚物包含DNA单元和RNA单元。在一些方面中，根据本公开的寡聚物、寡聚物的第一区域、或寡聚物的第一区域和第二区域一起(例如，作为单个连续序列)是直链分子。在一些方面中，根据本公开的寡聚物、寡聚物的第一区域、或寡聚物的第一区域和第二区域一起(例如，作为单个连续序列)被合成为直链分子。因此，在一些方面中，寡聚物可以是单链分子。在一些方面中，寡聚物不包含例如至少3、4或5个连续核苷酸的短区域，所述短区域与相同寡聚物(即，双链体)内的等同区域互补。
在一些方面中，寡聚物不是双链核酸。在一些方面中，本公开的寡聚物不是siRNA。在一些方面中，本公开的寡聚物不是shRNA。在一些方面中，寡聚物是双链核酸。在一些方面中，本公开的寡聚物是siRNA。在一些方面中，本公开的寡聚物是shRNA。
在一些方面中，本公开的寡聚物是反义寡核苷酸(ASO)。在一些方面中，本公开的寡聚物是多聚体的。在一些方面中，本公开的寡聚物是多聚体ASO，例如，其可包含几个串联的本公开寡聚物。在一些方面中，本公开的寡聚物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个串联的寡聚物。在一些方面中，所述串联的寡聚物经由插置在ASO多聚体中的各个ASO单元之间的可切割接头连接。
当应用于本文公开的两种寡核苷酸的比较时，术语“对应于(corresponding to/corresponds to)”是指本公开的寡聚物的核苷酸序列(即，核碱基或碱基序列)与核酸靶标或其子区域的反向互补序列(例如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:45)之间的比较。将核苷酸类似物直接与其等效或对应的核苷酸进行比较。在一些方面中，寡聚物(或其第一区域)与靶区域或其子区域(例如SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:45)互补，诸如完全互补。
II.a寡聚物序列
在一些方面中，本公开的寡聚物可以靶向表1A中公开的靶区域。表1A显示了靶区域的序列及其在PCSK9 mRNA中的位置。在一些方面中，本公开的寡聚物包含互补区域，所述互补区域与表1A的靶序列中的一个靶序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸互补。在一些方面中，本公开的寡聚物包含互补区域，所述互补区域与表1A的靶序列中的一个靶序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸互补，其中所述互补区位于寡聚物的5'端。在一些方面中，本公开的寡聚物包含互补区域，所述互补区域与表1A的靶序列中的一个靶序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸互补，其中所述互补区位于寡聚物的3'端。在一些方面中，本公开的寡聚物包含互补区域，所述互补区域与表1A的靶序列中的一个靶序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸互补，其中所述互补区位于寡聚物的5'端，并且其中所述寡聚物的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些方面中，本公开的寡聚物包含互补区域，所述互补区域与表1A的靶序列中的一个靶序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸互补，其中所述互补区位于寡聚物的3'端，并且其中所述寡聚物的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
表1A：PCSK9靶序列
表1B显示了SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:44，它们是碱基序列或核碱基基序序列。例如，SEQ ID NO:26是靶向SEQ ID NO:31的16聚体。在一些方面中，所述核碱基基序序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或多于20个核苷酸，所述核碱基基序序列与从表1B中呈现的基序序列的5'端、3'端或两者延伸的序列互补。本公开的寡聚物序列衍生自本文公开的基序序列，所述基序序列包含特定模式的核碱基类似物和/或核苷间键。
表1B：基序序列。
表1C显示了不同的寡聚物序列、其缀合物形式、以及与PCKS9基因上的靶区域对应的靶标。
表1C：寡聚物和缀合物
SEQ ID NO:1是SPC5001，其为一种在WO2011/009697中公开的反义寡聚物，已知其在施用于人类受试者时会引起严重的肾毒性。SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:43是包含核苷酸类似物的寡聚物，诸如LNA缺口聚体寡聚物，其中小写字母是DNA单位(核苷/核苷酸)，其中大写字母是LNA单位。在一些方面中，所有LNAC都是5-甲基胞嘧啶。在一些方面中，所有LNA单元都是β-D-氧基LNA。在一些方面中，SEQ ID NO:1至SEQID NO:24和SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:43的核苷之间的核苷间键都是硫代磷酸酯键。在一些方面中，硫代磷酸酯键仅存在于第一和/或第二5'硫代磷酸酯键中。在一些方面中，硫代磷酸酯键仅存在于第一和/或第二3'硫代磷酸酯键中。在一些方面中，硫代磷酸酯键存在于第一和/或第二5'硫代磷酸酯键，以及第一和/或第二3'硫代磷酸酯键中。
SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:43是缺口聚体，其中每个翼包含2、3或4个LNA单元。在一些方面中，本公开的寡聚物对应于SEQ ID NO:1至SEQID NO:24和SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:43的变体，其中该变体在缺口聚体的5'翼中包含1、2、3或4个附加LNA单元。在一些方面中，本公开的寡聚物对应于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:43的变体，其中该变体在缺口聚体的3'翼中包含1、2、3或4个附加LNA单元。在一些方面中，本公开的寡聚物对应于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24和SEQID NO:40至SEQ ID NO:43的变体，其中该变体在缺口聚体的5'翼中包含1、2、3或4个附加LNA单元并且在缺口聚体的3'翼中包含1、2、3或4个附加LNA单元。在一些方面中，本文公开的缺口聚体(例如，表1C的缺口聚体或其变体)的LNA单元可以是氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-5LNA、5'-甲基-LNA、ENA、cET或cMOE。
SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:43包含寡聚物(如由SEQ ID所指示)以及胆固醇缀合物，所述胆固醇缀合物可在所述寡聚物的5'或3'端共价连接至所述寡聚物，任选地经由生物可切割接头(诸如磷酸核苷接头)连接至所述寡聚物。在一些方面中，胆固醇缀合物连接在寡聚物的5'端处。SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:24包含寡聚物(如由SEQ ID所指示)以及GalNAc缀合物，所述GalNAc缀合物可在所述寡聚物的5'或3'端共价连接至所述寡聚物，任选地经由生物可切割接头(诸如磷酸核苷接头或可切割的肽接头)连接至所述寡聚物。在一些方面中，GalNAc缀合物连接在寡聚物的5'端处。本文使用的具体寡聚物和缀合物示出于图3(非缀合的寡聚物)、图4(胆固醇缀合物)以及图5A、图5B和图5C(GalNAc缀合物)中。可与本公开的寡聚物一起使用的缀合物部分的其他示例示出于图1A、图1C、图1C和图2中，并描述于以下小节GalNAc缀合物部分中。
表2提供了寡聚物和缀合物的特定组合。
表2：寡聚物/缀合物部分的组合
表2所示的寡聚物缀合物对应于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的寡聚物，所述寡聚物经由其任一5'末端缀合至在图1A、图1B、图1C或图2中呈现的缀合物部分。寡聚物共价附接至图1A、图1B、图1C或图2中由波浪线所指示的位置。在一些方面中，缀合物部分附接至寡聚物的3'端。
图5A、图5B和图5C示出了Conj2a与上面指定的SEQ ID NO的组合。图5B和图5C是图5A中化合物的两个详细示例，并且分别对应于SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的缀合物。
在一些方面中，任选的生物可切割接头(B)可以存在于缀合物部分(C)与寡聚物(A)之间。对于Conj1至Conj4和Conj1a至Conj4a，GalNAc缀合物本身利用GalNAc簇中的肽接头而成为可生物切割的，并且因此可以使用或不使用另外的生物可切割接头(B)。在一些方面中，包括生物可切割接头(B)，诸如本文公开的磷酸核苷酸接头，可以增强GalNAc簇寡聚物缀合物的活性。图4示出了Conj5a(胆固醇-C6)与上面指定的SEQ ID NO的组合。
II.b PCSK9靶区域
本公开涉及用于口服施用的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的寡聚物(例如，ASO)，所述寡聚物能够通过特异性靶向PCSK9 RNA(例如，mRNA)中的靶区域来调节PCSK9基因的表达。在一些方面中，寡聚物能够通过与此类靶区域结合来下调PCSK9基因的表达。因此，在一些方面中，本公开的寡聚物可以通过与PCSK9 RNA(例如，mRNA)中的特定靶区域结合来影响PCSK9在例如哺乳动物受试者(诸如人)中的表达。在一些方面中，本公开的寡聚物可以通过与PCSK9 RNA(例如，mRNA)中的特定靶区域结合来影响PCSK9在人细胞(例如，肝细胞)中的表达。
如本文所用的术语“靶核酸”或“靶区域”是指编码哺乳动物PCSK9或其天然存在的变体或突变形式(例如，人类PCSK9)的核酸(例如，RNA，诸如mRNA)的子序列。在一些方面中，编码哺乳动物PCSK9或其天然存在的变体或突变形式的核酸是RNA。在一些方面中，RNA是mRNA，诸如前mRNA。在一些方面中，RNA是成熟mRNA。根据本发明的寡聚物优选能够与靶核酸杂交。将认识到，SEQ ID NO:46是cDNA序列，并且因此对应于成熟mRNA靶序列，但是在cDNA序列中尿嘧啶被胸腺嘧啶替代。
在一些方面中，靶序列对应于SEQ ID NO:46所示的编码PCSK9的序列的子序列。具体靶序列在上表1A中呈现，例如SEQ ID NO:30，对应于SEQ ID NO:46的3643-3656位置；SEQID NO:31，对应于SEQ ID NO:46的3643-3658位置；SEQ ID NO:32，对应于SEQ ID NO:46的3251-3265位置；SEQ ID NO:33，对应于SEQ ID NO:46的3251-3266位置；SEQ ID NO:34，对应于SEQ ID NO:46的3373-3388位置；和SEQ ID NO:45，对应于SEQ ID NO:46的1005-1017位置。
在一些方面中，靶序列可以延伸超出SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:45的靶区域的5'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些方面中，靶序列可以延伸超出SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:45的靶区域的3'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些方面中，靶序列可以延伸超出SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:45的靶区域的5'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸和/或3'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些方面中，延伸的靶区域与SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:45的靶区域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸重叠。
在一些方面中，靶区域包含衍生自编码SEQ ID NO:46的mRNA的PCSK9基因的突变体或等位基因变体的序列的对应靶序列区或由其组成。在其他方面中，靶区域可以是存在于另一个编码PCSK9的mRNA转录变体中的子序列。在一些方面中，靶区域包含衍生自编码SEQ ID NO:46的mRNA的PCSK9基因的旁系同源物或直向同源物的序列的对应靶序列区或由其组成。
在一些方面中，靶区域对应于在NCBI Ref Seq登录号NM_174936中所示的序列的子序列，即编码智人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)转录变体1的mRNA。这种NCBI Ref Seq数据库条目可在www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_174936处访问，并且其全部内容以引用方式并入本文。
NM_174936mRNA转录物中的PCSK9编码序列位于291...2369位置处。因此，在一些方面中，靶区域位于NM_174936mRNA转录物的291位置与2369位置之间。在一些方面中，靶区域位于5'非编码区内。在一些方面中，靶区域位于3'非编码区内。NM_174936mRNA转录物包含位于以下位置处的外显子：1…497(外显子1)、498…689(外显子2)、690…813(外显子3)、814…947(外显子4)、948…1089(外显子5)、1090…1286(外显子6)、1287…1470(外显子7)、1471…1644(外显子8)、1645…1793(外显子9)、1794…1971(外显子10)、1972…2153(外显子11)和2154…3637(外显子12)。外显子1至12被内含子1至11分隔开，例如，内含子1位于外显子1与外显子2之间，内含子2位于外显子2与外显子3之间，依此类推。
在一些方面中，靶区域在外显子1内。在一些方面中，靶区域在外显子2内。在一些方面中，靶区域在外显子3内。在一些方面中，靶区域在外显子4内。在一些方面中，靶区域在外显子5内。在一些方面中，靶区域在外显子6内。在一些方面中，靶区域在外显子7内。在一些方面中，靶区域在外显子8内。在一些方面中，靶区域在外显子9内。在一些方面中，靶区域在外显子10内。在一些方面中，靶区域在外显子11内。在一些方面中，靶区域在外显子12内。
在一些方面中，靶区域在PCSK9前mRNA的内含子内。在一些方面中，靶区域在内含子1内。在一些方面中，靶区域在内含子2内。在一些方面中，靶区域在内含子3内。在一些方面中，靶区域在内含子4内。在一些方面中，靶区域在内含子5内。在一些方面中，靶区域在内含子6内。在一些方面中，靶区域在内含子7内。在一些方面中，靶区域在内含子8内。在一些方面中，靶区域在内含子9内。在一些方面中，靶区域在内含子10内。在一些方面中，靶区域在内含子11内。在一些方面中，靶区域包含在外显子1与内含子1之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子1与外显子2之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子2与内含子2之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子2与外显子3之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子3与内含子3之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子4与内含子4之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子4与外显子5之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子5与内含子5之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子5与外显子6之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子6与内含子6之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子6与外显子7之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子7与内含子7之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子7与外显子8之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子8与内含子8之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子8与外显子9之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子9与内含子9之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子9与外显子10之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子10与内含子10之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子10与外显子11之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在外显子11与内含子11之间的接合部。在一些方面中，靶区域包含在内含子11与外显子12之间的接合部。
在一些方面中，本公开的寡聚物结合靶核酸(例如，SEQ ID NO:31)，并且对PCSK9表达和/或活性水平的影响相较于正常PCSK9表达水平(例如，用盐水处理的细胞、动物或人的PCSK9表达水平)和/或正常活性水平(例如，用盐水处理的细胞、动物或人的表达水平)在PCSK9表达和/或活性水平方面降低了至少约10％至约20％。在一些方面中，相较于正常表达和/或活性水平，PCSK9表达和/或活性的降低为至少约10％、约至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％。在一些方面中，相较于正常表达和/或活性水平，表达和/或活性的降低为约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％。
在一些方面中，当使用浓度在0.04nM与25nM之间(诸如在0.8nM与20nM之间)的本公开寡聚物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。在一些方面中，当使用浓度为至少约0.04nM、至少约0.05nM、至少约0.06nM、至少约0.07nM、至少约0.08nM、至少约0.09nM、至少约0.1nM、至少约0.2nM、至少约0.3nM、至少约0.4nM、至少约0.5nM、至少约0.6nM、至少约0.7nM、至少约0.8nM、至少约0.9nM、至少约1nM、至少约2nM、至少约3nM、至少约4nM、至少约5nM、至少约6nM、至少约7nM、至少约8nM、至少约9nM、至少约10nM、至少约11nM、至少约12nM、至少约13nM、至少约14nM、至少约15nM、至少约16nM、至少约17nM、至少约18nM、至少约19nM、至少约20nM、至少约21nM、至少约22nM、至少约23nM、至少约24nM、至少约25nM的本公开寡聚物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。在一些方面中，当使用浓度为至少约0.04nM、约0.05nM、约0.06nM、约0.07nM、约0.08nM、约0.09nM、约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、约5nM、约6nM、约7nM、约8nM、约9nM、约10nM、约11nM、约12nM、约13nM、约14nM、约15nM、约16nM、约17nM、约18nM、约19nM、约20nM、约21nM、约22nM、约23nM、约24nM、约25nM的本公开寡聚物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。
在一些方面中，当使用浓度在0.01mg/kg与15mg/kg之间，诸如在0.05mg/kg与10mg/kg之间、诸如在0.1mg/kg与7.5mg/kg之间、诸如在0.25mg/kg与5mg/kg之间、诸如在0.5mg/kg与2.5mg/kg之间的本公开化合物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。在一些方面中，当使用浓度为至少约0.01mg/kg、至少约0.02mg/kg、至少约0.03mg/kg、至少约0.04mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.06mg/kg、至少约0.07mg/kg、至少约0.08mg/kg、至少约0.09mg.kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.2mg/kg、至少约0.3mg/kg、至少约0.4mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.6mg/kg、至少约0.7mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约0.9mg/kg、至少约1mg/kg、至少约1.5mg/kg、至少约2mg/kg、至少约2.5mg/kg、至少约3mg/kg、至少约4mg/kg、至少约4.5mg/kg、至少约5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约6.5mg/kg、至少约7mg/kg、至少约7.5mg/kg、至少约8mg/kg、至少约8.5mg/kg、至少约9mg/kg、至少约9.5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约10.5mg/kg、至少约11mg/kg、至少约11.5mg/kg、至少约12mg/kg,12.5mg/kg、至少约13mg/kg、至少约13.5mg/kg、至少约14mg/kg、至少约14.5mg/kg、或至少约15mg/kg的本公开化合物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。在一些方面中，当使用浓度为约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg.kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg、约10mg/kg、约10.5mg/kg、约11mg/kg、约11.5mg/kg、约12mg/kg,12.5mg/kg、约13mg/kg、约13.5mg/kg、约14mg/kg、约14.5mg/kg、或约15mg/kg的本公开化合物时，看到了此类调节(例如，表达水平和/或活性的降低)。
在一些方面中，在施用本公开的化合物之后的PCSK9表达和/或活性水平为在施用本公开的化合物之前的PCSK9表达和/或活性水平的小于约2％、小于约5％、小于约10％、小于约15％、小于约20％、小于约25％、小于约30％、小于约35％、小于约40％、小于约45％、小于约50％、小于约55％、小于约60％、小于约65％、小于约70％、小于约75％、或小于约80％。
在一些方面中，在施用本公开的化合物之后的PCSK9表达和/或活性水平为在施用本公开的化合物之前的PCSK9表达和/或活性水平的约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、或约75％至约80％。
表达水平的调节可以通过测量蛋白质水平来确定，例如通过诸如SDS-PAGE之后使用针对靶蛋白产生的合适抗体进行蛋白质印迹的方法。或者，表达水平的调节可以通过测量mRNA水平来确定，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR。当经由mRNA水平测量时，在使用适当剂量(诸如在0.04nM与25nM之间，诸如在0.8nM与20nM之间的浓度)时的下调水平在一些方面中通常为在不存在本公开的化合物的情况下的正常水平的10-20％之间的水平。
因此，本公开提供了下调或抑制PCSK9蛋白和/或mRNA在表达PCSK9蛋白和/或mRNA的细胞中的表达的体外或体内方法，所述方法包括向所述细胞施用根据本公开的寡聚物或缀合物，例如，作为本公开的药物组合物(例如，口服制剂，所述口服制剂包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、其药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)，以下调或抑制PCSK9蛋白和/或mRNA在所述细胞中的表达。适当地，细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞。
II.c长度
本公开的寡聚物可包含长度为总共16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。在一些方面中，寡聚物的长度长于22个连续核苷酸。长度可包括区域A或区域A和区域B。应当理解的是，在一些方面中，本公开的寡聚物可以是包含例如2、3、4、5、6个或更多个串联的本文公开的ASO的多聚体，所述多聚体可任选地通过间隔基或接头连接，所述间隔基或接头包含插置在多聚体中的每个ASO之间的核苷酸或非核苷酸单元。因此，在一些方面中，本公开的寡聚物可包含长度为总共至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个、或至少约200个连续核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些方面中，所述寡聚物包含长度为总共在16个与22个之间的连续核苷酸，诸如长度为16、17、18、18、20、21或22个连续核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。在一些特定方面中，区域A的寡聚物包含长度为16个连续核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些方面中，根据本公开的寡聚物在长度上由不多于16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸组成。在一些方面中，本公开的寡聚物在长度上包含少于22个、少于21个、少于20个、少于19个、少于18个或少于17个连续核苷酸。在一些方面中，根据本公开的寡聚物在长度上由16或17个、16至18个、16至19个、16至20个、16至21个或16至22个连续核苷酸组成。
II.d核苷酸类似物
在一些方面中，本公开的寡聚物包含非天然存在的核苷酸类似物，例如具有经修饰的糖部分的核苷酸，诸如双环核苷酸或经2'修饰的核苷酸，诸如2'取代的核苷酸。用非天然类似物替代天然存在的核苷酸可以赋予寡聚物所需的特性或性质，例如增加的抗降解性或稳定性。在一些方面中，核苷酸类似物对寡聚物工作以抑制表达的方式具有功能性影响；例如，通过产生对靶标的增加的结合亲和力(亲和力增强)和/或对细胞内核酸酶的增加的抗性和/或转运至细胞内的增加的容易性。核苷类似物的具体示例由例如Freier和Altmann(1997)Nucl.Acid Res.25:4429-4443和Uhlmann(2000)Curr.Opinion in DrugDevelopment3:293-213，以及在以下方案1中描述：
本公开提供了寡聚物，所述寡聚物包含天然存在的核苷酸—优选地2'-脱氧核苷酸(在本文中通常称为“DNA”)，但也可能是核糖核苷酸(在本文中通常称为“RNA”)—的简单序列，或这种天然存在的核苷酸与一种或多种非天然存在的核苷酸(即，核苷酸类似物)的组合或由其组成。此类核苷酸类似物可以适当地增强寡聚物对靶序列的亲和力。合适的核苷酸类似物的示例由WO2007/031091提供，该专利全文以引用方式并入本文，或在其中引用。
在寡聚物中并入亲和力增强的核苷酸类似物(诸如LNA或2'-取代的糖)可允许特异性结合的寡聚物的大小减小，并且还可降低在非特异性或异常结合发生之前寡聚物大小的上限。在一些方面中，本公开的寡聚物包含至少一种核苷酸类似物。在一些方面中，本公开的寡聚物包含至少两种核苷酸类似物。在一些方面中，本公开的寡聚物包含3、4、5、6、7或8种核苷酸类似物，例如6或7种核苷酸类似物。在一些方面中，所有核苷酸类似物都是相同的。在一些方面中，一些核苷酸类似物是不同的。在一些方面中，寡聚物中的所有核苷酸都是核苷酸类似物。在一些方面中，当寡聚物中的所有核苷酸都是核苷酸类似物时，所有核苷酸类似物是相同的。在一些方面中，当寡聚物中的所有核苷酸都是核苷酸类似物时，所述核苷酸类似物中的一些核苷酸类似物是不同的。在一些方面中，本公开的寡聚物包含遵循特定模式(例如，ABABABABABABABABABABA)的核苷酸类似物，例如类似物A和类似物B。
核苷酸类似物的示例包括修饰糖部分以提供2'-取代基或产生双环结构，所述2'-取代基或双环结构增强结合亲和力并且还可提供增强的核酸酶抗性。
在一些方面中，在本公开的反义寡聚物内(诸如在“缺口聚体设计”小节中提及的区域X'和Y'中)存在的核苷酸类似物独立地选自例如：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-O-烷基-DNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、LNA单元、阿拉伯核酸(arabinonucleic acid，ANA)单元、2'-氟-ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸(intercalatingnucleic acid)；Christensen(2002)Nucl.Acids.Res.30:4918-4925)单元和2'MOE单元。
在一些方面中，核苷酸类似物是2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'MOE)、2'-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，并且因此本公开的反义寡核苷酸可包含独立地选自这三种类型的类似物的核苷酸类似物，或者可以包含选自这三种类型的仅一种类型的类似物。在一些方面中，所述核苷酸类似物中的至少一种核苷酸类似物是2'-MOE-RNA，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-MOE-RNA核苷酸单元。在一些方面中，所述核苷酸类似物中的至少一种核苷酸类似物是2'-氟DNA，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-氟-DNA核苷酸单元。
在一些方面中，寡聚物可以是包含有义链和反义链的双链体RNA，其中有义链遵循模式3'ABABABABAAABABBBABABA5'并且反义链遵循模式5'BABABABABABBBABAAABABAB3'，其中A是2'-氟类似物并且B是2-OMe类似物，并且其中所述反义链相对于所述有义链具有两个碱基突出端(overhang)。在一些方面中，有义链的5'端缀合至GalNAc部分。在一些方面中，反义链5'端的最后两个键是PS。
在一些方面中，寡聚物可以是包含有义链和反义链的双链体RNA，其中有义链遵循模式3'BBBBBBABAAABBBBBBBBBB5'并且反义链遵循模式5'BBBBBBBABABBBBABBABBBAB3'，其中A是2'-氟类似物并且B是2-OMe类似物，并且其中所述反义链相对于所述有义链具有两个碱基突出端。在一些方面中，有义链的5'端缀合至GalNAc部分。在一些方面中，反义链的5'端和3'端的最后两个键是PS，并且有义链的最后两个3'端键是PS。
在一些方面中，寡聚物可以是包含有义链和反义链的双链体RNA，其中所述有义链包含在5'端处的一个或多个末端手性修饰的核苷酸间键；并且所述反义链包含在5'端处的一个或多个末端手性修饰的核苷酸间键以及在3'端处的一个或多个末端手性修饰的核苷酸间键。
在一些方面中，寡聚物可以是包含有义链和反义链的双链体RNA，有义链序列具有4-12个不对称的2'-O-烷基修饰，所述修饰中的至少4个修饰出现在5'端的4个末端核苷酸处；并且反义序列具有至少4个不对称的硫代磷酸酯修饰。
在一些方面中，寡聚物可以是包含第一序列和第二序列的双链体RNA，在从3'端或5'端的前3、4、5或6个位置内具有在第一序列中的第一单体和在第二序列中的第二单体，其中所述第一单体和第二单体经选择使得(i)第一单体和第二单体是天然存在的核糖核苷酸或具有天然存在的碱基的经修饰的核糖核苷酸，其中所述第一单体的核糖核苷酸和所述第二单体的核糖核苷酸，当占据不配对且没有实质H键合水平的互补位点时，形成非规范的沃森-克里克配对(Watson-Crick pairing)；(ii)有助于在所述第一序列与所述第二序列之间形成双链体的所述单体的配对的稳定性不同于在所述第一序列与靶序列之间或在所述第二序列与靶序列之间的配对的稳定性，其中所述双链RNA包含TT突出端序列。
在一些方面中，寡聚物可以是包含以下的双链体RNA：具有4-12个不对称的2'-O-烷基修饰的有义链序列，所述修饰中的至少4个修饰出现在5'端的6个末端核苷酸内；以及具有至少4个不对称的硫代磷酸酯修饰的反义序列。
在一些方面中，寡聚物可以是包含以下的双链体RNA：具有4-12个不对称的2'-O-烷基修饰的有义序列，所述修饰中的至少4个修饰出现在5'端的6个末端核苷酸内；以及具有至少4个不对称的硫代磷酸酯修饰的反义序列，其中所述双链体RNA包含多价半乳糖或多价N-乙酰基-半乳糖胺，并且其中所述反义序列靶向PCSK9靶序列。
在一些方面中，寡聚物可以是用于抑制细胞中PCSK9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包含有义序列和反义序列，其中所述有义序列具有一个或多个不对称的2'-O烷基修饰，并且所述反义序列具有4-20个硫代磷酸酯修饰，其中所述双链体RNA包含多价半乳糖或多价N-乙酰基-半乳糖胺，并且其中所述反义序列靶向人PCSK9序列。
在一些方面中，寡聚物可以是用于抑制细胞中PCSK9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包含有义序列和反义序列，其中所述有义序列具有一个或多个不对称的2'-O烷基修饰，并且所述反义序列具有4-20个硫代磷酸酯修饰，其中所述反义序列具有比所述有义序列更少的不对称2'-O烷基修饰，其中所述有义序列包含缀合物基团，并且其中所述反义序列靶向PCSK9序列。
在一些方面中，寡聚物可以是具有降低的脱靶RNA抑制活性的双链体RNA，所述双链体RNA包含：a.反义链，所述反义链与靶基因互补；和b.有义链，所述有义链与所述反义链互补并在对应于靶切割位点的区域中包含至少一个经修饰的核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸是无碱基的；其中所述降低的脱靶RNA抑制活性是相对于对应的未修饰的双链体RNA剂而言的。
在一些方面中，寡聚物可以是能够抑制体内PCSk9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包含：(a)有义链，其中所述有义链包含(i)具有至少2种不同化学修饰的核苷酸的交替基序；和(ii)一种或多种碳水化合物配体；和(b)反义链，其中所述反义链包含(i)具有至少2个不同化学修饰的核苷酸的交替基序，其中所述交替基序在双链体区域内，并且所述组合物任选地进一步包含一个或多个突出端和/或封端基团。
在一些方面中，所述寡聚物可以是能够抑制PCSK9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包括有义链和反义链，每条链均具有14至30个核苷酸，其中所述双链体由下式表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地为0或1，前提条件是i、j、k和l中的至少一者为1；p和q各自独立地为0-6；
每个Na和Na'独立地代表包含2-20个修饰的或未修饰的核苷酸或它们的组合的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸，每个Nb和Nb'独立地代表包含1-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np'、nq和nq'独立地代表包含0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；并
且
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地代表在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且
其中对Nb的修饰与对Y的修饰不同，并且对Nb'的修饰与对Y'的修饰不同。
在一些方面中，寡聚物可以是能够抑制PCSK9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包括有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中dsRNA剂由下式表示：
其中：B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自独立地代表含有选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：2'-O烷基、2'-取代的烷氧基、2'-取代的烷基、2'-卤基、ENA和BNA/LNA；
C1是选自由以下组成的组的热去稳定性核苷酸：i)与反义链中的相对核苷酸形成错配对的核苷酸，ii)具有无碱基修饰(abasic modification)的核苷酸，和iii)具有糖修饰并置于与反义链的种子区相对的位点(位置2-8)处的核苷酸；
T1、T1'、T2'和T3'各自独立地代表包含修饰的核苷酸，所述修饰为核苷酸提供比2'-OMe修饰的立体位阻更小的立体位阻，其中所述修饰在核苷酸的核糖的2'-位置处或在非核糖核苷酸的与核糖的2'-位置类似的位置处，并且其中T1'和T3'在长度上相隔11个核苷酸；
每个n1、n3、和q1独立地为4至15个核苷酸的长度；
每个n5、q3和q7独立地为1-6个核苷酸的长度；
每个n2、n4和q6独立地为1-3个核苷酸的长度；
q5独立地为0-10个核苷酸的长度；并且
每个n2、n4和q4独立地为0-3个核苷酸的长度；并且
其中dsRNA剂在dsRNA双链体的两端处具有两个平端(blunt end)。
在一些方面中，所述寡聚物可以是能够抑制PCSK9表达的双链体RNA，所述双链体RNA包括有义链和反义链，每条链均具有14至40个核苷酸，其中所述反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链在5'区或其前体的前9个核苷酸位置内包含所述双链体的至少一个热去稳定性修饰，其中所述有义链包含ASGPR配体。
在一些方面中，寡聚物包含美国专利号8,110,674、8,420,799、8,809,516、9,222,091、9,708,615、10,273,477、9,290,760、10,233,448、或9,796,974；美国申请公开号2018-0258427A1；或国际公开案WO2018098328A1中公开的修饰基序(例如，核苷酸类似物沿有义序列和反义序列、核苷间键合、缀合物部分等的分布模式)，上述所有文件的全文以引用方式并入本文。
在一些方面中，核苷酸类似物是LNA，诸如氧基-LNA(诸如β-D-氧基-LNA和α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(诸如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(诸如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(例如β-D-ENA和α-L-ENA)。在一些方面中，LNA是β-D-氧基-LNA。在一些方面中，只有上述类型的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物(例如，LNA)存在于本公开的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中。
本公开的反义寡核苷酸包含至少一个锁核酸(LNA)单元，诸如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，诸如3至7个、或4至8个LNA单元。在一些方面中，所述核苷酸类似物中的至少一种核苷酸类似物是锁核酸(LNA)；例如，所述核苷酸类似物中的至少3个或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或8个核苷酸类似物可为LNA。在一些方面中，所有核苷酸类似物都可以是LNA。
在一些方面中，本公开的反义寡核苷酸可包括核苷酸类似物(例如，LNA)单元和DNA单元两者。在一些方面中，核苷酸类似物(优选地LNA)单元和DNA单元的组合总数在5与22之间，例如16至18、或16至20、或16至22。在一些方面中，核苷酸类似物(例如，LNA)单元和DNA单元的组合总数为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。
在一些方面中，本公开的反义寡核苷酸的核苷酸序列，诸如连续核苷酸序列，由至少一种核苷酸类似物(LNA)组成，并且剩余的核苷酸单元是DNA单元。在一些方面中，本公开的反义寡核苷酸仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(诸如RNA或DNA，最优选地DNA核苷酸)，任选地具有经修饰的核苷间键，诸如硫代磷酸酯。
应当认识到，当提及仅由核苷酸组成的特定核苷酸序列基序或核苷酸序列时，由该序列限定的本公开的寡聚物可包含对应的核苷酸类似物来代替所述序列中存在的核苷酸中的一个或多个核苷酸，诸如LNA单元或其他核苷酸类似物，这提高了寡聚物/靶双链体的双链体稳定性/Tm(即，亲和力增强的核苷酸类似物)。
Tm测定：将寡核苷酸和RNA靶标(PO)双链体在500ml无核糖核酸酶的水中稀释至3mM，并与500ml 2x Tm缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠，pH 7.0)混合。将溶液加热至95℃，持续3min，然后在室温下退火30min。使用PE Templab软件(Perkin Elmer)在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上测量双链体解链温度(Tm)。使温度从约20℃升至约95℃，然后降至约25℃，记录260nm处的吸收。使用解链和退火两者的一阶导数和局部最大值来评定双链体Tm。
在一些方面中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配都存在于亲和力增强的核苷酸类似物外部的区域(诸如在缺口聚体设计小节中提及的区域Y')中，和/或在寡核苷酸中具有未修饰的诸如DNA核苷酸的位置处，和/或在处于连续核苷酸序列的5'或3'的区域中。
II.e LNA
在一些方面中，本公开的寡聚物(例如，ASO)包含至少一个LNA单元。术语“锁核酸”和“LNA”是指在核糖环的2'位置与4'位置之间包含桥的任何双环核苷类似物，即2'至4'双环核苷酸类似物。LNA在文献中有时被称为BNA(桥接核酸或双环核酸)，并且这两种术语可以互换地使用。术语LNA通常指LNA单体。术语“LNA寡核苷酸”是指包含一种或多种此类双环核苷酸类似物的寡核苷酸(例如，ASO，诸如缺口聚体)。在一些方面中，双环核苷类似物是LNA核苷酸，并且因此这些术语可以互换地使用。在此类方面中，两者的特征在于在核糖环的C2'与C4'之间存在接头基团(诸如桥)。
在一些方面中，本公开的反义寡核苷酸可包含β-D-氧基-LNA和以下LNA单元中的一个或多个LNA单元两者：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、5'-甲基-LNA和/或β-D或α-L构型的ENA，或它们的组合。
在一些方面中，所有LNA胞嘧啶单元都是5'-甲基胞嘧啶。在一些方面中，第一区域(X')中存在的至少一种核苷类似物是双环核苷类似物。在一些方面中，第一区域(X')中存在的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种核苷类似物是双环核苷类似物。因此，在一些方面中，本公开的寡核苷酸中的所有核苷，除了区域Y'的DNA和/或RNA核苷之外，都是经糖修饰的核苷类似物，例如双环核苷类似物，诸如LNA(例如，β-D-X-LNA或α-L-X-LNA，其中X是氧基、氨基或硫基)、本文公开的其他LNA，包括但不限于(R/S)cET、cMOE或5'-Me-LNA，或它们的任意组合。
在一些方面中，本公开的寡核苷酸中使用的LNA具有通式II的结构：
其中Y选自由以下组成的组：-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)和/或-CH2-；Z和Z*独立地选自核苷间键、RH、端基或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分(核碱基)，并且RH选自氢和C1-4-烷基；Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选独立地选自由以下项组成的组：氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单(C1-6-烷基)氨基和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单(C1-6-烷基)-氨基-羰基和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个成对取代基Ra和Rb一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)；并且RH选自氢和C1-4-烷基。
在一些方面中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re任选独立地选自由以下组成的组：氢和C1-6烷基，诸如甲基。对于所有手性中心，不对称基团可以在R或S取向上找到，例如，两种示例性立体化学异构体包括可如下说明的β-D异构体和α-L异构体：
具体示例性LNA单元如下所示：
术语“硫代-LNA”包括锁核苷酸，其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可为β-D构型和α-L构型二者。
术语“氨基-LNA”包括锁核苷酸，其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可为β-D构型和α-L构型二者。
术语“氧基-LNA”包括锁核苷酸，其中上述通式中的Y表示-O-。氧基-LNA可为β-D构型和α-L构型二者。
术语“ENA”包括锁核苷酸，其中上述通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子附接到相对于碱基B的2'-位置)。Re是氢或甲基。
在一些示例性方面中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，特别是β-D-氧基-LNA。
如本文所用，“双环核苷”是指包含双环糖部分的经修饰的核苷。双环核苷的示例包括但不限于在4'核糖基环原子与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在一些方面中，本文提供的化合物包括一种或多种双环核苷，其中所述桥包括4'至2'双环核苷。此类4'至2'双环核苷的示例包括但不限于下式之一：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2*以及它们的类似物(参见美国专利号7,399,845，该美国专利全文以引用方式并入本文)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见PCT公开WO2009/006478，该PCT公开全文以引用方式并入本文)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见PCT公开WO2008/150729，该PCT公开全文以引用方式并入本文)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见美国专利申请公开US2004/0171570，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C10烷基或保护基(参见美国专利号7,427,672，该美国专利全文以引用方式并入本文)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74:118-134，该文献全文以引用方式并入本文)；和4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见PCT公开WO 2008/154401，该PCT公开全文以引用方式并入本文)。还参见例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4:455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54:3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97:5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8:2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63:10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc,2007,129:8362-8379；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2:558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8:1-7；Oram等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3:239-243；美国专利号U.S.6,670,461、7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,399,845；公布的PCT公开WO2004/106356、WO94/14226、WO2005/021570和WO2007/134181；美国专利申请公开US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；和美国专利申请号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；和PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922，所有这些文献全文以引用方式并入本文。
前述双环核苷中的每种双环核苷可制备成具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见例如PCT公开WO 99/14226)。在一些方面中，LNA核苷的双环糖部分包括但不限于在戊呋喃糖基糖部分的4'位置和2'位置之间具有至少一个桥的化合物，其中此类桥独立地包含1个或2至4个连接的基团，所述基团独立地选自-[CiRaXRb)]-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每个Ra和Rb独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基基团、取代的杂环基基团、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或磺酰氧基(S(＝O)-J1)，其中每个J1和J2独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基基团、取代的杂环基基团、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在一些方面中，双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-、或-C(RaRb)-O-N(R)-。在一些方面中，桥是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4*-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
在一些方面中，双环核苷进一步由异构体构型限定。例如，包含4'-2'亚甲氧基桥的核苷可为α-L构型或β-D构型。先前，α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA已被并入到显示出反义活性的反义寡核苷酸中。参见Frieden等人(2003),Nucleic Acids Research,21:6365-6372。
在一些方面中，双环核苷包括但不限于，
(A)α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA，
(B)β-D-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA，
(C)乙烯氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA，
(D)氨氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA，
(E)氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA，
(F)甲基(亚甲氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA，
(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA，
(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA，
(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA，和(J)丙烯碳环(4'-(CH2)3-2')BNA，如下所描绘。
其中Bx是碱基部分并且R独立地为H、保护基或C1-C2烷基。
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc是-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-、或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且，
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部。
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部；并且，
Za是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇、或取代的硫基。
在一些方面中，取代的基团中的每个取代的基团独立地被取代基基团单取代或多取代，所述取代基基团独立地选自卤素、含氧基(oxo)、羟基、OJc、NJ d、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基并且X是O或NJc。
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部；并且，
Rd是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、或取代的酰基(C(＝O)-)。
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基；
每个qb、qc和qd独立地为H、卤素、C-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-Ce烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基、或取代的C1-C6氨基烷基；
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部；
qa、qb、qc和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJj Jk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJj Jk、N(H)C(＝O)NJj Jk、或N(H)C(＝S)NJjJk；
或者qe和qf一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
在一些方面中，双环核苷由下式定义：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支持介质附接的共价附接部；每个qj、qj、qk和ql独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C2-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、
O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk、或(H)C(＝S)NJjJk；
并且qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh),，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C6烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷，已描述于Freier等人(1997)Nucleic Acids Research 25:4429-4443和Albaek等人(2006)J.Org.Chem.71:7731-77'40中。
如本文所用，“4'-2'双环核苷”或“4'至2'双环核苷”是指包含呋喃糖环的双环核苷，所述呋喃糖环包含连接2'碳原子和4'碳原子的桥。如本文所用，“单环核苷”是指包含不是双环糖部分的经修饰的糖部分的核苷。在一些方面中，核苷的糖部分或糖部分类似物可以在任何位置处被修饰或取代。如本文所用，“2'-修饰的糖”意指在2'位置处被修饰的呋喃糖基糖。在一些方面中，此类修饰包括选自以下的取代基：卤化物，包括但不限于取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫代烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基、和取代和未取代的炔基。在一些方面中，2'修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。
其他2'-取代基也可以选自：C1-C12烷基；取代的烷基；烯基；炔基；烷芳基；芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；R；切割基团；报告基团；嵌入剂；用于改善药代动力学性质的基团；和用于改善反义化合物的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。
在一些方面中，经修饰的核苷包含2'-MOE侧链。此类2'-MOE取代已被描述为与未修饰的核苷和其他经修饰的核苷(诸如2'-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基)相比具有改进的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸是用于体内使用的强效的基因表达反义抑制剂。
如本文所用，“经修饰的四氢吡喃核苷”或“经修饰的THP核苷”意指具有六元四氢吡喃“糖”取代正常核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷(糖替代物)。经修饰的THP核苷包括但不限于本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)、氟代HNA(F-HNA)的物质或由下式定义的那些化合物：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一者是将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，并且T3和T4中的另一者是H、羟基保护基、连接的缀合物基团、或5'末端基团或3'末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2中的一者为氢，并且另一者选自卤素、取代或未取代的烷氧基、
NJ、J2、SJ、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其
中X是O、S或NJ1，并且每个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。在一些方面中，提供了上式的经修饰的THP核苷，其中qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu各自为H。在一些方面中，qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一者不是H。在一些方面中，qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一者是甲基。在一些方面中，提供了上式的THP核苷，其中R1和R2中的一者为F。
在一些方面中，R1是氟且R2是H、R1是甲氧基且R2是H、或R1是甲氧基乙氧基且R2是H。
如本文所用，“2'-修饰的”或“2'-取代的”是指包含糖的核苷，所述糖包含在2'位置处的除H或OH以外的取代基。2'-修饰的核苷包括但不限于具有非桥接2'取代基的核苷，所述非桥接2'取代基为诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CCH3、2'-O(CH2)2SCCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和R独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可进一步包含例如在糖的其他位置和/或在核碱基处的其他修饰。
在一些方面中，LNA单元具有选自以下组的结构：
在寡聚物中并入亲和力增强的核苷酸类似物(诸如LNA或2'-取代的糖)可允许特异性结合的寡聚物的大小减小，并且还可降低在非特异性或异常结合发生之前寡聚物大小的上限。
II.f RNA酶募集
本公开的寡聚化合物可以经由非RNA酶介导的靶mRNA降解发挥作用，诸如通过翻译的空间位阻或其他方法。在一些方面中，本公开的寡聚物能够募集内切核糖核酸酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。在一些寡聚物中，诸如区域A或连续核苷酸序列包含至少4个(诸如至少5个、诸如至少6个、诸如至少7个连续核苷酸单元，诸如至少8个或至少9个连续核苷酸单元(残基)，包括7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续核苷酸)的区域，所述区域当与互补靶RNA形成双链体时能够募集RNA酶(诸如DNA单元)。能够募集RNA酶的连续序列可以是在如本文所述的缺口聚体的上下文中提及的区域Y'。在一些方面中，能够募集RNA酶的连续序列(诸如区域Y')的大小可以更大，诸如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸单元。
如果当寡聚物具有互补RNA靶标时，使用例如EP1222309中提供的方法，所述寡聚物具有如以pmol/l/min测量的使用具有相同的碱基序列但仅含有DNA单体、没有2'取代、在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯键基团的仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的至少1％、诸如至少5％、诸如至少10％或大于20％的初始速率时，则所述寡聚物被认为能够募集RNA酶H。
在一些方面中，如果当寡聚物具有互补RNA靶标和RNA酶H时，使用例如EP1222309中提供的方法，如以pmol/l/min测量的RNA酶H初始速率为使用没有2'取代、在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯键基团的等同仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的小于1％，诸如小于5％、诸如小于10％或小于20％时，则所述寡聚物被认为基本上不能募集RNA酶H。
在其他方面中，如果当寡聚物具有互补RNA靶标和RNA酶H时，使用例如EP1222309中提供的方法，如以pmol/l/min测量的RNA酶H初始速率为使用没有2'取代、在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯键基团的等同仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的至少20％，诸如至少40％、诸如至少60％、诸如至少80％时，则所述寡聚物被认为能够募集RNA酶H。
通常，形成连续核苷酸单元的寡聚物区域(所述区域当与互补靶RNA形成双链体时能够募集RNA酶)由与RNA靶标形成DNA/RNA样双链体的核苷酸单元组成。本发明的寡聚物(诸如第一区域)可包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含核苷酸和核苷酸类似物两者，并且为LNA缺口聚体的形式。
II.g缺口聚体设计
在一些方面中，本公开的寡聚物是LNA缺口聚体。缺口聚体寡聚物是能够募集RNA酶(例如RNA酶H)的包含连续核苷酸段的寡聚物，诸如至少6或7个DNA核苷酸的区域，在本文中称为区域Y'(Y')，其中区域Y'在5'和3'都侧接有具有亲和力增强的核苷酸类似物(诸如在所述连续核苷酸段的5'和3'的1-6个核苷酸类似物)的区域，所述区域能够募集RNA酶—这些区域分别被称为区域X'(X')和区域Z'(Z')。X'区域和Z'区域也可被称为缺口聚体的翼。缺口聚体的示例公开于例如WO2004/046160、WO2008/113832和WO2007/146511中。
在一些方面中，能够募集RNA酶的单体选自由以下组成的组：DNA单体、α-L-LNA单体、C4'烷基化DNA单体和UNA(未连接的核酸)核苷酸。UNA是非锁核酸，通常其中核糖的C2-C3 C-C键已被移除，从而形成非锁定的“糖”残基。在一些方面中，LNA缺口聚体包含式(5'至3')X'-Y'-Z'的(多)核苷酸序列，其中区域X'(X')(5'区域)由以下组成或包含以下：至少一种核苷酸类似物，诸如至少一个LNA单元，诸如1-6个核苷酸类似物，诸如LNA单元；并且区域Y'(Y')由至少四个或至少五个连续核苷酸组成或包含所述至少四个或至少五个连续核苷酸，所述连续核苷酸能够募集RNA酶(当与互补RNA分子(诸如mRNA靶标)形成双链体时)，诸如DNA核苷酸；并且区域Z'(Z')(3'区域)由以下组成或包含以下：至少一种核苷酸类似物，诸如至少一个LNA单元，诸如1-6个核苷酸类似物，诸如LNA单元。
在一些方面中，区域X'由以下组成：1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如2-5个核苷酸类似物，诸如2-5个LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4个LNA单元；和/或区域Z由以下组成：1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如2-5个核苷酸类似物，诸如2-5个LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4个LNA单元。
在一些方面中，Y'由以下组成或包含以下：能够募集RNA酶的4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续核苷酸，或能够募集RNA酶的4-12个或6-10个、或7-9个，诸如8个连续核苷酸。在一些方面中，区域Y'由以下组成或包含以下：至少一个DNA核苷酸单元，诸如1-12个DNA单元，优选地4-12个DNA单元，更优选地6-10个DNA单元，诸如7-10个DNA单元，最优选地8、9或10个DNA单位。在一些方面中，区域X'由以下组成：3或4个核苷酸类似物，诸如LNA；区域X'由以下组成：7、8、9或10个DNA单元；并且区域Z'由以下组成：3或4个核苷酸类似物，诸如LNA。此类设计包括(X'-Y'-Z')3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。在一些方面中，缺口聚体是3-9-4缺口聚体。在一些方面中，缺口聚体是3-10-3缺口聚体。
在一些方面中，寡聚物，例如区域X'，由总共10、11、12、13或14个核苷酸单元的连续核苷酸序列组成，其中所述连续核苷酸序列包含或为式(5'-3')X'-Y'-Z'，其中X'由以下组成：1、2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元；Y'由以下组成：7、8或9个连续核苷酸单元，所述连续核苷酸单元当与互补RNA分子(诸如mRNA靶标)形成双链体时能够募集RNA酶；并且Z'由以下组成：1、2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元。
在一些方面中，X'由1个LNA单元组成。在一些方面中，X'由2个LNA单元组成。在一些方面中，X'由3个LNA单元组成。在一些方面中，Z'由1个LNA单元组成。在一些方面中，Z'由2个LNA单元组成。在一些方面中，Z'由3个LNA单元组成。在一些方面中，Y'由7个核苷酸单元组成。在一些方面中，Y'由8个核苷酸单元组成。在一些方面中，Y'由9个核苷酸单元组成。在某些方面中，区域Y'由10个核苷单体组成。在一些方面中，区域Y'由以下组成或包含以下：1-10个DNA单体。在一些方面中，Y'包含1-9个DNA单元，诸如2、3、4、5、6、7、8或9个DNA单元。在一些方面中，Y'由DNA单元组成。在一些方面中，Y'包含α-L构型的至少一个LNA单元，诸如α-L构型的2、3、4、5、6、7、8或9个LNA单元。在一些方面中，Y'包含至少一个α-L-氧基LNA单元，或其中所有α-L构型的LNA单元都是α-L-氧基LNA单元。在一些方面中，X'-Y'-Z'中存在的核苷酸的数目选自由以下组成的组(核苷酸类似物单元-区域Y'-核苷酸类似物单元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4；或1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、2-10-3、或3-10-2。在一些方面中，X'-Y'-Z'中的核苷酸的数目选自由以下组成的组：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4和4-7-3。
在某些方面中，区域X'和Y'中的每一者由三个LNA单体组成，并且区域Y'由8或9或10个核苷单体，优选地DNA单体组成。在一些方面中，X'和Z'均各自由两个LNA单元组成，并且Y'由8或9个核苷酸单元，优选地DNA单元组成。在一些方面中，其他缺口聚体设计包括这样的缺口聚体设计，其中区域X'和/或Z'由3、4、5或6个核苷类似物，诸如含有2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'-MOE)的单体或含有2'-氟-脱氧核糖糖的单体组成，并且区域Y'由8、9、10、11或12个核苷，诸如DNA单体组成，其中区域X'-Y'-Z'具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4单体。另外的缺口聚体设计公开于例如WO 2007/146511A2中，该专利全文以引用方式并入本文。
在一些方面中，本公开的缺口聚体寡聚物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:40所示的序列。在一些方面中，本公开的缺口聚体寡聚物由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:40所示的序列组成。
II.h核苷间键
在一些方面中，本公开的寡核苷酸的核苷单体经由核苷间键基团偶联在一起。每个单体经由键基团连接到3'相邻单体。每个核苷酸还经由键基团连接到3'相邻核苷酸。在本公开的上下文中，寡聚物末端的5'单体不包含5'键基团，但是所述5'单体可包含或不包含5'末端基团或用于缀合的键基团。
术语“键基团”或“核苷间键”旨在意指能够将两个核苷酸共价偶联在一起的基团。具体示例包括磷酸基团和硫代磷酸酯基团。核苷间键可以与核苷间连接可互换地使用。
合适的核苷间键包括例如在WO2007/031091中列出的那些，该专利申请全文以引用方式并入本文。在一些方面中，除了区域B的磷酸二酯键(在存在的情况下)之外，核苷间键可以从其正常磷酸二酯修饰成对核酸酶攻击更具抗性的键，诸如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。这两个可被RNA酶H切割的键还允许减少靶基因表达的反义抑制途径。
在一些方面中，本公开的寡聚物包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷键：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯，或它们的任意组合。可以使用如本文所提供的合适的含硫(S)的核苷间键，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，或它们的组合。硫代磷酸酯核苷间键也是优选的，特别是对于第一区域，诸如在缺口聚体、混合聚体、antimirs剪接转换寡聚物和全聚体(totalmer)中。
术语“混合聚体”是指包含天然存在的和非天然存在的核苷酸两者的寡聚物，其中与缺口聚体、尾聚体和头聚体不同，不存在具有大于5个，并且在一些方面中不大于4个连续的，诸如不大于三个连续的天然存在的核苷酸(诸如DNA单元)的连续序列。
术语“全聚体”是指单链寡聚物，所述单链寡聚物仅包含非天然存在的核苷，诸如经糖修饰的核苷类似物。
对于缺口聚体，寡聚物中的核苷间键可以是例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，以便允许RNA酶H切割所靶向的RNA。出于改进核酸酶抗性和其他原因，诸如易于制造，硫代磷酸酯是优选的。
在一些方面中，除了第一区域与第二区域之间以及任选地在区域B内的磷酸二酯键外，本公开的寡聚物的剩余核苷间键、核苷酸和/或核苷酸类似物借助于硫代磷酸酯基团连接至彼此。
在一些方面中，第一区域中核苷之间的所有核苷间键的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约110％选自由以下组成的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。在一些方面中，第一区域中核苷之间的所有核苷间键的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％选自由以下组成的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或硼烷磷酸酯。
在一些方面中，第一区域中核苷之间的所有核苷间键的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约110％为硫代磷酸酯。在一些方面中，第一区域中核苷之间的所有核苷间键的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％为硫代磷酸酯。
在一些方面中，本公开的寡核苷酸仅包含一个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含两个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含三个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含四个硫代磷酸酯键。本公开的寡核苷酸包含五个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含六个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含七个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含八个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含九个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含10个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含11个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含12个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含13个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含14个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含15个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含16个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含17个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含18个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含19个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含20个硫代磷酸酯键。在一些方面中，本公开的寡核苷酸包含21个硫代磷酸酯键。
WO09124238涉及具有通过中性核苷间键附接至3'或5'末端的至少一个双环核苷的寡聚化合物。因此，本发明的寡聚物可具有通过中性核苷间键(诸如一个或多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛(formacetal)或硫代甲缩醛)附接至3'或5'末端的至少一个双环核苷。剩余的键可以是硫代磷酸酯。
III.寡核苷酸缀合物
在一些方面中，本发明的反义寡核苷酸缀合物包含至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(C)，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分任选地经由位于寡聚物的连续序列与缀合物部分(B和/或Y)之间的接头区域共价附接至所述寡聚物(A)。
已与寡核苷酸一起使用的代表性缀合物部分可包括亲脂性分子(芳族和非芳族)，包括类固醇分子；蛋白质(例如，抗体、酶、血清蛋白)；多肽；维生素(水溶性或脂溶性)；聚合物(水溶性或脂溶性)；小分子，包括药物、毒素、报告分子和受体配体；碳水化合物复合物；核酸切割复合物；金属螯合剂(例如，卟啉、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、冠醚等)；嵌入剂，包括混合光核酸酶/嵌入剂；交联剂(例如，光活性剂、氧化还原活性剂)，以及它们的组合和衍生物。
在一些方面中，本公开提供了一种反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物包含：
a.长度在16-22个核苷酸之间的反义寡聚物(A)，所述反义寡聚物包含与SEQ IDNO:31的对应长度互补的16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是LNA缺口聚体，和
b.至少一种靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分(C)，所述至少一种靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分共价附接至所述寡聚物(A)。
在一些方面中，本公开的寡聚物靶向肝脏，即在全身施用后，所述化合物在肝脏细胞(诸如肝细胞)中积累。通过添加缀合物部分(C)可以大大增强对肝脏的靶向。然而，为了最大化寡聚物的功效，往往需要将缀合物(或靶向部分)经由生物可切割接头(B)(诸如核苷酸磷酸接头)连接至寡聚物。因此，需要使用增强肝细胞中的摄取和活性的缀合物部分。活性的增强可能是由于增强的摄取，或者其可能是由于肝细胞中化合物的效力增强。因此，本公开还提供了一种LNA寡聚物(诸如缺口聚体，或例如LNA反义寡聚物)形式的寡聚化合物(其在本文中可以称为区域A)，所述寡聚化合物包含反义寡聚物，任选地生物可切割接头(诸如区域B)和碳水化合物缀合物(其可称为区域C)。LNA反义寡聚物的长度可为7至30个核苷，例如长度为8-26个核苷，并且包含至少一个LNA单元(核苷)。
在一些方面中，所述缀合物是或可包含碳水化合物或包含碳水化合物基团。在一些方面中，碳水化合物选自由以下组成的组：半乳糖、乳糖、n-乙酰半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。在一些方面中，缀合物基团是或可包含甘露糖或甘露糖-6-磷酸。碳水化合物缀合物可用于增强一系列组织(诸如肝脏和/或肌肉)中的递送或活性。在一些方面中，本公开的缀合物包含碳水化合物部分(诸如GalNAc部分)形式的靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分(其可称为区域C)。碳水化合物部分可以是多价的，诸如例如2、3、4或4个相同或不同的碳水化合物部分可以任选地经由一个或多个接头(诸如区域Y)共价接合至寡聚物。
在一些方面中，碳水化合物部分不是直链碳水化合物聚合物。然而，碳水化合物部分可以是多价的，诸如例如2、3、4或4个相同或不相同的碳水化合物部分可以任选地经由一个或多个接头共价接合至寡聚物。
III.a GalNAc缀合物部分
本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含本公开的寡聚物和靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分(诸如GalNAc部分)，所述缀合物部分可以形成另一区域(称为区域C)的一部分。本公开还提供了一种反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物包含：
a.长度在16-22个核苷酸之间的反义寡聚物(A)，所述反义寡聚物包含与SEQ IDNO:31的对应长度互补的16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的LNA缺口聚体，和
b.至少一种靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分(C)，所述至少一种靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分共价附接至所述寡聚物(A)。
在一些方面中，所述缀合物部分(诸如第三区域或区域C)包含选自由以下组成的组的靶向去唾液酸糖蛋白受体的部分：诸如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。在一些方面中，缀合物包含半乳糖簇，诸如N-乙酰半乳糖胺三聚体。在一些方面中，缀合物部分包含GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)，诸如单价、二价、三价或四价GalNAc。
三价GalNAc缀合物可用于将化合物靶向至肝脏。GalNAc缀合物已与甲基膦酸酯、PNA反义寡核苷酸和siRNA一起使用。WO2012/083046公开了具有GalNAc缀合物部分的siRNA，所述GalNAc缀合物部分包含可切割的药代动力学调节剂，所述可切割的药代动力学调节剂适用于本公开，优选的药代动力学调节剂是C16疏水基团，诸如棕榈酰基、十六-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。所述'046可切割药代动力学调节剂也可以是胆固醇。
“靶向部分”(缀合物部分)可选自由以下组成的组：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、半乳糖簇和N-乙酰半乳糖胺三聚体，并且可以具有选自由以下组成的组的药代动力学调节剂：具有16个或更多个碳原子的疏水基团、具有16-20个碳原子的疏水基团、棕榈酰基、十六-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基、和胆固醇。'046中公开的某些GalNAc簇包括：(E)-十六-8-烯酰基(C16)、油烯基(C18)、(9,E,12E)-十八-9,12-二烯酰基(C18)、辛酰基(C8)、十二烷酰基(C12)、C-20酰基、C24酰基、二辛酰基(2xC8)。靶向部分—靶向药代动力学调节剂的部分可以经由生理学上不稳定的键或例如二硫键或PEG接头连接至多核苷酸。本公开还涉及寡聚物与缀合物基团之间磷酸二酯接头的用途(这些磷酸二酯接头在本文中被称为区域B，并且适当地位于LNA寡聚物与碳水化合物缀合物基团之间)。
对于靶向肝脏中的肝细胞，优选的靶向配体是半乳糖簇。半乳糖簇包含具有(例如包含)两个至四个末端半乳糖衍生物的分子。在一些方面中，半乳糖衍生物是N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的其他糖可以选自包括以下的列表：半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对去唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖的半乳糖衍生物两者。末端半乳糖衍生物经由其C-I碳附接至分子。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)主要在肝细胞上表达并结合分支的半乳糖末端糖蛋白。半乳糖簇具有三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，所述三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物各自对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和力。另一半乳糖簇具有三个末端N-乙酰基-半乳糖胺。本领域常见的其他术语包括三触角半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知三触角半乳糖衍生物簇以比双触角或单触角半乳糖衍生物结构更大的亲和力与ASGPr结合。需要多价才能实现nM亲和力。
半乳糖簇可包含两个或优选地三个半乳糖衍生物，所述半乳糖衍生物各自连接到中心分支点。半乳糖衍生物经由糖的C-I碳附接至中心分支点。半乳糖衍生物优选地经由接头或间隔基连接至分支点。在一些方面中，间隔基是柔性亲水间隔基，例如PEG间隔基，诸如PEG3间隔基。分支点可以是允许所述三个半乳糖衍生物附接并且进一步允许分支点附接至寡聚物的任何小分子。示例性分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子包含三个胺基团以及羧基反应基团，所述三个半乳糖衍生物可以经由所述胺基团附接，所述二赖氨酸可以经由所述羧基反应基团附接至寡聚物。分支点至寡聚物的附接可以经由接头或间隔基发生。在一些方面中，间隔基是柔性亲水间隔基，例如PEG间隔基，诸如PEG3间隔基(三个乙烯单元)。可以使用本领域已知的方法将半乳糖簇附接至寡聚物的3'或5'端。
在本公开的一些方面中，反义寡核苷酸缀合物的缀合物部分包含Conj 1、Conj 2、Conj 3、Conj 4和Conj1a、Conj2a、Conj3a和Conj4a或由其组成。在一些方面中，缀合物部分包含Conj 2a或由其组成。在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物选自由以下组成的组：SEQID NO:18和SEQ ID NO:19。
因此，GalNAc簇(例如，GalNAc)的每个碳水化合物部分可以经由间隔基接合至寡聚物，所述间隔基为诸如(聚)乙二醇接头(PEG)，诸如二乙二醇接头、三乙二醇接头、四乙二醇接头、五乙二醇接头、六乙二醇接头。如上所示，PEG部分在半乳糖部分与肽(示出了三赖氨酸)接头之间形成间隔基。
在一些方面中，GalNAc簇包含经由双基团接头附接至寡聚物(或至区域Y或区域B)的肽接头，例如Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽，例如GalNAc簇可包含以下双基团接头：
R1是双基，优选选自-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-、-C(O)CH2-、-C(O)C2H4-、-C(O)C3H6-、-C(O)C4H8-、-C(O)C5H10-、-C(O)C6H12-、1,4-环己基(-C(O)C6H10-)、1,4-苯基(-C(O)C6H4-)、-C(O)C2H4OC2H4-、-C(O)C2H4(OC2H4)2-或-C(O)C2H4(OC2H4)3-。
在一些方面中，R1是优选选自以下的双基团：-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-。
碳水化合物缀合物(例如，GalNAc)或碳水化合物-接头部分(例如碳水化合物-PEG部分)可以经由分支点基团(诸如氨基酸或肽)共价接合(连接)至寡聚物，所述分支点基团适当地包含两个或更多个氨基基团(诸如3、4或5个)，诸如赖氨酸、二赖氨酸或三赖氨酸或四赖氨酸。三赖氨酸分子含有四个胺基团以及羧基反应基团，三个碳水化合物缀合物基团(诸如半乳糖和衍生物(例如，GalNAc))和另外的缀合物(诸如疏水或亲脂部分/基团)可以经由所述四个胺基团附接，三赖氨酸可以经由所述羧基反应基团附接至寡聚物。另外的缀合物(诸如亲脂性/疏水性部分)可附接至赖氨酸残基，所述赖氨酸残基附接至寡聚物。
用于与本公开的LNA寡聚物一起使用的GalNAc缀合物不需要药代动力学调节剂(例如，下文公开的亲脂性部分)。因此，在一些方面中，GalNAc缀合物未共价连接至亲脂性或疏水性部分，诸如本文所述的那些，例如不包含C8-C36脂肪酸或甾醇。因此，本公开提供了LNA寡聚物GalNAc缀合物，所述GalNAc缀合物不包含缀合的亲脂性或疏水性药代动力学调节剂。
III.b亲脂性部分
本公开的寡核苷酸可进一步包含一个或多个附加缀合物部分(例如，作为GalNAc部分的替代或补充)，所述一个或多个附加缀合物部分中的亲脂性或疏水性部分是特别令人感兴趣的，诸如当缀合物基团是碳水化合物部分时。此类亲脂性或疏水性部分可以充当药代动力学调节剂，并且可以共价连接至碳水化合物缀合物、将碳水化合物缀合物连接至寡聚物的接头或连接多个碳水化合物缀合物(多价)缀合物的接头，或任选地经由接头(诸如生物可切割接头)共价连接至寡聚物。
因此，寡聚物或缀合物部分可包含药代动力学调节剂，诸如亲脂性或疏水性部分。此类部分在WO2012/082046中的siRNA缀合物的上下文下公开，该文专利申请的全文以引用方式并入本文。疏水部分可包含C8-C36脂肪酸，其可以是饱和的或不饱和的。在一些方面中，可以使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。疏水基团可具有16个或更多个碳原子。
示例性合适的疏水基团可选自包括以下的组：甾醇、胆固醇、棕榈酰基、十六-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸靶向方面不太有效，但它们可以以多拷贝(例如2x，诸如2xC8或C10、C12或C14)使用以增强功效。可用作靶向多核苷酸的部分的药代动力学调节剂可选自由以下组成的组：胆固醇、烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、芳烷基基团、芳烯基基团和芳炔基基团，它们中的每一者都可以是直链的、支链的或环状的。药代动力学调节剂优选是仅含有碳和氢原子的烃。然而，可以允许维持疏水性的取代或杂原子，例如氟。
III.c亲脂性缀合物
在一些方面中，缀合物部分是或可包含亲脂性部分，诸如甾醇(例如，胆固醇、胆固醇基、胆甾烷醇、豆甾醇、胆烷酸和麦角甾醇)。在一些方面中，缀合物部分是或包含生育酚(在图2中例示为Conj 6和Conj 6a)。在一些方面中，缀合物部分是或可包含胆固醇(在图2中例示为Conj 5和Conj 5a)。
在一些方面中，缀合物部分是或可以包含脂质、磷脂或亲脂醇(诸如阳离子脂质、中性脂质、鞘脂)，和脂肪酸(诸如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸)。在一些方面中，脂肪酸包含C4-C30饱和或不饱和烷基链。烷基链可以是直链或支链的。
亲脂性缀合物部分可用于例如抵消寡聚化合物的亲水性并增强细胞渗透。
亲脂性部分包括例如甾醇、甾烷醇和类固醇以及相关化合物，诸如胆固醇、巯基胆固醇、羊毛甾醇、粪甾烷醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、黄体酮、己烯雌酚、睾酮、雄甾酮、脱氧皮质酮、肾上腺皮质酮、17-羟基皮质酮、它们的衍生物等。在一些方面中，缀合物可选自由以下组成的组：胆固醇、巯基胆固醇、羊毛甾醇、粪甾烷醇、豆甾醇、麦角甾醇、钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌酮、雌二醇、雌三醇、黄体酮、己烯雌酚、睾酮、雄甾酮、脱氧皮质酮、肾上腺皮质酮、和17-羟基皮质酮。其他亲脂性缀合物部分包括脂族基团，诸如例如直链、支链和环状烷基、烯基和炔基。脂族基团可具有例如5至约50个、6至约50个、8至约50个、或10至约50个碳原子。示例性脂族基团包括十一烷基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜烯、冰片基、金刚烷基、它们的衍生物等。在一些方面中，脂肪族基团中的一个或多个碳原子可以被诸如O、S或N的杂原子(例如，香叶基氧基己基)替代。其他合适的亲脂性缀合物部分包括甘油的脂族衍生物，诸如烷基甘油、双(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在一些方面中，亲脂性缀合物是二己基癸基-rac-甘油或1,2-二-O-己基癸基-rac-甘油或它们的膦酸酯。饱和和不饱和脂肪官能团，诸如例如脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯和脂肪胺，也可以充当亲脂性缀合物部分。在一些方面中，脂肪官能团可包含约6个碳至约30个或约8个至约22个碳。示例性脂肪酸包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸等。
在另外的方面中，亲脂性缀合物基团可以是具有6至约50个、10至约50个或14至约40个碳原子的多环芳族基团。示例性多环芳族基团包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、它们的衍生物等。其他合适的亲脂性缀合物部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如，二甲氧基三苯甲基(DMT))、吩噁嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、它们的衍生物等。
含有对低密度脂蛋白(LDL)具有亲和力的缀合物部分的寡聚化合物可有助于提供有效的靶向递送系统。LDL受体在肿瘤细胞上的高表达水平使LDL成为有吸引力的用于将药物选择性递送至这些细胞的载体。对LDL具有亲和力的部分包括许多亲脂性基团，诸如类固醇(例如，胆固醇)、脂肪酸、其衍生物和它们的组合。在一些方面中，具有LDL亲和力的缀合物部分可以是胆酸(诸如鹅脱氧胆酸和石胆酸)的二油烯基酯。在一些方面中，亲脂性缀合物可以是或可包含生物素。在一些方面中，亲脂性缀合物部分可以是或可包含甘油化物或甘油酯。
亲脂性缀合物部分(诸如甾醇、甾烷醇)和染色剂(诸如胆固醇或如本文所公开的)可用于增强寡核苷酸递送至例如肝脏(通常，至肝细胞)。在本公开的一些方面中，反义寡核苷酸缀合物的缀合物部分包含Conj 5、Conj 5a、Conj 6或Conj 6a或由其组成。在一些方面中，缀合物部分包含Conj 5a或由其组成。在一些方面中，反义寡核苷酸缀合物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
III.d接头
键或接头是两个原子之间的连接部，所述连接部经由一个或多个共价键将一个感兴趣的化学基团或区段连接到另一个感兴趣的化学基团或区段。缀合物部分(或靶向或封闭部分)可以直接或经由连接部分(接头或系链)、即接头附接至寡聚化合物。接头是用于将第三区域(例如缀合物部分)共价连接至寡聚化合物(诸如至区域A)的双官能部分。在一些方面中，接头包含链结构或重复单元(诸如乙二醇或氨基酸单元)的寡聚物。接头可具有至少两个官能团，一个官能团用于附接至寡聚化合物，另一个官能团用于附接至缀合物部分。示例性接头官能团可以是亲电子的以用于与寡聚物或缀合物部分上的亲核基团反应，或者是亲核的以用于与亲电子基团反应。在一些方面中，接头官能团包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亚磷酸酯、不饱和基(例如，双键或三键)等。一些示例性接头包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己氧基、4-氨基丁酸、4-氨基环己基羧酸、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧基-(6-酰氨基-己酸琥珀酰亚胺酯)(LCSMCC)、间马来酰亚胺-苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-e-马来酰亚胺-己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、6-(β-马来酰亚胺-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(SMPH)、N-(a-马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯)(AMAS)、4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯基甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二烷酸(ADC)、烯化二醇(alylene diol)、聚乙二醇、氨基酸等。
多种另外的接头基团是本领域已知的，其可用于将缀合物部分附接至寡聚化合物。许多有用的接头基团的综述可以见于例如Antisense Research and Applications,S.T.Crooke和B.Lebleu编辑,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,第303-350页中。
贯穿本领域提供了接头及其在制备寡聚化合物的缀合物中的用途，诸如在WO 96/11205和WO 98/52614以及美国专利号4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603；5,608,046；4,587,044；4,667,025；5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5,510475；5,512,667；5,574,142；5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；和6,335,437；以及WO 2012/083046中，所有这些专利或专利申请的全文以引用方式并入本文。
如本文所用，生理学上不稳定的键是在哺乳动物体内通常遇到或与在哺乳动物体内遇到的那些类似的条件下可切割的不稳定键(也称为可切割接头，示出为图12和图13中的区域B)。生理学上不稳定的键基团经选择为使得它们当在某些生理条件下存在时经历化学转化(例如，切割)。哺乳动物细胞内条件包括在哺乳动物细胞中发现的或与在哺乳动物细胞中遇到的那些类似的化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂、和盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括哺乳动物细胞中正常存在的酶促活性(诸如来自蛋白水解酶或水解酶的酶促活性)的存在。在一些方面中，可切割接头对可以例如在靶细胞中表达的核酸酶易感，并且因此，如本文所详述，接头可以是具有(例如1-10个)磷酸二酯连接的核苷(诸如DNA核苷)的短区域。
化学转化(不稳定键的切割)可以通过向细胞添加药学上可接受的试剂来引发，或者可以在含所述不稳定的键的分子到达适当的细胞内和/或细胞外环境时自发发生。例如，当分子进入酸化核内体时，pH不稳定键可被切割。因此，pH不稳定键可被认为是核内体可切割键。当暴露于酶(诸如存在于核内体或溶酶体或细胞质中的那些酶)时，酶可切割键可被切割。当分子进入细胞质的还原性更强的环境时，二硫键可被切割。因此，二硫键可被认为是细胞质可切割键。如本文所用，pH不稳定键是在酸性条件(pH<7)下选择性断裂的不稳定键。这种键也可以称为核内体不稳定键，因为细胞核内体和溶酶体的pH小于7。
III.e与寡聚物连接的生物可切割缀合物
寡聚化合物可以任选地包含位于寡聚物(被称为区域A)与缀合物(被称为区域C)之间的第二区域(区域B)(参见用于说明的图12和图13)。区域B可以是接头，诸如可切割接头(也称为生理学上不稳定的键)。核酸酶易感的生理不稳定键：在一些方面中，本公开的寡聚物(也称为寡聚化合物)(或缀合物)包含三个区域：
i)第一区域(区域A)，所述第一区域包含例如16-18个连续核苷酸；
ii)第二区域(区域B)，所述第二区域包含生物可切割接头；以及
iii)第三区域(C)，所述第三区域包含缀合物部分、靶向部分、活化部分，其中所述第三区域共价连接至所述第二区域。
在一些方面中，区域B可以是磷酸核苷酸接头。例如，当缀合物是亲脂性缀合物(诸如脂质、脂肪酸、甾醇(例如胆固醇)或生育酚)时，可以使用此类接头。磷酸核苷酸接头也可用于其他缀合物，例如碳水化合物缀合物，诸如GalNAc。
III.e.1肽接头
在一些方面中，生物可切割接头(区域B)是肽，诸如三赖氨酸肽接头，所述肽可用于多GalNAc缀合物(诸如三GalNAc缀合物)中。还参见本文提到的肽双基团。
可以使用的本领域已知的其他接头包括二硫接头。
III.e.2磷酸核苷酸接头
在一些方面中，区域B包含1-6个之间的核苷酸，所述区域B诸如经由核苷间键基团(诸如磷酸二酯键)共价连接至第一区域(区域A)的5'或3'核苷酸，其中
a.第一区域与第二区域之间的核苷间键是磷酸二酯键，并且邻近[诸如紧邻]
第一区域的第二区域的核苷是DNA或RNA；和/或
b.第二区域的至少1个核苷是连接磷酸二酯的DNA或RNA核苷。
在一些方面中，区域A和区域B形成长度为16-22个核苷酸的单个连续核苷酸序列。
在一些方面中，第一区域与第二区域之间的核苷间键可以被认为是第二区域的一部分。
在一些方面中，第二区域与第三区域之间存在含磷键基团。所述磷键基团可以例如是磷酸酯(磷酸二酯)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯基团。在一些方面中，此含磷键基团位于第二区域与接头区域之间，该接头区域附接至第三区域。在一些方面中，磷酸基团是磷酸二酯。
因此，在一些方面中，寡聚化合物包含至少两个磷酸二酯基团，其中至少一个磷酸二酯基团根据上述陈述，并且另一个磷酸二酯基团位于第二区域与第三区域之间，任选地位于接头基团与第二区域之间。
在一些方面中，第三区域是活化基团，诸如用于缀合的活化基团。就此而言，本公开还提供了活化寡聚物，所述活化寡聚物包含区域A和区域B以及活化基团，例如适合于随后连接至第三区域(诸如适合于缀合)的中间体。
在一些方面中，第三区域是反应基团，诸如用于缀合的反应基团。就此而言，本公开还提供了寡聚物，所述寡聚物包含区域A和区域B以及反应基团，例如适合于随后连接至第三区域(诸如适合于缀合)的中间体。在一些方面中，反应基团可包括醇基团的胺，诸如胺基团。
在一些方面中，区域A包含至少一个，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个除磷酸二酯之外的核苷间键，诸如(任选独立地)选自由以下组成的组的核苷间键：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯、和甲基膦酸酯，诸如硫代磷酸酯。在一些方面中，区域A包含至少一个硫代磷酸酯键。在一些方面中，区域A内的核苷间键的至少50％，诸如至少75％、诸如至少90％，诸如所有核苷间键不是磷酸二酯，例如为硫代磷酸酯键。在一些方面中，区域A中的所有核苷间键不是磷酸二酯。
在一些方面中，寡聚化合物包含反义寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸缀合物。反义寡核苷酸可以是或者可包含第一区域和任选的第二区域。就此而言，在一些方面中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核碱基序列的一部分。在其他方面中，区域B可缺乏与靶标的互补性。
换句话说，在一些方面中，本公开提供了一种非磷酸二酯连接的(诸如硫代磷酸酯连接的)寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)，所述寡核苷酸具有至少一个末端(5'和/或3')DNA或RNA核苷，所述至少一个末端DNA或RNA核苷经由磷酸二酯键连接至所述寡核苷酸的相邻核苷，其中所述末端DNA或RNA核苷进一步任选地经由接头部分共价连接至缀合物部分、靶向部分或封闭部分。
在一些方面中，寡聚化合物包含反义寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸缀合物。反义寡核苷酸可以是或者可包含第一区域和任选的第二区域。就此而言，在一些方面中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核碱基序列的一部分。在其他方面中，区域B可缺乏与靶标的互补性。
在一些方面中，第二区域的至少两个连续核苷是DNA核苷(诸如至少3个或4个或5个连续DNA核苷酸)。
在此类方面中，本公开的寡核苷酸可以根据下式描述：5'-A-PO-B[Y]X-3'或3'-A-PO-B[Y]X-5'，其中A是区域A，PO是磷酸二酯键，B是区域B，Y是任选的键基团，并且X是缀合物、靶向基团、封闭基团或者反应基团或活化基团。
在一些方面中，区域B包含3'-5'或5'-3'：(i)至区域A的5'或3'核苷的磷酸二酯键，(ii)DNA或RNA核苷，诸如DNA核苷，和(iii)另外的磷酸二酯键5'-A-PO-B-PO-3'或3'-A-PO-B-PO-5'。
所述另外的磷酸二酯键将区域B核苷与一个或多个另外的核苷(诸如一个或多个DNA或RNA核苷)连接，或者可以任选地经由键基团(Y)连接至X(其为缀合物、靶向基团或封闭基团或反应基团或活化基团)。
在一些方面中，区域B包含3'-5'或5'-3'：i)至区域A的5'或3'核苷的磷酸二酯键，ii)在2-10个之间的DNA或RNA磷酸二酯连接的核苷，诸如DNA核苷，和任选的iii)另外的磷酸二酯键：
5'-A-[PO-B]n-[Y]-X 3'或3'-A-[PO-B]n-[Y]-X 5'
5'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 3'或3'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 5'
其中A代表区域A，[PO-B]n代表区域B，其中n为1-10，诸如1、2、3，4、5、6、7、8、9或10，PO是在区域B与X(或Y(如果存在的话))之间的任选的磷酸二酯键基团。
在一些方面中，本公开提供了根据(或包含)下式之一的化合物：
5'[区域A]-PO-[区域B]3'-Y-X
5'[区域A]-PO-[区域B]-PO 3'-Y-X
5'[区域A]-PO-[区域B]3'-X
5'[区域A]-PO-[区域B]-PO 3'-X
3'[区域A]-PO-[区域B]5'-Y-X
3'[区域A]-PO-[区域B]-PO 5'-Y-X
3'[区域A]-PO-[区域B]5'-X
3'[区域A]-PO-[区域B]-PO 5'-X
区域B可以例如包含或由以下组成：
5'DNA3'
3'DNA5'
5'DNA-PO-DNA-3'
3'DNA-PO-DNA-5'
5'DNA-PO-DNA-PO-DNA3'
3'DNA-PO-DNA-PO-DNA5'
5'DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA3'
3'DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA5'
5'DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA3'
3'DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'。
应该认识到，磷酸酯连接的生物可切割接头可以采用除DNA和RNA之外的核苷。可以使用实施例6中的测定来鉴定生物可切割的核苷酸接头。
在一些方面中，本公开的化合物包含生物可切割接头(也称为生理学上不稳定的接头、核酸酶易感的生理学上不稳定的接头或核酸酶易感接头)，例如磷酸核苷酸接头(诸如区域B)或肽接头，所述生物可切割接头将寡聚物(或连续核苷酸序列或区域A)接合至缀合物部分(或区域C)。
实施例6所示的测定中对切割的易感性可用于确定接头是可生物切割的还是生理学上不稳定的。
根据本公开的生物可切割接头包含在靶组织(例如肝和/或肾)中对切割易感的(即生理学上不稳定的)接头。优选的是，在靶组织中看到的切割速率大于在血清中存在的切割速率。用于测定组织(例如肝或肾)中和血清中的切割水平(％)的合适方法见于实施例6中。在一些方面中，本公开的化合物中的生物可切割接头(也称为生理学上不稳定的接头或核酸酶易感接头)，诸如区域B，在实施例6的肝脏或肾脏匀浆测定中至少约20％被切割，诸如至少约30％被切割、诸如至少约40％被切割、诸如至少约50％被切割、诸如至少约60％被切割、诸如至少约70％被切割，诸如至少约75％被切割。在一些方面中，如实施例6中的测定中所使用的，血清中的切割(％)小于约30％、小于约20％，诸如小于约10％、诸如小于5％、诸如小于约1％。
在一些可相同或不同的方面中，本公开的化合物中的生物可切割接头(也称为生理学上不稳定的接头或核酸酶易感接头)，诸如区域B，易被S1核酸酶切割。可以使用实施例6中所示的S1核酸酶测定来评估对S1切割的易感性。在一些方面中，本公开的化合物中的生物可切割接头(也称为生理学上不稳定的接头或核酸酶易感接头)，诸如区域B，根据实施例6所用的测定在与S1核酸酶一起孵育120min后，至少约30％被切割，诸如至少约40％被切割、诸如至少约50％被切割、诸如至少约60％被切割、诸如至少约70％被切割、诸如至少约80％被切割、诸如至少约90％被切割、诸如至少约95％被切割。
区域B中的序列选择：在一些方面中，本公开的寡聚物包含与靶序列不互补的区域(区域B)。在其他方面中，区域B确实形成靶序列的互补序列。在一些方面中，区域A和区域B一起可以形成与靶序列互补的单个连续序列。
在一些方面中，基于靶组织或细胞或亚细胞隔室中存在的主要核酸内切酶切割酶，选择区域B中的碱基序列以提供最佳核酸内切酶切割位点。在这方面，通过从靶组织和非靶组织中分离细胞提取物，可以基于在所需靶细胞(例如肝脏/肝细胞)中与非靶细胞(例如肾)相比优先的切割活性来选择用于在区域B中使用的核酸内切酶切割序列。在这方面，可以针对所需组织/细胞优化化合物用于靶标下调的效力。
在一些方面中，区域B包含二核苷酸序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以用U替换。在一些方面中，区域B包含三核苷酸序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以用U替换。
在一些方面中，区域B包含四核苷酸序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX和GGGX，其中X可选自由以下组成的组：A、T、U、G、C以及它们的类似物，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以用U替换。应当认识到，当提及(天然存在的)核碱基A、T、U、G、C时，这些核碱基可以用核碱基类似物取代，所述核碱基类似物作为等同的天然核碱基(例如与互补核苷的碱基对)发挥作用。在一些方面中，区域B不包含T或U。
IV.医疗适应症
在一些方面中，本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可用于治疗与PCSK9基因的正常形式、突变体形式、等位基因变体形式或剪接变体形式的过表达或表达相关联的病症。本公开进一步提供了本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)，所述药物组合物用于制造用于治疗本文提及的疾病、疾患或病症的药物。
本公开提供了治疗患有或易患与PCSK9的异常水平和/或活性相关联的病症的哺乳动物(例如，人)的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐或它们的任意组合)的口服制剂)。
本文提及的疾病或疾患在一些方面中可以与PCSK9基因或其蛋白质产物与PCSK9相关联或相互作用的基因中的突变相关联。因此，在一些方面中，靶标是RNA。在一些方面中，mRNA是前mRNA。在一些方面中，RNA是mRNA中的内含子。在一些方面中，RNA是RNA中的外显子。在一些方面中，RNA是内含子与外显子之间的接合部。在一些方面中，RNA是来自正常PCSK9的mRNA，所述mRNA例如通过缺陷型启动子或通过涵盖PCSK9的代谢或信号传导途径的其他部件进行上调。在一些方面中，mRNA来自PCSK9基因的等位基因变体。在一些方面中，mRNA来自正常或突变PCSK9基因的剪接变体。在一些方面中，mRNA来自PCSK9基因的突变形式(例如，功能获得性突变体)。
PCSK9在胆固醇稳态中发挥着重要的调节作用，主要是通过降低质膜上的LDLR水平。LDLR水平降低会导致LDL粒子的代谢减少，从而可能导致高胆固醇血症。LDL当与LDLR结合时会诱导LDLR-LDL复合物在核内体内的内化。当PCSK9与LDLR结合(经由EGF-A结构域)时，PCSK9会阻止受体-配体复合物的构象变化。这种抑制将LDLR替代地重定向至溶酶体。
PCSK9还在小肠中肠道富含甘油三酯的apoB脂蛋白产生和餐后脂血症中发挥重要作用。PCSK9的变体可以减少或增加循环胆固醇。其他变异与罕见的常染色体显性家族性高胆固醇血症(HCHOLA3)相关联。这些突变增加了其蛋白酶活性，降低了LDLR水平并阻止将胆固醇摄取到细胞中。PCSK9在动脉壁(内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)中高表达，具有调节血管稳态和动脉粥样硬化的局部效应。因此，PCSK9具有促动脉粥样硬化效应并调节脂蛋白合成。
PCSK9参与葡萄糖代谢和肥胖，调节肾脏中钠的重吸收(这与高血压有关)。此外，PCSK9可能参与细菌或病毒感染和败血症。
在一些方面中，PCSK9基因是选自Pro174Ser PCSK0、SeR127Arg PCSK9、Phe216LeuPCSK9和Asp374Tyr PCSK9的等位基因变体。
本文公开的方法优选地用于治疗或预防由PCSK9的异常水平和/或活性引起的疾病。本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者中PCSK9的异常水平和/或活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)。
本公开还涉及本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)，所述药物组合物用作药物。
本公开进一步涉及治疗有效量的本公开药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)用于制造用于治疗异常PCSK9水平和/或PCSK9活性和/或PCSK9突变形式(例如、功能获得性突变体)、PCSK9的等位基因变体或PCSK9的剪接变体的表达的药物的用途。
本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的药物组合物(包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平和/或降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。在一些方面中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)。在一些方面中，血脂异常是家族性高脂血症(FCHL)或获得性高脂血症。在一些方面中，高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症或耐他汀类高胆固醇血症。在一些方面中，需要治疗的受试者或患者是患有或可能患有本文公开的疾病或疾患的受试者或患者。
在一些示例中，如本文所用的术语‘治疗’是指治疗现有疾病(例如本文公开的疾病或疾患)或预防疾病(即预防)两者。因此，在一些方面中，本文提及的治疗可为预防性的。
在一些方面中，使用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)的治疗可以治疗、改善或抑制本文公开的疾病的症状。在一些方面中，用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)治疗可以预防、延迟或改善与本文公开的疾病相关的后遗症。
例如，在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以治疗受试者的高胆固醇血症。在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以抑制处于风险下的受试者的高胆固醇血症的发展。在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以延迟处于风险下的受试者的高胆固醇血症的发作。在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、它们的衍生物、药学上可接受的水合物，溶剂化物或盐或它们的任意组合)的口服制剂)可以抑制处于风险下的受试者的高胆固醇血症的发展。在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以抑制或延迟受试者的高胆固醇血症症状的发作或发展，所述症状例如为活动性胸痛、黄瘤(通常在肌腱中以及肘部、臀部和膝盖上发现的脂肪沉积物)、睑黄瘤(眼睑周围的胆固醇沉积)、角膜弓(角膜周围的灰白色胆固醇沉积)等。在一些方面中，施用本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以抑制或延迟受试者的高胆固醇血症的后遗症或并发症的发作或发展，所述后遗症或并发症例如为心脏病、心血管疾病、心脏病发作、长期动脉粥样硬化、中风等。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症(例如，高胆固醇血症)的方法，所述方法包括施用有效量的口服制剂(例如，以丸剂或胶囊剂的形式)，所述口服制剂包含CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平并降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用有效量的口服制剂(例如，以丸剂或胶囊剂的形式)，所述口服制剂包含CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC)，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平并降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用有效量的口服制剂(例如，以丸剂或胶囊剂的形式)，所述口服制剂包含CIVI 008和SNAC，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平并降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用有效量的口服制剂(例如，以丸剂或胶囊剂的形式)，所述口服制剂包含CIVI 008和C10，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平并降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用有效量的口服制剂(例如，以丸剂或胶囊剂的形式)，所述口服制剂包含CIVI 008和5-CNAC，其中所述药物组合物的施用降低了所述受试者的血清PCSK9水平并降低了所述受试者的血清LDL胆固醇水平。
V.联合治疗
在一些方面中，本公开的药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)可以与另一种治疗剂一起用于联合治疗。在一些方面中，附加治疗剂可以作为相同药物组合物的一部分共施用，例如作为相同丸剂或胶囊剂的附加组分。在一些方面中，附加治疗剂可以分开共施用，即本公开的药物组合物作为例如丸剂或胶囊剂施用，并且附加组分例如在另一丸剂或胶囊剂中施用。
可以与本公开的药物组合物共施用的附加治疗剂包括例如HMG CoA还原酶的抑制剂，诸如例如广泛用于治疗代谢疾病的他汀类(参见WO2009/043354，该专利申请的关于联合治疗的全部内容以引用方式并入本文)。
可以与本公开的药物组合物共施用的治疗剂可以是其他降低胆固醇的化合物，诸如选自由以下组成的组的化合物：
(i)胆汁盐螯合树脂(例如，消胆胺、考来替泊和盐酸考来维仑)；
(ii)HMGCoA-还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀和氟伐他汀)；
(iii)烟酸；
(iv)纤维酸衍生物(例如，氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特、苯扎贝特和环丙贝特)；
(v)普罗布考；
(vi)新霉素；
(vii)右旋甲状腺素；
(viii)植物甾烷醇酯，
(ix)胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝)；
(x)英普他派；
(xi)胆汁酸转运蛋白(例如，顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白)的抑制剂；
(xii)肝CYP7a的调节剂；
(xiii)雌激素替代疗法(例如，它莫西芬)；
(xiv)抗炎药(例如，糖皮质激素)；以及
(xv)它们的任何组合。
在一个方面中，共同疗法包括用于口服递送的丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含本公开的口服药物组合物(例如，包含例如CIVI 008和口服递送剂(诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合)的口服制剂)和他汀类。在一个方面中，共同疗法包括用于口服递送的丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含(i)CIVI 008；(ii)口服递送剂，诸如SNAC、C10或5-CNAC、其衍生物、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐，或它们的任意组合；和(iii)他汀类。在一个方面中，共同疗法包括用于口服递送的丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含(i)CIVI 008；(ii)SNAC；和(iii)他汀类。在一个方面中，共同疗法包括用于口服递送的丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含(i)CIVI 008；(ii)C10；和(iii)他汀类。在一个方面中，共同疗法包括用于口服递送的丸剂或胶囊剂，所述丸剂或胶囊剂包含(i)CIVI 008；(ii)5-CNAC；和(iii)他汀类。
VI.控释制剂
在一些方面中，本公开的口服药物组合物包含用于促进通过胃和上肠的转运的组分，例如肠溶包衣、pH敏感材料和酶抑制剂。在一些方面中，本公开的口服药物组合物还可包含明胶，例如作为包衣或增粘剂。
肠溶(抗胃)包衣材料，例如聚合物，可以是将在高于胃的pH水平(例如大于4.5的pH)的肠液(诸如在小肠内)中溶解，并因此允许活性物质在小肠区域释放并且基本上不在胃肠道的上部部分中释放的材料。在一个方面中，肠溶材料在约4.5与约5.5之间的pH下的水溶液中开始溶解。在另一方面中，肠溶材料在pH为约5的水溶液中快速溶解。在另一方面中，肠溶材料在pH为约5.5的水溶液中快速溶解。
合适的肠溶(抗胃)材料包括但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮；非交联聚乙烯吡咯烷酮；邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、醋酸琥珀酸纤维素；醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋酸琥珀酸羟丙甲基纤维素、偏苯三酸醋酸纤维素酯；醋酸邻苯二甲酸淀粉；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯；羧甲基纤维素；邻苯二甲酸甲基纤维素；琥珀酸甲基纤维素酯；邻苯二甲酸酯琥珀酸甲基纤维素酯；甲基纤维素邻苯二甲酸半酯；琥珀酸乙基纤维素酯；羧甲基酰胺；甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物；聚乙烯醇；聚氧乙烯二醇；聚乙二醇；海藻酸钠；半乳甘露聚糖；聚羧乙烯；羧甲基淀粉钠；丙烯酸和/或甲基丙烯酸与选自以下的单体的共聚物：甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸苯酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸异丁酯或丙烯酸十八烷基酯，例如可从Evonik Industries获得的EUDRAGITTM-L和EUDRAGITTM-S系列，包括L 100-55、L 30D-55、L 100、S100、L 12.5和S12.5；聚醋酸乙烯酯；脂肪；油；蜡；脂肪醇；虫胶；玉米醇溶蛋白；麸质；丙烯酸乙酯-马来酸酐共聚物；马来酸酐-乙烯基甲基醚共聚物；苯乙烯-马来酸共聚物；2-乙基-己基-丙烯酸酯马来酸酐；巴豆酸-醋酸乙烯酯共聚物；谷氨酸/谷氨酸酯共聚物；羧甲基乙基纤维素单辛酸甘油酯；聚精氨酸；聚(乙烯)；聚(丙烯)；聚(环氧乙烷)；聚(对苯二甲酸乙二醇酯)；聚(乙烯基异丁基醚)；聚(氯乙烯)；和聚氨酯。
也可以使用肠溶材料的组合。在一些方面中，肠溶材料在pH 5.5或更高时快速溶解，以提供在上肠中的快速溶解。例如，肠溶材料可以选自甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，以及甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物。例如，肠溶聚合物是聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1(EUDRAGITTML 30D-55和EUDRAGITTML 100-55)。
肠溶衣的其他合适的示例包括蜂蜡和单硬脂酸甘油酯；蜂蜡、虫胶和纤维素；鲸蜡醇、乳香和虫胶；虫胶和硬脂酸；聚醋酸乙烯酯和乙基纤维素；聚甲基丙烯酸酯的中性共聚物(EUDRAGITTML 30D)；甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，或含有金属硬脂酸盐的聚甲基丙烯酸酯的中性共聚物。此类包衣包含脂肪和脂肪酸、虫胶和虫胶衍生物以及纤维素酸邻苯二甲酸酯的混合物，例如具有游离羧基所含物的那些。
如本领域已知的，可以将一种或多种增塑剂添加到肠溶聚合物中以增加其柔韧性并降低脆性。合适的增塑剂包括例如柠檬酸丁酯、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、癸二酸二丁酯、聚乙二醇(PEG，诸如PEG 6000)、柠檬酸乙酰基三乙酯和三醋精。在一个方面中，增塑剂是柠檬酸三乙酯。虽然一些肠溶材料是柔性的并且不需要增塑剂，但更脆的聚合物(例如，EUDRAGITTML/S类型、EUDRAGITTMRL/RS和EUDRAGITTMFS 30D)受益于增塑剂，例如基于干聚合物质量，在5重量％与30重量％之间、在约8重量％与约12重量％之间的范围的柠檬酸三乙酯与聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1。
在某些方面中，肠溶衣包含一种或多种抗粘剂(抗粘附剂)以降低膜的粘着性并防止凝聚，如本领域已知的。合适的抗粘剂包括但不限于滑石、单硬脂酸甘油酯、气相二氧化硅(例如，AEROSILTM200)、沉淀二氧化硅(例如，SIPERNATTMPQ)和硬脂酸镁。抗粘剂可以以任何合适的量使用，例如基于干聚合物质量，在约10重量％与100重量％之间、约10重量％与约50重量％之间、约10重量％与约30重量％之间、或约15重量％与约30重量％之间的范围内。例如，在一个方面中，基于干聚合物质量，在15重量％与约30重量％之间的范围内。
还可以将一种或多种表面活性剂添加到肠溶包衣混合物中以增加基质润湿性和/或稳定化悬浮液，如本领域已知的。表面活性剂包括聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇单油酸酯和十二烷基硫酸钠，以及本文所述的其他表面活性剂。
肠溶包衣可以通过任何合适的工艺形成。包衣工艺包括例如锅包衣、流化床包衣和干法包衣(例如热干法包衣和静电干法包衣)。使用溶剂的锅包衣和流化床包衣是完善的工艺。在液体包衣中，将肠溶材料和任选的赋形剂(例如颜料、增塑剂、抗粘剂)混合在有机溶剂或水中以形成溶液或分散体。将包衣溶液或分散体在锅包衣机或流化床干燥器中喷雾成固体剂型并通过热空气干燥。例如，在Wurster流化床包衣工艺中，将包衣流体从流化床设备的底部喷雾。或者，通过顶部喷雾来施加包衣流体。在某些方面中，应用切向喷雾。
所施加的肠溶材料的量足以实现所需的耐酸性和释放特性。例如，在一个方面中，肠溶包衣的量满足延迟释放剂型的USP<711>要求(USP 36-NF 31)，从而在0.1N HCl中2小时后不释放10.0重量％的药物。在某些方面中，例如使用USP 36-NF 31第<711>小节的溶解方法，制剂在pH 6.8缓冲溶液中在20分钟内释放至少80％的活性物质。
在一个方面中，肠溶包衣以如通过与未包衣的粒子芯相比的重量增加测量的在约10％与40％之间、或在25％与约35％之间的范围内，或基于未包衣的粒子芯的重量，重量增加在约25％与约31％之间的重量增加、在约27％与约31％之间的重量增加、或在约28.5％与约31％之间的量存在。
制剂可包括胶囊壳。软胶囊壳和硬胶囊壳是已知的。在一个方面中，胶囊壳是硬胶囊壳，例如明胶胶囊壳或基于植物的硬胶囊壳。在某些方面中，胶囊壳包含一种或多种本文所述的肠溶包衣。在加速存储期间，明胶胶囊可能会塌陷。因此，在某些方面中，所述制剂可包括羟丙基甲基纤维素胶囊壳。
可以配制本发明的固体剂型以防止或延缓在胃中的分解。适用于本发明的控释制剂可例如包括肠溶衣或可配制为从表面溶蚀。
根据一个方面，所述固体口服剂型包含治疗有效量的本公开口服药物组合物，其中所述固体口服剂型在口服施用时具有约250秒至约650秒的崩解时间。在另一方面中，当口服施用时，崩解时间为约350秒至约550秒。在一个方面中，当口服施用时，崩解时间大于60秒。在另一方面中，当口服施用时，崩解时间大于400秒。可使用USP<701>中描述的方法在37±2℃的水中测定崩解时间。
本公开的固体剂型(例如，片剂或胶囊剂)可以被肠溶包衣覆盖。肠溶包衣可用作对延迟固体剂型中药物组合物或组合物释放的主要控制。肠溶包衣在胃中保持完整，并防止或延缓固体剂型中的活性剂释放到胃中。活性剂的释放被延迟，直到固体剂型到达肠道。一旦进入肠道，较高的pH就会导致活性剂的释放。肠溶衣包括但不限于羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯)、和聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯)。可根据本发明使用的其他肠溶包衣描述于美国专利号5,851,579中，该美国专利据此以引用方式并入。
在本公开的一个方面中，将肠溶衣施加至整个片剂或其他剂型。在一个方面中，将肠溶衣施加至多微粒系统，诸如包含微米粒子和/或纳米粒子的系统。
本公开的固体剂型可配制为从片剂(或其他剂量形式)的表面或在多微粒系统(例如包含微米粒子的系统)的表面处溶蚀。这些表面溶蚀制剂缓慢地从表面溶解而不是崩解。通过控制表面溶蚀速率，可以延迟固体剂型的活性剂和药物组合物的释放。表面溶蚀制剂可以配制为使得活性剂或药物组合物在固体口服剂型到达肠之前不会发生大量释放。
在一些方面中，本公开的固体剂型还可以包含保护剂，如核酸酶抑制剂。在一些方面中，核酸酶抑制剂包括金精三羧酸。在一些方面中，核酸酶抑制剂包括广泛特异性核酸酶抑制剂，诸如RNAsin。在一些方面中，核酸酶抑制剂包括GS-6620、IDX184、PSI-7777、PSI-938、RG7128、TMC649128或ABT-072。
在一些方面中，本公开的固体剂型还可包含防止或减少GalNAc缀合物部分降解的保护剂。在一些方面中，保护剂防止或减少从寡聚物切割GalNAc缀合物部分。在一些方面中，保护剂防止或减少GalNAc部分中的一个或多个N-乙酰半乳糖胺单元的切割或降解。
在一些方面中，本公开的固体剂型还可包含抗酸化合物。术语“抗酸化合物”是指能够中和胃酸(例如，水溶液中的HCl)的任何药学上可接受的化合物，优选地其中一摩尔的抗酸化合物能够中和至少0.5摩尔的HCl，更优选地能够中和至少1摩尔的HCl。在本发明的一些实施方案中，尽管本文描述的治疗活性剂(例如，单独的CIVI 008或其与第二药剂诸如他汀类的组合)、口服递送剂(例如，SNAC或5-CNAC)和蛋白酶抑制剂可能表现出一定的中和胃酸的能力，但是它们被排除在短语“抗酸剂”的范围之外。
可用于本文所述的与一种或多种抗酸化合物相关的方面中的任一方面的抗酸化合物的示例(根据本文所述的公开内容的方面中的任一方面)包括但不限于碳酸钙、葡糖酸钙、柠檬酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、葡糖酸钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、葡糖酸钾、柠檬酸钾、氢氧化钾、碳酸镁、葡糖酸镁、柠檬酸镁、氢氧化镁、氧化镁、碳酸铝、葡糖酸铝、柠檬酸铝和氢氧化铝。
在一些方面中，本公开的固体剂型还可包含胃酸分泌抑制剂。术语“胃酸分泌抑制剂”是指减少酸到胃中的分泌的任何药剂，但是其不一定对已经分泌的酸有任何效应。可用于本文所述的与抗酸组合物有关的方面中的任何方面的胃酸分泌抑制剂的示例包括但不限于：H2受体拮抗剂，诸如西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和雷尼替丁；和质子泵抑制剂，诸如奥美拉唑、兰索拉唑、右兰索拉唑、艾美拉唑、雷贝拉唑和艾普拉唑。
本公开的固体剂型还可包含酶抑制剂。结合到固体剂量单位形式中的酶抑制剂可以防止可能对酶促降解敏感的寡聚物或其他活性剂的分解。酶抑制剂描述于美国专利号6,458,383中，该美国专利据此以引用方式并入。酶抑制剂的选择和水平基于毒性和抑制效力，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。不希望受理论的束缚，据信抑制剂可以单独或组合用作：竞争性抑制剂，通过在酶的底物结合位点处结合，从而阻止接近底物；非竞争性抑制剂，所述非竞争性抑制剂可以同时与酶位点和底物结合，因为它们的结合位点是不同的；和/或络合剂，此是由于酶结构中必需的金属离子被剥夺而导致的酶促活性的损失。
在一些方面中，包含在本文所述的组合物(包括组合物单位剂型)中的任何组合物中的蛋白酶抑制剂包括至少一种胰蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种胰蛋白酶抑制剂组成。
可以利用的胰蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于利马豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂，以及它们的任意组合。在一些方面中，胰蛋白酶抑制剂包括大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)。在一些方面中，胰蛋白酶抑制剂(任选地至少一种蛋白酶抑制剂)基本上由SBTI组成。
在一些方面中，所述蛋白酶抑制剂包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂组成。可用于本文所述的方面中的任一方面的丝氨酸蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于α1-抗胰蛋白酶、抗胰蛋白酶相关蛋白、α1-抗糜蛋白酶、人组织激肽释放酶结合蛋白、蛋白C抑制剂、结合皮质醇的球蛋白、结合甲状腺素的球蛋白、血管紧张素原、中心体蛋白、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)、单核细胞/嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-2、鳞状细胞癌抗原-1(SCCA-1)、鳞状细胞癌抗原-2(SCCA-2)、乳腺丝抑蛋白、蛋白酶抑制剂6(PI-6)、megsin、丝氨酸蛋白酶抑制剂B8(PI-8)、丝氨酸蛋白酶抑制剂B9(PI-9)、bomapin、yukopin、hurpin/headpin、抗凝血酶、肝素辅因子II、纤溶酶原激活物抑制剂1、胶质细胞源性连接蛋白、色素上皮衍生因子、α2-抗纤溶酶、补体1-抑制剂、47kDa热休克蛋白(HSP47)、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胰蛋白(pancpin)。
在一些方面中，蛋白酶抑制剂包含至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂组成。可用于本文所述的方面中的任一方面的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于：1型半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)、2型胱抑素、人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、D、S、SN和SA、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M、半胱氨酸蛋白酶抑制剂F和3型半胱氨酸蛋白酶抑制剂(包括激肽原)。
在一些方面中，蛋白酶抑制剂包含至少一种苏氨酸蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种苏氨酸蛋白酶抑制剂组成。可用于本文所述的方面中的任一方面的苏氨酸蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于硼替佐米、MLN-519、ER-807446和TMC-95A。
在一些方面中，蛋白酶抑制剂包含至少一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂组成。可用于本文所述的方面中的任一方面的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于α2-巨球蛋白、胃酶抑素A、天冬氨酸蛋白酶抑制剂11、天冬氨酸蛋白酶抑制剂1、天冬氨酸蛋白酶抑制剂2、天冬氨酸蛋白酶抑制剂3、天冬氨酸蛋白酶抑制剂4、天冬氨酸蛋白酶抑制剂5、天冬氨酸蛋白酶抑制剂6、天冬氨酸蛋白酶抑制剂7、天冬氨酸蛋白酶抑制剂8、天冬氨酸蛋白酶抑制剂9、胃蛋白酶抑制剂Dit33和蛋白酶A抑制剂3。
在一些方面中，蛋白酶抑制剂包含至少一种金属蛋白酶抑制剂。在一些方面中，蛋白酶抑制剂基本上由一种或多种金属蛋白酶抑制剂组成。可用于本文所述的方面中的任一方面的金属蛋白酶抑制剂的示例包括但不限于血管紧张素-1-转换酶抑制肽、抗出血因子BJ46a、β-酪蛋白、蛋白酶抑制剂CeKI、毒液金属蛋白酶抑制剂DM43、羧肽酶A抑制剂、smpl、IMPI、碱性蛋白酶、胶乳素、羧肽酶抑制剂、抗出血因子HSF、睾丸蛋白聚糖-3、SPOCK3、TIMP1、金属蛋白酶抑制剂1、金属蛋白酶抑制剂2、TIMP2、金属蛋白酶抑制剂3、TIMP3、金属蛋白酶抑制剂4、TIMP4、推定金属蛋白酶抑制剂tag-225、金属蛋白酶组织抑制剂、WAP、kazal抑制剂、免疫球蛋白以及kunitz和含有NTR结构域的蛋白1。
可用于本文所述的方面中的任一方面的蛋白酶抑制剂的示例还包括但不限于AEBSF-HCl、ε-氨基己酸、α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗痛素、抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶、APMSF(4-脒苯基-甲磺酰氟)、sprotinin、苯甲脒、胰凝乳蛋白酶抑制剂、DFP(二异丙基氟磷酸酯)、亮抑酶肽、4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟盐酸盐、PMSF(苯甲基磺酰氟)、TLCK(1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-2-庚酮)、TPCK(1-氯-3-甲苯磺酰氨基-4-苯基-2-丁酮)、异硫代羟酸五脒(pentamidine isothionate)、胃酶抑素、胍鎓、α2-巨球蛋白、锌螯合剂、和碘乙酸盐。
在某些方面中，片剂或胶囊剂可包被有pH敏感包衣，因此其不会在胃的低pH下溶解。例如，pH敏感材料在剂型从胃中排空之前不会显著溶解。小肠的pH逐渐从十二指肠球部的约4.5至约6.5增加到小肠远端部分(回肠)的约7.2。为了提供与约3小时(例如，2-3小时)的小肠转运时间对应的可预测的溶解并允许在小肠中可再现的释放，包衣应在十二指肠的pH范围内开始溶解，并在小肠内的pH范围下继续溶解。因此，肠溶包衣的量(厚度)应足以在小肠(例如，近端和中段小肠)内在约三小时的转运时间内显著溶解。
在一些方面中，本发明的药物剂型通过pH敏感包衣的特定设计在受试者(例如，人类受试者)的空肠中(例如，在末端空肠中)中释放其活性化合物。通过肠溶包衣的特定选择，所述包衣在空肠中显著降解和/或溶解，所述肠溶包衣优选地选自在约5.5至约7.5，优选地约7.2至约7.3的pH值下显著降解和/或溶解的pH敏感聚合物。这种pH敏感性聚合物优选地选自羟丙基甲基纤维素(下文也称为“羟丙甲纤维素”)和甲基丙烯酸与甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子共聚物。在一些方面中，包含羟丙基甲基纤维素或由羟丙基甲基纤维素制成的pH敏感性肠溶包衣是醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素酯。这种类型的市售产品是例如(Shin-Etsu Chemical Co.,Chiyoda,Japan)。在甲基丙烯酸和甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子共聚物类型的其他方面，也可以使用各种形式的聚合物。可从Evonik Healthcare&Nutrition GmbH,Essen,Germany商购获得。在一些方面中，FS30D用作包衣或其至少一部分的pH敏感聚合物。
在本公开的另外方面中，可以组合应用不同的包衣。根据一个方面，所述包衣包含或由以下制成：羟丙基甲基纤维素与甲基丙烯酸和甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子共聚物的组合。在一些方面中，施加包衣的组合，使得通常将一种pH敏感聚合物的底包衣施加作为第一层，并将第二pH敏感聚合物的包衣施加至该底包衣上作为第二层。例如，pH敏感包衣可包含：包含羟丙基甲基纤维素的底包衣，所述底包衣作为第一层；以及包含甲基丙烯酸与甲甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子共聚物或由其制成的第二包衣，所述包衣作为第二层提供在底包衣上。在另外的方面中，本发明的药物口服剂型的包衣包括这样的包衣，所述包衣包括包含甲基丙烯酸和甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子聚合物(诸如例如FS30D)或由其制成的第一层(底包衣)；以及包含羟丙基甲基纤维素(诸如更优选地)或由其制成的第二层。更优选地，甲基丙烯酸与甲基丙烯酰甲基丙烯酸酯的阴离子共聚物(例如，诸如FS30D)以比羟丙基甲基纤维素(诸如例如，)更低的量存在。换句话说，这种类型的组合的第一层的厚度低于这种组合的第二层的厚度。更具体地，第一层与第二层之间的量或厚度的比率分别通常在约1:10至约1:50，例如约1:20至约1:30的范围。
在一个方面中，本公开提供了如上所述的特定药物剂型，所述特定药物剂型的尺寸较小，优选地最大尺寸小于3mm，更优选地最大尺寸为约0.6mm至约1.7mm。这种小剂型可以方便地采用颗粒剂或丸剂的形式。本发明的小剂型具有以下益处：在受试者胃中表现得像流体，从而导致本发明的药物口服剂型快速且持续地进入肠道，并因此更均匀地将其输送至受试者空肠、优选受试者的末端(即远端部分)空肠中所靶向的突释区域。
在本公开的其他方面中，也可能方便的是药物口服剂型具有较大的大小，即其中剂型的最大尺寸为约3mm或更大的形式，大小的上限由技术人员方便地选择，使得所述剂型可以被受试者很好地吞咽。本发明的药物口服剂型的典型范围是具有约3mm至约10mm的最大尺寸的剂型。应当理解的是，这种范围包括所有整数mm，即3、4、5、6、7、8、9和10mm及其任何子比例。
明胶是纯化的蛋白质级分的混合物，所述纯化的蛋白质级分可通过酸或碱对动物胶原蛋白的部分水解获得。酸水解过程被称为A型并且碱水解过程被称为B型。明胶是一种由氨基酸构成的直链聚合物，这可导致分子量范围为15,000至250,000。如本文所用，术语明胶包括动物胶原蛋白的酸性和碱性水解产物。
明胶可应用于本发明的制剂中以起到许多功能，诸如包衣、悬浮剂、片剂粘合剂和/或作为增粘剂。在水中，明胶会膨胀和软化，并且其可以吸收自身重量5-10倍的水。在某些方面中，可以应用几种亲水性天然和合成聚合物来代替明胶。例如，(a)阴离子聚合物，诸如海藻酸、硫酸葡聚糖或果胶；(b)阳离子酸，诸如壳聚糖或聚赖氨酸；(c)两亲聚合物，诸如羧甲基几丁质或纤维蛋白；或(d)中性聚合物，诸如葡聚糖、琼脂糖或支链淀粉。
如本文所用，术语明胶包括在Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1980),第1245页和第1576-1582页中公开的明胶和明胶替代品，该文献据此通过引用方式以全文并入本文。术语明胶还包括在美国专利号6,090,915、美国专利号4,043,996、美国专利号4,064,008、美国专利号4,176,117、美国专利号4,889,920、美国专利号4,374,063、美国专利号5,210,182、美国专利号4,232,425、美国专利号4,402,873、美国专利号4,427,583、美国专利号5,093,474、美国专利号5,288,408和美国专利号5,459,241中公开的组合物，上述每一项美国专利均据此通过引用方式以全文并入本文。
如本文所用的术语明胶还包括明胶代用品和替代品。通常，这种明胶替代品可以由具有均匀的组成并具有明胶的所有基本特性的易获得的(例如植物)材料制成。在软凝胶膜和胶囊剂的制造中，软凝胶组合物优选地具有以下性质：良好的湿膜和干膜强度；不溶于冷水、油和醇；可溶于热水；温度和压力密封性；膜透明度；膜柔韧性；可食性；对药物或其他待封装材料的惰性；以及从热液体中快速凝固以形成凝胶。
一种明胶替代品是成膜组合物，所述成膜组合物包含选自改性淀粉和蜡质淀粉的淀粉材料；胶剂；和增塑剂，如在美国专利6,375,981中所公开，该美国专利据此以引用方式并入本文。改性淀粉或蜡质淀粉优选地具有小于约1的右旋糖当量(DE)，更优选地没有可测量的DE。这种组合物可以但不要求是100％不含明胶的。因此，所述组合物可用作明胶替代品，或用作明胶制剂中的增量剂。
另一种明胶替代品是如在美国专利号6,440,480中所公开的小麦纤维凝胶，该美国专利据此以引用方式并入本文。小麦纤维凝胶是通过对小麦纤维进行热/物理处理而制成的。使用特殊的研磨技术来处理小麦材料，从而产生含有大比例的微细粒子的产物。通过将该产物与麦芽糖糊精混合获得了具体的改进。如此获得的产品由宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,Pa)的FMC Biopolymer以商品名销售。此产物为干粉，其易分散于水中。在搅拌分散体时，凝胶通过剪切力形成。据报导，小麦纤维凝胶可用作酸奶或冰淇淋中的明胶替代品。(I.I.Bollinger,Food Marketing&Techn.1995年10月，4-6)。
角叉菜胶是另一种明胶替代品。角叉菜胶是一种天然亲水胶体，一种多糖亲水胶体，其来源于海藻。角叉菜胶包含重复糖单元的碳水化合物聚合物，其是直链的，没有大量的分支或取代。
实施例
在EXPEDITETM8900/MOSS合成仪(多重寡核苷酸合成系统)或OLIGOMAKERTM48上使用亚磷酰胺方法分别以4μmol或1μmol规模在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。在合成结束时，在60℃使用氨水从固体载体上切割寡核苷酸达5-16小时。将寡核苷酸通过反相HPLC(RP-HPLC)或固相萃取进行纯化，并通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。有关更多详细信息，请参见下文。
寡核苷酸的伸长率：β-氰乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-SS-C6接头的偶联通过使用0.1M的5'-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中和DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液作为活化剂执行的。对于最后一个循环，使用市售C6连接的胆固醇亚磷酰胺在DCM中的0.1M溶液。使用氢化黄原素(在9:1的乙腈/吡啶中的0.01M)进行硫醇化以引入硫代磷酸酯键。使用在7:2:1的THF/吡啶/水中的0.02M碘引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。对于固相合成后的缀合，在固相合成的最后一个循环中使用市售的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护和从固体载体切割后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法经由官能团的活化引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化：通过制备型RP-HPLC在PHENOMENEXTM C18 10μ150×10mm柱上纯化粗化合物。使用0.1M醋酸铵pH 8和乙腈作为流率为5mL/min的缓冲液。将收集的级分冻干以得到通常呈白色固体的纯化化合物。
缩写：DCI(4,5-二氰基咪唑)、DCM(二氯甲烷)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基)、THF(四氢呋喃)、Bz(苯甲酰基)、Ibu(异丁酰基)、RP-HPLC(反相高效液相色谱)。
合成的化合物在本公开的附图和表格中示出。
实施例1
新PCSK9靶标基序探索
设计并合成了特异于人类和灵长类动物PCSK9的521种抗PCSK9反义寡核苷酸，其全部具有侧接有10个DNA的三个锁核酸，即具有16聚体LNA缺口聚体设计。将人细胞系15PC3与浓度为0.3μM的靶向人PCSK9的模拟(mock)或经锁核酸修饰的寡核苷酸一起孵育三天。在三个独立实验中测试每种抗PCSK9寡核苷酸。如所述使用实时PCR从所提取的RNA中定量PCSK9 mRNA水平，并针对β-肌动蛋白mRNA且相对于图8中的12个经模拟处理的样品中的平均水平进行归一化呈现，图9中是最有效的分子的子集的特写。
实施例2
体外mRNA敲低
将人细胞系15PC3与浓度分别为0.0012μM、0.06μM、0.3μM和1.5μM的靶向人PCSK9的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的模拟或经锁核酸修饰的寡核苷酸一起孵育3天。如所述使用实时PCR从所提取的RNA中定量PCSK9mRNA水平，并相对于图10中四个经模拟处理的样品中的平均水平进行呈现。对于每种寡核苷酸，量化为半最大有效浓度(EC50)的效力是通过下限固定为0％并且上限固定为100％的双参数逻辑斯蒂形式中Hill方程的最小二乘拟合确定的，如EC50＝估算值±标准偏差。
实施例3
体内丙氨酸氨基转移酶ALT水平
向到达时称量为约20g的四周龄的雌性NMRI小鼠(Taconic,Denmark)静脉内注射剂量为7.5mg/kg和15mg/kg的盐水或经锁核酸修饰的、胆固醇缀合的、靶向人PCSK9的具有SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:16的寡核苷酸一次。在施用后7天处死小鼠，并使用酶促测定(Horiba ABX Diagnostics)来测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平。对于具有五只小鼠的各个治疗组，计算平均值和标准偏差并在图11中相对于经盐水处理的小鼠的平均水平来呈现。对于一些(但不是全部)胆固醇缀合的分子，在两种浓度下都观察到了ALT升高。这些化合物中的一些化合物，诸如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，即使在将胆固醇用作缀合物以增强肝脏中化合物的摄取时，也不会以临床上有意义的方式增强小鼠的ALT。
实施例4
非人类灵长类动物研究
本研究的主要目的是在向食蟹猴单次缓慢推注抗PCSK9 LNA化合物后7周内调查选定的脂质标记物，并评定化合物在所述猴中的潜在毒性。本研究中使用的化合物为在无菌盐水(0.9％)中以0.625mg/ml和2.5mg/ml的初始浓度制备的SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
使用至少24月龄的雄性猴子，使其自由采食自来水，并每天向每只动物分配180g的MWM(E)SQC SHORT膨化日粮(Dietex France,SDS,Saint Gratien,France)。每个笼内分配的食物的总量根据当天笼内动物的数量计算。此外，每天向每只动物给予水果或蔬菜。在处理时段开始前，使动物适应研究条件达至少14天的时段。在此时段期间，执行处理前调查。分别向所述动物静脉内(静脉注射(i.v.))投配0.25mg/kg、1.0mg/kg或2.5mg/kg的单剂量的SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18和、SEQ ID NO:21，或1.0mg/kg或2.5mg/kg的单剂量的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。剂量体积为0.4mL/kg。每组使用两(2)只动物。
该剂量制剂在第1天施用一次。在处理后观察动物达7周的时段，并于第51天从研究中释放所述动物。第1天对应于处理时段的第一天。在研究之前和期间记录临床观察结果和体重和食物摄入(每组)。
在以下时间点采血并执行分析：
RCP意指常规临床病理学，LSB意指肝脏安全性生物化学，PK意指药代动力学，OA意指其他分析，并且L意指脂质。在指定的场合针对所有存活动物测定的参数是：第-8天、第15天和第50天的完整生化组(下面的完整列表)；第4天、第8天、第22天和第36天的肝脏安全性(仅ASAT、ALP、ALAT、TBIL和GGT)；以及在第-1天、第4天、第8天、第22天、第29天、第36天和第43天的血脂谱(总胆固醇、HDL-C、LDL-C和甘油三酯)和仅Apo-B。将血液(约1.0mL)取入肝素锂管(使用ADVIA 1650血液生化分析仪)：Apo-B、钠、钾、氯、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
血液中PCSK9的分析：在第-8天、第-1天、第4天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天和第50天收集用于PCSK9分析的血液样品。从每只动物的适当静脉收集静脉血(约2mL)到血清分离管(SST)中，并使其在室温下凝结至少60±30分钟。将血液在冷藏条件下(设定为维持+4℃)以1000g离心10分钟。将血清转移到3个单独的试管中并存储在-80℃，直到在CitoxLAB France处使用ELISA方法(Circulex Human PCSK9 ELISA试剂盒，CY-8079，针对来自食蟹猴的样品进行验证)进行分析。
其他分析：WO2011009697提供了用于qPCR和PCSK9 mRNA分析的方法。其他分析包括PCSK9蛋白ELISA、使用ELISA进行的血清Lp(a)分析(Mercodia号10-1106-01)、组织和血浆寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取(标准样品和QC样品)、以及通过ELISA进行寡核苷酸含量测定。
在施用SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的化合物后观察到的与投配前值相比的PCSK9表达值如下表所示：
没有迹象表明靶向PCSK9的化合物具有肝毒性或肾毒性。需注意的是，PCSK9-GalNAc化合物对PCSK9进行了快速且高效的下调，此下调在广泛的时间段(整个研究时长)中被维持，说明GalNAc缀合物化合物在快速初始敲低和长持续时间方面均更有效，表明与未缀合的母体化合物和使用替代缀合技术(诸如胆固醇缀合)的化合物相比，它们可以相对较不频繁地以较低剂量投配。然而，当施用未缀合的寡聚物时也观察到了敲低。尽管如此，两种类型的化合物可具有不同的治疗用途。例如，当需要瞬时效应或者例如作为负荷剂量(loiding dose)的一部分时，可以使用未缀合的化合物。相比之下，当需要长期效应时，可以施用缀合寡聚物。
SEQ ID NO:18整个研究持续时段期间给出了对PCSK9和LDL-C的快速且持续的下调(在2.5mg/kg剂量下在第34天观察到，其中在施用单2.5mg/kg剂量后48天观察到了显著的PCSK9下调，其中血浆PCSK9蛋白水平为投配前的71％)。
实施例5
大鼠中的肝和肾毒性评定
评估了本公开的化合物在啮齿动物中的毒性谱。Wistar Han Crl:WI(Han)在约8周龄时使用。在这个年龄，雄性称重为约250g。所有动物都可自由采食SSNIFF R/MH丸粒化维持日粮(SSNIFFGmbH,Soest,Germany)和容纳在瓶子中的自来水(用0.22μm过滤器过滤的)。使用10mg/kg/剂量和40mg/kg/剂量的剂量水平(皮下施用)并在第1天和第8天投配。将动物在第15天安乐死。在第7天和第14天收集尿液和血液样品。在第14天进行临床病理学评定。在研究前、施用第一天和尸检前1周测定体重。每天评定每组的食物消耗。在禁食6小时后经由尾静脉采集血液样品。执行了以下血清分析：红细胞计数、平均细胞体积、血细胞压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、具有细胞形态的白细胞分类计数、网织红细胞计数、钠、钾、氯、钙、无机磷、葡萄糖、尿素、肌酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
还执行了尿分析。测量了以下参数：α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、丛集素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF和NGAL表达。对第1组(MAP大鼠肾毒性磁性珠粒第1组，RKTX1MAG-37K)的七种分析物(钙结合蛋白、丛集素、GST-α、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1和VEGF)进行定量。对第2组(MAP大鼠肾毒性磁性珠粒第2组，RKTX2MAG-37K)的三种分析物(β-2微球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、脂质运载蛋白-2/NGAL)进行定量。用于测定大鼠尿液中这些生物标志物的浓度的测定基于Luminex技术。将包被有抗α-GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/丛集素/半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体的微球体用两种不同的荧光染料进行颜色编码。还使用ADVIA 1650测定尿液中的尿蛋白和尿肌酸酐。还确定了定量参数，即体积、pH(使用10-Multistix SG试纸/Clinitek 500尿液分析仪)、比重(使用折光仪)。半定量参数(使用10-Multistix SG试纸/Clinitek 500尿液分析仪)：蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、尿胆素原、沉积物细胞学(通过显微镜检查)。还确定了定性参数，诸如外观和颜色。
在处死后，测定体重以及肾、肝、脾重量并计算器官与体重的比率。采集肾脏和肝脏样品并冷冻或存储在福尔马林中。执行显微分析。
KIM-1(肾组织损伤生物标志物)表达数据在图15中示出。数据显示，除了SEQ IDNO：4之外的所有分子均具有比SEQ ID NO：1(SPC5001)更低的尿kIM-1信号，表明与原始的先前表征的未缀合分子相比，肾安全性得到改善。在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的未缀合寡聚物以及它们对应的GalNAc缀合形式SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19中均观察到不存在肾毒性，表明不存在肾毒性不是由于GalNAc的存在。因此，数据显示使SEQ ID NO：1(SPC5001)的长度增加两个核碱基意外地消除了肾毒性。事实上，本领域的普通技术人员会预期相反的效应，因为添加两个额外碱基增加了寡聚物与靶位点之间的相互作用的强度。
实施例6
可切割接头的分析
使具有不同DNA/PO接头的FAM(荧光素亚酰胺)标记的反义寡聚物(ASO)在S1核酸酶提取物(下表)、肝脏或肾脏匀浆或血清中经受体外切割。
# Seq(5′-3′) 可切割接头(B) 缀合物(C)
35 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5′tca3′) FAM
36 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5′ca3′) FAM
37 GCattggtatTCA 1PO-DNA(5′a3′) FAM
38 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5′gac3′) FAM
39 GCattggtatTCA no FAM
大写字母为LNA核苷(如β-D-氧基LNA)，小写字母为DNA核苷。下标s代表硫代磷酸酯核苷间键。LNA胞嘧啶任选地是5-甲基胞嘧啶。FAM缀合物部分在图6中示出并且缀合的分子在图7中示出。
使100μM的具有不同DNA/PO接头的FAM标记的ASO在核酸酶缓冲液(60U pr.100μL)中经受S1核酸酶体外切割20分钟和120分钟(A)。通过向缓冲溶液中添加EDTA来终止酶促活性。然后使用Dionex DNApac p-100柱和在10mM-1M的pH 7.5高氯酸钠范围的梯度，在Dionex Ultimate 3000上对溶液进行AIE HPLC分析。使用615nm下的荧光检测器和260nm下紫外光检测器两者对照标准品测定切割和未切割的寡核苷酸的含量。
SEQ ID NO 接头序列 在20min s1后被切割的％ 在120min S1后被切割的％
39 - 2 5
37 a 29.1 100
36 ca 40.8 100
35 tca 74.2 100
38 gac 22.9 未检测到(n.d)
PO接头(或如本文所提及的区域B)导致缀合物部分(或基团C)的切割。接头的长度和/或序列组成均可用于调节区域B对溶核切割的易感性。DNA/PO-接头的序列的选择能够调节切割率，如在区域B的核酸酶S1提取物序列选择中在20min后所看到的(例如，对于DNA/PO-接头)。因此，DNA/PO-接头的特定序列的选择也可用于调节血清和靶组织细胞中的切割水平。
将SEQ ID NO：35的寡聚物掺入肝脏和肾脏匀浆和血清中至200μg/g组织的浓度。将从NMRI小鼠收集的肝脏和肾脏样品在匀浆化缓冲液(0.5％Igepal CA-630、25mM TrispH 8.0、100mM NaCl，pH 8.0，用1N NaOH调整)中匀浆化。将匀浆在37℃下孵育24小时，然后将匀浆用苯酚-氯仿提取。使用上文公开的HPLC方法对照标准品测定来自肝脏和肾脏以及血清的提取物中切割和未切割的寡聚物缀合物的含量。
PO接头(或如本文中所提及的区域B)的存在导致缀合物部分(或基团C)在肝或肾匀浆中被切割掉，但在血清中则不被切割掉。实施例6所示的测定中对切割的易感性可用于确定接头是生物可切割的还是生理学上不稳定的。上述测定中的切割是指对单独的可切割接头的切割；即，寡聚物或区域A应保持功能完整(即，其不应经历降解)。
实施例7
用胆固醇缀合物在体内敲低PCSK9 mRNA
向NMRI小鼠注射单剂量盐水或10mg/kg未缀合的LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO：40)或等摩尔量的用不同接头缀合至胆固醇的LNA反义寡核苷酸，并根据情况将所述小鼠在第1-10天处死。
# Seq(5′-3′)(A) 可切割接头(B) 缀合物(C)
40 GTctgtggaaGCG 无 无
41 GTctgtggaaGCG 无 胆固醇
42 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5′ca3′) 胆固醇
43 GTctgtggaaGCG 2PO-DNA(5′ct3′) 胆固醇
从肝脏和肾脏中分离出RNA，并使用PCSK9特异性引物和探针进行qPCR以分析PCSK9 mRNA敲低。结果在图14中示出。
与未缀合的化合物(SEQ ID NO：40)相比，以及与具有稳定接头的胆固醇缀合物(SEQ ID NO：41)相比，用由2个具有磷酸二酯主链的DNA(SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43)构成的接头缀合至PCSK9 LNA反义寡核苷酸的胆固醇显示出增强的肝脏PCSK9敲低(图14)。
材料和方法：
实验设计：
剂量施用：根据上表，向到达时为约20g的NMRI雌性动物静脉注射投配10ml/kg BW(根据第0天的体重)的在盐水中配制的本公开化合物或仅盐水。
肝脏和肾脏组织的取样：将动物用70％CO2-30％O2麻醉并通过颈椎脱臼处死。将大肝叶的一半和一个肾脏切碎并浸没在RNAlater中。
根据制造商的使用说明，使用MagNa Pure 96细胞RNA大体积试剂盒(Roche产品目录号5467535001)，在MagNA Pure LC RNA分离组织缓冲液(Roche产品目录号03 604 721001)的存在下，从最大10mg的通过珠磨匀浆化的组织中提取总RNA。
根据制造商的使用说明，使用来自Ambion的逆转录酶试剂执行第一链合成。
对于每个样品，用不含RNA酶的H2O将0.5μg总RNA调整至(10.8μl)，与2μl随机十聚体(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM的各dNTP)混合，并加热至70℃，持续3分钟，在此之后将样品在冰上快速冷却。
向每个样品中添加2μl 10x Buffer RT、1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μlRNA酶抑制剂(10U/μl)，然后在42℃下孵育60分钟，在95℃下将酶热灭活10分钟，然后将样品冷却至4℃。将cDNA样品按1:5稀释并使用Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x(Applied Biosystems产品目录号4364103)和Taqman基因表达测定(mPCSK9、Mn00463738_m1和mActin#4352341E)按照制造商的方案进行RT-QPCR，并在Applied Biosystems RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式处理。
实施例8
非人灵长类动物研究；多次皮下(s.c.)注射
这种非人灵长类动物研究的目的是评定当通过皮下注射(s.c.)施用本文公开的抗PCSK9化合物时，所述化合物在重复施用环境中的功效和安全性。本研究中使用的化合物为在无菌盐水(0.9％)中以0.625mg/ml和2.5mg/ml的初始浓度制备的SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
使用至少24月龄的雌性食蟹猴，使其自由采食自来水，并每天向每只动物分配180g的OWM(E)SQC SHORT膨化日粮(Dietex France,SDS,Saint Gratien,France)。此外，每天向每只动物给予水果或蔬菜。在处理时段开始前，使动物适应研究条件持续至少14天的时段。在此时段期间，执行处理前调查。
以0.5mg/kg(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)或1.5mg/kg/注射(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)的剂量每周一次皮下向动物投配，持续四周，其中在四周的时段内总共进行四次注射。剂量体积为0.4mL/kg/注射。每组使用六只动物。在第四次和最后一次投配后，观察动物一周，在此之后处死一半动物以研究肝脏Apo-B转录调节、脂质参数、肝脏和肾脏组织学以及肝脏和肾脏组织分布。第1天对应于处理时段的第一天。在研究之前和期间记录临床观察结果和体重和食物摄入(每组)。
在下表所示的时间点对血液和组织进行取样和分析。
RCP意指常规临床病理学，LSB意指肝脏安全性生物化学，PK意指药代动力学，OA意指其他分析，并且L意指脂质。将血液(约1.0mL)取入肝素锂管，并使用ADVIA1650血液生化分析仪分析钠、钾、氯、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
血液的分析：在第-8天、第-1天、第4天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天和第50天从仅第1组至第16组动物(即，用抗Apo-B化合物处理的动物)收集用于Apo-B分析的血液样品。从每只动物的适当静脉收集静脉血(约2mL)到血清分离管(SST)中，并使其在室温下凝结至少60±30分钟。将血液在冷藏条件下(设定为维持+4℃)以1000g离心10分钟。将血清转移到3个单独的试管中并存储在-80℃，直到通过ELISA分析Apo-B蛋白。
其他分析：WO2010142805提供了用于qPCR和ApoB mRNA分析的方法。其他分析包括使用ELISA进行的血清Lp(a)分析(Mercodia号10-1106-01)、组织和血清寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取(标准样品和QC样品)、以及通过ELISA进行寡核苷酸含量测定。
抗PCSK9寡核苷酸的预期药理学是通过减少循环中的PCSK9蛋白(“血清PCSK9”)来降低LDL胆固醇。虽然未缀合形式和缀合形式均显示出药理学效应，但是在研究血清PCSK9和LDL胆固醇两者时，与未缀合分子相比，GalNAc缀合分子表现出增强的功效(图16和图17)。
图16示出了每周四次注射0.5mg/kg/注射的未缀合的SEQ ID NO:2对血清PCSK9和LDL胆固醇具有瞬时效应，而相同LNA缺口聚体的GalNAc缀合物(SEQ ID NO:18)对血清PCSK9和LDL胆固醇两者具有强效且持久的降低效应。当比较SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:19的多次注射的数据时注意到了相同的关系(图17)，即在施用未缀合的分子后观察到了瞬时效应，并且当施用对应的GalNAc缀合物(SEQ ID NO:19)时观察到了血清PCSK9和LDL胆固醇的强效且持久的下调。
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19对血清PCSK9和LDL胆固醇的效应是剂量依赖的并且具有长作用持续时间，其中在最后一次注射后至少七周内血清PCSK9和LDL胆固醇低于平均基线水平(最后一次注射在第22天，数据针对直至第71天的恢复期示出)。
在最后一次注射后一周，即研究的第29天，分析肝脏和肾脏寡核苷酸含量。在已经控制成如果使用(缀合的)SEQ ID NO:18来准备标准曲线，则结果没有变化之后，使用杂交ELISA(如在Lindholm等人，Mol Ther.2012年2月；20(2):376-81中所述)，使用SEQ ID NO:2分析寡核苷酸含量以准备来自用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18(即，缀合至GalNAc的SEQ IDNO:2)处理的动物的样品的标准曲线。以同样的方式，在已经控制成如果使用SEQ ID NO:19来准备标准曲线以用于进行这些样品的ELISA分析，则结果没有差异之后，使用SEQ ID NO:3来准备SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:19(即，缀合至GalNAc的SEQ ID NO:2)的标准曲线。
如上表中所示，当每周一次向动物皮下注射并持续四周时，在最后一次注射后一周，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的缀合导致缀合分子(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)的肝/肾比率高于对应的未缀合分子。
鉴于已经证明了使用其他未缀合的抗PCSK9分子(诸如SEQ ID NO:1，如图15所示)时的肾小管毒性的迹象，并且鉴于肝脏是抗PCSK9处理的靶器官，所以转向更高的肝/肾比率预期会导致与未缀合的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3相比，使用SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19的缀合物时安全性增加。尽管如此，如图15所示，虽然上表中的数据表明SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的缀合物的安全性增加，但是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3均不引起KIM-1的增加，并且因此它们对肾没有毒性。
如图16和图18所示，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19以药理学相关水平投配。相同动物在处理和恢复阶段期间的临床化学谱表明，肝脏或肾脏安全参数没有临床相关的增加。
实施例9
CIVI008：以SNAC为载体的CIVI 008在食蟹猴中皮下或口服(胶囊剂)重复投配毒性和毒代动力学研究
本研究的目的是评估CIVI008的毒性和可逆性，并确定相较于通过皮下途径每两周施用一次进行施用(先前调查的)，当每天通过口服胶囊剂对毛里求斯来源的食蟹猴施用达42天时CIVI008的药理学、血浆暴露和靶器官积聚。测试制品CIVI008是一种靶向PCSK9的反义寡核苷酸，其用沙波立沙钠[SNAC，8-[(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠]配制，制造商：abcr GmbH,Im Schlehert 10,76187Karlsruhe,Germany，目录号：AB 304409]，其先前已被证明能够提高动物和人体中肽的口服生物利用度。本研究的目的是为进一步的人体临床试验提供有关CIVI 008的胶囊剂投配的信息。在图20中提供了该研究的示意性描述。
组分配、研究设计和剂量水平
皮下和口服胶囊剂
A使用每只动物最近的体重，经由皮下途径向第1组的动物投配3mg/kg的CIVI008。对于施用，将计算剂量的CIVI 008溶解在杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)的无菌溶液中至1mL/kg的体积；
B使用1个胶囊剂(第2组)或两个胶囊剂(第3组至第6组)，向第2至6组动物口服投配组指定的胶囊剂。胶囊剂通过导管直接施用到胃的下部并随空气排出。在施用胶囊剂后立即施用约5mL的水以帮助溶解。
---------------------------------------
口服胶囊剂：将含有CIVI 008(10mg)/SNAC(100mg)的胶囊剂制成均匀的干共混制剂，将所述干共混制剂填充到4号硬壳明胶胶囊中，将所述硬壳明胶胶囊在填充后进行肠溶包衣。将CIVI 008药物产品配制成肠溶胶囊剂是合理的，因为已知CIVI 008药物物质对酸降解敏感。选择封装在4号胶囊(闭合长度14.3mm×外径5.05mm)内是为了促进完整胶囊通过猴幽门括约肌。
药代动力学和生物分布结果：如图21所示，向动物投配各自含有10mg的CIVI 008和100mg的SNAC的两颗胶囊剂，导致血浆中可测量浓度的CIVI 008，其中在投配后30min内达到平均T最大。与SNAC是摄取CIVI 008所必需的一致，在投配含有20mg的CIVI 008而不含SNAC载体的单个胶囊剂的对照动物的血浆中注意到了非常少的CIVI 008。
CIVI 008是GalNac缀合的LNA-缺口聚体。在投配后至多1.5小时内在血浆样品中检测到的CIVI 008在HLPC分析中显示出母体化合物保留时间，表明药物从肠道被完整吸收。来自稍后时间点的样品显示出更宽的峰，指示母体化合物和代谢产物(即具有不完整的糖部分的寡核苷酸)的混合物。
当口服投配时，CIVI 008在肝脏中经受首过效应，此由于存在靶向肝脏的GalNAc部分，应导致快速肝脏吸收。在低于肝脏的吸收能力的剂量下，预期所吸收的药物的大部分将因此积聚在肝脏中，因此很少有药物出现在全身循环中。在SQ(皮下)组和PO(口服)组的血浆AUC与肝脏浓度(在投配期结束时测量的)之间的比较支持了这一预期。具体地，观察到SQ组的血浆AUC比口服投配组的AUC高2-3个数量级(图22)，而肝脏浓度在SQ组与PO组之间仅相差大约一个数量级(图23)。当使用RNA疗法来抑制肝脏中的靶标时，口服投配与SQ或IV投配之间的血浆/肝脏暴露比的变化由此提供了显著减少非肝组织/血浆部位暴露并由此降低非靶组织中的潜在安全性问题的手段。
药效动力学结果：每日口服投配1粒或2粒CIVI 008/SNAC胶囊剂达42天，导致主要靶标PCSK9的可测量的降低，这通常在投配两周后被注意到。第35/42天的PCSK9的平均降低百分比在动物之间存在差异，与基线相比，最佳反应者实现>60％的PCSK9降低(图24)。对照动物(仅CIVI 008、仅SNAC和空胶囊剂)中的平均PCSK9降低相对较小，说明了活性组的显著降低是由SNAC介导的CIVI 008吸收引起的。
PCSK9负向调节细胞表面LDL受体，该细胞表面LDL受体负责将胆固醇输入肝脏。因此，在药理学上减少PCSK9会增加LDL受体的量，从而导致肝脏中的输入量增加并且血浆LDL胆固醇减少。与PCSK9的这一功能一致，CIVI 008/SNAC介导的PCSK9减少导致从投配后约3周开始并从第4周开始稳定化的LDL-c的可测量降低(图25A)。对照动物(仅CIVI 008、仅SNAC和空胶囊剂)中的LDL-c降低贯穿整个研究围绕基线值波动(图25B)。
如图23所示，CIVI 008浓度在恢复时段期间在肝脏中下降，但在3周的时间点处仍以可测量的量存在。与贯穿恢复时段肝脏中药物的存在一致，在投配结束时的LDL水平在投配后维持两周，并且在恢复结束时尚未完全恢复到基线水平(图26)。
毒性结果：该研究按照GLP标准进行，并贯穿该研究来监测以下毒性参数(投配前、第14天、第29天、第42天和恢复结束)：
血液学：红血细胞(红细胞)计数、血红蛋白、血细胞比容、平均血球体积、平均血球血红蛋白、平均血球血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、网织红细胞绝对计数、血小板计数、白血细胞(白细胞)计数、嗜中性粒细胞绝对计数、淋巴细胞绝对计数、单核细胞绝对计数、嗜酸性粒细胞绝对计数、嗜碱性粒细胞绝对计数、未染色大细胞绝对计数、血液涂片。
临床化学、PCSK9和脂质：尿素氮、肌酸酐、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白:球蛋白比率、总胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、肌酸激酶、钙、无机磷、钠、钾、氯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯。
用SNAC配制的CIVI 008是被良好耐受的，没有毒理学显著的临床观察的投配后迹象。在投配或恢复阶段期间，任何动物的临床化学参数或血液学标记物都没有显著变化。
口服胶囊剂施用后没有器官重量变化表明了所述药物的效应。此外，没有宏观或微观发现表明药物在投配结束和恢复结束时的局部或全身效应。特别地，在QD口服投配42天后，肠道的任何区段(十二指肠、空肠、回肠和结肠)中均无局部组织病理学变化，但是所有区段都具有可测量浓度的CIVI 008。
实施例10
N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸二钠的制备
步骤1：将5-氯-2-羟基-苯甲酰胺(30.0g，99.9％，1.0当量)、乙腈(90mL，3倍体积)、吡啶(19.4g，1.403当量)装入反应器中，并将混合物在8-16℃下搅拌10-30分钟。将氯甲酸乙酯(20.3g，1.07当量)装入到8-16℃的反应器中，并将反应混合物在10-18℃搅拌30-60分钟。然后将混合物加热至回流并在80-90℃搅拌4小时。将混合物通过在低于80-90℃的温度和减压(<1巴)下蒸馏浓缩至3.5倍体积。然后向反应器中装入乙腈(45mL，1.5体积)，再次浓缩至3.5倍体积，然后冷却至18-28℃。添加水(60mL，2倍体积)，并将混合物在18-28℃下搅拌1-3小时。将混合物冷却至4-8℃，通过过滤收集沉淀物，并用水(30mL，1倍体积)洗涤滤饼。将湿滤饼在58℃下干燥6小时以得到粗产率为92.6％的6-氯-2H-1,3-苯并噁嗪-2,4(3H)-二酮(31.5g，纯度92.6％)。
步骤2：干二甲基乙酰胺(150mL，3倍体积)、颗粒状碳酸钠(25.1g，1.0当量)、6-氯-2H-1,3-苯并噁嗪-2,4(3H)-二酮(50.0g，在经测定校正后为93.4重量％，1当量)和8-溴辛酸乙酯(56.8g，在经测定校正后为99.2重量％，0.95当量)，并减压至-0.3MPa。然后将经搅拌的混合物在70℃下加热14小时。然后将混合物冷却至35-45℃并通过过滤收集沉淀物。将湿滤饼装入被指定为反应器1(R1)的反应器中，将滤液装入被指定为反应器2(R2)的第二反应器中。将乙醇(60mL)装入R1并将湿滤饼-乙醇混合物在35-45℃下搅拌10-30分钟。将混合物过滤并将滤液与已经存在于R2中的物质合并。将R2的经搅拌的溶液内容物冷却至25-30℃并将水(100mL，2倍体积)缓慢地直接添加至所述溶液中。将混合物冷却至5-10℃并在保持9.5小时后，收集形成的沉淀以得到作为湿饼的8-(6-氯-2H-1,3-苯并噁嗪-2.4(3H)-二酮基)辛酸乙酯(100g，纯度97.5％)。
步骤3：将水(240mL，3倍体积)、氢氧化钠(30g，3.3当量)和8-(6-氯-2H-1,3-苯并噁嗪-2.4(3H)-二酮基)辛酸乙酯(83g，1.0当量)装入到反应器(反应器1(R1))中并在25℃下搅拌10分钟。将经搅拌的混合物在98℃下在蒸馏下加热3小时，此时起始材料已被消耗。然后将反应混合物冷却至27℃。将水(240mL)和HCl(66mL，3.5当量)在搅拌下装入相邻反应器(反应器2(R2))中并冷却至20-25℃。将皂化的反应混合物(R1)在5小时的时段内缓慢添加到R2中，伴随着二氧化碳的放出和产物沉淀。用50％氢氧化钠溶液将混合物的pH调节至pH 2-3并在8℃下搅拌3小时。通过过滤收集产物，用水洗涤并真空干燥，以得到粗产率为88.9％的N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC，63g，纯度95.7％)。
步骤4：将N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)(1.0g，1.0当量)、氢氧化钠(0.26g，2当量)和水(5mL，5倍体积)在反应器中组合并在55℃下搅拌2小时。将混合物冷却至20℃并将溶液过滤以去除不溶性固体。将滤液在低于50℃下减压浓缩，并将湿滤饼在50℃下干燥12小时，以得到粗产率为96.5％的N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸二钠(1.1g，97.9％纯度)。
实施例11
CIVI 008：以5-CNAC为载体的CIVI 008在食蟹猴中口服(胶囊剂)毒代动力学研究
本研究的目的是确定5-CNAC[N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸二钠]促进CIVI 008口服摄取的能力并确定当施用于毛里求斯来源的食蟹猴时提供最有效的CIVI 008口服摄取的CIVI 008/5-CNAC胶囊剂的制造方法和投配范例。本研究的目的是为在人体中进行进一步临床试验提供有关CIVI008胶囊剂投配的信息。在图27中提供了该研究的示意性纲要。
口服胶囊剂：如下所述制造了许多不同的胶囊剂。
1由均匀的干共混制剂制造干共混胶囊剂，所述干共混制剂填充到i)4号硬壳明胶胶囊(封闭长度14.3mm×外径5.05mm)并在填充后进行肠溶包衣，或ii)填充到肠溶包衣的0号硬壳明胶胶囊(闭合长度21.7mm×外径7.6mm)中。
2通过将CIVI 008和5-CNAC共溶在[水]中，然后冻干并填充到肠溶包衣的0号硬壳明胶胶囊中制备冻干胶囊剂。
研究纲要：向总共10只食蟹猴(5只雄性和5只雌性)在第1周的星期一和星期三各自投配2粒A组胶囊剂，之后是4天的投配假期。这个星期一和星期三投配方案在第2周、第3周、第5周、第6周、第7周、第8周、第13周、第14周、第15周和第17周中继续，其中在第2周中的每个投配时机使用2粒B组胶囊剂，并且在其相应周中的每个投配时机使用1粒C组至K组胶囊剂。在投配时段期间，在星期一和星期三在投配前和投配后0.5小时、1.5小时、3小时和5小时抽取血液样品进行PK分析。在研究前和研究结束时采集临床化学和血液学样品(参见实施例1)。
药代动力学结果：如图28所示，通过向动物投配两粒A组胶囊剂，导致血浆中可测量浓度的CIVI 008，其中在投配后30min内达到平均T最大。
与使用SNAC作为载体的类似剂量的CIVI 008(实施例9，图21)相比，使用5-CNAC载体导致AUC0-5以及C最大均增加(图29)，表明了5-CNAC在促进CIVI 008口服摄取方面是两种载体中更有效的。
研究中使用的胶囊剂是肠溶包衣的以促进CIVI 008/5-CNAC在肠道中的pH依赖性释放。将胶囊大小从4号(A组)增加到0号(B组)不会改变CIVI 008的平均血浆PK曲线或平均T最大，表明了较大的0号胶囊能够以与较小4号胶囊相同的动力学从胃转运。
当作为胶囊剂递送时，共制剂在肠道中的着陆点处产生高局部浓度的各种成分，这对于载体促进共制剂的药物的摄取的能力很重要。因此，在1或2粒胶囊剂中递送相似量的药物/载体可影响药物的吸收效率。如图30所示，情况就是如此。虽然血浆PK曲线的动力学非常相似，但含有20mg的CIVI 008/200mg的5-CNAC(C组胶囊剂)的单粒胶囊剂相较于以各自含有一半量的药物/载体的2粒胶囊剂施用的类似量的药物/载体导致更高的C最大和AUC0-5。
在恒定剂量的5-CNAC下增加CIVI 008的剂量，AUC和C最大剂量成比例地增加至25mg。增加剂量进一步导致AUC和C最大的大于剂量比例的增加，表明了肝脏摄取达到饱和(图31)。
将制造方法由CIVI 008和5-CNAC的干共混(图32A)改变为共溶解CIVI 008和5-CNAC，然后冻干(图32B)，似乎不影响CIVI 008药物的肠道吸收。因此，当通过任一方法制造胶囊时，在5mg至30mg的剂量范围内观察到了CIVI 008的非常相似的AUC和C最大曲线。
实施例12
CIVI 008：以5-CNAC为载体的CIVI 008在食蟹猴中的口服(胶囊剂)药理研究
本研究的目的是确定5-CNAC[N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸二钠]在每天一次投配并持续7周后降低血浆PCSK9的能力。CIVI 008在非人灵长类动物肝脏中的半衰期在2周至3周之间，因此在投配7周后，预期肝脏浓度达到其稳态水平的>80％。
研究纲要：干共混胶囊剂(20mg的CIVI 008/200mg的5-CNAC)由均匀的干共混制剂制造，所述均匀的干共混制剂被填充到肠溶包衣的0号硬壳明胶胶囊中。通过口服管饲法每天一次向总共10只食蟹猴(5只雄性和5只雌性)各自施用单粒胶囊达49天。两只未接受处理的动物(一只雄性和一只雌性)被纳入研究作为参考动物。在投配时段期间，在研究开始时和第49天在投配前和投配后0.5小时、1.5小时、3小时和5小时抽取血液样品进行PK分析。在研究前第-2周和第-1周、在第1天投配前并且此后每周抽取用于PCSK9和脂质分析的血液样品达研究的持续时间。在研究前第-2周和第-1周以及第22天和第49天采集用于临床化学、凝血和血液学的样品。
药效动力学结果：图33示出了在计划的49天投配的第22天时PCSK9和LDL降低。即使在这个早期时间点，动物中PCSK-9和LDL的显著降低也很明显，最高反应者实现了约60％的血浆LDL降低。PCSK9早在第8天就开始下降，并且在第15天时大多数动物中的PCSK9和LDL均明显下降。在第22天，所有猴子中的Apo-B-100均显著降低(从25％至45％)，其中5/10的猴子具有低于检测下限的水平。
与先前使用SNAC作为CIVI 008的载体的实验(实施例9，图25A)相比，用5-CNAC配制的CIVI 008投配，导致更快速和更显著的LDL下降(图34)，表明了5-CNAC在促进CIVI 008的口服摄取方面比SNAC显著更有效。
***
以引用方式并入
贯穿本申请可引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、专利、专利申请和网站)的内容出于任何目的据此明确通过引用方式以其全文并入本文，在2020年12月11日公开发布的版本中的所述参考文献中所引用的参考文献也出于任何目的据此明确通过引用方式以全文并入本文。通过数据库登录号标识的蛋白质和核酸序列以及主题数据库条目中所包含的其他信息(例如，对应于特定基因库登录号的数据库条目中的非序列相关内容)以引用方式并入本文，并且对应于在2020年12月11日公开可得的对应数据库公布。
等同物
虽然已经说明和描述了各种具体方面，但是以上说明书不是限制性的。应当理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。
序列表
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<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
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<221> misc_特征
<222> (1)..(14)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
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<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
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<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 2
aatgctacaa aaccca 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 3
aatgctacaa aaccca 16
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(15)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(15)
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<400> 4
gctgtgtgag cttgg 15
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
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tgctgtgtga gcttgg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷
<400> 6
tgctgtgtga gcttgg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> misc_特征
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<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 9
catgctacaa aaccca 16
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(18)
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<400> 10
caaatgctac aaaaccca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(18)
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<400> 11
caaatgctac aaaaccca 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(17)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(17)
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cagctgtgtg agcttgg 17
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
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catgctgtgt gagcttgg 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(18)
<223> LNA核苷
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catgctgtgt gagcttgg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(18)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 15
catcctggtc tgtgttcc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(18)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (17)..(18)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 16
catcctggtc tgtgttcc 18
<210> 17
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(14)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(14)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 17
tgctacaaaa ccca 14
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 18
aatgctacaa aaccca 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 19
aatgctacaa aaccca 16
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(15)
<223> LNA核苷
<400> 20
gctgtgtgag cttgg 15
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷
<400> 21
tgctgtgtga gcttgg 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷
<400> 22
tgctgtgtga gcttgg 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 23
tcctggtctg tgttcc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> GalNAc Conj2a
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 24
tcctggtctg tgttcc 16
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 25
tgctacaaaa ccca 14
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 26
aatgctacaa aaccca 16
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 27
gctgtgtgag cttgg 15
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 28
tgctgtgtga gcttgg 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 29
tcctggtctg tgttcc 16
<210> 30
<211> 14
<212> RNA
<213> 智人
<400> 30
uggguuuugu agca 14
<210> 31
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 31
uggguuuugu agcauu 16
<210> 32
<211> 15
<212> RNA
<213> 智人
<400> 32
ccaagcucac acagc 15
<210> 33
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 33
ccaagcucac acagca 16
<210> 34
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人
<400> 34
ggaacacaga ccagga 16
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 35
tcagcattgg tattca 16
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 36
cagcattggt attca 15
<210> 37
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(14)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (2)..(3)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (12)..(14)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 37
agcattggta ttca 14
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(3)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(16)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(5)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (14)..(16)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 38
gacgcattgg tattca 16
<210> 39
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> FAM缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 39
gcattggtat tca 13
<210> 40
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 40
gtctgtggaa gcg 13
<210> 41
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(13)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 41
gtctgtggaa gcg 13
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 42
cagtctgtgg aagcg 15
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LNA反义缺口聚体寡核苷酸缀合物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 胆固醇-C6
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> 磷酸二酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> LNA核苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(15)
<223> 硫代磷酸酯核苷间键
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(15)
<223> LNA核苷，LNA C是5-甲基C
<400> 43
ctgtctgtgg aagcg 15
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 核碱基序列基序
<400> 44
gtctgtggaa gcg 13
<210> 45
<211> 13
<212> RNA
<213> 智人
<400> 45
cgcuuccaca gac 13
<210> 46
<211> 3731
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
gtccgatggg gctctggtgg cgtgatctgc gcgccccagg cgtcaagcac ccacacccta 60
gaaggtttcc gcagcgacgt cgaggcgctc atggttgcag gcgggcgccg ccgttcagtt 120
cagggtctga gcctggagga gtgagccagg cagtgagact ggctcgggcg ggccgggacg 180
cgtcgttgca gcagcggctc ccagctccca gccaggattc cgcgcgcccc ttcacgcgcc 240
ctgctcctga acttcagctc ctgcacagtc ctccccaccg caaggctcaa ggcgccgccg 300
gcgtggaccg cgcacggcct ctaggtctcc tcgccaggac agcaacctct cccctggccc 360
tcatgggcac cgtcagctcc aggcggtcct ggtggccgct gccactgctg ctgctgctgc 420
tgctgctcct gggtcccgcg ggcgcccgtg cgcaggagga cgaggacggc gactacgagg 480
agctggtgct agccttgcgt tccgaggagg acggcctggc cgaagcaccc gagcacggaa 540
ccacagccac cttccaccgc tgcgccaagg atccgtggag gttgcctggc acctacgtgg 600
tggtgctgaa ggaggagacc cacctctcgc agtcagagcg cactgcccgc cgcctgcagg 660
cccaggctgc ccgccgggga tacctcacca agatcctgca tgtcttccat ggccttcttc 720
ctggcttcct ggtgaagatg agtggcgacc tgctggagct ggccttgaag ttgccccatg 780
tcgactacat cgaggaggac tcctctgtct ttgcccagag catcccgtgg aacctggagc 840
ggattacccc tccacggtac cgggcggatg aataccagcc ccccgacgga ggcagcctgg 900
tggaggtgta tctcctagac accagcatac agagtgacca ccgggaaatc gagggcaggg 960
tcatggtcac cgacttcgag aatgtgcccg aggaggacgg gacccgcttc cacagacagg 1020
ccagcaagtg tgacagtcat ggcacccacc tggcaggggt ggtcagcggc cgggatgccg 1080
gcgtggccaa gggtgccagc atgcgcagcc tgcgcgtgct caactgccaa gggaagggca 1140
cggttagcgg caccctcata ggcctggagt ttattcggaa aagccagctg gtccagcctg 1200
tggggccact ggtggtgctg ctgcccctgg cgggtgggta cagccgcgtc ctcaacgccg 1260
cctgccagcg cctggcgagg gctggggtcg tgctggtcac cgctgccggc aacttccggg 1320
acgatgcctg cctctactcc ccagcctcag ctcccgaggt catcacagtt ggggccacca 1380
atgcccaaga ccagccggtg accctgggga ctttggggac caactttggc cgctgtgtgg 1440
acctctttgc cccaggggag gacatcattg gtgcctccag cgactgcagc acctgctttg 1500
tgtcacagag tgggacatca caggctgctg cccacgtggc tggcattgca gccatgatgc 1560
tgtctgccga gccggagctc accctggccg agttgaggca gagactgatc cacttctctg 1620
ccaaagatgt catcaatgag gcctggttcc ctgaggacca gcgggtactg acccccaacc 1680
tggtggccgc cctgcccccc agcacccatg gggcaggttg gcagctgttt tgcaggactg 1740
tatggtcagc acactcgggg cctacacgga tggccacagc cgtcgcccgc tgcgccccag 1800
atgaggagct gctgagctgc tccagtttct ccaggagtgg gaagcggcgg ggcgagcgca 1860
tggaggccca agggggcaag ctggtctgcc gggcccacaa cgcttttggg ggtgagggtg 1920
tctacgccat tgccaggtgc tgcctgctac cccaggccaa ctgcagcgtc cacacagctc 1980
caccagctga ggccagcatg gggacccgtg tccactgcca ccaacagggc cacgtcctca 2040
caggctgcag ctcccactgg gaggtggagg accttggcac ccacaagccg cctgtgctga 2100
ggccacgagg tcagcccaac cagtgcgtgg gccacaggga ggccagcatc cacgcttcct 2160
gctgccatgc cccaggtctg gaatgcaaag tcaaggagca tggaatcccg gcccctcagg 2220
agcaggtgac cgtggcctgc gaggagggct ggaccctgac tggctgcagt gccctccctg 2280
ggacctccca cgtcctgggg gcctacgccg tagacaacac gtgtgtagtc aggagccggg 2340
acgtcagcac tacaggcagc accagcgaag gggccgtgac agccgttgcc atctgctgcc 2400
ggagccggca cctggcgcag gcctcccagg agctccagtg acagccccat cccaggatgg 2460
gtgtctgggg agggtcaagg gctggggctg agctttaaaa tggttccgac ttgtccctct 2520
ctcagccctc catggcctgg cacgagggga tggggatgct tccgcctttc cggggctgct 2580
ggcctggccc ttgagtgggg cagcctcctt gcctggaact cactcactct gggtgcctcc 2640
tccccaggtg gaggtgccag gaagctccct ccctcactgt ggggcatttc accattcaaa 2700
caggtcgagc tgtgctcggg tgctgccagc tgctcccaat gtgccgatgt ccgtgggcag 2760
aatgactttt attgagctct tgttccgtgc caggcattca atcctcaggt ctccaccaag 2820
gaggcaggat tcttcccatg gataggggag ggggcggtag gggctgcagg gacaaacatc 2880
gttggggggt gagtgtgaaa ggtgctgatg gccctcatct ccagctaact gtggagaagc 2940
ccctgggggc tccctgatta atggaggctt agctttctgg atggcatcta gccagaggct 3000
ggagacaggt gcgcccctgg tggtcacagg ctgtgccttg gtttcctgag ccacctttac 3060
tctgctctat gccaggctgt gctagcaaca cccaaaggtg gcctgcgggg agccatcacc 3120
taggactgac tcggcagtgt gcagtggtgc atgcactgtc tcagccaacc cgctccacta 3180
cccggcaggg tacacattcg cacccctact tcacagagga agaaacctgg aaccagaggg 3240
ggcgtgcctg ccaagctcac acagcaggaa ctgagccaga aacgcagatt gggctggctc 3300
tgaagccaag cctcttctta cttcacccgg ctgggctcct catttttacg ggtaacagtg 3360
aggctgggaa ggggaacaca gaccaggaag ctcggtgagt gatggcagaa cgatgcctgc 3420
aggcatggaa ctttttccgt tatcacccag gcctgattca ctggcctggc ggagatgctt 3480
ctaaggcatg gtcgggggag agggccaaca actgtccctc cttgagcacc agccccaccc 3540
aagcaagcag acatttatct tttgggtctg tcctctctgt tgccttttta cagccaactt 3600
ttctagacct gttttgcttt tgtaacttga agatatttat tctgggtttt gtagcatttt 3660
tattaatatg gtgacttttt aaaataaaaa caaacaaacg ttgtcctaac aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa a 3731

Claims (123)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含反义寡聚物和口服递送剂，其中所述反义寡聚物的长度为16至22个连续核苷酸，其中所述反义寡聚物的序列包含与PCSK9靶序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA，并且其中所述口服递送剂共价或非共价附接至所述反义寡聚物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RNA是前mRNA、前mRNA的剪接变体、成熟mRNA、或其等位基因变体或突变体。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列位于外显子或内含子内。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列如SEQ ID NO:31所示。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列包含外显子与内含子之间的接合部。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列位于编码PCSK9的开放阅读框的5'端的上游。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列位于编码PCSK9的开放阅读框的3'端的下游。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述LNA是氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-5LNA、5'-甲基-LNA、ENA、cET、cMOE或其组合。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述LNA是β-D构型或α-L构型的立体异构体。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含至少一个cET单元。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含2、3、4、5、6或7个LNA单元。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物中的每个LNA单元均为相同构型的立体异构体。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物中的每个LNA单元均为β-D-氧基LNA单元。
14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物中的每个LNA单元均为α-L-氧基-LNA单元。
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物的序列包含至少一个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所有所述核苷间键都是硫代磷酸酯。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述核苷间键中的一个或多个核苷间键包含R构象和/或S构象的手性中心。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所有手性中心均处于R构象。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所有手性中心均处于S构象。
20.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物和SEQ ID NO:31的寡聚物能够形成双链体，所述双链体相对于包含不含LNA的对应反义寡聚物的对应双链体具有增加的热稳定性。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含反义寡核苷酸缀合物和口服递送剂，其中所述反义寡核苷酸缀合物包含：
(i)为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与PCSK9靶序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，以及
(ii)至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，
其中所述反义寡核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的mRNA，并且其中所述口服递送剂共价地或非共价地附接至所述反义寡核苷酸缀合物。
22.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RNA是前mRNA、前mRNA的剪接变体、成熟mRNA或其等位基因变体或突变体。
23.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列是在外显子或内含子内的序列。
24.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列如SEQ ID NO:31所示。
25.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列包含外显子与内含子之间的接合部。
26.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列位于编码PCSK9的开放阅读框的5'端的上游。
27.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述PCSK9靶序列位于编码PCSK9的开放阅读框的3'端的下游。
28.根据权利要求21-27所述的药物组合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分是附接至所述反义寡聚物的5'末端或3'末端的靶向肝脏的部分。
29.根据权利要求21-28所述的药物组合物，其中所述靶向肝脏的部分经由接头连接至所述反义寡聚物。
30.根据权利要求21-29所述的药物组合物，其中所述靶向肝脏的部分包括碳水化合物缀合物部分，所述碳水化合物缀合物部分包含选自由以下组成的组的碳水化合物：半乳糖、乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖、甘露糖-6-磷酸以及其组合。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述碳水化合物缀合物部分不是直链碳水化合物聚合物。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述碳水化合物缀合物部分是包含1、2、3或4个碳水化合物部分的碳水化合物基团。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所有所述碳水化合物部分是相同的。
34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中至少一个碳水化合物部分与其他碳水化合物部分不同(不相同)。
35.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述碳水化合物缀合物部分包含靶向去唾液酸糖蛋白受体的至少一个缀合物部分。
36.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述靶向去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分包含单价、二价、三价或四价GalNAc簇。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述GalNAc簇中的每个GalNAc经由间隔基附接到分支点基团。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述分支点基团包含二赖氨酸。
39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述间隔基包括PEG间隔基。
40.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述接头包括C6至C12氨基烷基基团或包含1至6个核苷酸的生物可切割磷酸核苷酸接头。
41.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述三价GalNAc簇包含Conj 1、Conj 2、Conj 1a或Conj 2a。
42.根据权利要求21-41所述的药物组合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分经由共价键共价附接至所述反义寡聚物。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的反义寡核苷酸缀合物
以及口服递送剂，其中
上标L标识β-D-氧基LNA单元，
MeC标识5-甲基胞嘧啶单元，
下标s标识硫代磷酸酯核苷间键，
其中
是靶向Conj 2a去唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分，
并且其中所述反义寡核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述至少一种药学上可接受的赋形剂或其组合选自由以下组成的组：pH调节剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、芳香剂、保湿剂、张力调节剂、着色剂、表面活性剂、增塑剂、润滑剂、助流剂、压缩助剂、增溶剂、赋形剂、稀释剂、磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、乙二醇、分散剂、交聚维酮、聚维酮、或其任何组合。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：他汀类、依泽替米贝、胆汁螯合树脂、烟酸、纤维酸衍生物、普罗布考、新霉素、右旋甲状腺素、植物甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂、英普他派、胆汁酸转运蛋白抑制剂、肝CYP7a调节剂、雌激素替代治疗剂、和抗炎剂。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述他汀类选自由以下组成的组：洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀和氟伐他汀。
48.一种治疗有需要的受试者中由PCSK9的异常表达水平和/或活性引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的所述施用降低所述受试者中的血清PCSK9水平和/或降低所述受试者中的血清LDL胆固醇水平。
49.根据权利要求48所述的方法，其中PCSK9是(i)PCSK9等位基因变体；(ii)PCSK9突变体；或者(iii)PCSK9剪接变体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述PCSK9突变体是PCSK9功能获得性突变体。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述血脂异常是家族性高脂血症(FCHL)或获得性高脂血症。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症或耐他汀类高胆固醇血症。
54.根据权利要求48所述的方法，所述方法进一步包括施用选自由以下组成的组的治疗剂：他汀类、依泽替米贝、胆汁螯合树脂、烟酸、纤维酸衍生物、普罗布考、新霉素、右旋甲状腺素、植物甾烷醇酯、胆固醇吸收抑制剂、英普他派、胆汁酸转运蛋白抑制剂、肝CYP7a调节剂、雌激素替代治疗剂、抗炎剂或其任何组合。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述他汀类选自由以下组成的组：洛伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀和氟伐他汀。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述药物组合物是口服施用的。
57.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物作为单剂量施用。
58.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物作为多剂量施用。
59.一种治疗有需要的受试者中选自由动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)或冠心病(CHD)组成的组的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物。
60.一种降低细胞中PCSK9表达水平和/或活性的体外方法，所述体外方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物。
61.一种降低有需要的受试者中PCSK9的表达水平和/或活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物。
62.一种降低有需要的受试者中胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至权利要求47中任一项所述的药物组合物。
63.一种制造药物组合物的方法，所述方法包括掺混以下物质：(i)长度为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包括与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，并且其中所述反义寡聚物靶向编码PCSK9的RNA；以及
(ii)口服递送剂。
64.一种制造药物组合物的方法，所述方法包括掺混以下物质：
(i)缀合物，所述缀合物包含(a)为16至22个连续核苷酸的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物的序列包含与SEQ ID NO:31的序列100％互补的长度为16个核苷酸的连续序列，并且其中所述反义寡聚物是包含至少一个LNA单元的缺口聚体，和(b)至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分，所述至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分直接或经由位于所述连续寡聚物序列与所述非核苷酸或非多核苷酸部分之间的接头共价附接至所述反义寡聚物，其中所述反义寡聚核苷酸缀合物靶向编码PCSK9的RNA；以及
(ii)口服递送剂。
65.根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物或根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中所述反义寡聚物的序列包含SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成。
66.根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物或根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中所述反义寡聚物的序列包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成。
67.根据权利要求21至47中任一项所述的药物组合物或根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中所述反义寡聚物缀合物的序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19或由SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19组成。
68.根据权利要求1至47或65至67中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至67中任一项所述的方法，其中所述口服递送剂包含辛酸(C8)、癸酸(C10)、其衍生物、其药学上可接受的盐、或其任何组合。
69.根据权利要求1至47或65至68中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至68中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的盐是钠盐。
70.根据权利要求1至47或65至69中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至69中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是固体。
71.根据权利要求1至47或65至70中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至70中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是片剂或胶囊剂的形式。
72.根据权利要求71所述的药物组合物或方法，其中所述胶囊剂是液体胶囊剂。
73.根据权利要求1至47或65至72中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至72中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是肠溶包衣的。
74.根据权利要求71所述的药物组合物或方法，其中所述片剂或胶囊剂是肠溶包衣的。
75.根据权利要求71至74所述的药物组合物或方法，其中所述片剂或胶囊剂的重量在5mg与1000mg之间、在10mg与500mg之间、在10mg与250mg之间、在100mg与200mg之间、或在250mg与500mg之间。
76.根据权利要求71至75的药物组合物或方法，其中所述片剂或胶囊剂中的所述反义寡聚物或所述反义寡核苷酸缀合物的量在1mg至100mg、5mg至100mg、10mg至100mg、20mg至100mg、20mg和50mg的范围内。
77.根据权利要求1至47或65至76中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至76中任一项所述的方法，其中所述口服递送剂是
其中
R1、R2、R3、和R4独立地为氢、-OH、-NR6R7、卤素、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基；
R5是取代或未取代的C2-C16亚烷基，取代或未取代的C2-C16亚烯基、取代或未取代的C1-C12烷基(亚芳基)、或取代或未取代的芳基(C1-C4亚烷基)；并且
R6和R7独立地为氢、氧或C1-C4烷基。
78.根据权利要求1至47或65至77中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至77中任一项所述的方法，其中所述递送剂选自由以下组成的组：N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸(SNAC)、N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)、N-(10-[2-羟基苯甲酰基]氨基)癸酸(SNAD)、4-[(4-氯-2-羟基-苯甲酰基)氨基]丁酸(4-CNAB)、N-(8-[4-甲氧基-氯-2-羟基苯甲酰基-氨基)辛酸(4-MOAC)、8-(4-羟基苯氧基)辛酸(4-HPO)、4-间甲苯氧基丁酸(3-TBA)、4-(3-羟基苯硫醇基)丁酸(3-HPSB)、5-苯基戊酸(5-PPA)、8-(2-羟基苯氧基)辛基二乙醇胺(2-HPOD)、(4-异丙基苄氧基)乙酸(4-IBOA)、2-(5-戊酸)-5-(2-羟基苯基)-l,3,4-噁二唑(2-PHOD)、7-氧代-7-苯基庚酸(7-OPHA)、4-(3-氟苯基硫醇基)丁酸(3-FPSB)，或其任何组合。
79.根据权利要求1至47或65至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至78中任一项所述的方法，其中所述口服递送剂是N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐、水合物或溶剂化物，或其组合。
80.根据权利要求79所述的药物组合物或方法，其中所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的钠盐、钾盐、钙盐以及其任何组合。
81.根据权利要求80所述的药物组合物或方法，其中所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是钠盐。
82.根据权利要求80所述的药物组合物或方法，其中所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是单钠盐(沙波立沙钠203787-91-1,SNAC，8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠)。
83.根据权利要求80所述的药物组合物或方法，其中所述N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐是二钠盐。
84.根据权利要求1至47或65至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至78中任一项所述的方法，其中所述口服递送剂是N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐、水合物或溶剂化物，或其组合。
85.根据权利要求84所述的药物组合物或方法，其中所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐选自由以下组成的组：N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的钠盐、钾盐、钙盐，以及其任何组合。
86.根据权利要求85所述的药物组合物或方法，其中所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是钠盐。
87.根据权利要求85所述的药物组合物或方法，其中所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是单钠盐。
88.根据权利要求85所述的药物组合物或方法，其中所述N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸的盐是二钠盐。
89.根据权利要求1至47或65至88中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至88中任一项所述的方法，其中所述口服递送剂是癸酸(C10)的盐、水合物或溶剂化物，或其组合。
90.根据权利要求89所述的药物组合物或方法，其中所述癸酸(C10)的盐选自由以下组成的组：癸酸(C10)的钠盐、钾盐和钙盐，以及其任何组合。
91.根据权利要求90所述的药物组合物或方法，其中所述癸酸(C10)的盐是癸酸钠。
92.根据权利要求1至47或65至91中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至91中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在餐前5分钟至60分钟施用。
93.根据权利要求1至47或65至92中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至91中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在餐前至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟施用。
94.根据权利要求1至47或65至93中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求48至93中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含pH敏感包衣。
95.根据权利要求94所述的药物组合物或方法，其中所述pH敏感包衣是pH敏感聚合物。
96.根据权利要求94所述的药物组合物或方法，其中所述pH敏感聚合物包括纤维素、丙烯酸或其衍生物。
97.根据权利要求94至96所述的药物组合物或方法，其中所述pH敏感包衣包含pH敏感水凝胶、pH活化的药物递送系统、pH敏感脂质体、胶束或脂质纳米粒子、pH敏感微球体、pH敏感纳米粒子，或其任何组合。
98.一种片剂或胶囊剂，所述片剂或胶囊剂包含：
(i)(GalNAc)3-氨基-六亚甲基-5'硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧鸟苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胸苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧腺苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧胞苷基-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基(5-甲基-胞苷基)-(3'>5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O,4'-C-亚甲基腺苷基十六烷钠盐；
(ii)口服递送剂，所述口服递送剂选自由以下组成的组：SNAC、5-CNAC、C10、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合；以及
(iii)任选地，他汀类。
99.一种片剂或胶囊剂，所述片剂或胶囊剂包含：
(i)CIVI 008
(ii)口服递送剂，所述口服递送剂选自由以下组成的组：SNAC、5-CNAC、C10、其水合物、溶剂化物或盐、以及其组合；以及
(iii)任选地，他汀类。
100.根据权利要求98或99所述的片剂或胶囊剂，其中所述口服递送剂是SNAC。
101.根据权利要求100所述的片剂或胶囊剂，其中所述SNAC是单钠盐。
102.根据权利要求100所述的片剂或胶囊剂，其中所述SNAC是二钠盐。
103.根据权利要求98或99所述的片剂或胶囊剂，其中所述口服递送剂是5-CNAC。
104.根据权利要求103所述的片剂或胶囊剂，其中所述5-CNAC是单钠盐。
105.根据权利要求103所述的片剂或胶囊剂，其中所述5-CNAC是二钠盐。
106.根据权利要求98或99所述的片剂或胶囊剂，其中所述口服递送剂是C10。
107.根据权利要求98或99所述的片剂或胶囊剂，其中所述口服递送剂是C8或C12。
108.一种胶囊剂，所述胶囊剂包含：
(i)CIVI 008
109.根据权利要求108所述的胶囊剂，其中CIVI 008和5-CNAC处于干共混物中。
110.根据权利要求108或109所述的胶囊剂，其中所述胶囊剂是明胶胶囊剂。
111.根据权利要求110所述的胶囊剂，其中所述凝胶胶囊剂是硬壳明胶胶囊剂。
112.根据权利要求108至111中任一项所述的胶囊剂，其中所述胶囊剂是肠溶包衣的。
113.根据权利要求108至112中任一项所述的胶囊剂，其中所述胶囊剂包含5mg与30mg之间的CIVI 008和100mg与200mg之间的5-CNAC。
114.根据权利要求113所述的胶囊剂，其中所述胶囊剂包含约5mg、约10mg、约20mg、约25mg或约30mg的CIVI 008。
115.根据权利要求108至114中任一项所述的胶囊剂，其中所述胶囊剂包含：
10mg的CIVI 008和100mg的5-CNAC；
20mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；
5mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；
10mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；
25mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC；或者
30mg的CIVI 008和200mg的5-CNAC。
116.根据权利要求108至115中任一项所述的胶囊剂，所述胶囊剂进一步含有他汀类。
117.一种治疗有需要的受试者中选自由动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)或冠心病(CHD)组成的组的疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂。
118.一种降低有需要的受试者中PCSK9的表达水平和/或活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂。
119.一种降低有需要的受试者中的胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂。
120.根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂，所述胶囊剂用于治疗选自由以下组成的组的疾患：动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、HDL/LDL胆固醇失衡、冠状动脉疾病(CAD)或冠心病(CHD)。
121.根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂，所述胶囊剂用作用于降低受试者中PCSK9的表达水平和/或活性的药物。
122.根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂，所述胶囊剂用作用于降低受试者中胆固醇水平的药物。
123.一种制造根据权利要求108至116中任一项所述的胶囊剂的方法，所述方法包括：
(i)干共混包含CIVI 008的第一组合物和包含5-CNAC的第二组合物；以及
(ii)将步骤(i)的所得干共混物封装在胶囊中。
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