CN116888267A - 大豆工程化抗性 - Google Patents

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CN116888267A CN202280010968.5A CN202280010968A CN116888267A CN 116888267 A CN116888267 A CN 116888267A CN 202280010968 A CN202280010968 A CN 202280010968A CN 116888267 A CN116888267 A CN 116888267A
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刘清利
C·M·雷诺
谭晓萍
M·朱克维克
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    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Abstract

本发明提供了用于赋予对表达病原体特异性蛋白酶的植物病原体的抗性的组合物、系统和方法。本发明的组合物可以包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与核苷酸序列可操作地连接的启动子，该核苷酸序列编码由层锈菌属或胞囊线虫属植物病原体物种表达的植物病原体特异性蛋白酶的至少一种底物蛋白。此外，至少一种底物蛋白具有层锈菌属特异性或胞囊线虫属特异性异源切割位点，其中该切割位点的切割赋予对层锈菌属或胞囊线虫属植物病原体物种的改善的抗性。

Description

大豆工程化抗性
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月22日提交的美国专利申请号63/140539的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及植物遗传学和植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及包含工程化以被植物病原体特异性蛋白酶识别的新型底物蛋白的组合物，以及使用新型底物蛋白赋予对植物病原体病害抗性的方法。
序列表
本申请附有在2021年12月13日创建的命名为82202_WO_ST25.txt的序列表，其大小为大约234千字节。该序列表通过引用以其全文并入本文。该序列表随同此申请经由EFS-Web提交，并且符合37C.F.R.§1.824(a)(2)-(6)和(b)。
背景技术
大豆是世界上最重要的农作物之一。它在经济上至关重要，因为它是许多领域，诸如食品、蛋白质、油、和其他豆制品的主要来源。有许多威胁大豆产量的病原体(例如，真菌病原体、细菌病原体和线虫)。亚洲大豆锈病(ASR)由真菌病原体豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)引起，是影响豆科作物最具破坏性的病害之一。这种侵袭性病原体起源于东亚，并且于2004年首次在美国大陆被发现。它是一种破坏植物叶子的寄生虫。豆薯层锈菌可以感染超过95种物种，大多数是豆科作物；替代性宿主充当接种物积聚的储存库。病原体感染很快，因为孢子可以直接感染，而无需伤口或开口。如果温度和湿度条件最佳，感染可以在6小时内发生。受感染的植物叶子会出现浸水斑点，然后发展为红棕色或棕褐色病变。受感染的叶子变成青铜色/黄色，并且因此会发生过早落叶，最终影响豆荚数量和种子重量。孢子在空中传播，并且在最佳条件下，植物可以在1-2周内从感染的最初迹象发展到严重落叶。
据报道，由于ASR，产量损失高达80％(参见Kawashima等人(2016)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]34:661-65)。更具体地，ASR在拉丁美洲是毁灭性的，估计在巴西造成约20亿美元的损失。有几种用于ASR的主要控制措施：作物监测、化学杀菌剂、培育抗性大豆品种、和特定栽培方法。植物病害的发病率可以通过农艺实践来控制，包括常规育种技术、作物轮作、和使用合成农用化学品。然而，常规育种方法非常耗时，并且随着植物病原体的进化，需要不断努力来维持病害抗性。参见Grover和Gowthaman(2003)Curr.Sci.[当代科学]84:330-340。同样，农用化学品增加了农民的成本，并对生态系统造成有害影响。由于这样的担忧，监管者已禁止或限制使用一些最有害的农用化学品。
植物寄生线虫也对大豆以及其他作物有害。农业上重要的线虫包括来自例如胞囊线虫属(Heterodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、根结线虫属(Meloidogyne)和肾形线虫属(Rotylenchulus)的物种。大豆胞囊线虫(Heterodera glycines或Soybean CystNematode)，是产生大豆胞囊的病害的原因。这些有害生物是土壤传播的，并且其中许多会攻击多种作物的根部。遗憾的是，线虫造成的损害和损失在生长季节早期不容易被发现。与农作物上的锈病和其他病害一样，减少线虫侵扰、损害和产量损失的方法也很重要。
植物具有先天的免疫反应，可以对某些植物病原体提供一定程度的病害抗性。植物育种家和病理学家已经鉴定了针对植物病原体抗性的天然变异，并且该天然变异可以繁殖到许多植物中。植物对病原体的先天免疫反应的一个组成部分包括天然病害抗性基因(或R基因)，这些基因对特定植物病原体提供高水平的抗性(或免疫力)，并且代表经济和环境友好的植物保护形式。植物对植物病原体的先天病害抗性典型地取决于植物中显性或半显性病害抗性(R)基因的存在以及病原体中显性无毒性(avr)基因的存在。
现在农业科学家可以通过对植物进行基因工程来表达抗病原体多肽从而增强植物对病原体的抗性。例如，已经开发出对叶传和土传真菌病原体表现出增强抗性的马铃薯和烟草植物。参见Lorito等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]95:7860-7865。此外，已经开发出对真菌病原体具有增强抗性的转基因大麦。参见Horvath等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]100:364-369。此外，已开发出转基因玉米和棉花植物以产生Cry内毒素。参见例如，Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.[细胞与分子生命科学]59:417-425；以及Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述]62:775-806。其他作物(包括马铃薯)已被基因工程化以含有类似的内毒素。参见Hussein等人(2006)J.Chem.Ecol.[化学生态学杂志]32:1-8；Kalushkov和Nedved(2005)J.Appl.Entomol.[应用昆虫学杂志]129:401-406以及Dangl等人(2013)Science[科学]341:746-751。田间部署的商用大豆品系的大豆锈病抗性性状逐渐被大豆锈病克服。考虑到植物病原体例如亚洲大豆锈病和大豆胞囊线虫对植物产量和质量的重大影响，需要另外的组合物、系统和方法来保护植物免受植物病原体的侵害。
发明内容
本发明提供了用于赋予对表达病原体特异性蛋白酶的植物病原体的抗性的组合物、系统和方法。植物病原体使用病原体特异性蛋白酶作为感染寄主植物的毒力因子。本发明的各种实施例包括修饰由植物使用的用于检测病原体特异性蛋白酶的蛋白质对的至少一个成员。这些蛋白质对在识别病原体特异性蛋白酶后激活植物的内源防御系统。典型地，这样的蛋白质对包含一个成员，其为病害抗性蛋白(例如R基因的产物)，和另一个成员，其为病原体特异性蛋白酶的底物蛋白质(例如相应的Avr基因的产物)。如图5所示，病原体特异性蛋白酶在切割位点处切割底物蛋白后，底物蛋白与病害抗性蛋白相互作用(例如经由物理结合)，并且蛋白质对的协同作用引发针对植物中的病原体的局部免疫反应(例如，受感染植物细胞/组织中的超敏性程序性细胞死亡反应)。本文的诸位发明人已经认识到，可以通过用对应于目的病原体特异性蛋白酶(即，需要增强对其的抗性的靶标病原体的蛋白酶)的异源蛋白酶切割位点替代底物蛋白中的内源蛋白酶识别序列或切割位点来修饰此类对对给定病原体特异性蛋白酶的特异性。
本发明的组合物包括重组核酸，该重组核酸包含编码植物病原体特异性蛋白酶的至少一种经修饰的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，该经修饰的超敏反应底物蛋白包含异源切割位点(代替内源切割位点)。作为修饰的结果，底物蛋白可以被目的病原体特异性蛋白酶(例如源自靶病原体的蛋白酶，其不同于底物蛋白固有结合的天然病原体的内源蛋白酶)识别和切割，从而赋予表达经修饰的底物蛋白的植物对靶病原体增加的抗性。在一个特定实施例中，目的蛋白酶是由担子菌植物病原体物种表达的蛋白酶，并且至少一种经修饰的底物蛋白被修饰以使担子菌植物病原体特异性异源切割位点代替内源切割位点，其中在异源切割位点处切割经修饰HRS蛋白赋予对担子菌植物病原体物种的增强抗性。在另一个特定实施例中，目的蛋白酶是由线虫纲(例如，胞囊线虫属)植物病原体物种表达的蛋白酶，并且至少一种经修饰的底物蛋白被修饰以具有线虫纲植物病原体特异性异源切割位点代替内源切割位点，其中在异源切割位点处切割经修饰的HRS蛋白赋予对线虫纲植物病原体物种的增强抗性。HRS蛋白可以源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。在特定实施例中，HRS蛋白为PBS1，RIN4，或与PBS1或RIN4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性并保留底物蛋白活性的多肽。植物的HRS蛋白与植物R基因编码的病害抗性蛋白(R蛋白)相互作用以提供针对病原体的先天免疫反应。已在植物中发现了多种R基因，例如RPM1、RPS2和RPS5，并且已知它们通过特异性识别植物病原体特异性蛋白酶(例如拟南芥属中的蛋白酶AvrRpt2和AvrPphB)赋予植物病原体抗性。蛋白酶的识别需要底物蛋白(例如PBS1或RIN4)与抗性蛋白(例如RPS5或RPM1基因的产物)之间的相互作用。相应地，在实施例中，本发明的组合物包含含有编码经修饰的PBS1或RIN4蛋白的核酸序列的核酸，其中用异源切割位点修饰PBS1或RIN4的内源切割位点。在特定实施例中，PBS1或RIN4的内源切割位点被修饰以包含担子菌属物种植物病原体(例如层锈菌属物种病原体)或线虫纲物种植物病原体(例如胞囊线虫属物种病原体)的异源切割位点。
在其他实施例中，将编码超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列与植物中具有活性的启动子可操作地连接。在进一步的实施例中，重组核酸进一步包含表达盒，该表达盒包含在植物中具有活性的启动子，该启动子与R基因可操作地连接，该R基因在异源(例如担子菌特异性或线虫纲特异性)蛋白酶切割位点处切割后被HRS蛋白激活。
在仍进一步的实施例中，本发明包括载体、转化的植物细胞和转化的植物，其包含编码经修饰的HRS蛋白的重组核酸分子，所述经修饰的HRS蛋白包含病原体特异性蛋白酶的异源切割位点。任选地，转化的植物细胞和转化的植物是双子叶植物，而且是大豆属的成员。本发明还涵盖转基因种子或转化植物的其他植物部分。
在一些实施例中，本发明提供了保护植物免受植物病原体物种感染的方法。在特定实施例中，该方法保护植物免受靶标植物物种的感染，该植物针对该靶标植物物种不具有先天免疫性(例如，该植物针对该靶标植物物种不能引发防御反应)。在一个实例中，方法包括将编码由靶标植物病原体物种表达的植物病原体特异性蛋白酶的至少一种超敏反应底物蛋白的核苷酸序列引入植物中的步骤。至少一种底物蛋白具有病原体特异性异源切割位点，并且靶标病原体的蛋白酶对异源切割位点的切割赋予对靶标植物病原体物种的抗性。底物蛋白的异源切割位点被工程化以对靶标植物病原体物种具有特异性，并且从对靶标植物病原体物种不具有特异性的植物内源切割位点对其进行修饰。在前述方法的特定实施例中，植物病原体物种是层锈菌属植物病原体，并且任选地是引起亚洲大豆锈病的豆薯层锈菌。在另一个实施例中，植物病原体物种是线虫纲植物病原体，并且任选地是胞囊线虫属、球胞囊线虫属、根结线虫属或肾形线虫属的成员。在特定实施例中，植物病原体物种是大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode或Heterodera glycines)。
对序列表中的序列的简述
SEQ ID NO:1是拟南芥PBS1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是拟南芥PBS1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是来自拟南芥的RPS5蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是来自拟南芥的RPS5蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是用于驱动具有各种PBS1变体的载体的prGmUbi启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是用于驱动含有RPS5的载体的prMt12344启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是内源切割位点(AvrPphB)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是R1切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是R2切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是R3切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是R4切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是R5切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是R6切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是R7切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是R8切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是R9切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是R10切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是R11切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是R12切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是R13切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是R14切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是R15切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是R16切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是R17切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是R18切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是R19切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是R20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是R21切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是R22切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是S1切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是S2切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是S3切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是S4切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是S5切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是S6切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是S7切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是S8切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是S9切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是S10切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是S11切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是S12切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是S13切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是S14切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是S15切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是S16切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是S17切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是S18切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是S20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是S21切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是S23切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是S24切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是R26(串联)切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R1(SEQ IDNO:8)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:54是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R2(SEQ IDNO:9)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:55是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R3(SEQ IDNO:10)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:56是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R4(SEQ IDNO:11)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:57是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R5(SEQ IDNO:12)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:58是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R6(SEQ IDNO:13)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:59是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R7(SEQ IDNO:14)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:60是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R8(SEQ IDNO:15)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:61是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R9(SEQ IDNO:16)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:62是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R10(SEQ IDNO:17)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:63是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R11(SEQ IDNO:18)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:64是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R12(SEQ IDNO:19)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:65是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R13(SEQ IDNO:20)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:66是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R14(SEQ IDNO:21)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:67是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R15(SEQ IDNO:22)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:68是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R16(SEQ IDNO:23)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:69是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R17(SEQ IDNO:24)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:70是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R18(SEQ IDNO:25)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:71是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R19(SEQ IDNO:26)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:72是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R20(SEQ IDNO:27)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:73是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R21(SEQ IDNO:28)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:74是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R22(SEQ IDNO:29)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:75是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S1(SEQ IDNO:30)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:76是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S2(SEQ IDNO:31)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:77是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S3(SEQ IDNO:32)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:78是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S4(SEQ IDNO:33)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:79是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S5(SEQ IDNO:34)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:80是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S6(SEQ IDNO:35)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:81是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S7(SEQ IDNO:36)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:82是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S8(SEQ IDNO:37)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:83是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S9(SEQ IDNO:38)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:84是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S10(SEQ IDNO:39)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:85是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S11(SEQ IDNO:40)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:86是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S12(SEQ IDNO:41)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:87是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S13(SEQ IDNO:42)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:88是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S14(SEQ IDNO:43)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:89是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S15(SEQ IDNO:44)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:90是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S16(SEQ IDNO:45)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:91是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S17(SEQ IDNO:46)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:92是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S18(SEQ IDNO:47)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:93是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S20(SEQ IDNO:48)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:94是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S21(SEQ IDNO:49)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:95是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S23(SEQ IDNO:50)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:96是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点S24(SEQ IDNO:51)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:97是经修饰的PBS1氨基酸序列；对其修饰以用切割位点R26(SEQ IDNO:52)替代内源切割位点(SEQ ID NO:7)。
SEQ ID NO:98是R2-S5切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99是R2-S6切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:100是R2-S20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:101是R2-S21切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:102是R2-S23切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:103是R2-S24切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:104是R10-S5切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:105是R10-S6切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:106是R10-S20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107是R10-S21切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108是R10-S23切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109是R10-S24切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110是R14-S5切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:111是R14-S6切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:112是R14-S20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113是R14-S21切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:114是R14-S23切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:115是R14-S24切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:116是R17-S5切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:117是R17-S6切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:118是R17-S20切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:119是R17-S21切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:120是R17-S23切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:121是R17-S24切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:122是R19-S5切割位点肽的氨基酸序列。SEQID NO:123是R19-S6切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:124是R19-S20切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:125是R19-S21切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:126是R19-S23切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:127是R19-S24切割位点肽的氨基酸序列。SEQ IDNO:128是R20-S5切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:129是R20-S6切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:130是R20-S20切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:131是R20-S21切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:132是R20-S23切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:133是R20-S24切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:134是R21-S5切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:135是R21-S6切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:136是R21-S20切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:137是R21-S21切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:138是R21-S23切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:139是R21-S24切割位点肽的氨基酸序列。SEQ IDNO:140是R22-S5切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:141是R22-S6切割位点肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:142是R22-S20切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:143是R22-S21切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:144是R22-S23切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:145是R22-S24切割位点肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:146是大豆锈病切割位点的氨基酸基序。
SEQ ID NO:147是线虫切割位点的氨基酸基序。
SEQ ID NO:148是拟南芥RIN4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:149是拟南芥RIN4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:150是glyma.Wm82.gnm4.ann1.Glyma.20G249600.1(拟南芥PBS1的大豆属同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:151是glyma.Lee.gnm1.ann1.GlymaLee.20G209700.1(拟南芥PBS1的大豆属同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:152是glyma.Zh13.gnm1.ann1.SoyZH13_20G232600.m1(拟南芥PBS1的大豆属同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:153是编码拟南芥属PBS1(SEQ ID NO:1)的基因的核苷酸序列，包括5′-UTR和3′-UTR。
附图说明
图1是一些PBS1变体的叶示意图，示出了大豆锈病效应子在普通烟草(N.tobacum)中的切割位点(P+)依赖性细胞死亡与阴性对照(P-)的比较。
图2说明了大豆中3种PBS1变体的广谱大豆锈病抗性。该图分为A-K列，有三行叶子，本文称为顶行(锈病1)、中间行(锈病2)和底行(锈病3)。这三行是指评估期间使用的三种大豆锈病株。A列表示拷贝数量为2的阳性对照事件的叶子。B列表示具有包含1个拷贝的PBS1变体(构建体25327；PBS1-R19)和1个拷贝的RPS5的事件的叶子。C列表示具有包含>2个拷贝的PBS1变体(构建体25327；PBS1-R19)和0个拷贝的RPS5的事件的叶子。D列表示来自大豆对照的叶子。E列表示具有包含1个拷贝的PBS1变体(构建体25326；PBS-R17)和1个拷贝的RPS5的事件的叶子。F列表示具有包含>2个拷贝的PBS1变体(构建体25326；PBS1-R17)和1个拷贝的RPS5的事件的叶子。G列表示具有包含>2个拷贝的PBS1变体(构建体25326；PBS1-R17)和0个拷贝的RPS5的事件的叶子。H列表示来自大豆对照的叶子。I列表示具有包含>2个拷贝的PBS1变体(构建体25328；PBS1-R20)和2个拷贝的RPS5的事件的叶子。J列表示具有包含0个拷贝的PBS1变体(构建体25328；PBS1-R20)和>2个拷贝的RPS5的事件的叶子。K列表示具有包含>2个拷贝的PBS1变体(构建体25328；PBS1-R20)和2个拷贝的RPS5的事件的叶子。
图3代表双元载体(25326)的实例，该双元载体代表R17切割位点肽(SEQ ID NO:24)。组件“cAtPBS1-04”表示经修饰形式的拟南芥PBS1(AvrPphB易感1)基因，其中六个氨基酸从野生型(DKSHVS)突变为R17(QVFEFL)，该基因编码Ser/Thr蛋白激酶。
图4是一些PBS1变体的叶示意图，示出了线虫效应子在普通烟草中的切割位点(P+)依赖性细胞死亡与阴性对照(P-)的比较。
图5是将植物底物蛋白的内源切割位点修饰为对靶标植物病原体特异的异源切割位点从而赋予植物对靶标植物病原体的抗性的方法和系统的示意图。未经修饰的具有内源切割位点的底物蛋白被植物的天然病原体(本实例中为病原体A)识别，由于切割的底物蛋白与天然病原体的R蛋白相互作用导致先天免疫反应。然而，未经修饰的底物蛋白不能被病原体B识别，从而未产生先天免疫反应。因此，植物容易被病原体B感染。在对底物蛋白进行工程化以插入对病原体B特异的异源切割序列后，经修饰的底物蛋白会被识别并切割，从而产生对病原体B的先天免疫反应。这使得植物对病原体B具有抗性。
图6是经修饰的PBS1构建体(SEQ ID NO:53)的示意图，示出了用R17切割位点肽(SEQ ID NO:24)对内源切割位点(SEQ ID NO:7)的修饰，如实例4中所披露的。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。对本文采用的技术的提及旨在是指本领域中通常所理解的技术，包括对本领域普通技术人员而言很清楚的那些技术的变型和/或等效技术的替代物。
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指示。
如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如本文所用，术语“约”当是指一个可测量的值如剂量或时间段等时意在涵盖±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的指定量的变化。如本文所用，短语如“在约X和Y之间”意指“在约X和约Y之间”，并且短语如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非上下文另有说明，如本文所用，例如“在约X和Y之间”、“在约X和约Y之间”、“从X至Y”和“从约X至约Y”(以及类似短语)的短语应被解释为包括X和Y。
如本文所用，“担子菌”或“担子菌植物病原体物种”是指属于分类学分区担子菌门的植物病原体。此分类学分类中包含的植物病原体包括层锈菌属物种的成员，例如导致植物病害亚洲大豆锈病(ASR)的豆薯层锈菌。
如本文所用，“编码序列”或“CDS”是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA)的核酸序列。在实施例中，RNA随后被翻译以产生蛋白质。在示例性实施例中，CDS源自cDNA序列，并且包括DNA注释中转录本的剪接外显子序列，并且不包括任何内含子或5′或3′-非翻译区(UTR)。相比之下，cDNA序列含有DNA注释中相应RNA的整个序列，包括编码序列和未翻译序列。
如本文所用，“密码子优化的”核苷酸序列意指重组的、转基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以如下方式来完成，该方式是为了保持由密码子优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，针对构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、真菌或细菌细胞)对核苷酸序列进行密码子优化。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014。在实施例中，本发明的多核苷酸被密码子优化用于在植物细胞(例如，双子叶植物细胞或单子叶植物细胞)或细菌细胞中表达。
术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如本文所用，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
在核酸序列或蛋白质序列的上下文中，术语“对应于”意指当某些序列的核酸序列或氨基酸序列与彼此比对时，“对应于”在本发明中某些枚举的位置的核酸或氨基酸是与参考序列中的这些位置比对的那些，但相对于本发明的特定核酸序列而言并不一定位于这些精确的数字位置中。可以通过已知算法的计算机化实施方式或者通过目视检查进行用于比较的序列的最佳比对。易于获得的序列比较和多重序列比对算法分别是可在因特网(例如，EMBL-EBI的网站)上获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)和ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega程序。其他合适的程序包括但不限于GAP、BestFit、Plot Similarity和FASTA，它们是可从Accelrys公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)获得的Accelrys GCG软件包的一部分。还参见Smith和Waterman,1981；Needleman和Wunsch,1970；Pearson和Lipman,1988；Ausubel等人1988；以及Sambrook和Russell,2001。
除非另有说明，否则同一性和相似性将通过Needleman-Wunsch全局比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3):443-453，如通过“needle”程序实施，作为EMBOSS软件包(Rice,P.Longden和Bleasby,A.,EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],2000,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6)pp276-277,6.3.1版，获得自EMBnet的embnet.org/resource/emboss and emboss.sourceforge.net以及其他来源)的一部分分布)使用默认空位罚分和评分矩阵(EBLOSUM62用于蛋白质，EDNAFULL用于DNA)进行计算。也可以使用等效程序。通过“等效程序”是指任何序列比较程序，对于任两个所讨论序列，在与通过EMBOSS 6.3.1版的needle生成的相应比对相比时，该程序生成具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
另外的数学算法是本领域已知的并且可以用于比较两个序列。参见例如，Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87:2264的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-5877中进行了改良。将这种算法整合入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403的BLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以利用以下程序进行：利用BLASTN程序(针对核苷酸序列搜索核苷酸查询)以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列，或者利用BLASTX程序(针对蛋白质序列搜索翻译的核苷酸查询)以获得与本发明的核酸分子同源的蛋白质序列。BLAST蛋白质搜索可以利用以下程序进行：利用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索蛋白质查询)以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列，或者利用TBLASTN程序(针对翻译的核苷酸序列搜索蛋白质查询)以获得与本发明的蛋白质分子同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389中所述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。可替代地，可以使用PSI-Blast进行迭代搜索，该迭代搜索检测在分子之间的远的关系。参见Altschul等人(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST、以及PSI-Blast程序时，可以使用对应程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。比对也可以通过检查手动进行。
如本文所用，“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种目的多核苷酸(如编码包含异源切割位点的经修饰的底物蛋白(例如包含异源切割位点的经修饰的PBS1或RIN4)的多核苷酸)的表达的核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至目的多核苷酸(其可操作地连接至终止信号)的启动子。该盒将包括与编码本文提供的多肽的多核苷酸可操作地连接的5'和3'调节序列，该多肽允许多核苷酸的表达。表达盒还可以包含与目的多核苷酸的表达无关的但是为了提供用于从表达载体去除表达盒的方便限制位点而存在的其他多核苷酸。在实施例中，表达盒中的至少一种组分相对于至少一种其他组分(例如，与目的多核苷酸可操作相关联的异源启动子)可以是异源的(即外来的)。表达盒还可以是天然存在的但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，表达盒相对于宿主是异源的，即该表达盒(或甚至目的多核苷酸)不是天然存在于宿主细胞中的，并且已经通过转化方法或育种方法引入到该宿主细胞或其祖先细胞中。该表达盒中的一个或多个目的多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的(如本文更详细描述的)。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。该盒另外可以含有待共转化至生物体中的至少一个另外的基因或遗传元件。在包括另外的基因或元件的情况下，这些组分是可操作地连接的。替代性地，另外的一个或多个基因或元件可以提供在多个表达盒上。
如本文所用，术语“增强的植物病原体抗性”、“增强的病害抗性”和“赋予或增强对植物病原体的抗性”是指与一种或多种对照植物相比，尽管植物被靶标植物病原体(例如植物对其不具有先天免疫性的植物病原体)感染，但该植物耐受和/或茁壮成长的能力有改善、增强或增加。增强的植物病原体抗性包括对植物病原体的抗性的任何统计学上显著的增加，包括例如增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。对照植物可以是表达具有未经修饰的切割位点的内源底物蛋白的植物，其中未经修饰的切割位点不能被靶标病原体的蛋白酶识别或切割。因此，在对靶标病原体感染有反应的植物中不会引发强烈的免疫反应(例如，不引发免疫反应或引发弱的免疫反应)。这样的对照植物对病原体完全易感或者可能对病原体具有有限的抗性。具有增强的病害抗性的植物表达经修饰的底物蛋白(例如，经修饰的PBS1或经修饰的RIN4)，其中内源切割位点经由包含一个或多个选择性突变而工程化为异源切割位点，该异源切割位点被靶标病原体的蛋白酶识别并切割。作为包含异源切割位点的经修饰底物蛋白表达的结果，在植物中引发免疫反应，从而减少指示靶标病原体感染的症状的表达。在示例性实施例中，将底物蛋白工程化以包括针对担子菌物种特异性植物病原体(例如疫霉菌(Pytophthora)物种植物病原体(例如，引起亚洲大豆锈病的病原体)或线虫纲物种植物病原体，例如胞囊线虫属植物病原体(例如引起大豆胞囊的病原体))的异源切割位点。
赋予或增强针对植物病原体的抗性可以包括增加(部分或完全增加)与植物病原体特异性蛋白酶依赖性细胞死亡(本文也称为“超敏反应”)相关的表型特征。在一个实施例中，增强的抗性与更大程度的超敏反应相关，包括但不限于电解质从感染位点渗漏增加。
如本文所用，术语“内源”是指起源于生物体或细胞内的物质。相反，“异源(heterogenous或heterologous)”是指由于将修饰人工引入其内源状态而并非天然源自生物体或细胞内的材料。例如，本发明的包含切割肽序列(该肽序列从内源序列被修饰(经由一个或多个氨基酸取代)从而被靶标病原体特异性蛋白酶识别)的经修饰植物HRS蛋白是具有异源序列的经修饰HRS蛋白。因此，具有内源切割肽序列的未经修饰蛋白质将不会被靶标病原体识别，并且不会在植物中引发相应的免疫反应。
术语“基因”或“基因组序列”意指包含染色体DNA、基因组DNA、质粒DNA、cDNA、人工DNA多核苷酸或编码目的多肽的其他DNA的核酸。在特定实施例中，基因的核酸序列编码蛋白质，该蛋白质在表达时至少部分地负责特定特征或性状。在实施例中，基因可以是天然的、经修饰的(例如，通过定向重组或位点特异性突变)或合成的。在示例性实施例中，基因在细胞中被转录成RNA分子(例如，mRNA)，其中RNA可以编码目的肽、多肽或蛋白质，并且在一些实例中，还可以编码在编码序列侧翼的遗传元件，这些遗传元件参与调节本发明的mRNA或多肽的表达。因此，基因可以包含数个可操作地连接的序列，例如启动子序列、5′前导序列(包括例如参与翻译起始的序列)、(蛋白质)编码区(包含cDNA或基因组DNA)、3′非翻译序列(包含例如转录终止序列位点、内含子(例如，一个或多个天然、外来或经修饰的内含子))。在示例性实施例中，分离基因的核酸序列可包含内含子、外显子、5′或3′-非翻译区(UTR)和天然调节元件(例如，天然启动子)。在其他示例性实施例中，基因包含用于目的多肽的编码序列，而不包含任何调节元件(例如，不含任何天然或外来内含子，含有一些被外来或经修饰的内含子替代的天然内含子，不含任何未翻译的序列，或含有被外来、异源或经修饰的调节元件替代的天然调节元件)。
如本文所用，在特定实施例中，“R基因”或“抗性基因”是指编码R-蛋白或抗性蛋白的核酸(例如，DNA序列)，当其在植物细胞中表达时，可以赋予植物细胞和/或包含该植物细胞的植物对一种或多种植物病原体的增加的抗性。在实施例中，R基因可以包含与相应R蛋白的一个或多个结构域相关联的一个或多个基序。例如，实施例中，R基因可以包含TNL基序，该TNL基序包含Toll/白细胞介素-1受体(TIR)基序、核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸的重复序列(LRR)基序。当表达时，TNL基序编码R蛋白中的TNL基序，该TNL基序包含Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域、核苷酸结合位点(NBS)结构域和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域。示例性R基因和由相应R基因编码的R蛋白(包括RPS1-5)是已知的(参见例如，Warren等人Genetics[遗传学](1999)、US 7696410、WO 2019182884A1等，所有这些文献均通过引用并入本文)。如本文所用，“重组”是指核酸(例如，DNA或RNA)和/或蛋白质和/或生物的如下形式，该形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。这样的人为干预可能会产生重组核酸分子和/或重组植物。如本文所用，“重组DNA分子”是包含DNA分子组合的DNA分子，组合中的这些DNA分子不会天然地一起存在并且是人为干预的结果，例如，由至少两种彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或人工合成的并且包括偏离通常存在于自然界中的多核苷酸的多核苷酸的DNA分子，和/或人工掺入宿主细胞基因组DNA和该宿主细胞基因组的相关侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例是由将转基因或基因组修饰(即，基因编辑)插入至植物的基因组DNA而产生的DNA分子，这可以最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。如本文所用，“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且含有掺入至其基因组中的转基因和/或异源DNA分子和/或基因组修饰(即，基因编辑)。由于这样的基因组改变，重组植物明显不同于相关的野生型植物。
编码病原体特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白的重组核酸分子的实例包括编码PBS1的核苷酸序列，其中该PBS1的内源切割位点(SEQ ID NO:7)被异源切割位点(SEQ IDNO:24)替代，如SEQ ID NO:69中所示。编码病原体特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白的重组核酸分子的另一个实例包括编码RIN4的核苷酸序列，其中该RIN4的内源切割位点被异源TEV蛋白酶切割位点替代。
对于核苷酸序列，“变体”是指与如本文所述的重组核酸分子的核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，例如，基本上相似的编码经修饰底物蛋白的核苷酸序列。对于核苷酸序列，变体包含以下核苷酸序列：与如本文所述的重组核酸分子的核苷酸序列相比，该核苷酸序列在5′和/或3′末端处具有缺失(即，截短)、在一个或多个内部位点处具有一个或多个核苷酸的缺失和/或添加；并且/或者与本文所述的重组核酸分子的核苷酸序列相比，该核苷酸序列在一个或多个位点处具有一个或多个核苷酸的取代。本领域技术人员理解，变体是以保持开放阅读框架的方式构建的。
保守的变体包含那些(由于遗传密码的简并性)产生本文所述的在功能上具有活性的经修饰底物蛋白的核苷酸序列。可以通过使用熟知的分子生物学技术(例如，聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)来鉴定天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还可以包括以合成方式衍生的序列，例如通过定点诱变产生的但仍提供在功能上具有活性的经修饰底物蛋白的那些序列。通常，如本文所述的重组核酸分子的核苷酸序列的变体将与重组核酸分子的核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所确定。
如本文所用，“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA聚合物或多脱氧核糖核苷酸或者RNA聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含对生物RNA或DNA来说不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本发明的特定核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。
如本文所用，“启动子”是指多核苷酸，通常在表达盒中的它的编码多核苷酸的上游(5')，它通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码多核苷酸的表达。启动子是能够结合RNA聚合酶并且启动下游(3′方向)编码序列的转录的调节元件。许多启动子可用于表达盒中，包括编码HRS蛋白的基因的天然启动子或编码R蛋白的R基因的天然启动子。
可替代地，可以根据所希望的结果来选择启动子。这样的启动子包括但不限于“组成型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达不受调节，因此是连续的)、“诱导型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调节蛋白等抑制)和“组织偏好型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达，相对于其他组织，在偏好组织中较高，例如相对于其他植物组织，在叶组织中较高)。
如本文所用，“植物启动子”意指驱动在植物中表达的启动子，例如用于在植物中使用的组成型、诱导型(例如化学、环境、病原体或伤口诱导)、阻抑型、组织偏好型或其他启动子。
示例性启动子示出于WO 99/43838和美国专利号：8,575,425、7,790,846、8,147,856、8,586832、7,772,369、7,534,939、6,072,050、5,659,026、5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142、和6,177,611中，这些文献通过引用并入本文。示例性组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell等人(985)Nature[自然]313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2:163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581 -588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学组织杂志]3:2723-2730)。示例性诱导型启动子包括那些驱动病程相关蛋白(PR蛋白)表达的启动子，这些蛋白在病原体感染后被诱导。参见例如，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89:245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4:111-116；以及WO 99/43819，这些文献通过引用并入本文。也可使用在病原体感染部位或附近局部表达的启动子(Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9:335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2:325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83:2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]2:93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93:14972-14977；Chen等人(1996)Plant J.[植物杂志]10:955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.[植物杂志]3:191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1:961-968；Cordero等人(1992)Physiol.Mol.PlantPath.[生理学与分子植物病理学]41:189-200；美国专利号5,750,386(可诱导线虫的)；以及其中引用的参考文献)。
伤口诱导型启动子包括pin II启动子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年评]28:425-449；Ouan等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:494-498)；wunl和wun2(美国专利号5,428,148)；winl和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]215:200-208)；系统素(McGurl等人(1992)Science[科学]225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters[欧洲生化学会联盟通讯]323:73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.[植物杂志]6(2):141-150)；等等，这些文献通过引用并入本文。
用于在本发明中使用的组织偏好型启动子包括在以下文献中所示的那些：Yamamoto等人(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kawamata等人(1997)PlantCell Physiol.[植物细胞生理学]38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.[分子遗传学和普通遗传学]254(3):337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2):157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(3):1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):525-535；Canevascim等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果与问题]20:181-196；Orozco等人(1993)PlantMolBiol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.[植物杂志]4(3):495-505。
叶偏好型启动子包括在以下文献中所示的那些：Yamamoto等人(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105:357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Gotor等人(1993)Plant J.[植物杂志]3:509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590。
根偏好型启动子是已知的并且包括在以下文献中的那些：Hire等人(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10):1051-1061(根特异性对照元件)；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3):433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因)；以及Miao等人(1991)PlantCell[植物细胞]3(1):11-22(胞质谷氨酰胺合成酶(GS))；Bogusz等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7):633-641；Leach和Aoyagi(1991)Plant Science[植物科学](利默里克市(Limerick))79(l):69-76(rolC和rolD)；Teeri等人(1989)EMBO J.[欧洲分子生物学组织杂志]8(2):343-350；Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4):759-772(VfENOD-GRP3基因启动子)；以及Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4):681-691(rolB启动子)。还参见美国专利号5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732、和5,023,179。
如本文所用，“可操作地连接”是指在单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸或功能RNA的表达时(即，该编码多核苷酸或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码多核苷酸或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。
如本文所用，“启动子”是指多核苷酸，通常在它的编码多核苷酸的上游(5')，它通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码多核苷酸的表达。
如本文所用，“底物蛋白”是指酶对其反应的分子。例如在本发明中，底物蛋白包括超敏反应底物(HRS)蛋白，例如PBS1和RIN4，这些蛋白被病原体特异性蛋白酶识别和切割，导致植物中对病原体的超敏防御反应。特别地，病原体特异性蛋白酶，在识别底物蛋白中的病原体特异性切割序列后，在切割序列处结合并切割底物蛋白。然后，切割的底物蛋白能够与植物的抗性蛋白相互作用，从而引发超敏反应。
如本文所用，“蛋白酶”是指分解蛋白质和肽的酶。
如本文所用，“植物病原体”是指对植物造成病害的任何生物体。植物病原体的实例包括但不限于病毒、真菌、细菌和线虫。
如本文所用，“超敏反应底物蛋白(HRS)”是指如上所述的底物蛋白，其中对蛋白质的活性导致植物的超敏反应。
如本文所用，“超敏反应”是指在病原体进入植物时植物对病原体的快速局部免疫反应。该反应用于防止所述病原体感染的进一步传播，并使得局部区域的细胞快速死亡。
如本文所用，“PBS1”是指参与植物防御的蛋白激酶超家族蛋白，并且先前已在例如美国专利号9,816,102中披露。防御机制可能是由病害抗性(R)蛋白RPS5介导的。如本领域技术人员所理解的，“PBS1”是指avrPphB易感1。通过“PBS1活性”是指当被病原体特异性蛋白酶识别和切割时，多肽在植物中引发对病原体的超敏防御反应。特别地，病原体特异性蛋白酶，在识别PBS1多肽中的病原体特异性切割序列后，在切割序列处结合并切割PBS1多肽。然后，切割的PBS1底物蛋白能够与植物的抗性蛋白相互作用，从而引发超敏反应(图5示出了底物蛋白和病原体特异性蛋白酶之间这种相互作用的简化示例)。
如本文所用，“RIN4”是指像PBS1一样的植物防御调节剂。如本领域技术人员所理解的，“RIN4”是指对丁香假单胞杆菌斑点致病变种1(Pseudomonas syringaepv.maculicola 1，“RPM1”)具有抗性的相互作用蛋白4。通过“RIN4活性”是指被病原体特异性蛋白酶识别和切割的多肽在植物中引发对病原体的超敏防御反应。特别地，病原体特异性蛋白酶，在识别RIN4多肽中的病原体特异性切割序列后，在切割序列处结合并切割RIN4多肽。然后，切割的RIN4多肽能够与植物的抗性蛋白相互作用，从而引发超敏反应。
如本文所用，“RPS5”是指由Rps5基因编码的病害抗性蛋白。抗性蛋白与被病原体蛋白酶切割的底物蛋白片段相互作用，使得表达抗性蛋白的植物能够引发先天免疫反应，从而赋予植物对特定植物病原体的抗性。
如本文所用，在提及基因或核酸使用时，“异源的”是指编码因子的基因不在其自然环境中(即，已经人为改变)。例如，异源基因可以包括从一个物种引入另一个物种中的基因。异源基因还可以包括对生物来说是天然的基因，该基因已经以某种方式加以改变(例如，突变、以多个拷贝添加、连接至非天然启动子或增强子多核苷酸等)。异源基因可以包括植物基因多核苷酸，该植物基因多核苷酸包括植物基因的cDNA形式；这些cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生一种与mRNA转录本是互补的反义RNA转录本)被表达。在本发明的一个方面，异源基因与内源植物基因的区别在于，该异源基因多核苷酸典型地与包含调节元件如启动子的多核苷酸接合，未发现这些多核苷酸与该异源基因编码的蛋白质的基因或与染色体中的植物基因多核苷酸天然地相关联，或者这些多核苷酸与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在通常不表达该基因的基因座中表达的基因)相关联。另外，在实施例中，“异源的”多核苷酸是不与引入它的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多个拷贝。
如本文所用，“切割位点”是指可被位点特异性蛋白酶切割或剪短的特定肽序列(或基序)。蛋白酶可能是病原体特异性的。源自特定病原体的给定蛋白酶识别特定的切割位点序列或其变体。
“担子菌特异性切割位点”或“担子菌特异性切割序列”是指被担子菌植物病原体(例如，层锈菌属植物病原体，包括但不限于引起亚洲大豆锈病(ASR)的豆薯层锈菌)特异性识别的切割位点或氨基酸序列。在其中“担子菌特异性切割序列”对豆薯层锈菌具有特异性和/或是被评估用于赋予对亚洲大豆锈病的抗性的切割序列的实施例中，切割序列/肽在本文中也可以称为“大豆锈病切割肽”。
“线虫特异性切割位点”或“线虫特异性切割序列”是指被线虫植物病原体(例如，胞囊线虫属植物病原体，包括但不限于引起大豆胞囊的大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines或Soybean Cyst Nematode(SCN)))特异性识别的切割位点或氨基酸序列。在其中“线虫特异性切割序列”对大豆胞囊线虫具有特异性和/或是被评估用于赋予对SCN的抗性的切割序列的实施例中，切割序列/肽在本文中也可以称为“大豆胞囊切割肽”。
如本文所用，术语“赋予病原体抗性”、“赋予病害抗性”和“赋予或增强对病原体的抗性”是指与一种或多种对照植物(例如包含内源底物蛋白的对照植物，该内源底物蛋白未被修饰以包含异源R基因或与增强的对相应病原体/病害的病原体抗性相关的标志物的切割位点)相比，尽管植物被植物病原体感染，但该植物耐受和/或茁壮成长的能力有改善、增强或增加，该植物病原体是植物对其不具有先天免疫性的植物病原体(例如，担子菌物种病原体，例如层锈菌属植物病原体，包括但不限于引起亚洲大豆锈病的豆薯层锈菌)。对照植物可能对病原体完全易感或对病原体具有有限的抗性。增强的病害抗性包括减少指示对应的病害(如亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、疫霉菌等)感染的症状表达的任何机制(除了全株植物免疫或抗性)。赋予或增强抗性可能包括减少(部分减少或完全减少)与对病原体易感性相关的症状或表型特征和/或增加与对病原体抗性相关的表型特征。在示例性实施例中，赋予或增加对亚洲大豆锈病的抗性可以包括在感染引起亚洲大豆锈病的病原体后植物中超敏反应的增加。
如本文所用，“改善的抗性”是指与对照植物相比，对病原体表现出更大的抗性。
如本文所用，“载体”是指含有并携带经修饰遗传物质的试剂。例如，载体可以是质粒或病毒。
如本文所用，“双子叶植物”是指双子叶的植物，这意味着是其种子具有两片胚叶(子叶)的植物。
如本文所用，核苷酸或氨基酸序列的“同源性”“序列相似性”或“序列同一性”意指两个或更多个序列的同一性或相似性程度，并且可以常规地通过使用已知软件或计算机程序(如Best-Fit或Gap成对比较程序(GCG威斯康星软件包(Wisconsin Package)，威斯康星州麦迪逊科学先驱路575号遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)53711))确定。BestFit使用Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics[应用数学进展]2:482-489(1981)的局部同源性算法以找到两个序列之间最佳的同一性或相似性区段。通常通过在比较窗口上比较这两个序列的部分来进行两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列比较，以鉴定并比较序列相似性的局部区域。比较窗口通常是从约20至200个连续核苷酸。Gap使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453(1970)的方法执行所有一个序列与所有另一个相似序列的全局比对。当使用序列比对程序(如BestFit)来确定DNA序列同源性、相似性或同一性的程度时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵以优化同一性、相似性或同源性评分。类似地，当使用程序(如BestFit)来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵(如blosum45或blosum80)以优化同一性、相似性或同源性评分。
本发明尤其涉及重组核酸分子。在一个实施例中，核酸分子包含编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列。HRS蛋白包含异源担子菌特异性蛋白酶切割位点，其中切割位点的切割赋予植物对担子菌植物病原体物种的改善的抗性。
HRS蛋白可以是SEQ ID NO:1的PBS1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列(其中PBS1多肽的变体保留PBS1活性)，可以是SEQ ID NO:148的RIN4或与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列(其中RIN4多肽的变体保留RIN4活性)。例如，先前已披露了PBS1(参见例如，美国专利号9,816,102，其通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，HRS蛋白是来自大豆属物种的PBS1的同源物，该同源物与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％序列同一性，例如SEQ ID NO:150-152的同源物。在进一步的实施例中，HRS蛋白可以是www.researchsquare.com/article/rs-548382/v1(将其内容通过引用以其全文并入本文)中列出的任一大豆属PBS1同源物，包括但不限于以下任一大豆属同源物：glyma.Wm82.gnm4.ann1.Glyma.20G249600.1(SEQ ID NO:150)、glyma.Lee.gnm1.ann1.GlymaLee.20G209700.1(SEQ ID NO:151)、glyma.Zh13.gnm1.ann1.SoyZH13_20G232600.m1(SEQ ID NO:152)、glyso.PI483463.gnm1.ann1.GlysoPI483463.20G209800.1、glyso.W05.gnm1.ann1.Glysoja.20G055149.1、glycy.G1267.gnm1.ann1.Gcy20g056490.1、glysy.G1300.gnm1.ann1.Gsy20g055379.1、glyst.G1974.gnm1.ann1.Gst20g055837.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt20g056563.1、glyfa.G1718.gnm1.ann1.Gfa10g029889.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt39g108488.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt39g108489.1、glytoD3.G1403.gnm1.ann1.Gto18g048507.1、glytoD3.G1403.gnm1.ann1.Gto18g048508.1、glyma.Wm82.gnm4.ann1.Glyma.10G298400.1、glytoD3.G1403.gnm1.ann1.Gto19g051689.1、glysy.G1300.gnm1.ann1.Gsy10g028237.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt27g073198.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt27g073199.1、glyma.Lee.gnm1.ann1.GlymaLee.10G256900.1、glyso.W05.gnm1.ann1.Glysoja.10G028545.1、glyfa.G1718.gnm1.ann1.Gfa10g029932.1、glyso.PI483463.gnm1.ann1.GlysoPI483463.10G254200.1、glyma.Zh13.gnm1.ann1.SoyZH13_10G276200.m1、glycy.G1267.gnm1.ann1.Gcy10g025851.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt10g028972.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt10g028974.1、glyma.Wm82.gnm4.ann1.Glyma.08G360600.1、glyma.Lee.gnm1.ann1.GlymaLee.08G321900.1、glyso.PI483463.gnm1.ann1.GlysoPI483463.08G318000.1、glyma.Zh13.gnm1.ann1.SoyZH13_08G339400.m1、glyso.W05.gnm1.ann1.Glysoja.08G022682.1、glycy.G1267.gnm1.ann1.Gcy8g019398.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt30g083024.1、glytoD3.G1403.gnm1.ann1.Gto10g026268.1、glyst.G1974.gnm1.ann1.Gst8g021434.1、glysy.G1300.gnm1.ann1.Gsy8g021268.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt8g021843.1、glyfa.G1718.gnm1.ann1.Gfa8g022769.1、glycy.G1267.gnm1.ann1.Gcy18g050446.1、glyma.Zh13.gnm1.ann1.SoyZH13_18G268200.m1、glysy.G1300.gnm1.ann1.Gsy18g049180.1、glyma.Wm82.gnm4.ann1.Glyma.18G301000.1、glydo.G1134.gnm1.ann1.Gtt18g050188.1和glytoD3.G1403.gnm1.ann1.Gto20g056848.1。大豆属同源物的序列也可以在https://v1.legumefederation.org/data/v2/Glycine和/或www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB44023中找到。
在具体实施例中，异源担子菌特异性蛋白酶切割位点由选自由以下组成的组的切割序列编码：编码SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28、29或52中的至少一个的序列，或与SEQID NO:9、17、21、24、26、27、28、29或52具有至少65％同一性的序列，或编码SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28、29或52并且其中具有至少1、2或3个氨基酸取代的序列。切割位点的切割使得对植物病原体物种的抗性得到改善。切割序列可以包括编码具有六个氨基酸的氨基酸基序的序列。在六个氨基酸基序中，第一位置是精氨酸、组氨酸、色氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、缬氨酸或天冬酰胺；第二位置是亮氨酸或酪氨酸；第三位置是色氨酸、缬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸；第四位置是苯丙氨酸或色氨酸；第五位置是丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；以及第六位置是亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、缬氨酸或苏氨酸。
切割序列编码具有氨基酸数目在5至35个氨基酸范围内的氨基酸序列。在具体实施例中，切割序列编码：具有5至35个氨基酸并且包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在其他实施例中，切割序列编码包含以下中至少一个的氨基酸序列：RWWFAL(SEQID NO:8)、HWVNFL(SEQ ID NO:9)、WAELVL(SEQ ID NO:10)、PIISLA(SEQ ID NO:11)、WFYVLQ(SEQ ID NO:12)、LTEMFM(SEQ ID NO:13)、GQYFVW(SEQ ID NO:14)、YWTTLF(SEQ ID NO:15)、IQMLWA(SEQ ID NO:16)、YARFYL(SEQ ID NO:17)、LAKLWY(SEQ ID NO:18)、YFWLVR(SEQID NO:19)、GFWLSF(SEQ ID NO:20)、TLEEWF(SEQ ID NO:21)、QQLFVV(SEP ID NO:22)、MRFYFT(SEP ID NO:23)、QVFEFL(SEQ ID NO:24)、VYYFYR(SEQ ID NO:25)、QMIFLR(SEQ IDNO:26)、IFLWSA(SEQ ID NO:27)、NLEFLY(SEQ ID NO:28)、TFTFFQ(SEQ ID NO:29)或TLEEWFQVFEFL(SEQ ID NO:52)。
重组核酸分子的HRS蛋白可以是PBS1或RIN4中的至少一种。PBS1或RIN4可以源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属，其中至少一种PBS1蛋白是氨基酸SEQ ID NO:1或与SEQID NO:2的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(其中变体保留PBS1活性)。当HRS蛋白是RIN4时，其是氨基酸SEQ ID NO:148或与SEQID NO:148的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(其中变体保留RIN4活性)。
切割位点的位置可以因实施例而异。在一个实施例中，异源担子菌特异性切割位点或异源线虫纲特异性切割位点位于HRS蛋白的氨基酸位置150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310或310-320之间。在其他实施例中，异源担子菌特异性切割位点或异源线虫纲特异性切割位点位于野生型底物蛋白(例如，参考PBS1(SEQ ID NO:1))的氨基酸位置150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310或310-320之间。在特定实施例中，异源担子菌特异性切割位点或异源线虫纲特异性切割位点位于PBS1(SEQID NO:1)的氨基酸位置230-240、240-250、238-248或241-246之间。
在其他实施例中，参考经修饰的HRS蛋白，例如经修饰的PBS1(例如，SEQ ID NO:53-97中的任一个)，异源担子菌特异性异源切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间，或位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置254之间。在一个特定实施例中，参考SEQ ID NO:74的经修饰PBS1，异源担子菌特异性异源切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在其他实施例中，参考SEQ ID NO:1和53-73中的任一个，切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在另一个特定实施例中，参考SEQ ID NO:97的经修饰的PBS1，切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置254之间。
在实施例中，经修饰的底物蛋白包括核苷酸序列，该核苷酸序列在被编码时，用异源切割位点替代未经修饰底物蛋白的内源切割位点，例如通过插入内源切割序列的6-mer、12-mer、18-mer氨基酸取代来实现。在一个特定实施例中，PBS1的内源切割序列包含在约氨基酸241和约氨基酸246之间(参考SEQ ID NO:1)的6-mer氨基酸序列，并且经修饰的底物蛋白被工程化以用供选择的6-mer氨基酸序列替代在约氨基酸241和约氨基酸246之间(参考SEQ ID NO:1)的内源6-mer氨基酸序列，从而产生经修饰的底物蛋白。在其他实施例中，经修饰的底物蛋白被工程化以用供选择的12-mer、18-mer(或6-mer的其他倍数)氨基酸序列替代在约氨基酸241和约氨基酸246之间(参考SEQ ID NO:1)的内源6-mer氨基酸序列，从而产生经修饰的底物蛋白。
在一些实施例中，编码至少一种底物蛋白的核苷酸含有编码天然切割位点的核苷酸序列。在一些实施例中，编码天然切割位点的核苷酸序列被编码异源切割位点的核苷酸序列替代，该异源切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间(参考SEQ IDNO:1和53-97中任一个，例如参考SEQ ID NO:74)。
在一个实施例中，担子菌植物病原体物种是层锈菌属植物病原体物种。在另一个实施例中，层锈菌属植物病原体物种是豆薯层锈菌，并且任选地，病害是亚洲大豆锈病。另一个实施例涉及经修饰的底物蛋白，其由前文提到的核酸分子编码，是由层锈菌属植物病原体物种表达的植物病原体特异性蛋白酶的底物蛋白。所述经修饰的底物蛋白包含具有层锈菌属特异性异源切割位点的氨基酸序列。底物蛋白由上述重组核酸分子编码。
在另一个实施例中涵盖载体。
在实施例中，内源底物蛋白的内源切割序列被SEQ ID NO:8-51和98-145中的任一个的异源切割序列取代。在一个示例性实施例中，底物蛋白PBS1(SEQ ID NO:1)的6-mer内源切割序列(SEQ ID NO:7)被SEQ ID NO:8-51和98-145中任一个的异源切割序列取代。在其他实施例中，底物蛋白PBS1(SEQ ID NO:1)的6-mer内源切割序列(SEQ ID NO:7)被SEQID NO:52和98-145中任一个的12-mer异源切割序列取代。
在实施例中，内源底物蛋白的内源切割序列被包含组合或串联的一个或多个异源序列的异源切割序列取代。例如，异源切割序列可以包含串联的两个、三个、四个或更多个担子菌特异性切割序列，串联的两个、三个、四个或更多个线虫特异性切割序列，或串联的两个、三个、四个或更多个担子菌特异性和线虫特异性切割序列。在实施例中，经修饰的PBS1底物蛋白包含异源切割序列，该异源切割序列包含选自SEQ ID NO:8-29中任一个的第一担子菌特异性切割序列和选自SEQ ID NO:8-29中任一个的第二担子菌特异性切割序列。在一个特定实施例中，异源切割序列PBS-R26(SEQ ID NO:52)是包含以下氨基酸序列的肽，该氨基酸序列包含串联的两个不同的担子菌特异性切割序列R14(SEQ ID NO:14)和R17(SEQ ID NO:24)。在其他实施例中，经修饰的PBS1底物蛋白包含异源切割序列，该异源切割序列包含选自SEQ ID NO:30-51中任一个的第一线虫特异性切割序列和选自SEQ ID NO:30-51中任一个的第二担子菌特异性切割序列。在仍其他实施例中，经修饰的PBS1底物蛋白包含异源切割序列，该异源切割序列包含选自SEQ ID NO:8-29中任一个的第一担子菌特异性切割序列和选自SEQ ID NO:30-51中任一个的第二线虫特异性切割序列，从而赋予植物对担子菌植物病原体和线虫植物病原体的改善的抗性。
在另一个实例中，可以构建含有担子菌特异性和线虫特异性切割位点的底物蛋白。切割位点的长度可为12-35个氨基酸。切割位点的切割应使得对大豆锈病和线虫损害两者的抵抗力均增强。包含担子菌特异性和线虫特异性切割位点的示例性序列肽示出于SEQID NO:98-145。这些肽可以包括例如，包含以下的组合的肽：至少一种担子菌特异性切割位点序列(例如，大豆锈病切割位点序列)，例如选自SEQ ID NO:8-29的切割序列；和至少一种线虫特异性切割位点序列(例如，大豆胞囊线虫切割位点序列)，例如选自SEQ ID NO:98-145的切割序列。在一些实施例中，肽是包含串联的至少一种大豆锈病切割位点序列和至少一种大豆胞囊线虫切割位点序列的串联肽。
因此，在其他实施例中，本披露涉及含有担子菌特异性和线虫特异性切割位点的底物蛋白。切割位点的长度可为12-35个氨基酸。切割位点的切割使得对大豆锈病和线虫损害两者的抵抗力均增强。
进一步提供了包含编码本文披露的重组HRS蛋白的核酸序列的植物、植物细胞、植物部分和种子。具有重组多核苷酸的植物可以繁殖以产生子代植物，并且子代植物已将编码重组HRS多肽的多核苷酸稳定地整合至其基因组中。术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后裔。术语“稳定整合”是指将核酸序列引入植物的基因组中并且所述核酸序列能够由其子代遗传。
如本文所用，术语“植物部分”表明植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下的单细胞和组织：花粉、胚珠、接合子、叶、胚、根、根尖、花药、花、花器部分、果实、茎、芽、插条和种子；以及花粉、胚珠、卵细胞、接合子、叶、胚、根、根尖、花药、花、花器部分、果实、茎、芽、插条、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。
在具体实施例中，转化的植物细胞和转化的植物是双子叶植物，而且任选地是大豆属的成员。其他实施例包括转化的植物的转基因种子。此外，在又另一个实施例中，上述切割位点的切割激活RPS5蛋白，并且RPS5蛋白与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且引发细胞死亡反应。在具体实施例中，异源的RPS5蛋白拷贝或RPS5蛋白与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且引发细胞死亡反应，将其引入植物或植物细胞中。
可以通过多种方式将核酸序列引入植物细胞，例如通过转化、通过基因组修饰技术(例如通过基因组编辑)或通过育种。在一个方面，可以通过将编码本文披露的重组HRS多肽的核酸序列转化至受体植物中来产生植物。在一个方面，该方法可以包括编辑受体植物的基因组，使得所得植物包含编码上文披露的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，该方法包括将本文披露的多核苷酸或其活性变体或片段转化至受体植物中以获得转基因植物，并且所述转基因植物对目的病原体具有增加的抗性。包含编码如上所述的多肽的多核苷酸的表达盒可用于转化目的植物。
如本文所用，术语“转基因”及其语法变体是指其中异源核酸被整合到基因组中的植物，包括源自植物的任何部分，例如细胞、组织或器官。在具体实施例中，异源核酸是包含一个或多个核酸的重组构建体、载体或表达盒。在其他实施例中，转基因植物通过基因工程方法产生，例如农杆菌转化。通过基因技术，将异源核酸稳定整合到染色体中，使下一代也可以是转基因的。
转化产生转化的植物，包括整株植物以及植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。转化可以使得核酸稳定或瞬时整合到细胞中。“稳定转化”旨在意指被引入宿主细胞中的核苷酸构建体整合到宿主细胞的基因组中并且能够被其子代遗传。
用于转化的方法典型地涉及将核苷酸构建体引入到植物中。在一些实施例中，转化方法是农杆菌介导的转化。在一些实施例中，转化方法是基因枪法介导的转化。转化还可以通过以下方式进行：感染、转染、显微注射、电穿孔、微喷射(microprojection)、基因枪法或粒子轰击、电穿孔、二氧化硅/碳纤维、超声介导、PEG介导、磷酸钙共沉淀、聚阳离子DMSO技术、DEAE葡聚糖程序、农杆菌和病毒介导(例如，花椰菜病毒、双生病毒、RNA植物病毒)、脂质体介导等。
转化方案以及将多肽或多苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。用于转化的方法是本领域已知的，并且包括以下中所示的那些：美国专利号8,575,425、7,692,068、8,802,934、和7,541,517，将这些文献中的每一篇通过引用并入本文。还参见,Rakoczy-Trojanowska,M.(2002)Cell Mol Biol Lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858；Jones等人(2005)PlantMethods[植物方法],第1卷,第5篇；Rivera等人(2012)Physics of Life Reviews[生命物理学评论]9:308-345；Bartlett等人(2008)Plant Methods[植物方法]4:1-12；Bates,G.W.(1999)Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]111:359-366；Binns和Thomashow(1988)Annual Reviews in Microbiology[微生物学年度评论]42:57Sup'/Sup5-606；Christou,P.(1992)The Plant Journal[植物杂志]2:275-281；Christou,P.(1995)Euphytica[荷兰植物育种杂志]85:13-27；Tzfira等人(2004)TRENDS in Genetics[遗传学趋势]20:375-383；Yao等人(2006)Journal of Experimental Botany[实验植物学杂志]57:3737-3746；Zupan和Zambryski(1995)Plant Physiology[植物生理学]107:1041-1047。
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5:81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了转化种子(也称为“转基因种子”)，该转化种子具有可稳定地整合到它们的基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。
在一些实施例中，编码本文披露的重组HRS多肽的多核苷酸序列可以通过基因组修饰技术产生，该技术将异源蛋白酶特异性切割位点(即，异源担子菌特异性蛋白酶切割位点或异源线虫纲特异性蛋白酶位点)工程化到植物基因组中发现的内源HRS序列中。这样的方法包括但不限于针对目的植物基因组序列CRISPR-Cas9设计的大范围核酸酶、TALEN和用于精确编辑基因组的其他技术(Feng等人Cell Research[细胞研究]23:1229-1232,2013,WO 2013/026740)；Cre-lox位点特异性重组；FLP-FRT重组(Li等人(2009)Plant Physiol[植物生理学]151:1087-1095)；Bxbl介导的整合(Yau等人Plant J[植物杂志](2011)701:147-166)；锌指介导的整合(Wright等人(2005)Plant J[植物杂志]44:693-705；Cai等人(2009)Plant Mol Biol[植物分子生物学]69:699-709)；以及同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol[分子生物学方法]:51-65)。
在一些实施例中，本文提供了用如上所述的基因编辑机制转化并对其表达的植物，这些植物当与靶标植物杂交时，使得在靶标植物中发生基因编辑。
通常，基因编辑可能涉及基因编辑组分或系统的瞬时、诱导型或组成型表达。基因编辑可能涉及基因编辑组件或系统的基因组整合或游离体存在。
基因编辑通常是指使用定点核酸酶(包括但不限于CRISPR/Cas、锌指、大范围核酸酶等)在所希望的位置处剪短核苷酸序列。这可能导致插入/缺失(“插入缺失”)突变(即，“SDN1”)、碱基编辑(即，“SDN2”)或等位基因插入或替代(即，“SDN3”)。SDN2或SDN3基因编辑可以包括提供一个或多个重组模板(例如，在载体中)，该模板包含可用于植物内同源定向修复(HDR)的目的基因序列(即，待引入到植物基因组中)。在一些实施例中，目的基因或等位基因是能够赋予植物改善的性状(例如，增加的蛋白质含量和/或增加的油含量)的基因或等位基因。可以将重组模板引入到植物中，利用包含重组模板的供体植物通过转化或通过育种进行编辑。可以将植物基因组中的断裂引入到靶标序列的内部、上游和/或下游。在一些实施例中，在靶标序列基因座内部或附近产生双链DNA断裂。在一些实施例中，在靶标序列基因座的上游和下游产生断裂，这可以导致其从基因组中切除。在一些实施例中，在靶标序列内部、上游和/或下游产生一个或多个单链DNA断裂(切口)(例如，使用切口酶Cas9变体)。这些DNA断裂中的任一个以及经由本领域技术人员已知的其他方法引入的那些DNA断裂都可以诱导HDR。通过HDR，靶标序列被所提供的包含目的多核苷酸的重组模板的序列替代。通过设计该系统，使得一个或多个单链或双链断裂被引入到不包含目的基因序列的植物基因组中相应区域的内部、上游和/或下游，该区域可以用模板替代。
在一些实施例中，可以在不使用重组模板的情况下经由靶向引入DNA双链断裂来产生本文所述的目的基因中的突变。这样的断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)过程进行修复，这可能导致在修复位点产生小的插入或缺失(插入缺失)。这样的插入缺失可能导致移码突变，从而引起靶向基因中过早终止密码子或其他类型的功能丧失突变。
在一些实施例中，基因编辑可能涉及靶标植物中基因编辑组分或系统的瞬时、诱导型或组成型表达。基因编辑还可能涉及靶标植物中基因编辑组件或系统的基因组整合或游离体存在。
在某些实施例中，核酸修饰或突变由(经修饰的)锌指核酸酶(ZFN)系统实现。ZFN系统使用人工限制性内切酶，该人工限制性内切酶通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而生成，该DNA切割结构域可以被工程化以靶向所希望的DNA序列。使用ZFN进行基因组编辑的示例性方法可以在例如以下中发现：美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、和6,979,539。
在某些实施例中，核酸修饰由(经修饰的)大范围核酸酶实现，大范围核酸酶是脱氧核糖核酸内切酶，其特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)。使用大范围核酸酶的示例性方法可以在美国专利号：8,163,514、8,133,697、8,021,867、8,119,361、8,119,381、8,124,369、和8,129,134中找到，这些文献特别地通过引用并入。
在某些实施例中，核酸修饰由(经修饰的)CRISPR/Cas复合物或系统实现。在某些实施例中，CRISPR/Cas系统或复合物是2类CRISPR/Cas系统。在某些实施例中，所述CRISPR/Cas系统或复合物是II型、V型或VI型CRISPR/Cas系统或复合物。CRISPR/Cas系统不需要生成定制的蛋白质来靶向特定序列，而是可以通过RNA指导序列(gRNA)对单一Cas蛋白进行编程以识别特定的核酸靶标，换句话说，可以使用所述短RNA指导序列将Cas酶蛋白募集到目的特定核酸靶标基因座(该基因座可能包含RNA和/或DNA或由其组成)。
通常，CRISPR/Cas或CRISPR系统如本文上述文献所用，统指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列以及以下中的一个或多个：tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配对序列(在内源CRISPR系统的上下文中包含“直接重复序列”和tracrRNA处理的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也称为“间隔子”)、或一种或多种如本文中使用的术语“RNA”(例如，用于指导Cas例如Cas9的一种或多种RNA，例如CRISPRRNA以及在适用的情况下的反式激活(tracr)RNA或单指导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。总的来说，CRISPR系统特征在于在靶序列的位点处促进CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的上下文中也称为原型间隔区)。在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”是指指导序列被设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。
在某些实施例中，gRNA是嵌合指导RNA或单一指导RNA(sgRNA)。在某些实施例中，gRNA包含指导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施例中，gRNA包含指导序列、tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施例中，如本文所述的CRISPR/Cas系统或复合物不包含和/或不依赖于tracr序列的存在(例如，如果Cas蛋白是Cas12a)。
如本文提及的Cas蛋白，例如但不限于Cas9、Cas12a(以前称为Cpf1)、Cas12b(以前称为C2c1)、Cas13a(以前称为C2c2)、C2c3、Cas13b蛋白，可源自任何合适的来源，因此可以包括来自多种(原核)生物体的不同直系同源物，如在本领域中被充分记载的。在某些实施例中，Cas蛋白是(经修饰的)Cas9，优选(经修饰的)金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)或(经修饰的)化脓性链球菌Cas9(SpCas9)。在某些实施例中，Cas蛋白是Cas12a，任选地来自氨基酸球菌属物种，例如氨基酸球菌属物种BV3L6 Cpf1(AsCas12a)，或毛螺菌科细菌Cas12a，例如毛螺菌科细菌MA2020或毛螺菌科细菌MD2006(LBCas12a)。参见美国专利号10,669,540，通过引用以其全文并入本文。可替代地，Cas12a蛋白可以来自牛眼莫拉菌(Moraxellabovoculi)AAX08_00205(Mb2Cas12a)或牛眼莫拉菌AAX11_00205(Mb3Cas12a)。参见，WO2017/189308，通过引用以其全文并入本文中。在某些实施例中，Cas蛋白是(经修饰的)C2c2，优选瓦氏纤毛菌(Leptotrichia wadei)C2c2(LwC2c2)或纽约李斯特菌(Listerianewyorkensis)FSL M6-0635 C2c2(LbFSLC2c2)。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是C2c1。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是C2c3。在某些实施例中，(经修饰的)Cas蛋白是Cas13b。本领域技术人员可以获得其他Cas酶。
基因编辑方法和组合物也披露于美国专利号10,519,456和10,285,348 82中，其全部内容通过引用并入本文。
引入植物中的基因编辑机制(例如，DNA修饰酶)可以由能够驱动重组基因在植物中表达的任何启动子控制。在一些实施例中，启动子是组成型启动子。在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如花粉特异性启动子或精细胞特异性启动子，受精卵特异性启动子，或在精子、卵子和受精卵中高度表达的启动子(例如，prOsActin1)。合适的启动子披露于美国专利号10,519,456中，其全部内容通过引用并入本文。
在另一个方面，本文提供了编辑植物基因组DNA的方法。在一些实施例中，该方法包括使用表达DNA修饰酶和至少一种任选的如上所述的指导核酸的第一大豆植物来对包含待编辑的基因组DNA的靶标植物进行授粉。
还包括保护植物免受担子菌植物病原体物种感染或增强植物对担子菌植物病原体物种的病原体抗性的方法。在一个实施例中，方法包括将编码植物病原体特异性蛋白酶的HRS蛋白的核苷酸序列引入到植物中的步骤，其中HRS蛋白具有异源担子菌特异性切割位点，并且切割位点的切割赋予对担子菌植物病原体物种的抗性或增强的抗性。在示例性实施例中，担子菌植物病原体是豆薯层锈菌并且病害是亚洲大豆锈病，HRS蛋白是以下中的至少一种：SEQ ID NO:1的PBS1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列(其中变体保留PBS1活性)。在另一个实施例中，重组HSR序列包含SEQ ID NO:148的RIN4或与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列(其中变体保留RIN4活性)。在其他实施例中，重组底物蛋白具有异源层锈菌属特异性切割位点，该异源切割位点由选自由以下组成的组的切割序列编码：编码SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29中至少一个的序列或与SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且切割位点的切割赋予对豆薯层锈菌和亚洲大豆锈菌的改善的抗性。
在其他实施例中，重组核酸分子包含编码植物病原体特异性蛋白酶的至少一种超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列。植物病原体特异性蛋白酶由线虫物种表达，并且HRS蛋白包含异源线虫特异性蛋白酶切割位点，其中所述切割位点的切割赋予对线虫物种的抗性。在具体实施例中，重组核酸分子与植物中具有活性的启动子可操作地连接。HRS蛋白是以下中的至少一种：SEQ ID NO:1的PBS1，与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列(其中变体保留PBS1活性)；SEQ ID NO:148的RIN4，或与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列(其中变体保留RIN4活性)。上述异源线虫特异性蛋白酶切割位点由选自由以下组成的组的切割序列编码：编码SEQ IDNO:34、35、48、49、50或51中的至少一个的序列，或与SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列，或在SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51中具有至少1、2或3个氨基酸取代的序列。切割位点的切割使得对线虫纲物种的抗性得到改善或增强。在一个实施例中，切割序列包括编码具有六个氨基酸的氨基酸基序的序列。在氨基酸基序中，第一位置是苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或色氨酸；第二位置是丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、谷氨酸或组氨酸；第三位置是亮氨酸；第四位置是甲硫氨酸；第五位置是异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；以及第六位置是组氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸。
在另一个实施例中，重组核酸分子的切割位点序列编码至少一个具有氨基酸数目在5至35范围内的氨基酸序列。在具体实施例中，重组核酸分子的切割位点序列编码以下中的至少一种：具有氨基酸数目在5至3范围内并且其中包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及具有氨基酸数目在5至35范围内并且包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在另一个实施例中，切割位点序列编码以下中的至少一种：TAMRIH(SEQ ID NO:30)、LIMQKN(SEQ ID NO:31)、VMLMHA(SEQ ID NO:32)、VKSFLM(SEQ ID NO:33)、HLYLYH(SEQID NO:34)、LMFKMP(SEQ ID NO:35)、KLMHGI(SEQ ID NO:36)、LTPLMI(SEQ ID NO:37)、SPLMKH(SEQ ID NO:38)、YYIAPL(SEQ ID NO:39)、KNMMTF(SEQ ID NO:40)、FYTKHL(SEQ IDNO:41)、MQSAID(SEQ ID NO:42)、QFEGVL(SEQ ID NO:43)、MQHVIA(SEQ ID NO:44)、HNRIEQ(SEQ ID NO:45)、RIWKQM(SEQ ID NO:46)、KLRQRH(SEQ ID NO:47)、WEGLMK(SEQ ID NO:48)、FELMKA(SEQ ID NO:49)、LMKLHN(SEQ ID NO:50)或KHGLMR(SEQ ID NO:51)。
重组核酸分子的至少一种HRS蛋白是PBS1或RIN4中的至少一种。HRS蛋白可以包含PBS1蛋白，并且是SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:2的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(其中变体保留PBS1活性)。HRS蛋白可以包含RIN4蛋白，并且是SEQ ID NO:148或与SEQ ID NO:149的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(其中变体保留RIN4活性)。在一些实施例中，HRS蛋白源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。
切割位点的位置可以因实施例而异。在一个实施例中，异源线虫特异性切割位点位于氨基酸位置150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310或310-320之间。在其他实施例中，参考SEQ ID NO:79，重组核酸分子的异源线虫特异性蛋白酶切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在其他实施例中，参考SEQ ID NO:75-78和SEQ ID NO:80-96，切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在重组核酸分子的一些实施例中，编码至少一种HRS蛋白的核苷酸序列含有编码天然切割位点(例如，除了本文所述的异源切割位点之外)的序列。在一些实施例中，编码天然切割位点的序列被编码异源切割位点的核苷酸序列所替代。
在一个实施例中，重组核酸分子的线虫物种选自由以下组成的组：胞囊线虫属、球胞囊线虫属、根结线虫属或肾形线虫属。在另一个实施例中，线虫植物物种是大豆胞囊线虫。在又另一个实施例中，存在经修饰的由线虫物种表达的植物病原体特异性蛋白酶的HRS蛋白。经修饰的HRS蛋白包含具有线虫特异性异源切割位点的氨基酸序列，并且经修饰的HRS蛋白由重组核酸分子编码。
还包括包含本文披露的重组核酸分子的载体以及包含重组核酸分子的转化的植物细胞和转化的植物。在许多实施例中，转化的植物细胞和转化的植物是双子叶植物，例如，大豆属的成员。实施例还包括转化植物的转基因种子。在实施例中，切割位点的切割激活RPS5抗性蛋白。RPS5蛋白与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且引发细胞死亡反应。
在另一个实施例中，存在保护植物免受线虫植物病原体物种感染或增强植物对线虫植物病原体物种感染的抗性的方法。该方法包括将编码植物病原体特异性蛋白酶的重组HRS蛋白的核苷酸序列引入植物中，其中重组HRS蛋白包含异源线虫特异性蛋白酶切割位点并且切割位点的切割赋予对线虫植物病原体物种的抗性。在具体实施例中，线虫植物病原体物种是大豆胞囊线虫，并且至少一种底物蛋白具有胞囊线虫属特异性异源切割位点。异源切割位点由选自由以下组成的组的切割序列编码：编码SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51中的至少一个的序列，或与SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列。切割位点的切割改善了对大豆胞囊线虫的抗性。
在单独的实施例中，它是包含与核苷酸序列可操作地连接的启动子的重组核酸分子，该核苷酸序列编码由层锈菌属和胞囊线虫属植物病原体物种之一表达的植物病原体特异性蛋白酶的至少一种HRS蛋白。至少一种HRS蛋白具有层锈菌属-胞囊线虫属特异性异源切割位点，并且切割位点的切割赋予对层锈菌属和胞囊线虫属植物病原体物种中的至少一种的改善的抗性。在该重组核酸分子中，至少一种HRS蛋白是SEQ ID NO:1的PBS1或与SEQID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种，或者至少一种HRS蛋白质是SEQID NO:148的RIN4或与SEQ ID NO:148具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种。重组核酸的异源切割位点由选自由以下组成的组的切割序列编码：编码SEQ ID NO:98-145中的至少一个的序列，或与SEQ ID NO:98-145具有至少65％同一性的序列。切割位点的切割使得对植物病原体物种的抗性得到改善。在另一个实施例中，它是用于插入到HRS蛋白中以产生工程化抗性的分离的切割位点。切割位点肽选自由SEQ ID NO:8-52和98-147组成的组。
非限制性实施例包括重组核酸分子，该重组核酸分子包含：编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，其中HRS蛋白包含异源担子菌特异性蛋白酶切割位点。在重组核酸分子的一些实施例中，HRS蛋白包含：a)PBS1多肽；b)如SEQ IDNO:1中所示的PBS1多肽；c)与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留PBS1活性；d)RIN4多肽；e)如SEQID NO:148中所示的RIN4多肽；或f)与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留RIN4活性。在重组核酸分子的实施例中，异源担子菌特异性切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ IDNO:9、17、21、24、26、27、28或29，或与SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29具有至少65％同一性的序列。在实施例中，异源担子菌特异性切割位点包含以下的切割序列：SEQ ID NO:52或与SEQ ID NO:52具有至少65％同一性的序列。在重组核酸分子的实施例中，异源担子菌特异性切割位点编码以下中的至少一种：a)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；b)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；c)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；d)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；e)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；f)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；g)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；h)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或i)具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQID NO:52的氨基酸序列。在特定实施例中，重组核酸分子的切割序列包含编码以下中的至少一种的核苷酸序列：HWVNFL(SEQ ID NO:9)、YARFYL(SEQ ID NO:17)、TLEEWF(SEQ ID NO:21)、QVFEFL(SEP ID NO:24)、QMIFLR(SEQ ID NO:26)、IFLWSA(SEQ ID NO:27)、NLEFLY(SEQID NO:28)或TFTFFQ(SEQ ID NO:29)。在其他实施例中，切割序列包含编码TLEEWFQVFEFL(SEQ ID NO:52)的核苷酸序列。
在非限制性实施例中，HRS蛋白源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。在重组核酸分子的实施例中，参考SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:53-97中任一个，担子菌特异性异源切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在实施例中，异源担子菌特异性蛋白酶来自层锈菌属植物病原体物种。在特定实施例中，层锈菌属植物病原体物种是豆薯层锈菌，并且病害是亚洲大豆锈病。在重组核酸分子的实施例中，异源担子菌特异性蛋白酶切割位点的切割激活RPS5抗性蛋白。在特定实施例中，RPS5蛋白与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性，并且引发超敏细胞死亡反应。在重组核酸分子的实施例中，HRS蛋白的内源植物病原体特异性蛋白酶切割位点被异源担子菌特异性蛋白酶切割位点替代。在重组核酸分子的实施例中，编码超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列与植物中具有活性的启动子可操作地连接。在实施例中，重组核酸分子进一步包含表达盒，该表达盒包含在植物中具有活性的启动子，该启动子与R基因可操作地连接，该R基因在担子菌特异性蛋白酶切割位点处切割后被HRS蛋白激活。
在非限制性实施例中，提供了包含根据上述任一实施例的重组核酸分子的载体。在其他非限制性实施例中，提供了包含植物病原体特异性蛋白酶的经修饰超敏反应底物(HRS)蛋白的重组蛋白，其中经修饰的HRS蛋白包含异源担子菌特异性蛋白酶切割位点，并且其中经修饰的HRS蛋白由根据上述任一实施例的重组核酸分子编码。
在进一步的实施例中，提供了包含根据上述任一实施例的重组核酸分子的植物、植物细胞、植物部分或种子。在植物、植物细胞、植物部分或种子的特定实施例中，植物、植物部分或植物细胞是双子叶植物，例如大豆属的成员。
非限制性实施例包括增强植物中对由担子菌植物病原体物种感染的植物病原体抗性的方法，该方法包括：在植物中表达编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，该超敏反应底物蛋白包含如上述任一实施例中所述的异源担子菌特异性切割位点，其中蛋白酶对异源担子菌特异性切割位点的切割赋予对由担子菌植物病原体物种引起的病害的抗性。在实施例中，所述编码HRS蛋白的核苷酸序列通过转化引入到植物中。在实施例中，所述编码HRS蛋白的核苷酸序列通过基因组修饰引入到植物中。在方法的实施例中，担子菌植物病原体物种是豆薯层锈菌，并且病害是亚洲大豆锈病(ASR)；其中异源担子菌特异性切割位点是层锈菌属特异性异源切割位点，该切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29，或者与SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29具有至少65％同一性的序列；并且其中，蛋白酶在切割位点处切割HRS蛋白赋予了对豆薯层锈菌和ASR改善的抗性。
提供了重组核酸分子的非限制性实施例，该重组核酸分子包含：编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，其中HRS蛋白具有异源线虫纲特异性蛋白酶切割位点。在重组核酸分子的实施例中，HRS蛋白包含：PBS1多肽；如SEQ ID NO:1中所示的PBS1多肽，与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列(其中所述多肽保留PBS1活性)；RIN4多肽；如SEQ ID NO:148中所示的RIN4多肽；或与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列(其中所述多肽保留RIN4活性)。在重组核酸分子的特定实施例中，异源线虫纲特异性切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51，或与SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列。在重组核酸分子的实施例中，切割序列包含编码以下的核酸序列：具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在重组核酸分子的特定实施例中，HRS蛋白源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。在实施例中，参考SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:53-97中任一个，异源线虫纲特异性切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。在重组核酸分子的实施例中，编码HRS蛋白的核苷酸序列的内源植物蛋白酶切割位点被异源线虫纲特异性切割位点的核苷酸序列替代。在重组核酸分子的特定实施例中，线虫纲植物病原体物种是胞囊线虫属、球胞囊线虫属、根结线虫属或肾形线虫属，例如其中线虫纲植物病原体物种是大豆胞囊线虫。
在重组核酸分子的非限制性实施例中，编码超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列与植物中具有活性的启动子可操作地连接。在进一步的实施例中，重组核酸分子进一步包含表达盒，该表达盒包含在植物中具有活性的启动子，该启动子与编码抗性蛋白的R基因可操作地连接，该R基因在线虫纲特异性蛋白酶切割位点处切割后被HRS蛋白激活。在重组核酸分子的实施例中，线虫纲特异性蛋白酶切割位点的切割激活抗性蛋白RPS5并且引发局部超敏细胞死亡反应。在特定实施例中，抗性蛋白RPS5是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的蛋白，并且引发超敏细胞死亡反应。
提供了包含根据上文披露的任一实施例的重组核酸分子的载体的非限制性实施例。提供了植物、植物部分、植物细胞或种子的非限制性实施例，该植物、植物部分、植物细胞或种子包含根据上文披露的任一实施例的重组核酸分子。在植物、植物部分、植物细胞或种子的特定实施例中，植物、植物部分、植物细胞或种子是双子叶植物，例如大豆属的成员。在实施例中，提供了上述任一实施例的植物的转基因种子。在实施例中，提供了上述任一实施例的植物的转化的植物细胞。
非限制性实施例包括包含植物病原体特异性蛋白酶的经修饰超敏反应底物(HRS)蛋白的重组蛋白，其中经修饰的HRS蛋白包含具有异源线虫特异性切割位点的氨基酸序列，并且其中经修饰的HRS蛋白由上述任一实施例的重组核酸分子编码。
提供了增强植物中对线虫纲植物病原体物种感染的植物病原体抗性的方法的非限制性实施例，该方法包括：在植物中表达编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，该超敏反应底物蛋白包含如上述任一实施例中所述的异源线虫纲特异性切割位点，其中蛋白酶对异源线虫纲特异性切割位点的切割赋予植物对由线虫纲植物病原体物种引起的病害的抗性。在方法的实施例中，线虫纲植物病原体物种是大豆胞囊线虫，并且病害是大豆胞囊线虫病(SCN)；其中异源线虫纲特异性切割位点是胞囊线虫属特异性异源切割位点，该切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51，或与SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列；并且其中，蛋白酶在切割位点处切割HRS蛋白赋予了对大豆胞囊线虫和SCN改善的抗性。
提供了重组核酸分子的非限制性实施例，该重组核酸分子包含：与编码植物病原体特异性蛋白酶的HRS蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子，并且其中HRS蛋白具有异源层锈菌属-胞囊线虫属特异性切割位点，其中切割位点的切割赋予对层锈菌属和胞囊线虫属植物病原体物种中至少一种的改善的抗性。在重组核酸分子的实施例中，HRS蛋白是SEQ ID NO:1的PBS1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一种，或者其中至少一种HRS蛋白是SEQ ID NO:148的RIN4或与SEQ ID NO:148具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一种。在重组核酸分子的实施例中，异源切割位点包含选自SEQ ID NO:8-29中至少一个的层锈菌属的第一切割序列，以及选自SEQ ID NO:30-51中至少一个的胞囊线虫属的第二切割序列。在重组核酸分子的实施例中，异源切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：编码SEQ ID NO:98-145中至少一个的序列，或与SEQ ID NO:98-145具有至少65％同一性的序列，其中切割位点的切割使得对层锈菌属和胞囊线虫属中至少一种的抗性得到改善。
提供了用于插入到HRS蛋白中以产生工程化抗性的分离的切割位点肽的非限制性实施例，其中切割位点肽选自由SEQ ID NO:8-52和98-145组成的组。
实例
在考虑以下非限制性实例后，将会更全面地理解本披露，提供这些实例是出于说明而非限制的目的。
实例1.使用本氏烟草(Nicotiana benthimiana)和普通烟草选择和测试植物中的大豆锈病切割位点特异性。
基于超过10,000个肽的基序分析，我们选择了22个担子菌特异性切割位点肽用于在本氏烟草和普通烟草中进行评估，在本文中列为R1-R22(SEQ ID NO:8-29)。这些肽中的每一个长度均为6个氨基酸，并对其进行了分析以赋予对层锈菌属改善的抗性。本文中，为赋予对层锈菌属诱导的大豆锈病改善的抗性而测定的肽序列也称为大豆锈病切割位点序列。为了生成PBS1变体(即，具有异源切割位点序列的经修饰PBS1蛋白)，编码野生型肽的核苷酸序列被在由植物启动子prGmUbi驱动的二元载体中构建的长度为六个氨基酸的肽之一替代。编码相应R蛋白(其与底物蛋白相互作用以引发超敏反应)RPS5的基因包含在由植物启动子prMt12344驱动的另一个二元构建体中。将所有表达构建体转化至农杆菌菌株EHA101 RecA中用于植物实验。担子菌特异性大豆锈病切割位点的示例性氨基酸基序示出于SEQ ID NO:146。
在利用本氏烟草进行评估期间，几乎所有PBS1变体在用RPS5蛋白转化时均产生了细胞死亡或超敏反应，无论是否存在植物病原体特异性蛋白酶。这些结果可能表明，本氏烟草可能含有与病原体特异性蛋白酶具有相似底物特异性的蛋白酶。因此，我们无法通过病原体特异性蛋白酶区分PBS1变体切割的反应。
然而，当我们使用普通烟草评估PBS1变体时，存在我们观察到植物蛋白酶切割减少(例如，部分减少或完全减少)的变体。我们还观察到几种PBS1变体显示出病原体特异性蛋白酶细胞死亡。如表1所示，将细胞死亡分级为0-4，其中0表示无细胞死亡，而4表示最强细胞死亡反应。P+表示病原体特异性蛋白酶的存在，而P-表示蛋白酶缺失。表1中显示的肽表现出特异性细胞死亡反应，其中等级范围为3-4。此数据的叶插图示例参见图1。
实例2.可变长度的大豆锈病切割位点的功效
本发明的实施例还包括不同长度的切割位点，例如5至15个氨基酸。为了说明切割位点长度的影响，我们创建了具有两个串联6-mer肽的PBS1变体。在一个实例中，我们串联了PBS1-R14和PBS1-R17(编码为PBS1-R26)。PBS1-R26含有来自R14(SEQ ID NO:14)和R17(SEQ ID NO:24)的6个氨基酸，从而产生了TLEEWFQVFEL(SEQ ID NO:52)。串联变体导致普通烟草中切割位点依赖性细胞死亡。这些结果(细胞死亡等级为4)也可以在表1中看到。然后将包含串联PBS1的构建体与RPS5堆叠在分子堆叠物中以进行大豆转化。在其他实例中，切割位点可以根据需要延长或缩短，只要修饰赋予对靶标病原体(例如，对层锈菌属植物病原体物种)改善的抗性。在其他实例中，切割位点可以是多达五个氨基酸、六个氨基酸、七个氨基酸、八个氨基酸、九个氨基酸、十个氨基酸、十一个氨基酸、十二个氨基酸、十三个氨基酸、十四个氨基酸或十五个氨基酸，只要修饰赋予对靶标病原体(例如，对层锈菌属植物病原体物种)改善的抗性。
表1.表现出最大细胞死亡反应的切割位点
6-mer序列 编码 P+ P-
HWVNFL(SEQ ID NO:9) PBS1-R2 3 0
YARFYL(SEQ ID NO:17) PBS1-R10 4 0
TLEEWF(SEQ ID NO:21) PBS1-R14 4 0
QVFEFL(SEQ ID NO:24) PBS1-R17 4 0
QMIFLR(SEQ ID NO:26) PBS1-R19 4 0
IFLWSA(SEQ ID NO:27) PBS1-R20 4 0
NLEFLY(SEQ ID NO:28) PBS1-R21 4 0
TFTFFQ(SEQ ID NO:29) PBS1-R22 4 0
TLEEWFQVFEFL(SEQ ID NO:52) PBS1-R26 4 0
实例3.PBS1和RPS5在大豆中共转化
提交包含表现出植物病原体特异性蛋白酶依赖性细胞死亡(如表1中列出的)的PBS1变体的构建体用于利用RPS5进行大豆转化，以研究PBS1变体是否会引发大豆锈病抗性。我们将PBS1变体与RPS5共转化，以评估以下内容：1)大豆转化系是否含有功能性RPS5，以及2)如果含有，以确定PBS1变体和RPS5是否会一起起作用，因为PBS1变体源于拟南芥属。从共转化中，我们生成了3种GM大豆材料：1)仅含有PBS1变体，2)仅含有RPS5蛋白，3)含有PBS1变体以及RPS5蛋白两者。使用这些材料，我们评估了锈病特异性抗性。
实例4.大豆的锈病抗性
我们评估了转化产生的每种材料对于2-3种不同的锈病菌株(本文称为rust1、rust2和rust3)的情况。仅用RPS5生成的对照事件(无效事件G40；构建体25331)对三种菌株中的任一种上都没有显示出可观察到的抗性。参见图2，顶行、中间行和底行。
我们观察到与对照事件G40相比，3种PBS1变体(PBS1-R17、PBS1-R19和PBS1-R20)对三种大豆锈病菌株表现出强大(超过85％的有效性)抗性。基于真菌质量定量，当也存在RPS5时，抗性略有增加。这些结果表明，大豆的RPS5同源物能够与PBS1变体相互作用，从而引发植物中的超敏反应。此外，这表明植物中较大量的RPS5(例如，通过植物中RPS5的过表达产生)可以通过RPS5和PBS1变体之间的相互作用导致抗性水平增加。支持这一点的表型数据示出于图2中。
图3表示含有PBS1-R17变体的二元载体的图。该变体含有R17切割位点肽。拟南芥PBS1(AvrPphB易感1)基因中的切割位点被修饰，其中六个氨基酸从野生型(DKSHVS；SEQ IDNO:7)突变为R17肽(QVFEFL；SEQ ID NO:24)。
表2.
事件 构建体 拷贝数目 6mer编码 RPS5构建体 拷贝数目
G7 25326 1 R17 25331 1
G61 25326 >2 R17 25331 1
G80 25326 >2 R17 25331 0
G1 25327 1 R19 25331 1
G3 25327 >2 R19 25331 0
G2 25328 >2 R20 25331 2
G40 25328 0 R20 25331 >2
G97 25328 >2 R20 25331 2
实例4.使用普通烟草选择和测试植物中大豆胞囊线虫切割位点特异性
基于超过300,000个肽的基序分析，我们选择了25个线虫特异性切割位点肽用于在普通烟草中进行评估，在本文中列为S1-S24(SEQ ID NO:30-51)。这些切割位点肽的长度均为6个氨基酸。为赋予对胞囊线虫属诱导的大豆胞囊改善的抗性而测定的肽序列也称为大豆胞囊线虫切割位点序列。对于PBS1变体，野生型肽被在prGmUbi驱动的二元载体中构建的长度为六个氨基酸的肽之一替代。RPS5蛋白是在prMt12344驱动的另一种二元构建体中构建的。将所有构建体转化至农杆菌菌株EHA101 RecA中用于植物实验。线虫特异性大豆胞囊切割位点的示例性氨基酸基序示出于SEQ ID NO:146中。
实例5.大豆胞囊线虫切割位点在普通烟草中的功效
我们观察到几种PBS1变体显示病原体特异性蛋白酶细胞死亡。如表3所示，将细胞死亡分级为0-4，其中0表示无细胞死亡，而4为最强细胞死亡反应。P+表示病原体特异性蛋白酶的存在，而P-表示蛋白酶缺失。表3中显示的肽表现出特异性细胞死亡反应，其中等级范围为3-4。此数据的叶插图示例参见图4。
表3.表现出最大细胞死亡反应的切割位点
6-mer序列 编码 P+ P-
HLYLYH PBS1-S5 4 0
LMFKMP PBS1-S6 4 0
WEGLMK PBS1-S20 4 0
FELMKA PBS1-S21 4 0
LMKLHN PBS1-S23 3 0
KHGLMR PBS1-S24 4 0
实例6.不同长度的大豆锈病和大豆胞囊线虫切割位点的功效
在另一个实例中，可以构建含有大豆锈病和线虫切割位点的底物蛋白。切割位点的长度可为12–35个氨基酸。切割位点的切割应使得对大豆锈病和线虫损害两者的抵抗力均增强。包含锈病和大豆切割位点的示例性序列肽示出于SEQ ID NO:98-145中。这些肽可以包括例如包含至少一个大豆锈病切割位点序列(例如选自SEQ ID NO:8-29的切割序列)和至少一个大豆胞囊线虫切割位点序列(例如选自SEQ ID NO:98-145的切割序列)的组合的肽。在一些实施例中，肽是包含串联的至少一种大豆锈病切割位点序列和至少一种大豆胞囊线虫切割位点序列的串联肽。
因此，在其他实施例中，本披露涉及含有大豆锈病和线虫切割位点的底物蛋白。切割位点的长度可为12–35个氨基酸。切割位点的切割使得对大豆锈病和线虫损害两者的抵抗力均增强。
实例7.使用RIN4底物蛋白系统替代切割位点
在另一个实例中，可以使用RIN4底物蛋白替代PBS1或其他HRS蛋白来替代切割位点，以工程化对靶标病原体物种的抗性。
序列表
<110> Syngenta Crop Protection AG
Liu, Qingli
Reynolds, Mike
Tan, Xiaoping
Jucovic, Milan
<120> 大豆工程化抗性
<130> 82202-WO-REG-ORG-P-1
<150> US 63/140539
<151> 2021-01-22
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 456
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 1
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Gly Asp Lys Ser His Val Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
405 410 415
Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
420 425 430
Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
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<210> 2
<211> 1400
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 2
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tctaatcatg gtcagaagaa acaatcacaa ccgacagtat ccaataacat atctggactc 120
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cttccaaggg atggacttgg acaaattgct gctcatacat ttgctttccg cgagcttgct 240
gctgcaacta tgaactttca tcctgacact ttcttaggcg aaggtggatt tggacgtgtc 300
tacaaaggaa ggcttgacag caccggtcag gttgttgctg ttaaacaact agacaggaat 360
ggtctacaag gtaacagaga atttctggta gaggttctta tgctcagtct tcttcatcat 420
cccaacttag tcaaccttat tggttattgt gctgatggag atcaacgcct cttggtctac 480
gagtttatgc cgttaggatc attggaagat cacctccacg atcttccacc ggataaggag 540
gccttagatt ggaacatgag aatgaaaata gctgctggtg cggcgaaagg attggaattt 600
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ctggatgagg gtttccaccc taagctttct gattttggac ttgctaaact cggaccaacg 720
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ctcgagctga ttactggtcg caaagctata gacagcgaga tgcctcatgg agagcagaac 900
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ccaaggttaa aggggcggtt tccaacgcgt gcactctacc aagctttagc tgtggcatca 1020
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tcctatcttg caaaccaagc ttatgatcca agtaaagatg atagtagaag aaaccgggat 1140
gaaagaggtg caaggttaat aacaaggaac gacgatggag gtggctcggg aagtaaattc 1200
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gacgacgata agtaggagct 1400
<210> 3
<211> 889
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 3
Met Gly Gly Cys Phe Ser Val Ser Leu Pro Cys Asp Gln Val Val Ser
1 5 10 15
Gln Phe Ser Gln Leu Leu Cys Val Arg Gly Ser Tyr Ile His Asn Leu
20 25 30
Ser Lys Asn Leu Ala Ser Leu Gln Lys Ala Met Arg Met Leu Lys Ala
35 40 45
Arg Gln Tyr Asp Val Ile Arg Arg Leu Glu Thr Glu Glu Phe Thr Gly
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Arg Gln Gln Arg Leu Ser Gln Val Gln Val Trp Leu Thr Ser Val Leu
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Leu Gln Arg Leu Cys Leu Cys Gly Phe Cys Ser Lys Asp Leu Lys Leu
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Ser Tyr Arg Tyr Gly Lys Arg Val Ile Met Met Leu Lys Glu Val Glu
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Ser Leu Ser Ser Gln Gly Phe Phe Asp Val Val Ser Glu Ala Thr Pro
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Phe Ala Asp Val Asp Glu Ile Pro Phe Gln Pro Thr Ile Val Gly Gln
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Glu Ile Met Leu Glu Lys Ala Trp Asn Arg Leu Met Glu Asp Gly Ser
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Gly Ile Leu Gly Leu Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu
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Leu Thr Lys Ile Asn Asn Lys Phe Ser Lys Ile Asp Asp Arg Phe Asp
195 200 205
Val Val Ile Trp Val Val Val Ser Arg Ser Ser Thr Val Arg Lys Ile
210 215 220
Gln Arg Asp Ile Ala Glu Lys Val Gly Leu Gly Gly Met Glu Trp Ser
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Glu Lys Asn Asp Asn Gln Ile Ala Val Asp Ile His Asn Val Leu Arg
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Arg Arg Lys Phe Val Leu Leu Leu Asp Asp Ile Trp Glu Lys Val Asn
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Leu Lys Ala Val Gly Val Pro Tyr Pro Ser Lys Asp Asn Gly Cys Lys
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Val Ala Phe Thr Thr Arg Ser Arg Asp Val Cys Gly Arg Met Gly Val
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Asp Asp Pro Met Glu Val Ser Cys Leu Gln Pro Glu Glu Ser Trp Asp
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Leu Phe Gln Met Lys Val Gly Lys Asn Thr Leu Gly Ser His Pro Asp
325 330 335
Ile Pro Gly Leu Ala Arg Lys Val Ala Arg Lys Cys Arg Gly Leu Pro
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Leu Ala Leu Asn Val Ile Gly Glu Ala Met Ala Cys Lys Arg Thr Val
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His Glu Trp Cys His Ala Ile Asp Val Leu Thr Ser Ser Ala Ile Asp
370 375 380
Phe Ser Gly Met Glu Asp Glu Ile Leu His Val Leu Lys Tyr Ser Tyr
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Leu Leu Glu Glu Glu Arg Asn Lys Ser Asn Val Lys Met His Asp Val
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<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
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<223> 启动子
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cacacaatgc tgtaactcac accgcccagc atctccaatg tgaaagaagc taaaatttaa 240
taaacaatca tacgaagcag tgacaaaata ccagatggta ttaatgcttt gataaaatta 300
attggaaagt ataaaatggt aggaaataat taattataat taatttaaat aagattaaaa 360
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<220>
<223> 启动子
<400> 6
ccttaggaaa tatggtggct gtactcattt tgatgttgat gaatggttta actgaattcc 60
gtttattatc attttttttt ttttttgtat tatataaaat gaaatgtata gagttgtaca 120
aaaaaaatga aaccagagtt tagagtttat caacatagag ccaaaagttc acgcgatagg 180
ggtcaaaatc gaaatatagt gtgaacaaat aataaaacat aatgaaataa agcaaaatca 240
taaaagaaaa agataaaata atgtttgtac aaaaaaaaaa gataaaataa tgattgtagt 300
atctaccaaa aaaataataa taataatgat ggtagtctct catctgtttg actgaattaa 360
atttatttga caactttaaa tgagtttttt ctttgataaa aactttaaat tatagtataa 420
ataatatatt ataataccta tacacatata tttaaaaagt taagaaaatg ggtagaccat 480
gtcatggttt aaaaataaaa aataatttga caaaaatcat aaaaaattaa ataaccaagt 540
taataataac aagaatattt aatcatgatt ttattatatt gttgttgacc tattgactaa 600
tacatactaa aaataaacac acaagaagga gtatggagac ctaaaatcga actcaggatt 660
caacataaaa ttgttatagt caaaccattg ggttataaca atggggacaa taatgaaaat 720
ataaaaatga accaaaatta taaaacaaaa aagataaaat aatgatgaca atttctcatt 780
tgtttgattg gtttggtttt atttgacaat tttaaatgag ttaaataata tttctaatac 840
atacatatta aaaatttaag aaaattgggt agaccataga tccttccgct ttatatcaat 900
ataattttct cgatgtaaat gggcattttc cctcttttgc acaaaaaaaa aaatctcgat 960
gttacattga tatttatgtg cgcctaagac tttacattga tatatttatt tggtgcgcct 1020
tcattttttc tatattatat cataaatttt aaaaacaaag ttacaaacac aaagcgcgcc 1080
ttcatttttc tatattatat cataaattag aattacgttc tcgaagagtc aaaccaacct 1140
actgattacg ttctcggaga gacaaaccaa cctagtgatt tactactagc taattttggt 1200
tattcctcga aagtttactt tataatcgtg aaatgttatt ctgattttct tttgaggcca 1260
aaatcgtatc cgactcacga gagattgcta gtttttcttt tgcagccaaa ttcctttaca 1320
ttttaacaaa agaatttttt ttttttggtc aagtagccac ctagtggcta gagcacacac 1380
aatttaattg tggagaagtg gagtgtctgg ggttcgaacc ccggcccctg catataatat 1440
gcaatatccc taccaactga gctaagctca cgagaattaa aaaaaaagaa tattaatcta 1500
actaaatata cagttaagcg caatagaaaa acagacgaac aaaagaaaga aacgttgata 1560
tataattatt ggagaatgct aaccattgtt agtattgaaa aatggtgaaa aatgataaat 1620
ttaacttttt aaaagtcaaa atattattga aatcaatata aacatactac ttttgacttc 1680
tttaaccatt accagagggc aatggttaac gagacccata attattctaa ggagctactt 1740
tgcagatagg ggatgtcctt tttttttttt gttgaaagaa attaggggat gtccttatct 1800
ctttatccct gccaattttc ctatttataa ataaatatcg agtttatcgc tctccacctc 1860
aaacgctttc tttcttgttc ttggtttagg gttttcttca cccattaggg ttagggttca 1920
attttcccct tttcaatccc caaatcaaaa ttcaatcaaa acctcaaatt tctcaccttt 1980
tctcactcaa tcatcaatca ag 2002
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 7
Gly Asp Lys Ser His Val Ser
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 8
Arg Trp Trp Phe Ala Leu
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 9
His Trp Val Asn Phe Leu
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 10
Trp Ala Glu Leu Val Leu
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 11
Pro Ile Ile Ser Leu Ala
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 12
Trp Phe Tyr Val Leu Gln
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 13
Leu Thr Glu Met Phe Met
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 14
Gly Gln Tyr Phe Val Trp
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 15
Tyr Trp Thr Thr Leu Phe
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 16
Ile Gln Met Leu Trp Ala
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 17
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 18
Leu Ala Lys Leu Trp Tyr
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 19
Tyr Phe Trp Leu Val Arg
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 20
Gly Phe Trp Leu Ser Phe
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 21
Thr Leu Glu Glu Trp Phe
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 22
Gln Gln Leu Phe Val Val
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 23
Met Arg Phe Tyr Phe Thr
1 5
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 24
Gln Val Phe Glu Phe Leu
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 25
Val Tyr Tyr Phe Tyr Arg
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 26
Gln Met Ile Phe Leu Arg
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 27
Ile Phe Leu Trp Ser Ala
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 28
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 29
Thr Phe Thr Phe Phe Gln
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 30
Thr Ala Met Arg Ile His
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 31
Leu Ile Met Gln Lys Asn
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 32
Val Met Leu Met His Ala
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 33
Val Lys Ser Phe Leu Met
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 34
His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 35
Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 36
Lys Leu Met His Gly Ile
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 37
Leu Thr Pro Leu Met Ile
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 38
Ser Pro Leu Met Lys His
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 39
Tyr Tyr Ile Ala Pro Leu
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 40
Lys Asn Met Met Thr Phe
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 41
Phe Tyr Thr Lys His Leu
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 42
Met Gln Ser Ala Ile Asp
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 43
Gln Phe Glu Gly Val Leu
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 44
Met Gln His Val Ile Ala
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 45
His Asn Arg Ile Glu Gln
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 46
Arg Ile Trp Lys Gln Met
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 47
Lys Leu Arg Gln Arg His
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 48
Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 49
Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 50
Leu Met Lys Leu His Asn
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 51
Lys His Gly Leu Met Arg
1 5
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 52
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Gln Val Phe Glu Phe Leu
1 5 10
<210> 53
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R1变体
<400> 53
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Arg Trp Trp Phe Ala Leu Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
405 410 415
Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
420 425 430
Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 54
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R2变体
<400> 54
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
His Trp Val Asn Phe Leu Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
405 410 415
Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
420 425 430
Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 55
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R3变体
<400> 55
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Trp Ala Glu Leu Val Leu Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
405 410 415
Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
420 425 430
Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 56
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R4变体
<400> 56
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Pro Ile Ile Ser Leu Ala Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
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260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
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Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
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<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R5变体
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<220>
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405 410 415
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 64
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R12变体
<400> 64
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100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
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180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
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Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
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<220>
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Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
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<220>
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Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
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Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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<210> 72
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R20变体
<400> 72
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
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100 105 110
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Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
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210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 73
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R21变体
<400> 73
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1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
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435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R22变体
<400> 74
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1 5 10 15
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20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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Thr Phe Thr Phe Phe Gln Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
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325 330 335
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355 360 365
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<220>
<223> PBS1-S1变体
<400> 75
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50 55 60
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65 70 75 80
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450 455
<210> 76
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S2变体
<400> 76
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435 440 445
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<220>
<223> PBS1-S3变体
<400> 77
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Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
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Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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Val Met Leu Met His Ala Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
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Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
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Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
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Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
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Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S4变体
<400> 78
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Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Val Lys Ser Phe Leu Met Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
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Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 79
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S5变体
<400> 79
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Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
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Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
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Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
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Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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His Leu Tyr Leu Tyr His Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
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Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
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Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
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Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 80
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S6变体
<400> 80
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Leu Met Phe Lys Met Pro Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
245 250 255
Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
260 265 270
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
370 375 380
Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
405 410 415
Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
420 425 430
Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
<210> 81
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S7变体
<400> 81
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Val Asp Glu Ser Asn His Gly Gln Lys Lys Gln Ser Gln Pro Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu Lys Leu Ser
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Ser Lys Thr Asn Gly Gly Ser Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Arg Asp
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65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
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Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
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Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
210 215 220
Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
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Lys Leu Met His Gly Ile Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
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355 360 365
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165 170 175
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180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
305 310 315 320
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325 330 335
Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
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355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-S15变体
<400> 89
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Ser Asp Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
Gly Leu Gly Gln Ile Ala Ala His Thr Phe Ala Phe Arg Glu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Thr Met Asn Phe His Pro Asp Thr Phe Leu Gly Glu Gly Gly
85 90 95
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100 105 110
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Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
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Met Gln His Val Ile Ala Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr
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Cys Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp
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Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys
275 280 285
Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Ala Trp
290 295 300
Ala Arg Pro Leu Phe Asn Asp Arg Arg Lys Phe Ile Lys Leu Ala Asp
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
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Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
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435 440 445
Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455
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Pro Arg Leu Lys Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ala Leu Tyr Gln Ala Leu
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Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Thr Arg Pro Leu
340 345 350
Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr Leu Ala Asn Gln Ala Tyr
355 360 365
Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn Arg Asp Glu Arg Gly Ala
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Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe
385 390 395 400
Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg
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Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys
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Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Glu Gln Gly
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Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PBS1-R26变体
<400> 97
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65 70 75 80
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Phe Gly Arg Val Tyr Lys Gly Arg Leu Asp Ser Thr Gly Gln Val Val
100 105 110
Ala Val Lys Gln Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe
115 120 125
Leu Val Glu Val Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val
130 135 140
Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr
145 150 155 160
Glu Phe Met Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro
165 170 175
Pro Asp Lys Glu Ala Leu Asp Trp Asn Met Arg Met Lys Ile Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Lys Gly Leu Glu Phe Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro
195 200 205
Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly
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Phe His Pro Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Thr
225 230 235 240
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Gln Val Phe Glu Phe Leu Ser Thr Arg Val
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Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ser Glu Met Pro His Gly Glu
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Ala Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Val Ala Ser Met Cys Ile Gln Glu Gln
340 345 350
Ala Ala Thr Arg Pro Leu Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Leu Ser Tyr
355 360 365
Leu Ala Asn Gln Ala Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Asp Ser Arg Arg Asn
370 375 380
Arg Asp Glu Arg Gly Ala Arg Leu Ile Thr Arg Asn Asp Asp Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Gly Ser Lys Phe Asp Leu Glu Gly Ser Glu Lys Glu Asp Ser
405 410 415
Pro Arg Glu Thr Ala Arg Ile Leu Asn Arg Asp Ile Asn Arg Glu Arg
420 425 430
Ala Val Ala Glu Ala Lys Met Trp Gly Glu Ser Leu Arg Glu Lys Arg
435 440 445
Arg Gln Ser Glu Gln Gly Thr Ser Glu Ser Asn Ser Thr Gly
450 455 460
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 98
His Trp Val Asn Phe Leu His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 99
His Trp Val Asn Phe Leu Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 100
His Trp Val Asn Phe Leu Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 101
His Trp Val Asn Phe Leu Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 102
His Trp Val Asn Phe Leu Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 103
His Trp Val Asn Phe Leu Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 104
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 105
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 106
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 107
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 108
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 109
Tyr Ala Arg Phe Tyr Leu Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 110
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 110
Thr Leu Glu Glu Trp Phe His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 111
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 112
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R14-S21
<400> 113
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 114
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 115
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 115
Thr Leu Glu Glu Trp Phe Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 116
Gln Val Phe Glu Phe Leu His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 117
Gln Val Phe Glu Phe Leu Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 118
Gln Val Phe Glu Phe Leu Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 119
Gln Val Phe Glu Phe Leu Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 120
Gln Val Phe Glu Phe Leu Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 121
Gln Val Phe Glu Phe Leu Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 122
Gln Met Ile Phe Leu Arg His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 123
Gln Met Ile Phe Leu Arg Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 124
Gln Met Ile Phe Leu Arg Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R19-S21
<400> 125
Gln Met Ile Phe Leu Arg Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 126
Gln Met Ile Phe Leu Arg Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 127
Gln Met Ile Phe Leu Arg Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 128
Ile Phe Leu Trp Ser Ala His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 129
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 130
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 131
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 132
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 133
Ile Phe Leu Trp Ser Ala Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 134
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 135
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 136
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 137
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 138
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 139
Asn Leu Glu Phe Leu Tyr Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 140
Thr Phe Thr Phe Phe Gln His Leu Tyr Leu Tyr His
1 5 10
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 141
Thr Phe Thr Phe Phe Gln Leu Met Phe Lys Met Pro
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 142
Thr Phe Thr Phe Phe Gln Trp Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 143
Thr Phe Thr Phe Phe Gln Phe Glu Leu Met Lys Ala
1 5 10
<210> 144
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 144
Thr Phe Thr Phe Phe Gln Leu Met Lys Leu His Asn
1 5 10
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割肽
<400> 145
Thr Phe Thr Phe Phe Gln Lys His Gly Leu Met Arg
1 5 10
<210> 146
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大豆锈病基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> X是R、H、W、P、L、G、Y、I、T、Q、M、V或N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> X是L或Y
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> X是W、V、E、I、Y、T、M、R、K、L或F
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> X是F或W
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> X是A、F、V、L、W、Y或S
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> X是L、A、Q、M、W、F、Y、R、V或T
<400> 146
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 线虫基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> X是T、L、V、H、K、S、Y、F、M、Q、R或W
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> X是A、I、M、K、L、T、P、Y、N、Q、F、E或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> X是I、K、H、L、Y、M、G、P、T、V、E、Q或R
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> X是H、N、A、M、P、I、F、L、D、Q、K或R
<400> 147
Xaa Xaa Leu Met Xaa Xaa
1 5
<210> 148
<211> 211
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 148
Met Ala Arg Ser Asn Val Pro Lys Phe Gly Asn Trp Glu Ala Glu Glu
1 5 10 15
Asn Val Pro Tyr Thr Ala Tyr Phe Asp Lys Ala Arg Lys Thr Arg Ala
20 25 30
Pro Gly Ser Lys Ile Met Asn Pro Asn Asp Pro Glu Tyr Asn Ser Asp
35 40 45
Ser Gln Ser Gln Ala Pro Pro His Pro Pro Ser Ser Arg Thr Lys Pro
50 55 60
Glu Gln Val Asp Thr Val Arg Arg Ser Arg Glu His Met Arg Ser Arg
65 70 75 80
Glu Glu Ser Glu Leu Lys Gln Phe Gly Asp Ala Gly Gly Ser Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Ala Asn Lys Arg Gln Gly Arg Ala Ser Gln Asn Asn Ser Tyr
100 105 110
Asp Asn Lys Ser Pro Leu His Lys Asn Ser Tyr Asp Gly Thr Gly Lys
115 120 125
Ser Arg Pro Lys Pro Thr Asn Leu Arg Ala Asp Glu Ser Pro Glu Lys
130 135 140
Val Thr Val Val Pro Lys Phe Gly Asp Trp Asp Glu Asn Asn Pro Ser
145 150 155 160
Ser Ala Asp Gly Tyr Thr His Ile Phe Asn Lys Val Arg Glu Glu Arg
165 170 175
Ser Ser Gly Ala Asn Val Ser Gly Ser Ser Arg Thr Pro Thr His Gln
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Pro Asn Asn Thr Ser Ser Cys Cys Cys Phe Gly Phe
195 200 205
Gly Gly Lys
210
<210> 149
<211> 633
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 149
atggcgcgca gcaacgtgcc gaaatttggc aactgggaag cggaagaaaa cgtgccgtat 60
accgcgtatt ttgataaagc gcgcaaaacc cgcgcgccgg gcagcaaaat tatgaacccg 120
aacgatccgg aatataacag cgatagccag agccaggcgc cgccgcatcc gccgagcagc 180
cgcaccaaac cggaacaggt ggataccgtg cgccgcagcc gcgaacatat gcgcagccgc 240
gaagaaagcg aactgaaaca gtttggcgat gcgggcggca gcagcaacga agcggcgaac 300
aaacgccagg gccgcgcgag ccagaacaac agctatgata acaaaagccc gctgcataaa 360
aacagctatg atggcaccgg caaaagccgc ccgaaaccga ccaacctgcg cgcggatgaa 420
agcccggaaa aagtgaccgt ggtgccgaaa tttggcgatt gggatgaaaa caacccgagc 480
agcgcggatg gctataccca tatttttaac aaagtgcgcg aagaacgcag cagcggcgcg 540
aacgtgagcg gcagcagccg caccccgacc catcagagca gccgcaaccc gaacaacacc 600
agcagctgct gctgctttgg ctttggcggc aaa 633
<210> 150
<211> 466
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 150
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Arg Glu Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Asn Pro Gln Gln Glu Asn His Gln His Glu His Glu His Glu His
20 25 30
Asp Leu Lys Pro Pro Val Pro Ser Arg Ile Ser Arg Leu Pro Pro Ser
35 40 45
Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Gly Ala Asp Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Thr Thr Ser Asn Gly Asn Gly Glu Ser Thr Ala Val Gln Ile Ala
65 70 75 80
Ala Gln Thr Phe Ser Phe Arg Glu Leu Ala Ala Ala Thr Lys Asn Phe
85 90 95
Arg Pro Gln Ser Phe Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Arg Val Tyr Lys
100 105 110
Gly Arg Leu Glu Thr Thr Gly Gln Val Val Ala Val Lys Gln Leu Asp
115 120 125
Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe Leu Val Glu Val Leu Met
130 135 140
Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val Asn Leu Ile Gly Tyr Cys
145 150 155 160
Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr Glu Phe Met Pro Phe Gly
165 170 175
Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro Pro Asp Lys Glu Pro Leu
180 185 190
Asp Trp Asn Thr Arg Met Lys Ile Ala Ala Gly Ala Ala Lys Gly Leu
195 200 205
Glu Tyr Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro Val Ile Tyr Arg Asp Phe
210 215 220
Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly Tyr His Pro Lys Leu Ser
225 230 235 240
Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Val Gly Asp Lys Ser His Val
245 250 255
Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr Cys Ala Pro Glu Tyr Ala
260 265 270
Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val
275 280 285
Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ser Thr Arg
290 295 300
Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Thr Trp Ala Arg Pro Leu Phe Ser
305 310 315 320
Asp Arg Arg Lys Phe Pro Lys Leu Ala Asp Pro Gln Leu Gln Gly Arg
325 330 335
Tyr Pro Met Arg Gly Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Val Ala Ser Met Cys
340 345 350
Ile Gln Glu Gln Ala Ala Ala Arg Pro Leu Ile Gly Asp Val Val Thr
355 360 365
Ala Leu Ser Phe Leu Ala Asn Gln Ala Tyr Asp His Arg Gly Ala Gly
370 375 380
Asp Asp Lys Lys Asn Arg Asp Asp Lys Gly Gly Arg Ile Leu Lys Asn
385 390 395 400
Asp Val Gly Gly Gly Ser Gly Arg Arg Trp Asp Leu Glu Gly Ser Glu
405 410 415
Lys Asp Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg Met Leu Asn Asn Arg Asp
420 425 430
Leu Asp Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys Ile Trp Gly Glu Asn
435 440 445
Trp Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Ala Gln Gly Ser Phe Asp Gly Ser
450 455 460
Asn Ala
465
<210> 151
<211> 468
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 151
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Arg Glu Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Asn Pro Gln Gln Glu Asn His Gln His Glu His Glu His Glu His
20 25 30
Glu His Asp Leu Lys Pro Pro Val Pro Ser Arg Ile Ser Arg Leu Pro
35 40 45
Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Gly Ala Asp Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Thr Thr Ser Asn Gly Asn Gly Glu Ser Thr Ala Val Gln
65 70 75 80
Ile Ala Ala Gln Thr Phe Ser Phe Arg Glu Leu Ala Ala Ala Thr Lys
85 90 95
Asn Phe Arg Pro Gln Ser Phe Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Arg Val
100 105 110
Tyr Lys Gly Arg Leu Glu Thr Thr Gly Gln Val Val Ala Val Lys Gln
115 120 125
Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe Leu Val Glu Val
130 135 140
Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val Asn Leu Ile Gly
145 150 155 160
Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr Glu Phe Met Pro
165 170 175
Phe Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro Pro Asp Lys Glu
180 185 190
Pro Leu Asp Trp Asn Thr Arg Met Lys Ile Ala Ala Gly Ala Ala Lys
195 200 205
Gly Leu Glu Tyr Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro Val Ile Tyr Arg
210 215 220
Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly Tyr His Pro Lys
225 230 235 240
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Val Gly Asp Lys Ser
245 250 255
His Val Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr Cys Ala Pro Glu
260 265 270
Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe
275 280 285
Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ser
290 295 300
Thr Arg Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Thr Trp Ala Arg Pro Leu
305 310 315 320
Phe Ser Asp Arg Arg Lys Phe Pro Lys Leu Ala Asp Pro Gln Leu Gln
325 330 335
Gly Arg Tyr Pro Met Arg Gly Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Val Ala Ser
340 345 350
Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Ala Arg Pro Leu Ile Gly Asp Val
355 360 365
Val Thr Ala Leu Ser Phe Leu Ala Asn Gln Ala Tyr Asp His Arg Gly
370 375 380
Ala Gly Asp Asp Lys Lys Asn Arg Asp Asp Lys Gly Gly Arg Ile Leu
385 390 395 400
Lys Asn Asp Val Gly Gly Gly Ser Gly Arg Arg Trp Asp Leu Glu Gly
405 410 415
Ser Glu Lys Asp Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg Met Leu Asn Asn
420 425 430
Arg Asp Leu Asp Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys Ile Trp Gly
435 440 445
Glu Asn Trp Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Ala Gln Gly Ser Phe Asp
450 455 460
Gly Ser Asn Ala
465
<210> 152
<211> 468
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 152
Met Gly Cys Phe Ser Cys Phe Asp Ser Arg Glu Asp Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Pro Asn Pro Gln Gln Glu Asn His Gln His Glu His Glu His Glu His
20 25 30
Glu His Asp Leu Lys Pro Pro Val Pro Ser Arg Ile Ser Arg Leu Pro
35 40 45
Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Gly Ala Asp Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Thr Thr Ser Asn Gly Asn Gly Glu Ser Thr Ala Val Gln
65 70 75 80
Ile Ala Ala Gln Thr Phe Ser Phe Arg Glu Leu Ala Ala Ala Thr Lys
85 90 95
Asn Phe Arg Pro Gln Ser Phe Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Arg Val
100 105 110
Tyr Lys Gly Arg Leu Glu Thr Thr Gly Gln Val Val Ala Val Lys Gln
115 120 125
Leu Asp Arg Asn Gly Leu Gln Gly Asn Arg Glu Phe Leu Val Glu Val
130 135 140
Leu Met Leu Ser Leu Leu His His Pro Asn Leu Val Asn Leu Ile Gly
145 150 155 160
Tyr Cys Ala Asp Gly Asp Gln Arg Leu Leu Val Tyr Glu Phe Met Pro
165 170 175
Phe Gly Ser Leu Glu Asp His Leu His Asp Leu Pro Pro Asp Lys Glu
180 185 190
Pro Leu Asp Trp Asn Thr Arg Met Lys Ile Ala Ala Gly Ala Ala Lys
195 200 205
Gly Leu Glu Tyr Leu His Asp Lys Ala Asn Pro Pro Val Ile Tyr Arg
210 215 220
Asp Phe Lys Ser Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Gly Tyr His Pro Lys
225 230 235 240
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Gly Pro Val Gly Asp Lys Ser
245 250 255
His Val Ser Thr Arg Val Met Gly Thr Tyr Gly Tyr Cys Ala Pro Glu
260 265 270
Tyr Ala Met Thr Gly Gln Leu Thr Val Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe
275 280 285
Gly Val Val Phe Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ser
290 295 300
Thr Arg Pro His Gly Glu Gln Asn Leu Val Thr Trp Ala Arg Pro Leu
305 310 315 320
Phe Ser Asp Arg Arg Lys Phe Pro Lys Leu Ala Asp Pro Gln Leu Gln
325 330 335
Gly Arg Tyr Pro Met Arg Gly Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Val Ala Ser
340 345 350
Met Cys Ile Gln Glu Gln Ala Ala Ala Arg Pro Leu Ile Gly Asp Val
355 360 365
Val Thr Ala Leu Ser Phe Leu Ala Asn Gln Ala Tyr Asp His Arg Gly
370 375 380
Ala Gly Asp Asp Lys Lys Asn Arg Asp Asp Lys Gly Gly Arg Ile Leu
385 390 395 400
Lys Asn Asp Val Gly Gly Gly Ser Gly Arg Arg Trp Asp Leu Glu Gly
405 410 415
Ser Glu Lys Asp Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ala Arg Met Leu Asn Asn
420 425 430
Arg Asp Leu Asp Arg Glu Arg Ala Val Ala Glu Ala Lys Ile Trp Gly
435 440 445
Glu Asn Trp Arg Glu Lys Arg Arg Gln Ser Ala Gln Gly Ser Phe Asp
450 455 460
Gly Ser Asn Ala
465
<210> 153
<211> 2046
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 153
gtcaacgaga aaagtttcga aggaaggatt tactgagagt ttcagcaacg cgtcattgtt 60
aattcgcaat tggtaatagt gtgaacactc gtggacgaca aaagaagctg cttcttcatc 120
tctctctctc tccttctctt tctctctcaa ctccaattcg tttttaccag tttcgaatct 180
gaacaaagtt gggtttttta ttggtaccca gaatctcaat tctccttctt tccttctggg 240
tataggaaaa gtctcgcctt tttttatatt tatccaatcg ctcctgttca ttgattcccc 300
agtaggattg tagtttttgg ttattgggaa aattgagtaa aggaggagat gggttgtttc 360
tcgtgttttg attcgagtga tgacgagaag ctgaatccag ttgatgaatc taatcatggt 420
cagaagaaac aatcacaacc gacagtatcc aataacatat ctggactccc ttcaggtggg 480
gagaagctta gctcaaagac caatggagga tcaaaaaggg agctactgct tccaagggat 540
ggacttggac aaattgctgc tcatacattt gctttccgcg agcttgctgc tgcaactatg 600
aactttcatc ctgacacttt cttaggcgaa ggtggatttg gacgtgtcta caaaggaagg 660
cttgacagca ccggtcaggt tgttgctgtt aaacaactag acaggaatgg tctacaaggt 720
aacagagaat ttctggtaga ggttcttatg ctcagtcttc ttcatcatcc caacttagtc 780
aaccttattg gttattgtgc tgatggagat caacgcctct tggtctacga gtttatgccg 840
ttaggatcat tggaagatca cctccacgat cttccaccgg ataaggaggc cttagattgg 900
aacatgagaa tgaaaatagc tgctggtgcg gcgaaaggat tggaatttct acatgataag 960
gcaaaccctc cggttattta tagagatttt aagtcatcaa atattttact ggatgagggt 1020
ttccacccta agctttctga ttttggactt gctaaactcg gaccaacggg agacaaatct 1080
catgtctcca ctagagttat gggaacttat ggttattgtg ctcccgagta cgcaatgacg 1140
ggacaattga cagtaaaatc agatgtctac agttttggtg tggtttttct cgagctcatt 1200
actggtcgca aagctataga cagcgagatg cctcatggag agcagaacct ggtggcttgg 1260
gctcgcccat tgttcaacga caggcgaaag ttcataaaac tggctgatcc aaggttaaag 1320
gggcggtttc caacgcgtgc actctaccaa gctttagctg tggcatcaat gtgcatccaa 1380
gaacaggcgg ctacacgtcc tctcatagca gatgttgtca ctgcactctc ctatcttgca 1440
aaccaagctt atgatccaag taaagatgat agtagaagaa accgggatga aagaggtgca 1500
aggttaataa caaggaacga cgatggaggt ggctcgggaa gtaaattcga tttagaaggt 1560
tcagagaaag aagattcacc gagagagaca gctcggatat tgaaccgaga tatcaatagg 1620
gagcgtgcgg ttgcagaggc taagatgtgg ggagagagtt tgagggagaa acgaagacag 1680
agcgagcagg gtacttcaga gagcaacagt accgggtaga accggtttgg gtcggtcttg 1740
accctttttt gttcttattt ctctcaagac tctcatttat tgtcaaacat agaaaacaaa 1800
caaaaaaaca ttgggacgac gagttgctgt acattatata tgtgatgttg caatatgggc 1860
acaaaggtta ataaccaaaa ctctctaatt gagattctgg agagttgtga agattgttca 1920
tgtaaatttt gtagtctttc tatttttaaa ttttgacaga tatgtgtttc atgatgagtc 1980
acatgtggcg atgtttacgt ctcattgaaa gattgaatag caaagatcca atattaagtg 2040
tttctg 2046

Claims (52)

1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：
编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，其中所述HRS蛋白包含异源担子菌特异性蛋白酶切割位点。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述HRS蛋白包含：
a.PBS1多肽；
b.如SEQ ID NO:1中所示的PBS1多肽；
c.与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留PBS1活性；
d.RIN4多肽；
e.如SEQ ID NO:148中所示的RIN4多肽；或者
f.与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留了RIN4活性。
3.如权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中所述异源担子菌特异性切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29，或与SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29具有至少65％同一性的序列。
4.如权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中所述异源担子菌特异性切割位点包含以下的切割序列：SEQ ID NO:52或与SEQ ID NO:52具有至少65％同一性的序列。
5.如权利要求3或4所述的重组核酸分子，其中所述异源担子菌特异性切割位点编码以下中的至少一种：
a.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
b.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
c.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
d.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
e.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
f.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
g.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
h.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或者
I.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
6.如权利要求3或4所述的重组核酸分子，其中所述切割序列包含编码以下中的至少一种的核苷酸序列：HWVNFL(SEQ ID NO:9)、YARFYL(SEQ ID NO:17)、TLEEWF(SEQ ID NO:21)、QVFEFL(SEPID NO:24)、QMIFLR(SEQ ID NO:26)、IFLWSA(SEQ ID NO:27)、NLEFLY(SEQ IDNO:28)或TFTFFQ(SEQ ID NO:29)。
7.如权利要求3或4所述的重组核酸分子，其中所述切割序列包含编码TLEEWFQVFEFL(SEQ ID NO:52)的核苷酸序列。
8.如权利要求1-8中任一项所述的HRS蛋白，其中所述HRS蛋白源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。
9.如权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中参考SEQ ID NO:1和53-97中任一个，所述担子菌特异性异源切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。
10.如权利要求1-10中任一项所述的重组核酸分子，其中所述异源担子菌特异性蛋白酶来自层锈菌属植物病原体物种。
11.如权利要求11所述的重组核酸分子，其中所述层锈菌属植物病原体物种是豆薯层锈菌，并且所述病害是亚洲大豆锈病。
12.如权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子，其中所述异源担子菌特异性蛋白酶切割位点的切割激活RPS5抗性蛋白。
13.如权利要求13所述的重组核酸分子，其中所述RPS5蛋白与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性，并且引发超敏细胞死亡反应。
14.如权利要求1-14中任一项所述的重组核酸分子，其中所述HRS蛋白的内源植物病原体特异性蛋白酶切割位点被异源担子菌特异性蛋白酶切割位点替代。
15.如权利要求1-15中任一项所述的重组核酸分子，其中编码所述超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列与植物中具有活性的启动子可操作地连接。
16.如权利要求1-16中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子进一步包含表达盒，所述表达盒包含在植物中具有活性的启动子，所述启动子与R基因可操作地连接，所述R基因在所述担子菌特异性蛋白酶切割位点处切割后被所述HRS蛋白激活。
17.一种载体，所述载体包含如权利要求1-17中任一项所述的重组核酸分子。
18.一种重组蛋白，所述重组蛋白包含植物病原体特异性蛋白酶的经修饰超敏反应底物(HRS)蛋白，其中所述经修饰HRS蛋白包含异源担子菌特异性蛋白酶切割位点，并且其中经修饰HRS蛋白由如权利要求1-17中任一项所述的重组核酸分子编码。
19.一种植物、植物细胞、植物部分或种子，所述植物、植物细胞、植物部分或种子包含如权利要求1-17中任一项所述的重组核酸分子。
20.如权利要求20所述的植物、植物细胞、植物部分或种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞是双子叶植物。
21.如权利要求21所述的植物、植物部分、植物细胞或种子，其中所述双子叶植物是大豆属的成员。
22.一种增强植物中对由担子菌植物病原体物种感染的植物病原体抗性的方法，所述方法包括：
在所述植物中表达编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，所述超敏反应底物蛋白包含如权利要求1-17中任一项所述的异源担子菌特异性切割位点，其中所述蛋白酶对所述异源担子菌特异性切割位点的切割赋予对由所述担子菌植物病原体物种引起的病害的抗性。
23.如权利要求23所述的方法，其中编码所述HRS蛋白的核苷酸序列通过转化引入到所述植物中。
24.如权利要求23所述的方法，其中编码所述HRS蛋白的核苷酸序列通过基因组修饰引入到所述植物中。
25.如权利要求23-25中任一项所述的方法，
其中所述担子菌植物病原体物种是豆薯层锈菌，并且所述病害是亚洲大豆锈病(ASR)；
其中所述异源担子菌特异性切割位点是层锈菌属特异性异源切割位点，所述切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:9、17、21、24、26、27、28或29，或者与SEQID NO:9、17、21、24、26、27、28或29具有至少65％同一性的序列；并且
其中，所述蛋白酶在所述切割位点处切割所述HRS蛋白赋予对豆薯层锈菌和ASR改善的抗性。
26.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：
编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，其中所述HRS蛋白具有异源线虫纲特异性蛋白酶切割位点。
27.如权利要求27所述的重组核酸分子，其中所述HRS蛋白包含：
a.PBS1多肽；
b.如SEQ ID NO:1中所示的PBS1多肽，
c.与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留PBS1活性；
d.RIN4多肽；
e.如SEQ ID NO:148中所示的RIN4多肽；或者
f.与SEQ ID NO:148具有至少80％、85％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽保留了RIN4活性。
28.如权利要求27或28所述的重组核酸分子，其中所述异源线虫纲特异性切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51，或与SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列。
29.如权利要求29所述的重组核酸分子，其中所述切割序列包含编码以下的核酸序列：
a.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
b.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
c.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
d.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
f.具有氨基酸数目在5至35范围内并且其中包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
30.如权利要求27-30中任一项所述的重组核酸分子，其中所述HRS蛋白源自拟南芥属、大豆属、大麦属或小麦属。
31.如权利要求27-31中任一项所述的重组核酸分子，其中参考SEQ ID NO:1和53-97中任一个，所述异源线虫纲特异性切割位点位于约氨基酸位置238至约氨基酸位置248之间。
32.如权利要求27-32中任一项所述的重组核酸分子，其中编码所述HRS蛋白的核苷酸序列的内源植物蛋白酶切割位点被所述异源线虫纲特异性切割位点的核苷酸序列替代。
33.如权利要求27-33中任一项所述的重组核酸分子，其中所述线虫纲植物病原体物种是胞囊线虫属、球胞囊线虫属、根结线虫属或肾形线虫属。
34.如权利要求34所述的重组核酸分子，其中所述线虫纲植物病原体物种是大豆胞囊线虫。
35.如权利要求27-35中任一项所述的重组核酸分子，其中编码所述超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列与植物中具有活性的启动子可操作地连接。
36.如权利要求27-35中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子进一步包含表达盒，所述表达盒包含在植物中具有活性的启动子，所述启动子与编码抗性蛋白的R基因可操作地连接，所述R基因在所述线虫纲特异性蛋白酶切割位点处切割后被所述HRS蛋白激活。
37.如权利要求27-37中任一项所述的重组核酸分子，其中所述线虫纲特异性蛋白酶切割位点的切割激活所述抗性蛋白RPS5并且引发局部超敏细胞死亡反应。
38.如权利要求48所述的重组核酸分子，其中所述抗性蛋白RPS5是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的蛋白，并且引发超敏细胞死亡反应。
39.一种载体，所述载体包含如权利要求27-39中任一项所述的重组核酸分子。
40.一种植物、植物部分、植物细胞或种子，所述植物、植物部分、植物细胞或种子包含如权利要求27-39中任一项所述的重组核酸分子。
41.如权利要求41所述的植物、植物部分、植物细胞或种子，其中所述植物、植物部分、植物细胞或种子是双子叶植物。
42.如权利要求42所述的植物、植物部分、植物细胞或种子，其中所述双子叶植物是大豆属的成员。
43.一种如权利要求41-43中任一项所述的植物的转基因种子。
44.一种如权利要求41-43中任一项所述的植物的转化植物细胞。
45.一种重组蛋白，所述重组蛋白包含植物病原体特异性蛋白酶的经修饰超敏反应底物(HRS)蛋白，其中所述经修饰HRS蛋白包含具有异源线虫纲特异性切割位点的氨基酸序列，并且其中所述经修饰HRS蛋白由如权利要求27-39中任一项所述的重组核酸分子编码。
46.一种增强植物中对线虫纲植物病原体物种感染的植物病原体抗性的方法，所述方法包括：
在所述植物中表达编码植物病原体特异性蛋白酶的超敏反应底物(HRS)蛋白的核苷酸序列，所述超敏反应底物蛋白包含如权利要求27-39中任一项所述的异源线虫纲特异性切割位点，其中所述蛋白酶对所述异源线虫纲特异性切割位点的切割赋予所述植物对由所述线虫纲植物病原体物种引起的病害的抗性。
47.如权利要求47所述的方法，其中所述线虫纲植物病原体物种是大豆胞囊线虫，并且所述病害是大豆胞囊线虫病(SCN)；
其中所述异源线虫纲特异性切割位点是胞囊线虫属特异性异源切割位点，所述切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：SEQ ID NO:34、35、48、49、50或51，或与SEQ IDNO:34、35、48、49、50或51具有至少65％同一性的序列；并且
其中，所述蛋白酶在所述切割位点处切割所述HRS蛋白赋予对大豆胞囊线虫和SCN改善的抗性。
48.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：与编码植物病原体特异性蛋白酶的HRS蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子，并且其中HRS蛋白具有异源层锈菌属-胞囊线虫属特异性切割位点，其中切割位点的切割赋予对层锈菌属和胞囊线虫属植物病原体物种中至少一种的改善的抗性。
49.如权利要求49所述的重组核酸分子，其中所述HRS蛋白是SEQ ID NO:1的PBS1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一种，或者其中所述至少一种HRS蛋白是SEQ ID NO:148的RIN4或与SEQ IDNO:148具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一种。
50.如权利要求49或50所述的重组核酸分子，其中所述异源切割位点包含选自SEQ IDNO:8-29中至少一个的层锈菌属的第一切割序列，以及选自SEQ ID NO:30-51中至少一个的胞囊线虫属的第二切割序列。
51.如权利要求49-51中任一项所述的重组核酸分子，其中所述异源切割位点包含选自由以下组成的组的切割序列：编码SEQ ID NO:98-145中至少一个的序列，或与SEQ ID NO:98-145具有至少65％同一性的序列，其中所述切割位点的切割使得对层锈菌属和胞囊线虫属中至少一种的抗性得到改善。
52.一种分离的切割位点肽，所述分离的切割位点肽用于插入到HRS蛋白中以产生工程化抗性，其中所述切割位点肽选自由SEQ ID NO:8-52和98-145组成的组。
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