CN116887843A - 用于降低接受维持性透析的患者中的草酸盐/酯水平的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，在治疗或预防在接受透析治疗的未患有原发性高草酸尿症1‑3(PH)的患者中草酸盐/酯相关疾患中的用途。在本发明的进一步方面，包含卢马西兰和内多西兰的组合物减少或阻断接受透析的非PH患者中的肝脏草酸盐/酯产生，以预防或治疗所述患者中心血管事件、心源性猝死、充血性心力衰竭和过高死亡率。本发明还涉及给药、制备包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的方法以及包含卢马西兰和/或内多西兰及其使用说明书的试剂盒。

Description

用于降低接受维持性透析的患者中的草酸盐/酯水平的组合 物和方法

技术领域

本发明涉及包含卢马西兰(Lumasiran)和/或内多西兰(Nedosiran)的组合物，在治疗或预防在接受透析治疗的未患有原发性高草酸尿症1-3(PH)的患者中草酸盐/酯相关疾患(oxalate-related disorder)中的用途。在本发明的进一步方面，包含卢马西兰和内多西兰的组合物减少或阻断接受透析的非PH患者中的肝脏草酸盐/酯产生，以预防或治疗所述患者中心血管事件、心源性猝死、充血性心力衰竭和过高死亡率。本发明还涉及给药、制备包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的方法以及包含卢马西兰和/或内多西兰及其使用说明书的试剂盒。

背景技术

草酸盐/酯(草酸类化合物，oxalate)通过饮食或肝脏中产生的人体代谢副产物被吸收到人体中。草酸盐/酯不能被降解，而是通过两种不同的途径从人体排出：肾脏和肠道。¹在整个生命过程中通过尿液和肠腔维持草酸盐/酯的排泄至关重要，因为过量的草酸盐/酯水平对人体系统有潜在的毒性。原发性和继发性高草酸尿症(hyperoxaluria)的身体表现是两种不同的草酸盐/酯相关病症，其特征在于例如尿液草酸盐/酯排泄异常。原发性高草酸尿症(PH，1-3型)是一种酶活性缺陷的遗传性疾患，其中肝脏中草酸盐/酯病理性过量产生。大量草酸盐/酯负荷的长期后果是肾结石、肾功能不全，甚至需要透析，以及草酸盐/酯在内脏和组织中弥漫性沉积。1型PH是最常见和最严重的形式(占所有PH类型的80％)：即使在儿童期也可能致命，肝肾移植被认为是唯一的病因治疗。²继发性高草酸尿症可能由多种因素引起，诸如饮食中草酸盐/酯或草酸盐/酯前体的摄入量增加或肠道吸收或排泄草酸盐/酯或脂肪的变化以及肠道微生物群的改变或肠道或肾小管草酸盐/酯转运蛋白表达的遗传变异。

由继发性高草酸尿症引起的草酸盐/酯相关慢性肾脏疾病也是一个日益严重的全球健康问题。例如，其特征是尿液中草酸盐/酯浓度逐渐增加。草酸盐/酯浓度升高有在远侧肾小管和连接管中形成草酸钙晶体的风险，随后是形成草酸钙沉积或肾脏钙化，还会导致肾结石和肾功能下降。当草酸钙负荷超过肾脏的排泄能力时，草酸钙开始沉积在所有体液、骨骼和软组织中。

近年来，已经建立了新的药物疗法，利用RNA干扰原理在mRNA水平上特异性抑制肝脏草酸盐/酯的形成。目前，有两种化合物正在开发中：来自Alnylam的卢马西兰(ALN-GO1)，用于治疗1型PH；以及来自Dicerna Pharmaceuticals的内多西兰(DCR-PHXC)，用于治疗所有3种类型的PH。卢马西兰阻断羟基酸氧化酶HAO1(乙醇酸氧化酶，GO)的翻译。

卢马西兰目前正在临床试验中测试其在PH1患者中抑制HAO1的能力。PH1是一种常染色体隐性遗传病，由编码肝脏丙氨酸乙醛酸转氨酶(AGT)的AGXT基因中的突变引起。这些突变导致酶的量或功能减少，从而阻止乙醛酸盐/酯的分解。乙醛酸盐/酯积累并被还原为乙醇酸盐/酯，而乙醇酸盐/酯又被HAO1转化为草酸盐/酯。来自卢马西兰的令人鼓舞的数据已于2018年6月在OxalEurope会议上正式公布。2020年6月，在ERA-EDTA大会上公布的临床III期数据显示，在26名肾小球滤过率(GFR)≥30ml/min/1.73m²的PH1患者中，给药卢马西兰导致尿草酸盐/酯从基线下降约65％，血浆草酸盐/酯下降39.8％(ILLUMINATE-A研究)。在正常功能的肾脏中，GFR为每分钟90-130毫升。低于60ml/min的值表明严重肾损害。已向EMA(欧洲药品管理局)和FDA(食品和药物管理局)提交了上市许可申请。同时，该药自2020年底起已获得EMA和FDA的正式批准。卢马西兰的上市许可申请和适应症仅针对患有PH-1的患者；所有研究均仅在PH-1患者中进行，或在健康志愿者中进行I期研究。

内多西兰阻断肝脏特异性乳酸脱氢酶-A(LDH-A.)的翻译。³对内多西兰的研究仅包括患有PH 1-3的患者。目前，该产品正在2项II期研究(NCT03847909、NCT04580420)和一项III期研究(NCT04042402)中进行评估。最近，初步积极结果于2020年3月公布，报告了尿草酸盐/酯浓度相应降低(反映内源性草酸盐/酯负荷)。⁴

草酸盐/酯浓度不仅在患有原发性或继发性高草酸尿症的患者中升高，而且在接受血液透析或腹膜透析的其他患者(＝非PH透析接受患者)中也升高。非PH透析接受患者很难通过肾脏排出草酸盐/酯。这是一个严重但迄今为止被忽视的问题，这些患者的肝脏仍然继续产生草酸盐/酯，并且还从饮食中吸收草酸盐/酯。迄今为止，草酸盐/酯在非PH透析接受患者人群中的临床意义尚不清楚，尽管许多论文报道了草酸盐/酯与炎症以及慢性肾功能衰竭进展之间存在联系的证据。^5,6

迄今为止，尚缺乏支持非PH透析接受患者的草酸盐/酯负荷与健康结果和继发性疾病风险之间关联的临床证据。此外，透析患者尚未接受针对高草酸盐/酯水平的治疗和监测。

这是非PH透析接受患者的医疗保健中未得到满足的紧迫医疗需求。

发明内容

鉴于现有技术，本发明的技术问题是提供一种替代或改进的方法，用于治疗或预防在接受透析治疗但未患有原发性高草酸尿症1-3(PH)的患者中与血清和血浆中的草酸盐/酯浓度相关的医学状况。

该技术问题还可以被视为提供用于治疗与治疗相关水平的血浆或血清草酸盐/酯浓度或者器官或组织中的草酸盐/酯沉积物相关的医学病症和/或降低其风险的手段。该技术问题还可以被视为提供用于预防和/或治疗接受透析的非PH患者中草酸盐/酯或草酸盐/酯沉积物相关疾患、更具体地草酸盐/酯相关心血管疾患、草酸盐/酯沉积物相关心血管疾患、血管钙化和过高死亡率的手段。

该问题通过独立权利要求的特征得以解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。

因此，本发明涉及包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其用于治疗或预防在接受透析治疗且未患有原发性高草酸尿症1-3(PH)的患者中草酸盐/酯相关疾患(草酸类化合物相关疾患)。

根据本文提供的本发明，包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物以及包含所述组合物的药物产品对接受透析治疗的未患有原发性高草酸尿症的患者(进一步称为非PH透析患者)的血清或血浆中的草酸盐/酯水平具有治疗相关的作用。特别考虑与草酸盐/酯相关草酸钙沉积关联的疾患，诸如涉及血浆或血清中治疗相关水平的草酸盐/酯的草酸钙沉积相关疾患。

本发明还涉及在此类治疗或预防中联合给药治疗有效量的卢马西兰和治疗有效量的内多西兰。血浆和血清中治疗相关水平的草酸盐/酯可导致体内草酸钙复合物的形成和沉积。非PH透析患者(几乎)不通过肾脏排出草酸盐/酯，但继续在肝脏中产生草酸盐/酯。本领域已经表明，阐明草酸盐/酯在非PH透析患者中的重要性以及鉴定通过阻断或减少草酸盐/酯产生而对接受透析的非PH患者中的草酸盐/酯水平和形成的草酸盐/酯沉积物具有治疗作用的组合物是困难的。如果能够实现这样的治疗效果，则可以降低接受透析的非PH患者的血清或血浆草酸盐/酯浓度，从而延迟或中断草酸盐/酯沉积物的形成或帮助消除草酸盐/酯沉积物并治疗或预防相关疾病。

本发明提供了这样的意义和这样的效果，其在下面进一步描述。通过卢马西兰和/或内多西兰在非PH透析患者中抑制或减少内源性肝草酸盐/酯产生并且从而抑制或减少草酸盐/酯浓度，提供了降低透析患者的高死亡率风险的一种潜在的新治疗策略，如本文所述。本发明提供了对草酸盐/酯相关死亡率中的非PH透析患者的生存具有令人惊讶的有益影响的方法。

因此，本文提供了药物组合物的用途，特别是在治疗与治疗相关血清和血浆草酸盐/酯浓度、草酸盐/酯晶体沉积和受损的非PH肾功能关联的疾病中的用途。由于在用卢马西兰和/或内多西兰治疗期间，对血清和血浆中草酸盐/酯浓度以及草酸盐/酯沉积物的治疗相关影响可能需要一些时间，因此非PH透析患者的治疗期为数天、数周、数月至数年或终生。

如本文详细描述的，包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物代表了开发有效措施以治疗或预防接受透析的非PH患者中的草酸盐/酯相关疾患的新方法。

本文描述的新的医疗用途和适应症能够治疗疾病，对于该疾病，医学界不知道接受透析的非PH患者中存在草酸盐/酯相关疾患，并且患者迫切需要预防和治疗草酸盐/酯相关疾患和死亡的方法。目前，所述患者根本没有得到治疗或没有得到适当的治疗，因为没有有效的药物可用于本文描述的患者组。从本文提供的实验支持(实施例1，图1A)可以明显看出，血浆草酸盐/酯水平的增加与透析时间(图1A)和患者尿排出量显著关联。从实施例中可以明显看出，依赖透析的患者的草酸盐/酯浓度与死亡风险增加出乎意料地关联(图2A)。在图2B中，高血清草酸盐/酯水平进一步与4D患者群组中心力衰竭导致的死亡以及心源性猝死关联。这些特性的组合是本领域技术人员无法预测的，因此涉及本发明的非显而易见的特殊技术特征。

令人惊讶的是，当卢马西兰和/或内多西兰在没有草酸途径的潜在疾患的需要透析的非PH患者中用于治疗轻度升高的草酸盐/酯浓度(即血浆中<40μM)时，该患者心源性猝死和充血性心力衰竭的风险显著降低。

在现有技术中，尚不知道在没有过量草酸盐/酯负荷或由于草酸盐/酯负荷引起的疾病的终末肾衰竭患者中，用卢马西兰和/或内多西兰治疗也具有心血管疾病和心血管死亡的显著降低风险。特别地，现有技术没有认识到即使少量的草酸盐/酯也可能是有毒的并且增加心血管死亡的风险。先前已知需要非常高浓度的草酸盐/酯，特别是>60μM，诸如100μM。具有轻度升高的草酸盐/酯浓度<40μM(例如20μM)的患者对降低草酸盐/酯浓度的治疗(例如卢马西兰和/或内多西兰)不敏感。尚未发现草酸盐/酯浓度<40μM是心血管疾病和心血管死亡的风险或原因。特别有益的是将草酸盐/酯浓度降低至正常水平，例如，对于具有轻度升高的草酸盐/酯浓度<40μM的非PH患者，降低至<0.5mmol/24小时收集尿液或血浆中<20μM。

在一个实施方式中，用卢马西兰和/或内多西兰治疗改善的非PH患者是透析依赖性的并且不存在潜在的草酸盐/酯相关疾病，其中潜在的草酸盐/酯相关疾病包括肾结石、肠道高草酸尿症、原发性高草酸尿症和肝脏疾病。在一个实施方式中，卢马西兰和/或内多西兰适用于治疗或预防在草酸盐/酯浓度低于40μM并且不存在肾结石、肠道高草酸尿症和肝病的非pH透析患者中草酸盐/酯相关心血管事件。到目前为止，尚无法确定需要透析的非PH患者中轻度升高的草酸盐/酯浓度(低于40μM的)与诸如心源性猝死的心血管事件风险增加之间的病理生理学关联。实施例1显示，在患有终末肾衰竭的不具有草酸途径的潜在疾患的非PH患者中，轻度升高的血浆草酸盐/酯浓度(例如<40μM)对心血管疾病有显著的负面影响。在一个实施方式中，轻度升高的血浆草酸盐/酯浓度<40μM。在一个实施方式中，轻度升高的血浆草酸盐/酯浓度<30μM。在一个实施方式中，轻度升高的血浆草酸盐/酯浓度<20μM。

在一个实施方式中，卢马西兰抑制靶细胞、优选肝细胞中乙醇酸氧化酶的mRNA翻译。卢马西兰通过每次给药剂量降低血浆或血清草酸盐/酯浓度。

在一个实施方式中，内多西兰抑制靶细胞、优选肝细胞中肝脏特异性LDH-A的mRNA翻译。内多西兰通过每次给药剂量降低血浆或血清草酸盐/酯浓度。在一个实施方式中，当在本发明的组合物中给药卢马西兰和/或内多西兰时，加大了草酸盐/酯浓度的降低。

在一个实施方式中，通过量化来自非PH患者的血浆和/或血清中的草酸盐/酯水平来确定草酸盐/酯浓度的降低，优选在接受透析治疗时进行。在一个实施方式中，如实施例中所述确定来自接受透析的非PH患者的血浆和血清中的草酸盐/酯。

在一个实施方式中，在开始治疗或预防接受血液透析的非PH1患者之前，在长时间间隔后的第一次预约时在透析治疗之前收集血液样品。所述血液样品优选用于根据预分析并通过实施例中描述的氧化酶测定来测定血浆和血清中的草酸盐/酯浓度。样品处理和测量的更多细节在实施例中描述。

卢马西兰和内多西兰在临床研究中进行了测试，以治疗患有原发性高草酸尿症(PH，1-3型)的患者，这是一种遗传决定的代谢疾病，其中肝脏中发生病理性草酸盐/酯生成过多，导致患者体内草酸盐/酯负荷过高。Alnylam的卢马西兰(专利US202002062581；US20200165616)和Dicerna的内多西兰(WO 2015100436)是研究中的皮下给药的RNA干扰(RNAi)治疗剂，其阻断负责肝脏草酸盐/酯生成的蛋白质的mRNA翻译。卢马西兰抑制乙醇酸氧化酶的翻译，内多西兰阻断肝脏特异性LDH-A的翻译。卢马西兰和内多西兰的上市许可申请和应用领域专门覆盖患有PH 1-3的患者。与安慰剂相比，卢马西兰(ILLUMINATE-A研究，NCT03681184)平均使尿草酸盐/酯减少53.5％。对于内多西兰(PHYOX2/3；NCT03847909)，超过50％的患者达到正常的尿草酸盐/酯水平。

因此，本发明代表了在非PH透析患者中通过阻断乙醇酸氧化酶mRNA翻译与抑制肝脏特异性LDH-A的mRNA翻译的组合或每种治疗中仅一种来降低草酸盐/酯浓度的定制干预。

在一些实施方式中，草酸盐/酯相关疾患包括接受透析治疗的非PH患者中的心血管疾病。

如下所示，通过进行彻底的临床研究，发明人令人惊讶地证明了血清和血浆中的草酸盐/酯浓度与心血管疾病之间的关联，并且与其相关地，发现了包含卢马西兰和/或内多西兰的药物组合物的有益的医疗用途。

通过用卢马西兰和/或内多西兰降低治疗水平的草酸盐/酯浓度，可以对接受透析治疗的非PH患者的草酸盐/酯相关心血管疾病产生有益效果。

在一个实施方式中，本发明的一个目的是提供用于预防或治疗接受透析治疗的非PH患者中由草酸盐/酯引起的心血管疾病的组合物。发明人在两个独立的患者群组(实施例1和2)中惊奇地发现，非PH患者透析患者中草酸盐/酯的较高血浆或血清浓度与心血管疾病、优选心源性猝死关联。草酸钙被认为是非PH透析患者血管钙化的主要原因。

本发明涉及血清和血浆中具有治疗相关草酸盐/酯水平的非PH透析患者发生心血管疾病的风险。本公开提供的组合物可能够预防、延迟或阻止草酸盐/酯相关的心血管疾病的发展。

在一个实施方式中，血清草酸盐/酯与心肌梗死和卒中之间的关联也与复合事件，心力衰竭和心源性猝死的总体发现一致。草酸盐/酯浓度所涉及的机制是令人惊讶。如实施例1所示，所有患者中五分之一具有血浆草酸盐/酯浓度≥30μM。本领域技术人员不可能预料到高血清草酸盐/酯水平与由于心力衰竭或心源性猝死导致的过高死亡率关联。

在两个独立群组中验证任何已鉴定的关联是本公开的特别优点，也是临床研究的关键优点。此外，在具有和不具有二次诊断的在不同群体中诸如糖尿病和高胆固醇血症的验证代表了本公开的另一个优点。几项研究报告了同种异体肾移植中糖尿病与增加的尿草酸盐/酯排泄或草酸钙沉积之间的关联。本公开首次显示了与心血管疾病和心源性死亡的关联，并提供了预防或治疗所述疾病的手段。

在一些实施方式中，草酸盐/酯相关的心血管疾病与接受透析治疗的非PH患者的器官中的草酸钙沉积关联。

草酸盐/酯是草酸的盐和酯。肾功能不足或衰竭会导致进行性高草酸血症、血浆中草酸含量增加以及血浆草酸钙过饱和。血浆或血清中草酸盐/酯的浓度至关重要，草酸盐/酯浓度增加到过饱和水平会导致远端肾小管和连接管中形成草酸钙晶体，随后形成草酸钙沉积，或者组织和器官例如心脏、骨骼、软组织、肾脏、皮肤、血管(包括动脉和静脉)的钙化。可能会发生草酸盐/酯晶体相关的炎症。

如实施例1和实施例2所示，两个群组中的非PH透析患者均超过草酸钙过饱和阈值30μM，其中草酸钙过饱和导致草酸钙微晶的形成和器官中的草酸盐/酯沉积，以及血管和心脏损伤。发明人提供了草酸盐/酯、心脏功能受损和心源性猝死之间的病理生理学联系。在具有草酸钙水平过饱和的患者中，这两个群组中的过高死亡风险出乎意料地显著明显。在一个实施方式中，本发明提供了在治疗相关水平上预防、停止或减少草酸盐/酯和草酸钙沉积物形成的措施。在草酸盐/酯相关心血管疾患的早期阶段，钙化和心脏事件已经变得可见，诸如心力衰竭，如实施例3和4中明显可见的。

在一个实施方式中，包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物预防、减少或阻止草酸盐/酯相关疾患、草酸钙沉积和草酸钙沉积相关疾患的进展或发生。根据本公开的组合物还能够减少或消除草酸盐/酯形成，从而减少全身草酸盐/酯沉积。

在一个实施方式中，考虑到本文所示的改善效果，本发明在本文还提供了包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的新的医学用途。

在一些实施方式中，草酸盐/酯相关心血管疾病与接受透析治疗的非PH患者中>20μM、优选>30μM的血浆或血清草酸盐/酯浓度关联。

草酸盐/酯相关疾患随着总草酸盐/酯与游离草酸根比率的持续增加而进展。如实施例2-4所示，草酸盐/酯浓度≥30μM的接受透析的非PH患者的死亡率是低于此截止值的患者的2.9倍(图2A)。与草酸盐/酯浓度<40μM的患者相比，草酸盐/酯浓度≥40μM的接受透析的非PH患者的死亡率增加超过4倍(图2B)。发明人公开了接受透析的非PH患者的血清或血浆中的草酸盐/酯浓度与过高死亡率之间关联的证据。

在一些实施方式中，草酸盐/酯浓度与心血管事件关联，优选地与接受透析治疗的非PH患者的心源性猝死和充血性心力衰竭关联。

在一个实施方式中，包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物旨在用于治疗和/或预防草酸钙沉积相关的心血管疾患，其中所述用途包括治疗和/或预防心血管事件和心血管死亡，优选心源性猝死、心律失常或充血性心力衰竭。在一个实施方式中，包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物旨在用于治疗和/或预防草酸钙沉积相关死亡的用途。

本领域已广泛研究了阐明透析患者中的心源性猝死的病理生理学的假定原因和策略，并且存在透析处方的指导，包括已知因素，诸如电解质变化、酸碱平衡、容量控制、血压波动和其他重要的透析参数，但没有成功。发明人惊奇地发现草酸盐/酯是重要的靶标。

在一些实施方式中，所述组合物减少在接受透析治疗的非PH患者中肝脏草酸盐/酯产生并因此降低血浆或血清草酸盐/酯浓度。

参与内源性肝草酸盐/酯合成的主要酶包括乙醇酸氧化酶(GO)、丙氨酸:乙醛酸转氨酶、D-氨基酸氧化酶和乳酸脱氢酶(LDH)。在肝脏草酸盐/酯代谢中，乙醇酸盐/酯被氧化为乙醛酸盐/酯，然后乙醛酸盐/酯转化为草酸盐/酯。丙氨酸:乙醛酸转氨酶催化乙醛酸盐/酯的分解。乙醛酸盐/酯转化为草酸盐/酯可以由GO或LDH催化。在一个实施方式中，两项独立、互补研究的组合临床试验将草酸盐/酯浓度鉴定为非PH透析患者的死亡率、尤其是心源性猝死的危险因素。

在现有技术中，已知通过适当的饮食改变来减少草酸盐/酯摄入的措施。为了减少内源性草酸盐/酯的产生，优选肝脏草酸盐/酯的产生，已经开发了RNAi疗法(即卢马西兰和内多西兰)以阻断参与内源性乙醛酸盐/酯分解为草酸盐/酯的蛋白质(即GO和LDH)的mRNA翻译。在现有技术中，仅公开了卢马西兰和内多西兰在PH 1-3患者中的用途并进行了临床测试。

在一个实施方式中，卢马西兰或内多西兰减少接受透析治疗的非PH患者中肝脏草酸盐/酯产生，并因此降低治疗相关水平的血浆或血清草酸盐/酯浓度，其中所述减少肝脏草酸盐/酯产生是由阻断GO mRNA翻译的卢马西兰或阻断LDH mRNA翻译的内多西兰介导的。

在一个实施方式中，当向接受透析治疗的非PH患者给药时，卢马西兰和内多西兰的联合给药提供了减少肝脏草酸盐/酯产生的改善的效果。

在一些实施方式中，本发明的卢马西兰或内多西兰的效力是参考实现一定水平的靶基因敲低所需的靶细胞的细胞质中存在的dsRNA的拷贝数来确定的。优选地，如果与未处理的靶细胞相比，当存在于靶细胞的细胞质中时能够产生靶mRNA的至少50％的敲低，则卢马西兰或内多西兰是有效的。在一个实施方式中，卢马西兰和内多西兰对靶基因的功效可以通过定量所述靶基因的mRNA水平来获得，优选通过定量PCR。

在一些实施方式中，卢马西兰和内多西兰的靶细胞是肝细胞。

在一个实施方式中，本公开提供了包含卢马西兰和/或内多西兰的措施和治疗策略，用于治疗非PH透析患者以降低治疗相关水平的内源草酸盐/酯产生。在一个实施方式中，所述措施和治疗策略包括本文提供的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述组合物可以与饮食措施或其他治疗一起额外给药，或者作为用于降低治疗相关水平的血浆和血清草酸盐/酯浓度的独立治疗剂给药。

如实施例4所示，在较高的草酸盐/酯浓度下，复合心血管事件的发生率(如4D研究所示)显著增加(图3)。令人惊讶的是，最高草酸盐/酯四分位的非PH透析患者达到复合终点的风险增加了40％。技术人员不可能预料到较高的基线草酸盐/酯浓度也与因充血性心力衰竭导致的死亡风险逐渐升高相关。令人意外的是，最高四分位数的患者死于心力衰竭的可能性比最低四分位数的患者高超过2倍(表5和图3)。此外，发明人公开了心源性猝死的风险作为单独的结果测量，随着草酸盐/酯四分位数的升高而逐渐且显著地增加。与最低四分位数的患者相比，最高四分位数的患者猝死风险高出62％，如图3和实施例4所示。

本领域技术人员无法预料血浆和血清草酸盐/酯与心肌梗死以及卒中之间的关联也与复合事件、心力衰竭和心源性猝死一致。这些是高度相关的发现，为通过使用根据本公开的组合物改善草酸盐/酯相关的心血管疾患(包括与草酸钙沉积关联的那些，优选心源性猝死、心力衰竭和过高死亡率)的治疗或预防提供了机会。

这也证明了治疗非PH透析患者血浆和血清中草酸盐/酯浓度的措施以及对如本公开中所提供的适当手段的高需求。

在一个实施方式中，所述措施和治疗策略适合于预防过高死亡率和致命性心脏疾病。在另一个实施方式中，所述措施和治疗策略适合于治疗和改善与血浆和血清中的草酸盐/酯和/或组织和器官中的草酸盐/酯沉积物关联的心血管事件。

在一些实施方式中，所述组合物在透析治疗时以治疗相关剂量皮下、静脉内或口服给药。

在一个实施方式中，本公开还提供了如本文所述的治疗和/或预防草酸盐/酯相关的心血管疾患的方法，该方法包括向有需要的受试者给药药学有效量的如本文定义的药物组合物，其包含药学有效量的药物组合物。在一个实施方式中，卢马西兰或内多西兰或其衍生物是药学上可接受的化合物。

优选的治疗相关剂量对肝内源草酸盐/酯产生具有抑制作用，从而降低血清或血浆中的草酸盐/酯浓度，其中任何剂量也在透析治疗之前、期间、结束时或之后给药。

正常受试者中的血浆草酸盐/酯浓度范围为1.3-3.1μM。因此，在一些实施方式中，给药本文公开的组合物可用于降低血浆或血清草酸盐/酯浓度，使得受试者不再表现出高于正常范围的或与临床高草酸血症相关的血清或血浆草酸盐/酯水平。在一些实施方式中，给药本文公开的组合物在治疗后将受试者的血清或血浆草酸盐/酯降低至<30μM。

在一些实施方式中，治疗或预防是用本文描述的组合物的单剂量(例如一次性治疗)来完成的。在一些实施方式中，单剂量实现持久治疗或预防。如本文所用，持久治疗和/或预防包括至少从一次透析治疗持续至下一次透析治疗或每2、3、4、5、6、7、8、9或10次透析治疗或持续患者一生的治疗和/或预防。在一些实施方式中，治疗或预防通过多于一次的剂量来完成，例如两次治疗、三次治疗，或在患者的生命期间，包括本文所述的组合物的本文所述的剂量方案。如本文所用，在透析治疗时进行的治疗或预防对于功效而言是最有利的，对患者温和，并且还与较少的副作用相关。

在一个实施方式中，接受连续透析治疗的非PH1患者的治疗或预防是在透析治疗期间以本文所述的时间间隔和给药方案进行的。在一个实施方式中，优选在透析治疗时对接受间歇性透析治疗的非PH1患者进行治疗或预防。在一个实施方式中，持久治疗或预防还包括在一次透析治疗和接下来的另一次透析治疗之间的时期内的一次或多次治疗和/或预防，其中可以在所述时期内进行一次或多次另外的透析治疗。在一个实施方式中，临时治疗或预防还包括在一次透析治疗和接下来的另一次透析治疗之间的时期内的一次或多次治疗和/或预防，其中可以在所述时期内进行一次或多次另外的透析治疗。

在一个实施方式中，在一次透析治疗和随后的下一次透析治疗之间的时间段内的所述治疗或预防的数量也可以针对两次或更多个连续透析治疗之间的每个后续时间段而变化。在一些实施方式中，治疗或预防之间的时间间隔包括几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(2、3、4、5或6)的时期，优选4周至3个月。在一些实施方式中，从一次治疗或预防到下一次后续治疗的时间间隔可以相同、几乎相同或可以改变。

在一些实施方式中，本发明包括在受试者中治疗或预防草酸盐/酯相关心血管疾患的方法，其中所述方法包括给药本文所述的一种或多种组合物或药物制剂。在一个实施方式中，组合物和/或制剂皮下、静脉内或口服给药。

这里描述的治疗的另一个主要优点是副作用的发生率最小(如果有的话)。

在一些实施方式中，卢马西兰和/或内多西兰以足以提供治疗效果的浓度或量给药。本领域技术人员无需过多努力即可确定这种效果。该量涉及单独使用化合物时的治疗有效量，或涉及当化合物与第二化合物组合使用时的治疗有效量。在优选的实施方式中，化合物以根据本领域已经建立的剂量方案例如已经发布或授予监管批准(例如由FDA或EMA)的剂量方案的浓度或量给药，或以目前在2期或3期临床试验期间评估的剂量，和/或根据I期试验的最大允许剂量。在一个实施方式中，化合物以低于本领域已经建立的剂量方案例如已经发布或授予监管批准(例如由FDA或EMA)的剂量方案的浓度或量给药，或低于当前在2期或3期临床试验期间评估的剂量，和/或低于根据I期试验的最大允许剂量。

在这样的治疗中，组合物的卢马西兰和/或内多西兰可以同时或顺序给药于所述患者，卢马西兰在内多西兰之前或之后给药。卢马西兰和内多西兰也可以通过相同或不同的给药途径给药。

上述实施方式，关于具体的剂量、时间和应用类型，是基于本文所述的化合物的临床允许的或当前试验的剂量，单独给药或如本文所述组合给药。

在一些实施方式中，给药剂量和频率适合于实现血浆或血清草酸盐/酯浓度<30μM和/或低于治疗开始前的血浆或血清草酸盐/酯浓度，优选比治疗开始前低至少20％的血浆或血清草酸盐/酯浓度。

卢马西兰和内多西兰及其衍生物是有效且低毒性的化合物，其减少或阻止非PH透析患者中肝脏草酸盐/酯产生。这种组合的有益效果不能从本领域的任何建议中得出。

在本发明的实施方式中，如本文所述的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物可以给药于任何接受透析的非PH患者，例如治疗性地(例如，血浆或血清草酸盐/酯浓度>20μM，优选地>30μM和/或心血管疾病的患者)或预防性地(例如，具有患草酸盐/酯相关心血管疾病的风险的患者，或血浆或血清草酸盐/酯浓度>20μM但尚未发展严重健康问题的患者)。

基于本文提供的实验和书面支持，技术人员能够结合本领域的常识来实施本发明。通过采用实施例中描述的定量测量，或通过使用替代的定量方法来测定血浆或血清中草酸盐/酯浓度、草酸盐/酯沉积物、血管钙化或心血管事件的降低，可以确定和调整药物化合物的组合及其必要剂量，以获得由于本发明组合物的应用而产生的有益效果。

优选的治疗相关剂量对肝内源性草酸盐/酯产生具有抑制作用，降低血清或血浆中的草酸盐/酯浓度，其中所述剂量将所述草酸盐/酯浓度降低至<30μM和/或低于治疗开始前，优选血浆或血清草酸盐/酯浓度比治疗开始前低至少20％。

在一个实施方式中，将本文所述的组合物给药于血浆或血清草酸盐/酯浓度>20μM、优选>25μM、更优选>30μM并且患有或不患有草酸盐/酯相关心血管疾病的非PH透析患者。

在一个实施方式中，将本文所述的组合物给药于具有患充血性心力衰竭、卒中和/或心肌梗死风险的非PH透析患者。

在一个实施方式中，将本文所述的组合物给药于具有心源性猝死或总体过高死亡率的风险的非PH透析患者。

在一个实施方式中，将本文所述的组合物给药于患有器官或组织中草酸盐/酯沉积物、优选器官或组织中草酸钙沉积物、血管和/或心脏中更多草酸钙沉积物的非PH透析患者。

在一些实施方式中，给药所述组合物预防或减少草酸钙引起的治疗相关水平的血管钙化。

本发明还提供了用于预防或治疗受试者中由草酸钙引起的治疗相关水平的血管钙化的组合物。

在一个实施方式中，给药所述组合物降低了血浆或血清中的草酸盐/酯浓度，并降低了接受透析治疗的非PH患者中作为冠状动脉钙化的主要成分的草酸钙沉淀的风险，从而预防心血管疾病的发生或进展。

在一个实施方式中，将本文所述的组合物给药于具有草酸盐/酯相关血管钙化的非PH透析患者。

在一个实施方式中，在立即冷却、脱蛋白和酸化后，并且使用草酸-氧化酶测定法测定作为治疗靶标的血浆或血清草酸盐/酯浓度，优选如实施例所述。另外，本发明包括监测、测定或定量包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物与治疗开始前的草酸盐/酯浓度相比是否降低血浆或血清中的草酸盐/酯浓度的方法，优选如实施例所述。在一个实施方式中，接受间歇性透析的非PH1患者在开始透析治疗之前直接进行血液采样，其中所述血液采样可以用于量化作为治疗靶标的血浆或血清草酸盐/酯浓度。

本发明还涉及包含卢马西兰和/或内多西兰或其盐的核酸、dsNA或杂交复合物的组合物，其中所述核酸、dsNA或杂交复合物以当引入接受透析治疗的非PH患者的细胞时有效降低其靶基因的胞质mRNA水平的量存在。

在一个实施方式中，卢马西兰和/或内多西兰可以被化学修饰。

在一些实施方式中，核酸、dsNA或杂交复合物优选包被至药学上可接受的载体以及配制在药学缓冲溶液中。在一个实施方式中，本文所述的药物组合的特征在于卢马西兰及其衍生物在与药学上可接受的载体混合的药物组合物中，并且内多西兰及其衍生物在与药学上可接受的载体混合的单独的药物组合物中。因此，在一些实施方式中，本发明的药物组合可以涉及彼此接近的两种单独的组合物或剂型的存在。组合的化合物不需要存在于单一组合物中。

单一制剂、组合制剂或组合物是本领域技术人员已知的，他们能够评估适合于组合中的两种活性化合物的相容性载体材料和制剂形式。在一些实施方式中，可与载体材料组合以产生单一剂量的活性成分的量根据所治疗的患者和具体给药途径而变化。

本发明进一步涉及制备根据权利要求10和11所述的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的方法。

在一个实施方式中，为了制备本发明的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，所述化合物被直接添加或可以与脂质(例如，阳离子脂质)复合、包装在脂质体中、或以其他方式递送至靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以通过直接皮肤应用、透皮应用或注射，在离体或体内局部递送至相关组织，无论其掺入或不掺入生物聚合物中。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的卢马西兰和/或内多西兰及其使用说明书。在一个实施方式中，卢马西兰处于与药学上可接受的载体混合的药物组合物中，并且内多西兰处于与药学上可接受的载体混合的单独的药物组合物中。在一个实施方式中，卢马西兰和内多西兰与药学上可接受的载体混合在单一药物组合物中。在一个实施方式中，卢马西兰和内多西兰在空间上接近但在单独的容器和/或组合物中存在于试剂盒中。

本发明还涉及用于在受试者中治疗和/或预防草酸盐/酯相关心血管疾患和/或与治疗相关水平的血清或血浆草酸盐/酯浓度和/或草酸盐/酯沉积物相关的医学病症的药物组合。

药物组合物、治疗、患者、靶基因和靶标的进一步实例在下文详细描述。

本发明关于治疗和诊断方法的特征以及用于治疗各种医学病症的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的描述适用于组合物本身，反之亦然。

具体实施方式

本发明涉及治疗或预防在接受透析的非原发性高草酸尿症患者中草酸盐/酯相关疾患。

本文使用的所有词语和术语应具有本领域技术人员通常赋予的相同含义，除非上下文指示不同的含义。所有以单数形式使用的术语均应包括该术语的复数形式，反之亦然。

根据本公开，本文提供了药物形式的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其对草酸盐/酯相关疾患并且特别是草酸钙沉积相关疾患，诸如涉及高草酸血症的草酸钙沉积相关疾患具有作用。高草酸血症的特征是血浆和血清中草酸盐/酯浓度高，导致例如草酸钙复合物在体内形成和沉积。本领域已证明难以鉴定对自身形成的草酸钙沉积物和/或高草酸血症中形成的草酸钙沉积物有影响的药物组合物。如果这种作用是可能的，则它可以帮助延迟或阻止草酸盐/酯沉积物的形成或帮助溶解草酸盐/酯沉积物并可能逆转相关疾病，例如心血管并发症。本文发现了根据本公开的组合物的这种效果，其在下文进一步描述。

卢马西兰和内多西兰

Alnylam开发的卢马西兰是一种靶向羟酸氧化酶1(HAO1)的研究性皮下注射RNA干扰(RNAi)治疗剂，正在开发用于治疗原发性高草酸尿症1型(PH1)(专利US202002062581；US20200165616)。HAO1编码乙醇酸氧化酶(GO)。通过沉默HAO1和降解GO酶，卢马西兰抑制草酸盐/酯的产生——草酸盐/酯是直接影响PH1病理生理学的代谢物。PH1是一种极其罕见的疾病，其特征是草酸盐/酯形成过多。尿草酸盐/酯水平升高与疾病进展为终末期肾衰竭和该疾病的其他全身并发症关联(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1283)。

卢马西兰达到了ILLUMINATE-A研究(NCT03681184)的主要终点，与安慰剂相比，尿草酸盐/酯平均减少了53.5％(p＝1.7x10-14)。此外，尿草酸盐/酯浓度也较基线下降了65.4％。研究中评估的所有次要终点均得到满足。这包括尿草酸盐/酯水平接近正常化(84％)或正常化(52％)的患者比例，而安慰剂组为0％。卢马西兰给药显示出良好的安全性和耐受性，没有出现严重的不良事件。轻度注射部位反应是最常见的药物相关不良事件。卢马西兰采用Alnylam的增强稳定化学(ESC)GalNAc缀合物技术，该技术允许皮下给药，具有增强的功效、延长的作用持续时间和广泛的治疗范围。基于ILLUMINATE-A研究的结果，Alnylam向欧洲药品管理局(EMA)提交了卢马西兰的上市许可申请(MAA)。该申请已获得EMA的加速评估流程批准。在欧盟和美国均获得孤儿药资格认定卢马西兰获得了欧洲药品管理局(EMA)授予的优先药物(PRIME)资格。同时，卢马西兰自2020年底起已获得EMA和FDA的正式批准。

由Dicerna Pharmaceuticals开发的内多西兰是一种靶向肝乳酸脱氢酶的研究性皮下注射RNA干扰(RNAi)治疗剂，这种酶催化乙醛酸代谢途径的最后一步，可导致PH1、PH2或PH3患者草酸盐/酯过量产生(WO 2015100436)。内多西兰使用Dicerna Pharmaceuticals的GalXC技术。LDH酶抑制作用特异性发生在肝脏中，因为内多西兰中掺入了GalNAc靶向配体，该配体与肝细胞表面的Asialo糖蛋白受体(ASGPR)特异性结合。内多西兰是一种正在开发的RNAi疗法，用于治疗所有三种已知类型的PH。PHYOX2/3多中心关键试验(NCT03847909)于2020年12月完成入组。2020年10月对PHYOX3研究的中期分析表明，所有接受内多西兰的参与者，无论PH1或PH2亚型，到第180天时尿草酸盐/酯水平均达到正常或接近正常。在中期分析时达到第180天的13名参与者中，有10名(100％)的PH1参与者和三名PH2参与者中的两名(67％)实现了正常的尿草酸盐/酯排泄。

如本文所用，术语“草酸盐/酯晶体沉积物”、“草酸盐/酯沉积物”、“沉积物”可与也在本文中使用的术语“草酸钙沉积物”和“草酸钙复合物”互换，或至少与之相关。

RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是调节基因沉默的自然细胞过程。如本文所用，术语“干扰RNA”或“RNAi”、“dsNA”或“干扰RNA序列”包括单链RNA(例如，成熟miRNA、ssRNAi寡核苷酸、ssDNAi寡核苷酸)、双链RNA(即，双链体RNA，诸如siRNA、切丁酶(dicer)底物dsRNA、shRNA、aiRNA或pre-miRNA)，或杂交复合物，即DNA-RNA杂交体或DNA-DNA杂交体，当干扰RNA与靶基因或序列的mRNA在同一细胞中时，能够减少或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导与干扰RNA序列互补的mRNA的降解或翻译抑制)。因此，干扰RNA是指与靶mRNA序列互补的单链RNA或由两条互补链或由单条自互补链形成的双链RNA。干扰RNA可以与靶基因或序列具有实质上或完全的同一性。干扰RNA的序列可以对应于全长靶基因或其部分序列。优选地，干扰RNA或DNA/RNA分子是化学合成的。卢马西兰和内多西兰的上述每个专利文献的公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

术语“靶基因表达的抑制”是指干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)在mRNA水平上沉默、减少或抑制靶基因表达的能力。为了检查基因沉默的程度，将测试样品(例如，表达靶基因的培养物中的细胞的样品)或测试哺乳动物(例如，哺乳动物诸如人或动物模型诸如啮齿动物(例如小鼠)或非人灵长类动物模型(例如猴))暴露于沉默、减少或抑制靶基因的表达的干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)。将测试样品或测试哺乳动物中靶基因的表达与未暴露于或未给药干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)的对照样品(例如，表达靶基因的培养物中的靶细胞的样品)或对照哺乳动物(例如，哺乳动物诸如人或动物模型诸如啮齿动物(例如，小鼠)或非人灵长类动物模型(例如，猴))中的靶基因的表达进行比较。100％的值可以指定为对照样品或对照哺乳动物中靶基因的表达。在具体实施方式中，当测试样品或测试哺乳动物中的靶基因表达水平相对于对照样品或对照哺乳动物中的靶基因表达水平为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现了靶基因表达的沉默、抑制或降低。换句话说，与未暴露于或未给药干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)的对照样品或对照哺乳动物中的靶基因表达水平相比，干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)将测试样品或测试哺乳动物中的靶基因的表达沉默、减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。用于测定靶基因表达水平的合适测定法包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术测定蛋白质或mRNA水平，诸如斑点印迹、Northern印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能和本领域技术人员已知的表型测定法。

如本文所用，术语“靶基因”是指编码参与肝内源草酸盐/酯产生的蛋白质的核酸序列，所述蛋白质优选为乙醇酸氧化酶(GO)、丙氨酸:乙醛酸转氨酶、D-氨基酸氧化酶和乳酸脱氢酶(LDH)，更优选为GO或LDH。

如本文所用，术语“靶细胞”是指其中表达针对草酸盐/酯治疗的干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)的靶基因的活细胞。

如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA及其杂交体。DNA可以是例如反义分子、RNA-DNA双链体、PCR产物、嵌合序列、衍生物和这些组的组合的形式。RNA可以是小干扰RNA(siRNA)、切丁酶底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA及其组合的形式。DNA和RNA可以形成DNA-RNA杂交体。

治疗有效且具有治疗相关性

短语“治疗有效”旨在包括在合理的医学判断范围内的过度毒性、刺激、过敏反应和/或其他问题或并发症，但与合理的效益/风险比相称。如本文所用，是指适合与受试者接触使用的化合物、组合物、组合和/或剂型，其产生本身有助于治疗和/或治愈疾病的结果。

试剂或治疗手段(例如干扰RNA，即卢马西兰和/或内多西兰)的“治疗相关量”、“治疗相关剂量”或“治疗有效量”是足以产生所需效果的量，例如相对于在不存在干扰RNA的情况下检测到的正常表达水平抑制靶序列的表达。当用干扰RNA获得的水平相对于对照为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现了靶基因或序列表达的抑制。用于测量靶基因或序列的表达的合适测定法包括，例如，使用本领域技术人员已知的技术测定蛋白质或RNA水平，例如定量PCR、Northern印迹、Western印迹、原位杂交、ELISA、酶功能和本领域技术人员已知的表型测定法。

干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)引起的草酸盐/酯浓度的“减少”、“降低”、“下降”或“削弱”是指给定干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)引起的草酸盐/酯产生的可检测的下降。干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)导致草酸盐/酯浓度降低的程度可以相对于不存在干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)的情况下，优选在开始用卢马西兰和/或内多西兰治疗之前的草酸盐/酯浓度水平来确定。与开始用卢马西兰和/或内多西兰治疗之前检测到的草酸盐/酯浓度相比，可检测的降低可为约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。干扰RNA引起的草酸盐/酯浓度的降低通常通过首次和/或任何进一步给药干扰RNA(即卢马西兰和/或内多西兰)后体内应答细胞产生草酸盐/酯的减少或透析患者的血浆和血清中草酸盐/酯浓度的降低来理解和测量。

如本文所用，“全身给药”是指导致卢马西兰和/或内多西兰在生物体内广泛生物分布的组合物的给药。全身给药是指将治疗量的药剂暴露于身体的优选部位。组合物的全身给药可以通过本领域已知的任何方式来完成，例如静脉内、皮下、腹膜内。

草酸盐/酯、草酸盐/酯沉积物和草酸盐/酯相关疾患

如本文所用，术语“草酸盐/酯晶体沉积物”、“草酸盐/酯沉积物”、“沉积物”等可与本文中也使用的术语“草酸钙沉积物”和“草酸钙复合物”互换，或至少与之相关。体内草酸盐/酯沉积有时被称为“草酸中毒”，尤其发生在原发性高草酸尿症患者中。草酸盐/酯(草酸类化合物)可以游离草酸根、与二价金属结合的游离草酸根、与蛋白质和脂质缔合的草酸盐/酯以及二价金属草酸盐固体晶体的形式在血浆和血清中循环。草酸盐/酯相关疾患随着总草酸盐/酯与游离草酸根比率的持续增加而进展。高草酸血症决定血浆中草酸水平的临床升高。出于方法学原因，通常测定血浆中的草酸盐/酯。草酸盐/酯是草酸的盐和酯。

透析患者血浆中的草酸盐/酯浓度可以轻度升高，其中所述轻度升高的血浆草酸盐/酯浓度小于40μM、35μM、30μM、25μM、20μM、15μM、10μM或5μM。

透析患者血浆中的草酸盐/酯浓度可以显著升高，其中所述显著升高的血浆草酸盐/酯浓度高于40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM或甚至更高。

特别考虑使用药物组合物来治疗与血浆和血清草酸盐/酯水平升高、频繁的全身草酸盐/酯晶体沉积和肾功能受损相关的病症。由于用卢马西兰和/或内多西兰治疗后溶解的草酸盐/酯沉积物的排泄可能需要一些时间，因此对于患有此类疾患的个体预计治疗期为数月至数年。软组织钙化和草酸盐/酯沉积是接受透析的患者的常见问题。

卢马西兰和内多西兰通过抑制参与草酸盐/酯生成途径的靶基因的表达来介导主动减少草酸盐/酯的形成。草酸盐/酯水平的这种降低可以促进现有的游离草酸根从血浆/血清转移至肠道。这个过程破坏了游离血浆草酸根、蛋白质相关草酸盐/酯和沉积草酸钙之间的平衡。平衡的破坏会产生游离草酸根并导致沉积的草酸钙晶体溶解。由于晶体溶解是由所讨论的抗衡离子的周围质量浓度控制的，因此晶体可能会在饱和浓度以下短暂溶解。由于溶解，血浆和尿液中的草酸盐/酯也可能中间增加。这包括在本发明内。

用于量化作为治疗靶标的血浆或血清草酸盐/酯浓度的方法包括立即冷却、脱蛋白和酸化以及使用草酸盐/酯氧化酶测定。在一个实施方式中，接受间歇性透析的非PH1患者在开始透析治疗之前直接进行血液采样，其中所述血液采样可以用于量化作为治疗靶标的血浆或血清草酸盐/酯浓度。该方法在实施例中更详细地描述。

透析

如本文所用，术语透析是指所有形式的透析，包括血液透析、血液滤过、血液透析滤过、血液灌流和腹膜透析，优选血液透析和腹膜透析。在医学上，透析包括从血液中去除尿液物质的治疗方法(肾脏替代手术)。肾衰竭是一种严重的并发症，需要独立治疗。透析可以控制肾衰竭，因此是一种重要且通常是唯一的治疗方法，但往往不足以清除过量的草酸盐/酯，因此草酸盐/酯可能会沉积在肾脏和其他器官和组织中。

血液透析和腹膜透析是透析治疗的优选类型。血液透析治疗利用患者的血液去除患者体内的废物、毒素和多余的水分。患者被连接到血液透析机，并且患者的血液通过机器泵送。将导管插入患者的静脉和动脉，以使血液流入和流出血液透析机。血液流经机器透析器，从血液中去除废物、毒素和多余的水分。净化后的血液返回患者体内。血液透析治疗持续几个小时，并在治疗中心进行。

在腹膜透析中，透析溶液(也称为透析液)通过导管注入患者的腹膜腔。透析液与腹膜腔的腹膜接触。由于扩散和渗透，即跨膜产生渗透梯度，废物、毒素和多余的水从患者的血流通过腹膜进入透析液。用过的透析液从患者体内排出，去除患者体内的废物、毒素和多余的水分。腹膜透析疗法还包括连续流动腹膜透析(“CAPD”)、自动腹膜透析(“APD”)、潮汐流APD和连续流腹膜透析(“CFPD”)。

透析治疗方法可以在各种血液透析和腹膜透析技术中使用和实施，如例如美国专利号5,244,568、5,247,434、5,350,357、5,662,806、6,592,542和7,318,892中所描述的。

心血管疾病

心血管疾病是影响心脏或血管(动脉和静脉)的一大类疾病。心血管疾病包括心律失常、血管疾病、心肌梗死、心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化、再狭窄、冠心病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、动脉高血压、心脏纤维化、卒中、心源性猝死综合征、心力衰竭、缺血性心肌病、心肌梗死、冠状动脉钙化。这些疾病有相似的病因、机制和治疗方法。大多数心血管疾病都有共同的危险因素，包括炎症、纤维化、糖尿病、胆固醇和血管沉积物。草酸盐/酯在心脏沉积，称为“心脏草酸中毒”，可能导致充血性心力衰竭、心功能受损、心源性栓塞、血管和心脏损伤、舒张功能障碍，并导致传导障碍和猝死。

组合物

出于本发明的目的，本文所用的组合物也是“药物组合物”并且组合了一种或多种RNAi治疗剂(即卢马西兰和/或内多西兰)的存在，优选彼此紧密接近。在一个实施方式中，该组合适合联合给药。

在一个实施方式中，本文所述的药物组合物的特征在于卢马西兰与药学上可接受的载体混合存在，并且内多西兰与药学上可接受的载体混合存在于单独的药物组合物中。因此，在一些实施方式中，本发明的药物组合可以指存在彼此紧密接近的两种单独的组合物或剂型。组合的活性成分不需要存在于单一组合物中。

在一个实施方式中，本文所述的药物组合的特征在于根据前述权利要求中任一项所述的卢马西兰和/或内多西兰以紧邻但在单独的容器和/或组合物中存在于试剂盒中。生产试剂盒在本领域技术人员的技术范围内。在一个实施方式中，包含两种单独的活性成分的单独的组合物可以作为组合一起包装和销售。在其他实施方式中，在组合(例如在单个目录中)但在单独的包装中提供两种活性成分被理解为组合。

在一个实施方式中，本文所述的药物组合的特征在于根据前述权利要求中任一项的卢马西兰和/或内多西兰与药学上可接受的载体混合地组合在单一药物组合物中。组合制剂或组合物是本领域技术人员已知的，他们能够评估适合于组合中的两种活性成分的相容性载体材料和制剂形式。

抑制剂

根据本发明，“mRNA翻译抑制剂”上下文中的“抑制剂”被认为是导致减慢、抑制、阻断或以其他方式干扰或负面影响所述靶标在不存在抑制剂的情况下诱导、执行或展现的活性、功能、表达或信号传导的任何试剂、物质、化合物、分子或其他手段。术语“试剂”、“物质”、“化合物”、“分子”可以互换使用。例如，RNAi治疗剂，即卢马西兰和/或内多西兰，可以直接或间接地影响参与细胞内草酸盐/酯产生的靶基因的mRNA翻译。本文所述的抑制剂也可称为“药剂”。在本文描述的组合和方法的上下文中对“药剂”的提及应理解为RNA干扰和mRNA翻译抑制剂。优选的抑制剂是本文所述的那些。

联合给药：

根据本发明，术语“联合给药”和“联合疗法”，也称为共同给药或联合治疗，在一些实施方式中涵盖本文所述化合物的单独制剂的给药，由此治疗可以彼此在几分钟内、彼此在同一小时、在同一天、在同一周或在同一个月内进行。两种药剂的交替给药被认为是联合给药的一种实施方式。术语联合给药涵盖交错给药，由此可以给药一种药剂或治疗，随后给药第二种药剂或治疗，任选地随后再次给药第一种药剂或治疗，等等。同时给药多种药剂或治疗被认为是联合给药的一种实施方式。在一些实施方式中，同时给药涵盖例如同时服用包含多种药剂或治疗的多种组合物，例如通过输注、注射、透析治疗或通过同时摄取单独的片剂来口服，优选通过透析治疗的任何给药。还可以使用组合药物，例如包含本文公开的多种药剂或治疗以及任选的另外的心血管管理药物的单一制剂，以便在单次给药或剂量中共同给药各种组分。

一种药剂或治疗的组合疗法或组合给药可以在与待组合的另一种药剂或治疗给药之前或之后，间隔范围为数分钟至数周。在分开给药第二药剂或治疗和第一药剂或治疗的实施方式中，通常会确保每次递送的时间之间没有过长的时间段，使得第一和第二药剂或治疗仍能够对治疗部位发挥有利的组合效果。在这种情况下，预期人们在彼此约1小时至4周内用两种方式接触受试者。然而，在一些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中各次给药之间相隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(2、3、4、5或6)。

在本发明的含义中，联合给药涵盖本文所述的多种药剂的任何形式的给药，使得通过两种药剂的联合给药实现有益的额外治疗效果，优选协同效果。

医学适应症

在本发明的一个方面，提供了如本文所述的根据本发明的药物组合物，其用于治疗与血清和血浆中的草酸盐/酯水平相关的医学病症，其中与血清和血浆中的草酸盐/酯水平相关的医学病症优选是心血管疾病或与草酸钙沉积相关的心血管疾病。

本文所用的“患者”或“受试者”是指人类，优选接受透析的患者，但也可以是任何其他哺乳动物，例如家畜(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。术语“患者”优选是指患有或疑似患有心血管疾病并接受透析的“受试者”，不包括患有原发性高草酸尿症1-3(PH)的那些。

原发性高草酸尿症是一种罕见的乙醛酸代谢紊乱。其特点是草酸盐/酯过多。由此产生的症状包括偶发性肾结石、复发性肾结石和肾钙质沉着症、终末期肾病和系统性草酸中毒。该疾病分为三种不同的类型：原发性高草酸尿症1型、2型和3型。接受本文所述的透析治疗的患者组不包括诊断为原发性高草酸尿症1型、2型或3型的患者。

如本文所用，“具有心血管疾病症状的非PH透析患者”是呈现血管钙化、心肌梗死、充血性心力衰竭、幸存的心脏骤停、心律失常、心血管事件并且具有增加的死亡风险的受试者。如本文所用，术语“处于发生草酸盐/酯相关心血管疾患的风险中的非PH透析患者”涉及优选不同于一般人群中的任何给定人的受试者或患者，其具有增加的(例如高于平均水平)发生草酸盐/酯相关心血管疾患和/或草酸盐/酯沉积物相关心血管疾患的风险。在一些实施方式中，所述患者具有血管钙化的症状或心肌梗死的症状或充血性心力衰竭的症状或心血管事件的症状或死亡风险增加的症状。在一些实施方式中，所述患者没有血管钙化的症状或心肌梗死的症状或充血性心力衰竭的症状或心血管事件的症状或死亡风险增加的症状。在一些实施方式中，处于出现血管钙化症状或心肌梗死症状或充血性心力衰竭症状或心血管事件症状或死亡风险增加的症状的风险中的所述患者呈现治疗相关水平的血清或血浆草酸盐/酯浓度或草酸盐/酯沉积物。

治疗

在本发明中，“治疗”或“疗法”通常是指获得期望的药理作用和/或生理作用。考虑到完全或部分预防疾病和/或症状，例如通过降低受试者患有疾病或症状的风险，该效果可以是预防性的，或者考虑到部分或完全治愈疾病和/或疾病的副作用，该效果可以是治疗性的。

在本发明中，“治疗”包括对哺乳动物、特别是人类的疾病或病症的任意治疗，例如以下治疗(a)至(c)：a)预防患者的疾病、病症或症状的发作；(b)抑制病症的症状，即阻止症状的进展；(c)改善病症的症状，即诱导疾病或症状的消退。

具体地，本文描述的治疗涉及通过RNAi阻断mRNA翻译，导致RNAi靶基因的蛋白质表达减少。因此，根据个体患者的风险概况和反应，每周、每月或每季度，优选每月评估血清和血浆中的替代参数草酸盐/酯浓度。在卢马西兰/内多西兰治疗的初始阶段，草酸盐/酯浓度控制的频率可能会有所不同。本文所述的预防性治疗旨在涵盖预防或减少草酸盐/酯相关的心血管疾病，这是由于通过用本文所述的化合物阻断草酸盐/酯相关蛋白质产生来降低草酸盐/酯浓度。

药物组合物和给药方法

本发明还涉及包含本文所述的化合物的药物组合物。除了所述化合物的对映体和/或互变异构体之外，本发明还涉及本文所述化合物的药学上可接受的盐。术语“药物组合物”是指本文所述的药剂与药学上可接受的载体的组合。短语“药学上可接受的”是指当给药于人类时不产生严重过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“载体”或“载体物质”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充活性成分也可掺入组合物中。

包含活性成分的药物组合物可以是适合口服使用的形式，例如片剂、咀嚼片、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。旨在口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物和此类组合物的任何方法来制备。片剂包含与适合于片剂制造的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供较长时期内的持续作用。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的患者和特定的给药模式而变化。例如，用于人类静脉内或皮下给药的制剂可以在总组合物的约5％至约95％之间变化。然而，应当理解，任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。根据本发明的化合物的剂量有效量将根据包括具体化合物、毒性和抑制活性、所治疗的病症以及该化合物是单独给药还是与其他疗法一起给药的因素而变化。

本发明还涉及用于治疗上述病理状况的过程或方法。本发明的化合物可以预防性或治疗性地给药给需要这种治疗的温血动物例如人，优选以有效对抗所提到的疾患的量，所述化合物优选以药物组合物的形式使用。

在一些实施方式中，患者可以在给药本发明化合物或其药学上可接受的盐的治疗有效方案之前、期间或之后接受用于治疗和/或控制草酸盐/酯水平和/或草酸盐/酯相关心血管疾病的疗法。这种疗法的非限制性实例包括饮食改变、磷酸盐结合剂、含钙或镁补充剂、考来烯胺及其任何组合。在一些实施方式中，患者先前未接受过用于治疗和/或控制草酸盐/酯水平和/或草酸盐/酯相关心血管疾病的疗法。

附图说明

本发明通过本文所公开的附图的示例进行了说明。所提供的附图代表特定的非限制性实施方式并且不旨在限制本发明的范围。

附图简述：

图1：草酸盐/酯浓度及其与临床参数的相关性。

图2：104名需要长期透析的肾衰竭美国患者(美国群组)的草酸浓度和全因死亡风险。

图3：1108名需要长期血液透析的肾衰竭欧洲患者(4D群组)的草酸盐/酯浓度和死亡/心血管事件风险。

附图详述：

图1：草酸盐/酯浓度及其与临床参数的相关性：(A)在美国104名肾衰竭患者(美国群组)中，血浆草酸盐/酯浓度与透析时间关联(斯皮尔曼(Spearman)等级相关)。(B)在美国104名肾衰竭患者(美国群组)中，血浆草酸盐/酯浓度与残余肾功能关联，定义为尿排出量>300ml/天(未配对t检验)。

图2：104名需要长期透析的肾衰竭美国患者(美国群组)的草酸浓度和全因死亡风险：(A)美国群组显示了中位2.5年后总生存期的Kaplan-Meier曲线，以草酸盐/酯浓度30μM作为截止值。竖直线代表审查事件，即在分析时随访时间少于2.5年的患者。HR：风险比；Cl：置信区间。(B)美国群组显示中位2.5年后总生存期的Kaplan-Meier曲线，以草酸盐/酯浓度40μM作为截止值。竖直线代表审查事件，即在分析时随访时间少于2.5年的患者。HR：风险比；Cl：置信区间。

图3：1108名需要长期血液透析的肾衰竭欧洲患者(4D群组)的草酸盐/酯浓度和死亡/心血管事件风险。按基线草酸盐/酯浓度(四分位数)分层的4D群组中全因死亡率、复合心血管事件、心力衰竭死亡和心源性猝死的多变量调整风险比(HR)和95％ Cis(误差线)。模型根据年龄、性别、血液透析时间、利尿剂的使用、C反应蛋白、体重指数、血红蛋白、白蛋白、既往冠状动脉疾病和阿托伐他汀的使用进行调整。Cl：置信区间。

实施例

通过本文公开的实施例来论证本发明。所提供的实施例代表特定实施方式并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例被认为是为实施本发明提供非限制性说明和技术支持。

草酸盐/酯浓度升高是透析患者全因死亡、心力衰竭死亡和心源性猝死的新危险因素。这些发现表明，有必要进行研究来测试减少膳食草酸盐/酯吸收或限制内源性草酸盐/酯生成的药物措施是否可以改善透析患者的心血管死亡率。

下面的实施例将草酸盐/酯浓度作为透析患者全因死亡率、心力衰竭死亡和心源性猝死的新危险因素。在优选的实施方式中，已经在两个不同的群组中定义了肾衰竭患者中草酸盐/酯积累的临床意义，其中在血浆或血清中测量草酸盐/酯。在优选的实施方式中，限制内源草酸盐/酯产生的药理学措施改善透析患者的心血管死亡率。

下面更详细地描述的是：

-分析全因死亡和心血管事件的患者群组的研究设计和临床特征

-草酸盐/酯浓度高于40μM与全因死亡风险增加之间存在显著关联

-草酸盐/酯浓度高于59.7μM与充血性心力衰竭导致的死亡风险增加和心源性猝死风险之间存在显著相关性。

实施例1：美国群组中草酸盐/酯浓度的决定因素及其与死亡率的关联。

美国有106名患者符合纳入标准，其中104名患者进行了血浆草酸盐/酯检测；表1总结了基线特征。

表1.104名需要长期透析的美国肾衰竭患者的特征(美国研究)。(HD：血液透析；PD：腹膜透析；BMI：体重指数，计算为体重(千克)除以身高(米)平方；AV：动静脉。在HD患者中，从之前的三次HD治疗计算出Kt/V。在PD患者中，作为每三个月进行一次测量获得Kt/V。为了进行分析，仅使用腹膜(而非尿液)Kt/V。连续变量表示为平均值(SD)或中位数(IQR)*(如果适用)、分类变量为数量(％))。

草酸盐/酯浓度范围为<2至59.6μM，中位数为23.8(IQR 10.3)μM。所有患者中的五分之一具有草酸盐/酯浓度≥30μM，且小于10％具有草酸盐/酯浓度≥40μM。如图1A所示，血浆草酸盐/酯与透析时间显著相关(r＝0.30，P＝0.002)，但与年龄、BMI或Kt/V无关(表2)。

表2：美国群组中草酸盐/酯浓度与临床参数之间的相关性(n＝104)。(斯皮尔曼等级相关性。R：相关系数。BMI：体重指数，计算为体重(千克)除以身高(米)平方。在HD患者中，从之前的三次HD治疗计算出Kt/V。在PD患者中，作为每三个月进行一次测量获得Kt/V。为了进行分析，仅使用腹膜(而非尿液)Kt/V)。

此外，在没有残余肾功能的情况下，草酸盐/酯浓度平均高出近10μM。尿排出量>300mL/天的患者的草酸盐/酯中位数为17.9(9.5)μM；相比之下，尿排出量<300mL/天的患者的草酸盐/酯中位数为25.9(12)μM(P<0.001，图1B)。在多变量回归模型中调整年龄、BMI和Kt/V并没有改变草酸盐/酯与透析时间以及残余肾功能之间关联的方向、大小或显著性(表3)。

表3：美国群组(n＝104)中草酸浓度、年龄、BMI、Kt/V、透析时间和残余肾功能的多变量回归。(因变量：草酸盐/酯浓度；协变量：年龄、BMI、Kt/V、透析时间和残余肾功能；透析时间转换为其自然对数以获得正态分布值；分类变量：残余肾功能，定义为尿排出量>300mL/天。BMI：体重指数，计算为体重(千克)除以身高(米)平方。在HD患者中，从之前的三次HD治疗计算出Kt/V。在PD患者中，作为每三个月进行一次测量获得Kt/V。

为了进行分析，仅使用腹膜(而非尿液)Kt/V)。

2.5年的随访后，已有15名患者死亡。通过回归分析，草酸浓度≥30μM的患者比低于此截止值的患者死亡率更高(HR 2.9，95％ CI 1.02-8.04，P＝0.04，图2A)。与草酸盐/酯浓度<40μM的患者相比，草酸盐/酯浓度≥40μM的患者死亡率增加了超过4倍(HR 4.7，95％CI 1.32-16.70，P＝0.008，图2B)。

实施例2：4D研究中的草酸盐/酯浓度和临床结果

共有1108名患者进行了基线草酸盐/酯测量。阿托伐他汀组的中位随访时间为4.0年，安慰剂组的中位随访时间为4.1年。随访期间，548例患者死亡，其中139例(25.4％)死于心源性猝死，38例(6.9％)死于充血性心力衰竭。共有413名患者达到主要复合心血管终点，其中心肌梗死(致命或非致命)和卒中(致命或非致命)分别发生在177名和90名患者中。基线患者特征如表4所示。基线草酸盐/酯浓度中位数(IQR)为42.4(30)μM，阿托伐他汀组和安慰剂组之间没有显著差异。草酸盐/酯浓度处于最高四分位数的患者更年轻，更有可能是女性，具有较高的血清白蛋白、高密度脂蛋白胆固醇、血清磷酸盐、白细胞计数和血清肌酐(表4)。此外，正如在美国群组中观察到的那样，较高的草酸浓度与较长的HD时间呈正相关(P<0.001)。此外，血清草酸盐/酯浓度和NT-proBNP浓度之间存在很强的相关性(P＝0.001)。

表4.按基线草酸盐/酯浓度四分位数分层(4D研究)的1108名需要长期血液透析的欧洲患者的特征。(连续变量表示为平均值(SD)或中位数(IQR)*(如果适用)、分类变量为数量(％)。ANOVA F统计量的P值(对于连续结果)或皮尔森卡方统计量(对于分类结果)。

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实施例3：草酸盐/酯和死亡风险

我们观察到的模式与美国群组相似，草酸浓度增加的患者全因死亡风险增加。如表5所示，具有最高草酸盐/酯四分位数的患者死亡风险增加23％，然而，95％ CI的下限确实低于1(HR 1.23，95％ CI 0.97-1.56，P＝0.08)。

表5.全因死亡、复合心血管事件、心力衰竭导致的死亡、心源性猝死、心肌梗死和卒中的风险，按基线草酸盐/酯浓度四分位数分层(4D研究，n＝1108)。HR：风险比；95％ CI：95％置信区间。(*调整后的HR：根据年龄、性别、血液透析时间、利尿剂的使用和阿托伐他汀的使用进行调整。调整后的HR：根据年龄、性别、血液透析时间、利尿剂的使用、C反应蛋白、体重指数、血红蛋白、白蛋白、既往冠状动脉疾病和阿托伐他汀的使用进行调整。/>复合心血管事件被定义为心脏病死亡、致命性或非致命性卒中以及非致命性心肌梗死的复合事件，以先发生者为准。心脏原因死亡包括充血性心力衰竭导致的死亡、心源性猝死、致命性心肌梗死、干预期间或干预后28天内因冠状动脉疾病导致的死亡，以及所有其他可归因于冠状动脉疾病的死亡)。/>

实施例4：复合心血管事件、心力衰竭死亡和心源性猝死

草酸盐/酯浓度较高时，复合心血管事件的发生率(4D研究的主要复合结果)明显较高(图3)。对包括美国群组中确定的透析年份和残余肾功能的混杂因素进行调整后，具有最高草酸盐/酯四分位数的患者达到复合终点的风险增加了40％(调整后HR 1.40，95％ CI1.08-1.81，P＝0.01；表5)。

较高的基线草酸盐/酯浓度也与充血性心力衰竭导致的死亡风险逐渐升高相关。最高四分位数的患者死于心力衰竭的可能性是最低四分位数的患者的超过2倍(调整后HR2.40，95％ CI 0.99-5.80)，如表5和图3所示。发现作为单独结果指标的心源性猝死风险随着草酸盐/酯四分位数的升高而逐渐显著增加。与最低四分位数的患者相比，最高四分位数的患者猝死风险高出62％(调整后HR 1.62，95％ CI 1.03-2.56，P＝0.04)(图3)。观察到的NT-proBNP水平在草酸盐/酯四分位数上的增加表明存在潜在的中间途径。当我们另外调整NT-proBNP的分析时，与最低四分位数相比，最高四分位数的相关性略有减弱(调整后的HR1.51，95％ CI 0.94-2.43)。血清草酸盐/酯与心肌梗死和卒中之间的相关性与复合事件、心力衰竭和心源性猝死的总体结果一致，但这种相关性较弱，并且单独而言不具有统计学意义。

用于实施例1-4的材料和方法

研究设计和参与者

本研究包括两个患者群组：美国的观察性透析群组(血液透析HD和腹膜透析PD)和德国糖尿病和透析研究(4D)前瞻性试验群组(仅HD)。在美国，从康涅狄格州的四个门诊透析中心招募了106名年龄≥18岁的患者进行一项以死亡率为主要终点的观察性研究。参与者每周接受三次HD，每次治疗3-5小时，或每天接受家庭PD。符合本研究资格的患者必须(1)接受HD或PD治疗，并且(2)身体状况稳定，至少3个月没有感染或住院治疗。HD患者必须具有(3)通路血流量≥250mL/min和(4)透析液流量≥500mL/min。2016年4月至2016年9月期间，对所有患者采集一次性血样以测量血浆草酸盐/酯浓度。对患者进行随访直至死亡、移植或2018年11月研究结束之日。地方当局(西方机构审查委员会研究编号1162867)批准了该研究，所有患者在纳入之前都签署了书面知情同意书。4D研究的设计和方法之前已有报道。⁷简而言之，4D研究是一项前瞻性随机对照试验，纳入了1255名患有2型糖尿病的年龄18-80岁的患者，其在过去2年内开始HD。1998年3月至2002年10月期间，欧洲178个透析中心招募了患者，并随机分配接受每天一次20毫克阿托伐他汀(n＝619)或安慰剂(n＝636)的双盲治疗。直到2004年3月，每6个月进行一次随访，采集血样并记录临床信息，包括任何不良事件和心电图。该研究符合赫尔辛基宣言中概述的原则。它得到了德国维尔茨堡大学医学伦理委员会的批准，所有患者在纳入前都签署了书面知情同意书。

数据采集

在美国群组中，临床、补充实验室和死亡率数据是从电子健康记录中收集的，并由治疗医师助理的报告进行补充。根据标准临床常规，HD患者每周随访三次，PD患者每月随访一次。使用第二代Daugirdas公式计算单池Kt/V(spKt/V)。⁸平均spKt/V根据之前的3次HD处理计算。在PD患者中，每三个月进行一次Kt/V(腹膜和尿液)测量。在4D群组中，人口统计和临床信息是通过患者访谈和治疗肾病专家的报告获得的。冠状动脉疾病的定义是有心肌梗死病史、冠状动脉搭桥手术、经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉造影存在的典型血管发现。

结果评估

在美国群组中，全因死亡率是主要终点。在4D研究中，主要终点是心源性死亡、非致命性心肌梗死和致命性或非致命性卒中的复合终点，以先发生者为准(复合心血管终点)。心脏原因死亡包括充血性心力衰竭导致的死亡、心源性猝死、致命性心肌梗死、干预期间或干预后28天内因冠状动脉疾病导致的死亡，以及所有其他可归因于冠状动脉疾病的死亡。心源性猝死的定义为：心电图显示终末节律紊乱证实的死亡、出现心脏症状后一小时内目击者观察到的死亡、尸检证实的心源性猝死，或者推测或可能是心源性的意外死亡，并且在最近3次HD疗程开始前不存在钾水平≥7.5mmol/L。当满足以下三个标准中的两个时，诊断为心肌梗死：典型症状、心肌酶水平升高(即肌酸激酶MB水平>肌酸激酶总水平的5％、乳酸脱氢酶水平为正常上限的1.5倍、或肌钙蛋白T水平>2ng/mL)或心电图的诊断性改变。卒中被定义为持续>24小时的神经功能缺损。除16例外，所有病例均可进行计算机体层成像或磁共振成像。4D研究终点由对研究治疗不知情的终点判定委员会的三名成员根据预先定义的标准进行集中判定和分类。⁷在本分析中，全因死亡率、复合心血管终点、充血性心力衰竭导致的死亡、心源性猝死、心肌梗死(致命和非致命)和卒中(致命和非致命)被选为单独的结局指标，因此包括肾脏病学-血液透析标准化结果建议的核心心血管结果指标。⁹

样品处理和草酸盐/酯测量

在美国群组中，分别在长期间隔后的第一次预约和每月门诊预约时在透析治疗前获得的EDTA血浆样品中测量HD和PD患者的草酸盐/酯。如前所述，立即将样品置于冰上，离心并过滤，每500μL血浆用20μL 1N盐酸酸化滤液，分装并在-80℃下保存2小时内。²⁴将冷冻和酸化的滤液解冻，并使用草酸氧化酶(Trinity Biotech；Bray,Co.Wicklow,Ireland)以酶法测量草酸盐/酯。^10、11我们测定的检测下限为2μM。为了评估一次性采样的有效性，我们从11名HD患者(连续2-4周每周一次)和13名PD患者(连续2-4个月每月一次)采集重复血液样品。HD组的个体内变异性(中位CV)为9.4％，PD组为16.7％。在4D群组中，在随机分组前1周在开始透析和给药之前采集并保存在-80℃下的基线血清样品中测量草酸盐/酯浓度。按照之前的报道，将冷冻血清样品缓慢解冻、剧烈涡旋、脱蛋白、酸化和测量。¹²在36个随机选择的样品的储存洗脱液中重复测量的中位CV为4.1％。使用草酸钠溶液(10μM和50μM)以及草酸盐/酯浓度为15和30μM的合并患者样品作为质量对照。

统计分析

我们计算了分类变量的连续表和频率表的平均值(SD)或中位数(四分位数范围[IQR])。我们通过学生t检验、变异分析(ANOVA)、Mann-Whitney U检验或适当的卡方检验来比较各组之间的特征。在美国群组中，我们通过斯皮尔曼相关和回归模型研究了草酸盐/酯的临床决定因素。经过2.5年的随访后，我们使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验分析了基线时草酸盐/酯浓度低于或高于30或40μM的生存情况分层。在4D群组中，患者特征按基线草酸盐/酯浓度四分位数定义的亚组呈现，具有以下分割点：≤29.6μM、>29.6至≤42.3μM、>42.3至≤59.6μM和>59.6μM。根据草酸盐/酯四分位数(四分位数1为参考组)，通过Cox回归模型评估全因死亡率、达到复合心血管终点、充血性心力衰竭导致的死亡、心源性猝死、心肌梗死和卒中的风险。首先，我们拟合了一个模型，其中包括主要混杂变量，即年龄、性别、HD时间和利尿剂的使用(模型1)。其次，我们还建立了一个模型，对最近通过荟萃分析确定的肾衰竭死亡的其他危险因素进行调整，¹³包括C反应蛋白(CRP)、BMI、血红蛋白、白蛋白和既往冠状动脉疾病(模型2-核心模型)。为了探索潜在的中介途径，我们计算了另一个模型，包括NT-proBNP(模型3-中介模型)。所有模型均针对治疗组(阿托伐他汀对安慰剂)进行调整，并适合完整的病例分析(无缺失值插补)。P值是双向的。对于美国研究，使用IBM SPSSStatistics版本25(IBM Corp；Armonk,NY,USA)进行统计分析，对于4D研究，使用STATA(StataCorp.2017.Stata Statistical Software:Release 15.College Station,TX:StataCorp LLC)进行统计分析。

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Claims (13)

1.一种包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，在治疗或预防在接受透析治疗的未患有原发性高草酸尿症1-3(PH)的患者中的草酸盐/酯相关疾患中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述草酸盐/酯相关疾患包括接受透析治疗的非PH患者中的心血管疾病。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述草酸盐/酯相关心血管疾病与接受透析治疗的非PH患者的器官中的草酸钙沉积相关。

4.根据权利要求1至3所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述草酸盐/酯相关心血管疾病与接受透析治疗的非PH患者中血浆或血清草酸盐/酯浓度>20μM、优选>30μM相关。

5.根据权利要求4所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述草酸盐/酯浓度与接受透析治疗的非PH患者中的心血管事件、优选心源性猝死和充血性心力衰竭相关。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述组合物减少在接受透析治疗的非PH患者中的肝脏草酸盐/酯产生并因此降低血浆或血清草酸盐/酯浓度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述组合物在透析治疗时以治疗相关剂量皮下、静脉内或口服给药。

8.根据权利要求7所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述给药剂量和频率适合于实现血浆或血清草酸盐/酯浓度<30μM和/或低于治疗开始前的血浆或血清草酸盐/酯浓度，优选比治疗开始前低至少20％的血浆或血清草酸盐/酯浓度。

9.根据权利要求2至8所述的用途的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物，其中所述组合物的给药预防或减少由草酸钙引起的治疗相关水平的血管钙化。

10.一种组合物，其包含卢马西兰和/或内多西兰或其盐的核酸、dsNA或杂交复合物，其中所述核酸、dsNA或杂交复合物以当引入接受透析治疗的非PH患者的细胞时有效降低其靶基因的胞质mRNA水平的量存在。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸、dsNA或杂交复合物优选包被至药学上可接受的载体以及配制在药学缓冲溶液中。

12.一种用于制备根据权利要求10和11所述的包含卢马西兰和/或内多西兰的组合物的方法。

13.一种试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的卢马西兰和/或内多西兰及其使用说明书。