CN116875611A - 一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA及其构建方法和应用，本发明属于皮肤创面修复技术领域。本发明提供的一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA的构建方法，包括如下步骤：(1)以特异性表皮生长因子的DNA序列为模板转录合成mRNA；(2)对所述mRNA进行加尾和化学修饰，得到化学修饰mRNA。本发明提供的化学修饰性mRNA制剂相比病毒、质粒和重组蛋白递送EGF，更为安全有效，性价比更高。可以克服重组蛋白EGF的不足(价格高昂，用量过大)，促进皮肤创面快速修复。本发明提供的化学修饰mRNA属于新型基因治疗制剂，能够在更安全、更低的给药剂量下促进皮肤创面快速修复。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤创面修复技术领域，尤其涉及一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA及其构建方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，各种致伤因子对人体表面皮肤的各种创伤是生活中无法避免的场景，创面的愈合时间非常关键，迁延不愈的创面，会导致感染，免疫力下降，且迁延不愈的创面愈合后疤痕也不易消失。特别对于褥疮和糖尿病、各类皮肤表面溃疡等慢性大面积皮肤创面很多情况是致命性的，所以更需要皮肤表皮细胞的快速修复。
对于皮肤创面修复的关键在于如何加速关闭创面，属于临床重大未满足的临床需求。有科学研究证明EGF在皮肤创面修复中起着重要的作用，EGF在皮肤创面修复中通过刺激细胞增殖和迁移，参与细胞外基质重塑以及调节免疫反应等多种途径发挥作用。在这些机制的协同作用下，可以加速创面愈合过程，促进伤口的闭合和组织再生。但是科学研究和提供安全而有效处理皮肤创面修复药物产品之间存在着巨大的鸿沟，现有技术中迫切需要一种可以安全、高效诱导上皮细胞增殖和创面修复的新型基因治疗方法。
目前的基因治疗主要是基于病毒和质粒，但是基于病毒和质粒(DNA)的基因治疗又存在破坏基因组而导致肿瘤的风险。此外，重组蛋白EGF治疗皮肤创面取得了疗效，满足了部分皮肤创面修复的临床需求，但是包括以下几个方面的缺点和并发症：第一，成本：重组蛋白EGF的生产和纯化是一项非常昂贵的过程，需要大规模生产线，因此治疗成本较高，可能限制其广泛应用。第二，药物局部反应：在局部应用EGF治疗的过程中，因为重组蛋白EGF为体外大肠杆菌等产生，不是生理产生的蛋白，效价比较低，为了达到效果，需要的量非常大，一些患者会出现局部不良反应，如瘙痒、刺痛、红肿和皮疹等。这些反应通常是暂时的，但在某些情况下可能需要调整治疗方案或中止治疗。第三，过度治疗和副作用：使用过量的重组蛋白EGF可能导致过度治疗，产生不必要的细胞增殖和血管生成，可能导致异常组织生长和肿瘤形成的风险增加。因此，EGF治疗的剂量需要严格控制和监测。
而新兴化学修饰mRNA技术可以克服上述短板，首先mRNA不进入细胞核，不存在破坏基因组的风险，其次化学修饰mRNA是通过身体自身的细胞产生EGF蛋白，免去了重组蛋白EGF生产和纯化的昂贵过程，而且mRNA产生的EGF蛋白属于生理性蛋白，不需要过量治疗，产生的副作用少。基于此，提出本发明。
发明内容
本发明旨在提供一种安全有效，稳定可控，性价比极高的化学修饰性mRNA制剂，化学修饰性EGF mRNA可以很好的控制药物用量，同时化学修饰性EGF mRNA能够遵循机体正常的代谢路径快速降解，有固定的半衰期，而不需要严格控制和监测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA的构建方法，包括如下步骤：
(1)以特异性表皮生长因子的DNA序列为模板转录合成mRNA；
(2)对所述mRNA进行加尾和化学修饰，得到化学修饰mRNA。
优选的，所述特异性表皮生长因子的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述mRNA序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述化学修饰是在所述加尾后的mRNA上进行加帽，所述加帽的帽结构为N7mGpppGm RNA cap。
优选的，所述化学修饰时，所用CTP和UTP核苷酸为化学修饰后的Methylcytidine-5′-triphosphate和N1-methyl pseudouridine。
本发明还提供了一种所述的构建方法得到的编码表皮生长因子的化学修饰mRNA。
本发明还提供了一种所述的编码表皮生长因子的化学修饰mRNA在制备诱导和/或增强皮肤修复的基因药物中的应用。
优选的，所述基因药物包括所述化学修饰mRNA和柠檬酸-生理盐水。
优选的，所述柠檬酸-生理盐水的pH为7.4-7.6，所述柠檬酸-生理盐水以无核酸酶蒸馏水为溶剂，包含8-12mmol/L柠檬酸盐，120-140mmol/L氯化钠。
优选的，所述基因药物为注射制剂。
本发明提供了一种用于诱导和/或增强皮肤修复的编码表皮生长因子的化学修饰mRNA及其构建方法和应用。本发明通过化学修饰表达蛋白因子的表皮生长因子(EpidermalGrowth Factor,EGF)的mRNA，在EGF编码基因上添加5‘和3’非翻译区序列，增加mRNA分子的稳定性。并通过将化学修饰mRNA溶解于PH＝7.5的柠檬酸-生理盐水(10mmol/L柠檬酸盐，130mmol/L氯化钠无核酸酶蒸馏水)而形成特异mRNA药物注射制剂，利用皮内注射方法在创伤处导入编码EGF的化学修饰mRNA，通过机体创面本身的细胞生产EGF的蛋白因子，刺激细胞增殖和迁移，参与细胞外基质重塑以及调节免疫反应，进而使该编码蛋白因子达到快速修复皮肤创面的目的。
本发明提供的化学修饰性EGF mRNA制剂相比病毒、质粒和重组蛋白递送EGF，更为安全有效，性价比更高。可以克服重组蛋白EGF的不足(价格高昂，用量过大)，促进皮肤创面快速修复。本发明提供的化学修饰mRNA属于新型基因治疗制剂，能够在更安全、更低的给药剂量下促进皮肤创面快速修复。
附图说明
图1为实施例1中利用维也纳RNA软件分析(The ViennaRNA Web Services)对含有非编码区和120个PolyA的mRNA预测的二级结构和自由能计算(左图)和不含有非编码区和PolyA为15个的mRNA的二级结构和自由能计算(右图)。
图2为实施例1制备的编码EGF的化学修饰mRNA和Luci化学修饰mRNA、eGFP化学修饰mRNA的电泳结果。
图3为实施例2中在HaCaT(人角化细胞)中转染不同浓度的化学修饰mRNA后EGF蛋白的表达情况。
图4为实施例2中HaCat细胞转染化学修饰mRNA后，细胞增殖指标Ki67的表达情况。
图5为实施例3中小鼠皮肤损伤模型中用化学修饰mRNA、Luci mRNA和人重组EGF重组蛋白治疗创面的结果。
图6为实施例3中小鼠皮肤损伤模型中不同时间点人成纤维细胞的增殖和迁移情况。
图7为实施例3中小鼠皮肤损伤模型中不同时间点人成纤维细胞的增殖和迁移量化结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
步骤一、特异性表皮生长因子(EGF)的DNA模板的合成
编码EGF的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下：
(1)T7启动子：
TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：3)。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(SEQ ID NO：4)。
(3)EGF开放阅读框序列：
ATGCTGCTGACCCTGATCATCCTGCTGCCCGTGGTGAGCAAGTTCAGCTTCGTGAGCCTGAGCGCCAACAGCGACAGCGAGTGCCCCCTGAGCCACGACGGCTACTGCCTGCACGACGGCGTGTGCATGTACATCGAGGCCCTGGACAAGTACGCCTGCAACTGCGTGGTGGGCTACATCGGCGAGAGATGCCAGTACAGAGACCTGAAGTGGTGGGAGCTGAGATGA(SEQ ID NO：5)。
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGT(SEQ ID NO：6)。
合成后的特异性EGF的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
步骤二、加poly-(a)尾巴和转录mRNA
以上述合成的DNA序列为模板，按照表1制备PCR预混液(总体积为200μl)，按照表2的条件进行转录。
表1 PCR预混液的组成
注：表中gBlockDNA的终浓度可以在40-400pg/μl之间变化。
表中加尾引物-F1：5′-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3′(SEQ ID NO：7)。
加尾-F2-T120：
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3(SEQ ID NO：8)。
表2 PCR条件
| 循环次数 | 变性 | 退火 | 扩展 |
| 1 | 95℃,2-3min | - | - |
| 2-31 | 98℃,20s | 60℃,15s | 72℃,60s |
| 32 | 72℃,3min | - | - |
通过凝胶电泳检查PCR产物的质量，切胶回收PCR产物(QIAquick PCRpurification kit,Qiagen,cat.no.28106)，得到如SEQ ID NO：2所示的mRNA，将最终浓度调整为100ng/μl备用。
步骤三、对mRNA进行化学修饰
1、按照表3组装mRNA帽结构和核苷酸混合物，其中帽子结构为N7mGpppGm RNA capanalog(New England Biolabs，NEB)，核酸混合物中CTP 100％被替代为化学修饰性Methylcytidine-5′-triphosphate(Me-CTP)，UTP100％被替代为N1-methylpseudouridine。其他组分均来自MEGAscript T7试剂盒(Ambion)。
表3 mRNA帽结构
2、按照表4配置化学修饰反应体系。
表4 mRNA体外转录体系
| 组分 | 用量(ml) | 终浓度 |
| DNase/RNase-free water | 1.2 | - |
| CustomNTP(from last step) | 14.8 | - |
| Tailed PCR product,100ug/ul | 16 | 40ng/μl |
| T7 buffer,10X((from MEGAscript T7 kit) | 4.0 | 1X |
| T7 enzyme mix,10×(from MEGAscript T7 kit) | 4.0 | 1X |
3、将反应体系置于PCR仪器中，在37℃孵育6h。
4、向样品中添加2μl Turbo DNase(来自MEGAscript T7试剂盒，Ambion,cat.no.AM1334)。
5、轻轻混合并在37℃下孵育15min。
6、使用MEGAclear试剂盒(Ambion,cat.no.AM1908)，纯化经过DNase处理的反应产物。
7、然后用总共100μl的洗脱缓冲液洗脱化学修饰的mRNA(每次50μl，洗脱两次)。
8、使用磷酸酶(Antarctic phosphatase(New England Biolabs,cat.no.M0289S)处理步骤6处理后的化学修饰mRNA；具体是向样品(～100μl)中，添加11μl 10×磷酸酶缓冲液，然后添加2μl磷酸酶；轻轻混合样品并在37℃下孵育1h。
9、重新溶解RNA后，在NanoDrop分光光度计中测量化学修饰的mRNA的浓度。预期的总产量应为～50μg(30～70μg范围；一次40μl IVT反应的100μl洗脱体积为300～700ng/μl)。
10、通过添加柠檬酸-生理盐水(10mmol/L柠檬酸盐，130mmol/L氯化钠无核酸酶蒸馏水，PH7.5)形成制剂，将浓度调节至100ng/μl，备用。
11、按照前述步骤合成不含非编码区的mRNA，不含非编码区的mRNA合成除了不含5’UTR，3’UTR外，PolyA尾为15个A，其他序列与化学修饰mRNA一样。
12、通过The ViennaRNA Web Services网站http://rna.tbi.univie.ac.at计算含有非编码区的化学修饰mRNA和不含非编码区的mRNA的最小自由能。结果如图1所示。
从图1中可以看出，本发明提供的含有非编码区的化学修饰mRNA的自由能为78.2，不含非编码区的mRNA的自由能为18，显然含有非编码区的化学修饰mRNA结构更加稳定。
同时，按照上述步骤对Luci mRNA(购自Trilink)和eGFP基因(购自Trilink)进行加尾和化学修饰，然后将本实施例制备的含有非编码区的化学修饰mRNA(对应图中EGFmRNA)与Luci(萤火虫荧光素)化学修饰mRNA(对应图中Luc mRNA)和eGFP化学修饰mRNA(对应图中eGFP mRNA)进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。由图2可知，本实施例合成的EGFmRNA的序列是正确的。
实施例2
细胞培养和预处理：将HaCaT(人角化细胞)在10％胎牛血清DMEM的培养基中培养，并在转染前进行B18R，100ng/ml处理过夜。
准备形成mRNA转染复合物：在无血清的培养基(Opti-MEM)中，将RNAiMax转染试剂按照厂家(Life Technology 13778075)说明按照4:1稀释。然后，将实施例1合成的EGF化学修饰mRNA调整为100ng/μl，根据不同的实验EGF mRNA所需的终浓度，计算出需要的EGFmRNA的绝对量，得到相应的体积数，再按1：1体积同RNAiMax转染试剂混合，室温孵育15min，形成不同浓度(0.5、1、2、3μg/ml)的mRNA转染复合物。
转染：将不同浓度的mRNA转染复合物20μl加入到预处理后的HaCaT细胞(一百万个)的培养基中，转染复合物的加入可以通过直接滴加到培养皿中并确保转染试剂和mRNA均匀地分布在培养皿中。
培养：将转染后的细胞在5％CO237℃培养箱中继续培养，并在不同时间点进行ELISA检测和分析(转染后48h前每12小时测定一次，48h后每24h测定一次，直到转染后120小时)。
利用ELISA(酶联免疫吸附测定)测定细胞培养基中新增EGF蛋白含量的步骤为：
处理细胞培养基：收集mRNA转染HaCaT的细胞培养基样品，将其转移至离心管中，使用离心机以1200转/分钟，离心5分钟离心样品，将上清液分离出来。
稀释样品：使用稀释缓冲液(PBS)将样品从1：10稀释到1：200，每十倍为一个梯度，以确保在ELISA中获得可测量的信号。
准备酶标板：取出ELISA酶标板，并使用PBS进行孵育，以使酶标板表面润湿。随后，将孵育液倒掉，并用吸管小心地加入稀释后的样品，使其充分覆盖酶标板的孔。
孵育酶标板：将装有样品的酶标板放入恒温37℃孵育箱中，孵育45分钟。
清洗酶标板：将孵育完的酶标板倒置在洗涤缓冲液中，然后用洗涤缓冲液洗涤酶标板孔，3次。
添加检测抗体：根据所使用的ELISA试剂盒的说明书，加入与目标蛋白特异性结合的酶标EGF抗体。
添加底物：将ATP底物溶液加入每个酶标板孔中，充分反应后终止。
信号测量：使用ELISA光度计，测量每个酶标板孔中的信号强度。使用标准曲线法来确定样品中目标蛋白的浓度。
结果如图3所示，Elisa检测提示人角质细胞系HaCaT在转染EGF化学修饰mRNA会持续表达EGF蛋白，且mRNA量同蛋白表达的量成线性关系，且有固定的半衰期(12h)，这意味着mRNA药物量的持续时间是可以控制。
此外，按照上述转染方法分别在HaCaT细胞中转染100ng/μl的EGF mRNA、Luci(萤火虫荧光素)mRNA(Luc mRNA)和人重组EGF蛋白(rh EGF，购自Life Technology)，并从转染EGF mRNA、Luc mRNA和rhEGF的HaCaT细胞中Trizol法提取total RNA，按Ki67引物ForwardPrimer：GGATCGTCCCAGTGGAAGAG(SEQ ID NO：9)，Reverse Primer:CAAACAAGCAGGTGCTGAGG(SEQ ID NO：10)，按定量RT-PCR试剂盒(Life Technology)说明书组装PCR反应体系：RNA、逆转录酶，引物、探针、缓冲液、DNA聚合酶和核苷酸等，并按Applied Biosystems的QuantStudio机器说明完成PCR反应，使用PCR仪器的软件或其他数据分析工具，对PCR扩增过程中产生的荧光信号进行实时监测并完成定量差异分析等。结果如图4所示。
从图4中可以看出，HaCat细胞转染EGF mRNA后，细胞增殖指标Ki67明显升高，相对于报告基因Luc mRNA和rhEGF蛋白处理有更为显著的效果。
实施例3
小鼠皮肤缺损模型建立：选择合适的小白鼠BALB/c确保动物健康且符合实验要求，在进行实验操作之前，使用异氟醚麻醉方法对小鼠进行麻醉。使用酒精对小鼠的皮肤进行消毒处理，使用手术刀在背部制备小鼠皮肤上的缺损。
注射制剂的配置：用柠檬酸-生理盐水(10mmol/L柠檬酸盐，130mmol/L氯化钠无核酸酶蒸馏水，PH7.5)配置浓度为100ng/μl的EGF mRNA注射制剂、重组人EGF蛋白注射制剂和Luc mRNA注射制剂。
治疗：分别将Luc mRNA、EGF mRNA和重组人EGF蛋白在小鼠皮肤缺损处进行皮内注射，每3天注射1次，每次注射EGF mRNA 30μg、注射Luci mRNA 30μg、注射重组人EGF蛋白100μg，治疗小鼠皮肤缺损。分别于治疗的第0、3、6、10、15天观察创面修复情况，统计创面未完全愈合比例，如图5所示。小鼠皮肤损伤模型上，化学修饰性的EGF mRNA相对于报告基因Luci mRNA和人重组EGF蛋白，更为快速促地进皮肤损伤创面的愈合，且各时间点创面愈合的质量亦要优于Luci mRNA和人重组EGF重组。
化学修饰EGF mRNA(采用EGF mRNA1和EGF mRNA2两个浓度100ng/μl和200ng/μl)、报告基因Luci(萤火虫荧光素)mRNA和人重组EGF蛋白进行成纤维细胞划痕实验，利用倒置显微镜观察不同时间点(0、6、18、24、48h)人成纤维细胞的增殖和迁移状态并统计各时间点的伤口愈合的相对百分比，结果图6、7所示，肉眼可见相对于报告基因Luci mRNA和人重组EGF蛋白处理组，更加明显的促进人成纤维细胞的增殖和迁移。成纤维细胞增殖和迁移的量化结果(图7)，再次提示相对于报告基因Luci(萤火虫荧光素)mRNA和人重组EGF蛋白处理组，更加明显的促进人成纤维细胞的增殖和迁移。
由以上实施例可知，编码EGF的化学修饰mRNA可以在皮肤角质化细胞系及HaCaT细胞系统表达目标蛋白因子EGF，该编码EGF化学修饰mRNA可以转染并促进人皮肤角质化细胞和人成纤维细胞在划痕实验(损伤修复实验)，的增殖和迁移能力，其中化学修饰EGF诱导人角化细胞和成纤维细胞增殖能力明显优于人重组蛋白EGF。在小鼠皮肤损伤模型上，该编码EGF化学修饰mRNA可以加速小鼠皮肤损伤的愈合和提高皮肤创面愈合的治疗，这两个效果都优于人重组蛋白的效果。所以，本发明为皮肤创面修复提供了一种安全有效的用于临床基因治疗的方法，在创伤治疗作用上具有重大意义，其具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种编码表皮生长因子的化学修饰mRNA的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以特异性表皮生长因子的DNA序列为模板转录合成mRNA；
(2)对所述mRNA进行加尾和化学修饰，得到化学修饰mRNA。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述特异性表皮生长因子的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述mRNA序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述化学修饰是在所述加尾后的mRNA上进行加帽，所述加帽的帽结构为N7mGpppGmRNA cap。
5.如权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述化学修饰时，所用CTP和UTP核苷酸为化学修饰后的Methylcytidine-5′-triphosphate和N1-methylpseudouridine。
6.一种按照权利要求1-5任一项所述的构建方法得到的编码表皮生长因子的化学修饰mRNA。
7.一种权利要求6所述的编码表皮生长因子的化学修饰mRNA在制备诱导和/或增强皮肤修复的基因药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因药物包括所述化学修饰mRNA和柠檬酸-生理盐水。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述柠檬酸-生理盐水的pH为7.4-7.6，所述柠檬酸-生理盐水以无核酸酶蒸馏水为溶剂，包含8-12mmol/L柠檬酸盐，120-140mmol/L氯化钠。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述基因药物为注射制剂。
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