CN116855360A - 一种全自动离心微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种全自动离心微流控芯片及其制备方法，全自动离心微流控芯片包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元和细胞收集单元；密度梯度离心单元包括第一Percoll腔、直通道、样品腔、时序控制通道和沉降腔，第一Percoll腔的底部通过直通道与沉降腔的顶部连通，样品腔的底部通过时序控制通道与沉降腔的顶部连通；虹吸阀触发单元包括第二Percoll腔、毛细阀，第二Percoll腔的底部依次通过毛细阀和微通道与沉降腔的中部连通；细胞收集单元包括虹吸阀、收集腔，收集腔通过虹吸阀与沉降腔连通。本发明通过离心力、毛细力、科氏力的总和协同控制实现不同密度细胞的精确分层和流动富集。

Description

一种全自动离心微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，具体涉及一种全自动离心微流控芯片及其制备方法。
背景技术
从临床的角度来看，从全血中分离和提取单个核细胞进行计数与分析具有重要意义，常用于评估如某些癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病等一系列临床疾病。传统用于全血提取单个核细胞的方法是密度梯度离心，其步骤包括密度梯度液及全血顺序加载、离心分层、血浆移除和目标细胞层提取，这种方法所需样本量大(一毫升到数十毫升)、操作繁琐且过于依赖于人工。即使经过培训的人员也需要仔细观察密度层并准确地提取所需的细胞层，但仍不可避免地造成细胞层紊乱及单个核细胞提取损失。用于单个核细胞分离的离心机，必须在样本完成分层后以最小振动完成减速(刹车)操作。离心机经过优化的加速和减速坡道配合为密度梯度离心特殊设计的离心管可以获得至多88％的单个核细胞分离效率。样本量越大，离心分层所需的离心力就越大，完成分层的时间就越长，减速停止的过程中细胞层越容易受到干扰；另外，使用较小的样本对于样本采集用户更易接受，特别对于受检人数多、工作量大的检测，更需要一种简单、快速、准确的测定方法。因此，使用较少的血液样本获得外周血单个核细胞层和自动化提取是必要的。
离心微流控利用一套完整的流体单元操作，例如液体运输、计量、混合和阀门就能实现整个芯片的功能。由于离心芯片中的流体控制由旋转电机完成，成本低、可控，尤其不需要气动接口，具有集成化、自动化、小型化以及多通道等明显的优势。目前针对单个核细胞提取的离心式芯片一般采用虹吸阀或者离心-气动方案完成细胞分层之后的收集工作。传统的虹吸阀依赖于聚合物材料的亲水性改性，但是这些表面改性方法效果持续时间短且不稳定；离心-气动方案则利用高速离心时密封腔体内气体被压缩，转速降低时压力突破离心力完成虹吸，气动泵送会使细胞层紊乱造成细胞提取效率降低，另外这种方法在实际使用中不稳定甚至有些仍然依赖于芯片表面亲水性处理来提高气动泵送效果。总之，目前应用于单个核细胞提取的离心式芯片在完成细胞分层后都需要减速或者停止以打开截止阀门来进行细胞层提取，不可避免地会对细胞层的稳定造成一定影响，因此在保持高速的状态下实现细胞层在线提取是非常必要的，然而现有技术中没有此类方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全自动离心微流控芯片及其制备方法，该全自动离心微流控芯片采用多通道并行离心式实现了片上密度梯度离心分层和分层后单个核细胞或单个核细胞和粒细胞的自动化提取，大幅降低了样本的最小用量，同时实现了高纯度和高回收率单个核细胞分离和提取，提高了提取回收率、准确性和使用便捷性。
本发明的技术方案如下：
一种全自动离心微流控芯片，包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元和第一细胞收集单元；
所述密度梯度离心单元包括第一Percoll腔、直通道、样品腔、时序控制通道和沉降腔，所述第一Percoll腔的顶部设有第一进液口和第一通气孔，所述第一Percoll腔的底部通过直通道与沉降腔的顶部连通，所述样品腔的顶部设有第二进液口和第二通气孔，所述样品腔的底部通过时序控制通道与沉降腔的顶部连通，所述沉降腔的顶部设有第三通气孔，所述直通道、时序控制通道用于实现Percoll及全血样本的顺序释放和加载，密度梯度形成过程在沉降腔内完成；
所述虹吸阀触发单元包括第二Percoll腔、毛细阀和微通道，所述第二Percoll腔的顶部设有第三进液口和第四通气孔，所述第二Percoll腔的底部依次通过毛细阀和微通道与沉降腔的中部连通，所述毛细阀在高速时打开从而释放第二Percoll腔内的Percoll，使得沉降腔液面升高；
所述第一细胞收集单元包括第一虹吸阀、第一收集腔和废液腔，所述第一收集腔的顶部与废液腔的顶部连通并通过第一虹吸阀与沉降腔的中部连通，所述第一虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放Percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第一收集腔与废液腔位于同一离心半径，所述第一收集腔用于提取单个核细胞，所述第一收集腔的底部设有第一吸液口，所述废液腔用于存储剩余的Percoll及血浆，所述废液腔的顶部设有第五通气孔。
在另一方案中，该全自动离心微流控芯片还包括第二细胞收集单元；
所述第二细胞收集单元包括第二虹吸阀和第二收集腔，所述第二收集腔的顶部通过第二虹吸阀与沉降腔的下部连通，所述第二虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放Percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第二收集腔用于提取粒细胞，所述第二收集腔的底部设有第二吸液口，所述第二收集腔的顶部设有第六通气孔。
其中，所述第一Percoll腔与样品腔的容积相同且直通道的宽度大于时序控制通道的宽度。
其中，所述时序控制通道的长度为大于30mm。
其中，所述第一Percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离与样品腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离相等。
其中，所述毛细阀的宽度大于微通道的宽度，长度小于其高度。
其中，在密度梯度离心时沉降腔内液面到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离大于虹吸阀顶点到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离。
其中，所述第二Percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离为5-10mm。
上述另一方案的全自动离心微流控芯片的制备方法之一，包括以下步骤：
步骤一、加工聚合物板材，获得双面光滑的圆盘作为盖片，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；
步骤二、通过注塑制作聚合物微流控芯片作为基片，所述聚合物微流控芯片包括微流控结构和腔室结构，微流控结构的周围设有粘接筋；
步骤三、将步骤一得到的盖片和步骤二得到的基片固定并对准，置于超声波键合设备之下；
步骤四、使盖片和基片的粘接筋通过超声键合，获得全自动离心微流控芯片。
上述另一方案的全自动离心微流控芯片的制备方法之二，包括以下步骤：
步骤一、通过激光雕刻机加工聚合物板材得到第一层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀上表面结构，再通过激光切割得到若干个通孔，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；
步骤二、通过激光雕刻机加工双面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第二层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的微流控结构，中心为电机安装孔；
步骤三、通过激光雕刻机加工下表面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第三层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的腔室结构，中心为电机安装孔；
步骤四、通过激光雕刻机加工聚合物板材，得到第四层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀下表面结构，再通过激光切割得到微流控圆盘，圆盘中心为电机安装孔；
步骤五、将第二层圆盘粘有压敏胶的下表面与第三层圆盘无压敏胶的一面粘贴；
步骤六、将第一层圆盘与第二层圆盘粘有压敏胶的上表面粘贴；
步骤七、将第三层圆盘带有压敏胶的一面与第四层圆盘粘贴，完成全自动离心微流控芯片的封装。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过提高微尺度结构表面张力来提高血细胞分层效率，设计时序控制通道实现芯片上进样顺序的控制与目标细胞层的提取，代替传统密度梯度离心方法中手动操作的繁杂过程，实现全血中目标细胞层的自动分离和提取。另外，针对密度梯度离心静止提取造成细胞层紊乱的问题提出了虹吸阀高速触发方案，即高于离心分层转速时，第二Percoll腔内的Percoll液突破毛细阀的阻碍进入到沉降腔，腔内液面升高从而越过虹吸阀顶点，单个核细胞进入到第一收集腔内或单个核细胞和粒细胞分别进入到第一收集腔和第二收集腔内。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一的全自动单个核细胞分选和提取结构图；
图2为本发明实施例一的第一层圆盘的示意图；
图3为本发明实施例一的第二层圆盘的示意图；
图4为本发明实施例一的第三层圆盘的示意图；
图5为本发明实施例一的第四层圆盘的示意图；
图6为本发明实施例一的电机转速-时间控制图；
图7为本发明实施例一的单个核细胞分选和提取过程示意图；
图8为本发明实施例二的全自动单个核细胞分选和提取结构图；
图9为本发明实施例二的第一层圆盘的示意图；
图10为本发明实施例二的第二层圆盘的示意图；
图11为本发明实施例二的第三层圆盘的示意图；
图12为本发明实施例二的第四层圆盘的示意图；
图13为本发明实施例二的电机转速-时间控制图；
图14为本发明实施例二的单个核细胞分选和提取过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了说明本发明所述的技术方案，下面通过具体实施例来进行说明。
实施例一
请参阅图1，本实施例提供一种全自动离心微流控芯片，包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元和第一细胞收集单元。
密度梯度离心单元包括第一Percoll腔5、直通道7、样品腔6、时序控制通道8和沉降腔14，第一Percoll腔5的顶部设有第一进液口1和第一通气孔2，第一Percoll腔5的底部通过直通道7与沉降腔14的顶部连通，样品腔6的顶部设有第二进液口4和第二通气孔3，样品腔6的底部通过时序控制通道8与沉降腔14的顶部连通，沉降腔14的顶部设有第三通气孔9，直通道7、时序控制通道8用于实现Percoll及全血样本的顺序释放和加载，密度梯度形成过程在沉降腔14内完成。
其中，第一Percoll腔5与样品腔6的容积相同且直通道的宽度大于时序控制通道8的宽度；时序控制通道8的长度为大于30mm；第一Percoll腔5到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离与样品腔6到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离相等。
虹吸阀触发单元包括第二Percoll腔12、毛细阀13和微通道，第二Percoll腔12的顶部设有第三进液口10和第四通气孔11，第二Percoll腔12的底部依次通过毛细阀13和微通道与沉降腔14的中部连通，毛细阀13在高速时打开从而释放第二Percoll腔12内的Percoll，使得沉降腔14液面升高。
其中，毛细阀13的宽度大于微通道的宽度，长度小于其高度。
第一细胞收集单元包括第一虹吸阀15、第一收集腔16和废液腔18，第一收集腔16的顶部与废液腔18的顶部连通并通过第一虹吸阀15与沉降腔14的中部连通，第一虹吸阀15用于目标细胞层的转移和提取，在毛细阀13打开释放Percoll令沉降腔14液面升高时触发开启，第一收集腔16与废液腔18位于同一离心半径，第一收集腔16用于提取单个核细胞，第一收集腔16的底部设有第一吸液口17，废液腔18用于存储剩余的Percoll及血浆，废液腔18的顶部设有第五通气孔19。
其中，第二Percoll腔12到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离为5-10mm；密度梯度离心时沉降腔14内液面到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离大于第一虹吸阀15顶点到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离。
该全自动离心微流控芯片通过设计时序控制通道8的长度、宽度及深度来改变流体流速和流动时间。由于密度梯度离心中Percoll和样本的顺序加载对最终目标细胞层的提取效果有重要影响。传统方法一般都是先加入Percoll沉降到底部后停止，然后在加入全血样本，这对于加载的稳定性的自动化的实现都是不利的。而时序控制通道8的设计可以让样品腔6内全血样本流动速度降低，Percoll进入到沉降腔14时，血液刚充满弯曲通道，开始沿沉降室14壁平稳加载到Percoll液上。
常规虹吸阀是利用高转速截止，低转速下毛细力突破离心力作用使虹吸阀打开。而该全自动离心微流控芯片是利用转速1(细胞分层转速)截止第一虹吸阀15，之后再以更高转速2驱动第二Percoll腔12内的液体突破与之相连的毛细阀13溢出到沉降腔14内导致内部液柱升高，第一虹吸阀15导通并持续泵送沉降腔14内的液体和细胞层，解决了常规虹吸阀在密度梯度离心应用中导致细胞层紊乱和单个核细胞提取效率低的问题。实际操作中仅需要在驱动芯片转动前在两个Percoll腔加入Percoll液和样品腔6加入外周血样本即可，全部过程均为离心力驱动，由控制转速来实现Percoll和全血样本的顺序加载以及毛细阀13和第一虹吸阀15的打开，尤其是细胞提取过程仍然保持高转速，无需减速、停止和人工干预，克服了传统离心机提取方法和目前应用的离心式芯片需要制动或减速以完成细胞提取的缺点。
上述用于单个核细胞提取的全自动离心微流控芯片的制备方法有两种方法获得，一种方法是分别加工盖片和基片，并通过超声键合；另一种方法是四层圆盘通过激光雕刻和切割，并通过压敏胶依次粘贴构成。
第一种方法的制备步骤包括：
步骤一、加工聚合物(包括但不限于PMMA、PC、COC、COP、PS、PVC等)板材，获得双面光滑的圆盘作为盖片，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口1、第二进液口4、第三进液口10和第一通气孔2、第二通气孔3、第三通气孔9、第四通气孔11、第五通气孔19，中心为电机安装孔；
步骤二、通过注塑制作聚合物微流控芯片作为基片，所述聚合物微流控芯片包括微流控结构和腔室结构，微流控结构的周围设有粘接筋；
步骤三、将步骤一得到的盖片和步骤二得到的基片固定并对准，置于超声波键合设备之下；
步骤四、使盖片和基片的粘接筋通过超声键合，获得全自动离心微流控芯片。
第二种方法的制备步骤包括：
步骤一、通过激光雕刻机加工聚合物(包括但不限于PMMA、PC、COC、COP、PS、PVC等)板材得到第一层圆盘(如图2所示)，先通过激光雕刻形成毛细阀上表面结构，再通过激光切割得到若干个通孔，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口1、第二进液口4、第三进液口10和第一通气孔2、第二通气孔3、第三通气孔9、第四通气孔11、第五通气孔19，中心为电机安装孔；
步骤二、通过激光雕刻机加工双面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第二层圆盘(如图3所示)，其上带有通过切穿板材得到的微流控结构，中心为电机安装孔；
步骤三、通过激光雕刻机加工下表面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第三层圆盘(如图4所示)，其上带有通过切穿板材得到的腔室结构，中心为电机安装孔；
步骤四、通过激光雕刻机加工聚合物板材，得到第四层圆盘(如图5所示)，先通过激光雕刻形成毛细阀下表面结构，再通过激光切割得到微流控圆盘，圆盘中心为电机安装孔；
步骤五、将第二层圆盘粘有压敏胶的下表面与第三层圆盘无压敏胶的一面粘贴；
步骤六、将第一层圆盘与第二层圆盘粘有压敏胶的上表面粘贴；
步骤七、将第三层圆盘带有压敏胶的一面与第四层圆盘粘贴，完成全自动离心微流控芯片的封装。
其中，第一层圆盘和第四层圆盘的厚度为0.5mm，第二层圆盘的厚度为0.2mm，第三层圆盘的厚度为1mm。芯片各层圆盘的直径均为102mm。第一层圆盘、第二层圆盘、第三层圆盘的安装孔直径为8mm，第四层圆盘安装孔直径为6mm。各圆盘上通气孔和进液口的直径均为1mm。所采用压敏胶厚度为86um。
圆盘转速-时间控制(如图6所示)。Percoll溶液轻微加载到全血上对于提高分层清晰及稳定是必要的，因此圆盘开启旋转的转加速度设置较低水平为40转/分·秒。整个沉降过程是通过保持毛细阀突破的临界转速2000转/分钟的旋转速度8分钟，分层完成后以25转/分·秒加速圆盘至大于2000转/分钟(优选的为2500转/分钟)，此时毛细阀13打开，第一虹吸阀15截止处液体开始越过第一虹吸阀15，持续旋转20秒直至沉降腔14液体全部进入到第一收集腔16和废液腔18，提取完成后以100转/分·秒加速度停止芯片。
离心式微流控芯片用于单个核细胞提取实验过程为(如图7所示)：首先，将35ul密度为1.09g/ml的Percoll液预先加载到沉降腔14底部，用移液枪将35ul体积的稀释血样和30ul密度为1.077g/ml的Percoll液分别注射到样品腔6和第一Percoll腔5，再将9ul密度为1.077g/ml的Percoll密度梯度液注射到第二Percoll腔12，如图7(a)所示。然后，驱动离心机在固定转加速度下旋转，旋转产生的离心力驱动Percoll密度梯度液和血液样本流动。时序控制通道8用于控制Percoll密度梯度液与血液样品的进样顺序，细胞分选过程要求血液样品在Percoll密度梯度液完全加载沉降腔14后再载入沉降腔14。液体流动速度与水动力阻力成反比，且水动力阻力与特征尺寸和时序控制通道8长度有关，增加时序控制通道8长度，减小时序控制通道8的宽度和深度能够减小流体流动速度。因此，根据该原理通过控制样品腔6和第一Percoll腔5连接沉降腔14的通道结构特征，来控制液体加载到沉降腔14所需时间。由于样品腔6下方存在较长的弯曲通道，样品腔6内血液流动速度降低；而第一Percoll腔5下方宽直通道促进Percoll密度梯度液快速加载到沉降腔14中。待完全加载后，血液样品刚充满弯曲通道，开始沿沉降室壁平稳加载到沉降腔14中，如图7(b)(c)所示。在稳定的离心转速下，不同密度细胞开始沉降并在Percoll密度梯度液的作用下分层，如图7(d)所示。其中，沉淀腔14上方第三通气孔9的设计可更好地控制空气的进出，这样能够促进沉降腔14内液面稳定，利于血细胞稳定分层。此时的离心转速不足以使毛细阀13打开，Percoll液继续停留在第二Percoll腔12内。细胞分层完成后，加速启动圆盘旋转，Percoll液突破毛细阀13并进入到沉降腔14内，如图7(e)所示。沉降腔14液面升高且高于第一虹吸阀15顶点，第一虹吸阀15打开并且第一虹吸阀15与沉降腔14连接处上方的液体导入到第一收集腔16中。当第一收集腔16内液体装满时，多余的Percoll液及血浆溢出到废液腔18中，如图7(f)所示。最后，打开第一吸液口17密封的胶带用移液器提取第一收集腔16中的单个核细胞完成分选。
实施例二
请参阅图8，本实施例提供一种全自动离心微流控芯片，包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元、第一细胞收集单元和第二细胞收集单元。
密度梯度离心单元包括第一Percoll腔5、直通道7、样品腔6、时序控制通道8和沉降腔14，第一Percoll腔5的顶部设有第一进液口1和第一通气孔2，第一Percoll腔5的底部通过直通道7与沉降腔14的顶部连通，样品腔6的顶部设有第二进液口4和第二通气孔3，样品腔6的底部通过时序控制通道8与沉降腔14的顶部连通，沉降腔14的顶部设有第三通气孔9，直通道7、时序控制通道8用于实现Percoll及全血样本的顺序释放和加载，密度梯度形成过程在沉降腔14内完成。
其中，第一Percoll腔5与样品腔6的容积相同且直通道的宽度大于时序控制通道8的宽度；时序控制通道8的长度为大于30mm；第一Percoll腔5到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离与样品腔6到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离相等。
虹吸阀触发单元包括第二Percoll腔12、毛细阀13和微通道，第二Percoll腔12的顶部设有第三进液口10和第四通气孔11，第二Percoll腔12的底部依次通过毛细阀13和微通道与沉降腔14的中部连通，毛细阀13在高速时打开从而释放第二Percoll腔12内的Percoll，使得沉降腔14液面升高。
其中，毛细阀13的宽度大于微通道的宽度，长度小于其高度。
第一细胞收集单元包括第一虹吸阀15、第一收集腔16和废液腔18，第一收集腔16的顶部与废液腔18的顶部连通并通过第一虹吸阀15与沉降腔14的中部连通，第一虹吸阀15用于目标细胞层的转移和提取，在毛细阀13打开释放Percoll令沉降腔14液面升高时触发开启，第一收集腔16与废液腔18位于同一离心半径，第一收集腔16用于提取单个核细胞，第一收集腔16的底部设有第一吸液口17，废液腔18用于存储剩余的Percoll及血浆，废液腔18的顶部设有第五通气孔19。
其中，第二Percoll腔12到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离为5-10mm；密度梯度离心时沉降腔14内液面到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离大于第一虹吸阀15顶点到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离。
第二细胞收集单元包括第二虹吸阀20和第二收集腔21，第二收集腔21的顶部通过第二虹吸阀20与沉降腔14的下部连通，第二虹吸阀20用于目标细胞层的转移和提取，在毛细阀13打开释放Percoll令沉降腔14液面升高时触发开启，第二收集腔21用于提取粒细胞，第二收集腔21的底部设有第二吸液口22，第二收集腔21的顶部设有第六通气孔23。
该全自动离心微流控芯片通过设计时序控制通道8的长度、宽度及深度来改变流体流速和流动时间。由于密度梯度离心中Percoll和样本的顺序加载对最终目标细胞层的提取效果有重要影响。传统方法一般都是先加入Percoll沉降到底部后停止，然后在加入全血样本，这对于加载的稳定性的自动化的实现都是不利的。而时序控制通道8的设计可以让样品腔6内全血样本流动速度降低，Percoll进入到沉降腔14时，血液刚充满弯曲通道，开始沿沉降室14壁平稳加载到Percoll液上。
常规虹吸阀是利用高转速截止，低转速下毛细力突破离心力作用使虹吸阀打开。而该全自动离心微流控芯片是利用转速1(细胞分层转速)截止第一虹吸阀15，之后再以更高转速2驱动第二Percoll腔12内的液体突破与之相连的毛细阀13溢出到沉降腔14内导致内部液柱升高，第一虹吸阀15、第二虹吸阀20导通并持续泵送沉降腔14内的液体和细胞层，解决了常规虹吸阀在密度梯度离心应用中导致细胞层紊乱和单个核细胞提取效率低的问题。实际操作中仅需要在驱动芯片转动前在两个Percoll腔加入Percoll液和样品腔6加入外周血样本即可，全部过程均为离心力驱动，由控制转速来实现Percoll和全血样本的顺序加载以及毛细阀13和第一虹吸阀15、第二虹吸阀20的打开，尤其是细胞提取过程仍然保持高转速，无需减速、停止和人工干预，克服了传统离心机提取方法和目前应用的离心式芯片需要制动或减速以完成细胞提取的缺点。
上述用于单个核细胞提取的全自动离心微流控芯片的制备方法有两种方法获得，一种方法是分别加工盖片和基片，并通过超声键合；另一种方法是四层圆盘通过激光雕刻和切割，并通过压敏胶依次粘贴构成。
第一种方法的制备步骤包括：
步骤一、加工聚合物(包括但不限于PMMA、PC、COC、COP、PS、PVC等)板材，获得双面光滑的圆盘作为盖片，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口1、第二进液口4、第三进液口10和第一通气孔2、第二通气孔3、第三通气孔9、第四通气孔11、第五通气孔19、第六通气孔23，中心为电机安装孔；
步骤二、通过注塑制作聚合物微流控芯片作为基片，所述聚合物微流控芯片包括微流控结构和腔室结构，微流控结构的周围设有粘接筋；
步骤三、将步骤一得到的盖片和步骤二得到的基片固定并对准，置于超声波键合设备之下；
步骤四、使盖片和基片的粘接筋通过超声键合，获得全自动离心微流控芯片。
第二种方法的制备步骤包括：
步骤一、通过激光雕刻机加工聚合物(包括但不限于PMMA、PC、COC、COP、PS、PVC等)板材得到第一层圆盘(如图9所示)，先通过激光雕刻形成毛细阀上表面结构，再通过激光切割得到若干个通孔，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口1、第二进液口4、第三进液口10和第一通气孔2、第二通气孔3、第三通气孔9、第四通气孔11、第五通气孔19、第六通气孔23，中心为电机安装孔；
步骤二、通过激光雕刻机加工双面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第二层圆盘(如图10所示)，其上带有通过切穿板材得到的微流控结构，中心为电机安装孔；
步骤三、通过激光雕刻机加工下表面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第三层圆盘(如图11所示)，其上带有通过切穿板材得到的腔室结构，中心为电机安装孔；
步骤四、通过激光雕刻机加工聚合物板材，得到第四层圆盘(如图12所示)，先通过激光雕刻形成毛细阀下表面结构，再通过激光切割得到微流控圆盘，圆盘中心为电机安装孔；
步骤五、将第二层圆盘粘有压敏胶的下表面与第三层圆盘无压敏胶的一面粘贴；
步骤六、将第一层圆盘与第二层圆盘粘有压敏胶的上表面粘贴；
步骤七、将第三层圆盘带有压敏胶的一面与第四层圆盘粘贴，完成全自动离心微流控芯片的封装。
其中，第一层圆盘和第四层圆盘的厚度为0.5mm，第二层圆盘的厚度为0.2mm，第三层圆盘的厚度为1mm。芯片各层圆盘的直径均为102mm。第一层圆盘、第二层圆盘、第三层圆盘的安装孔直径为8mm，第四层圆盘安装孔直径为6mm。各圆盘上通气孔和进液口的直径均为1mm。所采用压敏胶厚度为86um。
圆盘转速-时间控制(如图13所示)。Percoll溶液轻微加载到全血上对于提高分层清晰及稳定是必要的，因此圆盘开启旋转的转加速度设置较低水平为40转/分·秒。整个沉降过程是通过保持2000转/分钟的旋转速度8分钟，分层完成后以25转/分·秒加速圆盘至大于2000转/分钟(优选的为2500转/分钟)，此时毛细阀13打开，第二虹吸阀20截止处液体开始越过第二虹吸阀20，第一虹吸阀15截止处液体开始越过第一虹吸阀15，持续旋转20秒直至沉降腔14液体全部进入到第二收集腔21、第一收集腔16和废液腔18，提取完成后以100转/分·秒加速度停止芯片。
离心式微流控芯片用于单个核细胞和粒细胞提取实验过程为(如图14所示)：首先，将35ul密度为1.09g/ml的Percoll液预先加载到沉降腔14底部，用移液枪将35ul体积的稀释血样和30ul密度为1.077g/ml的Percoll液分别注射到样品腔6和第一Percoll腔5，再将9ul密度为1.077g/ml的Percoll密度梯度液注射到第二Percoll腔12，如图14(a)所示。然后，驱动离心机在固定转加速度下旋转，旋转产生的离心力驱动Percoll密度梯度液和血液样本流动。时序控制通道8用于控制Percoll密度梯度液与血液样品的进样顺序，细胞分选过程要求血液样品在Percoll密度梯度液完全加载沉降腔14后再载入沉降腔14。液体流动速度与水动力阻力成反比，且水动力阻力与特征尺寸和时序控制通道8长度有关，增加时序控制通道8长度，减小时序控制通道8的宽度和深度能够减小流体流动速度。因此，根据该原理通过控制样品腔6和第一Percoll腔5连接沉降腔14的通道结构特征，来控制液体加载到沉降腔14所需时间。由于样品腔6下方存在较长的弯曲通道，样品腔6内血液流动速度降低；而第一Percoll腔5下方宽直通道促进Percoll密度梯度液快速加载到沉降腔14中。待完全加载后，血液样品刚充满弯曲通道，开始沿沉降室壁平稳加载到沉降腔14中，如图14(b)(c)所示。在稳定的离心转速下，不同密度细胞开始沉降并在Percoll密度梯度液的作用下分层，如图14(d)所示。其中，沉淀腔14上方第三通气孔9的设计可更好地控制空气的进出，这样能够促进沉降腔14内液面稳定，利于血细胞稳定分层。此时的离心转速不足以使毛细阀13打开，Percoll液继续停留在第二Percoll腔12内。细胞分层完成后，加速启动圆盘旋转，Percoll液突破毛细阀13并进入到沉降腔14内，如图14(e)所示。沉降腔14液面升高且高于第二虹吸阀20、第一虹吸阀15顶点，第二虹吸阀20、第一虹吸阀15打开并且第二虹吸阀20、第一虹吸阀15与沉降腔14连接处上方的液体导入到第二收集腔21、第一收集腔16中。当第一收集腔16内液体装满时，多余的Percoll液及血浆溢出到废液腔18中，如图14(f)所示。最后，打开第二吸液口22、第一吸液口17密封的胶带用移液器提取第二收集腔21、第一收集腔16中的粒细胞和单个核细胞完成分选。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：包括密度梯度离心单元、虹吸阀触发单元和第一细胞收集单元；
所述密度梯度离心单元包括第一Percoll腔、直通道、样品腔、时序控制通道和沉降腔，所述第一Percoll腔的顶部设有第一进液口和第一通气孔，所述第一Percoll腔的底部通过直通道与沉降腔的顶部连通，所述样品腔的顶部设有第二进液口和第二通气孔，所述样品腔的底部通过时序控制通道与沉降腔的顶部连通，所述沉降腔的顶部设有第三通气孔，所述直通道、时序控制通道用于实现Percoll及全血样本的顺序释放和加载，密度梯度形成过程在沉降腔内完成；
所述虹吸阀触发单元包括第二Percoll腔、毛细阀和微通道，所述第二Percoll腔的顶部设有第三进液口和第四通气孔，所述第二Percoll腔的底部依次通过毛细阀和微通道与沉降腔的中部连通，所述毛细阀在高速时打开从而释放第二Percoll腔内的Percoll，使得沉降腔液面升高；
所述第一细胞收集单元包括第一虹吸阀、第一收集腔和废液腔，所述第一收集腔的顶部与废液腔的顶部连通并通过第一虹吸阀与沉降腔的中部连通，所述第一虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放Percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第一收集腔与废液腔位于同一离心半径，所述第一收集腔用于提取单个核细胞，所述第一收集腔的底部设有第一吸液口，所述废液腔用于存储剩余的Percoll及血浆，所述废液腔的顶部设有第五通气孔。
2.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：该全自动离心微流控芯片还包括第二细胞收集单元；
所述第二细胞收集单元包括第二虹吸阀和第二收集腔，所述第二收集腔的顶部通过第二虹吸阀与沉降腔的下部连通，所述第二虹吸阀用于目标细胞层的转移和提取，在所述毛细阀打开释放Percoll令沉降腔液面升高时触发开启，所述第二收集腔用于提取粒细胞，所述第二收集腔的底部设有第二吸液口，所述第二收集腔的顶部设有第六通气孔。
3.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：所述第一Percoll腔与样品腔的容积相同且直通道的宽度大于时序控制通道的宽度。
4.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：所述时序控制通道的长度为大于30mm。
5.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：所述第一Percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离与样品腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离相等。
6.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：所述毛细阀的宽度大于微通道的宽度，长度小于其高度。
7.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：在密度梯度离心时沉降腔内液面到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离大于虹吸阀顶点到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离。
8.根据权利要求1所述的一种全自动离心微流控芯片，其特征在于：所述第二Percoll腔到该全自动离心微流控芯片的旋转中心的距离为5-10mm。
9.根据权利要求2所述的一种全自动离心微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、加工聚合物板材，获得双面光滑的圆盘作为盖片，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；
步骤二、通过注塑制作聚合物微流控芯片作为基片，所述聚合物微流控芯片包括微流控结构和腔室结构，微流控结构的周围设有粘接筋；
步骤三、将步骤一得到的盖片和步骤二得到的基片固定并对准，置于超声波键合设备之下；
步骤四、使盖片和基片的粘接筋通过超声键合，获得全自动离心微流控芯片。
10.根据权利要求2所述的一种全自动离心微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、通过激光雕刻机加工聚合物板材得到第一层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀上表面结构，再通过激光切割得到若干个通孔，所得通孔用于形成全自动离心微流控芯片的第一进液口、第二进液口、第三进液口和第一通气孔、第二通气孔、第三通气孔、第四通气孔、第五通气孔、第六通气孔，中心为电机安装孔；
步骤二、通过激光雕刻机加工双面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第二层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的微流控结构，中心为电机安装孔；
步骤三、通过激光雕刻机加工下表面粘贴有压敏胶的聚合物板材，得到第三层圆盘，其上带有通过切穿板材得到的腔室结构，中心为电机安装孔；
步骤四、通过激光雕刻机加工聚合物板材，得到第四层圆盘，先通过激光雕刻形成毛细阀下表面结构，再通过激光切割得到微流控圆盘，圆盘中心为电机安装孔；
步骤五、将第二层圆盘粘有压敏胶的下表面与第三层圆盘无压敏胶的一面粘贴；
步骤六、将第一层圆盘与第二层圆盘粘有压敏胶的上表面粘贴；
步骤七、将第三层圆盘带有压敏胶的一面与第四层圆盘粘贴，完成全自动离心微流控芯片的封装。
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