CN116854960A - 酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法 - Google Patents

酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白‑花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于包括如下步骤：S1、制备肌原纤维蛋白溶液；S2、于肌原纤维蛋白溶液中添加酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下暴露于空气中进行连续搅拌反应，反应结束后调节溶液的pH，即制得成膜溶液；S3、将成膜溶液浇注至培养皿中进行干燥，即得本发明指示膜。本发明利用酪氨酸酶催化法对花青素与肌原纤维蛋白进行共价交联结合，同时添加细菌纳米纤维素作为强化剂，可制备出花青素释放率低，镶嵌稳定性高，且使用安全的指示膜，另外本发明指示膜的光照稳定性高，对三甲胺的检测限最低可达1.5μmol，表现出了优越的三甲胺响应性能和检测稳定性。

Description

酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜 度指示膜的方法
技术领域
本发明属于食品无损监测技术领域，具体涉及一种酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法。
背景技术
鱼肉含有丰富的营养却很容易腐败变质，准确评估鱼肉产品的新鲜度对食品安全至关重要。用于检测鱼肉新鲜度的传统方法主要是微生物法和化学方法，例如挥发性盐基氮和菌落总数分析，而它们通常是耗时且复杂的。因此，用于评估鱼类产品新鲜度的简单、低成本、无损和准确的监测系统变得不可或缺。基于比色法的智能包装是一种无损的监测技术，它通过颜色色调的变化，可以直观的反映鱼肉的新鲜程度。其反应原理是鱼类腐败过程中释放的挥发性胺会使包装内顶部空气的pH升高，导致pH敏感染料发生化学变化，继而产生颜色变化。
花青素(ACN)作为一种天然安全、变色范围广、变色效果明显的色素，已经广泛的应用于智能包装中。迄今为止，大多数基于花青素指示膜都是以亲水聚合物为载体开发的，并被应用于监测高水分食品的新鲜度，如鲜鱼和牛肉等。然而，亲水性薄膜在高湿度的包装环境中吸水后会溶胀，导致花青素的渗漏，从而限制了这些薄膜的指示能力。此外，由于天然着色剂的不稳定性，如花青素对光、热、pH、氧和金属离子等高度敏感。在指示膜的长期使用和贮藏过程中，花青素在光照和氧气环境下很容易降解，从而导致指示膜的指示效果失灵。另外，由于指示膜需要暴露在食品包装内，其有可能与食品或人体直接接触，从而带来潜在的安全风险，虽然使用天然安全的花青素替代化学显色剂可提升指示膜的安全性，但是指示膜使用不安全的基材，或制备过程中引入有潜在安全风险的化学成分同样会降低指示膜的使用安全性。
综上可知，如何减少镶嵌在指示膜中花青素的浸出，以及提升指示膜中花青素的稳定性，同时保证指示膜的使用安全性是花青素指示膜推广应用需要解决的关键问题。对此，现有技术中披露了相关技术方案以解决上述问题，例如，中国专利(申请号202111182867.X)公开了一种花青素-甜菜素-k-卡拉胶鲜度指示膜的制备方法，其通过花青素、甜菜素两者与聚合物结合增强天然色素的pH响应变色敏感性并改善其化学稳定性，从而得到了高效、稳定的新鲜度指示膜。但是该技术方案并未解决指示膜在高湿度的包装环境中吸水后溶胀，从而导致花青素和甜菜素-k浸出渗漏的问题。
又如，中国专利(申请号202211608639.9)公开了一种低花青素泄露的海藻酸钠/纤维素纳米晶体/蜂蜡基疏水性指示膜的制备方法，其利用纤维素纳米晶体的分子络合性质和蜂蜡的水阻隔性质，实现了低花青素泄漏量和高疏水稳定性，确保了智能指示膜在实际应用中良好的指示效果，延长了智能指示膜的使用寿命。虽然上述技术方案解决了指示膜吸水溶胀导致花青素泄露的问题，但是该制备方法比较复杂，且使用了正己烷、聚二甲基硅氧烷等化学试剂处理指示膜，而正己烷、聚二甲基硅氧烷的残留问题则对指示膜的使用安全性造成了影响。
再如，中国专利(申请号202210650331.4)公开了一种监测鸡肉新鲜度的海藻酸钠-紫薯皮花青素智能指示膜制备的方法，其以安全无毒、具有很好的成膜性能和可食性的海藻酸钠作为成膜基材，并利用紫薯皮花青素作为指示剂，可制备出对鸡胸肉新鲜度指示效果明显的指示膜。虽然该指示膜安全性好，但是并未解决花青素容易浸出，且稳定性低的问题。
基于上述可知，现有技术披露的上述花青素指示膜并不能同时解决花青素易泄露、稳定性低，指示膜存在安全隐患的问题，其均存在可以改进的空间。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，本发明利用酪氨酸酶催化法对花青素与肌原纤维蛋白进行共价交联结合，同时添加细菌纳米纤维素作为强化剂，可制备出花青素释放率低，镶嵌稳定性高，且使用安全的指示膜，另外本发明指示膜的光照稳定性高，对三甲胺的检测限最低可达1.5μmol，表现出了优越的三甲胺响应性能和检测稳定性。
本发明通过下述技术方案实现。
一方面，本发明提供了一种酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、制备肌原纤维蛋白溶液；
S2、于肌原纤维蛋白溶液中添加酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下暴露于空气中进行连续搅拌反应，反应结束后调节溶液的pH，即制得成膜溶液；
S3、将成膜溶液浇注至培养皿中进行干燥，即得本发明指示膜。
作为优选技术方案，所述步骤S3具体为，于成膜溶液中加入细菌纳米纤维素和甘油，在室温下搅拌0.5～3h，然后过滤除去杂质，将滤液浇注至培养皿中，之后于40～55℃条件下干燥，即得本发明指示膜。
作为优选技术方案，所述步骤S1中肌原纤维蛋白溶液的制备方法为，将冷冻鱼糜解冻后切割成小块，然后按料液质量7～10:50加入蒸馏水，同时以鱼糜质量计加入2％～3％的氯化钠，之后进行均质，即得肌原纤维蛋白溶液。
作为优选技术方案，所述均质的条件为，均质转速8000～12000r/min，均质时间100～150s。
作为优选技术方案，所述步骤S2中，控制连续搅拌反应的时间为3～5h，反应结束后调节溶液的pH至3。
作为优选技术方案，所述步骤S2中，控制添加的酪氨酸酶酶活性浓度为20～35U/mL。
作为优选技术方案，所述步骤S2中，控制花青素的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为0.5％～2％。
作为优选技术方案，所述步骤S3中，细菌纳米纤维素以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计添加量为5％～7％。
作为优选技术方案，所述步骤S3中，甘油的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为40％。
另一方面，本发明提供了一种食品新鲜度指示膜，其特征在于，采用上述任一所述方法制备而成。
对于本发明技术方案的探索和实现，由于发明人团队长期从事水产加工方面的研发和应用工作，因此基于肌原纤维蛋白在水产加工副产物中易获取，且肌原纤维蛋白可食用，安全性高的特点，发明人提出了采用从鱼肉中提取的肌原纤维蛋白作为制备指示膜基材的创新思路；基于上述思路，发明人知晓蛋白质是制备花青素指示膜常用的基质材料，如明胶、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等，虽然肌原纤维蛋白也属于蛋白质材料，但是其在制备花青素指示膜产品中的应用并未见报道，况且在使用常规的蛋白质作为基材制备花青素指示膜仍然还存在花青素易浸出，花青素稳定性差，安全性不高的诸多问题，因此，本发明采用肌原纤维蛋白是否能成功制备出可检测食品新鲜度的花青素指示膜基材是未知的，尤其是还需要克服背景技术中提及的问题更是增加了本发明的实现难度；
在本发明技术方案的摸索过程中，申请人首选尝试了采用常规的花青素指示膜制备方法，即将肌原纤维蛋白与花青素在厌氧条件下连续搅拌混合来制备成膜液，但是制备的成膜液中花青素与肌原纤维蛋白的结合率较低，且花青素与肌原纤维蛋白的结合物对紫外线照射的颜色稳定性和抗氧化稳定性均较差，如实施例3所示出的实验数据；对此，为了提升花青素与肌原纤维蛋白结合物的稳定性，发明人经检索文献发现，现有技术中稳定花青素的策略有共色素化，乙酰化，微胶囊化和脂质体化，但是上述方法均是非共价相互作用，而非共价相互作用通常是可逆的，容易受到环境因素，因此并不适合应用于制备花青素指示膜中；另外，现有技术中也披露，通过多酚类物质与肌纤维蛋白的共价相互作用可改善蛋白质的抗氧化稳定性和凝胶特性，但是在加入花青素的情况下，多酚类物质与肌纤维蛋白共价相互作用是否会影响花青素与肌原纤维蛋白结合物的稳定性仍然是不可预期或未知的；为了不排除上述可改进花青素与肌原纤维蛋白结合物的稳定性的可能，发明人仍然通过实验尝试了采用不同共价结合方法对所形成的花青素与肌原纤维蛋白结合物的颜色稳定性和抗氧化活性方面的有效性，如实施例3所示出的实验数据；而发明人欣喜发现，通过酪氨酸酶催化法制备的花青素与肌原纤维蛋白结合物的颜色稳定性和抗氧化活性均较好，且可应用于食品新鲜度指示膜的制备中，以获得稳定性好和使用安全性高的花青素指示膜；并且，发明人意外发现，由于肌原纤维蛋白富含能够吸收紫外线的酪氨酸和苯丙氨酸，因此，采用肌原纤维蛋白作为基材将具有优良的紫外线阻隔性能，可在一定程度上能够减少紫外线辐射造成的花青素降解；另外，为进一步提高蛋白膜的机械性能，发明人还在成膜液中加入细菌纳米纤维素(BNC)作为强化剂，由于细菌纳米纤维素具有三维多孔网络结构，高纵横比、高孔隙率、高表面积的特点，这种特殊的分子结构使细菌纳米纤维素容易与其它分子进行复合或链接，从而提升了指示膜的机械性能，并且发明人还发现，细菌纳米纤维素的加入还提高了指示膜的其疏水性，从而可防止花青素与水接触而溶出。
本发明的有益效果如下：
1)本发明利用酪氨酸酶催化法对花青素与肌原纤维蛋白进行共价交联结合，可提高花青素的颜色稳定性和抗氧化活性，同时添加细菌纳米纤维素作为强化剂，可明显改善蛋白质膜的疏水性，从而进一步提高了花青素在蛋白质膜中的镶嵌稳定性；另外，通过本发明方法制备的指示膜的光照稳定性高，对三甲胺的检测限最低可达1.5μmol，表现出了优越的三甲胺响应性能和检测稳定性。
2)本发明指示膜采用肌原纤维蛋白作为基材，同时添加细菌纳米纤维素作为强化剂，制备过程中不额外加入其它具有安全风险的化学添加剂，从而使得本发明制备的食品新鲜度指示膜具有较好的安全性。
3)本发明方法制备的指示膜可以显著区分鲜鱼的新鲜、次鲜、腐败级，因此本发明指示膜通过颜色的变化实时可视化监控并预警制造商和消费者食品腐败的发生，将有较好的实用和推广价值。
附图说明
图1为不同共价结合方式对花青素结合率的影响图；
图2为紫外线照射时间对花青素溶液，结合物和混合物颜色的影响；图中A为紫外线照射时间对花青素溶液颜色的影响，图中B为紫外线照射时间对结合物和混合物颜色的影响；
图3为紫外线照射时间对结合物和混合物的DPPH自由基清除活性的影响；
图4为本发明指示膜的水接触角检测结果图；
图5为本发明指示膜的X射线衍射图谱；
图6为本发明指示膜的傅里叶红外光谱图；
图7为本发明指示膜的薄膜表面和截面的微观结构图；
图8为本发明指示膜在不同三甲胺浓度下的颜色响应结果图；其中，A为视觉颜色结果图，B为ΔE变化趋势图，C为拟合曲线图；
图9为本发明指示膜的花青素释放率结果图；
图10为本发明指示膜的光照稳定性测定结果图；
图11为本发明不同花青素含量指示膜在紫外光200-400nm和可见光400-800nm区的透光率结果图；
图12为新鲜团头鲂贮藏期间的指标变化图；
图13为指示膜的图像和色度值变化结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域技术人员以本发明的精神对本发明做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其包括如下步骤：
S1、制备肌原纤维蛋白溶液；
S2、于肌原纤维蛋白溶液中添加酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下暴露于空气中进行连续搅拌反应，反应结束后调节溶液的pH，即制得成膜溶液；
S3、将成膜溶液浇注至培养皿中进行干燥，即得本发明指示膜。
实施例2
酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其包括如下步骤：
S1、制备肌原纤维蛋白溶液，具体方法为，将冷冻鱼糜解冻后切割成小块，然后按料液质量7～10:50加入蒸馏水，同时以鱼糜质量计加入2％～3％的氯化钠，之后于转速8000～12000r/min的条件下均质100～150s，即得肌原纤维蛋白溶液；之后采用Lowery法测定肌原纤维蛋白溶液中的蛋白质含量；
需要指出的是，本发明采用的肌原纤维蛋白溶液是以鱼糜为原料制取而得，而可以推测的是，采用其它动物来源的肌原纤维蛋白同样可以应用在本发明中并取得相同的效果，且肌原纤维蛋白溶液的制备形式并不限于上述，其可以从新鲜或冷冻的动物组织中提取，也可从新鲜或冷冻的动物肉糜中提取，还可用肌原纤维蛋白粉复溶获得；
S2、将步骤S1制备的肌原纤维蛋白溶液的pH调至6.5±0.5，然后于肌原纤维蛋白溶液中加入酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下暴露于空气中连续搅拌反应3～5h，之后调节溶液的pH至3，即制得成膜溶液；其中，控制酪氨酸酶的添加量，使酪氨酸酶的酶活性浓度为20～35U/mL；花青素的加入量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为0.5％～2％；
S3、于步骤S2获得的成膜溶液中加入细菌纳米纤维素和甘油，在室温下搅拌0.5～3h，然后过滤除去杂质，将滤液浇注至聚苯乙烯培养皿中，之后于40～55℃条件下干燥；其中，细菌纳米纤维素以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计添加量为5％～7％，甘油的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为40％。
实施例3
酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其包括如下步骤：
S1、制备肌原纤维蛋白溶液：将冷冻鱼糜在4℃下解冻12h，将解冻后的鱼糜切割成小块，然后取16g鱼糜加入至84g蒸馏水中，同时以鱼糜质量计加入0.4g氯化钠，之后于转速10000r/min的条件下均质120s，即得肌原纤维蛋白溶液；之后采用Lowery法测定肌原纤维蛋白溶液中的蛋白质含量；
S2、将步骤S1制备的肌原纤维蛋白溶液的pH调至6.5±0.5，然后于肌原纤维蛋白溶液中加入酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下，暴露于空气中连续搅拌反应4h，之后用1mol/L的HCl调节溶液的pH至3，即制得成膜溶液；其中，控制酪氨酸酶的添加量，使酪氨酸酶的酶活性浓度为27U/mL；花青素的加入量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为0.5％～2％；
S3、于步骤S2获得的成膜溶液中加入细菌纳米纤维素和甘油，在室温下搅拌2h，然后通过一层粗棉布过滤除去杂质，将滤液浇注至聚苯乙烯培养皿中，之后在50℃的烘箱中干燥36h，干燥结束后用镊子将薄膜剥离，并将其放置在75％相对湿度(RH)的干燥器中储存以备进一步分析；其中，菌纳米纤维素以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计添加量为6％，甘油的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为40％。
实施例4
不同共价结合方法对所形成的花青素与肌原纤维蛋白结合物的颜色稳定性和抗氧化活性方面的测定。
一、实验设置
酪氨酸酶催化法(enzymatic conjugates)：用含有0.6mol NaCl的磷酸盐缓冲液将肌原纤维蛋白溶液稀释到蛋白质浓度为15mg/mL。首先将肌原纤维蛋白溶液调节到pH6.5±0.5，然后加入花青素(15μmol/g蛋白质)和酪氨酸酶(27U/mL)。将其混合后在暴露于空气下的冰水浴中连续搅拌4小时；最后，溶液的pH值被调整到7.0。
自由基接枝法(radical conjugates)：将肌原纤维蛋白溶液(15mg/mL)置于烧杯中，同时加入10μmol FeCl3、100μmol抗坏血酸和1mmol H2O2作为氧化发生系统。然后加入花青素(15μmol/g蛋白质)并在暴露于空气下的冰水浴中连续搅拌4小时；在反应结束时加入Trolox(1mmol/L)终止氧化反应；最后，溶液的pH值被调整到7.0。
碱性pH shift处理法(alkaline conjugates)：将花青素(15μmol/g蛋白质)加入到肌原纤维蛋白溶液(15mg/mL)中，混合后进行碱性pH shift处理(pH7.0→9.0→7.0)。简而言之，用1mol/L NaOH将混合物的pH值调整到9.0，然后将混合物在暴露于空气下的冰水浴中持续搅拌4小时，最后将溶液的pH值调整到7.0。
超声处理法(ultrasonic conjugates)：将花青素(15μmol/g蛋白)加入到肌原纤维蛋白溶液(15mg/mL)中，混合后在冰水浴中以400W的功率进行超声处理20min。然后将混合物在暴露于空气下的冰水浴中连续搅拌4小时，最后将溶液的pH值调整到7.0。
作为比较，采用指示膜制备过程中成膜液的常规处理方法，即将肌原纤维蛋白溶液与花青素混合，之后在厌氧条件下连续搅拌4小时，最后将溶液的pH值调整到7.0，以制得肌原纤维蛋白-花青素混合物(complexes)。
上述方法中，花青素为食物中最具代表性的花青素矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)，购自成都瑞芬思德丹生物技术有限公司；酪氨酸酶(1350u/mg)购于上海源叶生物技术有限公司。
二、检测方法
花青素结合率用pH示差法测定。用磷酸盐缓冲液将样品的蛋白浓度稀释到2mg/mL，然后加入1mL蛋白变性剂(20％三氯乙酸和0.4％磷钨酸)，在4℃下孵育30分钟。孵育完成后的样品在12000r/min，4℃的条件下离心15min，除去上清，清洗沉淀，再用0.1mol/LNaOH复溶。通过pH示差法测定蛋白中的花青素含量。花青素结合率计算公式如下所示：
花青素结合率(％)＝花青素结合量/花青素总含量×100％
颜色稳定性的测定方法为，使用紫外线分析仪将制备的样品暴露在紫外线下48h，辐照度为400μW/cm2，波长为365nm，在第24h和48h收集样品进行色度变化分析。经紫外线辐照处理的样品的色度值测量是用Hunter Lab UltraScan VIS色度计进行。
抗氧化特性的测定方法为，用含有0.6mol NaCl的磷酸盐缓冲液将样品的蛋白浓度稀释到0.5mg/mL，取2mL样品溶液与2mL DPPH乙醇溶液混合，在室温下避光反应1h，用分光光度计在517nm处测定其吸光值。DPPH自由基清除率用以下公式计算：DPPH自由基清除率(％)＝[A0–(A–B)]/A0×100％，其中A是样品的吸光度，B是对照的吸光度(在样品中加入乙醇而不是DPPH)，A0是空白对照的吸光度(在DPPH中加入蒸馏水而不是样品)。
二、结果分析
测定不同共价结合方法及常规处理方法获得的成膜液的花青素结合率，颜色稳定性和抗氧化特性，结果分别见图1，图2和表1，图3。
表1紫外照射时间对花青素溶液、肌原纤维蛋白-花青素结合物、肌原纤维蛋白-花青素混合物比色参数的影响
注：不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。
如图1所示，肌原纤维蛋白-花青素结合物显示出比肌原纤维蛋白-花青素混合物更高的结合率，这表明共价相互作用比非共价相互作用力更强。结果表明，相较于其它方法而言，酪氨酸酶催化法能更有效地将肌原纤维蛋白与花青素结合。
如图2A所示，在紫外线照射24h和48h后，肌原纤维蛋白-花青素混合物溶液的颜色从紫红色变为淡粉色，再变为黄色。同时，由表1可知，肌原纤维蛋白-花青素混合物溶液的L*和b*值显著增大，而a*值显著减小，表明肌原纤维蛋白-花青素混合物溶液中花青素在紫外线照射下发生光解褪色。图2B和表1显示了不同紫外线照射时间对肌原纤维蛋白-花青素结合物和混合物的颜色稳定性的影响。在紫外线照射后，与未经处理的肌原纤维蛋白-花青素混合物溶液相比，与蛋白质结合的花青素的△E值显著降低(P<0.05)，表明肌原纤维蛋白对花青素在紫外线照射后的降解有保护作用。此外，在紫外线照射24h后，肌原纤维蛋白-花青素结合物的褪色没有混合物那么明显，表明花青素与蛋白质的共价结合有助于花青素的颜色稳定性。在紫外线照射48h后，只有酪氨酸酶催化法结合物的△E值最小，表明紫外线照射对它的影响最小。
如图3所示，肌原纤维蛋白-花青素结合物的抗氧化能力明显高于混合物，这与花青素结合率的结果一致，其中酪氨酸酶催化法制备的样品具有最高的DPPH自由基清除活性，这是因为酶法结合的结合效率更高。上述结果表明，通过酪氨酸酶催化法制备的肌原纤维蛋白-花青素结合物具有更好的抗氧化活性，从而可延缓花青素在紫外照射条件下的降解。
综上可知，通过酪氨酸酶催化法制备的花青素与肌原纤维蛋白结合物的颜色稳定性和抗氧化活性均较好，且可应用于食品新鲜度指示膜的制备中，以获得稳定性好和使用安全性高的花青素指示膜。
实施例5
本发明所制备的指示膜的性能测定。
1、样品制备
MP，指示膜采用实施例3的方法制备，但不添加细菌纳米纤维素(BNC)和花青素(ACN)；
MP/BNC，指示膜采用实施例3的方法制备，但不添加花青素(ACN)；
MP/BNC/ACN0.5，指示膜采用实施例3的方法制备，其中控制步骤S2中花青素的添加量为0.5％；
MP/BNC/ACN1，指示膜采用实施例3的方法制备，其中控制步骤S2中花青素的添加量为1％；
MP/BNC/ACN2，指示膜采用实施例3的方法制备，其中控制步骤S2中花青素的添加量为2％；
2、检测方法与结果
2.1指示膜的机械性能
检测所制备样品的机械性能，机械性能参照国标《塑料拉伸性能的测定》(GB/T1040.1-2018)的方法测定指示膜的机械性能，结果见表2；
表2机械性能测定结果
样品名称 拉伸强度(MPa) 断裂伸长率(％)
MP 5.28±0.36d 60.63±2.86a
MP/BNC 7.62±0.13c 41.18±1.32b
MP/BNC/ACN0.5 8.06±0.21b 30.12±2.31c
MP/BNC/ACN1 8.53±0.11a 24.85±1.38d
MP/BNC/ACN2 8.22±0.15b 23.57±1.88d
从上表可以看出，在蛋白质膜中添加细菌纳米纤维素后(BNC)，薄膜的拉伸强度显著增加，而断裂伸长率减小。在与花青素共价交联后，膜的拉伸强度进一步增大。当花青素浓度增加到2％时，膜的拉伸强度呈下降趋势。
2.2指示膜的水接触角
采用OCA20接触角测量仪测定指示膜的水接触角，其结果见图4。由图4可知，加入细菌纳米纤维素后，明显改善提高了膜的疏水性。随着花青素浓度的增加，薄膜的接触角在花青素浓度为1％时逐渐增加到最大值60.6°，随后在花青素浓度为2％时降低。
2.3指示膜的X衍射
采用X射线衍射仪测定膜的X射线衍射图谱，其结果见图5。由图5可知，在蛋白质聚合物基质中加入细菌纳米纤维素后，膜的X射线衍射图谱出现新的尖峰，证实了细菌纳米纤维素在聚合物基底中的存在。
2.4指示膜的傅里叶红外图
采用傅里叶红外仪测定膜的傅里叶红外光谱，其结果见图6。由图6可知，花青素可以通过氢键、疏水作用或静电相互作用以及共价键与肌原纤维蛋白结合，这也与实施例5中的实验数据相符，证明了酪氨酸酶催化法能更有效地将肌原纤维蛋白与花青素结合。
2.5指示膜的扫描电镜观察
利用扫描电子显微镜观察薄膜表面和截面的微观结构，其结果见图7。由图7可知，肌原纤维蛋白膜表面不均匀，截面也有凸起。在加入细菌纳米纤维素后，MP/BNC膜的表面粗糙度显著减小，但是截面裂纹增多。随着花青素的添加，膜的微观结构变得更致密，截面无明显孔洞。随着花青素含量的进一步增加，在MP/BNC/ACN2膜的表面和横截面上形成了团聚物和裂纹。
2.6指示膜对三甲胺的颜色响应
将薄膜(10mm×10mm)放置在密闭的相对湿度为75％的测试室内，用微升注射器将分析物的溶液注入测试室，使用如下公式计算测试室中三甲胺的浓度：
其中C(mol/L)是测试室中三甲胺的浓度；ρs是三甲胺溶液的密度(g/mL)；Vs是三甲胺溶液的体积(mL)；W是三甲胺溶液中三甲胺的质量分数；M是三甲胺的摩尔质量(g/mol)；V是测试室的体积(L)。
将膜在测试室中保持3小时以达到反应平衡之后，分别使用扫描仪和色度计记录薄膜的图像和色度值。其中色差值ΔE按照如下公式计算：
其中，L*、a*和b*分别代表三甲胺处理后薄膜的色度值，和/>代表三甲胺处理前的薄膜的色度值，其结果见图8。
由图8A可知，MP/BNC/ACN薄膜暴露于三甲胺气氛中的颜色由红色变为蓝灰色，且随着花青素含量的增加颜色逐渐加深，表明指示膜中花青素的含量对三甲胺颜色响应的灵敏度有一定的影响。由图8B可知，指示膜在三甲胺浓度为2.5～10μmol时的色差值呈现较好的线性关系，经拟合计算，由图8C可知，MP/BNC/ACN0.5、MP/BNC/ACN1和MP/BNC/ACN2对三甲胺的检测限(LOD)分别为1.5、2.0和2.2μmol，均远低于其它已报道的三甲胺检测限5.6μmol(Valdez,Gupta,Lozano,&Mao.ForceSpun polydiacetylene nanofibers ascolorimetric sensor for food spoilage detection.Sensors and Actuators B-Chemical.2019)，从而表明本发明具有较高的三甲胺反应灵敏度。
2.7指示膜中花青素释放特性
取制备好的薄膜(20mm×20mm)浸没在装有50mL去离子水的试管中，然后将试管移至振荡培养箱在黑暗的条件下转速设为100r/min，温度为25℃。根据标准曲线可以计算出相应时间内花青素的释放百分比，计算公式如下：
其中Mt和M0分别表示在时间t释放的花青素的量和在膜中的总的花青素的量。每隔2小时进行一次测量，在每次测量后，测试样品立即倒回到原始溶液中，以保持总体积恒定，测定结果见图9。
由图9可知，由于花青素与肌原纤维蛋白的共价交联，使得指示膜具有较低的花青素释放率，MP/BNC/ACN0.5，MP/BNC/ACN1，MP/BNC/ACN2三个指示膜样品在12h后的累积释放率为12.32％～14.33％，且随着时间的延长释放率趋于稳定，远低于专利号为202211608639.9的发明专利报道的33.7％。
2.8指示膜的光照稳定性测定
使用紫外线分析仪将薄膜暴露在紫外线下，辐照度为400μW/cm2，波长为365nm，并每隔16h使用光学扫描仪和色度计记录薄膜的图像和色度值。使用荧光灯照射薄膜，薄膜与光源之间的距离为20cm，并每隔5d使用光学扫描仪和色度计记录薄膜的图像和色度值，测定结果见图10。
由图10可知，MP/BNC/ACN1和MP/BNC/ACN2指示膜样品在25℃条件下可见光照射30天和紫外照射96小时后，其△E均较小，颜色变化轻微，表明MP/BNC/ACN1和MP/BNC/ACN2指示膜具有较高的光照稳定性。
2.9指示膜对团头鲂新鲜度的监测
利用紫外可见分光光度计在200～800nm下测定膜的透过率。将膜剪成10mm×30mm的矩形长条，将矩形长条放入比色皿中进行测量，以空的比色皿作为对照，每张膜测量6个样品，结果见图11；
指示膜的透光率反映了它们的光阻隔特性，低透光率表明高阻隔性，如图11所示，肌原纤维蛋白膜MP在200～320nm处均显示出低透过率，表明肌原纤维蛋白膜MP本身具有较好的紫外线阻隔性能，这可能与肌原纤维蛋白富含能够吸收紫外线的酪氨酸和苯丙氨酸有关，因此采用肌原纤维蛋白作为制备指示膜的基材可有利于保护花青素受紫外照射而降解。另外，当肌原纤维蛋白膜加入花青素后，即通过酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素后，指示膜的透过率要远低于肌原纤维蛋白膜MP，且随着花青素含量的增大，指示膜的透过率降低，同时在整个紫外线区均显示出极低的透过率，这是因为花青素结构中丰富的芳香环可以吸收紫外-可见照射。
2.10指示膜对团头鲂新鲜度的监测
将新鲜团头鲂密封在无菌培养皿中，将制备的智能指示膜(20mm×20mm)贴在盖子内表面且不与鱼接触。然后在4℃下贮藏10天，每隔两天采用相机和色度仪记录智能指示膜的图像和色度值变化，测定结果见图9。在此期间分别按照GB5009.237-2016《食品pH值的测定》、GB5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》、GB4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB5009.181-2016《食品中丙二醛的测定》操作要求测定鱼肉pH、挥发性盐基氮含量(TVB-N)、菌落总数(TVC)、硫代巴比妥酸值(TBARS)指标的变化情况，测定结果见图8。
由图12可知，在4℃贮藏期间鱼肉pH的变化趋势为先降低后升高。鱼肉的菌落总数、硫代巴比妥酸值和挥发性盐基氮都逐渐增加，在第八天时分别达到8.17lg CFU/g，1.08mg MDA/kg和25.02mg/100g。一般认为当硫代巴比妥酸值大于1.0mg MDA/kg时会产生不愉快的酸败味。这些数值明显超过了国际微生物规范委员会(ICMSF)食品微生物限量107lg CFU/g以及中国国家标准(GB2733-2015)的上限20mg/100g，因此表明该鱼肉在8天后不可食用。由图13可知，在鱼肉的贮藏腐败过程中，比色膜的颜色总体上由红色向灰黑色转变，可以直观地反映鱼肉从新鲜到腐烂过程中的颜色变化。其中MP/BNC/ACN1指示膜对鱼肉新鲜度的变化最敏感和准确，当指示膜的颜色为红色时，表明此时鱼肉比较新鲜；当薄膜呈浅红色时，表明鱼肉处于次新鲜状态；当薄膜的颜色为灰黑色时，说明鱼肉已经明显变质。

Claims (10)

1.酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、制备肌原纤维蛋白溶液；
S2、于肌原纤维蛋白溶液中添加酪氨酸酶和花青素，在冰水浴条件下暴露于空气中进行连续搅拌反应，反应结束后调节溶液的pH，即制得成膜溶液；
S3、将成膜溶液浇注至培养皿中进行干燥，即得本发明指示膜。
2.如权利要求1所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于所述步骤S3具体为，于成膜溶液中加入细菌纳米纤维素和甘油，在室温下搅拌0.5～3h，然后过滤除去杂质，将滤液浇注至培养皿中，之后于40～55℃条件下干燥，即得本发明指示膜。
3.如权利要求1所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S1中肌原纤维蛋白溶液的制备方法为，将冷冻鱼糜解冻后切割成小块，然后按料液质量7～10:50加入蒸馏水，同时以鱼糜质量计加入2％～3％的氯化钠，之后进行均质，即得肌原纤维蛋白溶液。
4.如权利要求3所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述均质的条件为，均质转速8000～12000r/min，均质时间100～150s。
5.如权利要求1所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S2中，控制连续搅拌反应的时间为3～5h，反应结束后调节溶液的pH至3。
6.如权利要求1所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S2中，控制添加的酪氨酸酶酶活性浓度为20～35U/mL。
7.如权利要求1所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S2中，控制花青素的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为0.5％～2％。
8.如权利要求2所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S3中，细菌纳米纤维素以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计添加量为5％～7％。
9.如权利要求2所述的酪氨酸酶催化共价交联肌原纤维蛋白-花青素制备食品新鲜度指示膜的方法，其特征在于，所述步骤S3中，甘油的添加量以肌原纤维蛋白溶液中蛋白质的质量计为40％。
10.一种食品新鲜度指示膜，其特征在于，采用上述任一所述方法制备而成。
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