CN116848239A - 用于二萜生产的微生物 - Google Patents

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CN116848239A CN202180071923.4A CN202180071923A CN116848239A CN 116848239 A CN116848239 A CN 116848239A CN 202180071923 A CN202180071923 A CN 202180071923A CN 116848239 A CN116848239 A CN 116848239A
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Abstract

本文公开的本发明整体涉及甜菊醇糖苷的重组生产的领域、将甜菊醇生物转化为甜菊醇糖苷的领域以及将甜菊醇糖苷生物转化为另一种甜菊醇糖苷的领域。具体地，本发明提供了一种用于重组生产甜菊醇糖苷的方法、一种将甜菊醇生物转化为甜菊醇糖苷的方法、一种用于将甜菊醇糖苷生物转化为另一种甜菊醇糖苷的方法以及一种包含甜菊醇糖苷的组合物。更具体地，本发明涉及一种微生物，所述微生物具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷并且包含编码具有尿苷二磷酸依赖性葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸。

Description

用于二萜生产的微生物
技术领域
本文公开的本发明整体涉及甜菊醇糖苷的重组生产的领域、将甜菊醇生物转化为甜菊醇糖苷的领域以及将甜菊醇糖苷生物转化为另一种甜菊醇糖苷的领域。具体地，本发明提供了一种用于重组生产甜菊醇糖苷的方法、一种将甜菊醇生物转化为甜菊醇糖苷的方法、一种用于将甜菊醇糖苷生物转化为另一种甜菊醇糖苷的方法以及一种包含甜菊醇糖苷的组合物。更具体地，本发明涉及一种微生物，所述微生物具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷并且包含编码具有尿苷二磷酸依赖性葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸。
背景技术
全球对高效甜味剂的需求不断增加，并且不同的人工甜味剂的共混已成为标准做法。然而，预期对替代物的需求将增加。多年生草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana)的叶片积聚了大量被称为甜菊醇糖苷的极为甘甜的化合物。虽然这些化合物在植物中的生物学功能尚不清楚，但它们作为替代性的高效甜味剂具有商业意义，并且还有甜菊甜味剂是天然植物产品的额外优势。
这些甘甜的甜菊醇糖苷具有似乎优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外，研究表明，甜菊苷可以降低II型糖尿病患者的血糖水平，并且可以降低轻度高血压患者的血压。
甜菊醇糖苷积聚在甜菊叶片中，其中所述甜菊醇糖苷可占叶片干重的10％至20％。甜菊苷和莱鲍迪苷是热和pH稳定的，并且适用于碳酸饮料和许多其他食品。甜菊苷的甜度是蔗糖的例如110倍与270倍之间，并且莱鲍迪苷A的甜度是蔗糖的150倍与320倍之间。此外，莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M也是积聚在甜菊叶片中的高效的甜菊醇糖苷甜味剂。莱鲍迪苷M特别地在某些甜菊品种的叶片中以痕量存在，但据说与其他甜菊醇糖苷相比具有更佳的口感。具体地，莱鲍迪苷M似乎没有其他甜菊醇糖苷(尤其是莱鲍迪苷A)所典型具有的苦苦的甘草味后味。可商购获得的甜菊醇糖苷大多从甜菊植物中提取。在甜菊中，赤霉酸(GA)生物合成中的中间体(-)-贝壳杉烯酸被转化为四环二萜甜菊醇，其进一步继续进行多步骤葡糖基化途径以形成各种甜菊醇糖苷，诸如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。然而，提取物产率可能有所不同并且可能受到农业和环境条件的影响。此外，甜菊种植需要大量的土地面积、到收获的时间长、劳动密集并且提取和纯化糖苷需要额外成本。
因此，最近人们对使用发酵或生物转化工艺生产甜菊醇糖苷的兴趣越来越大。WO2011/153378A1、WO2013022989A2、WO2013/110673和WO2015/007748描述了可用于通过发酵和/或生物转化生产至少甜菊醇糖苷诸如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的方法和微生物。
期望进一步改善此类微生物，以便可生产更大量的甜菊醇糖苷和/或生产另外的或新的甜菊醇糖苷和/或更大量的特定甜菊醇糖苷和/或具有期望比率的不同甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷混合物。
为了满足对高效、天然甜味剂的不断增长的商业需求，需要新型、更标准化、纯净的单一组成、无后味的甜菊醇糖苷来源。
发明内容
本申请涉及一种重组微生物，其包含、优选地表达一种或多种编码一种或多种具有尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸，其中所述重组微生物在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽上具有缺陷，例如在PSK1多肽和/或PSK2多肽上具有缺陷。
所述修饰最终导致重组微生物的甜菊醇糖苷，特别是莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的产生改善。
还提供了
-一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括在有益于产生甜菊醇糖苷的条件下培养根据本公开的重组微生物，以及任选地回收甜菊醇糖苷；
-一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括使甜菊醇或甜菊醇糖苷与根据本公开的重组微生物、包含此类重组微生物的发酵肉汤接触，以及任选地回收甜菊醇糖苷。
还提供了使用根据本公开的方法获得的培养肉汤、甜菊醇糖苷以及食品、饲料或饮料。
附图说明
图1示出导致甜菊醇糖苷的生物合成的潜在途径的示意图。UGT85C2为UGT1；UGT74G1为UGT3；UGT76G1为UGT4；UGT91D2e为UGT2；EUGT11为UGT2。
图2示出PSK1缺失构建体的构建和分裂标志物片段正确整合后的最终基因组修饰的示意图。Scer trafo：转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。Ylip trafo：转化到解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中。
序列表的描述
序列的描述在表1中示出。本文所述的序列可参考序列表或参考也在表1中示出的数据库登录号来限定。
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一般定义
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应具有下文阐述的含义。附加定义在整个本申请中阐述。如发生矛盾，以包括定义的本申请为准。除非上下文另外需求，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。本文提及的所有公布、专利和其他参考文献均出于所有目的以引用方式整体并入，就如同每个单独的公布或专利申请被明确地并单独地指示为以引用方式并入一般。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本公开，下文描述合适的方法和材料。材料、方法和示例仅为说明性的并且不旨在进行限制。由具体实施方式并且由权利要求，本公开的其他特征和优点将显而易见。
如本公开和权利要求所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数形式。例如，“一个/种元件”可表示一个/种元件或多于一个/种元件，即“至少一个/种元件”。
除非具体指出或从上下文显而易见，如本文所用，术语“或”被理解为包括性的。如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分取决于所述值或组成如何测量或确定，即，测量系统的极限。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由...构成”可以表示在1个标准偏差以内或超过1个标准偏差。可替代地，“约”或“基本上由...构成”可以表示最多至20％的范围。此外，尤其是就生物系统或工艺而言，所述术语可以表示最多至值的一个数量级或最多至所述值的5倍。当在申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另外指出，否则“约”或“基本上由...构成”的含义应假定为在所述特定值或组成的可接受误差范围内。
“核酸分子”或“多核苷酸”(所述术语在本文可互换使用)由核苷酸序列表示。
“多肽”由氨基酸序列表示。
如本文所用，术语“分离的多肽”是指从至少一种组分，例如产生多肽的细胞和或发酵肉汤或粗物质或细胞提取物中存在的组分中去除或纯化的多肽。
术语“成熟多肽”在本文定义为处于其最终形式的多肽，并且是在将mRNA翻译成多肽、所述多肽在细胞内或外进行翻译后修饰后获得的。翻译后修饰包括N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化以及通过切割实现的如本文所定义的前导序列诸如信号肽、前肽和/或前肽前体的去除。
如本文所用的术语“天然存在的”是指在自然界中以其相关形式存在的过程、事件或产物。相比之下，“非天然存在的”是指其存在或形式涉及人为的过程、事件或产物。术语“非天然存在的在本文中与“人造的”同义。通常，关于多肽或核酸的术语“天然存在的”可以与术语“野生型”或“天然的”互换使用。它是指多肽或编码多肽的核酸，其分别具有与在自然界中发现的氨基酸序列或多核苷酸序列相同的氨基酸序列或多核苷酸序列。天然存在的多肽包括天然多肽，诸如在特定细胞中天然表达或发现的那些多肽。天然存在的多核苷酸包括天然多核苷酸，诸如在特定细胞的基因组中天然发现的那些多核苷酸。此外，为野生型或天然存在的序列可指从中衍生出变体或合成序列的序列。
术语“表达”包括涉及一种或多种多肽的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本文所用的术语“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶”、“PAS激酶”、“PSK”具有相同的含义并且可互换使用。如本文所用的所述术语是指将磷酸转移至蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸侧链的氧原子的含有PAS结构域的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.11.1)。所述酶参与例如糖代谢和翻译的控制。所述酶包括被称为“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1”和“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2”的酶。如本文所用的术语“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1”、“PAS激酶1”、“PSK1”具有相同含义并且可互换使用。如本文所用的术语“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2”、“PAS激酶2”、“PSK2”具有相同含义并且可互换使用。在酵母中，PSK1和PSK2是两种PAS激酶旁系同源物。
重组微生物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽缺陷在本文中意指重组微生物在多肽的产生中存在缺陷，并且所述缺陷在本文定义为表型特征，其中当在基本上相同的条件下进行分析时，与在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶上没有缺陷的相应重组微生物相比，所述重组微生物：a)产生较少的多肽，和/或b)从编码多肽的基因转录的mRNA的表达水平降低或翻译水平降低，和/或c)产生活性降低的多肽；以及这些可能性中的一种或多种的组合。重组微生物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷通常是其基因组修饰的结果。
在本文中，基因定义为含有开放阅读框(ORF)及其转录控制元件(启动子和终止子)的多核苷酸，ORF是基因上将被转录并翻译成多肽的区域。
重组微生物中的多肽生产缺陷可通过确定由在其基因组中进行修饰的重组微生物产生的相关多肽的量和/或(比)活性来测量，和/或其可通过确定由编码多肽的基因转录的(游离)mRNA的量来测量，和/或其可通过确定由如上文所定义的在其基因组中进行修饰的重组微生物中的多肽产生的产物的量来测量，和/或在与其基因组中未进行修饰的亲本(重组)微生物相比较时，其可通过基因或基因组测序来测量。多肽生产中的缺陷可以使用技术人员可获得的任何测定来测量，诸如转录谱分析、RNA印迹、RT-PCR、Q-PCR和蛋白质印迹。
重组微生物的基因组的修饰在本文定义为导致重组微生物的基因组中的多核苷酸发生变化的任何事件。修饰被理解为一个或多个修饰。可以通过例如经典菌株改良引入修饰，诸如随机诱变，然后进行选择。修饰可通过在多核苷酸中引入(插入)、取代或去除(缺失)一个或多个核苷酸来完成。这种修饰可以例如在编码序列或多核苷酸的转录或翻译所需要的调控元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或编码序列的开放阅读框的改变或移码。编码序列或其调控元件的修饰可通过定点或随机诱变、DNA改组方法、DNA重新组装方法、基因合成(参见例如Young和Dong,(2004),Nucleic Acids Research 32,(7)electronic access http://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或Gupta等人(1968),Proc.Natl.Acad.Sci USA,60:1338-1344；Scarpulla等人(1982),Anal.Biochem.121:356-365；Stemmer等人(1995),Gene164:49-53)，或根据本领域已知的方法的PCR产生的诱变来实现。随机诱变程序的示例是本领域熟知的，例如化学(例如NTG)诱变或物理(例如UV)诱变。定向诱变程序的示例是QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)、‘The AlteredII体外诱变系统’(Promega Corporation)或通过使用PCR实现的重叠延伸，如Gene.1989年4月15日；77(1):51-9.(Ho SN、Hunt HD、Horton RM、Pullen JK、Pease LR“Site-directedmutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction”)中所描述的，或使用PCR，如Molecular Biology:Current Innovations and Future Trends.(A.M.Griffin和H.G.Griffin编.ISBN 1-898486-01-8；1995Horizon Scientific Press,PO Box 1,Wymondham,Norfolk,U.K.)中所描述的。
可以通过将修饰的重组微生物的多核苷酸序列与未修饰的重组微生物的多核苷酸序列相比较来确定基因组中的修饰。多核苷酸的测序和基因组测序可以使用本领域技术人员已知的标准方法进行，例如使用Sanger测序技术和/或下一代测序技术，诸如IlluminaGA2、Roche 454等，如Elaine R.Mardis(2008),Next-Generation DNA SequencingMethods,Annual Review of Genomics and Human Genetics,9:387-402.(doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中所综述的。
示例性修饰方法基于基因替换、基因缺失或基因破坏的技术。
例如，在替换多核苷酸、多核苷酸构建体或表达盒的情况下，可在待替换的靶基因座处引入适当的多核苷酸。适当的多核苷酸可存在于克隆载体上。示例性的整合性克隆载体包含DNA片段，所述片段与该多核苷酸同源和/或与待替换的基因座侧接的多核苷酸具有同源性，以用于将克隆载体的整合靶向该预先确定的基因座。为了促进靶向整合，可在转化微生物之前将克隆载体线性化。在一些实施方式中，进行线性化使得克隆载体的至少一个末端或任一个末端侧接与待替换的多核苷酸(或侧翼序列)同源的多核苷酸序列。该过程称为同源重组，并且也可使用该技术实现(部分)基因缺失或基因破坏。
例如，对于基因破坏，可用缺陷性多核苷酸，即不能产生(完全功能性)蛋白质的多核苷酸替换与内源性多核苷酸相对应的多核苷酸。通过同源重组，缺陷性多核苷酸替换了内源性多核苷酸。可期望缺陷性多核苷酸还编码标志物，所述标志物可用于选择其中多核苷酸已被修饰的转化体。
可替代地，由于重组微生物在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶上具有缺陷而引起的修饰可通过已确定的反义技术使用具有与编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽的多核苷酸互补的多核苷酸的多核苷酸进行。更具体地，通过引入可在重组微生物中转录并且能够与重组微生物中产生的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mRNA杂交的具有与编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的多核苷酸的序列互补的序列的多核苷酸，可减少或消除重组微生物对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多核苷酸的表达。在允许互补反义多核苷酸与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mRNA杂交的条件下，所翻译的蛋白质的量因此减少或消除。表达反义RNA的示例在Appl.Environ.Microbiol.2000年2月；66(2):775-82.(Characterization of a foldase,protein disulfide isomerase A,in the protein secretory pathway of Aspergillusniger.Ngiam C、Jeenes DJ、Punt PJ、Van Den Hondel CA、Archer DB)或(Zrenner R、Willmitzer L、Sonnewald U.Analysis of the expression of potatouridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisenseRNA.Planta.(1993)；190(2):247-52)中示出。
此外，可通过RNA干扰(RNAi)技术获得丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽的修饰、下调或失活(FEMS Microb.Lett.237(2004):317-324)。在该方法中，将表达将受到影响的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码多核苷酸的相同有义和反义部分克隆在彼此后面且其间有核苷酸间隔子，并插入到表达载体中。在这样的分子转录后，小核苷酸片段的形成将导致mRNA的靶向降解，这将受到影响。特定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mRNA的消除可以达到不同程度。WO2008/053019、WO2005/05672A1、WO2005/026356A1、Oliveira等人,“Efficient cloningsystem for construction of gene silencing vectors in Aspergillus niger”(2008)Appl.Microbiol.and Biotechnol.80(5):917-924和/或Barnes等人,“siRNA as amolecular tool for use in Aspergillus niger”(2008)Biotechnology Letters 30(5):885-890中描述的RNA干扰技术可用于多核苷酸的下调、修饰或失活。
本申请涉及一种重组微生物。
如本文所公开的微生物可以是原核、古细菌或真核细胞。
原核细胞可以是但不限于细菌细胞。细菌细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的示例包括但不限于属于以下属的细菌：芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(B.puntis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus))、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、链霉菌属(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、伤寒杆菌(S.typhi))、鱼腥藻属(Anabaena)、柄杆菌属(Caulobactert)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、红细菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)(中华根瘤菌属(Sinorhizobium))、黄杆菌属(Flavobacterium)、克雷伯氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)。细菌还包括但不限于光合细菌(例如，绿色非硫细菌、绿色硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。
真核细胞可以是但不限于真菌(例如酵母或丝状真菌)、藻类、植物细胞、细胞系。
真核细胞可以是真菌，诸如丝状真菌或酵母。丝状真菌菌株包括但不限于以下各项的菌株：顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans))、伞菌属(Agaricus)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、被孢霉属(Mortierella)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)(例如产黄青霉(P.chrysogenum)、卡门培尔青霉(P.camemberti))、梨囊鞭菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、红孔菌属(Pycnoporus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、粪壳菌属(Sordaria)、踝节菌属(Talaromyces)、罗萨氏菌属(Rasamsonia)(例如埃默森罗萨氏菌(Rasamsoniaemersonii))、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
酵母细胞可选自以下属：酵母属(例如，酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡尔伯斯酵母(S.carlsbergensis))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)(例如，皱褶假丝酵母(C.rugosa)、拉考夫假丝酵母(C.revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)(例如，解脂耶氏酵母，以前分类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
细胞可以是藻类、微藻类或海洋真核生物。细胞可以是网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)细胞，优选地属于破囊壶菌目(Thraustochytriales)，更优选地属于破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，更优选地为选自由以下组成的组的属的成员：橙壶菌属(Aurantiochytrium)、狭长壶菌属(Oblongichytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)，甚至更优选地为裂殖壶菌属物种ATCC#20888。
在一个实施方式中，如本文所公开的重组细胞属于以下属中的一种：酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、腐质霉属、伊萨酵母属、丝孢酵母属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属、山田氏酵母属(Yamadazyma)或埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如酿酒酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞、克鲁斯假丝酵母细胞、东方伊萨酵母细胞或大肠杆菌细胞。
如本文所用，重组微生物定义为优选地用如本文其他地方所定义的一种或多种多核苷酸进行基因修饰或转化/转染的微生物。一种或多种此类多核苷酸的存在改变了微生物产生甜菊醇糖苷的能力。未转化/转染或基因修饰的微生物不是重组微生物，并且通常不包含使得微生物能够产生甜菊醇糖苷的一种或多种多核苷酸。因此，非转化/非转染的微生物通常是不天然产生甜菊醇糖苷的微生物，尽管天然产生甜菊醇糖苷并且已如本文所公开的那样进行修饰(并且因此具有改变的产生甜菊醇糖苷的能力)的微生物被视为如本文所公开的重组微生物。
序列同一性在本文定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较所述序列所确定的。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性或相似性。
序列的比较和两个序列之间的序列同一性百分比的确定可以使用数学算法完成。技术人员将意识到以下事实：若干不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison在D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编),Time warps,string edits and macromolecules:the theory andpractice of sequence comparison中,第1-44页Addison Wesley)。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本公开的目的，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276—277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所用的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将认识到，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比没有显著改变。
在通过如上所述的程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本公开的序列之间的序列同一性百分比计算如下：两个序列中在比对中显示相同氨基酸或相同核苷酸的相应位置的数量除以减去比对中的空位总数之后的比对总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中标记为“最长同一性(longest-identity)”。
本公开的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与本公开的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本公开的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
与所提及的多核苷酸具有至少约10％、约15％、约20％，诸如至少约25％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列同一性的多核苷酸可用于本文的实施方式中。
为了增加所引入的酶在如本文所公开的重组微生物中以活性形式表达的可能性，可调整相应的编码多核苷酸以优化其密码子使用频率以适应所选重组微生物的密码子使用频率。编码酶的多核苷酸对所选重组微生物的密码子使用频率的适应性可表示为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文定义为基因的密码子使用频率对高表达基因的密码子使用频率的相对适应性的量度。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用频率与相同氨基酸的丰度最大的密码子的使用频率的比率。CAI指数定义为这些相对适应性值的几何平均值。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0至1的范围内，值越高表示丰度最大的密码子的比例越高(参见Sharp和Li,1987,NucleicAcids Research15:1281-1295；另外参见：Jansen等人,2003,Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。适应的多核苷酸可具有至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7的CAI。
使用本领域技术人员众所周知的密码子对优化技术，用适应重组微生物的密码子使用频率的一种或多种多核苷酸对如本文所公开的重组微生物进行基因修饰。密码子对优化是一种用于在重组微生物中产生多肽的方法，其中编码多肽的多核苷酸已针对其密码子使用频率，特别是所使用的密码子对进行了修饰，以获得编码多肽的多核苷酸的改善表达和/或改善的多肽产生。密码子对定义为编码序列中的一组两个相继的三联体(密码子)。
如本文所公开的重组微生物的体内酶活性的进一步改善可以通过众所周知的方法如易错PCR或定向进化获得。在WO03010183和WO03010311中描述了定向进化的示例性方法。
如本文所用，术语“标志物”是指编码允许选择或筛选含有标志物的重组微生物的性状或表型的基因。标志物基因可以是抗生素抗性基因，由此可以使用适当的抗生素从未转化的细胞中选择转化的细胞。可替代地或另外，使用非抗生素抗性标志物，诸如营养缺陷型标志物(URA3、TRP1、LEU2)。用多核苷酸构建体转化的重组微生物可不含标志物基因。用于构建不含重组标志物基因的重组微生物的方法公开于EP-A-0 635 574中并且是基于双向标志物的使用。可替代地，可将可筛选标志物诸如绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶掺入如本文所公开的多核苷酸构建体中，从而允许筛选转化的细胞。用于引入异源多核苷酸的示例性无标志物方法描述于WO0540186中。
如本文所用，术语“可操作地连接的”是指处于功能关系的多核苷酸元件(包括例如编码序列或另一多核苷酸序列)的连接。当使多核苷酸与另一多核苷酸处于功能关系时，所述多核苷酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子序列或增强子序列影响编码序列的转录，那么所述启动子序列或增强子序列可操作地连接至编码序列。
如本文所用，术语“启动子”是指用于控制一种或多种基因的转录的多核苷酸片段，其相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的存在、转录起始位点和任何其他多核苷酸片段在结构上进行鉴定，包括但不限于转录因子结合位点、阻抑和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知直接或间接地用于调控来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。
术语“同源”当用于表示给定(重组)多核苷酸或多肽与给定宿主生物体或宿主细胞(诸如如本文所公开的重组微生物)之间的关系时，应理解为是指在自然界中多核苷酸或多肽分子是由相同物种(诸如相同品种或品系)的重组微生物宿主细胞或生物体产生的。
当关于多核苷酸(DNA或RNA)、多肽或蛋白质使用时，术语“异源的”是指不作为其所存在于其中的重组微生物生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA的一部分天然存在，或者与在自然界中所发现的相比，以不同的拷贝数或在不同细胞中或在基因组或DNA或RNA中的一个或多个不同的位置中存在的多核苷酸、多肽或蛋白质。异源多核苷酸、多肽或蛋白质对于其被引入的细胞而言不是内源性的，而是从另一个细胞获得或通过合成或重组方式产生的。
术语“源自”还包括术语“来源于”、“获自”、“可获自”、“分离自”和“由...产生”，并且通常指示一种指定材料在另一指定材料中找到其起源或者具有可以参照另一指定材料而描述的特征。如本文所用，“源自”微生物的物质(例如，核酸分子或多肽)优选表示该物质是所述微生物的天然物质。
具体实施方式
提供了一种重组微生物，其包含、优选地表达一种或多种编码一种或多种具有尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸，其中所述重组微生物在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽上具有缺陷。具体地，所述重组微生物在PSK1多肽和/或PSK2多肽上具有缺陷。更具体地，所述重组微生物在PSK1上具有缺陷。
重组微生物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷通常是其基因组修饰的结果。因此，本发明的重组微生物可在其基因组中包含导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷的基因修饰。具体地，所述重组微生物可在其基因组中包含导致PSK1和/或PSK2缺陷的基因修饰。更具体地，所述重组微生物可在其基因组中包含导致PSK1缺陷的基因修饰。
PSK1以及其旁系同源物PSK2被注释为参与控制糖代谢和翻译的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
在一些实施方式中，在如本文所公开的重组微生物中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(例如PSK1和/或PSK2)的产生缺陷是当在基本上相同的条件下进行分析时，与在所述PSK(例如PSK1和/或PSK2)上没有缺陷的相应微生物相比，产生减少至少20％，诸如至少30％，诸如至少40％，诸如至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如100％。
在一些实施方式中，在如本文所公开的重组微生物中，由编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PSK(例如PSK1和/或PSK2)的基因转录的mRNA的表达水平的缺陷是当在基本上相同的条件下进行分析时，与在所述PSK(例如PSK1和/或PSK2)上没有缺陷的相应微生物相比，表达减少至少20％，诸如至少30％，诸如至少40％，诸如至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如100％。
在一些实施方式中，在如本文所公开的重组微生物中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PSK(例如PSK1和/或PSK2)的活性缺陷是当在基本上相同的条件下进行分析时，与在所述PSK(例如PSK1和/或PSK2)上没有缺陷的相应微生物相比，活性减少至少20％，诸如至少30％，诸如至少40％，诸如至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如100％。
当在基本上相同的条件下进行分析时，与没有所述PSK缺陷的相应微生物相比，产生甜菊醇糖苷的微生物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，特别是PSK1和/或PSK2的缺陷导致更高的甜菊醇糖苷产量。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶缺陷，其中所述PSK包含与SEQ ID NO:26具有至少约30％序列同一性的多肽，或由其组成，诸如与具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的PSK多肽具有至少35％同一性，诸如至少40％同一性，诸如至少45％同一性，诸如至少50％同一性，诸如至少55％同一性，诸如至少60％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少75％同一性，诸如至少80％同一性，诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少91％同一性，诸如至少92％同一性，诸如至少93％同一性，诸如至少94％同一性，诸如至少95％同一性，诸如至少96％同一性，诸如至少97％同一性，诸如至少98％同一性，诸如至少99％同一性，或诸如100％序列同一性。
在一些实施方式中，缺陷是mRNA或编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶多肽的多核苷酸中的修饰的结果。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可包含、优选地表达：
(a)编码功能性UGT1多肽的多核苷酸，
(b)编码功能性UGT3多肽的多核苷酸，
(c)编码功能性UGT4多肽的多核苷酸，
(d)编码第一功能性UGT2多肽的多核苷酸，和/或
(e)编码第二功能性UGT2多肽的多核苷酸。
在一个实施方式中，第二功能性UGT2多肽具有对甜菊苷和/或甜叶悬钩子苷中的19-O-葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的能力；和/或当在相应条件下进行反应时，所述第二功能性UGT2多肽具有以比第一功能性UGT2多肽将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的速率更快的速率将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的能力；和/或当在相应条件下进行反应时，与所述第一功能性UGT2多肽相比，所述第二功能性UGT2多肽具有将更大量的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的能力。
在本文中，具有UGT活性的多肽被理解为具有糖基转移酶活性的多肽(EC 2.4)，即可以催化单糖单元从活化的核苷酸糖(也称为“糖基供体”)转移至糖基受体分子，通常是醇。UGT的糖基供体通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶二磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖)。
在一些实施方式中，具有UGT活性的多肽也可以理解为具有如本文所定义的糖基转移酶活性但能够使用除UDP-葡萄糖以外的糖基供体诸如NDP-葡萄糖(即核苷二磷酸葡萄糖)的多肽。在一些实施方式中，糖基供体是腺嘌呤二磷酸葡萄糖(ADP-葡萄糖)。能够使用NDP-葡萄糖作为糖基供体的工程化糖基转移酶的示例例如描述于WO2018/144675中，其通过引用整体并入本文。
所使用的UGT可经过选择，以便产生期望的甜菊醇糖苷，诸如莱鲍迪苷A、D或M。甜菊醇糖苷形成的示意图示出于Humphrey等人,Plant Molecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人,J.Plant Physiology 168(2011)1136-1141，以及Olsson等人,Microb.Cell Fact.(2016)15:207,DOI 10.1186/s12934-016-0609-1中。此外，图1示出甜菊醇糖苷形成的示意图。例如，在图1中，莱鲍迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化；或者具体地，莱鲍迪苷A可以通过形成13-O-甜菊醇单糖苷的甜菊醇的13-OH的葡糖基化、形成甜菊醇-1,2-双糖苷的甜菊醇单糖苷的13-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化、形成甜菊苷的甜菊醇-1,2-双糖苷的C-19羧基的葡糖基化，以及甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的葡糖基化形成。葡糖基化反应的发生顺序可以变化。UGT酶的非限制性示例在表1中示出。
在本文中，UGT1活性优选是将葡萄糖单元转移至甜菊醇主链的13-OH。因此，UGT1多肽能够在存在于所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-13羟基处对甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化，优选地其中糖基化是β-糖基化。
合适的UGT1多肽可用作，例如，尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶。
UGT1多肽还可催化利用除甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡糖苷之外的甜菊醇葡糖苷底物的葡糖基转移酶反应，只要该底物具有在甜菊醇部分的C13处具有游离羟基的甜菊醇主链即可。
UGT1的示例性非限制性反应包括：
-将甜菊醇和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-13-O-葡糖苷，以及
-将甜菊醇-19-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜叶悬钩子苷。
因此，在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-13-O-葡糖苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇-19-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜叶悬钩子苷。可以在根据本公开的重组微生物中使用的UGT1多肽的非限制性示例例如在与本文一起的SEQ ID NO:151、152、153中、在WO2014/191581A2的SEQ ID NO:72中、或与WO2011/153378A1的SEQ ID NO:3相对应的多肽UGT85C、或具有和与本文一起的SEQ ID NO:151、152、153、WO2014/191581A2的SEQ IDNO:72、或WO2011/153378A1的SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽中给出。
在本文中，UGT2活性优选是将葡萄糖单元转移至通过糖苷键连接至甜菊醇糖苷的C13-羟基或C19-羟基或两者的葡萄糖的C-2’位置。因此，具有UGT2活性的多肽是能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化的多肽。
合适的UGT2多肽可用作，例如，尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷C-2’葡糖基转移酶和尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜叶悬钩子苷C-2’葡糖基转移酶。UGT2多肽还可催化利用除甜菊醇-13-O-葡糖苷和甜叶悬钩子苷之外的甜菊醇葡糖苷底物的葡糖基转移酶反应，只要该底物具有甜菊醇主链即可。
UGT2多肽的示例性非限制性反应是：
-将甜菊醇13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-1,2-双糖苷，
-将甜叶悬钩子苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊苷，
-将甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷E，
-将莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷D。
因此，在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-1,2-双糖苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜叶悬钩子苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷E。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷D。可以用于根据本公开的重组微生物中的UGT2多肽的非限制性示例是例如与本文一起的SEQ IDNO:160、161、162、163、164、165、166或167中的那些、根据WO2014/191581A2的SEQ ID NO:88的UGT2_1a多肽、根据WO2011/153378A1的SEQ ID NO:5的UGT91D2多肽或根据WO2013/022989A2的SEQ ID NO:152的EUGT11多肽、根据WO2016/151046A1的SEQ ID NO:1、2、3、4的多肽、根据WO2016/146711A1的SEQ ID NO:1、3、6、9、11、14、17、20、22、25的多肽。可替代地，所述UGT2多肽可具有分别和与本文一起的SEQ ID NO:160、161、162、163、164、165、166或167、WO2014/191581A2的SEQ ID NO:88、WO2011/153378A1的SEQ ID NO:5、WO2013/022989A2的SEQ ID NO:152、WO2016/151046A1的SEQ ID NO:1、2、3、4、WO2016/146711A1的SEQ ID NO:1、3、6、9、11、14、17、20、22、25的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在本文中，UGT3活性优选是将葡萄糖单元转移至甜菊醇主链的19-COOH。因此，具有UGT3活性的多肽是能够在存在于所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-19羧基处对甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化的多肽，优选地其中糖基化是β-糖基化。
合适的UGT3多肽可用作，例如，尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷19-COOH转移酶。
UGT3多肽还可催化利用除甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡糖苷之外的甜菊醇葡糖苷底物的葡糖基转移酶反应，只要该底物具有甜菊醇主链即可。
UGT3的示例性非限制性反应包括：
-将甜菊醇和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-19-O-葡糖苷，
-将甜菊醇-13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜叶悬钩子苷，
-将甜菊醇-1,3-双糖苷和UDP-葡萄糖转化为1,3-甜菊苷(莱鲍迪苷G)，
-将甜菊醇-1,2-双糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊苷，以及
-将莱鲍迪苷B和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷A。
因此，在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇-19-O-葡糖苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇-13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜叶悬钩子苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇-1,3-双糖苷和UDP-葡萄糖转化为1,3-甜菊苷(甜叶悬钩子苷G)。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇-1,2-双糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将莱鲍迪苷B和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷A。可以用于根据本公开的重组微生物中的UGT3多肽的非限制性示例是例如根据与本文一起的SEQ ID NO:177、178、179、180、181或182的多肽、WO2014/191581A2的SEQ ID NO:74、根据WO2014/122227A2的SEQ ID NO:19的UGT74G1多肽、或根据WO2019/002264A1的SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18或20的多肽。可替代地，所述UGT3多肽可具有分别和与本文一起的SEQ ID NO:177、178、179、180、181或182、WO2014/191581A2的SEQ ID NO:74、WO2014/122227A2的SEQ ID NO:19、WO2019/002264A1的SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在本文中，UGT4活性优选是将葡萄糖单元转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH位置处的葡萄糖的C-3’位置。UGT4多肽能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1,3糖基化。合适的UGT4多肽可用作，例如，尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇13-O-葡糖苷C-3’葡糖基转移酶和尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇1,2双糖苷C-3’葡糖基转移酶。UGT4多肽还可催化利用除甜菊醇糖苷和甜菊醇二糖苷之外的甜菊醇葡糖苷底物的葡糖基转移酶反应，只要该底物具有甜菊醇主链即可。
UGT4的示例性非限制性反应包括：
-将甜菊醇-13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇1,3双糖苷，
-将甜菊醇1,2双糖苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷B，
-将甜叶悬钩子苷和UDP-葡萄糖转化为1,3甜菊苷，
-将1,3甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷Q，
-将甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷A，
-将莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷I，
-将莱鲍迪苷E和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷D，以及
-将莱鲍迪苷D和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷M。
因此，在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇-13-O-葡糖苷和UDP-葡萄糖转化为甜菊醇1,3双糖苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊醇1,2双糖苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷B。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜叶悬钩子苷和UDP-葡萄糖转化为1,3甜菊苷。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将1,3甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷Q。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将甜菊苷和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷A。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷I。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将莱鲍迪苷E和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷D。在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以能够将莱鲍迪苷D和UDP-葡萄糖转化为莱鲍迪苷M。可以用于根据本公开的重组微生物中的UGT4多肽的非限制性示例为例如，根据与本文一起的SEQ ID NO:195、196或197的多肽、WO2014/191581A2的SEQ ID NO:50、52、根据WO2011/153378A1的SEQ ID NO:7的UGT76G多肽。可替代地，所述UGT多肽可具有分别和与本文一起的SEQ ID NO:195、196或197、WO2014/191581A2的SEQ ID NO:50、52、WO2011/153378A1的SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可包含、优选地表达：
(a)编码UGT1多肽的多核苷酸，其中所述UGT1多肽能够在存在于所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-13羟基处对甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行β糖基化，优选地UGT1多肽具有至少尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和/或尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶活性，诸如UGT85C2多肽；
(b)编码UGT3多肽的多核苷酸，其中所述UGT3多肽能够在存在于所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-19羧基处对甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行β糖基化，优选地UGT3多肽具有至少尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和/或尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷19-COOH转移酶活性，诸如UGT74G1多肽；
(c)编码UGT4多肽的多核苷酸，其催化19-O位置和/或13-O位置处的甜菊醇和甜菊醇糖苷的至少糖基化，诸如UGT76G1多肽，
(d)编码第一UGT2多肽的多核苷酸，其中所述UGT2多肽能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化，优选地UGT2多肽具有至少尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶活性，诸如UGT91d2多肽，和/或
(e)编码第二UGT2多肽的多核苷酸，其中当在相应条件下进行反应时，所述第二UGT2多肽具有以比第一功能性UGT2多肽将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的速率更快的速率将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的能力；和/或当在相应条件下进行反应时，与所述第一功能性UGT2多肽相比，所述第二功能性UGT2多肽具有将更大量的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的能力，优选EUGT11多肽；
其中微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D，和/或莱鲍迪苷M。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物能够表达、优选地表达编码UGT1多肽的多核苷酸，其选自由以下组成的组：
i.编码包含与SEQ ID NO:151、152或153的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
ii.与SEQ ID NO:154、155、156、157、158、159、36的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物能够表达、优选地表达编码UGT2多肽的多核苷酸，其选自由以下组成的组：
i.编码包含与SEQ ID NO:160、161、162、163、164、165、166或167的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
ii.与SEQ ID NO:166、169、170、171、172、173、174、175、176或37的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物能够表达、优选地表达编码UGT3多肽的多核苷酸，其选自由以下组成的组：
i.编码包含与SEQ ID NO:177、178、179、180、181或182的氨基酸序列具有至少约20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
ii.与SEQ ID NO:183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194或38的多核苷酸具有至少约15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物能够表达、优选地表达编码UGT4多肽的多核苷酸，其选自由以下组成的组：
i.编码包含与SEQ ID NO:195、196或197的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
ii.与SEQ ID NO:38、199、200、201、202、203或39的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
如果如本文所公开的重组微生物不能产生甜菊醇作为本文公开的甜菊醇糖苷的中间产物，则需要一种或多种酶由香叶基-香叶基焦磷酸(GGPP)产生甜菊醇。
因此，在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达：
(f)编码香叶基-香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的多核苷酸，
(g)编码对映柯巴基焦磷酸合酶(CDPS)的多核苷酸，
(h)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的多核苷酸，
(i)编码贝壳杉烯合酶(KS)的多核苷酸，和/或
(j)编码贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)的多核苷酸；
其中微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D，和/或莱鲍迪苷M。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码香叶基-香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的多核苷酸。此类GGPPS可以是本领域技术人员已知的任何合适的GGPPS，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码GGPPS的多核苷酸可包括：
i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:208；WO2011/53378A1的SEQ ID No:121-128，或WO2016/170045A1的SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
ii.与SEQ ID NO:209的多核苷酸具有至少约15％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码对映柯巴基焦磷酸合酶(CDPS)的多核苷酸。此类CDPS可以是本领域技术人员已知的任何合适的CDPS，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码CDPS的多核苷酸可包括：
i.编码具有对映柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67或68或WO2011/53378A1的SEQ ID No:129-131、WO2013/022989A2的SEQ ID No:158、160的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、29或85的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
示例性的对映柯巴基焦磷酸合酶是由SEQ ID NO:29所示的多核苷酸编码的多肽。
在本文中，具有对映柯巴基焦磷酸合酶(EC 5.5.1.13)的多肽被理解为能够催化以下化学反应：
该酶具有一种底物，即香叶基香叶基焦磷酸，和一种产物，即对映柯巴基焦磷酸。这种酶参与赤霉素的生物合成。这种酶属于异构酶家族，特别是分子内裂解酶类。这类酶的系统名称是对映柯巴基二磷酸裂解酶(去环化)。其他常用名称包括对映柯巴基焦磷酸合酶、对映贝壳杉烯合酶A和对映贝壳杉烯合成酶A。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的多核苷酸。此类KO可以是本领域技术人员已知的任何合适的KO，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码KO的多核苷酸可包括：
i.编码具有对映贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:111、112、113、114或115或WO2011/53378 A1的SEQ ID No:138-141的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或32的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
示例性的对映贝壳杉烯氧化酶是由SEQ ID NO:120所示的多核苷酸编码的多肽。
在本文中，具有对映贝壳杉烯氧化酶活性的多肽(EC 1.14.13.78)被理解为能够催化对映贝壳杉烯的4-甲基连续三次氧化以得到贝壳杉烯酸的多肽。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码贝壳杉烯合酶(KS)的多核苷酸。此类KS可以是本领域技术人员已知的任何合适的KS，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码KS的多核苷酸可包括：
i.编码具有对映贝壳杉烯合酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:86、87、88、89、90、91、92或93或WO2011/153378A1的SEQ ID No:132-135、WO2013/022989A2的SEQ ID No:156的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、30或110的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
示例性的对映贝壳杉烯合酶是由SEQ ID NO:30所示的多核苷酸编码的多肽。
在本文中，具有对映贝壳杉烯合酶活性的多肽(EC 4.2.3.19)被理解为能够催化以下化学反应的多肽：
因此，该酶具有一种底物，即对映柯巴基二磷酸，和两种产物，即对映贝壳杉烯和二磷酸。
这种酶属于裂解酶家族，特别是作用于磷酸的那些碳-氧裂解酶。这类酶的系统名称是对映柯巴基二磷酸二磷酸裂解酶(环化，形成对映贝壳杉烯)。其他常用名称包括对映贝壳杉烯合酶B、对映贝壳杉烯合成酶B、对映柯巴基二磷酸二磷酸裂解酶和(环化)。这种酶参与二萜类的生物合成。
对映柯巴基二磷酸合酶也可具有与相同蛋白质相关的不同对映贝壳杉烯合酶活性。对映贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径的下一步。两种类型的酶促活性是不同的，并且用以抑制蛋白质的对映贝壳杉烯合酶活性的定点诱变导致对映柯巴基焦磷酸的积累。
因此，在本文的实施方式中，单个多核苷酸可编码具有对映柯巴基焦磷酸合酶活性和对映贝壳杉烯合酶活性的多肽。可替代地，这两种活性可编码两种不同的、独立的多核苷酸。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)的多核苷酸。此类KAH可以是本领域技术人员已知的任何合适的KAH，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码KAH的多核苷酸可包括：
i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:126、127、128、129、130、131、132、133、134或135、WO2011/153378A1的SEQ ID NO:142-146、WO2013/022989A2的SEQ ID NO:164或WO2017/060318A2的SEQ ID NO:1、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或WO2018/104238A1的SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150或33的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
示例性KAH是由SEQ ID NO:139所示的多核苷酸编码的多肽。
在本文中，具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽(EC 1.14.13)将被理解为能够使用NADPH和O2催化甜菊醇(对映贝壳杉-16-烯-13-醇-19-酸)形成的多肽。这种活性也可称为对映贝壳杉烯酸13-羟化酶活性。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可另外包含、优选地表达编码细胞色素P450还原酶(CPR)的多核苷酸。此类CPR可以是本领域技术人员已知的任何合适的CPR，诸如NADPH-细胞色素p450还原酶，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码CPR的多核苷酸可包括：
i.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:211、213、215或217或WO2011/153378A1的SEQ ID No:147-149的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:35、210、212、214或216的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
示例性CPR是由SEQ ID NO:35所示的多核苷酸编码的多肽。
在本文中，具有NADPH-细胞色素P450还原酶活性的多肽(EC 1.6.2.4；也称为NADPH:高铁血红蛋白氧化还原酶、NADPH:血红蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450还原酶、POR、CPR、CYPOR)通常是作为膜结合酶的多肽，其允许电子从含有FAD和FMN的酶NADPH:细胞色素P450还原酶(POR；EC 1.6.2.4)转移至真核细胞微粒体中的细胞色素P450。
在一些实施方式中，在如本文所公开的重组微生物中，产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力可上调。在一些这样的实施方式中，重组微生物可包含、优选地表达一种或多种编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的多核苷酸，由此一种或多种多核苷酸的表达赋予重组微生物产生升高水平的GGPP的能力。
此类羟甲基戊二酰辅酶A还原酶可以是本领域技术人员已知的任何合适的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的多核苷酸可包括：
i.编码具有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO:204或WO2011/152278A1的SEQ ID NO:104、106、108、110、112、114、116、118、120的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:205的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
示例性的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶是由SEQ ID NO:205所示的多核苷酸编码的多肽。
此类法尼基焦磷酸合成酶可以是本领域技术人员已知的任何合适的法尼基焦磷酸合成酶，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码法尼基焦磷酸合成酶的多核苷酸可包括：
i.编码具有法尼基焦磷酸合成酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含和与本文一起的SEQ ID NO:206的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:207的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(iii)的多核苷酸的序列不同的多核苷酸。
示例性的法尼基焦磷酸合成酶是由SEQ ID NO:207所示的多核苷酸编码的多肽。
此类香叶基香叶基二磷酸合酶可以是本领域技术人员已知的任何合适的香叶基香叶基二磷酸合酶，并且可以例如来自原核或真核来源。这种编码香叶基香叶基二磷酸合酶的多核苷酸可包括：
i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO:208的氨基酸序列具有至少约20％，诸如至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
ii.与SEQ ID NO:209的多核苷酸具有至少约15％，诸如至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸；
iii.与(i)或(ii)的多核苷酸杂交的互补链的多核苷酸；或
iv.由于遗传密码的简并性而与(i)、(ii)或(iii)的多核苷酸不同的多核苷酸。
示例性的香叶基香叶基二磷酸合酶是由SEQ ID NO:209所示的多核苷酸编码的多肽。
如本文所公开的示例性重组微生物是酵母，诸如酿酒酵母或解脂耶氏酵母。如本文所公开的重组微生物，诸如重组酿酒酵母细胞或解脂耶氏酵母细胞，可包含来自下组中的每一个的一种或多种多核苷酸：
(i)SEQ ID NO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、80、81、82、83、84、29或110；
(ii)SEQ ID NO:94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、30或110；
(iii)SEQ ID NO:116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或32；或
(iv)SEQ ID NO:136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150或33。
此类重组微生物通常还将包含如SEQ ID NO:35、210、212、214或216中所示的一种或多种多核苷酸。
此类重组微生物还可包含如SEQ ID NO:154、155、183、184、185、186、187、38、199、156、188、200、158、159、190、191、192、193、194、202、203、157、189、201、168、176、169、161、170、162、171、163、172、164、173、165、174、166、175、167、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、36、247、39或37中所示的一种或多种多核苷酸。在这些多核苷酸的情况下，可使用来自(i)SEQ ID NO:154、155、158、159、156、157或36；(ii)SEQ ID NO:168、169、170、171、172、173、174、175、176或37；(iii)SEQ ID NO:183、184、185、186、187、190、191、192、193、194、188、189或38；以及(iv)SEQ ID NO:38、199、202、203、200、201或39中的每一个的至少一个的组合。通常，可使用来自组(i)的至少一个UGT。如果使用来自组(iii)的至少一个UGT，通常也使用来自组(i)的至少一个UGT。如果使用来自组(iv)的至少一个UGT，通常使用来自组(i)的至少一个UGT和来自组(iii)的至少一个UGT。通常，使用来自组(ii)的至少一个UGT。
这样的重组微生物还可包含以下多核苷酸：SEQ ID.NO:205；SEQ ID.NO:207；以及SEQ ID.NO:209。
如本文所公开的重组生物体可以是如一般定义部分和本文其他地方中所指定的任何微生物。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物属于以下属中的一种：酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、腐质霉属、丝孢酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、山田氏酵母属或埃希氏杆菌属。
在一些此类实施方式中，重组微生物可以是酿酒酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞或大肠杆菌细胞。
可对如本文所公开的重组微生物进行修饰，使得ERG9基因下调和或ERG5/ERG6基因缺失。相应的基因可在其他微生物中以这种方式修饰。
可如本文所述转化此类重组微生物，由此用来转化重组微生物的多核苷酸赋予重组微生物产生二萜或其糖苷的能力。
可将编码UGT、对映柯巴基焦磷酸合酶、对映贝壳杉烯合酶、对映贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和/或细胞色素p450还原酶的多核苷酸连接到一种或多种多核苷酸构建体中以促进如本文所公开的重组微生物的转化。
多核苷酸构建体可以是携带编码如本文所公开的甜菊醇糖苷途径的酶的基因的质粒，或者多核苷酸构建体可包含各自携带以任何适当的方式分布的三种或两种分别编码甜菊醇糖苷途径的酶的基因的两种或三种质粒。
可使用任何合适的质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。
可能的是，选自由UGT、对映柯巴基焦磷酸合酶、对映贝壳杉烯合酶、对映贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶组成的组的酶对于重组微生物而言是天然的，并且可能不需要用编码这些酶的一种或多种多核苷酸进行转化来赋予重组微生物产生甜菊醇糖苷的能力。重组微生物的甜菊醇糖苷生产的进一步改善可通过经典菌株改善获得。
多核苷酸构建体可保持为附加型实体，并且因此包含用于自主复制的序列，诸如常染色体复制序列。如果重组微生物是真菌来源的，则合适的附加型多核苷酸构建体可以例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等人,1991,Biotechnology 9:968-975)或AMA质粒(Fierro等人,1995,Curr.Genet.29:482-489)。
可替代地，每个多核苷酸构建体可以一个或多个拷贝整合到重组微生物的基因组中。整合到重组微生物的基因组中可通过非同源重组随机发生，或者多核苷酸构建体可通过如本领域众所周知的同源重组整合到重组微生物的基因组中(参见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186)。
任选地，选择性标志物可存在于多核苷酸构建体中。
在一些实施方式中，编码UGT、对映柯巴基焦磷酸合酶、对映贝壳杉烯合酶、对映贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和/或NADPH-细胞色素p450还原酶的多核苷酸各自可操作地连接至启动子，所述启动子导致相应多核苷酸在如本文所公开的重组微生物中充分表达，以赋予细胞产生甜菊醇糖苷的能力。
可以用于实现编码如上文所定义的酶的多核苷酸的表达的启动子对于编码待表达的酶的多核苷酸而言可以不是天然的，即对于与其可操作地连接的多核苷酸(编码序列)是异源的启动子。在一些实施方式中，启动子是同源的，即对于重组微生物而言是内源性的。
如本文所公开的微生物中的合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL 1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其他合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。
在重组微生物中具有功能的任何终止子均可在本文使用。示例性终止子获自重组微生物的天然基因。合适的终止子序列是本领域众所周知的。在一些实施方式中，将此类终止子与防止如本文所公开的重组微生物中发生无义介导的mRNA衰变的突变组合(参见例如：Shirley等人,2002,Genetics 161:1465-1482)。
本文所用的多核苷酸可包括将它们靶向微生物的期望区室的多核苷酸片段。例如，在如本文所公开的示例性重组微生物中，除了对映贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶和NADPH-细胞色素p450还原酶编码序列之外的所有多核苷酸都可靶向胞质溶胶。当重组微生物是酵母细胞时可便利地使用该方法。
通常，如本文所公开的重组微生物将包含异源多核苷酸。可替代地，如本文所公开的重组微生物可包含完全同源的多核苷酸、多肽或蛋白质，其已如本文所述进行修饰，使得与相同微生物的未修饰型式相比，重组微生物产生增加量的甜菊醇糖苷。
如本文所述的甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶可被过表达以通过重组微生物实现足够的甜菊醇糖苷产生。
本领域有多种手段可用于在如本文所公开的重组微生物中过表达酶。具体地，可通过增加重组微生物中编码酶的基因的拷贝数来过表达酶，例如，通过将另外的基因拷贝整合到重组微生物的基因组中。
如本文所公开的示例性重组微生物可以是天然能够产生GGPP的重组细胞。
如本文所公开的重组微生物可以能够在本领域已知的任何合适的碳源上生长并将其转化为甜菊醇糖苷。重组微生物可以能够直接转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，示例性的宿主生物体表达酶，诸如将纤维素转化为葡萄糖单体和将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体所必需的纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)、能够将果胶转化为葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化为葡萄糖单体的淀粉酶。在一些实施方式中，重组微生物能够转化选自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油组成的组的碳源。重组微生物可以例如是如WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO06096130或WO04/099381中所述的真核宿主细胞。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物具有改善的产生甜菊醇糖苷的能力，尤其是高度糖基化的甜菊醇糖苷，诸如莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D。这种改善的能力可以通过评估以下各项来测量：
(a)由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的摩尔浓度，
(b)由如本文所公开的重组微生物从碳源(例如葡萄糖)产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的产率，
(c)由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的摩尔浓度与由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷(即“总甜菊醇糖苷”)的摩尔浓度的比率，和/或
(d)由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷(即具有低糖基化水平的甜菊醇糖苷或“小甜菊醇糖苷”)的摩尔浓度与由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷(即“总甜菊醇糖苷”)的摩尔浓度的比率，并且
当在基本上相同的条件下进行分析时，将上述值(a)、(b)、(c)和/或(d)与在PSK上没有缺陷的相应微生物的值进行比较。
在本公开的上下文中，当提及甜菊醇糖苷时，措词“由重组微生物产生”是指在打开细胞以释放细胞内含物并且任选地去除未溶解的细胞材料诸如细胞壁之后存在于发酵肉汤中的甜菊醇糖苷。
在本公开的上下文中，“在基本上相同的条件下进行分析”或“在基本上相同的条件下进行测量”是指将如本文所公开的重组微生物和在PSK多肽上没有缺陷的相应微生物在相同条件下培养，并且由所述微生物产生的甜菊醇糖苷的量(浓度)使用相同的条件进行测量，优选地通过使用相同的测定和/或方法，更优选地在同一实验中。
在本公开的上下文中，措词“总甜菊醇糖苷”(或“总SG”)是指莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的总和。在一个实施方式中，总甜菊醇糖苷的摩尔浓度是指莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度之和。
在本公开的上下文中，措词“小甜菊醇糖苷”(或“小SG”)是指莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的总和。在一个实施方式中，“小甜菊醇糖苷”的摩尔浓度是指莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度之和。
由如本文所公开的重组微生物或在PSK上没有缺陷的相应微生物产生的甜菊醇糖苷的浓度(例如摩尔浓度)可根据实施例中描述的方案进行测量。
在一些实施方式中，当在基本上相同的条件下进行分析时，由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的摩尔浓度比针对在PSK多肽上没有缺陷的相应微生物所评估的摩尔浓度高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％、500％、1000％。
在一些实施方式中，当在基本上相同的条件下进行分析时，由如本文所公开的重组微生物从碳源(例如葡萄糖)产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的产率比针对在PSK多肽上没有缺陷的相应微生物所评估的产率高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％、500％、1000％。
在一些实施方式中，当在基本上相同的条件下进行分析时，由如本文所公开的重组微生物产生的莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的摩尔浓度与由如本文所公开的重组微生物产生的总甜菊醇糖苷的摩尔浓度的比率比针对在PSK多肽上没有缺陷的相应微生物所评估的比率高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％、500％、1000％。
在一些实施方式中，当在基本上相同的条件下进行分析时，由如本文所公开的重组微生物产生的小甜菊醇糖苷的摩尔浓度与由如本文所公开的重组微生物产生的总甜菊醇糖苷的摩尔浓度的比率比针对在PSK多肽上没有缺陷的相应微生物所评估的比率低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。
如本文所公开的重组微生物可以便利地用于生产如本文所公开的甜菊醇糖苷。
提供了一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括在有益于产生甜菊醇糖苷的条件下培养如本文所公开的重组微生物，以及任选地回收甜菊醇糖苷。
术语培养在本文与发酵可互换使用。
在一些实施方式中，用于生产甜菊醇糖苷的方法中使用的培养基可以是允许培养本文公开的特定重组微生物的任何合适的培养基。培养基的基本成分是本领域技术人员已知的并且可适于所选的重组微生物。
在一些实施方式中，培养基包含选自由植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油组成的组的碳源。在一些实施方式中，培养基还包含氮源诸如尿素，或铵盐诸如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵。
在一些实施方式中，如本文所公开的培养过程或发酵过程可以分批、分批补料或连续模式进行。也可应用分开的水解和发酵(SHF)过程或同步糖化和发酵(SSF)过程。这些发酵过程模式的组合对于最佳生产率也是可能的。如果在发酵过程中使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源，则SSF过程可能特别有吸引力，其中可能需要添加水解酶，诸如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶来水解底物。
在一些实施方式中，在用于制备甜菊醇糖苷的方法中使用的重组微生物可以是如本文所定义的任何合适的重组微生物。在用于生产甜菊醇糖苷的方法中使用如本文所公开的重组真核微生物可以是有利的，因为大多数真核细胞不需要无菌条件来增殖并且对噬菌体感染不敏感。此外，真核宿主细胞可在低pH下生长以防止细菌污染。
在一些实施方式中，如本文所公开的重组微生物可以是兼性厌氧微生物。兼性厌氧重组微生物可以需氧增殖至高细胞浓度。然后可以在高细胞密度下进行该厌氧阶段，这大大减少了所需要的发酵体积，并且可使需氧微生物的污染风险降至最低。
在一些实施方式中，如本文所公开的用于生产甜菊醇糖苷的发酵过程可以是需氧或厌氧发酵过程。
厌氧发酵过程在本文中可定义为在不存在氧或基本上不消耗氧(诸如小于5、2.5或1mmol/L/h)的情况下进行的发酵过程，并且其中有机分子既充当电子供体，又充当电子受体。如本文所公开的发酵过程也可首先在需氧条件下进行并且随后在厌氧条件下进行。
在一些实施方式中，发酵过程也可在限氧或微需氧条件下进行。可替代地，发酵过程可首先在需氧条件下进行，并且随后在限氧条件下进行。限氧发酵过程是其中氧消耗受到从气体转移到液体的氧的限制的过程。氧限制的程度取决于进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性。
在一些实施方式中，如本文所公开的方法中的甜菊醇糖苷的产生可发生在重组微生物的生长阶段期间、静止(稳态)阶段期间或两个阶段期间。可以在不同温度下进行发酵过程。
在一些实施方式中，用于生产甜菊醇糖苷的方法可在对重组微生物最佳的温度下进行。每种重组微生物的最佳生长温度可以不同并且是本领域技术人员已知的。最佳温度可能高于野生型生物体的最佳温度，以使重组微生物在非无菌条件下以最低感染敏感性和最低冷却成本有效生长。可替代地，该方法可在对于重组微生物的生长不是最佳的温度下进行。事实上，我们已经表明，可在重组微生物的次佳生长温度下有益地进行用于制备甜菊醇糖苷的方法。
在一些实施方式中，甜菊醇糖苷的回收可使用本领域技术人员已知的任何手段进行。
在一些实施方式中，用于生产甜菊醇糖苷的方法中培养重组微生物的温度可高于20℃、22℃、25℃、28℃、或高于30℃、35℃、或高于37℃、40℃、42℃，并且可低于45℃。然而，在甜菊醇糖苷的生产阶段期间，最佳温度可能低于平均值，以优化生物质稳定性。此阶段的温度可低于45℃，诸如低于42℃、40℃、37℃，诸如低于35℃、30℃、或低于28℃、25℃、22℃或低于20℃但高于15℃。
在一些实施方式中，培养在约29℃或更低、约28℃或更低、约27℃或更低、或约26℃或更低的温度下进行。
在一些实施方式中，发酵培养基中的pH可具有低于8，诸如低于7.5、低于7，诸如低于7.5、低于6，诸如低于5.5，诸如低于5，诸如低于4.5，诸如低于4，诸如低于pH 3.5或低于pH 3.0，或低于pH 2.5但高于pH 2的值。在低pH值下进行发酵的优点是可防止发酵培养基中的污染细菌生长。
在一些实施方式中，如本文所公开的方法在工业规模上进行。
在一些实施方式中，如本文所公开的方法的产物是甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选地莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷Q和/或莱鲍迪苷I中的一种或多种。在一些实施方式中，产生莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。
在如本文所公开的用于生产甜菊醇糖苷的方法中，可以实现高于5mg/l发酵肉汤的浓度，诸如高于10mg/l，诸如高于20mg/l，诸如高于30mg/l发酵肉汤，诸如高于40mg/l，诸如高于50mg/l，诸如高于60mg/l，诸如高于70，诸如高于80mg/l，诸如高于100mg/l，诸如高于1g/l，诸如高于5g/l，诸如高于10g/l，诸如高于20g/l，诸如高于30g/l，诸如高于40g/l，诸如高于50g/l，但通常低于100g/l。
如本文所公开的重组微生物可以便利地用于通过将甜菊醇或甜菊醇糖苷生物转化为另一种甜菊醇糖苷来生产甜菊醇糖苷。
因此，提供了一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，包括植物来源的甜菊醇或合成甜菊醇或植物来源的甜菊醇糖苷或合成甜菊醇糖苷的生物转化，包括使植物来源的或合成的甜菊醇或甜菊醇糖苷与如本文所公开的重组微生物、此类重组微生物的提取物、包含此类重组微生物的发酵肉汤或此类重组微生物的培养物的上清液接触，以及任选地回收甜菊醇糖苷。
还提供了一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括使甜菊醇或甜菊醇糖苷与根据本发明的重组微生物、包含此类重组微生物的发酵肉汤接触，以及任选地回收甜菊醇糖苷。
在一些实施方式中，(生物转化)过程是全细胞生物转化过程。在一些实施方式中，生物转化是体外生物转化。
在如本文所公开的生物转化过程的一些实施方式中：
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇转化为甜菊醇-13-O-葡糖苷，
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇-19-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇转化为甜菊醇-19-O-葡糖苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-13-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-1,3-双糖苷转化为1,3-甜菊苷(莱鲍迪苷G)，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为1,2-甜菊苷(也表示为甜菊苷)，
-通过UGT3，优选UGT74G1将莱鲍迪苷B转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将甜菊醇-13-O-葡糖苷转化为甜菊醇1,3-双糖苷，
-通过UGT4，优选UGT76G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为莱鲍迪苷B，
-通过UGT4，优选UGT76G1将甜叶悬钩子苷转化为1,3-甜菊苷，
-通过UGT4，优选UGT76G1将1,3-甜菊苷转化为莱鲍迪苷Q，
-通过UGT4，优选UGT76G1将1,2-甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷E转化为莱鲍迪苷D，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜菊醇13-O-葡糖苷转化为甜菊醇-1,2-双糖苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜叶悬钩子苷转化为1,2-甜菊苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e和/或EUGT11将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E，和/或
-通过UGT2，优选EUGT11将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。在这些实施方式中，酶可以是上文公开的那些。
在一些实施方式中，如本文所公开的方法在工业规模上进行。
还提供了一种包含通过如本文所公开的方法可获得的甜菊醇糖苷的培养肉汤或生物转化混合物。
还提供了一种通过如本文所公开的方法可获得或获得的甜菊醇糖苷。通过如本文所公开的方法生产的甜菊醇糖苷，诸如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷M，可用于此类化合物的任何已知应用。具体地，它们可例如用作甜味剂，诸如在食品或饮料中。例如，甜菊醇糖苷可配制在软饮品中、作为餐桌甜味剂、口香糖、乳制品诸如酸奶(例如原味酸奶)、蛋糕、谷类或基于谷类的食品、营养食品、药品、可食用凝胶、糖果产品、化妆品、牙膏或其他口腔组合物等。此外，甜菊醇糖苷不仅可以用作饮料、食品和专供人类消费的其他产品的甜味剂，而且还可以用于具有改善特征的动物饲料和草料中。因此还提供了包含所述甜菊醇糖苷，特别是莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M的此类食品、饲料或饮料。在食品、饮料、药品、化妆品、餐桌用品(table-top product)、口香糖的制造过程中，可以使用诸如混合、揉捏、溶解、腌制、渗透、渗滤、喷洒、雾化、浸渍以及其他方法的常规方法。
如本文所公开获得的甜菊醇糖苷可以以干燥或液体形式使用。它可以在食物产品的热处理之前或之后添加。甜味剂的量取决于使用目的。它可以单独添加或与其他化合物组合添加。
根据如本文所公开的方法生产的化合物可与一种或多种另外的无热量或有热量的甜味剂共混。这种共混可用于改善风味或时间曲线或稳定性。范围广泛的无热量和有热量的甜味剂可适合与甜菊醇糖苷共混。例如，诸如罗汉果苷、莫纳甜(monatin)、阿斯巴甜、乙酰磺胺酸盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、糖精盐或赤藓糖醇的无热量甜味剂。适合与甜菊醇糖苷共混的有热量甜味剂包括糖醇和碳水化合物，诸如蔗糖、葡萄糖、果糖和HFCS。也可使用甜味氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
甜菊醇糖苷可以与甜味剂抑制剂诸如天然甜味剂抑制剂组合使用。它可与鲜味增强剂诸如氨基酸或其盐组合。
甜菊醇糖苷可以与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(诸如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)、多元醇、益生元、益生菌、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或基于健康益处(诸如心血管、降胆固醇或抗炎)分类的物质组合。
包含甜菊醇糖苷的组合物可包含调味剂、芳香组分、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味化合物、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂化合物、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或盐。
如本文所公开的甜菊醇糖苷可应用为高强度甜味剂以生产具有改善的口味特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病饮料和食品。此外，它还可以用于不可使用糖的饮品、食品、药品和其他产品中。
此外，如本文所公开的甜菊醇糖苷不仅可用作饮品、食品和专供人类消费的其他产品的甜味剂，而且还可用于具有改善特征的动物饲料和草料。
可以使用如本文所公开的甜菊醇糖苷作为甜味化合物的产品的示例可以如酒精饮料诸如伏特加、葡萄酒、啤酒、白酒、清酒等；天然果汁、提神饮品、碳酸软饮品、低糖饮品、零卡路里饮品、低卡路里饮品和食品、酸奶饮品、速溶果汁、速溶咖啡、粉状速溶饮料、罐装产品、糖浆、发酵豆瓣酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱、汤、即食肉羹、酱油粉、醋粉、各种饼干、米饼、薄脆饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、果脯和榨菜、鲜奶油、果酱、柑橘酱、花酱、奶粉、冰淇淋、果汁冰糕、瓶装蔬菜和水果、罐装和煮熟豆类、在甜酱汁中煮熟的肉类和食品、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干海产品、冷冻食品、腌制海带(preserved seaweed)、腊肉、烟草、医药产品等。原则上，它可以具有不受限制的应用。
甜化组合物包括饮料，其非限制性示例包括非碳酸饮料和碳酸饮料，诸如可乐、姜汁汽水、沙士、苹果酒、水果味软饮品(例如，柑橘味软饮品，诸如柠檬酸橙或橙子)、软饮品粉等；源自水果或蔬菜的果汁、包括榨汁等的果汁、含有水果颗粒的果汁、水果饮料、果汁饮料、含有果汁的饮料、具有水果香精的饮料、蔬菜汁、含有蔬菜的汁以及含有水果和蔬菜的混合汁；运动饮品、能量饮品、近水和类似饮品(例如，具有天然或合成香料的水)；茶型或喜爱型饮料诸如咖啡、可可、红茶、绿茶、乌龙茶等；含有牛奶组分的饮料诸如牛奶饮料、含有牛奶组分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、果奶饮料、可饮用酸奶、乳酸菌饮料等；以及乳制品。
通常，甜化组合物中存在的甜味剂的量根据甜化组合物的具体类型及其期望甜度而有很大差异。本领域普通技术人员可以容易地辨别放入甜化组合物中的甜味剂的适当量，所述甜味剂可以以干燥或液体形式使用。它可以在食物产品的热处理之前或之后添加。甜味剂的量取决于使用目的。它可以单独添加或与其他化合物组合添加。
在食品、饮品、药品、化妆品、餐桌用品、口香糖的制造过程中，可以使用诸如混合、揉捏、溶解、腌制、渗透、渗滤、喷洒、雾化、浸渍和其他方法的常规方法。
因此，如本文所公开的组合物可以通过本领域技术人员已知的提供成分的均质均匀或均质混合物的任何方法制备。这些方法包括干混、喷雾干燥、附聚、湿法制粒、压实、共结晶等。
在固体形式下，如本文所公开生产的甜菊醇糖苷可以以适合递送至待甜化的食物中的任何形式提供给消费者，包括小囊、小包、散装袋或盒、立方体、片剂、雾剂或可溶解条。组合物可以以单位剂量或散装形式递送。
对于便利地在流体、半流体、糊和奶油形式范围内的液体甜味剂体系和组合物，应发明使用任何形状或形式的适当包装材料的适当包装，以便利地携带或分配或储存或运输包含上述甜味剂产品或上文产生的产品的组合中的任一者的任何组合。
组合物可包含各种增量剂、功能性成分、着色剂、调味剂。
本文对作为现有技术给出的专利文件或其他事项的引用不应被视为承认该文件或事项是已知的或者其包含的信息在截至任一项权利要求的优先权日是公知常识的一部分。
本文列出的每个参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。
下文给出本公开的实施方式的以下列表，然而其并不旨在为限制性的。
1.一种重组微生物，其包含、优选地表达一种或多种编码一种或多种具有尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸，其中所述重组微生物在PSK1上具有缺陷。
2.根据实施方式1所述的重组微生物，其中所述PSK1包含与SEQ ID NO:26具有至少约30％序列同一性的多肽或由其组成。
3.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中PSK1的所述缺陷是PSK1活性降低至少约40％。
4.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物包含、优选地表达：
(a)编码功能性UGT1多肽的多核苷酸，
(b)编码功能性UGT3多肽的多核苷酸，
(c)编码功能性UGT4多肽的多核苷酸，
(d)编码第一功能性UGT2多肽的多核苷酸，和/或
(e)编码第二功能性UGT2多肽的多核苷酸。
5.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物包含、优选地表达：
(a)编码能够在存在于甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-13羟基处对所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化的UGT1多肽的多核苷酸，优选地其中所述糖基化是β-糖基化，诸如UGT85C2多肽，
(b)编码能够在存在于甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-19羧基处对所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化的UGT3多肽的多核苷酸，优选地其中所述糖基化是β-糖基化，诸如UGT74G1多肽，
(c)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1,3糖基化的UGT4多肽的多核苷酸，诸如UGT76G1多肽，
(d)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化的第一UGT2多肽的多核苷酸，优选地UGT2多肽具有至少尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶活性，诸如UGT91d2多肽，和/或
(e)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的所述前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化的第二UGT2多肽的多核苷酸，其中与所述第一UGT2多肽的相同活性相比，所述第二UGT2多肽在所述前体甜菊醇糖苷中的所述19-O-葡萄糖的C2’处具有更高的β1,2糖基化活性，诸如EUGT11多肽；并且
其中所述微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷M。
6.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物另外包含、优选地表达：
(f)编码香叶基-香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的多核苷酸，
(g)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)的多核苷酸，
(h)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的多核苷酸，
(i)编码贝壳杉烯合酶(KS)的多核苷酸，和/或
(j)编码贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)的多核苷酸；并且
其中所述微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D，和/或莱鲍迪苷M。
7.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物另外包含、优选地表达编码细胞色素P450还原酶(CPR)的多核苷酸。
8.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力上调。
9.根据实施方式8所述的重组微生物，其包含一种或多种编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的多核苷酸，由此所述一种或多种多核苷酸的表达赋予所述重组微生物产生升高水平的GGPP的能力。
10.根据前述实施方式中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物属于以下属中的一种：酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、腐质霉属、丝孢酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、山田氏酵母属或埃希氏杆菌属。
11.根据实施方式10所述的重组微生物，其中所述重组微生物是酿酒酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞或大肠杆菌细胞。
12.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括在有益于产生所述甜菊醇糖苷的条件下培养根据实施方式4至11中任一项所述的重组微生物，以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
13.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括使甜菊醇或甜菊醇糖苷与根据实施方式1至11中任一项所述的重组微生物、包含此类重组微生物的发酵肉汤接触，以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
14.根据实施方式13所述的方法，其中所述方法是全细胞生物转化方法。
15.根据实施方式14所述的方法，其中
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇转化为甜菊醇-13-O-葡糖苷，
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇-19-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-13-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为1,2-甜菊苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将莱鲍迪苷B转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为莱鲍迪苷B，
-通过UGT4，优选UGT76G1将1,2-甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷E转化为莱鲍迪苷D，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜菊醇13-O-葡糖苷转化为甜菊醇-1,2-双糖苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜叶悬钩子苷转化为1,2-甜菊苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e和/或EUGT11将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E，和/或
-通过UGT2，优选EUGT11将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。
16.一种培养肉汤或生物转化混合物，其包含通过根据实施方式12至15中任一项所述的方法能够获得的甜菊醇糖苷。
17.一种甜菊醇糖苷，其通过根据实施方式12至15中任一项所述的方法能够获得或分离自来自实施方式16的所述肉汤或混合物。
18.一种食品、饲料或饮料，其包含根据实施方式17所述的甜菊醇糖苷。
本公开通过以下实施例进一步说明：
实施例
基因修饰技术
标准基因技术，诸如酶在重组微生物中的过表达以及重组微生物的另外基因修饰，是本领域的已知方法，诸如描述于Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press或F.Ausubel等人编,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。用于真菌宿主细胞的转化和基因修饰的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671中了解。
序列的描述在表1中示出。本文所述的序列可参考序列表或参考也在表1中示出的数据库登录号来限定。
用于测量甜菊醇糖苷(SG)的测定
在与PDA检测器(210nm处的UV吸光度)联用的Ultimate3000HPLC(Thermo)上分析发酵样品中的甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷。
使用4.6×150mm 3μm粒度的Waters Atlantis C-18柱实现色谱分离，使用以(A)25％乙腈和B)100％乙腈作为流动相的梯度洗脱液。22min。梯度从0％ B开始，在13分钟内线性增加至46％ B，在0.1分钟内进一步线性增加至98％ B，并保持4分钟，然后是100％ A，从17.1分钟直到22分钟。流速保持在1ml/min，注入体积为10μl并且柱温设置为50℃。使用浓度为约200μg/mL的莱鲍迪苷A和M标准品的外部单点校准对期望组分进行量化。该方法的线性范围为0-200μg/mL。莱鲍迪苷B和D的浓度基于莱鲍迪苷A外标使用FCC 9专著中针对莱鲍迪苷A报告的相对响应因子进行计算。
可商购获得的参考用于莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷。用于莱鲍迪苷M的参考由DSM提供。
实施例1.在菌株STV2019和PSK1缺陷型STV2019中产生甜菊醇糖苷
专利申请WO2015/007748的实施例7中的解脂耶氏酵母菌株STV2019包含产生甜菊醇糖苷诸如莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷D(RebD)和莱鲍迪苷M(RebM)所需要的所有元件。在WO2015/007748中广泛描述了菌株STV2019的构建；STV2019表达本文在以下表2中列出的酶。WO2015/007748以引用方式并入本文。
通过同源重组用显性标志物(潮霉素)替换PSK1开放阅读框，使菌株STV2019在PSK1(SEQ ID NO:25(开放阅读框)；SEQ ID NO:26(蛋白质))上具有缺陷。
与野生型细胞相比，PSK1缺陷的影响是莱鲍迪苷M的产率(g/kg葡萄糖)增加约10％，并且相对于其他甜菊醇糖苷，莱鲍迪苷M的百分比增加了15％。
结果清楚地表明PSK1缺陷对至少莱鲍迪苷M的产生的益处。
表2.参与甜菊醇糖苷的生物合成途径的酶的多肽序列
实施例2.菌株STVP003、STVP004和STVP005的构建
解脂耶氏酵母菌株STVP003以与专利申请WO2019/211230的实施例1中描述的解脂耶氏酵母菌株STVP001相当的方式构建。解脂耶氏酵母菌株STVP003包含产生甜菊醇糖苷诸如莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷D(RebD)和莱鲍迪苷M(RebM)所需要的所有元件。它具有表3所列基因的一个或几个过表达的拷贝。
表3.参与甜菊醇糖苷的生物合成途径的酶的多肽序列
使用表4中列出的启动子和终止子表达表3的基因。
表4.启动子和终止子的多核苷酸序列
根据图2中描绘的策略，通过同源重组用菌株STVP003中的显性标志物(潮霉素)替换编码解脂耶氏酵母内源性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1，即PSK1(SEQ ID NO:26)的PSK1开放阅读框(如SEQ ID NO:25中所定义)。
为此，首先在酿酒酵母中组装PSK1缺失构建体。使用适当的引物([5]-5’-PSK1-Fw和[C]-5’-PSK1-Rv；SEQ ID NO:11和12)从解脂耶氏酵母基因组DNA扩增直接位于PSK1(5’-PSK1；SEQ ID NO:3)上游的1-kb片段。这些引物引入另外50bp序列“5”和“C”(SEQ ID NOs:2和4)，从而允许在酿酒酵母中通过同源重组进行质粒组装。以相同的方式，使用引物[D]-3’-PSK1-Fw和[3]-3’-PSK1-Rv(SEQ ID NO:15和16)，在任一位点上添加50bp序列“D”和“3”(SEQ ID NO:8和10)，从解脂耶氏酵母基因组DNA生成直接位于PSK1(3’-PSK1；SEQ ID NO:9)下游的1-kb片段。第三片段是HygB的表达盒(编码潮霉素抗性)，其用引物DBC-05799和DBC-05800(SEQ ID NO:13和14)扩增。将这三个片段连同线性化的pRS417 5_3目的载体(SEQ ID NO:1)一起转化到酿酒酵母中。在酿酒酵母中组装并重组序列“5”、“C”、“D”和“3”(SEQ ID NO:2、4、8和10)后，PSK1缺失构建体由5’-PSK1侧翼、HygB表达盒和3’-PSK1侧翼组成。
从酿酒酵母中分离含有PSK1缺失构建体的质粒(根据WO2015/007748中描述的方法)，并且使用PSK1缺失构建体对两个片段进行PCR扩增。为了生成由5’-PSK1和5’-HygB组成的5’-片段，在PCR中使用引物5’-PSK1-Fw和DBC-10297(SEQ ID NO:17和18)。由3’-HygB和3’-PSK1组成的另一个片段是用引物DBC-10296和3’-PSK1-Rv(SEQ ID NO:19和20)生成的。两个片段在HygB开放阅读框中共享0.96kb同一性。
将纯化的PCR产物转化到解脂耶氏酵母菌株STVP003中，并在含有100μg/ml潮霉素的YEPhD平板上选择转化体。在使用针对5’-整合位点的引物5’-对照-Fw和DBC-05798(SEQID NO:21和22)和针对3’-整合位点的引物DBC-05801和3’-对照-Rv(SEQ ID NO:23和24)的菌落PCR中确认在5’-和3’-PSK1侧翼上的同源重组后，HygB盒正确整合在PSK1基因座上。
选择了两种具有PSK1开放阅读框的正确替换的缺失菌株，并将其命名为菌株STVP004和STVP005。
实施例3.在菌株STVP003、STVP004和STVP005中产生甜菊醇糖苷
为了确定PSK1缺陷的影响，将菌株STVP003、STVP004和STVP005在摇瓶(0.5L，具有60ml培养基)中于30℃和280rpm下培养2天。培养基是基于Verduyn等人(Verduyn C、PostmaE、Scheffers WA、Van Dijken JP.Yeast,1992年7月；8(7):501-517)，其中碳源和氮源有所修改，如表5所述。
表5.预培养培养基组成
a痕量元素溶液
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b维生素溶液
随后，将40ml预培养物转移到含有如表6所示培养基的发酵罐(起始体积0.4L)中。在培养过程中，通过添加氨(10w/w％)将pH控制在5.7，将温度控制在30℃，并且通过调整搅拌速度将pO2控制在20％(相对于空气饱和度)。通过将受控的55重量％葡萄糖进料到发酵罐，葡萄糖浓度保持受限。培养143小时后，收集肉汤以用于样品制备和甜菊醇糖苷的量化。
表6.发酵培养基组成
/>
a痕量元素溶液
b维生素溶液
/>
用于量化甜菊醇糖苷的发酵样品通过以下方式制备：首先用水稀释均质化的全肉汤，然后用乙腈稀释1.3倍(最终乙腈浓度为25％)，使得甜菊醇糖苷的最终浓度在0–200μg/mL的线性测量范围内。然后将样品以3700rpm离心10分钟，并将上清液用于通过如上文所述的测定对甜菊醇糖苷进行量化。
对于菌株STVP003和PSK1缺失菌株STVP004和STVP005而言，所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度(称为“RebM”)、从葡萄糖产生的莱鲍迪苷M的产率(称为“Yps RebM”)、所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(称为“RebM/总SG”)，以及所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷(即具有低糖基化水平的甜菊醇糖苷)的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(称为“小SG/总SG”)在表7中给出。将值针对在PSK1上没有缺陷的菌株STVP003中的相应值归一化。
表7.STVP003、STVP004和STVP005中的所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度(“RebM”)、从葡萄糖产生的莱鲍迪苷M的产率(“Yps RebM”)、所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(“RebM/总SG”)，以及所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(“小SG/总SG”)。将值针对在PSK1上没有缺陷的菌株STVP003中的相应值归一化。
亲本菌株STVP003和PSK1缺失菌株STVP004和STVP005的生产数据的比较表明，酵母中的PSK(在这种情况下是PSK1)有缺陷对甜菊醇糖苷的产生有积极影响，尤其是对高度糖基化的甜菊醇糖苷诸如RebM的产生。实际上，如表7所示，与亲本菌株STVP003相比，PSK1缺失菌株STVP004和STVP005中的所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度(“RebM”)、从葡萄糖产生的莱鲍迪苷M的产率(“Yps RebM”)，以及所产生的莱鲍迪苷M的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(“RebM/总SG”)高得多。在所述PSK1缺失菌株中，摩尔浓度“RebM”、产率“Yps RebM”和比率“RebM/总SG”比亲本菌株STVP003中分别高约40％、35％至40％，以及约40％。
此外，表7中的数据表明，与亲本菌株STVP003相比，PSK1缺失菌株STVP004和STVP005中的不期望的甜菊醇糖苷(例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷)的摩尔浓度与总甜菊醇糖苷的摩尔浓度的比率低得多。在所述PSK1缺失菌株中，比率“小SG/总SG”比亲本菌株STVP003中低约50％。因此，与亲本菌株STVP003相比，在所述PSK1缺失菌株中，高度糖基化的甜菊醇糖苷(诸如莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷D)以更高的纯度水平产生。
总而言之，这些结果表明，能够产生期望甜菊醇糖苷(诸如莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷D)的重组微生物明显受益于在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(诸如PSK1)上具有缺陷。
实施例4.菌株STVP006、STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011的构建
解脂耶氏酵母菌株STVP006以与如专利申请WO2019/211230的实施例中所述的解脂耶氏酵母菌株STVP002相当的方式构建。解脂耶氏酵母菌株STVP006包含产生甜菊醇糖苷诸如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M所需要的所有元件。它具有表8所列基因的一个或几个过表达的拷贝。
表8.参与甜菊醇糖苷的生物合成途径的酶的多肽序列
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使用表9中列出的启动子和终止子表达表8的基因。
表9.启动子和终止子的多核苷酸序列
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通过在STVP006的PSK1开放阅读框(如SEQ ID NO:25中所定义)中引入突变，从而导致产生终止密码子来构建菌株STVP007。通过序列分析确认点突变的存在。所述突变影响SEQ ID NO:26中的位置317处的赖氨酸残基，从而导致具有缺陷活性的截短的PSK1多肽。
通过使STVP006中的编码内源性PSK1的PSK1开放阅读框(如SEQ ID NO:25中所定义)缺失来构建STVP008。使用位于PSK1开放阅读框上游和下游的引物通过PCR确认完整基因的缺失。
通过在STVP006中的PSK1启动子的5’末端产生各种大小的缺失来构建STVP009、STVP010和STVP011。在STVP009中，PSK1启动子缺失，在PSK1开放阅读框的ATG正前方留下200bp的原始PSK1启动子。在STVP010中，PSK1启动子缺失，在PSK1开放阅读框的ATG正前方留下100bp的原始PSK1启动子。在STVP011中，PSK1启动子缺失，在PSK1开放阅读框的ATG正前方留下50bp的原始PSK1启动子。使用位于PSK1启动子上游和下游的引物通过PCR确认启动子中的缺失。PSK1启动子中的缺失影响PSK1开放阅读框的表达水平，并且因此，所产生的PSK1多肽的量在不同的突变菌株STVP009、STVP010和STVP011中有所不同。
菌株STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011是用本领域技术人员已知的基因修饰技术构建的，诸如上文提及或描述的技术。
实施例5.在菌株STVP006、STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011中生产甜菊醇糖苷
为了确定PSK1缺陷的影响，根据实施例3中描述的方法培养菌株STVP006、STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011。培养141小时后，收集肉汤以用于样品制备和甜菊醇糖苷的量化，如实施例3中所述。
针对菌株STVP006和PSK1缺陷菌株STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011评估了所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷(即具有低糖基化水平的甜菊醇糖苷)的摩尔浓度与所产生的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、甜菊苷、甜菊醇双糖苷和甜叶悬钩子苷的摩尔浓度的比率(称为“小SG/总SG”)。将值针对在PSK1上没有缺陷的菌株STVP006中的相应值归一化。
在PSK1缺陷菌株STVP007、STVP008、STVP009、STVP010和STVP011中，比率“小SG”/“总SG”比STVP006中低约10％至40％，通常低约20％至30％。
因此，与用于使酵母菌株在PSK1上有缺陷的方法无关，结果表明酵母中的PSK缺陷始终导致甜菊醇糖苷，尤其是莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷D的产生改善。

Claims (19)

1.一种重组微生物，其包含、优选地表达一种或多种编码一种或多种具有尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)活性的多肽的多核苷酸，其中所述重组微生物在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶上具有缺陷。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1或丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2。
3.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶包含与SEQ ID NO:26具有至少约30％序列同一性的多肽或由其组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的所述缺陷是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性降低至少约40％。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物包含、优选地表达：
(a)编码功能性UGT1多肽的多核苷酸，
(b)编码功能性UGT3多肽的多核苷酸，
(c)编码功能性UGT4多肽的多核苷酸，
(d)编码第一功能性UGT2多肽的多核苷酸，和/或
(e)编码第二功能性UGT2多肽的多核苷酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物包含、优选地表达：
(a)编码能够在存在于甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-13羟基处对所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化的UGT1多肽的多核苷酸，优选地其中所述糖基化是β-糖基化，诸如UGT85C2多肽，
(b)编码能够在存在于甜菊醇或前体甜菊醇糖苷中的C-19羧基处对所述甜菊醇或前体甜菊醇糖苷进行糖基化的UGT3多肽的多核苷酸，优选地其中所述糖基化是β-糖基化，诸如UGT74G1多肽，
(c)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1,3糖基化的UGT4多肽的多核苷酸，诸如UGT76G1多肽，
(d)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化的第一UGT2多肽的多核苷酸，优选地UGT2多肽具有至少尿苷5’-二磷酰葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶活性，诸如UGT91d2多肽，和/或
(e)编码能够对具有13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的所述前体甜菊醇糖苷的所述13-O-葡萄糖、所述19-O-葡萄糖或所述13-O-葡萄糖和所述19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1,2糖基化的第二UGT2多肽的多核苷酸，其中与所述第一UGT2多肽的相同活性相比，所述第二UGT2多肽在所述前体甜菊醇糖苷中的所述19-O-葡萄糖的C2’处具有更高的β1,2糖基化活性，诸如EUGT11多肽；并且
其中所述微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷M。
7.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物另外包含、优选地表达：
(f)编码香叶基-香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的多核苷酸，
(g)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)的多核苷酸，
(h)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的多核苷酸，
(i)编码贝壳杉烯合酶(KS)的多核苷酸，和/或
(j)编码贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)的多核苷酸；并且
其中所述微生物产生甜菊醇糖苷，诸如：甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-双糖苷、甜菊醇-1,3-双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷Q、莱鲍迪苷M、甜叶悬钩子苷和/或杜尔可苷A，优选至少莱鲍迪苷D，和/或莱鲍迪苷M。
8.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物另外包含、优选地表达编码细胞色素P450还原酶(CPR)的多核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力上调。
10.根据权利要求9所述的重组微生物，其包含一种或多种编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的多核苷酸，由此所述一种或多种多核苷酸的表达赋予所述重组微生物产生升高水平的GGPP的能力。
11.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物属于以下属中的一种：酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、腐质霉属、丝孢酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、山田氏酵母属或埃希氏杆菌属。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述重组微生物是酿酒酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞或大肠杆菌细胞。
13.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括在有益于产生所述甜菊醇糖苷的条件下培养根据权利要求4至12中任一项所述的重组微生物，以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
14.一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括使甜菊醇或甜菊醇糖苷与根据权利要求1至12中任一项所述的重组微生物、包含此类重组微生物的发酵肉汤接触，以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法是全细胞生物转化方法。
16.根据权利要求15所述的方法，其中
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇转化为甜菊醇-13-O-葡糖苷，
-通过UGT1，优选UGT85C2将甜菊醇-19-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-13-O-葡糖苷转化为甜叶悬钩子苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为1,2-甜菊苷，
-通过UGT3，优选UGT74G1将莱鲍迪苷B转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将甜菊醇-1,2-双糖苷转化为莱鲍迪苷B，
-通过UGT4，优选UGT76G1将1,2-甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷E转化为莱鲍迪苷D，
-通过UGT4，优选UGT76G1将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜菊醇13-O-葡糖苷转化为甜菊醇-1,2-双糖苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e将甜叶悬钩子苷转化为1,2-甜菊苷，
-通过UGT2，优选UGT91D2e和/或EUGT11将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E，和/或
-通过UGT2，优选EUGT11将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。
17.一种培养肉汤或生物转化混合物，其包含通过根据权利要求13至16中任一项所述的方法能够获得的甜菊醇糖苷。
18.一种甜菊醇糖苷，其通过根据权利要求13至16中任一项所述的方法能够获得或分离自来自权利要求17的所述肉汤或混合物。
19.一种食品、饲料或饮料，其包含根据权利要求18所述的甜菊醇糖苷。
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CN117625420A (zh) * 2024-01-25 2024-03-01 天津科技大学 一种复合微生物液态发酵烟草烟叶制备香精香料的方法及酿酒酵母
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