CN116848233A - Pparβ/δ激动剂预处理的msc用于治疗缺血再灌注损伤 - Google Patents

Pparβ/δ激动剂预处理的msc用于治疗缺血再灌注损伤 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法，其包括：a)提供MSC；b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；c)去除培养基并洗涤MSC；以及d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中药学上可接受的载体不含有PPARβ/δ激动剂。本发明进一步涉及使用本发明的方法获得的MSC，以及其作为药物的用途，优选在治疗或预防缺血再灌注损伤中的用途，其中所述治疗或预防的方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。

Description

PPARΒ/Δ激动剂预处理的MSC用于治疗缺血再灌注损伤
技术领域
本发明属于旨在基于使用间充质干细胞治疗缺血再灌注损伤的治疗领域。其涉及一种制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法，所述体外方法包括a)提供MSC；b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；c)去除培养基并洗涤MSC；以及d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中药学上可接受的载体不含有PPARβ/δ激动剂。本发明进一步涉及使用本发明的方法获得的MSC，以及其作为药物的用途，优选在治疗或预防缺血再灌注损伤中的用途，其中所述治疗或预防的方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
背景技术
通过血运重建致病(culprit)动脉进行心肌再灌注是急性心肌梗塞(AMI)患者的唯一治疗方法。然而，目前还没有专门预防不可逆缺血再灌注(IR)损伤的治疗方法，这种损伤被认为是再灌注的副作用，主要是由于细胞凋亡和缺血组织突然恢复供氧引发的。细胞凋亡是一种高度调节的能量依赖性细胞死亡形式，在缺血性疾病的动物模型和患者中均可观察到，因此具有潜在的治疗干预意义(Roubille，F.等人，Delayed postconditioning inthe mouse heart in vivo.Circulation124,1330-1336,doi:CIRCULATIONAHA.111.031864[pii]10.1161/CIRCULATIONAHA.111.031864(2011)；)；Saraste,A.等人，Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation 95,320-323,doi:10.1161/01.cir.95.2.320(1997))。这种细胞死亡的调节机制是再灌注阶段特有的。事实上，细胞凋亡在缺血期间预先激活，并在再灌注期间执行，因为细胞凋亡依赖于ATP的产生(McCully,J.D.,Wakiyama,H.,Hsieh,Y.J.,Jones,M.&Levitsky,S.Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury.Am J Physiol Heart Circ Physiol 286,H1923-1935,doi:10.1152/ajpheart.00935.2003(2004))。特异性靶向细胞凋亡级联似乎是预防再灌注损伤和限制梗塞大小的主要策略(Boisguerin,P.等人，A novel therapeutic peptidetargeting myocardial reperfusion injury.Cardiovasc Res 116,633-644,doi:10.1093/cvr/cvz145(2020))。因此，需要开发针对AMI后IR诱导的细胞凋亡的策略。
据报道，基于间充质干细胞(MSC)的治疗可通过多种途径改善心肌梗塞(MI)后心肌的功能恢复，包括增加内源性细胞存活、增殖和血管生成。此外，MSC通过其可塑性及其释放生物活性分子和转移细胞器(如线粒体和细胞外囊泡(EV))的能力，有效抑制炎症和细胞凋亡(Karantalis,V.&Hare,J.M.Use of mesenchymal stem cells for therapy ofcardiac disease.Circ Res 116,1413-1430,doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.303614(2015))。基于这些特性，MSC已在多项临床前研究中进行了测试，并取得了有希望的结果。事实上，在AMI的临床前研究中，MSC注射可改善组织修复和心脏功能(Cashman,T.J.,Gouon-Evans,V.&Costa,K.D.Mesenchymal stem cells for cardiac therapy:practicalchallenges and potential mechanisms.Stem Cell Rev Rep 9,254-265,doi:10.1007/s12015-012-9375-6(2013))、调节炎症反应、减少细胞凋亡(Tompkins,B.A.等人，Preclinical Studies of Stem Cell Therapy for Heart Disease.Circ Res 122,1006-1020,doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.312486(2018))以及在动物中的死亡率(Llano,R.等人，Intracoronary delivery of mesenchymal stem cells at high flow rates aftermyocardial infarction improves distal coronary blood flow and decreasesmortality in pigs.Catheter Cardiovasc Interv 73,251-257,doi:10.1002/ccd.21781(2009))。在临床试验中，尽管MSC在I期和II期中的安全性和有效性已得到证明，但在III期试验中却报告了不一致的情况(Jeong，H.等人，Mesenchymal Stem Cell Therapy forIschemic Heart Disease:Systematic Review and Meta-analysis.Internationaljournal of stem cells,doi:10.15283/ijsc17061(2018)；Roncalli,J.等人，Intracoronary autologous mononucleated bone marrow cell infusion for acutemyocardial infarction:results of the randomized multicenter BONAMItrial.European heart journal 32,1748-1757,doi:10.1093/eurheartj/ehq455(2011)；Chen,Z.,Chen,L.,Zeng,C.&Wang,W.E.Functionally Improved Mesenchymal Stem Cellsto Better Treat Myocardial Infarction.Stem Cells Int 2018,7045245,doi:10.1155/2018/7045245(2018))。这些不一致部分归因于MSC表现出的体内存活率和移植率低，但也归因于所用MSC的来源以及体外扩增过程对MSC功能的有害影响(Chen,Z.,Chen,L.,Zeng,C.&Wang,W.E.Functionally Improved Mesenchymal Stem Cells to BetterTreat Myocardial Infarction.Stem Cells Int 2018,7045245,doi:10.1155/2018/7045245(2018))。因此，为了优化MSC的治疗潜力并将其纳入常规临床实践，有人提出需要通过提高MSC的存活率和在受损组织中的移植，以及其对心肌细胞的抗细胞凋亡特性来增强/强化MSC。
过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)是核受体，存在三种不同的亚型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。它们与类视黄醇X受体(RXR)形成异二聚体，在配体结合后作为转录调节子发挥作用。依赖于组织配体和辅助因子，PPAR亚型发挥多种功能(Wagner,K.D.&Wagner,N.Peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta(PPARbeta/delta)actsas regulator of metabolism linked to multiple cellularfunctions.Pharmacology&therapeutics 125,423-435,doi:10.1016/j.pharmthera.2009.12.001(2010))。PPARα主要在棕色脂肪组织、肠、心脏、肝脏、肾脏中表达，而PPARγ在免疫细胞、肠道、白色和棕色脂肪组织中表达，并且PPARβ/δ普遍表达。PPARβ/δ是PPAR家族的促血管生成成员，在血管细胞中表达(Bishop-Bailey,D.Peroxisomeproliferator-activated receptors in the cardiovascular system.Br J Pharmacol129,823-834,doi:10.1038/sj.bjp.0703149(2000))。缺少细胞质前列环素受体的HEK293细胞中PPARβ/δ激活是促细胞凋亡的(Hatae,T.,Wada,M.,Yokoyama,C.,Shimonishi,M.&Tanabe,T.Prostacyclin-dependent apoptosis mediated by PPAR delta.The Journalof biological chemistry 276,46260-46267,doi:10.1074/jbc.M107180200(2001))。后来的研究报道，内皮细胞中PPARβ/δ的抗细胞凋亡特性是通过内皮细胞14-3-3的激活介导的(Liou,J.Y.,Lee,S.,Ghelani,D.,Matijevic-Aleksic,N.&Wu,K.K.Protection ofendothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-deltamediated 14-3-3upregulation.Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology26,1481-1487,doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93(2006)；Brunelli,L.,Cieslik,K.A.,Alcorn,J.L.,Vatta,M.&Baldini,A.Peroxisome proliferator-activatedreceptor-delta upregulates 14-3-3epsilon in human endothelial cells viaCCAAT/enhancer binding protein-beta.Circ Res 100,e59-71,doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22(2007))。与这些研究一致，选择性PPARδ激动剂GW501516被证明可以保护心肌母细胞系H9c2免受H2O2诱导的细胞死亡(Pesant,M等人，Peroxisomeproliferator-activated receptor delta(PPARdelta)activation protects H9c2cardiomyoblasts from oxidative stress-induced apoptosis.Cardiovasc Res 69,440-449,doi:10.1016/j.cardiores.2005.10.019(2006))。
在WO2015/164506中也提出了PPARβ/δ激动剂作为干细胞移植增强剂用于治疗各种病变的联合疗法，包括联合施用干细胞和PPARβ/δ激动剂。具体地，虽然本申请公开的主要用途是使用过表达前列环素(PGI2)的干细胞和PGI2联合用于治疗血管相关疾病和/或肌肉疾病，但本申请的实施例6公开了MSC和PPARβ/δ激动剂GW501516在缺血性后肢中的联合应用。MSC在体外用PPARβ/δ激动剂GW501516预处理4天，直接注射到NOD/SCID小鼠的缺血后肢的腓肠肌中，该小鼠每天也接受PPARβ/δ激动剂GW501516的施用。
在WO2014/015318中，还提出PPARβ/δ激动剂用于增加基因递送载体(特别是逆转录病毒载体)在各种细胞群(包括MSC，尽管实验数据集中于造血干细胞-HSC)中的细胞转导效率。
然而，体内施用PPARβ/δ激动剂可以导致显著的有害作用。特别地，发现了PPARβ/δ激动剂GW501516在小鼠和大鼠中以3mg/kg/天的剂量时，导致癌症在多个器官中迅速发展(Sahebkar A,Chew GT,Watts GF(2014)."New peroxisome proliferator-activatedreceptor agonists:potential treatments for atherogenic dyslipidemia and non-alcoholic fatty liver disease".Expert Opin Pharmacother.15(4):493–503；GeigerLE,Dunsford WS,Lewis DJ,Brennan C,Liu KC,Newsholme SJ(2009).PS 895-Ratcarcinogenicity study with GW501516,a PPAR delta agonist.48th Annual Meetingof the Society of Toxicology.Baltimore:Society of Toxicology.第105页，Newsholme SJ,Dunsford WS,Brodie T,Brennan C,Brown M,Geiger LE(2009).PS 896-Mouse carcinogenicity study with GW501516,a PPAR delta agonist.48th AnnualMeeting of the Society of Toxicology.Baltimore:Society of Toxicology.第105页)。
因此，需要改进通过细胞疗法治疗缺血再灌注损伤的方法，特别是在心肌梗塞的情况下，其将允许有效移植具有抗细胞凋亡特性的MSC，而不会引起现有技术中公开的共同施用PPARβ/δ激动剂的有害影响。
发明内容
PPARβ/δ在MSC中高度表达(Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directs thetherapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis.Annals of therheumatic diseases,doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696(2016))，但其对MSC抗细胞凋亡和心脏保护特性的作用还没有得到研究。
在本发明的上下文中，发明人发现通过MSC表达PPARβ/δ对于MSC在治疗心肌缺血再灌注损伤中的治疗效率至关重要。事实上，虽然PPARβ/δ的敲除并没有改变它们的抗炎特性，但却减弱了它们的心脏保护作用(见实施例1，特别是图4B)，这表明增强MSC的免疫调节特性以改善它们对AMI的有益作用不应该是克服III期临床试验的不一致性的唯一或主要的方法，而是应该考虑在施用至患者后同时提高MSC的存活率。
在这些初步结果的基础上，本发明人进一步令人惊讶地发现，用PPARβ/δ激动剂对MSC进行短时间预处理(仅24小时)就足以显著改善MSC在心肌缺血再灌注损伤中的存活、移植和抗细胞凋亡特性，在比使用未经预处理的MSC低两倍的剂量下产生相似的治疗效果。在该方法中，用PPARβ/δ激动剂预处理天然(未转导的)MSC，然后将激动剂洗掉，并向需要其的受试者施用包含经预处理的MSC但不包含任何PPARβ/δ激动剂的组合物，从而防止与体内施用PPARβ/δ激动剂相关的任何有害作用。出乎意料的是，如此短的预处理足以显著提高MSC的移植和抗细胞凋亡特性，以及其在治疗缺血再灌注损伤中的治疗效率(参见实施例2)。
因此，在第一方面，本发明涉及一种制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法，所述体外方法包括：a)提供MSC；b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；c)去除培养基并洗涤MSC；以及d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中药学上可接受的载体不含有PPARβ/δ激动剂。
本发明还涉及包含间充质干细胞(MSC)的组合物，其中所述组合物是通过根据本发明的体外方法获得的。
本发明还涉及根据本发明的组合物，其用作药物，优选在需要其的受试者中治疗缺血再灌注损伤的方法中，其中所述治疗方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
附图说明
图1：C57Bl6小鼠心脏安装在Langendorff系统上并进行IR损伤。(A)：离体操作方案包括15分钟的稳定期，然后通过停止通过主动脉的液流(无液流)，实现30分钟的整体缺血。通过在60分钟内恢复Tyrode灌注，实现再灌注。对于SHAM条件，在整个操作方案期间对心脏进行灌注，没有任何缺血诱导。在操作方案结束时，使用TTC染色方法测量梗塞大小。在离体操作方案期间的两个时间点收集冠状动脉流出物：在稳定期间评价细胞因子的“基础”释放水平，并在再灌注阶段结束时评估IR损伤后“IR60”细胞因子的产生。(B)：散点图和条形图(平均值±SD)表示IR(n＝12)和SHAM(n＝3)心脏中的梗塞大小(以LV的百分比表示)。显示了每组TTC染色的LV切片的代表性图片。
(C)：散点图和条形图(平均值±SD)表示使用Meso Scale Discovery(MSD)V-PlexPlus Proinflammatory Panel 1(小鼠)试剂盒，对缺血前(Basal)和IR操作方案后60分钟再灌注后(IR60)收集的冠状动脉流出物中的细胞因子进行定量。使用Mann-Whitney检验进行统计分析。对于TNFα(pg/ml)，**记为p**＝0.002，对于CXCL1(pg/ml)，***记为p***＝0.0007，对于IL-6(pg/ml)，**记为p****<0.0001。
图2.在Langendorff系统上进行离体灌注的离体心脏被置于与图1A中所述类似的灌注操作方案中。(A)在MSC组中，使用Tyrode缓冲液中制备的不同浓度(2,500；5,000或20,000个细胞/mL)的MSC细胞溶液实现再灌注。对于PostC组，在再灌注开始时，应用后调理刺激，包括1分钟缺血-1分钟再灌注的3个循环。
在对照条件(IR)中，仅用Tyrode溶液(对照条件)对心脏进行再灌注。在操作方案结束后进行组织学分析，测量梗塞大小并进行免疫化学检测。
(B)：散点图和条形图(平均值±SD)表示在IR(n＝12)、MSC 2500个细胞/mL(n＝6)、MSC 5,000个细胞/mL(n＝6)和MSC 20,000(n＝6)中的梗塞大小(以LV的百分比表示)。使用Kruskal-Wallis和Dunn事后检验进行统计分析以进行多重比较。与IR相比的统计显著性记为，***为p＝0.0009，ns为p＝0.22vs IR，#为p＝0.84vs MSC 5,000个细胞/mL。
(C)：散点图和条形图(平均值±SD)表示IR(n＝12)、PostC(n＝6)和MSC(5,000个细胞/mL，n＝6)中的梗塞大小(以LV的百分比表示)。使用Kruskal-Wallis和Dunn事后检验进行统计分析以进行多重比较。与IR相比的统计显著性记为，***为p＝0.0002，**为p＝0.006以及#为p>0.99vs PostC。
图3.(A)：在Langendorff系统上进行离体灌注的分离的心脏被置于与图1A中所述类似的灌注操作方案中。在MSC组中，用浓度为5000个细胞/mL制备的MSC Tyrode溶液实现再灌注。对于PostC组，在再灌注开始时，应用后调理刺激，包括1分钟缺血-1分钟再灌注的3个循环。在对照条件(IR)中，仅用Tyrode溶液(对照条件)对心脏进行再灌注。在再灌注阶段结束时收集冠状动脉流出物，以评价IR损伤和PostC操作方案后细胞因子产量。
(B、C、D)：散点图和条形图(平均值±SD)表示使用Meso Scale Discovery(MSD)V-Plex Plus Proinflammatory Panel 1(小鼠)试剂盒，对IR或PostC操作方案(分别为IR和MSC)之后，在60分钟再灌注后，对收集的冠状动脉流出物中的细胞因子进行定量。使用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。(B)：对于TNFα(pg/ml)，ns记为p＝0.108。(C)：对于CXCL1(pg/ml)，***记为p***＝0.0006(vs IR)、**记为p*＝0.018(vs IR)和#记为p#>0.999。(D)：对于IL-6(pg/ml)，**记为p**＝0.002(vs IR)、**记为p*＝0.029(vs IR)和#记为p#>0.999。
图4.(A)：在Langendorff系统上进行离体灌注的分离的心脏被置于与图1A中所述类似的灌注操作方案中。IR组仅使用Tyrode溶液进行再灌注，在MSC(MSC组)和KO MSC(KOMSC组)使用含有浓度为5000个细胞/ML的MSC制备的Tyrode溶液进行再灌注。在操作方案结束时，使用Meso Scale Discovery(MSD)V-Plex Plus Proinflammatory Panel 1(小鼠)试剂盒对分离的心脏(B)进行梗塞大小分析和细胞因子产量分析(C、D、E)。适当时使用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后检验进行统计分析。
(B)：散点图和条形图(平均值±SD)表示IR(n＝12)、MSC(5,000个细胞/mL，n＝9)和KO MSC(5,000个细胞/mL，n＝13)中的梗塞大小(以LV的百分比表示)。与IR相比的统计显著性记为，**记为p＝0.001，*记为p＝0.029以及#记为p＝075vs MSC。
(C、D、E)：散点图和条形图(平均值±SD)显示了使用Meso Scale Discovery试剂盒，对于来自未处理的心脏(IR)、用野生型MSC和缺少PPARβ/δ的MSC(KO MSC)处理的心脏(MSC)，在再灌注开始后60分钟收集的冠状动脉流出物中的TNFα、CXCL1和IL-6进行定量。使用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。(C)：对于TNFα(pg/ml)，ns记为pns＝0.60。(D)：对于CXCL1(pg/ml)，**记为p**＝0.0017(MSC vs IR)、ns记为p＝0.34(KO MSC vs IR)和#记为p#＝0.28(KO MSC vs MSC)；(E)：对于IL-6(pg/ml)，**记为p**＝0.004(MSC vs IR)、*记为p*＝0.03(KO MSC vs IR)和#记为p#>0.999(KO MSC vs MSC)。
图5：经PPARβ/δ引发(prime)的MSC处理的心脏增强了心脏保护作用。(A)C57Bl6小鼠心脏安装在Langendorff系统上，进行IR损伤。离体操作方案包括15分钟的稳定期，然后通过停止通过主动脉的液流(无液流)，实现30分钟的整体缺血。在60分钟内恢复Tyrode灌注，实现再灌注(IR组)。对于PostC组，在再灌注开始时，应用后调理刺激，包括1分钟缺血-1分钟再灌注的3个循环。在MSC组中，使用在Tyrode缓冲液中制备的不同浓度(2,500；5,000或10,000个细胞/mL)的MSC细胞溶液实现再灌注。在操作方案结束时，将心脏专门用于梗塞大小(TTC染色方法；B-E)或免疫化学(F)分析。(B)散点图和条形图(平均值±SD)表示为在IR(n＝11)、PostC(n＝7)、MSC 2500个细胞/mL(n＝11)、MSC 5,000个细胞/mL(n＝10)和MSC10,000个细胞/mL(n＝10)中的梗塞大小；使用Kruskal-Wallis和Dunn事后检验进行统计分析，以进行多重比较。与IR相比统计显著性记为，***记为p＝0.0004(PostC vs IR)，ns记为pns＝0.80(MSC 2500vs IR)，***记为p***＝0.0004(MSC 5,000vs IR)，ns记为pns>0.99(MSC 10,000vs IR)，以及与PostC的比较：$记为p$＝0.097(MSC 2,500)、$记为p$>0.99(MSC5,000)、##记为p##＝0.001(MSC 10,000)。(C)散点图和条形图(平均值±SD)表示在IR(n＝11)、MSC(5,000个细胞/mL，n＝12)、MSC(5,000个细胞/mL)+GSK0660(n＝9)中的梗塞大小。通过ANOVA(因为数据通过了正态性检验)进行统计分析，然后进行Tukey多重比较检验。统计显著性表示为****记为p****<0.0001vs IR、**记为p**＝0.007vs IR以及#记为p#＝0.019vs MSC。(D)散点图和条形图(平均值±SD)表示在IR(n＝11)、MSC 2,500个细胞/mL(n＝12)、MSC(2,500个细胞/mL)+GW0742 0.1μM(n＝8)、MSC(2,500个细胞/mL)+GW0742 1μM(n＝7)和MSC(2,500个细胞/mL)+GW0742 5μM(n＝5)中的梗塞大小。使用Kruskal-Wallis进行统计分析，之后进行Dunn事后检验。统计显著性记为，****记为p****<0.0001(MSC+GW07421μM vs IR)、ns记为pns＝0.16(MSC vs IR)、ns记为pns＝0.056(MSC+GW0742 0.1μM vs IR)以及ns记为pns＝0.0.07(MSC+GW0742 5μM vs IR)。(E)散点图和条形图(平均值±SD)表示在IR(n＝11)、MSC(5,000个细胞/mL，n＝12)和MSC(2,500个细胞/mL)+GW0742 1μM(n＝7)中的梗塞大小。使用Kruskal-Wallis进行统计分析，之后进行Dunn事后检验。统计显著性记为，***记为p***＝0.001(MSC 5,000vs IR)，***记为p***＝0.0003(MSC 2,500+GW0742 vsIR)和ns记为pns>0.99。(F)散点图和条形图(平均值±SD)表示注射了MSC(DI-I标记的MSC)与MSC+GW07421μM的心脏中测量的荧光百分比(每组n＝3)。每个点代表每个心脏的n＝17至26个切片获得的荧光百分比的平均值。
图6：增加对氧化应激的抗性和PPARβ/δ引发的MSC的存活率。
(A)MSC在完全培养基中进行接种步骤48小时后，在不含血清的基本培养基中进行4小时的H2O2诱导的氧化应激。在暴露至氧化应激之前的24小时，使用PPARβ/δ激动剂或拮抗剂对MSC进行药理学预调理。在操作方案结束时，通过ELISA测量特定DNA片段化，通过RT-qPCR测量转录本的量，分析细胞死亡或相关基因表达。(B)：散点图和条形图显示，在基本培养基中用不同浓度(0、100、150、250、500和750μM)的H2O2处理4小时的MSC中测量的特定DNA片段化的定量。将每个处理组的数据(通过未经处理的MSC获得的对照值归一化)绘制为散点印迹和平均值±SD，使用Kruskal-Wallis(Dunn事后检验)进行比较，记为，****记为p<0.0001(250组，n＝11个独立培养物vs 0组，n＝13)，**记为p＝0.0013(100组，n＝10vs 0组，n＝13)，**记为p＝0.0015(350组，n＝9vs 0组，n＝13)，**记为p＝0.0015(500组，n＝9vs 0组，n＝13)，*记为p＝0.0332(750组，n＝3vs 0组，n＝13)。(C)：散点图和条形图显示，在暴露至H2O2之前24小时，用0.1和1μM的GW0742或GSK0660预处理，再用250μM的H2O2处理的MSC中测量的特定DNA片段化定量。将每个处理组的数据(通过H2O2诱导的初始MSC获得的值归一化)绘制为散点印迹和平均值±SD，使用Kruskal-Wallis(Dunn事后检验)进行比较。P值记为，****记为p<0.0001(MSC，n＝16个独立培养物vs MSC/H2O2，n＝18)，*记为p＝0.0402(MSC+1μM GSK0660/H2O2，n＝8vs MSC/H2O2，n＝18)，(D)在H2O2暴露之前24小时，用0.1和1μM的GW0742或GSK0660预处理、再用H2O2处理的MSC中，Bcl-2的相对表达。
图7：PPARβ/δ引发的MSC对心肌细胞的抗细胞凋亡作用的增强。(A)使用PPARβ/δ激动剂对MSC进行药理预调理24小时后，使用transwells(上室)与H9c2(下室)共培养细胞。两种培养物均暴露于含有350μM的H2O2的基本培养基(不含血清)中4小时。在操作方案结束时，对H9c2细胞中的特定DNA片段化进行定量，并将值与用初始MSC、或用PPARβ/δ拮抗剂(GSK0660或GSK03787)预处理的MSC共培养并暴露于350μM的H2O2获得的值进行比较。(B、C、D)散点图和条形图显示在操作方案结束时，在H9c2中定量的特定DNA片段化。数据(每个处理组的平均值±SD)通过初始MSC/H2O2获得的值进行归一化，使用Kruskal-Wallis(Dunn事后检验)进行比较，(B)：使用条件1操作方案获得的数据。(C)：按照条件2操作方案P，将p值记为，****记为p<0.0001(MSC，n＝16个独立培养物vs MSC/H2O2，n＝18)。对于使用条件3操作方案获得的数据(D)，p值记为，*记为p＝0.0436(MSC+1μM GSK0660/H2O2，n＝6vs MSC/H2O2，n＝10)。
图8：(A)MSC在完全培养基中进行接种步骤48小时后，在不含血清的基本培养基中进行4小时的H2O2诱导的氧化应激。在暴露至氧化应激前24小时，使用PPARβ/δ激动剂或拮抗剂对MSC进行药理学预调理。在操作方案结束时，通过RT-qPCR测量转录本量来分析相对基因表达。通过RT-qPCR评估暴露于氧化应激的未经处理或预调理的MSC中的mRNA表达水平(B)vegf：使用ANOVA和Tukey事后多重比较对数据(平均值±SEM)进行比较(通过正态性检验)。P值记为，*记为p＝0.0301(对照，n＝9vs H2O2，n＝9)，***记为p＝0.0009(H2O2，n＝9vsGSK0660 0.1μM，n＝9)，以及*记为p＝0.0191(H2O2，n＝9vs GSK0660 1μM，n＝8)；(C)对于hgf：使用Kruskal-Wallis比较数据(平均值±SEM)，然后使用Dunn事后检验用于多重比较。P值记为ns vs H2O2，n＝7，对于对照，n＝8，GWO7420.1μM，n＝7，GW0742 1μM n＝9，GSK06600.1μM n＝6和GSK0660 1μM n＝9；以及(D)对于pdgf：数据(平均值±SEM)使用ANOVA和Tukey事后多重比较进行比较(通过正态性检验)。P值记为，*记为p＝0.0132(对照，n＝9vsH2O2，n＝9)，以及*记为p＝0.0277(H2O2，n＝9vs GW07421 1μM，n＝9)。为了进行统计分析，与未处理的MSC/H2O2组进行比较。
图9：(A)将C57Bl6小鼠心脏安装在Langendorff系统上。离体操作方案包括15分钟的稳定期，然后通过停止通过主动脉的液流(无液流)，实现30分钟的整体缺血。通过在60分钟内恢复Tyrode灌注，实现再灌注(IR组)。在MSC组中，使用经过或未经过1μM的GW0742预处理的Tyrode缓冲液中制备的MSC细胞溶液(2500个细胞/mL)实现再灌注。在操作方案结束时，收集心脏，提取蛋白质用于进一步分析。(B、C、D)对IR未处理、或经过MSC处理的小鼠IR心脏(离体)(经过或未经过药理预处理)的LV蛋白提取物进行蛋白质印迹分析。针对切割的半胱天冬酶3(对于IR，p*＝0.0322，n＝10vs MSC+GW0742，n＝10)以及针对pAKT/AKT(对于IR，p*＝0.0385，n＝8vs MSC+GW0742，n＝8)绘制散点印迹和平均值±SD。数据使用非参数的Kruskal-Wallis检验(Dunn事后检验)进行比较。
图10：(A)MSC在完全培养基中培养，所述完全培养基含有补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的基本必需培养基(MEM)-α。在离体实验前24小时或96小时，将MSC与含有稀释在培养基中的PPARβ/δ激动剂的处理溶液(GW0742，1μM和GW501516，0.1μM)一起孵育。处理持续24小时或96小时。洗涤细胞，在胰蛋白酶消化步骤后，以200g离心3分钟。将MSC重悬于预热的Tyrode溶液中，终浓度为5000个细胞/ml。(B)C56Bl6小鼠心脏在15分钟内用预热的Tyrode溶液灌注(稳定)。通过在30分钟内停止灌注液流(“无液流”)获得整体缺血。再灌注步骤(60分钟)是通过使用MSC溶液恢复液流来实现的，该MSC溶液在60分钟再灌注步骤期间应用。仅使用Tyrode获得对照条件(IR)。(C)散点图和条形图(平均值±SD)代表在IR(n＝1；在图中记为未处理)、MSC(n＝3)、MSC+GW501516 0.1μM(96小时预调理；n＝8)、MSC+GW501516 0.1μM(24小时预调理；n＝7)、MSC+GW0742 1μM(24小时预调理；n＝2)中的梗塞大小。无论预调理处理及其持续时间如何，MSC都表现出类似的心脏保护作用。
具体实施方式
制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法
本发明首先涉及一种制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法，其包括
a)提供MSC；
b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；
c)去除培养基并洗涤MSC；和
d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中药学上可接受的载体不含有PPARβ/δ激动剂。
步骤a)
在步骤a)中，提供间充质干细胞。
国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会(the Mesenchymal and TissueStem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy)于2006年制定了用于定义人类MSC的最低标准，至今仍被广泛接受：
1.当维持在标准培养条件下时，MSC必须具有是塑料-贴壁性。
2.表型：MSC必须
a.表达(至少95％的细胞)CD105(称为内皮糖蛋白，最初由MAb SH2识别)、CD73(称为外切5'核苷酸酶，最初由MAb SH3和SH4识别)和CD90(也称为Thy-1)，和
b.缺少(少于2％的细胞)CD45(泛白细胞标记物)、CD34(原始造血祖细胞和内皮细胞的标记物)、CD14或CD11b(主要在单核细胞和巨噬细胞上表达，最有可能在MSC培养物中发现的的造血细胞上，仅需要检测一种)、CD79a或CD19(B细胞的标记物，仅需要检测一种)和HLA-DR(除非受到刺激，否则不在MSC上表达)表面分子的表达。
3.体外分化：MSC必须能够在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。
MSC的起源组织
MSC可以从各种组织中分离，包括骨髓(BM，MSC的最初来源，Pittenger MF,MackayAM,Beck SC,Jaiswal RK,Douglas R,Mosca JD,Moorman MA,Simonetti DW,Craig S,Marshak DR.Multilineage potential of adult human mesenchymalstemcells.Science 1999；284:143–147)、脂肪组织(Wagner W,Wein F,Seckinger A,Frankhauser M,Wirkner U,Krause U,Blake J,Schwager C,Eckstein V,AnsorgeW.Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bonemarrow,adipose tissue,and umbilical cord blood.Exp Hematol 2005；33:1402–1416；Zhang X,Yang M,Lin L,Chen P,Ma K,Zhou C,Ao Y.Runx2 overexpression enhancesosteoblastic differentiation and mineralization in adipose-derived stem cellsin vitro and in vivo.Calcif Tissue Int 2006；79:169–178)、牙组织(Huang GT,Gronthos S,Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.thosefrom other sources:Their biology and role in regenerative medicine.J Dent Res2009；88:792–806)、唾液腺(Rotter N,Oder J,Schlenke P,Lindner U,Bohrnsen F,Kramer J,Rohwedel J,Huss R,€Brandau S,Wollenberg B.Isolation andcharacterization of adult stem cells from human salivary glands.Stem CellsDev 2008；17:509–518)、围产期组织，如胎盘、脐带组织(Wharton’s Jelly)或羊水(Raynaud C,Maleki M,Lis R,Ahmed B,Al-Azwani I,Malek J,Safadi F,RafiiA.Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from humanplacenta and fetal membrane and their response to osteoactivinstimulation.Stem Cells Int 2012；2012:658356；Wang HS,Hung SC,Peng ST,Huang CC,Wei HM,Guo YJ,Fu YS,Lai MC,Chen CC.Mesenchymal stem cells in the Wharton’sjelly of the human umbilical cord.Stem Cells 2004；22:1330–1337；Hou T,Xu J,WuX,Xie Z,Luo F,Zhang Z,Zeng L.Umbilical cord Wharton’s Jelly:a new potentialcell source of mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering.TissueEng Part A 2009；15:2325–2334；Kita K,Gauglitz GG,Phan TT,Herndon DN,JeschkeMG.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.Stem Cells Dev 2010；19:491–502)、经血(Luz-Crawford,P.等人，Mesenchymal Stem Cell-Derived Interleukin1Receptor Antagonist Promotes Macrophage Polarization and Inhibits B CellDifferentiation.Stem cells 2016；34,483-492,doi:10.1002/stem.2254；FranciscaAlcayaga-Miranda等人，Characterization of menstrual stem cells:angiogeniceffect,migration and hematopoietic stem cell support in comparison with bonemarrow mesenchymal stem cells.Stem Cell Res Ther 2015Mar 17；6(1):32)、外周血(Weiping Lin等人，Characterisation of multipotent stem cells from humanperipheral blood using an improved protocol.J Orthop Translat 2019；7；19:18-28)和滑膜组织(Djouad,F.,Bony,C.,T.等人，Transcriptional profilesdiscriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stemcells.Arthritis Res Ther 7,R1304(2005)；De Bari C,Dell'Accio F,等人，Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovialmembrane.Arthritis Rheum.2001年8月；44(8)：1928-42)。
因此，步骤a)中提供的MSC可以源自骨髓、脂肪组织、牙组织、唾液腺来源的、或源自围产期组织(如胎盘、脐带组织(Wharton’s Jelly)、羊水、经血、外周血或滑膜组织)。
在优选的实施方案中，步骤a)中提供的MSC是骨髓来源的或脂肪组织来源的MSC，特别是骨髓来源的MSC。
MSC来源的受试者
步骤a)中提供的MSC旨在其施用用于治疗缺血再灌注损伤之前进行预处理。因此，它们可以是自体的(即，它们源自待治疗的受试者的组织)或同种异体的(即，它们源自另一受试者的组织)。
在本发明的上下文中，优选步骤a)中提供的MSC是同种异体的并且之前已从健康受试者获得。
这允许克服个体差异，使得MSC在向患有缺血再灌注损伤的受试者施用之前的制备更加简单和更加快速。
可以在步骤a)之前从健康受试者中获得步骤a)中提供的MSC。然而，为了限制个体差异并尽快开始本发明的制备方法，优选使用之前分离的源自健康受试者的同种异体MSC库中的MSC。在该实施方案中，之前已经生成了源自健康受试者的分离的同种异体MSC的冷冻样本库，并且将其用作步骤a)中的MSC的来源。
MSC的分离
从上述各种组织中分离MSC的方法是本领域已知的。他们通常依赖于手术过程中从捐赠者采集的骨髓和脂肪组织的新鲜样本。
当从骨髓(BM)开始时，合适的操作方案可如下(Djouad,F.,Bony,C.,T.等人，Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells.Arthritis Res Ther 7,R1304(2005))：
将BM抽吸物重悬于培养基中，在环境温度下以150至300×g(优选约200×g)离心5至15分钟(优选约10分钟)。然后，将细胞以4×104至6×104个细胞/cm2(优选约5×104个细胞/cm2)的密度铺在α-MEM中，其补充有5至15％(优选约10％)的胎牛血清、1至10ng/mL(优选1ng/mL)的碱性成纤维细胞生长因子、抗生素(通常是青霉素和链霉素)。在汇合时，将细胞分离，随后以500至1,500个细胞/cm2(优选约1,000个细胞/cm2)的密度重新铺板。第2代和第7代之间的贴壁细胞构成了分离的BM来源的MSC。
当从人BM中分离人MSC时，优选的操作方案公布在Djouad,F.,Bony,C.,T.等人，Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells.Arthritis Res Ther 7,R1304(2005)。
当从脂肪组织开始时，合适的操作方案可如下(Maumus M,Manferdini C,等人，Adipose mesenchymal stem cells protect chondrocytes from degenerationassociated with osteoarthritis.Stem Cell Res.2013年9月；11(2)：834-44.)：
将脂肪组织消化并离心(以150至300×g，优选约300×g，离心5至15分钟，优选约10分钟)。收集间质血管部分，以3000至600个细胞/cm2(优选约4000个细胞/cm2)的初始密度接种在补充有抗生素(通常为青霉素和链霉素)、谷氨酰胺和5％至15％(优选约10％)的胎牛血清(FCS)的αMEM中。在24小时至48小时(优选约24小时)后，用盐水溶液(优选PBS)洗涤培养物两次。5至10天(优选约1周)后，将细胞分离，以1000至3000个细胞/cm2(优选约2000个细胞/cm2)扩增，直到它们达到亚汇合。
在本领域中公开了用于从以下分离MSC的合适的操作方案：牙组织(Huang GT,Gronthos S,Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.thosefrom other sources:Their biology and role in regenerative medicine.J DentRes2009；88:792–806)，唾液腺(Rotter N,Oder J,Schlenke P,Lindner U,Bohrnsen F,Kramer J,Rohwedel J,Huss R,€Brandau S,Wollenberg B.Isolation andcharacterization of adult stem cells from human salivary glands.Stem CellsDev 2008；17:509–518)，以及围产期组织，如胎盘、脐带组织(Wharton’s Jelly)或羊水(Raynaud C,Maleki M,Lis R,Ahmed B,Al-Azwani I,Malek J,Safadi F,RafiiA.Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from humanplacenta and fetal membrane and their response to osteoactivinstimulation.Stem Cells Int 2012；2012:658356；Wang HS,Hung SC,Peng ST,Huang CC,Wei HM,Guo YJ,Fu YS,Lai MC,Chen CC.Mesenchymal stem cells in the Wharton’sjelly of the human umbilical cord.Stem Cells 2004；22:1330–1337；Hou T,Xu J,WuX,Xie Z,Luo F,Zhang Z,Zeng L.Umbilical cord Wharton’s Jelly:a new potentialcell source of mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering.TissueEng Part A 2009；15:2325–2334；Kita K,Gauglitz GG,Phan TT,Herndon DN,JeschkeMG.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.Stem Cells Dev 2010；19：491-502)。
步骤b)
在步骤b)中，在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC。
MSC的接种
将步骤a)中提供的MSC接种到包含培养基的培养容器中。
由于MSC是贴壁细胞，因此优选将它们接种在适合贴壁细胞培养的培养容器中，例如由Corning或Falcon供应商提供的75cm2烧瓶。
MSC的合适接种密度为60％至80％汇合，即3000至10000个细胞/cm2，优选3000至7000个细胞/cm2，4000至6000个细胞/cm2，更优选约5,000个细胞/cm2(Bouffi C、Bony C等人，IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits localinflammation in experimental arthritis.PLoS One.2010年12月7日；5(12):e14247)。
培养基
步骤b)中使用的培养基可以是任何适合维持MSC的培养基。此类培养基包括补充有胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、抗生素(通常是青霉素和链霉素)和人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的基本必需培养基(MEM)-α。
在一个实施方案中，步骤b)的培养基可以是补充有5-15％(优选10％)的胎牛血清、1至5mM(优选2mM)的谷氨酰胺、50至200U/mL(优选100U/mL)的青霉素、50至200mg/mL(优选100mg/mL)的链霉素以及1至5ng/mL(优选2ng/mL)的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的基本必需培养基(MEM)-α。
PPARβ/δ激动剂
实施例2和3中提供的数据表明，当用于预处理的操作方案时，几种不同的PPARβ/δ激动剂能够显著改善MSC的心脏保护特性。另外，由于根据本发明的制备方法在步骤c)中通过去除培养基和洗涤经PPARβ/δ激动剂处理的MSC，消除了PPARβ/δ激动剂，因此即使是已被证明在体内施用时会增加有害影响风险(如PPARβ/δ激动剂GW501516的癌症风险)的PPARβ/δ激动剂也可使用，因为PPARβ/δ激动剂不会被施用至受试者。
因此，任何PPARβ/δ激动剂都可以用于根据本发明的制备方法中。
已知的PPARβ/δ激动剂包括下表1中呈现的化合物，如公开在Takada I,MakishimaM.Peroxisome proliferator-activated receptor agonists and antagonists:apatent review(2014年至今)。Expert Opin Ther Pat.2020年1月；30(1):1-13(特别参见该文献图1中的化合物3至5，以及图3中的化合物14至20)：
表1.可以在步骤b)中使用的已知的PPARβ/δ激动剂。
/>
提议作为可用于本发明上下文中的PPARβ/δ激动剂的其他化合物公开于US9487493B2、US9695137B2、US2017304255A1、US2018305403A1和WO2017180818A1，所有这些均通过引用并入本文。
步骤b)中使用的PPARβ/δ激动剂因此可以选自任何PPARβ/δ激动剂，特别是上表1中公开的那些，优选选自GW0742、GW501516、L165041、MBX-8025和KD-3010。在一个特别优选的实施方案中，步骤b)中使用的PPARβ/δ激动剂选自GW0742和GW501516。
步骤b)中使用的PPARβ/δ激动剂的浓度将根据所选择的具体PPARβ/δ激动剂及其对PPARβ/δ的亲和力进行调整。然而，基于实施例2和3中获得的数据，步骤b)的培养基中PPARβ/δ激动剂(特别是化合物GW0742和GW501516)的浓度优选为0.001至10μM，更优选为0.01μM至10μM，更优选0.05μM至5μM，最优选0.1μM至1μM。
持续时间
实施例2和3中呈现的数据表明，用PPARβ/δ激动剂对MSC进行短暂(24小时)预处理足以显著改善其心脏保护特性。
因此，步骤b)的持续时间优选在12小时至72小时之间，优选在18小时至48小时之间，更优选在20小时至30小时之间，如24小时。
缺少用于转导MSC的病毒载体
与WO2014/015318中公开的相反，使用根据本发明的制备方法制备的MSC优选不使用通过表达异源基因的载体(特别是病毒载体，尤其是逆转录病毒载体)的转导进行遗传修饰。
因此，步骤b)的培养基优选不含有用于转导MSC的病毒载体。
步骤c)
在步骤c)中，除去培养基并洗涤MSC。
此步骤非常重要，因为它可以消除用于预处理MSC的PPARβ/δ激动剂。结果，使用根据本发明的制备方法获得的预处理的MSC组合物不含有或仅含有痕量水平的步骤b)中使用的PPARβ/δ激动剂。这避免了与PPARβ/δ激动剂的体内施用可能相关的任何有害影响。
由于MSC是贴壁细胞，因此可以通过丢弃或吸出培养基来容易地去除培养基。
然后通过添加洗涤溶液洗涤MSC，并用与处理步骤b)的培养基类似的方法除去所述洗涤溶液。洗涤溶液不包含PPARβ/δ激动剂，并且优选选自盐水缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，MEM)。洗涤步骤(即，添加洗涤溶液并将其除去)可以任选地重复(即，可以存在多于一个洗涤步骤，例如可以存在2或3个步骤洗涤)，但是通常仅一个洗涤步骤就足以获得不包含或仅包含痕量PPARβ/δ激动剂的组合物。
步骤d)
在步骤d)中，将MSC收集在药学上可接受的载体中，其不包含PPARβ/δ激动剂。
所述药学上可接受的载体是与血液等渗的盐水溶液，可以尤其地选自氯化钠在水中的等渗溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)1×和生理血清。还可以将以下化合物添加到与血液等渗的盐水溶液中：
·肝素，优选浓度为1至10U/mL，因为在兔的IR损伤模型中描述肝素提高了细胞疗法的疗效(Ghadrdoost B,Khoshravesh R,等人，Heparin Enhances the Effects ofMesenchymal Stem Cell Transplantation in a Rabbit Model of Acute MyocardialInfarction.Niger J Physiol Sci.2018年6月30日；33(1):9-15)，和/或
·人血清(Janssens S,Dubois C,等人，Autologous bone marrow-derivedstem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardialinfarction:double-blind,randomised controlled trial.Lancet.2006年1月14日；367(9505)：113-21)，或人血清白蛋白(Chullikana A、Majumdar AS、Gottipamula S,等人，Randomized,double-blind,phase I/II study of intravenous allogeneicmesenchymal stromal cells in acute myocardial infarction.Cytotherapy.2015年3月；17(3):250-261)，优选浓度为1至10％(v/v)。
由于MSC是贴壁细胞，因此其收集包括将它们从培养容器中分离。这可以通过将它们暴露于胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA或PBS-EDTA来完成。
然后，用于收集MSC的药学上可接受的载体的体积，根据以下进行选择：
·培养容器中存在的MSC总数，以及
·MSC所需的最终浓度，其本身取决于适合根据所选施用途径进行施用的液体体积。
例如，当预处理的MSC旨在用于静脉内施用时，可以施用多至150mL(特别是30至150mL)的体积，可以使用的药学上可接受的载体中的MSC的浓度为102至108个MSC细胞，优选103至107个MSC细胞/mL，特别是在心肌缺血再灌注损伤的治疗中。
当预处理的MSC旨在用于冠状动脉内施用时，可以施用多至10mL(特别是2至10mL)的体积，可以使用的药学上可接受的载体中的MSC的浓度为106至1010个MSC细胞/mL之间，特别是在心肌缺血再灌注损伤的治疗中。
任选的冷冻步骤e)
根据本发明的制备方法可以任选地还包括步骤e)，其中PPARβ/δ引发的MSC在使用前冷冻保存。
在这种情况下，PPARβ/δ引发的MSC组合物优选地使用特定的MSC冷冻溶液(尤其是多电解质注射溶液，如可以从不同供应商获得的Plasma-lyte A，优选含有冷冻保存剂，如人血清白蛋白(优选3-7％)和/或二甲亚砜(优选8-12％))根据供应商的要求进行冷冻，并在-196℃的温度下储存在液氮中。
冷冻的PPARβ/δ引发的MSC组合物可以用于产生冷冻的PPARβ/δ引发的MSC样本的库。
包含通过上述根据本发明的体外制备方法获得的PPARβ/δ引发的MSC的组合物
本发明还涉及包含PPARβ/δ引发的间充质干细胞(MSC)的组合物，其中所述组合物是通过根据本发明的体外方法获得的。
“PPARβ/δ引发的MSC”在本文中意指已经使用根据本发明的方法通过PPARβ/δ处理的MSC。
因此，根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物具有以下特征：
·其包含经过PPARβ/δ激动剂短暂引发的MSC，具有改善的心脏保护特性，
·其不包含或仅包含痕量的PPARβ/δ激动剂。
PPARβ/δ引发的MSC在不包含PPARβ/δ激动剂的药学上可接受的载体中，所述载体是与血液等渗的盐水溶液，尤其可以选自氯化钠在水中的等渗溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)1×和生理血清。药学上可接受的载体中还可以存在以下化合物：
·肝素，优选浓度为1至10U/mL，因为在兔的IR损伤模型中描述了肝素提高了细胞疗法的疗效(Ghadrdoost B,Khoshravesh R,等人，Heparin Enhances the Effects ofMesenchymal Stem Cell Transplantation in a Rabbit Model of Acute MyocardialInfarction.Niger J Physiol Sci.2018年6月30日；33(1):9-15)，和/或
·人血清(Janssens S,Dubois C,等人，Autologous bone marrow-derivedstem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardialinfarction:double-blind,randomised controlled trial.Lancet.2006年1月14日；367(9505)：113-21)或人血清白蛋白(Chullikana A、Majumdar AS、Gottipamula S，等人，Randomized,double-blind,phase I/II study of intravenous allogeneicmesenchymal stromal cells in acute myocardial infarction.Cytotherapy.2015年3月；17(3):250-261)，优选浓度为1至10％(v/v)。
根据本发明的组合物优选含有治疗有效量的预处理的MSC。发明人发现，在小鼠模型中，再灌注80至150mL体积的包含预处理的MSC的组合物(浓度为2.5×103个MSC细胞/mL，对应于3.105个细胞PPARβ/δ引发的MSC的总数)，其与双倍数量的初始(即非PPARβ/δ引发的)MSC一样有效。因此，PPARβ/δ引发的MSC的治疗有效量应约为初始MSC的治疗有效量的一半。
在人类中，已发现在各种情况下(MSC来源、施用途径……)对治疗缺血再灌注损伤具有一定功效的初始MSC数量为107至1011个细胞。当使用PPARβ/δ引发的MSC时，治疗有效量应较低，尤其可以为5×106至5×1010个细胞。
取决于使用所选施用途径时可施用的体积，将为根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物选择合适的PPARβ/δ引发的MSC的体积和浓度，如上文根据本发明的方法的步骤d)中所公开的。
如上文关于根据本发明的制备方法的步骤a)所解释的，虽然组合物的MSC可以是自体的或同种异体的，但其优选是同种异体的，优选从健康受试者获得。
根据本发明的组合物优选是药物组合物。
根据本发明的组合物的治疗用途
发明人出乎意料地表明，根据本发明的组合物包含PPARβ/δ引发的MSC，其在心肌缺血再灌注损伤的情况下表现出改善的心脏保护作用，因此当单独施用、而非同时施用PPARβ/δ激动剂时能有效地治疗或预防心肌缺血再灌注损伤。
因此，本发明还涉及根据本发明的组合物用于治疗或预防方法中，其中所述治疗或预防方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
具体地，本发明涉及根据本发明的组合物用于在需要其的受试者中治疗或预防缺血再灌注损伤的方法中，其中所述治疗或预防方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
本发明还涉及根据本发明的组合物在制备旨在用于治疗或预防缺血再灌注损伤的药物中的用途，其中所述治疗或预防不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
本发明还涉及根据本发明的组合物在治疗或预防缺血再灌注损伤中的用途，其中所述治疗或预防不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
本发明还涉及用于在需要其的受试者中治疗或预防缺血再灌注损伤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的组合物。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指在发生缺血再灌注损伤后，当施用根据本发明的组合物时受试者的临床或生物学标准的改善。例如，“治疗”或“治疗”可对应于与施用根据本发明的组合物之前相比，感兴趣器官中细胞凋亡和/或炎症的减少。
“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指当在缺血发生之后，但在感兴趣的器官再灌注之前或期间(即发生缺血再灌注损伤之前)，当施用根据本发明的组合物时，预防或推迟与缺血再灌注损伤相关的临床或生物学标准的发作或降低其强度的事实。例如，“预防”或“预防”可对应于相较于在类似的再灌注情况中通常观察到的情况，在器官再灌注后在感兴趣的器官中炎症和/或细胞凋亡不存在或发生较弱。
“治疗有效量”对应于向受试者赋予治疗或预防益处所必需的量，如上文所定义。
缺血再灌注损伤
“缺血再灌注损伤”或“IR损伤”或“IRI”可以被定义为在之前缺血的组织中血流恢复后，细胞功能障碍和死亡的矛盾加剧。虽然重建血流对于挽救缺血组织至关重要，但再灌注本身却会矛盾地导致进一步的损伤，威胁器官的功能和活力。IRI发生在多种器官中，包括心脏、肺、肾、肠道、骨骼肌和大脑，不仅可以涉及缺血器官本身，还可以诱发远处器官的系统性损伤，可能导致多系统器官衰竭。
因此，根据本发明的组合物可以尤其用于治疗心脏、肺、肾、肠、骨骼肌或脑的缺血再灌注损伤。
根据发明人在心肌缺血再灌注损伤中获得的数据，其将优选用于心脏(特别是心肌)的缺血再灌注损伤。
缺血再灌注损伤是重要问题的另一种情况是在器官移植(如肾移植)期间，因此本发明的组合物也可以优选用于治疗器官移植后、特别是肾移植后的缺血再灌注损伤。
施用时间表
可以使用任何合适的施用时间表。
施用途径
特别地，根据所治疗的缺血再灌注损伤的类型，可以使用多种施用途径。
在心脏(特别是心肌)缺血再灌注损伤的情况下，合适的施用途径包括冠状动脉内(通过血管内方式)、静脉内和心肌内(过开胸手术方法)或经心内膜(通过血管内方式)。
使用血管内装置的冠状动脉内施用是特别优选的，因为它可以在冠状动脉造影期间进行，在再灌注时或之后进行，冠状动脉造影是在患有心肌梗塞的患者中定期进行的相对软性干预。
静脉内施用不太优选，因为全身施用意味着所施用的PPARβ/δ引发的MSC将散布在各个器官中，并且其中许多MSC可能滞留在非靶器官(如肺)中。然而，在一些临床操作方案中，使用初始MSC的静脉施用已在心肌梗塞后的患者中使用(参见Kobayashi K,SuzukiK.Mesenchymal Stem/Stromal Cell-Based Therapy for Heart Failure-What Is theBest Source？Circ J.2018年8月24；82(9):2222-2232)，因此也可用于本发明的上下文中。
在一些临床操作方案中，使用初始MSC的心肌内施用也在心肌梗塞后的患者中使用(参见Kobayashi K,Suzuki K.Mesenchymal Stem/Stromal Cell-Based Therapy forHeart Failure-What Is the Best Source？Circ J.2018年8月24日；82(9):2222-2232)，因此也可用于本发明的上下文中。虽然心肌内施用可以在开胸手术的情况下，或使用血管内装置进行，但优选使用血管内装置进行心肌内施用。
在器官(尤其是肾脏)移植后出现缺血再灌注损伤的情况下，合适的施用途径包括通过血管内装置向最近的动脉(肾移植情况下为肾内动脉)施用。
MSC剂量
使用治疗有效剂量的根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物。
如上在涉及根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物的部分中所解释的，治疗有效剂量的范围将取决于各种参数，包括施用途径。然而，合适的剂量范围是在5×106至5×1010个PPARβ/δ引发的MSC之间，特别是当通过冠状动脉内施用进行施用时。
施用的时间
在缺血再灌注损伤的情况下，快速的治疗干预至关重要。特别是在AMI(急性心肌梗塞)患者中，应在AMI后1周内进行MSC的施用，以使其效率。
因此，在优选的实施方案中，根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物在缺血再灌注损伤发生的1周内施用，优选在6天内、5天内、4天内，更优选在3天内、2天内或者甚至在24小时内施用。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的PPARβ/δ引发的MSC组合物在缺血器官的再灌注期间施用，以预防缺血再灌注损伤。
在本发明的背景下，通过短暂的PPARβ/δ引发的MSC，使得对缺血或缺血再灌注损伤的这种快速反应成为可能。
当使用同种异体MSC时，通过使用之前生成的MSC库的样本进一步使其成为可能。在一个实施方案中，该库含有初始MSC的样本，随时可使用根据本发明的快速制备方法进行PPARβ/δ引发，从而允许在受试者被收入(taken in charge)后2天内施用PPARβ/δ引发的MSC。在另一个实施方案中，该库含有已经由PPARβ/δ引发的MSC的样本，允许在受试者被收入后的数小时内(如，24小时内、18小时内、12小时内、10小时内、8小时内、或甚至6小时内)施用。
以下实施例仅旨在说明本发明。
实施例
实施例1：PPARβ/δ是间充质干细胞在心肌缺血再灌注损伤中发挥心脏保护作用所必需的
心肌梗塞在全球死亡率中居首位。由于成人心脏无法再生，纤维化会扩大以补偿梗塞后收缩组织的损失，导致心脏重塑和心力衰竭。成体间充质干细胞(MSC)的再生特性及其安全性和有效性已在临床前模型中得到证实。然而，在临床试验中，它们的有益效果存在争议。在关节炎实验模型中，源自PPARβ/δ敲除(KO MSC)小鼠的MSC已被证明比源自野生型小鼠的MSC提供更强的治疗效果。
本研究的目的是比较KO MSC细胞和野生型MSC相较于未经处理的对照条件(IR)对缺血再灌注损伤的治疗效果。
材料和方法
动物饲养和护理
实验按照1986年11月欧洲共同体理事会指令在C57BL/6J小鼠(Charles Riverlaboratory)上进行，符合美国国立卫生研究院出版的《the Guide for the Care and Useof Laboratory Animals》(NIH出版，第8版，2011)。所有小鼠均在研究所的动物设施中维持在环境控制条件下(22±2℃，12小时光照/12小时黑暗循环)。所有离体操作方案均经动物研究伦理委员会批准(协议#A34-172-41)。
离体实验
雄性小鼠腹膜内注射(IP)氯胺酮(14mg/kg，Merial)、赛拉嗪(14mg/kg，/>Bayer)，然后注射戊巴比妥(IP；76.6mg/kg；Sanofi-Aventis)进行麻醉。麻醉小鼠接受250U肝素(IP)以防止血凝块形成。胸骨切开术后，切除心脏，通过升主动脉插管，快速安装在Langendorff系统上。在恒定压力和温度(37℃)下灌注预热的Tyrode溶液(NaCl140mM、KCl 5.4mM、MgCl 1mM、Hepes 5mM、葡萄糖5.5mM、CaCl2 1.8mM、pH 7.4)。
缺血再灌注操作方案(IR)
在Langendorff系统上，心脏用预热的Tyrode溶液灌注15分钟(稳定)。通过在30分钟内停止灌注液流(“无液流”)，获得整体缺血。通过恢复液流实现再灌注步骤(60分钟)。再灌注期间应用MSC处理(含有MSC的Tyrode溶液)。仅使用Tyrode获得对照条件(IR)。在再灌注操作方案期间(再灌注后5分钟、30分钟和60分钟)，收集冠状动脉流出物，储存在-80℃下以供将来的实验。
梗塞大小测量
在IR操作方案结束时，将心脏解剖出来。将左心室包含在琼脂(4％)中，用振动切片机横向切片(1mm)。为显示出组织活力，将切片与2,3,5-氯化三苯基四唑溶液(TTC染料)在37℃下孵育15分钟。经过固定步骤(4％多聚甲醛，48小时)后，对每个切片的每一片进行拍照。使用ImageJ软件通过平面测量来量化梗塞面积。
MSC培养
小鼠MSC的分离、扩增和表征按照之前所述进行(Scholtysek,C.等人，PPARβ/δgoverns Wnt signaling and bone turnover.NatMed 19,608-613,doi:10.1038/nm.3146(2013))。简而言之，从由Béatrice Desvergne提供的Ppard fl/fl sox2cretg PPARβ/δ缺陷小鼠(称为PPARβ/δ-/-MSC)及其野生型Ppard fl/+同窝小鼠(称为PPARβ/δ+/+MSC)的长骨中冲洗出骨髓(BM)(Scholtysek,C.等人，PPARβ/δgoverns Wnt signaling and boneturnover.Nat Med 19,608-613,doi:10.1038/nm.3146(2013))。细胞以0.5×106个细胞/cm2的密度培养在基本必需培养基(MEM)-α中，其含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。之前已对MSC的表型和功能进行了表征(Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directs the therapeuticpotential of mesenchymal stem cells in arthritis.Annals of the rheumaticdiseases,doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696(2016))。PPARβ/δ+/+MSC与5μM的PPARβ/δ拮抗剂GSK0660预孵育24小时。
用CM-DiI标记MSC。
荧光细胞示踪剂CM-DiI(Molecular Probes)的原液以1μg/μL的浓度复溶在二甲基亚砜(DMSO)中。收集MSC，以107个细胞/10μg CM-DiI的浓度悬浮在5mL的PBS中。将细胞在37℃中孵育5分钟，然后在4℃中在黑暗中孵育15分钟。然后通过在300g下离心5分钟，以及在PBS中洗涤2次来去除未掺入的荧光染料。将标记的细胞重悬于PBS中并维持在4℃，然后注射到心肌中。
细胞因子定量。
对于细胞因子定量，在基础条件(t0)下、稳定10分钟后以及在再灌注60分钟后(IR60)的操作方案结束时，收集来自被灌注的心脏的流出物。将不同的流出物储存在-80℃，直到根据制造商的操作方案在“Plateforme de Protéomique Clinique deMontpellier”上使用Meso Scale Discovery(MSD)V-Plex Plus Proinflammatory Panel1(小鼠)试剂盒进行测定。该组包括IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO(CXCL1)、IL-10、IL-12p70和TNFα。如果样品中的特定细胞因子浓度低于检测限，即细胞因子浓度与背景噪声无法区分，则认为样品的该细胞因子呈阴性。
免疫化学
离体实验结束时，将左心室(LV)固定在4％-PFA中，并包埋在石蜡中。每个左心室从心尖到基部被切开(每150μm切4μm切片)。将石蜡包埋切片脱蜡，然后通过酒精梯度再水化。LV切片与一抗一起孵育：抗F4/80(1：100；大鼠单克隆；Abcam)、抗CD68单克隆抗体(FA-11；Invitrogen)、CX3CR1抗体(1H14L7；Thermofischer Scientific)和抗α肌动蛋白(1：100，小鼠单克隆；Sigma-Aldrich)。细胞核用赫斯特染料(Life Technologies SAS)染色，内皮细胞用异凝集素B4(FITC偶联物；Sigma-Aldrich)染色。一抗孵育后，将切片在PBS中洗涤，与二抗(1：2,000，Jackson ImmunoRes Laboratories,Inc.)一起孵育(3小时)。将一抗和二抗在含有3％BSA和0.1％Triton X100的PBS中稀释。将染色切片安装在Mowiol(Biovalley)中。使用Zeiss Axioimager Z3荧光显微镜获得图像，并使用ImageJ和AdobePhotoshop进行分析以准备最终图像。
统计分析
使用GraphPad Prism 8软件，使用非参数Mann-Whitney(两组)和Kruskal-Wallis(多重比较)对以平均值±SD值表示的数据进行比较。图表显示平均值±标准差(SD)。P值<0.05(*)、P<0.01(**)、P<0.001(***)和p<0.0001(****)被认为具有统计显著性。使用Graph-Pad PrismTM软件(Graphpad)进行分析和图形表示。
结果
在经历离体缺血再灌注损伤的分离的灌注心脏中诱导促炎反应
在这项研究中，我们开发了一种整体缺血之后再灌注的离体模型(IR操作方案)，以评价MSC的治疗效果。将分离的心脏在Langendorff系统上安装并灌注，进行30分钟的整体缺血(无液流)，然后进行60分钟的再灌注，在该阶段期间施用细胞(参见图1A中的操作方案)。研究的第一部分致力于描述我们模型的特征。心肌缺血再灌注损伤后心脏的特征是梗塞大小平均值为56.4±10.3，以左心室百分比表示(图1B)。免疫组织学允许证明定位于心肌中的巨噬细胞位于心肌层厚度处(数据未显示)。
因此，我们想知道，IR损伤的诱导和心肌中巨噬细胞的存在是否与稳定期间收集的基础条件(Basal)相比，再灌注开始后60分钟收集的冠状动脉流出物中促炎细胞因子的过量释放有关。在使用Meso Scale Discovery VPlex Plus Proinflammatory定量的10种细胞因子中，其中包括IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70的7种细胞因子未纳入统计分析，因为在过多样品中存在检测不到的水平。与基础条件(在10分钟稳定期收集，basal)相比，在IR损伤后(缺血和再灌注60分钟后)，在心脏冠状动脉流出物中，三种细胞因子TNFα、KC/GRO(CXCL1)和IL-6表现出非常显著的增加(图1C)。总而言之，这些结果表明，经离体缺血30分钟然后再灌注1小时，C57Bl6小鼠心脏的心肌IR损伤与浸泡(bathe)在发炎心肌中的巨噬细胞的存在有关。
在离体的整体缺血模型的再灌注过程中，MSC发挥了有效的心脏保护作用。
为了减少IR心肌的炎症，从而减少梗塞大小，我们依赖于两种公认的心脏保护策略，我们首次在离体模型中比较了这两种策略：基于缺血后PostC和基于MSC的疗法。为此，对于经历30分钟的整体缺血的分离的心脏，在其再灌注期间施用MSC，如图2A中所示的操作方案所述。测试了不同浓度的MSC的灌注溶液(图2B)。使用不同剂量的MSC建立剂量反应曲线，结果显示5,000个细胞/mL(6.105个细胞/心脏)和20,000个细胞/mL(24.105个细胞/心脏)诱导心脏保护作用(分别是，对于MSC 5,000为17.29±6,84,n＝6vs对于IR为56.39±10.33,n＝12；p＝0.0009，以及对于MSC 20,000是17.04±4.07；n＝6vs 56.39±10.33,n＝12；p＝0.0009)，与之相反，2,500个细胞/mL(3.105个细胞/心脏)并没有提供显著的有益效果(对于MSC 2,500为34.1±13.93,n＝6vs对于IR为56.39±10.33,n＝12；p＝0.2238)。我们研究的所有实验均选择5,000个细胞/mL的浓度，因为这是在离体小鼠模型中提供最大心脏保护的最低浓度。更进一步，我们证实了再灌注5000个细胞/mL的MSC(6.105个细胞/心脏)与缺血的PostC(实验中作为阳性对照)在相同程度上减少了梗塞大小(对于PostC为14.04±4.32，n＝8vs对于MSC为17.29±6.84，n＝6，p>0.99；图2C)。免疫组织学分析显示，再灌注1小时后，离体灌注的MSC位于冠状动脉微血管中(数据未显示)。总而言之，这些结果证实6.105MSC/心脏与缺血后PostC具有相同的治疗效果，缺血后PostC是AMI期间心脏保护的金标准策略。
缺血后PostC和MSC施用的有效心脏保护作用都与受损心肌内促炎细胞因子的减 少有关
为了确定缺血后PostC和MSC施用对IR损伤的有益作用是否与免疫反应的调节相关，我们对再灌注开始后15、30和60分钟收集的冠状动脉流出物中的促炎细胞因子进行了定量(图3A)。使用MSD方法定量的10种细胞因子中，样本中未检测到7种细胞因子，包括IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70。然而，在经历缺血后PostC或MSC施用的心脏的冠状动脉流出物中，TNFα(图3B)、CXCL1(KC/GRO)(图3C)和IL-6(图3D)的水平显著降低。该结果表明，根据冠状动脉流出物中促炎细胞因子的定量评估，PostC和MSC的保护作用与有效的抗炎作用相关。
PPARβ/δ参与MSC介导的针对IR损伤的心脏保护作用。
最近，我们在关节炎实验中证明，PPARβ/δ对于MSC免疫调节和治疗功能至关重要(Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directs the therapeutic potential ofmesenchymal stem cells in arthritis.Annals of the Rheumatic Diseases2016；75:2166-2174)。然而，PPARβ/δ对MSC心脏保护活性的作用以及PPARβ/δ对发炎心肌中MSC免疫调节特性的相关性尚未得到解决。为了确定PPARβ/δ是否对MSC心脏保护特性至关重要，我们比较了从PPARβ/δ-/-缺陷小鼠(KO MSC)中分离的MSC与从PPARβ/δ+/+对照同窝小鼠中获得的MSC(MSC)的效果。在再灌注过程中，用含有MSC的溶液以6.105个细胞/心脏的最佳剂量对分离的心脏进行灌注(参见操作方案图4A)。在这些条件下，当在缺血性损伤后分离的心脏中灌注KO MSC时，野生型MSC诱导的梗塞大小的急剧减小(对于MSC为24.1±11.8，n＝9，vs对于IR为56.4±10.3，n＝12；p**＝0.001)消失(对于KO MSC为48.4±25.4，n＝13vs对于IR为56.4±10.3，n＝12；pns＝0.75，以及对于KO MSC为48.4±25.4，n＝13vs对于MSC为24.1±11.8，n＝9；p*＝0.029)(图4B)。为了确定在PPARβ/δ敲除后，MSC失去治疗作用是否与MSC失去减轻梗塞心肌的炎症的能力有关，我们对再灌注开始后60分钟收集的冠状动脉流出物中的促炎细胞因子进行了定量。细胞因子的MSD定量显示，在MSC处理的和未处理的心脏的冠状动脉流出物中，TNFα浓度未有任何变化。然而，我们证明了，在遭受缺血性损伤的心脏中MSC具有抗炎作用，这表现在，在再灌注时收集的冠状动脉流出物中CXCL1和IL-6浓度显著下降(对于CXCL1：IR为16.61pg/ml±10.53，n＝10vs对于MSC为2.56pg/ml±3.79，n＝10；p**＝0.0017(图4D)，以及对于IL-6：对于IR为21.83pg/ml±11.08，n＝10vs对MSC为5.43pg/ml±3.02，n＝10；p**＝0.004(图4E))。值得注意的是，MSC中的PPARβ/δ敲除并没有改变其抗炎潜力，如在再灌注时收集的冠状动脉流出物中的CXCL1浓度保持不变所示(对于MSC为2.56pg/ml±3.79，n＝10vs对于KO MSC为3.73pg/ml±1.65，n＝8，pns＝0.28；图4D)和IL-6(对于MSC为5.43pg/ml±3.02，n＝10vs对于KO MSC为7.65pg/ml±5.04，n＝8，pns>0.99；图4E)。
讨论和结论
证实了该研究中使用的整体缺血(30分钟)、然后60分钟再灌注的离体操作方案诱导了促炎症反应，其评估为经过60分钟再灌注的冠状动脉流出物中的TNFα、IL-6和CXCL1的水平增加，之后我们测试了PPARβ/δ对MSC免疫调节和治疗功能的作用。首先，我们确定了MSC的最佳剂量(6.105个细胞/心脏)，其能够以最小浓度的细胞在离体小鼠模型中提供显著的心脏保护作用。值得注意的是，在选择的该剂量的MSC下，我们观察到的心脏保护作用与在我们的研究中作为阳性对照的缺血后调理(PostC)类似。事实上，两种治疗方法都允许减少IR损伤的促炎症反应，并以相同的疗效减少梗塞大小。此外，这项研究显示，MSC的心脏保护特性是PPARβ/δ依赖性的，与其对冠状动脉流出物中TNFα、CXCL1和IL-6释放的抗炎症作用形成鲜明对比。
尽管再灌注疗法对AMI患者具有有益的效果，但会诱发局部和全身性炎症，称为无菌炎症，其会强化在AMI后为清除坏死细胞和修复梗塞心肌而引发的初始炎症反应。为了开发和评价创新的治疗方法，我们设计了一种离体模型，其提供了强烈的IR损伤，其通过如已在体内报道的，梗塞大小达56％(以左心室的百分比表示)以及冠状动脉流出物中释放显著水平的促炎细胞因子来评价。
这种炎症反应是改善心肌梗塞后临床的潜在治疗目标，因为它在确定梗塞大小和随后的左心室重塑中起着至关重要的作用。为了保护心肌，已经测试了多种间接或直接针对AMI后促炎症反应的治疗策略。
缺血后调理(PostC)被认为是针对IR损伤的心脏保护的金标准，据报道可以激活无数的细胞内级联反应，从而抑制调节的细胞死亡和抗炎症反应，以便在再灌注一小时后诱导强烈的心脏保护作用(Roubille,F.等人，Delayed postconditioning in the mouseheart in vivo.Circulation 124,1330-1336,doi:CIRCULATIONAHA.111.031864[pii]10.1161/CIRCULATIONAHA.111.031864(2011))。在本研究中使用的IR损伤的离体模型中，相较于IR，PostC心脏保护策略将梗塞大小减少了75.1％(PostC vs IR，p*)，以及将在分离的心脏的冠状动脉流出物中的TNFα、IL-6和CXCL1水平分别减少了71.7％、71.8％和91.4％。总而言之，这些结果表明炎症反应的调节与缺血后PostC介导的IR损伤的心脏保护作用相关。
在此背景下，针对靶向动物模型中的炎症细胞因子和趋化因子的策略进行了研究，在控制炎症方面取得了令人鼓舞的结果(Ong,S.B.等人，Inflammation followingacute myocardial infarction:Multiple players,dynamicroles,and noveltherapeutic opportunities.Pharmacol Ther 186,73-87,doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001(2018))。然而，在AMI患者中进行评价时，大多数治疗试验对减少梗塞大小或临床结果没有任何益处(参见Ong,S.B.等人的综述Inflammation followingacute myocardial infarction:Multiple players,dynamic roles,and noveltherapeutic opportunities.Pharmacol Ther 186,73-87,doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001(2018))。据报道，使用白介素-1的特异性抑制剂作为再灌注的辅助手段，使得NSTEMI患者的死亡人数显著增加(Morton,A.C.等人，The effect ofinterleukin-1receptor antagonist therapy on markers of inflammation in non-STelevation acute coronary syndromes:the MRC-ILA Heart Study.Eur Heart J 36,377-384,doi:10.1093/eurheartj/ehu272(2015))。此外，皮质类固醇或免疫抑制剂在临床试验中也显示出令人失望的结果(Ong,S.B.等人，Inflammation following acutemyocardial infarction:Multiple players,dynamicroles,and novel therapeuticopportunities.Pharmacol Ther 186,73-87,doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001(2018))，在急性MI后，人们对这种治疗方法提出质疑，表明炎症只是冰山一角。
因此，包括基于MSC的疗法在内的更多综合性疗法已成为治疗多发性缺血性心脏病和恢复心脏功能的有前途的方法。事实上，考虑到MSC的多种效应，包括其免疫调节、抗纤维化和抗细胞凋亡的能力，基于MSC的疗法可以对抗AMI的三个主要致病轴，因此被认为是这一尚未满足医疗需求的不治之症的一个突破口。安全性和有效性分别通过不良事件评估、左心室射血分数(LVEF)的改善和死亡率进行评价。尽管获得的结果具有重要的异质性，但MSC注射似乎与急性不良事件无关，并且诱导患者LVEF的改善。据报道死亡率没有显著差异。对其他感兴趣结果的研究很少，从而限制了结论的得出。在我们的研究中，MSC发挥了与PostC所提供的相似的心脏保护作用，PostC在我们的研究中被视为阳性对照。事实上，使用MSC细胞疗法，梗塞大小减少了69.3％(PostC vs MSC，p＝ns)。此外，MSC(6.105个细胞/心脏)提供很强的抗炎症作用，如通过TNFα、IL-6和CXCL1的MSD定量所评估的，其分别降低了35％、75.1％和84.6％。我们的结果与AMI的小鼠模型中报道的数据一致，该小鼠模型表明MI诱导2天后注射MSC，降低了在循环和梗塞心脏中巨噬细胞/单核细胞(包括促炎巨噬细胞)的频率，增加了抗炎症和修复巨噬细胞的百分比(F4/80+CD206+)(Ben-Mordechai,T.等人，Macrophage subpopulations are essential for infarct repair with andwithout stem cell therapy.J Am Coll Cardiol 62,1890-1901,doi:10.1016/j.jacc.2013.07.057(2013)；Dayan,V.等人Mesenchymal stromal cells mediate aswitch to alternatively activated monocytes/macrophages after acutemyocardial infarction.Basic Res Cardiol 106,1299-1310,doi:10.1007/s00395-011-0221-9(2011))。因此，基于MSC的疗法可以对抗AMI的三个主要致病轴之一(即炎症)，增强这种免疫调节特性可以改善MSC在AMI中的治疗效果。事实上，在MI的大鼠模型中，与对照MSC相比，MSC中IL-33的过度表达改善了LVEF。过表达IL-33的MSC的这种增强疗效与其在体外促进巨噬细胞向抗炎症表型极化、以及在体内减少心脏炎症的能力较强有关(Chen,Y.等人，The enhanced effect and underlying mechanisms of mesenchymal stem cellswith IL-33overexpression on myocardial infarction.Stem Cell Res Ther 10,295,doi:10.1186/s13287-019-1392-9(2019))。在这种背景下，我们在本研究中测试了我们实验室之前描述的敲除了PPARβ/δ的MSC的治疗作用，相较于初始MSC，其显示出增强的在体外抑制T淋巴细胞增殖、以及在体内抑制关节炎发展和CIA进展的能力(Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cellsin arthritis.Annals of the rheumatic diseases,doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696(2016))。当用TNFα和IFNγ引发时，与其野生型对应的MSC相比，PPARβ/δ缺陷的MSC表达水平增加的MSC免疫抑制调节物，包括VCAM-1、ICAM-1和一氧化氮(NO)(Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stemcells in arthritis.Annals of the rheumatic diseases,doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696(2016))。
在本研究中，我们观察到，当注射到梗塞心肌中时，MSC中的PPARβ/δ敲除并没有改变其抗炎症特性。事实上，在IR操作方案之后在再灌注60分钟后，野生型和PPARβ/δKO MSC均显著降低了冠状动脉流出物中的促炎症细胞因子的浓度。因此，本文报道的PPARβ/δKOMSC在心肌缺血再灌注损伤中失去MSC的治疗效果，可能归因于MSC的其他功能受损，其对于AMI有益作用是关键的，或者通过促进MSC细胞凋亡来降低MSC的体内存活率。由于PPARβ/δ已被描述为促进了包括癌细胞和心肌细胞在内的多种细胞类型的存活率，因此试图预测MSC中的PPARβ/δ缺陷可能会影响MSC的存活率并降低MSC在体内注射后的移植(Palomer,X.,Barroso,E.,Zarei,M.,Botteri,G.&Vazquez-Carrera,M.PPARbeta/delta and lipidmetabolismin the heart.Biochim Biophys Acta 1861,1569-1578,doi:10.1016/j.bbalip.2016.01.019(2016)；Li,Y.J.等人，PPAR-delta promotes survival ofchronic lymphocytic leukemia cells in energetically unfavorableconditions.Leukemia 31,1905-1914,doi:10.1038/leu.2016.395(2017)；Wang,X.等人，PPAR-delta promotes survival of breast cancer cells in harsh metabolicconditions.Oncogenesis 5,e232,doi:10.1038/oncsis.2016.41(2016))。事实上，PPARβ/δ在血管细胞中的作用可保护其免于细胞凋亡，而当细胞缺少细胞质前列环素受体时，PPARβ/δ激活促进了细胞凋亡(Hatae,T.,等人，(2001)."Prostacyclin-dependent apoptosismediated by PPAR delta."JBiolChem 276(49):46260-46267)。在内皮细胞中，PPARβ/δ的抗细胞凋亡特性已被报道，其潜在机制与内皮14-3-3激活有关(Liou,J.Y.,等人(2006)."Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activatedreceptor-delta mediated 14-3-3upregulation."Arterioscler Thromb Vasc Biol 26(7):1481-1487；Brunelli,L.,等人(2007)."Peroxisome proliferator-activatedreceptor-delta upregulates 14-3-3epsilon in human endothelial cells viaCCAAT/enhancer binding protein-beta."Circ Res 100(5):e59-71)。同样在心肌细胞系H9c2中，据描述，选择性激动剂GW501516激活了PPARβ/δ受体，这保护了免受H2O2诱导的细胞死亡(Pesant,M.,等人(2006)."Peroxisome proliferator-activated receptor delta(PPARdelta)activation protects H9c2cardiomyoblasts from oxidative stress-induced apoptosis."Cardiovasc Res 69(2):440-449)。PPARβ/δ被MSC高度表达(Luz-Crawford,P.,等人(2016)."PPARbeta/delta directs the therapeutic potential ofmesenchymal stem cells in arthritis."Ann Rheum Dis 75(12):2166-2174)，但PPARβ/δ的C抗细胞凋亡和心脏保护特性从未被研究过。
总之，我们的研究表明，当PPARβ/δ受体缺乏时，MSC的心脏保护作用就会丧失，尽管其抗炎症作用仍然保持。这表明，增强MSC的免疫调节特性以提高其对AMI的有益效果，不应是克服III期临床试验不一致的唯一或主要方法(Jeong,H.等人，Mesenchymal StemCell Therapy for Ischemic Heart Disease:Systematic Review and Meta-analysis.International journal of stem cells,doi:10.15283/ijsc17061(2018)；Roncalli,J.等人，Intracoronary autologous mononucleated bone marrow cellinfusion for acute myocardial infarction:results of the randomizedmulticenter BONAMI trial.Eur Heart J 32,1748-1757,doi:10.1093/eurheartj/ehq455(2011))，但更确切地说，一旦施用至患者，应同时考虑其存活率的提高。
实施例2：过氧化物酶体增殖物激活的受体β/δ激动剂增强了间充质干细胞在心肌缺血再灌注损伤中的抗细胞凋亡和治疗特性
根据实施例1中使用KO MSC细胞获得的结果，测试了用PPARβ/δ激动剂预处理MSC对于MSC在心肌缺血再灌注损伤中的抗细胞凋亡和治疗特性的影响。
材料和方法
动物实验
所有实验均按照1986年11月欧洲共同体理事会指令在C57BL/6J小鼠(CharlesRiver laboratory)上进行，符合美国国立卫生研究院出版的《Guide for the Care andUse of Laboratory Animals》(NIH出版，第8版，2011)。
Langendorff离体研究
对C57Bl6雄性小鼠进行麻醉，首先肌肉注射麻醉剂混合物，包括氯胺酮(14mg/kg，Merial)和赛拉嗪(14mg/kg，/>Bayer)，然后注射戊巴比妥(76.6mg/kg；Sanofi-Aventis)。胸骨切开术后，切除心脏，快速通过主动脉插管，并安装在自制的Langendorff系统上。在压力和温度恒定(37℃)的Tyrode溶液中逆行灌注。
缺血再灌注操作方案
在Langendorff系统上，对心脏进行缺血再灌注(IR)操作方案，包括在15分钟的Tyrode灌注稳定期后，进行30分钟的无液流期以诱导整体缺血。再灌注是通过在60分钟内单独使用Tyrode溶液(IR对照组)，或在再灌注期间施用包含MSC细胞的Tyrode溶液以恢复灌注来实现的。在整体缺血结束时，通过应用包括3个周期的1分钟再灌注/1分钟缺血、随后是54分钟的再灌注的调理刺激来诱导缺血后调理。为了对基于MSC的细胞疗法进行离体评价，在60分钟再灌注阶段，在离体心脏中通过主动脉和冠状动脉血管逆行灌注了在80至150mL(平均120mL)的Tyrode溶液中制备的不同浓度(2500、5000和20000个细胞/mL)的MSC细胞。
梗塞大小评估
将LV横向切成1mm厚的切片，在1％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)溶液中于37℃孵育15分钟。在4％多聚甲醛-PBS溶液中固定后，对切片进行称重，并对每一侧进行拍照(Olympus相机)。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)通过平面测量法测量梗塞面积，以占左心室的百分比表示。
MSC培养
在之前描述的条件下进行小鼠MSC的MSC分离和扩增(Bouffi,C.,Bony,C.,Courties,G.,Jorgensen,C.&Noel,D.IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymalstem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis.PLoS One 5,e14247(2010))。然后，将MSC以0.5×106个细胞/cm2的密度接种在基本必需培养基(MEM)-α中，其补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。MSC的表型和分化潜力如前所述进行(Bouffi,C.,Bony,C.,Courties,G.,Jorgensen,C.&Noel,D.IL-6-dependent PGE2 secretion bymesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimentalarthritis.PLoS One 5,e14247(2010))。简而言之，为了表征表型，将MSC与来自BDBiosciences(Le Pont de Claix，法国)的偶联单克隆抗体在补充有0.1％牛血清白蛋白的PBS中孵育20分钟。关于MSC分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，我们依赖于已经报道的诱导条件(Bouffi,C.,Bony,C.,Courties,G.,Jorgensen,C.&Noel,D.IL-6-dependentPGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation inexperimental arthritis.PLoS One 5,e14247(2010))。MSC的成脂分化通过油红O染色后的脂滴形成分析和RT-qPCR进行评估。通过RT-qPCR评价MSC软骨分化，通过RT-qPCR和细胞外基质的矿化测量成骨分化。
用PPARβ/δ激动剂和拮抗剂预处理MSC，用CM-DiI标记。
将MSC与PPARβ/δ拮抗剂GSK3787(0.1和1μM)、PPARβ/δ反向激动剂GSK0660(0.1和1μM)或PPARβ/δ激动剂GW0742(0.1、1和5μM)预孵育24小时，然后用PBS洗涤，用于共培养实验或注射到心肌中。当指出时，MSC用荧光细胞示踪剂CM-DiI(Molecular Probes)进行标记。收集MSC，悬浮于5mL的含有CM-DiI的PBS中(107个细胞/10μg)，然后在37℃下孵育5分钟，然后在4℃在黑暗中孵育15分钟。将标记的MSC在PBS中洗涤两次，重悬于PBS中并维持在4℃，然后注射到心肌中。
心肌细胞和MSC共培养
H9c2(褐家鼠心肌细胞)在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，其补充有10％胎牛血清(FBS)、100单位/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。为了诱导细胞凋亡，将H9c2在含有350μM的H2O2的基本培养基(不含FBS)中培养4小时。为了评价MSC对心肌细胞的影响，使用Transwell系统设计了共培养测定法，以避免细胞与细胞接触。在350μM的H2O2存在下将15,000个心肌细胞(下部)和/或15,000个MSC(上部)铺板到12孔培养皿的每孔中。进行了两种不同的共培养操作方案。在操作方案1中，H9c2和共培养的MSC暴露于H2O2(不含血清)。在操作方案2中，H9c2在基本培养基中暴露于H2O2中4小时，洗涤后，将细胞在完全培养基中与MSC共培养。在操作方案3中，H9c2在H2O2存在下在不含血清的常规培养基中培养4小时，并再继续培养1小时。然后，将H9c2与MSC在完全培养基中共培养1小时。在所有操作方案结束时，回收H9c2用于细胞凋亡和RT-qPCR分析。
DNA片段化的测定法
使用酶联免疫吸附测定试剂盒(Cell Death ELISA；Roche Diagnostics)对细胞裂解物中的DNA片段化进行体外定量，该试剂盒涉及用于测量细胞凋亡诱导后的细胞的细胞质中的组蛋白复合的DNA片段(单核糖体和寡核糖体)。
RT-qPCR
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf)分离每个样本的总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop ND，Thermo Fisher Scientific)确定提取的RNA的数量和质量。然后，使用SensiFAST cDNA合成试剂盒(Bioline)，通过将500ng RNA反转录成cDNA来合成cDNA。使用SensiFASTTMSYBR(Bioline)和480定量检测系统，按照制造商的建议进行PCR。使用Primer3软件设计了angpl4、pdk4、bcl2、hgf、pdgf、nrf2的特异性引物。将数据相对于管家基因核糖体蛋白S9(RPS9)归一化，将值表示为使用2-ΔCt方法计算的特定基因表达的相对mRNA水平。
免疫印迹
在离体IR操作方案结束后，将组织样本(左心室)快速冷冻在液氮中。使用研磨机将样本在RIPA缓冲液中[50mM Tris(Sigma-Aldrich)、150mM NaCl(Sigma-Aldrich)、1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)、0.1％十二烷基硫酸钠(Sigma-Aldrich)，pH 8.0]均质化，所述缓冲液补充有不含EDTA的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(HaltTM蛋白酶和磷酸酶一次性抑制剂Cocktail-100×，Thermoscientific)。离心后，将沉淀重悬于RIPA缓冲液中以进行蛋白质纯化，在4℃下孵育1小时。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。蛋白质的样本(25μg)通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(4-20％TGXTM预制凝胶；Biorad)进行解析，并转移至硝基纤维素(/>TurboTM；Biorad)。使用以下抗体和供应商：1)EMD Millipore：抗半胱天冬酶3(Upstate 06-735)，2)细胞信号传导技术：抗磷酸ERK1,2；抗ERK1,2；抗磷酸AKT；抗AKT；β-微管蛋白；抗α-肌动蛋白；纽蛋白(vinculin)(E1E9V)、GAPDH，3)Jackson ImmunoResearch：辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体。使用ECL试剂盒(SuperSignalTMWest Pico化学发光底物；Thermo ScientificTM)通过增强化学发光方法对蛋白质条带进行可视化。使用ChemidocTM(Biorad)和ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行密度测定分析。每个蛋白质条带的信号强度用上样对照(微管蛋白、纽蛋白、GAPDH或α-肌动蛋白)获得的相应值进行校正，然后用IR对照条件获得的平均值进行归一化。
免疫化学
在离体实验结束时，将左心室(LV)固定在甲醛中，包埋在石蜡中。每个左心室从心尖到基部被切开(每个150μm切4μm切片)。将石蜡包埋切片脱蜡，然后通过酒精梯度再水化。将切片安装在Mowiol(Biovalley)中。LV切片由Zeiss Axio Scan Z1玻片扫描仪(Zeiss，Oberkochen，德国)进行扫描。使用×20物镜进行扫描。使用ImageJ分析图像。
统计分析
仅对n≥5个的独立实验进行统计分析。确认群体的正态性后，使用ANOVA参数检验对数据(平均值±SD)进行分析(正态分布的Anderson-Darling检验)。如果不一致，则使用非参数Kruskal-Wallis和Dunn事后检验进行多重比较，或使用Mann-Whitney进行两组比较。使用GraphPad Prism(MacO版本8.3.0，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com)分析数据。统计显著性记为，ns记为p>0.05，*记为p<0.05，**记为p<0.01，***记为p<0.001以及****记为p<0.0001。
结果
在离体的整体缺血模型中，在再灌注期间施用MSC的心脏保护作用取决于PPARβ/δ
首先，我们对用于研究的MSC进行表型和功能表征，如前所述(Bouffi,C.,Bony,C.,Courties,G.,Jorgensen,C.&Noel,D.IL-6-dependent PGE2 secretion bymesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimentalarthritis.PLoS One5,e14247(2010))。我们表明MSC的CD11b和CD45呈阴性，而MSC上表达的标记物如CD44和Sca-1呈阳性(数据未显示)。在诱导MSC向三个特定谱系分化后，MSC产生：1)软骨细胞，如II型胶原蛋白(Col2)的表达所示；2)脂肪细胞，其特征在于pparγ和lpl的表达以及脂滴的形成，以及3)成骨细胞，其特征在于骨钙素和碱性磷酸酶的表达以及茜素红S染色(数据未显示)。为了评价MSC在我们的IR损伤的离体模型中的保护作用，在经历整体缺血的离体心脏的再灌注阶段，以不同浓度(在Tyrode溶液中2500、5000和10000个细胞/mL)施用MSC(参见操作方案，图5A)。图5B显示了MSC心脏保护作用的剂量-反应获得的U曲线。5,000个细胞/mL的浓度被认为是提供最佳疗效的剂量，与PostC刺激提供的疗效相似，该PostC刺激被认为是我们实验中的阳性对照(对于PostC为28.13±4.69，n＝7，vs对于MSC 5,000为30.27±5.89；n＝12；p$>0.999)。此外，与IR相比，无论是2,500个细胞/mL的剂量(38.64±5.36，n＝11vs对于IR为46.51±6.28，n＝11；pns＝0.80)，还是最大的测试剂量，10,000个细胞/mL(对于MSC 10,000为50.28±11.09，n＝6vs对于IR为46.51±6.28，n＝11；pns>0.999)，都没有产生显著减小的梗塞大小。
因为我们在之前的研究中证明了PPARβ/δ表达对MSC功能至关重要，包括MSC的差异电位和免疫调节特性，我们在这里讨论了PPARβ/δ在MSC心脏保护效果中发挥的作用(Scholtysek,C.等人，PPARβ/δgoverns Wnt signaling and bone turnover.Nat Med 19,608-613,doi:10.1038/nm.3146(2013)；Luz-Crawford,P.等人，PPARbeta/delta directsthe therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis.Ann RheumDis 75,2166-2174,doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696(2016)；Contreras-Lopez,R.A.等人，PPARβ/δ-dependent MSC metabolism determines their immunoregulatoryproperties.Sci Rep 10,11423,doi:10.1038/s41598-020-68347-x(2020))。为此，将MSC用PPARβ/δ拮抗剂或激动剂药物试剂进行预处理，然后在IR损伤的离体模型中施用(5,000个细胞/mL)。图5C显示，将MSC(5,000个细胞/mL)用GSK0660(1μM)预处理24小时后，在离体缺血心脏中在再灌注阶段施用时，MSC的心脏保护作用会降低(对于MSC+GSK0660为37.78±5.31,n＝9vs对于MSC为30.27±5.89,n＝12；p#＝0.019)。根据这一结果，我们研究了使用不同剂量(0.1、1和5μM)的GW0742PPARβ/δ激动剂是否与改善以较低剂量(2,500个细胞/ml)施用MSC提供的心脏保护作用相关，较低剂量(2,500个细胞/ml)的MSC本身并没有保护作用(图5D)。首先，我们验证了GW0742 PPARβ/δ激动剂预处理对培养的MSC的作用，发现GW0742的激动作用与angpl4和pdk4靶基因表达水平的增加相关，从而证明了激动剂的功能性(数据未显示)。然后，我们表明用不同浓度的PPARβ/δ激动剂预处理MSC，在1μM浓度下可诱导MSC的心脏保护作用(对于MSC+GW0742 1μM为25.77±4.68，n＝7vs对于IR为46.51±6.28，n＝11；p****<0.0001)，而在0.1和5μM时未观察到有益效果。用GW0472(1μM)预处理细胞，再以2500c/mL施用，可以诱导与使用5000c/mL的初始MSC观察到的心脏保护作用相同的心脏保护作用(图5E)。PPARβ/δ引发的MSC治疗效果的改善与移入梗塞心肌组织中的MSC数量增加有关，如使用DiI标记的MSC进行免疫组织学实验所评估的，显示了经过GW0472预处理将荧光百分比增加了3.5倍(图5F)。
PPARβ/δ引发的MSC对模拟IR的抗性增强
由于组织学实验显示，当MSC用PPARβ/δ激动剂引发时，心肌梗塞区域的MSC数量增加，因此我们首先研究了引发的MSC对IR应激的抗性。为此，使用不同浓度的H2O2(100、250、350、500和750μM；参见图6A中的操作方案)，对MSC进行4小时的体外IR模拟应激。通过对不同处理组的特异性DNA片段化测量的平均值，评估了细胞凋亡定量。我们发现，在暴露于100μM的H2O2的MSC中，H2O2诱导特异性DNA片段化，其中评分在100至750μM之间达到平台(图6B)。选择250μM的H2O2浓度，是因为与未经处理的MSC相比，这是提供最大效果的最低剂量(p****)。为了确定PPARβ/δ在MSC对H2O2抗性中的作用，我们在H2O2应激诱导(250μM，4小时)之前，用不同浓度(0.1和1μM)的PPARβ/δ拮抗剂和激动剂预处理MSC 24小时。用0.1μM PPARβ/δ激动剂GW0742预处理MSC，并没有改变MSC抵抗氧化应激的能力(图6C)。然而，与暴露于H2O2的初始MSC相比，用1μM PPARβ/δ激动剂GW0742预处理显著增强了MSC对H2O2的抗性(p*)。用1μM的PPARβ/δ拮抗剂GSK0660预处理损害了MSC对H2O2诱导的氧化的抗性，但未达到显著性(图6C)。经PPARβ/δ激动剂预处理，特别是经0.1μM的GW0742预处理后的MSC对细胞凋亡的抗性增强(p**)，这一点通过bcl2基因表达水平的显著增加得到了证实。相反，与对照H2O2处理的MSC相比，用1μM GSK0660预处理MSC显著降低了bcl2基因表达水平(p*；图6D)。总而言之，这些结果表明，PPARβ/δ的激活保护了MSC免受H2O2诱导的模拟IR应激引起的细胞凋亡。
PPARβ/δ-引发增强了MSC对暴露于IR样氧化应激的心肌细胞的保护作用
为了确定PPARβ/δ对MSC诱导的对心肌细胞的保护作用中的影响，我们设计并开发了三种操作方案，以模拟当MSC移植到梗塞组织时受到的应激。第一个操作方案包括使用Transwell，将初始或引发的MSC与H9c2在暴露于350μM的H2O2中共培养4小时。第二个操作方案包括将H9c2暴露于350μM的H2O2中4小时，然后将H9c2与初始或引发的MSC在完全培养基中共培养。第三个操作方案包括将H9c2暴露于350μM的H2O2中4小时，之后去除血清1小时，然后将H9c2与初始或引发的MSC在完全培养基中共培养(图7A)。在第一个操作方案中，我们发现与初始MSC相比，用1μM的GSK0660或GSK3787预处理的MSC失去了保护心肌细胞免于细胞凋亡的能力。相比之下，对暴露于H2O2诱导的氧化应激的心肌细胞而言，与初始MSC相比，用0.1和1μM的PPARβ/δ激动剂GW0742预处理的MSC表现出更高的抗细胞凋亡作用(图7B)。在第二个操作方案中，我们表明用1μM的GSK0660或GSK3787预处理的MSC不会改变MSC对H2O2应激的心肌细胞的保护特性。然而，对暴露于IR样氧化应激的心肌细胞而言，与初始MSC相比，用1μM的PPARβ/δ激动剂GW0742预处理的MSC诱导了显著的保护作用(MSC，n＝18vs MSC/1μMGSK07342，n＝10；p***＝0.0008)(图7C)。对于第三个操作方案，与初始MSC相比，用1μM的GSK0660或GSK3787预处理的MSC失去了保护心肌细胞免于细胞凋亡的能力。对暴露于IR样氧化应激的心肌细胞而言，与初始MSC相比，PPARβ/δ激动剂GW0742预处理(1μM)诱导了显著的保护作用(MSC，n＝11vs MSC/1μM GSK07342，n＝6；p*＝0.004326)(图7D)。总而言之，这些结果显示，在MSC与受损心肌细胞共培养之前，用PPARβ/δ激动剂对MSC进行预处理，增强了MSC在体外对心肌细胞的抗细胞凋亡特性。
PPARβ/δ-引发逆转了IR样氧化应激对MSC旁分泌功能的抑制作用
MSC移植通过其释放抗细胞凋亡因子的能力来抑制IR诱导的细胞凋亡，所述抗细胞凋亡因子包括VEGF(Scott,R.C.等人，Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomesto MI heart improves vascularity and cardiac function.Faseb j 23,3361-3367,doi:10.1096/fj.08-127373(2009)；Ruvinov,E.,Leor,J.&Cohen,S.The promotion ofmyocardial repair by the sequential delivery of IGF-1and HGF from aninjectable alginate biomaterial in a model of acute myocardialinfarction.Biomaterials 32,565-578,doi:10.1016/j.biomaterials.2010.08.097(2011)和PDGF(Xu,B.,Luo,Y.,Liu,Y.,Li,B.Y.&Wang,Y.Platelet-derived growthfactor-BB enhances MSC-mediated cardioprotection via suppression of miR-320expression.Am J Physiol Heart Circ Physiol 308,H980-989,doi:10.1152/ajpheart.00737.2014(2015))，也描述了其应用于AMI模型时的心脏再生能力。因此，我们测试了H2O2诱导的氧化应激对MSC调节这些因子转录本水平的能力的影响(图8A)，发现H2O2应激的MSC表现出增强的上调vegf-a转录本和下调hgf和pdgf转录本的能力(图8B-图8D)。我们证明，在用0.1或1μM的GSK0660预处理的MSC中，vegf-a转录本的量显著减少(分别为p***和p*；图8B)。对于hgf和pdgf也观察到类似的趋势(图8C、图8D)。相比之下，虽然用0.1和1μM的PPARβ/δ激动剂GW0742预处理MSC，并没有改变MSC的vegf-a和hgf转录的水平(图8B、图8C)，但当GW0742以1μM浓度应用时，显著增加了pdgf的表达(p*；图8D)。
PPARβ/δ-引发增加了在离体时MSC对心脏的保护作用
PPARβ/δ引发的MSC对心肌细胞的有效抗细胞凋亡作用在整个心脏上得到了进一步证实。对离体经受IR损伤的心脏进行蛋白质印迹分析，结果表明，与未受处理的IR条件相比，MSC处理诱导减少了对半胱天冬酶3的激活(图9A)。当用GW0742 PPARβ/δ激动剂(1μM)预处理MSC 24小时时，对半胱天冬酶3切割的抑制作用进一步增加(图9B)。相比之下，用GSK0660 PPARβ/δ拮抗剂预处理MSC，然后在再灌注时将MSC注射到离体IR心脏中，使得半胱天冬酶3的完全激活恢复到与IR对照条件相同的水平。
此外，当用GW0742 PPARβ/δ激动剂(1μM)预处理MSC，然后在再灌注期间施用MSC时，对ERK1/2(图9C)和AKT(图9D)促生存激酶的磷酸化模式的评价显示，MSC处理的IR心脏与未处理的IR心脏相比,显著增加了pAkt/Akt的磷酸化比率。相比之下，当在IR操作方案的缺血后阶段施用初始MSC时，pERK1/2/ERK1/2的比率没有变化。
讨论和结论
我们的研究首次证明PPARβ/δ激活保护了MSC免于细胞凋亡，增强MSC抗细胞凋亡和治疗心肌缺血再灌注损伤的特性。在这项研究中，我们开发了一种整体缺血之后再灌注的离体模型(IR操作方案)，以评价和比较PPARβ/δ引发的MSC相对于初始MSC的治疗效果。在接受IR操作方案的心脏中，在再灌注阶段施用MSC允许减少梗塞大小。当MSC在施用前用PPARβ/δ拮抗剂预处理24小时时，其心脏保护作用显著降低。使用PPARβ/δ激动剂预处理显著增加了MSC诱导的心脏保护作用，这与心室壁中检测到的细胞数量显著增加有关。我们在体外证明PPARβ/δ预激活允许增加MSC的存活率和对氧化应激的抗性。当用PPARβ/δ激动剂引发MSC时，MSC对H2O2诱导应激的抗性增加与细胞凋亡率降低相关，并且与bcl2转录本数量的增加有关。此外，相较于初始MSC，PPARβ/δ引发的MSC对H2O2应激的培养的心肌细胞具有更有效的抗细胞凋亡治疗作用。在整个心脏中，我们的结果还表明，如通过半胱天冬酶3激活的蛋白质印迹分析所评估的，PPARβ/δ引发的MSC的抗细胞凋亡作用比初始MSC提供的抗细胞凋亡作用更有效。因此，与初始MSC相比，通过PPARβ/δ引发处理的IR心脏中AKT促生存激酶的磷酸化比率也增加。
再灌注，即使被认为是一把双刃剑，也是对急性心肌梗塞患者推荐的唯一治疗方法(Braunwald,E.&Kloner,R.A.Myocardial reperfusion:a double-edged sword？J ClinInvest 76,1713-1719,doi:10.1172/JCI112160(1985))。尽管对缓解缺血损伤有明显的益处，但对致病动脉的重建会导致受威胁(threatened)的心肌组织突然恢复供氧。致命性再灌注损伤对应于在缺血期结束时存活的心肌细胞在再灌注开始时死亡，最终导致细胞凋亡死亡。(Piper,H.M.&Garcia-Dorado,D.Prime causes of rapid cardiomyocyte deathduring reperfusion.Ann Thorac Surg 68,1913-1919,doi:10.1016/s0003-4975(99)01025-5(1999)；Zhao,Z.Q.等人，Progressively developed myocardial apoptotic celldeath during late phase of reperfusion.Apoptosis 6,279-290(2001))。在缺血再灌注损伤期间，心脏细胞可激活多种细胞死亡、细胞凋亡、坏死、坏死性凋亡(necroptosis)和自噬的调节形式。细胞凋亡和坏死主要是在严重损伤的情况下诱发的，而自噬则有助于确保病变较轻的细胞存活下来(Galluzzi,L.等人，Molecular mechanisms of cell death:recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.Cell deathand differentiation 25,486-541,doi:10.1038/s41418-017-0012-4(2018))。在缺血事件发生后，以调节细胞死亡途径为目标似乎是防止再灌注损伤和限制梗塞大小的主要策略(Boisguerin,P.等人，Anovel therapeutic peptide targeting myocardialreperfusion injury.Cardiovasc Res 116,633-644,doi:10.1093/cvr/cvz145(2020))。抗细胞凋亡策略允许特异性抑制再灌注诱导的细胞死亡，提供长期的心脏保护作用，正如我们团队最近在小鼠心脏中所证明的那样(Covinhes,A.等人，Anti-apoptotic peptidefor long term cardioprotection in a mouse model of myocardial ischemia-reperfusion injury.Sci Rep 10,18116,doi:10.1038/s41598-020-75154-x(2020))。我们研究中使用的离体模型设计用于产生46.5％的梗塞大小(表示为LV的百分比)，诱导强烈的促细胞凋亡应激，如切割的半胱天冬酶3表达的蛋白质印迹分析所证明(SHAM，n＝6vsIR，n＝10；p**＝0.0047；数据未显示)。在分离的灌注心脏的离体模型中，再灌注时施用MSC使梗塞大小减少35％。我们观察到体内数据已经证实的U形心脏保护曲线，清楚地表明MSC诱导的心脏保护作用是剂量依赖性的，正如临床试验中报告的那样。事实上，在AMI患者中，最近的一项研究表明，仅在1周内施用少于107个MSC的剂量才能增强左心室的收缩功能，而在1周后施用超过107个细胞则具有相反的效果(Wang,Z.等人，Rational transplanttiming and dose of mesenchymal stromal cells in patients with acutemyocardial infarction:a meta-analysis of randomized controlled trials.StemCell Res Ther 8,21,doi:10.1186/s13287-016-0450-9(2017))。与本研究一致，据报道MSC在治疗慢性晚期缺血性心力衰竭时的心脏保护作用呈U形曲线，表明细胞最高剂量时的效果较差(Bartunek,J.等人，Congestive Heart Failure Cardiopoietic RegenerativeTherapy(CHART-1)trial design.Eur J Heart Fail 18,160-168,doi:10.1002/ejhf.434(2016))。U形曲线允许确定提供最大心脏保护作用的最佳剂量(60分钟内以5000c/mL进行再灌注)。每颗心脏施用的相应细胞数量约为7.5.105个细胞，这对应于相对较低的剂量。使用较高剂量的MSC导致失去心脏保护作用。这些结果与观察到的结果一致，即在人类中施用较高剂量(超过107个细胞)后出现有害作用(Wang,Z.等人，Rational transplant timingand dose of mesenchymal stromal cells in patients with acute myocardialinfarction:a meta-analysis of randomized controlled trials.Stem Cell Res Ther8,21,doi:10.1186/s13287-016-0450-9(2017))。有趣的是，我们还观察到，用PPARβ/δ激动剂引发的MSC可以将注射到心脏中的MSC剂量减少两倍。事实上，在我们的研究中，将PPARβ/δ引发的MSC以3.105MSC的剂量注射，观察到的离体心脏保护作用与以最佳剂量(6.105MSC)施用的初始MSC获得的效果相似。MSC诱导的心脏保护作用已在离体被证明与左心室中测量的切割的半胱天冬酶3量的减少有关，如已报道的将MSC注射到受损心肌中(Ward,M.R.,Abadeh,A.&Connelly,K.A.Concise Review:Rational Use of Mesenchymal Stem Cellsin the Treatment of Ischemic Heart Disease.Stem Cells Transl Med 7,543-550,doi:10.1002/sctm.17-0210(2018))。使用PPARβ/δ激动剂引发的MSC增加了在离体心脏中使用初始MSC所表明的抗细胞凋亡特性。体外实验进一步证实了这一结果，表明在共培养的心肌细胞中，经引发的MSC抑制H2O2诱导的细胞凋亡的疗效增加。使用各种操作方案模拟在移植时环境对MSC的影响，我们证明PPARβ/δ激动剂引发允许增加MSC的治疗特性。与操作方案1相比，在操作方案2和操作方案3中，MSC与H9c2的共培养是在完全培养基存在下实现的，假设在体内，在再灌注期间、在存在含氧血液的情况下将MSC递送至梗塞区域的部位。然而，在两个操作方案中，MSC从未暴露于H2O2，这并不代表临床情况。因此，在补充操作方案中研究引发的MSC的心脏保护作用是很有意义的。在此操作方案中，在与MSC共培养前将H9c2暴露于氧化应激，与MSC共培养4小时内仍面临H2O2诱导的应激，然后切换到完全培养基中，以模拟向同时容纳应激的心肌细胞和引发MSC的缺血心脏中再输入含氧血液。
最近，在一项针对小鼠关节炎的体内概念验证研究中，我们的团队证明了PPARβ/δ表达水平预测了MSC的免疫调节潜力，下调PPARβ/δ增强了MSC的治疗性抗炎作用(Luz-Crawford P,Ipseiz N,Espinosa-Carrasco G,等人，PPARβ/δdirects the therapeuticpotential of mesenchymal stem cells in arthritis Annals of the RheumaticDiseases 2016；75:2166-2174)。在本研究中，在离体施用前，下调PPARβ/δ活性降低了MSC对IR损伤心脏的心脏保护作用。同样，用PPARβ/δ激动剂(GW0742，1μM)预处理MSC增强了这种心脏保护作用。事实上，我们证明，在梗塞心脏的再灌注过程中，以2500个细胞/mL施用的MSC中，对PPARβ/δ受体的刺激(提供微弱且不显著的有益作用)允许揭示MSC的心脏保护特性。在体外，我们首次在MSC中证明，PPARβ/δ预调理与MSC在受到H2O2应激时保护免受细胞凋亡的能力增强相关。在几种分化的细胞类型(包括H9c2心肌母细胞、内皮细胞、神经元或角质形成细胞)中，PPARβ/δ刺激已被描述为在体外实验中提供了抗细胞凋亡作用(Liou,J.Y.,等人，Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-delta mediated 14-3-3upregulation.Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology 26,1481-1487,doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93(2006)；Pesant,M.等人，Peroxisome proliferator-activated receptor delta(PPARdelta)activation protects H9c2cardiomyoblastsfrom oxidative stress-induced apoptosis.Cardiovasc Res 69,440-449,doi:10.1016/j.cardiores.2005.10.019(2006)；Brunelli,L.,等人，Peroxisomeproliferator-activated receptor-delta upregulates 14-3-3epsilon in humanendothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta.Circ Res 100,e59-71,doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22(2007))。
在内皮细胞中，PPARβ/δ的抗细胞凋亡特性显示是通过增加与促细胞凋亡因子Bad结合的内皮14-3-3的表达来介导的，从而增强针对氧化应激的保护(Liou,J.Y.,等人，Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activatedreceptor-delta mediated 14-3-3upregulation.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascular biology 26,1481-1487,doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93(2006)；Brunelli,L.,等人，Peroxisome proliferator-activated receptor-delta upregulates14-3-3epsilon in human endothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta.Circ Res 100,e59-71,doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22(2007))。
PPARβ/δ受体激活后，其他抗细胞凋亡机制也得到了强调，例如AKT1通路。事实上，和合作者已经证明，角质形成细胞中PPARβ/δ的激活通过增加ilk(整合素连接的激酶)和pdk1(3-磷酸肌醇依赖性激酶-1)的转录来防止细胞凋亡(/>N.,等人，Antiapoptotic role of PPARbeta in keratinocytes via transcriptional controlof the Akt1 signaling pathway.Mol Cell 10,721-733,doi:10.1016/s1097-2765(02)00646-9(2002))。Gamdzyk团队已证明，在神经元应激背景下，PPARβ/δ的激动剂GW0742对PPARβ/δ的激活，抑制了TXNIP(硫氧还蛋白相互作用蛋白)，而TXNIP负责激活促细胞凋亡通路ASK1/p38 MAPK(Gamdzyk,M.等人，Role of PPAR-β/δ/miR-17/TXNIP pathway inneuronal apoptosis after neonatal hypoxic-ischemic injury inrats.Neuropharmacology 140,150-161,doi:10.1016/j.neuropharm.2018.08.003(2018))。在MSC的背景下，在H2O2诱导的应激存在下，观察到的细胞凋亡率降低对于解释MSC治疗特性的增强可能具有重要意义。细胞凋亡是一种众所周知的细胞死亡机制，影响MSC的活力，特别是当MSC移植到受损组织，如IR损伤后受损的心脏时(Zhu,W等人，Hypoxia andserum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells.Stem cells 24,416-425,doi:10.1634/stemcells.2005-0121(2006))。人们开发了几种策略来抑制移植后MSC的细胞凋亡，以帮助MSC在缺氧-复氧损伤中存活，如MSC的热休克治疗(Gao,F.等人，Heat shock protein 90protects rat mesenchymal stem cells against hypoxia andserum deprivation-induced apoptosis via the PI3K/Akt and ERK1/2pathways.JZhejiang Univ Sci B 11,608-617,doi:10.1631/jzus.B1001007(2010))；或MSC的低氧调控的血红素加氧酶-1(HO-1)载体修饰(Tang,Y.L.等人，Improved graft mesenchymalstem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1vector.Journal of the American College of Cardiology 46,1339-1350,doi:10.1016/j.jacc.2005.05.079(2005))。在对MSC治疗效果产生负面影响的因素中，细胞移植后存活率低是非常重要的。因此，为了提高IR损伤的治疗疗效，应提高MSC对氧化应激的抗性(Li,L.,Chen,X.,Wang,W.E.&Zeng,C.How to Improve the Survival ofTransplanted Mesenchymal Stem Cell in Ischemic Heart？Stem Cells Int 2016,9682757,doi:10.1155/2016/9682757(2016))。我们的研究证明，PPARβ/δ激动剂引发允许增加MSC对H2O2诱导的体外氧化应激的抗性。此外，我们的RT-qPCR实验表明，通过PPARβ/δ引发增加的MSC对H2O2诱导的应激的抗性与抗细胞凋亡bcl2基因转录本数量的增加相关，从而支持细胞凋亡率的降低。
此外，我们观察到vegf(血管内皮生长因子)基因的上调。据报道，VEGF激活Nrf2激活下游的促血管生成程序，提供抗细胞凋亡作用。此外，MSC分泌的VEGF可以与还被MSC释放的HGF协同作用，以保护内皮屏障功能(Yang,Y.等人，Synergism of MSC-secreted HGFand VEGF in stabilising endothelial barrier function upon lipopolysaccharidestimulation via the Rac1 pathway.Stem Cell Res Ther6,250,doi:10.1186/s13287-015-0257-0(2015))。
在我们的研究中，在PPARβ/δ激动剂引发的MSC中，当MSC暴露于H2O2时，vegf增加，表明vegf参与PPARβ/δ的抗细胞凋亡作用，在HGF中观察到相同的表达谱。HGF和VEGF旁分泌因子均表现出抗细胞凋亡特性(Kinnaird,T.等人，Marrow-derived stromal cellsexpress genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promotein vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms.Circ Res 94,678-685,doi:10.1161/01.RES.0000118601.37875.AC(2004)；Xu M,Uemura R,Dai Y,WangY,Pasha Z and Ashraf M.In vitro and in vivo effects of bone marrow stem cellson cardiac structure and function.J Mol Cell Cardiol.2007；42:441-8)。事实上，据报道，VEGF由骨髓来源的MSC分泌，通过下调miRNA-23a和miRNA-92从而在受损心肌细胞中产生抗细胞凋亡作用(Song,Y.S.等人，Bone marrow mesenchymal stem cell-derivedvascular endothelial growth factor attenuates cardiac apoptosis viaregulation of cardiac miRNA-23a and miRNA-92a in arat model of myocardialinfarction.PLoS One 12,e0179972,doi:10.1371/journal.pone.0179972(2017))。
HGF已被描述为保护心肌细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡，特别是通过激活生存途径，如Akt(Wang,Y.,Ahmad,N.,Wani,M.A.&Ashraf,M.Hepatocyte growth factorprevents ventricular remodeling and dysfunction in mice via Akt pathway andangiogenesis.J Mol Cell Cardiol 37,1041-1052,doi:10.1016/j.yjmcc.2004.09.004(2004))。在缺氧预调理中，MSC对缺氧-复氧应激的抗性增强，并且与bcl-2和vegf表达上调相关，从而促进ERK和Akt(Wang,J.A.等人，Hypoxic preconditioning attenuateshypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells.ActaPharmacol Sin 29,74-82,doi:10.1111/j.1745-7254.2008.00716.x(2008))。
最后，我们观察到，在MSC暴露于H2O2诱导的应激中时，观察到pdgf表达水平显著降低，这通过用PPARβ/δ预处理MSC可以显著抵消，而在用PPARβ/δ拮抗剂预处理MSC后，pdgf表达倾向于增强。这与PDGF的有据可查的作用一致，PDGF被描述为保护多种细胞类型免于细胞凋亡，并诱导肥大细胞(hypertrophic)生长(Vantler,M.等人，PDGF-BB protectscardiomyocytes from apoptosis and improves contractile function of engineeredheart tissue.J Mol Cell Cardiol 48,1316-1323,doi:10.1016/j.yjmcc.2010.03.008(2010))。关于心肌细胞的存活和功能，PDGF被证明改善了心肌细胞的存活、α-肌动蛋白含量和收缩性能(Vantler,M.等人，PDGF-BB protects cardiomyocytes from apoptosisand improves contractile function of engineered heart tissue.J Mol CellCardiol 48,1316-1323,doi:10.1016/j.yjmcc.2010.03.008(2010))。因此，用PPARβ/δ激动剂引发的MSC的增强的抗细胞凋亡作用可能部分是通过vegf、hgf和pdgf表达水平的联合增加来介导的。应该在功能丧失和增强实验中研究这一假设。
总之，我们的研究提供了基于MSC的细胞产品诱导的对IR损伤增强的心脏保护的证据，所述基于MSC的细胞产品具有有效的抗细胞凋亡作用，以及在再灌注开始后一小时在受损心肌中具有增加的存活MSC的数量。
对于临床提高MSC对AMI患者的受损心肌的心脏保护的疗效，这些结果可以具有重大意义。
实施例3：使用PPARβ/δ激动剂预处理MSC的持续时间的影响
材料和方法
体外：
间充质干细胞的培养
如前所述，分离来自C57BL/6的骨髓来源的MSC(Bouffi C,Bony C,Courties G,Jorgensen C,D.IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cellsinhibits local inflammation in experimental arthritis.PLoS One.2010年12月7日；5(12):e14247)。简而言之，从长骨中冲洗出骨髓，将细胞悬液(0.5×106个细胞/cm2)铺板在基本必须培养基(MEM)-α中，其补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在亚汇合时，收集细胞，以5,000个细胞/cm2的密度进行增殖，从第7代开始使用。
药理预调理：
离体实验前24小时或96小时，将MSC与含有在培养基中稀释的PPARβ/δ激动剂的处理溶液(GW0742，1μM和G501516，0.1μM)一起孵育。处理持续24小时或96小时。在预调理阶段后，用PBS冲洗细胞两次，用胰蛋白酶EDTA(Invitrogen)在37℃(5％CO2)胰蛋白酶消化1分钟。将细胞以200g离心3分钟，然后重悬于预热的Tyrode溶液中，终浓度为5000个细胞/ml。
离体评价：
在离体心肌缺血再灌注模型中评价了预调理的MSC的心脏保护作用。在来自C57Bl6小鼠的分离的灌注心脏中进行急性心肌缺血再灌注，该小鼠经历30分钟缺血(无液流)，然后再灌注。雄性小鼠腹膜内注射(IP)氯胺酮(14mg/kg，Merial)、赛拉嗪(14mg/kg，/>Bayer)，然后注射戊巴比妥(IP；76.6mg/kg；Sanofi-Aventis)进行麻醉。麻醉小鼠接受250U肝素(IP)以防止血凝块形成。胸骨切开术后，切除心脏，通过升主动脉插管，快速安装在Langendorff系统上。在恒定压力和温度(37℃)下，灌注预热的Tyrode溶液(NaCl 140mM、KCl 5.4mM、MgCl 1mM、Hepes 5mM、葡萄糖5.5mM、CaCl2 1.8mM、pH 7.4)。
缺血再灌注操作方案(IR)
在Langendorff系统上，心脏用预热的Tyrode溶液灌注15分钟(稳定)。通过在30分钟内停止灌注液流(“无液流”)，获得整体缺血。通过恢复液流实现再灌注步骤(60分钟)。再灌注期间应用使用MSC的治疗(Tyrode溶液中的MSC，5,000个细胞/ml)。仅使用Tyrode获得对照条件(IR)。
梗塞大小测量：
在IR操作方案结束时，将心脏从Langendorff中取出并解剖出来。将左心室包含在琼脂(4％)中，用振动切片机横向切片(1mm)。为显示组织活力，将切片与2,3,5-氯化三苯基四唑溶液(TTC染料)在37℃下孵育15分钟。经过固定步骤(4％多聚甲醛，48小时)后，对每个切片的每一侧进行拍照。使用ImageJ软件通过平面测量来定量梗塞大小，并表示为左心室质量的百分比。
结果：
图10显示，与对照条件(用Tyrode溶液灌注，IR)相比，用含有5,000个细胞/ml(共计4.105个细胞/心脏)的Tyrode溶液再灌注允许梗塞大小减小39.8％。
当在Langendorff系统上以4.105个细胞/心脏的剂量灌注时，与对照条件(单独使用Tyrode溶液再灌注，IR)相比，用GW501516(0.1μM)对MSC进行4天预调理，允许梗塞大小减少54.5％。。
当仅进行24小时GW501516预处理时，MSC(4.105个细胞/心脏)能够以相同程度减少梗塞大小，对于GW501516 1天(n＝7)的平均值为37.4(以LV质量百分比计)，而GW5015164天的平均值为36.05％(n＝8)，导致梗塞大小分别减少52.8％和54.5％。
使用另一种PPARβ/δ激动剂GWO742也获得了类似的结果。事实上，与未处理条件(IR)相比，当MSC用GWO742(1μM)预调理24小时，梗塞大小减少了54.6％。
结论：
上述数据表明，用GW501516预处理MSC 24小时所产生的药理刺激作用与96小时预处理所产生的药理刺激作用具有相同的心脏保护作用。
因此，PPARβ/δ激动剂对MSC进行短暂预处理，足以显著改善在心肌缺血再灌注损伤后的MSC的心脏保护作用。
尽管如此，我们的24小时操作方案优于WO2015164506的96小时操作方案(实施例6)，有两个主要优点：
-预处理时间缩短4倍(1天与4天相比)，
-细胞剂量少1000至100 000倍(5,000个细胞/ml对比5-600×106个细胞/ml，如WO2015164506实施例6中所述)。

Claims (14)

1.一种包含PPARβ/δ引发的间充质干细胞(MSC)的组合物，其中所述组合物是通过体外方法获得的，所述体外方法包括
a)提供MSC；
b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；
c)去除所述培养基，洗涤所述MSC；和
d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中所述药学上可接受的载体不包含PPARβ/δ激动剂，
所述组合物用于在需要其的受试者中治疗缺血再灌注损伤，优选心肌或肾脏缺血再灌注损伤的方法中，其中所述治疗方法不包括向所述受试者施用PPARβ/δ激动剂。
2.根据权利要求1所述的用途的组合物，其中所述组合物通过静脉内或冠状动脉内施用向受试者施用。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途的组合物，其中施用至所述受试者的MSC的总量为5×106至5×1010个PPARβ/δ引发的MSC。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的组合物，其中所述组合物在缺血再灌注损伤开始后7天内、或在缺血器官的再灌注期间施用。
5.一种制备旨在用于治疗缺血再灌注损伤的包含间充质干细胞(MSC)的组合物的体外方法，所述体外方法包括：
a)提供MSC；
b)在包含PPARβ/δ激动剂的培养基中培养MSC；
c)去除所述培养基，洗涤所述MSC；和
d)将MSC收集在药学上可接受的载体中，其中所述药学上可接受的载体不包含PPARβ/δ激动剂，
其中步骤b)的持续时间为12小时至72小时，优选18小时至48小时，更优选20小时至30小时，如24小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤a)中提供的MSC为骨髓来源的MSC或脂肪组织来源的MSC。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在步骤a)中提供的所述MSC是同种异体的，并且已从健康受试者获得。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在所述步骤b)的培养基中，所述PPARβ/δ激动剂的浓度为0.01μM至10μM，优选0.05μM至5μM，更优选0.1μM至1μM。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述PPARβ/δ激动剂选自GW0742和GW501516。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述步骤b)的培养基不含有用于转导MSC的病毒载体。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述步骤c)中的洗涤用不包含PPARβ/δ激动剂的溶液进行。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，将MSC以102至108个MSC细胞/mL的浓度，优选以103至107个MSC细胞/mL的浓度收集在药学上可接受的载体中。
13.一种包含PPARβ/δ引发的间充质干细胞(MSC)的组合物，其中所述组合物是通过根据权利要求1至12中任一项所述的体外方法获得的。
14.根据权利要13所述的组合物，其用于治疗方法中，其中所述治疗方法不包括向受试者施用PPARβ/δ激动剂。
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