CN116831568A - 海绵骨针在体内目标物质提取和检测中的用途及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了海绵骨针在体内目标物质提取和检测中的用途及其方法。本发明利用海绵骨针涂抹于皮肤后打开皮肤微通道，体内目标物质通过自由扩散方式经微通道渗透出皮肤外，经有效采集后可获取皮肤内的目标物质，并可用于检测该目标物质在体内的量。本发明将海绵骨针应用于内源性分子的提取及检测或治疗药物监测等领域，具备优良的普适性，且操作简便，提取时间短，提取部位和提取面积灵活且不受限，患者的顺从性高。
Description
技术领域
本发明属于体内提取及检测技术领域，具体涉及海绵骨针作为一种皮肤通道物理性打开方式，在检测人体内源性分子和治疗药物监测中的应用。
背景技术
人体是一个复杂的系统，存在着各种各样的生物分子，它们有序地在人体中发挥着维持体内稳态的作用。但当它们的浓度出现异常时，也通常意味着身体存在异常。比如半胱氨酸(Cys)在机体的各种生理和病理过程中发挥作用。但是过量的Cys可能会预示着阿尔茨海默病、心血管问题等。反之，当Cys不足时，也有引起肝损伤、神经毒性、银屑病、造血功能下降、生长迟缓等的风险。又如，重症监护病房的病人需要广泛的急性疾病的复杂护理，监测乳酸水平对危重病患者是很重要的，因为乳酸水平的变化趋势被认为是病人生存能力的一个指标，血乳酸水平已被用于危重疾病的辅助预测和评估治疗措施的效果，因为血乳酸是非常快的细胞缺氧的指标，在生命受到威胁的几秒内升高，在适当的治疗后几秒内降低，故可以通过连续的乳酸监测来辅助预测器官衰竭。此外，肾功能不全患者和糖尿病患者则需要实时监测其体内尿素以及葡萄糖水平。因此，监测人体内特定内源性分子的浓度变化至关重要。
另外，随着社会经济的发展，人们对于医疗保健的要求已经逐渐从普遍治疗向个体化治疗转化，但个体化治疗提高了治疗成本，目前只有发达国家才能享受到这种治疗方式。对世界其他地区而言，普遍治疗仍是唯一选择。然而，有些药物在没有剂量滴定的情况下的治疗风险是很高的，这类药物通常是用于治疗癌症、癫痫、抑郁症和心律失常等等。例如水杨酸作为一种镇痛剂，治疗范围窄，过高浓度则会对人体产生毒害作用。治疗性药物监测是指监测特定药物在患者生物基质中的浓度来管理治疗过程和调整药物剂量。治疗性药物监测的目的是保证病人安全性、个性化给药方案和尽量减少全身毒性。治疗性药物监测在监测治疗浓度范围窄，具有与药物浓度相关的不良反应和药代动力学反应的药物中起着重要作用。
药物的治疗活性和毒性往往都取决于它在组织周围的积累量，就像大部分的感染都发生在组织中而非血浆中一样，所以抗生素能否抵达靶向位置是临床应用的关键因素。组织间液中游离药物的浓度与药物活性相关，也与其治疗效果相关，细胞外液可以看做药物进入细胞必经的液体室。因此，检测细胞外液中药物浓度对了解药物作用的时间进程和优化给药方案至关重要。皮肤是人体最大的器官，其实质是一层生物膜屏障，用于保护机体免受外界病原微生物的侵害。只有极少数的小分子能够有效通过皮肤屏障进出，因此，如何克服皮肤屏障，采集细胞外液中的药物，是进行药物监测的重点。在药物代谢动力学检测时常通过间歇性采血来估计组织中的药物浓度，但患者的顺从性较差，特别是对于老人和小孩来说。微透析是侵入性相对较小的方法，已经被用于估计真皮、皮下和肌肉组织中的药物水平，但透析探头的插入可能会导致微血管的损伤，造成局部缺血，影响组织代谢。经皮提取是可代替静脉采血和微透析的非侵入性技术，经皮提取是一种利用能够打破皮肤角质层屏障或外力驱动药物的技术来提取组织中药物的方式。既不会对人体造成伤害也提高了患者的顺从性，目前已经成为了研究的热点。已经出现的经皮提取方法，如反向离子导入，仅适用于离子型药物。还有一些经皮提取方法，如电致孔法、微针贴片、超声法，对仪器设备的要求高，生产成本较高，同时提取时间也较长，限制了其应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了海绵骨针在体内目标物质提取和检测中的用途及其方法。
本发明的主要技术思路在于，利用海绵骨针刺入皮肤后停留在皮肤，在海绵骨针和皮肤之间形成环形缝隙(环宽小于100纳米)，从而构成连通皮肤内外的微通道，体内(尤其是皮肤内)的目标物质可以通过这些环形缝隙构成的微通道以自由扩散等方式渗透出皮肤。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
海绵骨针在体内目标物质提取中的用途。所述提取具体指的是，利用海绵骨针在皮肤上打开微通道，使得体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)渗透出皮肤外，从而可对渗透出皮肤外的目标物质进行收集。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
海绵骨针在体内目标物质检测中的用途。所述检测具体指的是，利用海绵骨针在皮肤上打开微通道，使得体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质并检测其浓度或含量，可以得到该目标物质在体内(如皮肤内或血液内)的浓度或含量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
海绵骨针在制备体内目标物质的提取剂中的用途。如前所述，利用海绵骨针在皮肤上打开微通道，可使得体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)渗透出皮肤外，从而可对渗透出皮肤外的目标物质进行收集。因此，海绵骨针可以用于制备体内目标物质的提取剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
海绵骨针在制备体内目标物质的检测剂中的用途。如前所述，利用海绵骨针在皮肤上打开微通道，可使得体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质并检测其浓度或含量，可以得到该目标物质在体内(如皮肤内或血液内)的浓度或含量。因此，海绵骨针可以用于制备体内目标物质的检测剂。
进一步地，所述海绵骨针包括天然海绵骨针或人工制备的仿生海绵骨针中的至少一种；所述人工制备的仿生海绵骨针的形态和性质与天然的海绵骨针相似。
优选地，所述海绵骨针包括蜂海绵骨针。蜂海绵骨针是近年来新发现的一种海洋来源的天然微针，生产成本低，使用剂量、方式灵活多变，可有效打开皮肤角质层，提供分子进出人体的通道。
进一步地，所述的“体内”指的是皮肤内、血液内、细胞外液内、组织内或器官内等。所述皮肤包括角质层、表皮层和真皮层等。所述细胞外液指的是人体内存在于细胞外的体液，主要包括组织液(又称组织间隙液、组织间液)、淋巴液、脑脊液等。本发明所述的海绵骨针在体内目标物质提取中的用途，最主要的是利用海绵骨针提取皮肤内的目标物质。本发明所述的海绵骨针在体内目标物质检测中的用途，最主要的是利用海绵骨针提取皮肤内的目标物质后检测其含量或浓度，以间接获得皮肤内、血液内、细胞外液内、组织内或器官内等该目标物质的浓度或含量。
进一步地，所述目标物质包括内源性目标物质或外源性目标物质中的至少一种。
进一步地，所述内源性目标物质指的是人体本身含有的或者人体本身产生的，例如葡萄糖、尿素、乳酸、半胱氨酸等。所述外源性目标物质指的是人体从外界摄入的，例如包括药物或活性成分。所述活性成分指的是具有一定的生理或药理功效，但没有被评价为或暂未被评价为药物的一类物质。
例如，所述目标物质包括葡萄糖、尿素、水杨酸、罗丹明B或荧光素钠中的至少一种。
本发明所述用途为非疾病诊断或治疗目的的用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：
一种利用海绵骨针提取体内目标物质的方法，将所述海绵骨针涂抹于皮肤，使体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)通过海绵骨针在皮肤上打开的微通道渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质，实现提取。
优选地，涂抹于皮肤的海绵骨针的剂量为1～10mg/cm2。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之六是：
一种利用海绵骨针检测体内目标物质的方法，将所述海绵骨针涂抹于皮肤，使体内目标物质(如位于皮肤内的目标物质)通过海绵骨针在皮肤上打开的微通道通过自由扩散等方式渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质，对其进行分离(如有必要)、分析和检测，检测其浓度或含量，以获得所述目标物质在体内(如皮肤内或血液内)的浓度或含量。
优选地，涂抹于皮肤的海绵骨针的剂量为1～10mg/cm2。
进一步地，所述利用海绵骨针检测体内目标物质的方法包括：
1)将海绵骨针涂抹于皮肤并按摩；
2)将提取液置于海绵骨针涂抹并按摩后的皮肤，对渗透出皮肤外的目标物质进行收集；
3)检测收集了目标物质的提取液中的目标物质的浓度或含量；
4)以体内目标物质的实际量(通过其他方式测得，如利用胶带剥离萃取法测得皮肤中目标物质的实际量，或检测血液中该目标物质的实际量等)与利用海绵骨针获得的渗透出皮肤的目标物质的检测量(即通过提取液收集海绵骨针按摩后渗透出皮肤外的目标物质并对其进行检测获得)建立对应关系，以步骤3)获得的提取液中的目标物质的浓度或含量代入所述对应关系中，计算得到体内目标物质的含量。
在实际应用中，可以预先利用抽血、血液取样或者组织取样等方法获得血液或皮肤层中目标物质的实际量并以此为实际值，利用海绵骨针提取法获得渗透出皮肤的目标物质的检测量并以此为检测值，将实际值和检测值二者建立对应关系式或标准曲线；检测时，利用骨针提取法获得目标物质的量后，代入上述对应关系式或标准曲线，计算可得血液或皮肤层中目标物质的量。
进一步地，海绵骨针可以直接在皮肤上按摩，而后加入提取液进行提取，或者海绵骨针可与提取液混合，在皮肤上按摩，而后再加入提取液进行提取。海绵骨针可以用生理盐水等缓冲液配制成海绵骨针溶液(或称海绵骨针分散液)进行使用，海绵骨针的浓度可以为80～120mg/L。
进一步地，所述提取液包括但不限于生理盐水，也可以是其他可用于皮肤的液体，如水、磷酸盐缓冲液等各种缓冲液。
进一步地，所述按摩方式为电动按摩或手动按摩。
在一个具体的实施例中，所述方法包括如下步骤：
1)海绵骨针溶液的配制：用一定量的生理盐水，制备浓度为80～120mg/mL的海绵骨针溶液；
2)将80～120μL的海绵骨针溶液直接涂抹于清洁后的皮肤，电动按摩1～3min；
3)将200～400μL的生理盐水置于骨针涂抹后的皮肤，提取时间1～3min；
4)收集提取后的生理盐水，检测其中的目标物质含量(根据不同的目标物质，利用荧光或者试剂盒等方法检测)；
5)利用预先测定的体内目标物质含量与提取所得目标物质含量的对应关系式估计体内该目标物质分子含量。
本发明所述方法不用于疾病诊断或疾病治疗的目的，但可以用于健康评估目的。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明利用海绵骨针等骨针涂抹于皮肤后打开皮肤微通道，体内目标物质通过自由扩散方式经微通道渗透出皮肤，可有效采集渗透出的体内目标物质分子，还可进一步用于计算血液或皮肤层等的该目标物质含量。本发明提供了一种无创、非侵入性、有效、普适性高、检测部位和面积不受限制、操作简便的体内物质提取和体内药物监测方式，伤害小，顺从性好，且可以用于持续监测。
附图说明
图1为实施例1中荧光素钠的骨针提取组(SHS组)、反向离子导入组、滚轮微针组、超声组和对照组的对比结果图。
图2为实施例2中罗丹明B的骨针提取组(SHS组)、反向离子导入组和对照组的对比结果图。
图3为实施例3中荧光素钠的骨针提取组与对照组的对比结果图(A)及提取浓度与对应的皮肤层内含量关系图(包括B角质层、C表皮层和D真皮层)。
图4为实施例4中罗丹明B的骨针提取组和对照组的对比结果图(A)及提取浓度与对应的皮肤层内含量关系图(包括B角质层、C表皮层和D真皮层)。
图5为实施例5中水杨酸的骨针提取组和对照组的对比结果图(A)及提取浓度与对应的皮肤层内含量关系图(包括B角质层、C表皮层和D真皮层)。
图6为实施例6中尿素的骨针提取组和对照组的对比结果图(A)及提取浓度与对应的皮肤层内含量关系图(包括B表皮层和C真皮层)。
图7为实施例7中葡萄糖的骨针提取组和对照组的对比结果图(A)及提取浓度与对应的皮肤层内含量关系图(包括B表皮层和C真皮层)。
图8为实施例8中通过海绵骨针提取检测得到的葡萄糖提取浓度与对应血液中葡萄糖含量关系图。
具体实施方式
下面将通过实施例，对本发明中涉及的技术方案进行进一步的说明和描述，显然，应该理解的是本发明并不仅限于以下所列的内容，所用的术语和实施例也并不是对本发明的限定。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入4mg/mL的荧光素钠溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮6h。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针(SHS)，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
荧光素钠的提取：分为骨针提取组、反向离子导入组、滚轮微针组、超声组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于荧光素钠透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间10min。
反向离子导入组在皮肤表面添加300μL生理盐水，使用Ag/AgCl电极施加4V的电压在皮肤表面提取10min。
滚轮微针组使用滚轮微针在皮肤表面沿不同方向滚动六次。将300μL的生理盐水置于微针处理后的皮肤，提取时间10min。
超声组在皮肤表面加上4mL预先配制好的1％十二烷基硫酸钠溶液，将整个装置置于超声波细胞破碎仪中，超声频率为20KHz，调整超声变幅杆到皮肤角质层上表面的距离为3mm，设置超声开时间2s，超声关时间2s，超声占空比为50％，输出功率为30％，超声总时长为90s，超声处理结束后用生理盐水冲洗皮肤表面3次。在皮肤表面添加300μL生理盐水，提取时间10min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于荧光素钠透皮后的皮肤，提取时间10min。
分别收集骨针提取组、反向离子导入组、滚轮微针组、超声组和对照组提取后的生理盐水，利用酶标仪根据荧光素钠的检测波长(激发波长：485nm和发射波长：535nm)检测其中的荧光素钠含量。结果表明，与反向离子导入组和对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内荧光素钠，参见附图1。
实施例2
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入4mg/mL的罗丹明B溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮6h。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
罗丹明B的提取：分为骨针提取组、反向离子导入组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于罗丹明B透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间10min。
反向离子导入组在皮肤表面添加300μL生理盐水，使用Ag/AgCl电极施加4V的电压在皮肤表面提取10min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于罗丹明B透皮后的皮肤，提取时间10min。
分别收集骨针提取组、反向离子导入组和对照组提取后的生理盐水，利用酶标仪根据罗丹明B的检测波长(激发波长：355nm和发射波长：580nm)检测其中的罗丹明B含量。结果表明，与反向离子导入组和对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内罗丹明B，参见附图2。
实施例3
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入一定浓度的荧光素钠溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮。通过控制荧光素钠溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同荧光素钠的皮肤模型。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
荧光素钠的提取：分为骨针提取组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于荧光素钠透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于荧光素钠透皮后的皮肤，提取时间2min。
分别收集骨针提取组和对照组提取后的生理盐水，利用酶标仪根据荧光素钠的检测波长(激发波长：485nm和发射波长：535nm)检测其中的荧光素钠含量。结果表明，与对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内荧光素钠，参见附图3中A。
皮肤层中荧光素钠的测定：采用胶带剥离萃取法，用胶带依次剥离第1～10层角质层、分离活性表皮层并将真皮层部分切碎，分别浸于4mL PBS/甲醇＝1:1溶液中，室温条件下，160r/min，萃取24h。利用酶标仪根据荧光素钠的检测波长(激发波长：485nm和发射波长：535nm)检测其中的荧光素钠含量，分别得到角质层、表皮层和真皮层的荧光素钠含量。
线性关系考察：在上述体外透皮实验中，通过控制荧光素钠溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同含量荧光素钠的皮肤模型。在含有不同含量荧光素钠的皮肤模型中，针对每一个皮肤模型，采用骨针提取法测定荧光素钠提取浓度，分离皮肤各层后采用胶带剥离萃取法测定皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中荧光素钠含量；将各个含有不同含量荧光素钠的皮肤模型中，通过骨针提取法测得的荧光素钠提取浓度与所对应的通过胶带剥离萃取法测得的角质层、表皮层和真皮层荧光素钠含量制图，结果表明使用骨针提取得到的提取溶液中荧光素钠浓度(附图3中B、C、D横轴)与采用胶带剥离萃取法测得的皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中荧光素钠含量(附图3中B、C、D纵轴)具备良好的线性相关关系，参见附图3中B、C、D。即可根据骨针提取法测得荧光素钠浓度，代入线性相关关系式中，计算各皮层的荧光素钠含量。
实施例4
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入一定浓度的罗丹明B溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮。通过控制罗丹明B溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同罗丹明B的皮肤模型。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
罗丹明B的提取：分为骨针提取组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于罗丹明B透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于罗丹明B透皮后的皮肤，提取时间2min。
分别收集骨针提取组和对照组提取后的生理盐水，利用酶标仪根据罗丹明B的检测波长(激发波长：355nm和发射波长：580nm)检测其中的罗丹明B含量。结果表明，与对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内罗丹明B，参见附图4中A。
皮肤层中罗丹明B的测定：采用胶带剥离萃取法，用胶带依次剥离第1～10层角质层、分离活性表皮层并将真皮层部分切碎，分别浸于4mL PBS/甲醇＝1:1溶液中，室温条件下，160r/min，萃取24h。利用酶标仪根据罗丹明B的检测波长(激发波长：355nm和发射波长：580nm)检测其中的罗丹明B含量，分别得到角质层、表皮层和真皮层的罗丹明B含量。
线性关系考察：在上述体外透皮实验中，通过控制罗丹明B溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同含量罗丹明B的皮肤模型。在含有不同含量罗丹明B的皮肤模型中，针对每一个皮肤模型，采用骨针提取法测定罗丹明B提取浓度，分离皮肤各层后采用胶带剥离萃取法测定皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中罗丹明B含量；将各个含有不同含量罗丹明B的皮肤模型中，通过骨针提取法测得的罗丹明B提取浓度与所对应的通过胶带剥离萃取法测得的角质层、表皮层和真皮层罗丹明B含量制图，结果表明使用骨针提取得到的提取溶液中罗丹明B浓度(附图4中B、C、D横轴)与采用胶带剥离萃取法测得的皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中罗丹明B含量(附图4中B、C、D纵轴)具备良好的线性相关关系，参见附图4中B、C、D。即可根据骨针提取法测得罗丹明B浓度，代入线性相关关系式中，计算各皮层的罗丹明B含量。
实施例5
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入一定浓度的水杨酸溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮。通过控制水杨酸溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同水杨酸的皮肤模型。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
水杨酸的提取：分为骨针提取组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于水杨酸透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于水杨酸透皮后的皮肤，提取时间2min。
分别收集骨针提取组和对照组提取后的生理盐水，利用酶标仪根据水杨酸的检测波长(激发波长：308nm和发射波长：396nm)检测其中的水杨酸含量。结果表明，与对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内水杨酸，参见附图5中A。
皮肤层中水杨酸的测定：采用胶带剥离萃取法，用胶带依次剥离第1～10层角质层、分离活性表皮层并将真皮层部分切碎，分别浸于4mL PBS/甲醇＝1:1溶液中，室温条件下，160r/min，萃取24h。利用酶标仪根据水杨酸的检测波长(激发波长：308nm和发射波长：396nm)检测其中的水杨酸含量，分别得到角质层、表皮层和真皮层的水杨酸含量。
线性关系考察：在上述体外透皮实验中，通过控制水杨酸溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同含量水杨酸的皮肤模型。在含有不同含量水杨酸的皮肤模型中，针对每一个皮肤模型，采用骨针提取法测定水杨酸提取浓度，分离皮肤各层后采用胶带剥离萃取法测定皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中水杨酸含量；将各个含有不同含量水杨酸的皮肤模型中，通过骨针提取法测得的水杨酸提取浓度与所对应的通过胶带剥离萃取法测得的角质层、表皮层和真皮层水杨酸含量制图，结果表明使用骨针提取得到的提取溶液中水杨酸浓度(附图5中B、C、D横轴)与采用胶带剥离萃取法测得的皮肤各层(角质层、表皮层和真皮层)中水杨酸含量(附图5中B、C、D纵轴)具备良好的线性相关关系，参见附图5中B、C、D。即可根据骨针提取法测得水杨酸浓度，代入线性相关关系式中，计算各皮层的水杨酸含量。
实施例6
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入一定浓度的尿素溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮。通过控制尿素溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同尿素的皮肤模型。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
尿素的提取：分为骨针提取组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于尿素透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于尿素透皮后的皮肤，提取时间2min。
分别收集骨针提取组和对照组提取后的生理盐水，利用试剂盒根检测其中的尿素含量。结果表明，与对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内尿素，参见附图6中A。
皮肤层中尿素的测定：采用胶带剥离萃取法，用胶带依次剥离第1～10层角质层、分离活性表皮层并将真皮层部分切碎，分别浸于4mL PBS/甲醇＝1:1溶液中，室温条件下，160r/min，萃取24h。利用试剂盒检测其中的尿素含量，分别得到表皮层和真皮层的尿素含量。
线性关系考察：在上述体外透皮实验中，通过控制尿素溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同含量尿素的皮肤模型。在含有不同含量尿素的皮肤模型中，针对每一个皮肤模型，采用骨针提取法测定尿素提取浓度，分离皮肤各层后采用胶带剥离萃取法测定皮肤各层(表皮层和真皮层)中尿素含量；将各个含有不同含量尿素的皮肤模型中，通过骨针提取法测得的尿素提取浓度与所对应的通过胶带剥离萃取法测得的表皮层和真皮层尿素含量制图，结果表明使用骨针提取得到的提取溶液中尿素浓度(附图6中B、C横轴)与采用胶带剥离萃取法测得的皮肤各层(表皮层和真皮层)中尿素含量(附图6中B、C纵轴)具备良好的线性相关关系，参见附图6中B、C。即可根据骨针提取法测得尿素浓度，代入线性相关关系式中，计算各皮层的尿素含量。(说明：由于试剂盒的检测限度，无法准确检测出角质层中尿素含量)
实施例7
猪皮的前期处理：取新鲜的猪皮，除去皮下脂肪层，将猪毛剃至长度不长于2mm，立即使用或冻存于-20℃～-80℃备用。
体外透皮实验：用φ40nm的圆形打孔器钻取同样直径大小的猪皮，安装至Franz扩散透皮装置上，采用离体皮肤经皮电阻试验测定海绵骨针溶液作用前后皮肤的电导变化情况。海绵骨针作用前，离体猪皮的电导不高于10μA，则说明皮肤角质层屏障功能完好，可用于接下来的实验。在Franz扩散透皮装置下方腔室加入一定浓度的葡萄糖溶液(溶剂为生理盐水)，于37℃，600r/min透皮。通过控制葡萄糖溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同葡萄糖的皮肤模型。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
葡萄糖的提取：分为骨针提取组和对照组。
骨针提取组将100μL的蜂海绵骨针溶液直接涂抹于葡萄糖透皮后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min。
对照组不使用海绵骨针按摩处理，直接将300μL的生理盐水置于葡萄糖透皮后的皮肤，提取时间2min。
分别收集骨针提取组和对照组提取后的生理盐水，利用试剂盒根检测其中的葡萄糖含量。结果表明，与对照组相比，骨针提取组能有效提取皮肤内葡萄糖，参见附图7中A。
皮肤层中葡萄糖的测定：采用胶带剥离萃取法，用胶带依次剥离第1～10层角质层、分离活性表皮层并将真皮层部分切碎，分别浸于4mL PBS/甲醇＝1:1溶液中，室温条件下，160r/min，萃取24h。利用试剂盒检测其中的葡萄糖含量，分别得到表皮层和真皮层的葡萄糖含量。
线性关系考察：在上述体外透皮实验中，通过控制葡萄糖溶液的浓度或者透皮时间，从而获得含有不同含量葡萄糖的皮肤模型。在含有不同含量葡萄糖的皮肤模型中，针对每一个皮肤模型，采用骨针提取法测定葡萄糖提取浓度，分离皮肤各层后采用胶带剥离萃取法测定皮肤各层(表皮层和真皮层)中葡萄糖含量；将各个含有不同含量葡萄糖的皮肤模型中，通过骨针提取法测得的葡萄糖提取浓度与所对应的通过胶带剥离萃取法测得的表皮层和真皮层葡萄糖含量制图，结果表明使用骨针提取得到的提取溶液中葡萄糖浓度(附图7中B、C横轴)与采用胶带剥离萃取法测得的皮肤各层(表皮层和真皮层)中葡萄糖含量(附图7中B、C纵轴)具备良好的线性相关关系，参见附图7中B、C。即可根据骨针提取法测得葡萄糖浓度，代入线性相关关系式中，计算各皮层的葡萄糖含量。(说明：由于试剂盒的检测限度，无法准确检测出角质层中葡萄糖含量)
实施例8
体内实验：使用6-8周龄雄性SD大鼠，用一定量的水合氯醛麻醉后将其背部毛发剃除，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将透皮杯上部供体室粘在大鼠背部。进行一次血糖测量和骨针提取，随后腹腔注射一定量的葡萄糖溶液使得大鼠体内血糖含量变化，用于接下来的实验。
蜂海绵骨针溶液的配制：取一定量的蜂海绵骨针，加入生理盐水，使骨针浓度达到100mg/mL。
葡萄糖的提取与测定：分为骨针提取组和血糖组。
骨针提取组将100μL的海绵骨针溶液直接涂抹于剃除毛发后的皮肤上，电动按摩2min。将300μL的生理盐水置于骨针涂抹按摩后的皮肤，使生理盐水在皮肤表面停留以对渗出的荧光素钠进行提取，时间2min，随后收集提取后的生理盐水利用试剂盒测定其中葡萄糖含量。
血糖组在大鼠尾巴的静脉血管上割开一个小口，挤出一定血样，使用血糖试纸进行测定。骨针提取组和血糖组的测定在大鼠注射葡萄糖的0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h进行，得到不同血糖含量对应的骨针提取葡萄糖含量。
线性关系考察：在上述体内实验中，通过注射葡萄糖使得大鼠体内血糖开始变化，从而获得含有不同血糖值的大鼠模型。在含有不同血糖的大鼠中，采用骨针提取法测定葡萄糖提取浓度，将通过骨针提取法测得的葡萄糖提取浓度与所对应的血糖含量制图，结果表明使用骨针提取得到葡萄糖浓度(附图8中纵轴)与血糖(附图8中横轴)具备良好的线性相关关系，参见附图8。即可根据骨针提取法测得葡萄糖浓度，代入线性相关关系式中，计算大鼠血糖含量。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (15)
1.海绵骨针在体内目标物质提取中的用途。
2.海绵骨针在体内目标物质检测中的用途。
3.海绵骨针在制备体内目标物质的提取剂中的用途。
4.海绵骨针在制备体内目标物质的检测剂中的用途。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于：所述海绵骨针包括天然海绵骨针或人工制备的仿生海绵骨针中的至少一种。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于：所述海绵骨针包括蜂海绵骨针。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于：所述目标物质包括内源性目标物质或外源性目标物质中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述外源性目标物质包括药物或活性成分。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于：所述目标物质包括葡萄糖、尿素、水杨酸、罗丹明B或荧光素钠中的至少一种。
10.一种利用海绵骨针提取体内目标物质的方法，其特征在于：将所述海绵骨针涂抹于皮肤，使体内目标物质通过海绵骨针在皮肤上打开的微通道渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质，实现提取。
11.一种利用海绵骨针检测体内目标物质的方法，其特征在于：将所述海绵骨针涂抹于皮肤，使体内目标物质通过海绵骨针在皮肤上打开的微通道渗透出皮肤外，收集渗透出皮肤外的目标物质并检测其浓度或含量，以获得所述目标物质在体内的浓度或含量。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：涂抹于皮肤的海绵骨针的剂量为1～10mg/cm2。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法包括：
1)将海绵骨针涂抹于皮肤并按摩；
2)将提取液置于海绵骨针涂抹并按摩后的皮肤，对渗透出皮肤外的目标物质进行收集；
3)检测收集了目标物质的提取液中的目标物质的浓度或含量；
4)以体内目标物质的实际量与利用海绵骨针获得的渗透出皮肤的目标物质的检测量建立对应关系，以步骤3)获得的提取液中的目标物质的浓度或含量代入所述对应关系中，计算得到体内目标物质的量。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述提取液包括生理盐水或其他可用于皮肤的液体。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述按摩方式为电动按摩或手动按摩。
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