CN116829691A - 分子到体内细胞的脉冲电场转移 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将分子，特别是小分子和/或大分子，递送至体内细胞，特别是递送至在治疗上直接受益于分子功能的靶细胞的装置、系统和方法。在这样的情况下，使用脉冲电场(PEF)将分子驱动到靶细胞内，脉冲电场在所需时间并且以相对于脉冲电场的递送的所需浓度将分子递送通过靶细胞的细胞壁，以便所需的基因能够在细胞内发挥所需的作用。脉冲电场能量在体内和原位递送至靶细胞，驱动分子进入细胞。因此，在不使用病毒或离体方法(例如，体外电穿孔)的情况下，分子被递送到细胞内。

Description

分子到体内细胞的脉冲电场转移
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月4日提交的名称为“Enhanced Transfer with PulsedElectric Fields”的美国临时专利申请号63/061,114、2020年8月4日提交的名称为“Pulsed Electric Fields in the Eye”的美国临时专利申请号63/061,091，以及2021年6月10日提交的名称为“Induced Extravasation by Energy Delivery to Tissue”的美国临时专利申请号63/209,335的优先权和权益，所有上述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
基因创建了基于核苷酸的指令存储系统，其对细胞的存在、功能和复制至关重要。每个基因都由不同的核苷酸序列(一小段DNA)组成，这些核苷酸序列编码在生物体中具有特定功能的特定蛋白质。酶通过构建单链RNA分子来转录DNA片段。与DNA一样，RNA也是一链核苷酸。这种转录的RNA(即，信使RNA或mRNA)离开细胞核并进入细胞质，在细胞质内核糖体翻译mRNA以制造DNA指定的蛋白质。这些蛋白质是生命的基石。
然而，DNA复制过程并不完美，导致在复制过程中产生突变。通常，这些突变无关紧要，或者可以提高或降低蛋白质形成的功效。然而，有时基因突变会阻碍蛋白质的正常功能。这会产生许多疾病，例如癌症或诸如血友病、囊性纤维化等遗传病。当基因突变硬编码在父母的性染色体中时，这些性状可以遗传。有时，父母双方都必须有致病的受损基因，例如镰状细胞性贫血。在其他时候，单个染色体上的受损基因会导致疾病，例如从原癌基因转变为癌基因，导致失控的细胞分裂，而失控的细胞分裂可能导致癌症形成。
近几十年来研发了许多基因疗法，试图纠正或改善受这样的突变影响的蛋白质的产生。在一些情况下，基因疗法会植入正确版本的基因，从而产生正确的蛋白质。例如，编码凝血因子的基因已被引入血友病患者的身体内。在其他情况下，基因疗法会引发特定分子表达的上调，该上调增强正确蛋白质的细胞输出，例如引发细胞产生治疗诸如癌症等疾病的免疫刺激分子。
然而，将遗传物质引入细胞有其挑战。与其他许多生物分子和治疗化合物不同，DNA序列并非设计成穿过细胞膜。此外，它们缺乏会引起其他转运机制进入细胞的内吞因子。因此，所有基因疗法都需要至少两个特征的组合：治疗性编码分子(DNA序列、基因、siRNA等)和靶向细胞的给药途径。已经开发了几种方法来实现这一点。
病毒载体
病毒(包括慢病毒和腺相关病毒)非常适合递送遗传物质。就其性质而言，病毒依赖于将其病毒DNA或RNA递送到宿主细胞中来复制病毒材料，因此使它们成为基因疗法的强有力的候选者。通过载体递送基因或其他遗传物质被称为转导，被感染的细胞称为转导的细胞。
当利用病毒进行转导时，病毒中的致病基因被去除并替换为编码所需效果的所需基因(例如糖尿病患者的胰岛素生成)。这是通过使病毒感染宿主的基因保持完整的方式实现的。使用质粒将所需基因引入病毒。质粒是一种细胞内的小的染色体外DNA分子，其与染色体DNA物理分离。它们最常见的形式是细菌中的小环状双链DNA分子，但人工构建的质粒在基因工程中用作载体。感兴趣的基因通常通过不同的克隆方法(例如，限制酶连接、不依赖于连接的克隆、Gateway克隆和Gibson组装)插入到载体内。所选的克隆方法取决于质粒。在克隆过程之后，生成了包含感兴趣基因的重建载体。
在一些情况下，质粒本身不会复制，并且由于质粒降解、宿主细胞分裂或宿主细胞死亡，基因效应的效力可能会随着时间衰减。在其他情况下，遗传物质融合到宿主细胞的DNA中。虽然使用病毒载体将遗传物质持久整合到宿主的DNA中具有更有效的作用，但它也可能带来已知和未知的风险，并且如果该基因出现问题则无法逆转。病毒的诱病方面的灭活成本高昂且可能不全面，导致基因疗法患者面临感染风险。病毒也可能迁移到靶向位点基因疗法之外。病毒通常可以感染不止一种类型的细胞。因此，当使用病毒载体携带基因进入癌症患者的身体内时，病毒载体可能会感染健康细胞和癌细胞。同样地，新基因可能会在整合过程中插入DNA中的错误位置，这可能导致DNA发生有害突变，甚至引起癌症。这已经在针对X连锁重症联合免疫缺陷病(X-SCID)患者的临床试验中发生，在此临床试验中，使用逆转录病毒用纠正性转基因转导造血干细胞，这导致20名患者中有4名患上了T细胞白血病。此外，故意引入致病性或其他病毒会调用宿主的免疫系统。免疫系统可能会通过阻止转导来降低病毒基因疗法的有效性。此外，这种引起可能会对患者造成严重的副作用，并且已经报道了多例基于病毒的基因疗法导致的死亡。归根结底，基于病毒的基因疗法，尤其是靶向位点基因疗法，成本高、有风险，而且疗效不一。
电穿孔介导的基因转移
电穿孔作为一种破坏细胞膜完整性并导致悬浮细胞摄取大分子的方法已有三十多年的历史。通常，电穿孔通过使用电穿孔比色杯10和电穿孔器12来实现，如图1A-图1B所示。参见图1A，比色杯10由玻璃或塑料制成，并且包括用于接收细胞C的悬浮液的贮液器14。一对电极板16a、16b设置在贮液器14的相对侧上，以既定距离隔开。将细胞C悬浮在培养基中，培养基被吸取到比色杯10内。然后将比色杯10放置在电穿孔器12中，如图1B所示。电穿孔器12包含电容器，该电容器充有高压，并在指示下，将电容器内存储的电流放电到比色杯10中的细胞C样品中。电容放电电路产生电脉冲，该电脉冲具有峰值电压和指数衰减波形。电场强度是施加在电极板16a、16b之间的电压并且可以通过电场强度＝电压/距离来描述，其中距离是板16A、16b之间的距离。电场强度和细胞大小决定了跨每个细胞的电压降，因此确定了电穿孔中的电压效应。因此，通常针对细胞类型研发协议。同样地，可以针对每个协议更改诸如场强、时间常数和衰减脉冲宽度等参数。因此，体外环境允许非常精确地控制转染条件，允许高水平的基因递送而不杀死太大比例的细胞。
总的来说，体外转染对于生成基因效应的基本理解或产生转基因实验动物模型具有很高的可靠性。然而，它在实施可行的临床基因疗法方面存在困难。需要转染培养细胞要求几个附加的步骤才能转化为针对患者的疗法。大多数情况下，使用基于单采血液成分术的方法提供基因疗法。这涉及通过抽血或活检对患者的细胞进行取样。然后分离并浓缩靶细胞群。通常，细胞群也会被扩增以产生有意义的转染细胞群大小。一旦细胞准备好，它们就会被基因疗法分子电穿孔。转染后，细胞会重新分布在患者的身体内的必要位点，例如血液或靶器官中的靶位置。这些步骤增加了提供基因疗法的大量负担、成本、侵入性、时间和风险。总体而言，这些众多且实质性的缺点阻碍了广泛采用基于脉冲电场的基因疗法作为最可能的治疗选择。
总的来说，尽管基于基因的疗法提供了广泛的潜在应用，但这些疗法的临床转化仍处于起步阶段，主要是由于基因递送给药途径的局限性，这些途径昂贵、耗时、有风险、无效、或不适用于某些疾病状态。因此，需要改进基因疗法。这种治疗应该是安全、有效的，并能减少并发症。这种治疗也应该适用于涉及将其他类型的分子，特别是大分子，转移到细胞的疗法。这些目标中的至少一些将由本文描述的系统、装置和方法来满足。
发明内容
本文描述的是用于治疗身体内靶组织的设备、系统和方法的实施方式。同样地，本发明涉及以下编号的条款：
1.一种用于将分子转移到患者的身体内的靶组织细胞的系统，包括：
能量递送装置，具有至少一个能量递送体，所述至少一个能量递送体被配置为定位在所述身体内的所述靶组织细胞附近；和
与所述至少一个能量递送体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少一种能量递送算法，所述至少一种能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的电信号以便传输脉冲电场能量，所述脉冲电场能量使所述分子中的至少一个进入所述靶组织细胞的至少一个细胞。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中所述一系列脉冲包括具有正振幅的至少一个脉冲和具有负振幅的至少一个脉冲。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的电荷平衡。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述身体内的肌肉刺激。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述靶组织细胞的消融。
6.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，所述一系列脉冲包括振幅或脉冲宽度不同的至少一个脉冲。
7.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有在10-500V范围内的电压。
8.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有在0.5-200ms范围内的脉冲持续时间。
9.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，所述一系列脉冲具有在10ms-10s范围内的至少一个脉冲间延迟。
10.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括具有1-100个脉冲的一系列脉冲。
11.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一起具有0.5至500ms的持续时间的一系列脉冲。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有足够长度的基脉冲宽度以引起所述身体中的肌肉刺激，并且其中所述至少一个脉冲包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有足以至少减少所述肌肉刺激的分段延迟。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述基脉冲宽度在0.01-50000μs的范围内。
14.根据权利要求13所述的系统，其中由于多个分段脉冲和分段延迟包含到基脉冲宽度，所述至少一个脉冲具有1-100000μs的脉冲宽度。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述多个分段脉冲包括多达10000个分段脉冲。
16.根据权利要求15所述的系统，其中每个分段脉冲具有在0.05-5μs范围内的持续时间。
17.根据权利要求15所述的系统，其中每个分段延迟具有在0.001-10μs范围内的持续时间。
18.根据权利要求14所述的系统，其中每个分段脉冲具有在0.05-50μs范围内的持续时间。
19.根据权利要求14所述的系统，其中每个分段延迟具有在0.001-100ms范围内的持续时间。
20.根据权利要求14所述的系统，其中所述至少一个分段脉冲具有不超过10μs的接通时间。
21.根据权利要求12所述的系统，其中所述至少一个脉冲包括由10ms-10s的延迟分开的至少两个脉冲。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述至少两个脉冲具有相反的极性。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述一系列脉冲中的所述脉冲的每一个具有足够长度的基脉冲宽度以引起所述身体中的肌肉刺激，并且其中所述一系列脉冲中的所述脉冲的每一个包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有足以至少减少所述肌肉刺激的分段延迟。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述一系列脉冲中的所述脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的电荷平衡。
25.根据权利要求12-24中任一项所述的系统，其中所述至少一个脉冲具有在10-250V范围内的电压。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列双相脉冲，其中至少一个双相脉冲具有0.01-10μs的周期长度，并且其中所述至少一个双相脉冲包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有分段延迟。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述多个分段脉冲包括多达10000个分段脉冲。
28.根据权利要求27所述的系统，其中每个分段脉冲具有在0.004-0.4μs范围内的持续时间。
29.根据权利要求28所述的系统，其中每个分段延迟具有在10-10000μs范围内的持续时间。
30.根据权利要求28所述的系统，其中每个分段脉冲具有在0.05-50μs范围内的持续时间。
31.根据权利要求26所述的系统，其中每个分段延迟具有在0.001-100ms范围内的持续时间。
32.根据权利要求26所述的系统，其中所述至少一个分段脉冲具有不超过10μs的接通时间。
33.根据权利要求26所述的系统，其中所述一系列双相脉冲包括多达1000个周期。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的系统，其中所述一系列双相脉冲被分组为其间具有封包间延迟的封包。
35.根据权利要求26-34中任一项所述的系统，其中所述至少一个双相脉冲具有在500-2000V范围内的电压。
36.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中所述一系列脉冲包括至少一个高压、高频脉冲，然后是至少一个低压、低频脉冲，其中高压在100-1000V的范围内，高频具有50ns-1ms的脉冲宽度，低压在5-100V的范围内，低频具有1ms-50ms的脉冲宽度。
37.根据权利要求36所述的系统，其中所述至少一个低压、低频脉冲包括具有相反极性的至少两个低压、低频脉冲。
38.根据权利要求36所述的系统，其中所述至少一个低压、低频脉冲包括DC波形。
39.根据权利要求36所述的系统，其中所述至少一个高压、高频脉冲包括双相波形。
40.根据权利要求36所述的系统，其中所述至少一个高压、高频脉冲通过100μs-2秒的延迟与所述至少一个低压、低频脉冲分开。
41.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲包括至少一个尖峰。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述至少一个脉冲具有初级电压并且所述至少一个尖峰包括围绕所述初级电压振荡形成的多个尖峰。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述振荡在所述初级电压的1-25％的范围内。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述振荡在所述初级电压的1-10％的范围内。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的系统，其中所述至少一个脉冲包括多个尖峰，所述多个尖峰沿所述至少一个脉冲不均匀分布。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的系统，其中所述一系列脉冲是双相的。
47.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述能量递送装置包括具有一个或多个可从其延伸的尖齿的轴。
48.根据权利要求47所述的系统，其中所述能量递送装置被配置为通过所述一个或多个尖齿中的至少一个递送所述分子。
49.根据权利要求48所述的系统，其中与所述一个或多个尖齿中的至少另一个相比，所述能量递送装置被配置为通过所述一个或多个尖齿中的至少一个递送不同的分子。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的系统，其中所述至少一个能量递送体包括所述一个或多个尖齿中的至少一个。
51.根据权利要求50所述的系统，其中所述至少一个能量递送体包括可单独通电的所述一个或多个尖齿中的至少两个。
52.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个能量递送体包括篮形电极。
53.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述能量递送装置包括细长轴，并且其中所述至少一个能量递送体包括至少两个突起，每个突起从所述细长轴径向向外延伸。
54.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述发生器包括至少一种其他能量递送算法，所述至少一种其他能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的另一个电信号以便传输调节能量，所述调节能量在所述靶组织细胞的局部区域内引起流体从所述身体外渗。
55.根据权利要求54所述的系统，其中所述外渗来自所述患者的身体的脉管系统。
56.根据权利要求54-55中任一项所述的系统，其中所述局部区域包括所述靶组织细胞周围的间隙空间。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的系统，其中所述分子被递送至所述身体的脉管系统并且其中所引起的外渗将所述分子从所述脉管系统递送至所述局部区域。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的系统，其中所述另一个电信号包括多个单相脉冲，所述多个单相脉冲各具有超过500微秒的持续时间。
59.根据权利要求54-57中任一项所述的系统，其中所述另一个电信号包括多个脉冲，其中所述多个脉冲中的至少一个具有正振幅，并且其中所述多个脉冲中的至少一个具有负振幅。
60.根据权利要求59所述的系统，其中所述多个脉冲中的所述每一个具有超过500微秒的持续时间。
61.根据权利要求54-60中任一项所述的系统，其中所述能量递送装置包括至少一个压力传感器。
62.根据权利要求61所述的系统，其中所述至少一个压力传感器被配置为监控所述外渗的影响并提供传感器反馈数据。
63.根据权利要求62所述的系统，其中所述系统包括向用户提供所述传感器反馈数据或基于所述传感器反馈数据的信息的机制。
64.根据权利要求62所述的系统，其中所述发生器包括处理器，所述处理器被配置为基于所述传感器反馈数据修改所述至少一种能量递送算法或切换到不同的能量递送算法，以便传输调节外渗引起的能量。
65.根据权利要求1-60中任一项所述的系统，其中所述系统包括至少一个传感器。
66.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个传感器包括监控压力、温度、阻抗、电阻、电容、电导率、pH、光学特性、相干性、回声性、荧光、介电常数、光介电常数和/或电导的传感器。
67.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述发生器包括附加的能量递送算法，所述附加的能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的消融电信号以便传输引起所述靶组织细胞中的至少一个死亡的消融能量。
68.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括小分子和/或大分子。
69.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括质粒、DNA、合成DNA载体、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、靶向嵌合体的蛋白水解、锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
70.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包含至少一个大于5kb的基因。
71.根据权利要求70所述的系统，其中所述至少一个分子包括至少一个大于10kb的基因。
72.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括视网膜的细胞。
73.根据权利要求72所述的系统，其中所述视网膜的所述细胞包括视杆视锥层的细胞和/或视网膜色素上皮的细胞。
74.根据权利要求1-71中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括骨髓的细胞。
75.根据权利要求1-71中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括消化系统的细胞，所述消化系统包括肝脏、胰腺、肠和/或结肠。
76.根据权利要求1-71中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括心脏的细胞。
77.一种用于治疗患者的身体内的靶组织细胞的系统，包括：
能量递送装置，包括具有从其延伸的一个或多个尖齿的轴，其中所述一个或多个尖齿包括第一能量递送体和第二能量递送体，其中所述一个或多个尖齿被配置为定位在所述患者的身体内的所述靶组织细胞附近；
与所述第一和第二能量递送体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少第一能量递送算法，所述第一能量递送算法被配置为提供可递送至所述第一能量递送体的第一电信号，以及至少第二能量递送算法，所述第二能量递送算法被配置为提供可递送至所述第二能量递送体的第二电信号。
78.根据权利要求77所述的系统，其中所述第一电信号产生使至少一个分子转移到所述靶组织细胞中的至少一个的能量。
79.根据权利要求77-78中任一项所述的系统，其中所述第二电信号生成使至少一个靶组织细胞的消融的能量。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的系统，其中所述一个或多个尖齿中的至少一个从所述轴的远端沿其纵轴向远侧延伸，并且其中所述第二能量递送体沿其设置。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的系统，其中所述一个或多个尖齿中的至少一个从所述轴径向延伸，并且其中所述第一能量递送体沿其设置。
82.根据权利要求77所述的系统，其中所述一个或多个尖齿被配置为允许所述靶组织细胞的第一区域的消融并且允许将分子转移到所述靶组织细胞的第二区域。
83.根据权利要求82所述的系统，其中所述第二区域至少部分地围绕所述第一区域。
84.根据权利要求77-83中任一项所述的系统，其中能量递送装置被配置为使得所述一个或多个尖齿中的至少一个能够递送多个分子。
85.根据权利要求84所述的系统，其中与一个或多个尖齿中的至少另一个相比，所述能量递送装置被配置为通过所述一个或多个尖齿中的至少一个递送不同的分子。
86.根据权利要求77-85中任一项所述的系统，其中所述一个或多个尖齿中的至少一个是可调节地延伸的。
87.一种将分子转移到患者的身体内的靶组织细胞的方法，包括：
将多个分子递送至所述患者的身体；
将能量递送装置的至少一个能量递送体定位在靶组织的足够范围内，以接收从其递送的脉冲电场能量；和
将所述脉冲电场能量递送至所述至少一个能量递送体，以便以使所述分子中的至少一个进入所述靶组织的所述细胞中的至少一个的方式将所述脉冲电场能量传输至所述靶组织。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述靶组织细胞在治疗上直接受益于所述分子的功能。
89.根据权利要求88所述的方法，其中直接治疗受益包括病症的治疗。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述病症包括遗传病症。
91.根据权利要求87-90中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括小分子和/或大分子。
92.根据权利要求87-91中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括质粒、DNA、合成DNA载体、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、靶向嵌合体的蛋白水解、锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
93.根据权利要求87-92中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括至少一个大于5kb的基因。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述至少一个分子包括至少一个大于10kb的基因。
95.根据权利要求87-94中任一项所述的方法，其中将所述多个分子递送至所述身体包括将所述分子静脉递送至所述身体。
96.根据权利要求87-94所述的方法，其中将所述多个分子递送至所述身体包括将所述分子静脉递送至所述身体并局部递送至所述靶组织。
97.根据权利要求87-96中任一项所述的方法，其中递送所述多个分子至少发生在递送所述能量之前。
98.根据权利要求87-97中任一项所述的方法，其中递送所述多个分子包括将所述多个分子递送至所述靶组织内或所述靶组织附近的多个位置。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述多个位置在所述靶组织的所述至少一个细胞的0.5mm-5cm内。
100.根据权利要求98-99中任一项所述的方法，其中在多个位置递送所述多个分子包括将不同浓度的分子溶液、不同体积的分子溶液和/或不同类型的分子溶液递送至所述多个位置中的一个或多个。
101.根据权利要求87-99中任一项所述的方法，其中将所述多个分子递送至多个位置包括与所述多个位置中的另一个相比将不同的分子递送至所述多个位置中的至少一个。
102.根据权利要求87-101中任一项所述的方法，其中所述能量递送装置包括具有可从其延伸的一个或多个尖齿的轴，并且其中在多个位置处递送所述多个分子是由通过所述一个或多个尖齿中的一个或多个递送分子来实现的。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述递送所述多个分子包括与所述一个或多个尖齿中的至少另一个相比通过所述一个或多个尖齿中的至少一个递送不同的分子。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述能量递送装置包括具有可从其延伸的一个或多个尖齿的轴，并且其中所述至少一个能量递送体包括所述一个或多个尖齿中的至少一个，并且其中递送所述能量包括为所述多个尖齿中的至少一个提供能量。
105.根据权利要求104所述的方法，其中为所述多个尖齿中的至少一个提供能量包括单独地为所述多个尖齿中的至少一个提供能量，同时所述多个尖齿中的至少一个未被提供能量。
106.根据权利要求87-105中任一项所述的方法，还包括在所述身体的局部区域内引起流体外渗。
107.根据权利要求106所述的方法，其中引起外渗发生在递送能量之前。
108.根据权利要求106-107中任一项所述的方法，其中所述外渗增加分子向所述靶组织的递送。
109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中传递所述多个分子包括将所述多个分子递送至所述身体的脉管系统并且其中所述外渗来自所述脉管系统。
110.根据权利要求106所述的方法，其中引起外渗包括将调节能量递送至所述至少一个能量递送体，以便以在所述靶组织的局部区域内引起流体从所述身体外渗的方式将调节能量传输至所述身体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述调节能量来自另一个电信号，所述另一个电信号包括多个单相脉冲，所述多个单相脉冲各具有超过500微秒的持续时间。
112.根据权利要求110-111中任一项所述的方法，其中所述调节能量包括PEF能量。
113.根据权利要求87所述的方法，还包括在递送所述脉冲电场能量之前将调节能量递送到所述靶组织。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述调节增加所述靶组织对最终细胞死亡的细胞抵抗力。
115.根据权利要求87-114中任一项所述的方法，还包括在递送所述能量之前预热所述靶组织。
116.根据权利要求115所述的方法，其中预热所述靶组织包括将调节能量递送至所述靶组织。
117.根据权利要求87-116中任一项所述的方法，其中所述脉冲电场能量来自包括一系列脉冲的电信号，其中所述一系列脉冲包括具有正振幅的至少一个脉冲和具有负振幅的至少一个脉冲。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的电荷平衡。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述身体内的肌肉刺激。
120.根据权利要求117所述的方法，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述靶组织细胞的消融。
121.一种用于治疗患者眼睛的一部分的系统，包括：
具有至少一个电极体的仪器，所述电极体被配置为定位在所述眼睛中、所述眼睛上或所述眼睛附近；和
与所述至少一个电极体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少一种能量递送算法，所述至少一种能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个电极体的脉冲电场能量的电信号，以使至少一个分子进入所述眼睛的细胞。
122.根据权利要求121所述的系统，其中所述仪器包括具有远端的轴，其中所述至少一个电极体设置在所述轴的所述远端附近。
123.根据权利要求121-122中任一项所述的系统，其中所述轴被配置为可插入所述眼睛的玻璃体腔内。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的系统，其中所述至少一个电极体的至少一个被配置为可插入所述眼睛内的视网膜下泡内。
125.根据权利要求121-123中任一项所述的系统，其中所述至少一个电极体的至少一个被配置为可插入所述眼睛内的脉络膜上腔内。
126.根据权利要求121-123中任一项所述的系统，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对。
127.根据权利要求126所述的系统，其中所述双极电极体对包括第一电极体，其设置为可定位在视网膜泡内，而第二电极体设置为可定位在所述视网膜泡外。
128.根据权利要求126所述的系统，其中所述双极电极体对包括第一电极体，所述第一电极体设置为可定位在脉络膜上腔内，而第二电极体设置为可定位在所述脉络膜上腔外。
129.根据权利要求126所述的系统，其中所述双极电极体对包括第一电极体，所述第一电极体设置为可定位在玻璃体腔内，而第二电极体设置为可定位在所述玻璃体腔外。
130.根据权利要求126所述的系统，其中所述双极电极体对包括设置为可定位在第一位置处的第一电极体和设置为可定位在第二位置处的第二电极体，其中视网膜的一部分设置在所述第一位置和第二位置之间。
131.根据权利要求126所述的系统，其中所述双极电极体对的极性是可逆的。
132.根据权利要求121-125中任一项所述的系统，还包括返回电极，所述返回电极被配置为定位在距所述至少一个电极体中的至少一个一定距离处，使得所述至少一个电极体以单极方式起作用。
133.根据权利要求132所述的系统，其中所述返回电极被配置为抵靠或靠近所述眼睛的外表面定位。
134.根据权利要求133所述的系统，其中所述返回电极包括视网膜电图电极、窥器、隐形眼镜或镊子电极。
135.根据权利要求132所述的系统，其中所述返回电极被配置为至少部分地定位在球后空间中。
136.根据权利要求132所述的系统，其中所述返回电极被配置为至少部分地定位在脉络膜上腔中。
137.根据权利要求121-136中任一项所述的系统，其中所述仪器包括用于递送流体的管腔。
138.根据权利要求137所述的系统，其中所述仪器包括与所述内腔流体连通的至少一个出口，使得所述流体可递送到所述电极体中的至少一个附近。
139.根据权利要求137所述的系统，还包括所述流体，其中所述流体包括小分子和/或大分子。
140.根据权利要求121-139中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括小分子和/或大分子。
141.根据权利要求121-139中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括质粒、DNA、合成DNA载体、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、靶向嵌合体的蛋白水解、锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶、引起细胞行为的遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
142.根据权利要求121-141中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括至少一个大于5kb的基因。
143.根据权利要求142所述的系统，其中所述至少一个分子包括至少一个大于10kb的基因。
144.根据权利要求121-143中任一项所述的系统，其中所述细胞位于所述眼睛的视网膜内。
145.根据权利要求144所述的系统，其中所述细胞位于所述视网膜的视杆视锥层内。
146.根据权利要求144所述的系统，其中所述细胞位于所述视网膜的视网膜色素上皮内。
147.一种用于治疗患者眼睛的方法，包括：
将至少一个电极体定位在所述眼睛中或所述眼睛附近；
将至少一个分子引入到所述眼睛的一部分；和
将脉冲电场能量递送至所述至少一个电极体，以使所述至少一个分子中的至少一个进入所述眼睛内的细胞。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述脉冲电场能量包括一系列单相脉冲。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述一系列单相脉冲包括一系列低压脉冲。
150.根据权利要求147所述的方法，其中所述脉冲电场能量包括一系列双相脉冲。
151.根据权利要求147-150中任一项所述的方法，其中定位所述至少一个电极体包括将所述至少一个电极体的至少一个定位到所述眼睛的玻璃体腔中。
152.根据权利要求147-150中任一项所述的方法，其中定位所述至少一个电极体包括将所述至少一个电极体的至少一个定位到所述眼睛内的视网膜下泡中。
153.根据权利要求147-150中任一项所述的方法，其中定位所述至少一个电极体包括将所述至少一个电极体的至少一个定位到所述眼睛内的脉络膜上腔中。
154.根据权利要求147所述的方法，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对，并且其中定位所述至少一个电极体包括将第一电极体定位在视网膜下泡内以及将第二电极体定位在所述视网膜下泡外。
155.根据权利要求147所述的方法，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对，并且其中定位所述至少一个电极体包括将第一电极体定位在脉络膜上腔内以及将第二电极体定位在所述脉络膜上腔外。
156.根据权利要求147所述的方法，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对，并且其中定位所述至少一个电极体包括将第一电极体定位在玻璃体腔内以及将第二电极体定位在所述玻璃体腔外。
157.根据权利要求147所述的方法，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对，并且其中定位所述至少一个电极体包括将第一电极体定位在第一位置以及将第二电极体定位在第二位置位置，其中视网膜的一部分设置在所述第一位置和第二位置之间。
158.根据权利要求154-157中任一项所述的方法，还包括反转所述双极对的极性。
159.根据权利要求147所述的方法，其中所述细胞存在于所述眼睛的视网膜层内，并且还包括将能量递送至所述至少一个电极体以使所述至少一个分子中的至少一个进入所述视网膜的不同层内的细胞。
160.根据权利要求147所述的方法，还包括将返回电极定位在距所述至少一个电极体中的至少一个一定距离处，使得所述至少一个电极体能够以单极方式起作用。
161.根据权利要求160所述的方法，其中定位所述返回电极包括将所述返回电极抵靠所述眼睛的外表面或靠近所述眼睛的外表面定位。
162.根据权利要求161所述的方法，其中所述返回电极包括视网膜电图电极、窥器、隐形眼镜或镊子电极。
163.根据权利要求160所述的方法，其中定位所述返回电极包括将所述返回电极至少部分地定位在球后空间中。
164.根据权利要求160所述的方法，其中定位所述返回电极包括将所述返回电极至少部分地定位在脉络膜上腔中。
165.根据权利要求147-164中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括至少一个小分子和/或大分子。
166.根据权利要求147-164中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括质粒、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
167.根据权利要求147-164中任一项所述的方法，其中所述至少一个分子包括合成DNA载体。
168.根据权利要求147-167中任一项所述的方法，其中所述细胞位于所述眼睛的视网膜内。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述细胞位于所述视网膜的视杆视锥层内。
170.根据权利要求168所述的方法，其中所述细胞位于所述视网膜的视网膜色素上皮内。
在与附图相关的以下描述中更详细地描述了这些和其他实施方式。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地和个别地指出通过引用而并入每一个别出版物、专利或专利申请。
附图说明
在不一定按比例绘制的附图中，相似的数字可以在不同的视图中描述相似的组件。具有不同字母后缀的相似数字可以表示相似组件的不同实例。附图通过示例而非限制的方式总体地图示了本文档中讨论的各个实施方式。
图1A-图1B图示了传统的体外电穿孔系统的实施例。
图2图示了传输系统的实施例。
图3A图示了通过针将质粒直接注射到靶组织。
图3B图示了从插入图3A的针中适当位置的能量递送装置递送能量。
图4A图示了质粒通过能量递送体直接注射到靶组织。
图4B图示了从图4A的能量递送体传递能量。
图5图示了当本地递送能量，以及可选地也本地递送质粒时的局部递送的质粒。
图6图示了能量递送装置，其包括轴，该轴在其远端附近具有能量递送体，其中该能量递送体包括多个尖齿。
图7图示了包括能量递送体的能量递送装置，该能量递送体具有篮子形状，其被配置用于在腔内治疗靶组织。
图8图示了能量递送装置的另一个实施方式，该能量递送装置包括能量递送体，该能量递送体的形状被配置为用于腔内治疗靶组织，其中能量递送体包括至少两个突起，每个突起径向向外延伸以接触内腔壁。
图9图示了能量递送装置的另一个实施方式，该能量传递装置包括能量递送体，该能量递送体的形状被配置为用于腔内治疗靶组织，其中该能量递送体包括可扩张构件(例如可充气球囊)，其具有安装在其上或并入其中的电极。
图10图示了能量递送装置102的实施方式，其中递送体108具有配置为接触内腔壁的指尖形状。
图11A-图11C图示了外渗过程的实施方式的各个阶段。
图12A-图12B图示了由用于引起外渗的发生器的能量递送算法提供的脉冲电场(PEF)能量的示例波形。
图13图示了由具有PEF能量的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码质粒DNA的不同递送类型产生的数据。
图14图示了图13的数据作为平均值。
图15A-图15C图示了基于能量递送算法提供的DC电流的示例波形。
图16图示了极性交替的专用波形的实施方式，其中脉冲被“斩波”、分割或分段成相同相位的脉冲阵列。
图17图示了双相波形的实施方式，其中脉冲被“斩波”、分割或分段成相同相位的脉冲阵列。
图18A-图18C图示了具有高脉冲和短脉冲与低脉冲和长脉冲的组合的波形的实施方式。
图19图示了包括分组为封包的一系列脉冲的封包。
图20图示了包括一系列双相脉冲或周期的封包，每个双相脉冲具有切换时间延迟。
图21-图22图示了具有一系列高压、高频脉冲，然后是一系列低压、低频脉冲的波形的实施方式，其中该组合有助于将分子转移至靶细胞。
图23图示了脉冲波形的另一个实施方式。
图24A-图24C图示了由算法152提供的波形的附加实施方式，其中脉冲包括高频的快速振荡。
图25A-图25C图示了沿能量递送装置的远端设置在多个位置处的压力传感器。
图26图示了腔内能量递送装置的实施方式，其具有能量递送体和适当的机动性以方便放置和能量直接递送至器官(例如心脏)的壁。
图27图示了冠状动脉相对于主动脉以及图26的能量递送装置的位置的布置。
图28图示了视神经附近的视网膜的横截面部分。
图29图示了被配置用于将能量递送到眼睛的部分的能量递送系统的实施方式。
图30图示了用于产生视网膜下泡的过程的实施方式。
图31图示了将能量传递装置定位到眼睛中使得电极体定位在视网膜下泡内的实施方式。
图32A-图32B图示了在施加脉冲电场能量时已经进入视网膜色素上皮细胞的分子。
图33图示了一个实施方式，其中分子被递送至视网膜下泡并且电极体定位在视网膜下泡内用于向其单极能量递送。
图34图示了一个实施方式，其中分子被递送至视网膜下泡并且电极体定位在眼睛的玻璃体腔内用于向其单极递送。
图35图示了一个实施方式，其中分子被递送至玻璃体腔并且电极体也被定位在玻璃体腔中用于向其单极递送。
图36图示了设置在视网膜下泡内的分子和定位在眼睛中以双极方式将能量从一个递送到另一个的两个电极体。
图37图示了设置在玻璃体腔内的分子和定位在眼睛中以双极方式将能量从一个递送到另一个的两个电极体。
图38图示了设置在视网膜下泡和玻璃体腔内的分子以及位于眼睛中以双极方式将能量从一个递送到另一个的两个电极体。
图39图示了双极能量递送到眼睛，其中一个电极体被设置在玻璃体腔中并且一个电极体被设置在球后腔中，而分子被设置在视网膜下泡内。
图40图示了双极能量递送到眼睛，其中一个电极体被设置在视网膜下泡中并且一个电极体被设置在球后腔中，而分子被设置在视网膜下泡内。
图41图示了双极能量递送到眼睛，其中一个电极体被设置在视网膜下泡中并且一个电极体被设置在球后腔中，而分子被设置在玻璃体腔内。
图42图示了双极能量递送到眼睛，其中一个电极体被设置在视网膜下泡中并且一个电极体被设置在球后腔中，而分子被设置在视网膜下泡内和玻璃体腔内。
图43图示了一个实施方式，其中分子被递送到玻璃体腔并且第一电极体定位在玻璃体腔内而第二电极体抵靠角膜定位。
图44A-图44B图示了能量递送装置的实施方式，该能量递送装置被配置为将溶液(例如包含分子)递送到靶组织。
图45图示了能量递送装置的实施方式，显示了其远端的特写。
具体实施方式
提供了用于将分子，特别是小分子和/或大分子递送至身体内细胞，特别是递送至在治疗上直接受益于分子功能的靶细胞的装置、系统和方法。这种递送被认为是转移或生物转移。示例分子包括例如DNA质粒、RNA(例如信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA)、寡核苷酸、反义寡核苷酸(ASO)、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料等。在这种情况下，使用脉冲电场(PEF)将分子驱动到靶细胞中，脉冲电场将分子递送通过靶细胞的细胞壁，以便所需的基因能够在细胞内发挥所需的作用。因此，分子将在期望时间并以相对于脉冲电场递送的期望浓度被递送至体内的期望位置以获得最佳结果，如本文将描述的。可以通过多种方法，例如系统地、局部地和/或通过直接注射至靶细胞区域，将分子递送至身体。脉冲电场能量在体内和原位递送至靶细胞，驱动分子进入细胞。因此，在不使用病毒或离体方法(例如体外电穿孔)的情况下，分子被递送到细胞内。
这些装置、系统和方法优于其他方法(例如腺相关病毒(AAV)，其是一种已知的基于病毒的基因治疗)的递送。AAV的有效载荷能力有限；AAV只能容纳小于4.4kb的基因，并且用于遗传控制元件(例如启动子等)的空间有限。有超过300种疾病基因，对于基于AAV的基因疗法来说太大了。这些疾病基因包括导致许多相对常见疾病(例如，Stargardt病、Usher1B和1D、Leber先天性黑蒙10(LCA10)和囊性纤维化)的基因。相比之下，本文所述的非病毒递送可以容纳大于10kb的基因，并且不受空间限制。因此，许多不能使用AAV递送的基因可以通过本文所述的装置、系统和方法递送。此外，许多患者具有预存的抗AAV抗体，排除了AAV抗体的治疗，并且针对病毒蛋白或序列的免疫响应阻止了再次治疗。这种免疫学考虑与本文所述的非病毒递送方法无关，并且通常患者很好地耐受脉冲电场。此外，AAV基因治疗只能针对适合现有AAV血清型的组织和细胞类型。这些限制也不适用于本文所述的非病毒递送方法，因为脉冲电场递送适用于所有细胞类型和组织。
这些装置、系统和方法也优于将细胞递送至先前已被体外实验室技术转染的身体。如前所述，在将这种转染转化为患者的疗法时，转染培养的细胞需要几个附加步骤。这些步骤增加了递送基因疗法的大量负担、成本、侵入性、时间和风险。
尽管使用本文所述的装置、系统和方法避免了病毒递送和基于单采血液成分法的递送的缺点，但是使用PEF将分子直接转移至身体内细胞面临许多挑战。首先，这种转移涉及将各种装置和组件递送至身体中天然具有解剖学和生理学限制的靶位置。用于转移的分子的递送和/或PEF能量涉及的装置专门设计以用于进入身体内的靶组织，例如通过内窥镜，并将所需的成分递送到靶细胞。
此外，身体呈现出高度多变的靶组织和局部环境，这些靶组织和局部环境在面对生理反应、状况和过程时不断变化。定制分子和PEF能量递送方案，以在各种设置和面对不断变化的环境时最大限度地转移。在一些情况下，引起环境的变化以有利于方案并因此有利于结果。当在身体内所需的靶位置传递并浓缩分子以转移到靶细胞时，情况尤其如此。
其他挑战包括以使分子转移但最小化对靶细胞本身和/或任何周围细胞的任何潜在有害影响的方式将PEF能量递送至身体内的靶细胞。在一些情况下，PEF能量可用于消融组织而不是转移分子。消融涉及细胞死亡，这与基因疗法和依赖于细胞存活至少足够长时间以产生和引起转移分子的治疗效果的其他疗法的期望结果大相径庭。在一些情况下，PEF能够根据PEF波形和所采用的方案，通过一系列非热量机制和热量机制杀死细胞。这在使用高电压时尤为相关。因此，为了产生更多转移，简单地增加电压可能是有害的，导致不期望的细胞死亡。所以，许多变量都被仔细优化和平衡，以实现无致死性转移。
在一些情况下，优化装置设计以控制身体内转移的独特情况。从装置上的电极发出的能量，例如使用远程返回电极以单极方式发出的能量，可能会导致最靠近电极的细胞接收高能量水平，并随着与电极的距离呈指数下降。因此，能带可能导致最接近电极的细胞可能死亡，而更远的细胞接收转移的细胞，甚至更远的细胞不受影响。这些带可能都存在于距电极几毫米的范围内。增加电压可能会加剧这种细胞死亡，使大体积和/或高总细胞计数转移变得困难。对于在受控距离处的平板电极实验室技术几乎不适用的身体内递送来说，这些挑战是特有的。
此外，身体内递送涉及关注整个身体环境和对递送过程的潜在反应。特别地，不期望的肌肉收缩是潜在的结果，特别是在使用为体外实验室技术设计的常规转染方法时。这些技术涉及作为转染过程的一部分的长持续时间(例如，μs的100s到ms的100s)波形的递送。在体内，这激活了运动神经元和骨骼肌，其能导致患者受伤(例如，从桌子上掉下来、装置在患者身体内移动等)、引起疼痛(例如，需要局部或全身麻醉)或影响疗法结果(例如通过治疗过程中的电极迁移)。神经肌肉麻痹可有助于降低这种风险，但这涉及全身麻醉，并且经常不足以充分减轻收缩。
本文所述的装置、系统和方法克服了这些特有的挑战，将身体中PEF转移带到临床相关的、可转化的、潜在治疗技术的前沿。
这些装置、系统和方法使用能量递送系统将能量递送至细胞。通常，能量递送系统包括专用能量递送装置、波形发生器和至少一种不同的能量递送算法。可以使用附加的附件和器材。例如，在一些实施方式中，能量递送装置通过内窥镜递送，通常针对内窥镜正在使用的解剖位置，例如胃镜(上消化道(包括胃、食道和小肠(十二指肠)内窥镜检查)、结肠镜(大肠)、支气管镜(肺)、喉镜(喉)、膀胱镜(泌尿道)、十二指肠镜(小肠)、肠镜(消化系统)、输尿管镜(输尿管)、宫腔镜(宫颈、子宫)等。可以理解，在其他实施方式中，能量递送装置可通过导管、护套、导引器、针或其他递送系统递送。
腔内通路允许从身体内不同腔内治疗靶组织。管腔是身体内管状或中空结构内部的空间，包括通道、食道、管道和腔等。示例管腔结构包括血管、食道、胃、小肠和大肠、结肠、膀胱、尿道、集尿管、子宫、阴道、输卵管、输尿管、肾脏、肾小管、椎管、脊髓，以及整个身体中的其他结构，以及内部结构，包括肺、心脏和肾脏等器官。在一些实施方式中，通过附近的管腔结构进入靶组织。在一些情况下，能量递送装置被推进通过各种管腔结构或管腔系统的分支以到达靶组织位置。例如，当通过血管进入靶组织部位时，能量递送装置可以远程插入并被推进通过脉管系统的各个分支以到达靶部位。同样地，如果管腔结构起源于自然孔口，例如鼻子、嘴巴、尿道或直肠，则可以通过自然孔口进入，然后能量递送装置被推进通过管腔系统的分支以到达靶组织位置。或者，可以通过切口或其他方法在靶组织附近进入管腔结构。当进入不是大型系统的一部分或以其他方式难以进入的管腔结构时，可能会出现这种情况。
可以理解，可以使用本文描述的系统和方法在腔内治疗多种解剖位置。示例包括管腔结构本身、位于管腔结构附近的遍布身体的软组织和可从管腔结构进入的实体器官，包括但不限于肝脏、胰腺、胆囊、肾脏、前列腺、卵巢、淋巴结和淋巴引流管、下层肌肉组织、骨组织、脑、眼睛、甲状腺等。还可以理解，可以经皮或通过其他方法进入各种组织位置。
可以在全身的任何位置治疗靶组织细胞，包括消化系统的细胞(例如，口腔、腺体、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、肠、结肠、直肠、肝脏、胆囊、胰腺、肛管等)、呼吸系统细胞(例如，鼻腔、咽喉、气管、支气管、肺等)、泌尿系统细胞(例如，肾脏、输尿管、膀胱、尿道等)、生殖系统细胞(例如，生殖器官、卵巢、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、附睾、输精管、精囊、前列腺、腺体、阴茎、阴囊等)、内分泌系统细胞(例如，垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)、循环系统细胞(例如，心脏、动脉、静脉等)、淋巴系统细胞(例如，淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏等)、神经系统细胞(例如，大脑、脊髓、神经、神经节等)、眼睛的细胞(例如，视网膜、伤斑、杆状锥状层，视网膜色素上皮视神经、脉络膜、巩膜等)、肌肉系统的细胞(例如，肌细胞等)和皮肤的细胞(例如，表皮、真皮、皮下组织等)等。
能量递送装置根据所述至少一种不同的能量递送算法递送波形发生器提供的能量。可以理解，在一些实施方式中，能量递送装置也递送分子。然而，在其他实施方式中，通过单独的装置(例如，通过IV、导管或针头注射)递送分子。可选地，分子可以由能量递送装置和单独的装置两者递送。此处提供的专用能量递送装置的示例实施方式主要专注于单极能量递送，然而，可以理解，可以使用双极或多极布置。
图2图示了能量递送系统100的实施方式，该能量递送系统100包括专用能量递送装置102、返回电极115和波形发生器104。在该实施方式中，靶组织位于患者P的肝脏L内。在该实施方式中，能量递送装置102包括具有远端的柔性细长轴，该远端能够被腔内推进到肝脏L内的靶组织。如图所示，递送装置102的远端被推进通过嘴M，向下通过食道E，进入胃S，在胃S内，该远端穿过胃壁进入肝脏L。在一些实施方式中，远端具有配置为穿透胃壁和/或肝脏L的远端尖端103。在其他实施方式中，使用单独的仪器形成穿过胃壁的通道，然后将仪器移除，使得具有无创伤尖端的能量递送装置102能够穿过该通道。
在该实施方式中，使用IV袋112系统地、静脉内递送分子110。这通常将分子110分散到患者P的整个身体，包括分散到肝脏L内的靶组织。可以理解的是，在其他实施方式中，局部递送分子110。在这样的实施方式中，分子110可以被递送至通向靶器官或组织区域的动脉系统上游的脉管系统。然后分子110行进通过下游动脉循环进入靶区域。如果提供分子110的弹丸式注射，则突然涌入的分子110将进入靶组织。然而，如果随时间递送分子110，例如使用输液泵，则可以在靶组织中实现稳定、持续水平的分子110。可以理解，在其他实施方式中，通过直接注射将分子110递送至靶组织。在这样的实施方式中，将注射装置插入靶组织中或靶组织附近，例如靶器官区域的实质组织内，并注射包含影响遗传物质的溶液。可以允许分子溶液一段时间以使其通过薄壁组织和间隙空间分布以到达用于转移的靶区域或体积。可以理解，可以替代地使用全身、区域和局部递送的任何组合。
脉冲电场能量通过递送装置102的远端递送至靶组织。递送装置102的近端与波形发生器104电连接。在一些实施方式中，发生器104还与外部心脏监控器(未示出)连接以允许能量与从患者P感测到的心脏信号协调递送。
在该实施方式中，能量递送装置102被设计成单极的，其中递送装置102的远端具有递送电极并且返回电极115定位在身体外的皮肤上，通常在大腿上(如图所示)、下背部或背部上。
脉冲电场(PEF)由发生器104提供，并通过放置在靶组织区域上、靶组织区域中或靶组织区域附近的能量递送体108递送到组织。可以理解，在一些实施方式中，能量递送体108定位成与导电物质接触，导电物质同样与靶组织接触。这样的溶液可以包括等渗或高渗溶液。然后通过靶组织附近的能量递送体108递送电脉冲。这些电脉冲由至少一种能量递送算法152提供。算法152指定信号的各种参数，这些参数导致波形的整体形状，例如能量幅度(例如电压)和施加能量的持续时间，其由脉冲数、脉冲宽度和脉冲之间的延迟等组成。在一些实施方式中，所述能量递送体中的一个或多个很小并且易于在电极周围耗散大量能量。因此，需要最佳的能量递送。在一些实施方式中，在这种情况下，利用具有半晶体管桥的大直流链路电容来递送有效的递送脉冲。在一些情况下，这优选与功率放大器(有限带宽)或指数衰减发生器递送的脉冲电压有关。在一些实施方式中，可以包括基于传感器信息和自动关闭规范的反馈回路等。
如将在后面部分中描述的，在一些实施方式中，可以使用双相脉冲。在这样的实施方式中，附加参数可以包括双相脉冲中的极性之间的切换时间和双相循环之间的停滞时间。双相波形可用于减少患者的肌肉刺激。这在能量递送体的轻微移动可能导致无效疗法或有害后果的应用中尤为重要。双相波形涉及信号的相位/极性的快速变化，以最小化极性转换期间的神经激活。例如，在H桥结构或全桥中需要并采用以及配置多个快速开关元件(例如MOSFET、IGBT晶体管)。
返回参考图1，在本实施方式中，发生器104包括用户界面150、一种或多种能量递送算法152、处理器154、数据存储/检索单元156(诸如存储器和/或数据库)以及生成和储存待递送的能量的储能子系统158。在一些实施方式中，使用一个或多个电容器来储存/递送能量，然而，可以使用任何其他合适的储能元件。此外，还可包括一个或多个通信端口。
在一些实施方式中，发生器104包括三个子系统：1)高能量存储系统，2)高电压、中频开关放大器和3)系统控制器、固件和用户界面。发生器采用交流(AC)电源为多个直流(DC)电源供电。发生器的控制器可以使DC电源在启动能量递送之前为高能量电容器储能组充电。在一些实施方式中，在启动能量递送时，发生器的控制器、高能量储能组和双相脉冲放大器可以同时操作以创造高电压、中频输出。
应当理解，可以采用多种发生器电气架构来执行能量递送算法。特别地，在一些实施方式中，使用高级开关系统，其能够将脉冲电场电路引导到与同一能量存储和高电压递送系统分开的能量递送电极。此外，在采用快速变化的脉冲参数(例如，电压、频率等)或多个能量递送电极的高级能量递送算法中采用的发生器可以利用模块化能量存储和/或高电压系统，从而有助于高度可定制的波形和地理脉冲递送范式。还应当理解，本文以上所述的电气架构仅为举例说明，并且递送脉冲电场的系统可以包括或者可以不包括附加开关放大器组件。
用户界面150可以包括触摸屏和/或更传统的按钮，以允许操作者输入患者数据、选择处理算法(例如，能量递送算法152)、启动能量递送、查看存储/检索单元156上储存的记录，和/或以其他方式与发生器104通信。
在一些实施方式中，用户界面150被配置为接收操作者定义的输入。操作者定义的输入可以包括能量递送的持续时间，能量递送脉冲的一个或多个其他时序方面、功率和/或操作模式，或者其组合。示例操作模式可以包括(但不限于)：系统启动和自检、操作者输入、算法选择、处理前系统状态和反馈、能量递送、能量递送后显示或反馈、治疗数据审查和/或下载、软件更新，或者其任何组合或子组合。
在一些实施方式中，除其他活动外，处理器154在能量递送算法之间修改和/或切换，监控能量递送和任何传感器数据，并经由反馈回路对监控数据作出反应。在一些实施方式中，处理器154被配置为基于一个或多个测量的系统参数(例如，电流)、一个或多个测量的组织参数(例如，阻抗)和/或它们的组合执行用于运行反馈控制回路的一个或多个算法。
数据存储/检索单元156存储数据，例如与递送的治疗相关的数据，并且可以可选地通过将装置(例如，膝上型电脑或拇指驱动器)连接到通信端口来下载。在一些实施方式中，装置具有用于指导信息下载的本地软件，例如存储在数据存储/检索单元156上并可由处理器154执行的指令。在一些实施方式中，用户界面150允许运营商选择将数据下载到装置和/或系统，例如但不限于计算机装置、平板电脑、移动装置、服务器、工作站、云计算设备/系统等。可允许有线和/或无线连接的通信端口可允许数据下载，如刚刚描述的，但也可用于数据上传，例如上传自定义算法或提供软件更新。
如本文所述，多种能量递送算法152可编程或可预编程到发生器104中，例如存储在存储器或数据存储/检索单元156中。备选地，能量递送算法可添加到数据存储/检索单元中以由处理器154执行。这些算法152中的每一个都可以由处理器154执行。
在一些实施方式中，能量递送装置102包括一个或多个传感器，其可用于确定温度、阻抗、电阻、电容、电导率、pH、光学特性(相干性、回声性、荧光)、电或光介电常数，和/或电导等。在一些实施方式中，所述电极中的一个或多个充当一个或多个传感器。在其他实施方式中，一个或多个传感器与电极分开。传感器数据可用于规划疗法、监控疗法和/或通过处理器154提供直接反馈，处理器154然后可改变能量递送算法152。例如，阻抗测量不仅可用于确定要施加的初始剂量，而且还可用于确定是否需要进一步的能量递送。
可以理解的是，在一些实施方式中，系统100包括自动化处理递送算法，该算法响应于诸如温度、各种电压或AC频率下的阻抗、能量递送脉冲的持续时间或其他时序方面、治疗功率和/或系统状态，以动态响应以及调节和/或终止递送。
装置实施方式
能量可由多种能量递送装置102递送。通常，能量递送装置102包括具有远端的柔性细长轴，其能够被推进到身体内的靶组织，以及设置在远端附近的至少一个能量递送体108。能量递送体108包括将PEF能量递送至靶组织的一个或多个电极。
如前所述，在一些实施方式中，能量递送装置102递送PEF能量并且分子110通过单独的装置(例如,通过IV、导管或针注射)递送。图3A图示了通过针500将分子110直接注射到靶组织。靶组织示为细胞C(未按比例)。将针500插入靶组织中或靶组织附近，使得注射的分子110能够浸润靶组织。在该实施方式中，然后移除针500并且分子110停留用于生物分布。参考图3B，然后将递送装置102的远端插入靶组织中，使得能量递送体108期望地定位在靶组织内或靶组织附近。在该实施方式中，能量递送体108由单个电极组成。然后PEF能量从能量递送体108递送到靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
在一些实施方式中，分子110和能量由能量递送装置102递送。图4A-图4B示出了具有针形的能量递送体108的能量递送装置102。针形的尖端能够像针一样穿透并递送分子110通过其内腔。此外，除了作为电极的针形的尖端以外，能量递送体108与绝缘层504电绝缘。图4A图示了分子110通过能量递送体108直接注射到靶组织。再一次地，靶组织被图示为细胞C(未按比例)。将尖端插入靶组织中或靶组织附近，使得注射的分子110能够沐浴靶组织并且可选地停留用于生物分布。参考图4B，然后PEF能量从能量递送体108递送到靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
图5示出了当局部递送能量(以及可选地，另外局部递送分子110)时区域递送的分子110。这里，分子110由单独的装置递送，例如由定位在供给靶组织区域的脉管系统V内的导管501递送。因此，分子110被局部递送至靶组织区域。能量递送装置102从不同的途径插入靶组织区域。这里，能量递送装置102包括具有针形的能量递送体108。针形的尖端能够像针一样穿透。在一些实施方式中，分子110能够递送通过其内腔。在本实施方式中，除了用作电极的针形尖端之外，能量递送体108与绝缘层504电绝缘。将尖端插入靶组织中或靶组织附近，然后将PEF能量从能量递送体108递送至靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到靶细胞中。
图6图示了包括轴106的能量递送装置102，该轴106在其远端附近具有能量递送体108，其中能量递送体108包括多个尖齿600。通常，尖齿600具有尖头形状以便穿透组织。同样地，尖齿600通常从轴106横向向外延伸，并且在一些实施方式中尖齿600围绕轴106周向部署。可以理解，在一些实施方式中，尖齿600从轴106的一侧展开,例如排成一行。在一些实施方式中，尖齿600从轴106延伸相同的距离，而在其他实施方式中，尖齿600延伸不同的距离。可以理解，在一些实施方式中，至少一些尖齿600从轴106的延伸是可调节的。
通常，每个尖齿600从其递送分子110和/或能量。在一些实施方式中，分子110从尖齿600的尖端601递送，而在其他实施方式中，分子110从递送端口602沿尖齿600递送。在一些实施方式中，尖齿600可一起通电(例如，以便充当单个电极)或至少一些尖齿600可单独通电(例如，以便充当双极对或充当可选择的单个电极，包括成组起作用)。在一些实施方式中，一个或多个尖齿600递送不同的能量(例如，由不同的能量递送算法152产生)和/或不同类型的分子110。
在该实施方式中，轴106具有三个部分：第一部分106a、第二部分106b和第三部分106c。如图6所示，第一部分106a远离第二部分106b，第二部分106b远离第三部分106c。每个部分106a、106b、106c可以绝缘或非绝缘，以便创造各种不同的电极组合。这可以允许各种电场形状和/或在期望的方向上引导电场。还可以理解，在一些实施方式中，至少一个尖齿600的至少一部分绝缘，以便引导从其发出的能量。总的来说，与使用包括单个针的能量递送装置108的装置102相比，使用能量递送装置102的单次放置，尖齿600通常能够将分子110和/或能量递送至更大体积的靶组织。
在一些实施方式中，第一部分106a充当能量递送体108并且一个或多个尖齿600充当能量递送体108。不同的能量递送体108中的每一个可以递送相同或不同类型的能量；同样地，能量递送体108可以成组起作用。在一些实施方式中，尖齿600延伸经过第一部分106a。在一些实施方式中，尖齿600从轴106延伸相同的距离(相对于第一部分106a)，而在其他实施方式中尖齿600延伸不同的距离(相对于第一部分106a)。在一些实施方式中，第一部分106a充当能量递送体108并且一个或多个尖齿600充当用于递送分子110的导管。
图7图示了能量递送装置102，该能量递送装置102包括具有篮状的能量递送体108，其被配置用于在腔内治疗靶组织。这里，靶组织包括细胞C，该细胞C设置在体腔的壁W附近，特别是至少部分地周向地包裹体腔。在此实施方式中，能量递送体108由多根线材或带材120组成，形成用作电极的螺旋形篮。在一些实施方式中，能量递送体108可自扩张并且以塌缩构型递送至靶区域。例如，可以通过在能量递送体108上放置鞘套来实现这种塌缩构型。鞘套的缩回或能量递送体108从鞘套的推进允许能量递送体108自扩张。在其他实施方式中，能量递送装置102包括具有能量递送体操纵旋钮的手柄，其中旋钮的运动引起篮形电极的扩张或缩回/塌缩。篮形电极可在体腔或通道内扩张(在身体内自然产生或创造)，以便接触腔壁W的至少一部分。例如沿装置102的轴106通过远端端口510和/或通过各个侧端口512(例如在篮形电极内)，分子110从能量递送装置102递送，如图7所示。分子110能够沐浴靶组织并且可选地停留以进行生物分布。然后PEF能量从能量递送体108递送到靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
图8图示了能量递送装置102的另一个实施方式，该能量递送装置102包括能量递送体108，其具有被配置用于腔内处理靶组织的形状。在该实施方式中，能量递送体108包括至少两个突起514，每个突起径向向外延伸以便接触内腔壁W。可以理解，虽然可能存在单个突起，但是通常存在两个突起以对内腔壁施加大致相反的力。在图8的实施方式中，存在三个突起514。在一些实施方式中，每个突起514由线或带形成，其用作电极并从递送装置102的纵轴或轴106径向向外弯曲或弯曲的。在该实施方式中，突起514一起充当单个电极。然而，在其他实施方式中，一个或多个突起514可独立地通电以便充当多个电极(例如，作为一个或多个双极对)。突起514可以由各种合适的材料(例如，不锈钢、弹簧钢或其他合金)组成以充当电极，并且可以是例如圆线或带。在一些实施方式中，突起514的一部分与诸如聚合物(例如，PET、聚醚嵌段酰胺、聚酰亚胺)的绝缘段绝缘。例如，在一些实施方式中，能量递送体108的近端和远端的至少一部分绝缘以将能量横向地导向壁W。
在一些实施方式中，图8的能量递送体108可自扩张并且以塌缩构型递送至靶区域。突起在体腔或通道内扩张期间向外弯曲(在体内自然发生或创造)，以便接触腔壁W的至少一部分。分子110从能量递送装置102诸如经由能量递送体108内的端口516递送，如图8所示。分子110能够沐浴靶组织并且可选地停留以进行生物分布。然后PEF能量从能量递送体108递送到靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
图9图示了能量递送装置102的另一个实施方式，该能量递送装置102包括能量递送体108，其具有被配置用于腔内处理靶组织的形状。在该实施方式中，能量递送体108包括可扩张构件518，例如可充气气球，具有安装在其上或并入其中的电极520。能量递送体108以塌缩构型递送至靶区域。在该实施方式中，电极520具有垫的形式，其具有相对宽的表面积和薄的横截面。与其他形状(例如线形)相比，垫形状提供了更宽的表面积。每个电极520与导线522连接，导线522将电极520与发生器电连接。在该实施方式中，三个电极520可见，然而可以理解，附加电极可以存在于可扩张构件518周围。可以理解，可以存在任意数量的电极520，充当单个电极或独立地或组合起作用。电极520的放置和/或电极520的选择性通电可以将能量引向特定靶位置。在一些实施方式中，电极520由附接到可扩张构件518或形成在可扩张构件518中的柔性电路垫或其他材料组成。在一些实施方式中，电极520围绕可扩张构件518的周围径向分布和/或沿着可扩张构件518的长度纵向分布。这样的设计可以促进改进展开和缩回质量，便于用户操作以及与引入器管腔兼容。
在可扩张构件扩张时，所述电极520中的一个或多个被定位成接触内腔壁W的至少一部分。分子110例如通过远端端口510从能量递送装置102递送，如图9所示。分子110能够沐浴靶组织并且可选地停留以进行生物分布。然后PEF能量从能量递送体108递送到靶组织，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
图10图示了能量递送装置102的另一个实施方式。这里，能量递送体108具有配置为接触内腔壁W的指尖形状。在该实施方式中，能量递送装置102具有细长轴106和设置在其远端尖端处指尖电极530。指尖电极530可抵靠靶组织细胞C附近的内腔壁W的部分定位。分子110可通过任何合适的方法例如全身地、区域地或局部地(例如，通过单独的装置或通过能量递送装置102注射)来递送。图10图示了分子110通过指尖电极530的递送。给指尖电极530通电将PEF能量导向细胞C，如波浪线502所示。PEF能量将分子110转移到细胞C中。
可以理解，在一些实施方式中，PEF能量被递送至与靶组织接触的导电流体(例如，血液、盐水等)。因此，能量能够穿过导电流体到靶组织以用于转移。在其他实施方式中，向导电流体递送能量促进遗传物质转移到流体本身的细胞中，例如转移到血液中的白细胞内。
分子
如前所述，提供了用于将分子110，特别是小分子和/或大分子，递送至体内细胞，例如递送至在治疗上直接受益于分子功能的靶细胞的装置、系统和方法。这种治疗益处可存在于多种病症的治疗中。
在一些实施方式中，病症包括凝血病症，诸如血友病(例如，血友病A或血友病B)、血管性血友病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原病症或维生素K缺乏症。凝血病症可以以编码纤维蛋白原、凝血酶原、V因子、VII因子、VIII因子、X因子、XI因子、XIII因子或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因突变为特征。在一些实施方式中，凝血病症的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
在一些实施方式中，病症包括神经病症，例如神经退行性疾病。在一些实施方式中，神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化症。在一些实施方式中，神经退行性疾病包括中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病，例如多发性硬化症、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病或眼阵挛性肌阵挛综合征。神经病症可以是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病(例如，癫痫或偏头痛)。神经病症可以是焦虑障碍、情绪障碍、儿童障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。在一些实施方式中，神经病症是脑梗塞、中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
在一些实施方式中，病症包括溶酶体贮积症，例如泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-匹克病或粘多糖贮积症(MPS)。
在一些实施方式中，病症包括心血管病症，例如退化性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。心血管病症可以是选自缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷的退化性心脏病。
在一些实施方式中，病症包括免疫病症，例如自身免疫病症。自身免疫性病症可以是1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病或眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、牛皮癣、肌无力重症、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、周围神经病、纤维肌痛、桥本氏甲状腺炎、溃疡性结肠炎或川崎病。
在一些实施方式中，所述病症包括肝病，例如肝炎、Alagille综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积疾病、威尔逊氏病或内分泌缺陷。肝病可以是肝癌，例如肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
在一些实施方式中，病症包括癌症，诸如血癌(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤)或实体组织癌(例如，肝癌、肾癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌)。
在一些实施方式中，病症包括隐性遗传病症。在一些实施方式中，病症是孟德尔遗传病症。
在一些实施方式中，该病症包括视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良)的眼部病症。视网膜营养不良可包括莱伯先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、杆锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、斯蒂克勒综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、视网膜色素变性、CSNB 2、Usher综合征或Wagner综合征。
在一些实施方式中，本文所述的装置、系统和方法递送的分子110包括合成DNA载体，例如2019年3月15日提交的名称为“Synthetic DNA Vectors and Methods of Use”的公开号WO2019178500中描述的合成DNA载体，其出于所有目的而整体并入本文。这样的合成DNA载体包括非病毒DNA载体，诸如以类似于AAV载体的方式提供静止细胞(例如，有丝分裂后细胞)的长期转导的非病毒DNA载体。在一些实施方式中，这样的非病毒DNA载体由体外(例如，无细胞)系统开发以通过等温滚环扩增和连接介导的环化(例如，与细菌表达和位点特异性重组相反)合成产生环状AAV样DNA载体(例如，包含末端重复序列的DNA载体，诸如DD元件)。这种研发可以提高环状AAV样DNA载体生产的规模性和制造效率。此外，通过这些方法产生的载体旨在克服与质粒-DNA载体相关的许多问题，例如Lu等人，Mol.Ther.2017,25(5):1187-98中讨论的问题，其全部内容通过引用并入本文。例如，通过消除或减少CpG岛和/或细菌质粒DNA序列(例如，RNAPII停滞位点)的存在，可以减少或消除转录沉默，导致异源基因的持久性增加。此外，通过消除免疫原性成分(例如，细菌内毒素、DNA或RNA，或细菌特征，诸如CpG基序)的存在，刺激宿主免疫系统的风险降低。这样的益处在某些病症(诸如视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良))的治疗中特别有利。
因此，这样的载体包括合成DNA载体，其：(i)基本上没有细菌质粒DNA序列(例如，RNAPII停滞位点、复制起点和/或抗性基因)和其他细菌特征(例如，免疫原性CpG基序)；和/或(ii)可以在试管中完全合成和扩增(例如，在细菌中的复制是不必要的，例如，细菌复制起点和细菌抗性基因是不必要的)。在一些实施方式中，载体包含AAV载体的双D(DD)元件特征。这允许用具有异源基因的DNA载体转导靶细胞，该异源基因表现得像AAV病毒DNA(例如，具有低转录沉默和增强的持久性)，而不需要病毒本身。
在一些实施方式中，分子110包括基于核酸的分子，例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、寡核苷酸、反义寡核苷酸(ASO)、微小RNA(miRNA)、诱饵DNA、核酶、吗啉代和质粒。使用小抑制性RNA(siRNA)的RNA干扰可用于通过细胞核酸酶下调mRNA水平，当检测到siRNA和相应mRNA分子之间的序列同源性时，细胞核酸酶被激活。因此，在一些实施方式中，siRNA用于沉默涉及与已知遗传背景相关的各种疾病的发病机制的基因。在一些实施方式中，分子110包含patisiran，一种FDA批准的基于siRNA的药物，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性患者的多发性神经病。为了使siRNA发挥作用，siRNA必须位于感兴趣的靶细胞内。这意味着siRNA必须被运送到靶细胞所在的身体组织，然后它必须穿过细胞膜。这些要求通常被称为siRNA到所需位置的“递送”。用常规递送方法递送已被证明有难度，因为siRNA是带负电荷的分子，不会自然地穿过细胞的外膜。本文所述的装置、系统和方法克服了这些递送困难，将siRNA递送到靶细胞中。
在一些实施方式中，分子110包括微小RNA(miRNA)。miRNA是一类长度为约22nt的小非编码RNA，参与通过降解其靶mRNA和/或抑制其翻译调控转录后水平的基因表达。
在一些实施方式中，分子110包括反义寡核苷酸(ASO)。ASO是合成的DNA寡聚体，它以序列特异性方式与靶RNA杂交。在一些实施方式中，递送ASO以抑制基因表达、调节前体信使RNA的剪接或使微小RNA失活。为了稳定ASO以防止核酸降解，可以使用化学修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯、2'-O-甲基RNA或锁核酸，因为它们具有核酸酶抗性。在一些实施方式中，通过优化了增强的递送、特异性、亲和力和核酸酶抗性，同时降低了毒性来递送ASO。
示例ASO包括(1)福米韦生，例如用于治疗AIDS患者的CMV视网膜炎，(2)米泊美生，例如用于治疗家族性高胆固醇血症，(3)去纤维蛋白核苷酸，例如用于治疗肝脏中的静脉闭塞性疾病，(4)eteplirsen，例如用于治疗杜氏肌营养不良症，(5)pegaptanib，例如用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性，以及(6)nusinersen，例如用于治疗脊髓性肌萎缩症。
在一些实施方式中，分子110包括寡聚物分子，例如二氨基磷酸酯吗啉寡聚物(PMO)，也称为吗啉代，一种用于修饰基因表达敲落基因功能的寡聚物分子。通常长度为25个碱基，吗啉代通过标准核酸碱基配对与RNA或单链DNA的互补序列结合。吗啉代寡核苷酸特异性结合其选定的DNA或RNA靶位点，以阻断细胞成分进入该位点。该特性可用于阻断翻译、阻断剪接、阻断微小RNA(miRNA)或其靶标，以及阻断核酶活性。其分子结构包含DNA碱基，该DNA碱基附接到通过二氨基磷酸酯基团连接的亚甲基吗啉环主链。由于吗啉代寡核苷酸的不带电主链不被酶识别，因此它对核酸酶完全稳定。在一些实施方式中，递送基于吗啉代的药物eteplirsen，其可用于治疗引起杜氏肌营养不良症(DMD)的一些突变。在其他实施方式中，递送基于吗啉代的药物golodirsen，其可用于DMD治疗。
在一些实施方式中，分子110包括核酶(核糖核酸酶)，其是天然存在的RNA分子，催化包括基因表达中RNA剪接的特定生化反应，类似于蛋白质酶的作用。在一些实施方式中，分子110包含例如被设计成通过特异性切割致病mRNA来抑制蛋白质产生的合成核酶。核酶疗法的另一个应用包括抑制基于RNA的病毒，例如HIV、丙型肝炎病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、腺病毒以及甲型和乙型流感病毒。
在一些实施方式中，分子110包含核糖核蛋白(RNP)。RNP是RNA和RNA结合蛋白之间形成的复合物。例如，纯化的Cas9蛋白可以与向导RNA结合以形成RNP复合物，以递送至细胞以进行快速高效的基因组编辑。RNP在细胞中停留的时间很短，剂量很小，因此与其他方法相比，毒性更低，脱靶位点的编辑也更少。RNP复合物也不含DNA，因此没有插入诱变风险。
在一些实施方式中，由本文所述的装置、系统和方法递送的分子110包括成簇的规律间隔短回文重复重复(CRISPR)DNA序列，称为CRISPR。这些DNA序列最初是在细菌中观察到的，在与病毒序列完全匹配的重复序列之间具有“间隔”DNA序列。随后发现细菌在病毒感染后将这些DNA元件转录为RNA。RNA将核酸酶(一种切割DNA的蛋白质)引导至病毒DNA以将其切割，从而提供针对病毒的保护。这些核酸酶被命名为“Cas”，意为“CRISPR相关”。
在2012年，研究人员证明可以构建RNA以将Cas核酸酶(Cas9是第一个使用的)引导至任何DNA序列。也可以制造所谓的向导RNA，使其仅针对那个序列，从而提高DNA在该位点而不是基因组其他任何地方被切割的可能性。进一步的测试表明，该系统在包括人类细胞的所有类型的细胞中都表现很好。
使用CRISPR/Cas，可以破坏靶基因，或者，如果将DNA模板添加到混合物中，则可以将新序列插入所需的精确位置。该方法已被用于开发具有特定基因组变化的动物模型。而对于具有已知突变的人类疾病，例如囊性纤维化，理论上可以插入纠正突变的DNA。然而，使用例如病毒载体等常规方法很难将CRISPR/Cas材料大量递送至成熟细胞。但是，本文所述的装置、系统和方法克服了这些困难，允许将包含CRISPR/Cas材料的分子110递送至细胞。
在一些实施方式中，分子110包含重组蛋白。通过使用重组DNA技术，这样的治疗性蛋白质已被研发用于治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫/炎症、感染因子暴露和遗传病症。
在一些实施方式中，分子110包含蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。PROTAC是一种小分子，能够去除特定不需要的蛋白质。PROTAC由两个共价连接的蛋白质结合分子组成：一个能够结合E3泛素连接酶，另一个结合用于降解的靶蛋白。将E3连接酶募集到靶蛋白会导致泛素化，随后蛋白酶体会降解靶蛋白。目前，PROTAC已成功应用于与多种疾病相关的不同类型靶蛋白的降解，包括癌症、病毒感染、免疫病症和神经退行性疾病。PROTAC在癌症疗法中具有多种优势，例如克服耐药性和降解传统上“无成药性”的蛋白质靶标。目前，只有20-25％的已知蛋白质靶标可以通过使用传统的药物发现技术进行靶向。缺乏催化活性和/或具有催化独立功能的蛋白质仍被视为“无成药性”靶标。此外，大量的癌蛋白，如转录因子、染色质调节剂和小GTP酶，很难在药物上直接靶向。PROTAC旨在通过劫持内源性E3连接酶和泛素蛋白酶体系统来靶向感兴趣的蛋白质(通常是癌蛋白)进行降解。口服PROTAC药物的一个示例是ARV-110，用于靶向雄激素受体进行降解，最近被FDA批准用于在2019年治疗转移性去势抵抗性前列腺癌患者的I期临床试验。
在一些实施方式中，分子110包含锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。从机制上讲，一对ZFN单体必须通过与相反极性的DNA链相关联来结合DNA，通常以头对头的配置。这会催化DNA DSB(双链断裂)。TALEN由DNA结合域组成，该域由模块化TALE重复序列组成，并与FokI核酸酶域融合。每个TALE重复序列由33-35个氨基酸组成并识别单个核苷酸；特异性由称为重复可变残基(RVD)的两个高变残基决定。事实上，TALE重复序列可以以一种相当直接的方式组装在一起，以逐个核苷酸配对所需的DNA序列。对于ZFN，引入DSB需要一对TALEN单体。ZFN和TALEN的可靶向DNA序列范围有限，因为ZFN更喜欢富含G的序列，而TALEN通常结合严格从T碱基开始的低G含量位点。
可以理解，CRISPR/Cas9系统更灵活，并且靶向通常更容易且更快，因为CRISPR/Cas9系统足以设计和合成与感兴趣的序列互补的sgRNA。可以同时靶向多个序列，并且不需要蛋白质优化。由于其特性，CRISPR/Cas技术在一些情况下优于ZFN和TALEN。
生物分布
身体内分子转移的一个关键特征涉及分子的生物分布。为了成功地将分子转移至细胞，分子将在与用于转移的能量递送相关的所需时间以所需浓度处于体内所需位置。
在一些实施方式中，这是通过专用的输注技术实现的。可以理解，在一些情况下，输注技术被设计成在靶细胞附近提供比通常用于基于病毒的基因载体或体外实验室技术中浓度更高的分子110。这可以通过多种方法实现。在一些情况下，靶细胞被输入含有高浓度分子的溶液。例如，在一些实施方式中，溶液中含有的分子是用于基于病毒的基因载体或体外实验室技术中所用分子的1-1000倍，例如100-500倍。在一些实施方式中，使用1-5mg/ml的分子。这与更典型的0.5-2mg/ml的浓度形成对比。在其他实施方式中，在靶细胞附近提供体积大得多的溶液。这可能会增加靶位置中的分子数量，而不会增加递送溶液的浓度。例如，可以使用体积是在基于病毒的基因载体或体外实验室技术中使用量的5至50倍，例如10-25倍的溶液。在一些实施方式中，使用0.5-5ml分子。这与更典型的1-2ml体积形成对比。可以理解，在一些实施方式中，可以使用增加的浓度和体积两者。在一些实施方式中，通过在靶细胞周围或附近的多个位置递送溶液来实现靶细胞附近溶液体积的增加。在一些情况下，这是通过使用包括多个尖齿的能量递送装置102来实现，如图6所示。在这样的实施方式中，溶液可以通过单独的尖齿递送到不同位置，例如围绕靶组织区域。例如，这些位置可以距靶组织区域0.5mm-5cm，特别是1-25mm，更特别是5-20mm。可以理解，在一些实施方式中，不同类型的溶液(诸如不同浓度的溶液、不同体积的溶液和/或包含不同类型分子的溶液)通过不同的尖齿递送。
在一些实施方式中，分子110或溶液的其他成分被优化以增加转移至身体内靶细胞的可用性。例如，在一些实施方式中，改变分子以提高它们的溶解并因此改善分布。在一些实施方式中，分子包含可有助于细胞转移的线性化DNA、c3DNA或超螺旋DNA。在其他实施方式中，DNA与靶向类型的添加缀合，例如被吸引到特定靶细胞群(例如，被吸引到细胞上的抗原/蛋白质)的添加。通常，裸露的质粒DNA具有最少的细胞摄取，因为它具有高负净电荷、非常大的分子大小以及对酶促降解的敏感性。然而，缀合和类似的方法可以缓解这种情况。在一些情况下，脂质和聚合物纳米颗粒利用阳离子基团来掩埋和浓缩DNA质粒，以防止降解核酸酶和中和负电荷。同样地，金纳米粒子可用于通过将PAMAM(聚酰胺胺)聚合物缀合到金表面，从而与负磷酸主链产生电荷相互作用，保护DNA质粒免受核酸酶活性的影响。在一些实施方式中，修饰的核苷酸被掺入质粒的特定位点，产生可用于纳米颗粒附着的特定缀合点。然后，纳米粒子是各种聚合物相互作用的平台，特别是靶向用于细胞摄取的适配子。例如，与CD44-适配子缀合的质粒/纳米颗粒复合物促进质粒靶向递送至在细胞膜上高度表达CD44的乳腺癌细胞。各种适配子可用于将质粒导向特定细胞类型。
在一些实施方式中，遗传物质或其他成分与增加其留在靶组织区域内的能力的添加物组合。例如，在一些实施方式中，诸如DNA的遗传物质与诸如聚乙二醇的聚合物组合，其有助于遗传物质进入细胞。在其他实施方式中，将遗传物质或其他成分组合在改善其溶解或改善其在组织体积中扩散的能力的溶液中，例如改变流体表面张力的溶液，例如表面活性剂、乙二醇、二甲基亚砜、利非他明、阳离子镇痛药等。
在一些实施方式中，使用身体内局部区域内的引起流体外渗改善分子110生物分布。产生这种外渗的装置、系统和方法可能涉及诸如特定类型的脉冲电场能量或其他合适的能量类型的能量的递送。这种外渗通常来自附近的脉管系统、淋巴管或其他接收能量的组织。在一些情况下，外渗是水肿或水肿样，其中毛细血管将液体渗漏到周围组织中。当非典型体积的液体积聚在组织中时，水肿发生或者发生在细胞内(细胞水肿)或者发生在间质空间中分布的胶原蛋白-粘多糖基质内(间质性水肿)。此处描述的外渗方法侧重于细胞外基质的肿胀或间质性水肿。自然发生的间质性水肿可能是由于作用在微血管壁上的压力(静水压和渗透压)的异常变化、包括内皮壁流体和溶质通量屏障的分子结构的改变(这些改变表现为水力传导率和血浆蛋白的渗透反射系数)，或淋巴流出系统的改变。然而，本文所述的方法通过传递专用的能量引起水肿或外渗。
在一些情况下，血管液体的外渗会携带分子到靶组织区域，然后通过静脉内递送。在其他情况下，血管和分子的流体泄漏被区域性地或局部地(例如，通过注射)递送至靶组织区域。并且在另外一些情况下，单独使用外渗而不递送分子。治疗疗法的示例改进包括但不限于调节靶组织、增加分子的可用性、增加分子可用性的均匀性、增加对自然受限靶组织的访问、创造更大的治疗区域以及降低潜在不期望的副作用等。
图11A-图11C图示了外渗过程的实施例的各个阶段。在该实施例中，能量递送装置102包括细长轴106和设置在细长轴106远端附近的能量递送体108。在该实施方式中，能量递送体108包括单个电极并且远侧尖端101被配置为穿透靶组织区域T中或附近的组织的一部分。可以理解，在其他实施方式中，能量递送体108具有无创伤尖端并且经由能够穿透组织的单独仪器递送。如图11A所示，能量递送体108定位在靠近血管BV(例如毛细血管)的靶组织区域T内。在该实施方式中，分子110通过血管BV，例如通过IV给药，被递送至靶组织区域T。这种分子110是所提供的治疗所所特有的，例如用于基因转移的遗传物质。
图11A示出只有少数分子110进入了靶组织区域，但大量分子仍留在血管BV内。然后将至少一定剂量的调节能量从能量递送体108递送至波浪线113所示的靶组织区域，如图11B所示。通常，调节能量包括专用形式的PEF能量，然而可以理解，可以使用其他类型的专用能量来产生期望的外渗。在这个实施方式中，专用的PEF能量，例如通过影响血浆蛋白的水力传导率和渗透反射系数可逆地破坏血管BV内的内皮细胞的流体屏障功能完整性。这种破坏导致屏障更不能限制液体和大分子从血液移动到周围组织的间质。这导致外渗以及靶组织区域充满流体和溶质，包括来自血管BV的分子110，如图11C所示。PEF能量通常会破坏毛细血管，同时对靶区域中的细胞破坏最少。
这个外渗过程可能会持续一段时间，例如5秒，或者30秒到15分钟。因此，在一些情况下，希望在递送调节PEF能量之前开始将分子110传递至脉管系统以确保分子110在血流中的最大浓度和可用性。外渗和水肿产生的时间段长度具体取决于多种因素可能会不同，这些因素包括靶器官、使用的参数和疗法的具体目标。例如，未以高全身浓度提供分子110可能涉及治疗过程之前的最大外渗效应。同样地，具有高生物利用度的分子110可能涉及治疗过程之前的较少的外渗效应。通常希望血管BV在通过这些血管BV的分子110的浓度处于最高期间处于最渗漏状态，从而提供分子110最大程度地外渗到靶组织区域间质环境中。
诱发的外渗提供了多种优点。示例优点包括但不限于创建更大的治疗区域、调节治疗区域以更容易接受治疗、增加分子的可用性、增加分子可用性的均匀性、增加分子向天然受限的位置的递送，例如跨越血脑屏障，并减少治疗潜在副作用的可能性。
在该实施方式中，分子110旨在被靶治疗区域的细胞摄取。在一些实施方式中，单独引起的外渗足以增加靶组织区域的细胞对分子110的摄取。在其他实施方式中，随着治疗能量的递送进一步促进分子110的摄取，如将在本文中进一步详细描述的。可以理解，在一些实施方式中，治疗能量包括PEF能量，该PEF能量具有与调节PEF能量不同的波形。可以理解，在一些实施方式中，治疗PEF能量是利用位于靶组织区域内的相同能量递送体108来递送的。在其他实施方式中，使用不同的装置来递送治疗能量。
在一些实施方式中，调节PEF能量具有包括单相、长持续时间(>500μs)脉冲的波形。图12A图示了由用于引起外渗的发生器104的能量递送算法152提供的这种PEF能量的示例波形。在这个实施方式中，波形由一系列脉冲400组成，每个脉冲具有脉冲宽度402和振幅(由设定电压404确定)，其中每个脉冲400由延迟406分开。在这个实施方式中，脉冲宽度被认为是长持续时间并且大于500微秒。在这个实施方式中，脉冲400之间的延迟406在10μs到10s的范围内，例如1ms、500ms、1秒、2秒、5秒。在图12A中，图示了两个脉冲400，然而可以用一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个脉冲来实现调节。在一些实施方式中，该PEF能量未被设计成引起靶组织区域内的细胞摄取分子110，因此可以利用一定范围的脉冲参数(例如电压、频率、脉冲间延迟等)。然而，可以理解，在一些实施例中，治疗能量本身可以类似于图12A的能量。在一些实施方式中，波形是双相的，如图12B所示。这里，每个脉冲400是双相的并且具有由延迟406分开的脉冲宽度402。在该实施方式中，脉冲宽度402再次被认为是长持续时间并且大于500微秒。在该实施方式中，脉冲400之间的延迟406在1μs到1秒的范围内，例如1μs到10μs、10μs、1μs到100μs、100μs、1μs到250μs、250μs、1μs到500μs、500μs、1ms、2ms、5ms或1-5ms等。可以理解，在一些实施方式中，脉冲400反转极性，使得一些脉冲400具有正振幅而一些脉冲400具有负振幅；这种极性的反转可以是对称的或不对称的。还可以理解，在一些实施方式中，脉冲400按极性分组。可以理解，每组中可以存在任何合适数量的脉冲，并且每组可以具有相同或不同数量的脉冲。例如，六个正脉冲之后可以跟随两个负脉冲，或者四个正脉冲之后可以跟随一个负脉冲。因此，可以进行各种组合。这样的分组可以是对称的或非对称的。
可以理解，在一些实施方式中，调节能量被递送至靶组织区域，增加了靶组织区域对最终细胞死亡的细胞抵抗力。众所周知，经历亚致死应激的细胞会对应激产生修复性和预防性反应，本质上是对类似或不同性质的后续应激产生抵抗力，增强它们的恢复能力。例如，在一些实施方式中，调节能量使得热休克蛋白(HSP)被释放。HSP是一个蛋白质家族，由细胞响应暴露于应激条件(如本文所述的调节能量)而产生。尽管HSP最初被描述为与热休克有关，但现在已知HSP在其他应激(包括暴露于寒冷、紫外线)期间以及伤口愈合或组织重塑期间也被表达。该组的许多成员通过稳定新蛋白质以确保正确折叠或通过帮助重新折叠因细胞应激而受损的蛋白质来执行伴侣功能。这种表达的增加是转录调节的。热休克蛋白的显著上调是热休克反应的关键部分，主要由热休克因子(HSF)引起。
在一些实施方式中，组织或细胞的预热(在传递分子110之前)可以启动热休克蛋白的表达，其在细胞损伤、修复和存活中发挥作用。在这样的实施方式中，可以将诸如温盐水的温溶液注射到治疗部位，其中分子110在等待期之后随着能量的递送而被递送。等待期可以是加温溶液递送后的几分钟、几小时或几天。在一些实施方式中，等待期为5-30分钟、1-2小时或1-2天。
在其他实施方式中，使用能量递送体108加热组织或细胞。在这样的实施方式中，以受控速率递送能量以将局部温度维持在特定范围内，例如40-50℃之间，用于少于10分钟的治疗。可以理解，在一些实施方式中，热休克蛋白在约41℃左右被触发。因此，亚致死脉冲电场递送可用于在更强的治疗脉冲电场之前促进热休克蛋白的上调和其他损伤修复准备。这促进了细胞对脉冲电场造成的损伤的恢复能力，并提高了将分子转移到有意义数量的细胞而不会出现不希望的过度细胞死亡的能力。
因此，在一个实施方式中，调节能量被递送到靶治疗区域，其升高至少一部分治疗区域的温度，例如升高到45摄氏度。这会导致液体外渗到该区域。药物、基因或其他类型的分子通过注射递送并受益于本文所述的外渗优势。然后疗法(例如治疗性PEF能量)被递送至靶治疗区域。由于治疗区域的细胞先前已被调节以抵抗细胞死亡，因此更大量的细胞在治疗方案中存活下来。这有利于基因疗法或依赖细胞存活的其他类型的治疗。
2021年6月10日提交的名称为“INDUCED EXTRAVASATION BY ENERGY DELIVERY TOTISSUE”的美国临时专利号63/209,335中提供了提供这样的预处理(例如导致外渗)的装置、方法和能量波形的更多示例，其出于所有目的而通过引用并入本文。
在一些实施方式中，通过将分子110递送至身体的受控组合方法来优化分子的生物分布。在一些实施方式中，通过IV结合局部注射比单独通过IV或单独通过局部注射来递送分子110提供了增强转移的更大协同效应。
示例1：将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码质粒DNA递送到具有PEF能量的balb/c小鼠的腓肠肌后肌中。质粒DNA以三种方式施用于小鼠：1)全身注射(在尾静脉中)在200μl体积的盐水中的20μg质粒，等于1mg/kg；2)用给药电针局部注射包含接种200μg质粒DNA的200μl生理盐水到腓肠肌中；3)将先前的给药途径与在递送能量之前/同时首先进行全身注射，然后进行局部给药相结合。使用了两种不同的PEF能量递送算法：1)PEF算法A(斩波循环双相，将在后面部分的中描述)；和2)PEF算法B(交替DC，将在后面的部分中描述)。根据所使用的能量递送算法，质粒DNA的局部递送在PEF算法B(8秒长方案)之前1分钟进行或与PEF算法A(5分钟长方案)同时进行，以确保缓慢而持续地递送材料，同时能量沉积在组织中。为了在5分钟的过程中实现恒定和精确的遗传物质递送，使用输液泵以0.04毫升/分钟的速率递送200微升。在递送遗传物质和能量的过程中，使用异氟醚对小鼠进行气体麻醉。在治疗后，小鼠恢复并存活3天，然后被安乐死并收集腓肠肌。肌肉组织称重，用刀片机械切碎，用RIPA缓冲液裂解并超声处理以完成均质化过程。在超速离心后从均质组织中提取蛋白质，并将蛋白质用于通过ELISA测量EGFP蛋白质。将结果归一化为每个组织的重量，以获得样品中EGFP蛋白质的pg/mg浓度。结果示于图13中。可以理解IV+IM＝静脉内递送然后局部递送。针对PEF算法A测量了5个样品，针对PEF算法B测量了9个样品。可以理解，IM＝局部肌内递送。针对PEF算法A测量了5个样本，针对PEF算法B测量了10个样本。可以理解IV＝静脉内全身递送。针对PEF算法A测量了4个样本，针对PEF算法B测量了4个样本。图14将图13的结果示为平均值。因此，可以看出，在这个示例中，单独IV没有产生可测量的转移，而IV+IM的方案产生的转移大于单独IV和单独IM的组合所预期的转移。此外，可以看出，在该示例中，具有IV+IM方案的PEF算法B产生了最大级别的转移。
可以理解，如果在施加能够进入细胞膜并引起与细胞膜接触的DNA电泳的电脉冲之前加入质粒DNA，则基因转移通常最大化。基因电转移的另一种假定机制是，在电场递送过程中，带负电荷的DNA分子由于电泳力而移动，与自由扩散相比，与细胞膜接触的分子数量更多。大质粒DNA分子在电脉冲期间在细胞膜上形成聚集体，并通过内吞作用进入细胞。由于这个附加的原因，希望在转移位点具有高质粒浓度，如果全身施用质粒，则这更具挑战性。
能量
如前所述，能量递送装置102根据至少一种不同的能量递送算法152递送由波形发生器104提供的能量。提供了多种能量递送算法152，其专门设计用于在体内进行的转移程序。在一些实施方式中，算法152规定具有波形的信号，该波形包括其间具有延迟的一系列脉冲。在这样的实施方式中，算法152指定信号的参数，例如能量幅度(例如，电压)、脉冲宽度、延迟周期和脉冲数等。可以理解，能量递送算法152产生最大化转移但避免负面影响的波形，特别是特定于在体内转移的那些波形。
电基因转移的常规离体技术通常涉及来自具有脉冲的波形的能量，该脉冲涉及非常长的DC部分(例如1-100ms，诸如2-50ms)。具有一个极性的长DC脉冲或全部以相同极性递送的脉冲序列，增加了消融的风险和产生的消融损伤的大小。这通常是由于电解、pH失衡和沉积到组织中的净电荷所致。流过生物物质的电流除了转移和潜在的焦耳热外还会产生多种效应，例如电解、离子电渗和电渗流。这些可以有助于消融的形成。
此外，当在身体内使用这些不平衡波形时，会在身体内产生多种影响。这些不平衡的波形会激活运动神经元和骨骼肌，这会导致患者受伤、患者疼痛并会对疗法结果产生负面影响。因此，本文描述的能量递送算法152被配置为避免这些不平衡，从而避免这些有害影响。
图15A图示了由能量递送算法152提供的示例波形。在该实施方式中，波形由一系列脉冲400组成，每个脉冲具有脉冲宽度402和振幅(由设定电压404确定)，其中每个脉冲400由延迟406分开。在该实施方式中，图示了三个脉冲400，然而可以用一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个脉冲来实现转移。在一些实施方式中，以这种单极方式递送能量并且每个脉冲或设定电压404的振幅是1-500V、1-250V、1-100V、10-100V、10-70V、10-50V、10-40V、10-30V、10-20V、10V、20V、30V、40V、50V、60V、70V、80V、90V、100V等。使用和考虑的电压可能是方波的顶部，可能是正弦波或锯齿波的峰值，或者可能是正弦波或锯齿波的RMS电压。
在一些实施方式中，脉冲宽度为1ms、2ms、5ms、10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、1-20ms、1ms-50ms、1ms-100ms、2ms-100ms、1-2ms等。在一些实施方式中，脉冲之间的延迟为0.01-5秒、0.01-0.1秒、0.01-0.5秒、0.01-1秒、0.5秒、0.5-1秒、1秒、1-1.5秒、1-2秒、0.5到2秒、2秒、1-3秒等。在一些实施方式中，脉冲的数量是1个脉冲、2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲、10个脉冲、10个以上的脉冲等。
可以理解，在优选实施方式中，脉冲400反转极性，使得一些脉冲400具有正振幅而一些脉冲400具有负振幅。如上所述，这种逆转减少了可能导致消融和/或肌肉收缩增加的电荷失衡。可以理解，在一些实施方式中，极性以向上、向下、向上、向下的方式交替。例如，图15B图示了由算法152提供的交替DC波形。这里，正脉冲400'之后是负脉冲400”，然后以交替方式重复。同样地，每个脉冲400'、400”具有脉冲宽度402和幅度(由设定电压404确定)，其中每个脉冲400'、400”由延迟406分开。可以理解，每个脉冲的这些参数可以不同，例如具有变化的脉冲宽度402、振幅404和延迟405。然而，希望正和负接通时间随时间平衡。在一些实施方式中，振幅404在10-500V的范围内，例如50-100V。在一些实施方式中，脉冲持续时间402在0.5-200ms的范围内，例如1-100ms、2-50ms或20-30ms等。在一些实施方式中，脉冲间延迟406在10ms-10s的范围内，例如200ms-3s或500ms-2s。可选地，脉冲间延迟406可以与患者的ECG同步。在一些实施方式中，治疗包括1-100个脉冲，例如1-20个脉冲或1-10个脉冲。这些可以达到0.5到500ms(通常为20-200ms)的总治疗持续时间。下面的表1提供了各种示例参数组合以实现分子110的转移：
表1：
可以理解，图13-图14的算法B产生了具有图15B形状的波形。在该实验中，算法B在单独肌肉注射和与静脉内给药组合的两种条件下产生了更高水平的转移。因此，该波形已被证明可保留受影响细胞的显著转移，同时减少或消除PEF的任何潜在致死作用。
还可以理解，在一些实施方式中，脉冲400按极性分组。例如，图15C图示了由能量递送算法152提供的示例波形，其中两个脉冲400'具有正极性，随后是两个脉冲400”具有负极性。可以理解，每组中可以存在任何合适数量的脉冲，并且每组可以具有相同或不同数量的脉冲。例如，六个正脉冲之后可以跟随两个负脉冲，或者四个正脉冲之后可以跟随一个负脉冲。因此，可以进行各种组合。这样的分组可以是对称的或非对称的。
在一些实施方式中，一个或多个脉冲400被“斩波”、分割或分段成相同相位的分段脉冲阵列。因此，每个脉冲400在被“斩波”时更长，这是因为在分段脉冲之间包括延迟，该延迟可以被认为是分段延迟。图16图示了基于常规单相波形的波形的实施方式(因此被认为是具有基脉冲的“基”波形)，然而它已经被显著改变以优化体内环境中的转移。传统基因疗法中使用的单相波形是DC脉冲，通常脉冲宽度为1-50ms，通常为20ms。这里，示出了类似于单相波形的脉冲(即正脉冲400')，然而，这里正脉冲400'被斩波或分割成多个分段脉冲401，其间具有分段延迟405。因此，在该实施方式中，正脉冲400'具有10-100000微秒范围内的脉冲宽度，这比传统基因疗法中使用的单相直流脉冲长得多。然而，脉冲400'的“接通时间”与基波形相同，因为分段引入延迟而不是附加脉冲。图16还示出了负脉冲400”与正脉冲400'被延迟406分开。在该实施方式中，负脉冲400”类似于正脉冲400'，但是它具有负极性。因此，图16的波形总体上与传统的单相波形大致不同。分段脉冲在分子转移到细胞中的过程中打破了长驱动力，以避免肌肉激活。可以理解，电泳是在分子110向细胞转移期间驱动分子朝向细胞并进入细胞的重要组成部分。通常，在具有本文所述分子110的大小和分子量的分子中驱动电泳运动的时间尺度大于这些跨膜电位引起肌肉激活的时间尺度。例如，神经元激活可能发生在10ms的PEF能量递送时，骨骼肌激活可能发生在40ms的PEF能量递送时。通过将长驱动力(脉冲402)“斩波”为具有短/短暂脉冲宽度403的分段脉冲401的阵列，可以避免这种激活。这会逐渐驱动分子110进入细胞，其中中断(分段延迟405)允许弛豫跨膜电位电荷，从而防止肌肉兴奋。因此，小的中断不会减慢分子110进入细胞的驱动力，而是会减慢肌肉的兴奋。
可以理解，在一些实施方式中，脉冲400'、400”相对较长，例如10-100000μs或100-50000μs并且具有在100μs-10s范围内(例如1ms-5s或50ms-2s等)的延迟406。这些脉冲400'、400”可以被斩波成多个分段脉冲401(例如多达10000个分段脉冲401、10-2000个分段脉冲401或20-1000个分段脉冲401等)，其中分段脉冲403持续时间是0.05-50μs，例如0.5-20μs，或1-5μs等，分段延迟405是1-100000μs，例如1-10000μs或10-2000μs。在一些实施方式中，接通时间不超过10μs，这可以被认为是启动肌肉刺激的拐点。在这样的实施方式中，在脉冲400'、400”之间需要10ms的延迟406。因此，图16的脉冲400'400”和分段脉冲401只是为了说明目的以突出显示波形的分量，并且对于许多实施方式而言并未按比例绘制，因为数千个分段脉冲的单独图示将非常困难。可以理解，图16所示的脉冲400'、400”对409可以被认为是一个周期并且通常被重复，例如1-1000次，特别是1-200次，更特别是1-100次，更特别是40-50次等。可以使用各种重复，只要重复次数不是小到肌肉收缩合并(E>250毫秒)，也不是大到效果不会累积(E<10秒)。
可以理解，在一些实施方式中，电压幅度在10-250V的范围内，例如50-250V或50-100V等。
下面的表2提供了实现分子转移的各种示例参数组合：
表2：
图17图示了基于双相AC波形的波形的实施方式。这里，示出了两个脉冲，正脉冲400'和负脉冲400'，由延迟406分开，其中这两个脉冲形成一个周期。然而，这里正脉冲400'被斩波成多个分段脉冲401，其间具有分段延迟405。同样地，负脉冲400”也被斩波成多个分段脉冲401，其间具有分段延迟405。类似于图16的实施方式，这些分段脉冲在分子转移到细胞中期间打断长驱动力以避免肌肉激活。同样地，小的中断不会减慢分子110进入细胞的驱动力，但它们会减慢肌肉的兴奋。通常，这些实施方式比图16的实施方式更频繁地改变极性。同样地，在这些实施方式中，周期409通常被分组为封包(其间具有封包间延迟)并且在治疗期间一个或多个封包被递送。
在一些实施方式中，脉冲宽度402略短于图16的脉冲宽度，例如0.1-10000μs、10-1000μs或5-500μs，但具有在100μs-10s范围内(例如1ms-5s或50ms-2s等)的类似延迟406。这些脉冲402可以被斩波成多个分段脉冲401(例如多达1000个分段脉冲401、5-100个分段脉冲401或10-50个分段脉冲401等)，其中分段脉冲持续时间403是0.05-50μs，例如0.5-20μs，或1-5μs等，以及分段延迟405是1-100000μs，例如1-10000μs或10-2000μs。同样地，图17的脉冲只是为了说明目的以突出显示波形的分量，并且对于许多实施方式而言并未按比例绘制，因为数千个分段脉冲的单独图示将非常困难。可以理解，图17所示的周期409通常被重复，例如1-1000次，特别是1-100次，更特别是1-10次等。可以使用各种重复，只要重复次数不是小到肌肉收缩合并(E>250毫秒)，也不是大到效果不会累积(E<10秒)。在一些实施方式中，周期被分组为在其间具有封包间延迟的封包。在一些实施方式中，封包包括1-100个周期，例如1-50个周期、1-20个周期、1-10个周期、1-5个周期等。在一些实施方式中，在单次治疗或将分子110转移至靶细胞期间递送多个封包。在一些实施方式中，递送1-100个封包，例如1-50个封包、1-20个封包、1-10个封包、1-5个封包等。
可以理解，在一些实施方式中，电压幅度在10-5000V的范围内，例如10-1000V、10-50V、50-100V、50-200V、10V、50V、100V、200V、500V、1000V等。
下面的表3提供了实现分子转移的各种示例参数组合：
表3：
可以理解，图13-图14的算法A产生具有图17形状的波形。在该实验中，算法A在单独肌肉注射和与静脉内给药组合的两种条件下产生了显著水平的转移。因此，该波形已被证明可保留受影响细胞的显著转移，同时减少或消除PEF的任何潜在致死作用。
如所提到的，脉冲400可以具有不同的特征，例如不同的振幅(由设定电压404确定)和脉冲宽度402。例如，图18A图示了由能量递送算法152提供的示例波形，其中具有第一电压404'和第一脉冲宽度402的第一脉冲400”，之后是具有第二电压404”和第二脉冲宽度402”的不同的第二脉冲400”。这里，第一电压404'高于第二电压404”，并且第一脉冲宽度402'比第二脉冲宽度402”窄。因此，相对于可以被认为是低且长的第二脉冲400”，第一脉冲400'可以被认为是高且短的。在该实施方式中，然后重复这些脉冲400'、400”。在一些实施方式中，短-高脉冲具有在100-1000V范围内的电压幅度404'和在50ns-1ms范围内(例如50ns-100μs或50ns-10μs)的脉冲宽度402'。并且，低长脉冲具有在5V-100V范围内的电压幅度404”和在1ms-50ms范围内的脉冲宽度402”。
在一些实施方式中，这样的波形被认为是多功能波形。例如，在一些实施方式中，短高压脉冲创造允许转移的条件，而长低压脉冲例如通过电泳驱动分子进入细胞。在一些情况下，接近细胞的分子110，或者由电泳驱动，或者简单地通过旋转、振动或摇晃而更靠近细胞，它们“粘附”到细胞上并且在细胞经历其膜修复时被拉入细胞内。因此，一些分子110可以在修复期间或在其他细胞状态期间通过内吞作用进入细胞。在一些实施方式中，短高压脉冲是单相的或双相的。并且，在一些实施方式中，长低压是DC或交流DC。
图18B图示了类似的实施方式，但是这里第二脉冲400”是负的。因此，第一电压404'大于第二电压404”，且极性相反。这提供了电荷平衡。在一些实施方式中，期望平衡正脉冲与负脉冲的振幅和接通时间。这可以通过使脉冲面积相等来可视化。例如，如果正脉冲400'的面积等于负脉冲400'的面积，则脉冲被认为是平衡的。这允许各种不同形状的脉冲。这种平衡减少了正向或负向的净电荷，从而减少了肌肉刺激。
图18C示出了另一个类似的实施方式，然而，此处脉冲400'、400”在分组或一组内具有相同的极性，但下一组的脉冲具有相反的极性。可以理解，这些组可以被延迟分开。这种延迟通常在1-3秒的范围内，或者可能与患者的心率同步。还可以理解，转移可以通过递送一组或多个组来实现。在一些实施方式中，附加组的递送是预定的、(例如由一个或多个传感器)触发的或根据用户的决定施加的。
在一些实施方式中，第一脉冲400'引起至少一些分子110的旋转，例如没有平移效应的纯旋转。在一些情况下，这通过具有50ns-1ms(例如50ns-100μs或50ns-10μs))的脉冲宽度402'的第一脉冲400'(例如具有1GHz或以上的固有频率)来实现。在这样的实施方式中，第二脉冲400”具有1ms-50ms的脉冲宽度402”，例如具有低于1GHz(例如在1kHz-999MHz的范围内)的固有频率。第二脉冲400”引起平移和旋转效果的混合或引起纯平移效果。脉冲400'、400”的这种组合加速了分子110向细胞的移动以进行转移，例如在治疗开始时利用旋转效应来促进后来的平移效应。可以理解，可以组合使用多个第一脉冲400'和/或第二脉冲400”来定制效果。
如前所述，在一些实施方式中，一系列脉冲400在封包中被递送，其中封包由封包间延迟分开。图19图示了包括一系列脉冲400的封包411；在本实施方式中，封包411由四个脉冲组成。每个脉冲具有电压404和脉冲宽度402。在该实施方式中，每个脉冲由延迟406分开，同样地，每个封包由封包间延迟415分开。可以理解，封包411可以由一系列相同的脉冲或一系列不同的脉冲组成。同样地，脉冲之间的延迟415可以是规则的或不规则的。图20图示了封包411，该封包411包括具有交替极性的一系列脉冲400，其可被认为是一系列双相脉冲，每个双相脉冲具有切换时间延迟407。这里，每个封包411由四个脉冲组成，每个脉冲交替极性，或由两个双相脉冲组成。
可以理解，在本文描述的每个实施方式中，脉冲(无论是单相脉冲、双相脉冲、交替DC脉冲等)可以在封包411中分组。在一些实施方式中，封包延迟高达20秒，例如0.1-20s、0.1-20s、10s、0.1-5s、0.1-2s、0.1-1s、0.5-1s、0.5-5s、0.1s、0.5s、1s、5s、10s等。在一些实施方式中，封包间延迟与ECG同步。
在一些实施方式中，如图21-图22所示，一系列高压、高频脉冲之后是一系列低压、低频脉冲，其中组合有助于将分子110转移至靶细胞。例如，如图21所示，递送第一组脉冲420，其中第一组脉冲420包括多个高压、高频脉冲，可选地以封包的形式。这样的脉冲可使细胞为以后的转移做好准备。
名称为“Methods,apparatuses,and systems for the treatment of pulmonarydisorders”的美国专利号10,702,337和名称为“DEVICES,SYSTEMS AND METHODS FOR THETREATMENT OF ABNORMAL TISSUE”的PCT/US2020/028844中提供了这样的高压、高频脉冲的示例，通过引用并入本文。这样的脉冲420可以用于其他临床应用中的消融，然而对于转移或分子110，这样的脉冲适于使细胞为转移做好准备。这些脉冲420通常是双相的(具有正脉冲和负脉冲，该正脉冲和负脉冲一起形成周期)并且周期被分组为封包。循环计数是每个双相封包内的脉冲数的一半。在一些实施方式中，循环计数被设置在每封包1至100之间，包括其间的所有值和子范围。在一些实施方式中，循环计数多达5个循环、多达10个循环、多达25个循环、多达40个循环、多达60个循环、多达80个循环、多达100个循环、多达1000个循环或多达2000个循环，包括其间的所有值和子范围。封包持续时间由循环计数等因素决定。通常，循环计数越高，封包持续时间越长，递送的能量的量越大。在一些实施方式中，封包持续时间在约50至1000微秒的范围内，诸如50μs、60μs、70μs、80μs、90μs、100μs、125μs、150μs、175μs、200μs、250μs、100至250μs、150至250μs、200至250μs、500至1000μs等。在其他实施方式中，封包持续时间在约100至1000微秒的范围内，例如150μs、200μs、250μs、500μs或1000μs。
通常，在封包之间存在固定的停息期。然而，可以存在有意的变化的停息期算法，或者封包之间也可能不应用停息期。表4提供了这样的脉冲420的示例参数值。
表4：示例参数组合包括：
在一些实施方式中，第一组脉冲420之后是延迟422(诸如100微秒到2秒)，然后是第二组脉冲424。在该实施方式中，第二组脉冲424由多个低压、低频脉冲组成。图21图示了第二组脉冲424的第一脉冲426持续长达10微秒，然后是延迟406(例如长达1ms)，然后是第二脉冲428。在该实施方式中，第二脉冲428具有与第一脉冲426相反的极性，因此延迟406可被认为是切换时间延迟407。可以理解，在一些实施方式中，脉冲426、428之间没有延迟406/407。在一些情况下，第一组脉冲420使细胞为分子转移做好准备，诸如将它们置于更能接受分子或转移过程的状态，第一组脉冲420开始转移过程。然后第二组脉冲424协助将分子转移至细胞，例如驱动或推动分子进入细胞。可选地，这些脉冲组420、424可以以一定的图案重复。
图22图示了具有不同段的波形的另一个示例。此处，第一组脉冲420被递送，其中第一组脉冲420包括多个高压、高频脉冲，可选地以封包的形式，诸如上面关于图21所描述的。再一次地，名称为“Methods,apparatuses,and systems for the treatment ofpulmonary disorders”的美国专利号10,702,337和名称为“DEVICES,SYSTEMS ANDMETHODS FOR THE TREATMENT OF ABNORMAL TISSUE”的PCT/US2020/028844中提供了这种高压、高频脉冲的示例，通过引用并入本文，并在上文进一步描述。在一些实施方式中，第一组脉冲420之后是延迟422(诸如100微秒至2秒)，然后是第二组脉冲424。在该实施方式中，第二组脉冲424包括多个低压、低频脉冲。在该实施方式中，第二组脉冲424由一系列没有切换时间延迟的双相脉冲组成，其中第二组脉冲424持续约100微秒至5毫秒。再一次地，在一些情况下，第一组脉冲420使细胞准备好分子转移或开始转移过程。然后第二组脉冲424协助将分子转移至细胞，例如驱动或推动分子进入细胞。可选地，这些脉冲组420、424可以以一定的图案重复。
可以理解，这些脉冲400可以是正弦波或具有其他形状而不是方波。例如，图23图示了脉冲波形的另一个实施方式。这里，每个脉冲由多个增加和减少的电压组成以形成金字塔形状。
可以理解，在本文描述的任何实施方式中，设定电压404可能根据能量是以单极方式还是双极方式递送而变化。在双极传递中，由于电场更小、方向性更强，因此可以使用更低的电压。选择用于治疗的双极电压取决于电极的间隔距离，而使用一个或多个远距离分散垫电极的单极电极配置可以在较少考虑导管电极和放置在身体上的分散电极的确切放置的情况下递送。在单极电极实施方式中，分散电极可以由垫或任何其他接收电极组成。通常，能作为分散电极是由于其尺寸(足够大以防止在它被放置的地方引起局部影响)和/或由于它的放置(足够远以避免局部影响并且没有电弧风险)。然而，在一些实施方式中，分散电极很小并且可能在其放置位置产生一些影响，然而这样的影响可能是良性的附带影响。例如，递送的分子可能不存在于分散电极附近以避免转移或该区域中的任何转移无关紧要。在单极电极实施方式中，由于递送的能量通过身体到达分散电极的分散行为，有效间隔距离约为10cm至100cm，因此通常使用较大的电压。相反，在双极电极配置中，电极的0.5mm至10cm数量级，包括1mm至1cm的相对靠近的活性区域对从间隔距离递送到组织的电能集中度和有效剂量产生更大的影响。
能量递送可以通过多种机制来致动，诸如使用能量递送装置102上的按钮或可操作地连接到发生器104的脚踏开关。这样的致动通常提供单一能量剂量。能量剂量由递送的脉冲数和脉冲电压限定。
图24A-图24C图示了由算法152提供的波形的另外的实施方式。这里，高频的快速振荡被添加到脉冲以向分子110提供附加的推动或旋转，同时脉冲整体朝着细胞驱动分子110。当大分子110或分子110的聚集体已经接触细胞膜但正难以进入细胞时，这可能特别有益。这样的能量尖峰可能会提供进入细胞所需的推动力。参考图24A，在该实施方式中，提供具有第一脉冲宽度(诸如20ms)的脉冲宽度402的第一脉冲400'，接着是具有第二脉冲宽度402(例如20ms)的第二脉冲400”。这里，脉冲400'、400”被延迟406(诸如5000μs的延迟)分开。在该实施方式中，脉冲400'、400”中的每一个都处于正方向并且具有设定电压或初级电压V1。在该实施方式中，电压围绕初级电压V1振荡以产生尖峰413。这样的振荡通常高达初级电压的25％，诸如0.1-25％或1-25％，更通常地高达初级电压的10％，诸如0.1-10％或1-10％(诸如初级电压的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)，或初级电压的15％、20％或25％。例如，在10％的振荡的情况下，具有50V的初级电压V1的脉冲400'将在55V和45V之间振荡以产生55V的尖峰413。同样地，在10％的振荡的情况下，具有1000V的初级电压V1的脉冲400'将在1100V和900V之间振荡。每个尖峰413在平移过程中为分子110提供附加的推动或旋转。因此，由于振荡引起的尖峰413导致脉冲400'、400”呈现为皇冠状。可以理解，在脉冲的整个长度(即脉冲宽度402)中脉冲可能包括尖峰413，如图所示，或者尖峰413可能发生在沿脉冲长度的任何点处。同样地，可以存在任何数量的尖峰413，包括100-10000个尖峰、100-5000个尖峰、500-5000个尖峰、500-1000个尖峰等。在一些实施方式中，振荡的频率高于1GHz，这会导致至少一些分子110发生旋转，例如没有平移效应的纯旋转。脉冲400'、400”内的尖峰413的这种组合有助于将分子110转移到靶细胞，例如增加推向细胞或推进细胞。
图24B图示了与图24A类似的实施方式。这里，脉冲400'、400”中的每一个都在负方向上。同样地，图24C图示了相反方向的脉冲400'、400”。可以理解，本文描述和图示的波形仅仅是图示各种波形概念的示例，并不旨在包括所有可能波形的列表。同样地，这些波形概念已在一系列示例中与可能变化的特定波形特征一起呈现。因此，可以理解，波形的方面、特征和概念可以以各种组合使用且不限于此文描述的组合。例如，“斩波”波形的概念可以应用于任何基波形，其中基波形的脉冲如本文所述被斩波。同样地，冠状振荡的概念可以应用于任何基波形，其中改变基波形的脉冲以包括振荡。此外，可以以各种组合来组合波形，例如一个波形实施方式的一部分后面紧跟不同波形实施方式的一部分。同样地，诱发外渗的波形可与本文公开的任何波形或任何变体组合使用。
增强
将分子110递送至组织或细胞的能力可以通过使用多种增强来改变。例如，在一些实施方式中，将辅助材料添加到身体中，例如添加到携带分子的溶液中，其中辅助材料使细胞对小分子或大分子转运更敏感。示例性辅助材料包括聚合物纳米颗粒、脂质体、聚乙二醇化脂质体、脂质体、细胞穿透肽(CPC)、二甲基亚砜(DMSO)、胆固醇或其他已知与细胞膜流动性和力学相互作用的材料。在一些实施方式中，注射辅助材料，并且选择或调整注射压力以增强细胞对分子110的摄取。
在其他实施方式中，组织或细胞被加热或冷却以改变它们成功接收分子110的能力。例如，在一些实施方式中，细胞被加热或冷却，例如通过加热或冷却携带分子110的溶液，以在能量递送后调用更好的转移效率或提高细胞存活的可能性。在一些实施方式中，细胞的加热可以增加膜流动性并因此增加对分子110的接受。在其他实施方式中，细胞的冷却可以增加刚性和“裂纹”的潜在形成，该“裂纹”增加了对分子110的接受。
在其他实施方式中，组织或细胞的预热(在递送分子110之前)可以启动热休克蛋白的表达，热休克蛋白在细胞损伤、修复和存活中发挥作用。在这样的实施方式中，可以将诸如温盐水的温溶液注射到治疗部位，其中分子110在等待期之后随着能量的递送而被递送。等待期可以是温溶液递送后的几分钟、几小时或几天。在一些实施方式中，等待期为5-30分钟、1-2小时或1-2天。
在一些实施方式中，使用能量递送体108加热组织或细胞。在这样的实施方式中，能量以受控速率递送以将局部温度维持在特定范围内，例如40-50℃之间，用于少于10分钟的治疗。可以理解，在一些实施方式中，热休克蛋白在约41℃左右被触发。因此，亚致死脉冲电场递送可用于在更强的治疗脉冲电场之前促进热休克蛋白的上调和其他损伤修复准备。这促进了细胞对脉冲电场造成的损伤的恢复能力，并提高了将分子转移到有意义数量的细胞而不会出现不希望的过度细胞死亡的能力。
如前所述，除其他活动外，处理器154在能量递送算法之间修改和/或切换、监控能量递送和任何传感器数据，以及通过反馈回路对监控数据作出反应。在一些实施方式中，处理器154被配置为执行一个或多个算法，用于基于一个或多个测量的系统参数、一个或多个测量的组织参数和/或其组合来运行反馈控制回路。在一些实施方式中，参数包括温度，使得通过控制能量递送的节律温度能够维持在特定范围内。这可能有助于增强细胞摄取、免疫反应、整体安全性等。
可以理解，在递送分子110之前、期间或之后和/或在递送治疗能量之前、期间或之后可以施加增强。在一些实施方式中，在多功能波形期间，例如在不对称波形的短高脉冲和长低脉冲之间，以期望的间隔向患者施用辅助材料。这可以有助于驱动或推动辅助材料进入细胞。
可以理解，在一些实施方式中，将等渗或高渗盐溶液递送至治疗部位以调节局部张力。
传感器
如前所述，在一些实施方式中，能量递送装置102包括一个或多个传感器，该一个或多个传感器可以用于确定压力、温度、阻抗、电阻、电容、电导率、pH、光学特性(相干性、回声性、荧光)、电或光介电常数和/或电导等。在一些实施方式中，所述电极中的一个或多个充当一个或多个传感器。在其他实施方式中，一个或多个传感器与电极分开。传感器数据可用于规划治疗、监控治疗和/或经由处理器154提供直接反馈，而这继而可以改变能量递送算法152。
A压力感测
可以理解，细胞通常对机械刺激有反应。一种这样类型的机械刺激是压力。一般而言，静水压力由间质液体积和靶组织间质的一般顺应性决定。重要的是要注意到这对于组织类型是可变的，因为一些器官(例如，大脑、肾脏等)被包裹在更刚性/更不顺应的结构中，而其他器官(例如，肺、肌肉、皮肤等)则更自由地扩张/收缩。虽然增加静水压力可以增加局部细胞膜的渗透性，但过量的组织间质压力肯定会导致组织损伤和细胞死亡。已经表明，哺乳动物细胞在200-300MPa之间的压力下会经历不同形式的细胞凋亡，并在300-400MPa之间的压力下屈服于更多的立即细胞死亡。
因此，注意靶细胞正承受的压力通常是有益的，特别是在分子110注射期间，此时局部注射压力可能影响靶细胞。因此，在一些实施方式中，能量递送装置102包括压力传感器，其通常定位成监控局部注射压力。
在一些实施方式中，来自压力传感器的反馈用于防止达到有害压力。例如，可以为用户显示来自传感器的压力测量值，一个或多个算法152可以基于测量值改变，和/或当压力达到预定阈值时可以发生警报或关闭。
然而，静水压力在细胞膜的透化中起着重要作用。在一些情况下，期望的细胞外压力增加将促进分子110(例如外源DNA)转移到细胞中。此外，静水压力通常在注射分子110在组织内的分布中起重要作用。因此，在一些实施方式中，压力测量值(例如，在装置102的近端取的外部压力测量值)可以被用户用作度量以确保优化的转移条件。在这样的实施方式中，压力可以增加或减少以落入期望的预定压力范围内。在一些实施方式中，在注射分子110(最小或零注射流速)之前测量压力以识别基础细胞内压(Pi＝P1|Q1＝0)。考虑到实现转移的最优限定靶压差(Pd＝Pi-Pe)并了解系统对溶液(Rapplicator)的静水压力，调整流入速率(Q1)直到压力增加期望的压差(P1＝Pi+Pd+Q1*Rapplicator)。因此，可以优化注射速率和治疗施加启动以实现期望的结果。
当递送方法包括引起的外渗时，如上所述，压力传感器测量值可用于监控诸如在注射分子110和治疗能量之前、期间和/或之后的水肿水平。因此，可以调整外渗的引起以在整个治疗方案的特定时间达到期望的水肿水平。
可以使用多种压力传感器200。在一些实施方式中，压力传感器200沿着能量递送装置102的远侧尖端设置，如图25A所示。此处，能量递送装置102包括具有针形的能量递送体108，其中能量递送体108至少部分地被绝缘套管202覆盖。如图所示，分子110被传送通过能量递送体108到达附近的靶组织区域。这允许压力传感器200在注射分子110和施加治疗能量期间监控压力。在其他实施方式中，压力传感器200沿能量递送装置102的远端但靠近尖端布置，如图25B所示。这里，压力传感器200沿着至少部分地覆盖能量递送体108的绝缘套筒202布置。在组织水平上进行相对压力测量允许用户了解注射分子110在组织内的分布。考虑到在已知压力和流速(在装置102的近端附近能容易测量的值)下注射的溶液，在远端的附加相对测量将提供信息以了解分子沿靶组织以及时间压力曲线的空间分布。
在一些实施方式中，压力传感器200包括应变计换能器。应变计换能器通常以响应于被测量(即应变、电阻或波长)而表现出其输出形式的变化为特征。灵敏度由电阻相对于长度的相对变化而确定。
在其他实施方式中，压力传感器200包括隔膜位移换能器。隔膜位移换能器基于微机电系统技术，其中传感器在密封腔体上具有可弯曲平坦表面(隔膜)。隔膜响应压力变化而弯曲或变形。所得输出形式可以是基于电容的或基于压电换能器的。在一些实施方式中，传感器200被放置在能量递送装置102的远端，而其对应的隔膜被设置在传感器200的近端，因此能够跨越其间的距离测量压降。在难以这样放置传感器的情况下，例如由于尺寸限制，可以优选压力传感光纤。
在一些实施方式中，能量递送装置102包括沿其远端布置的可扩张构件204，如图25C所示。这里，可扩张构件204安装在绝缘套筒202上，该绝缘套筒202至少部分地覆盖具有针形的能量递送体108。可扩张构件204的这种定位可有助于防止分子110的溶液沿通过插入能量递送装置102所产生的通路回流。这可以改善靶组织内的压力分布并因此改善分子110的整体转移。可扩张构件204还可以防止针形能量递送体108在递送PEF能量期间移动。在一些实施方式中，安装在可扩张构件204上的压力传感器200监控可扩张构件204内的压力。这确保可扩张构件204的适当膨胀。此外，在一些实施方式中，压力传感器200在分子110输注和/或PEF能量递送期间监控组织压力。
B.pH感测
可以理解，细胞通常也对生物刺激作出反应。一种在细胞活力中起重要作用的生物刺激物是pH。假设pH稳定，则pH内相对微小的变化可能会影响几乎所有细胞过程，包括新陈代谢、膜电位、细胞生长、物质穿过细胞膜的运动、细胞骨架的聚合状态和肌肉细胞中的收缩能力。
在一些实施方式中，设置pH传感器(例如沿着能量递送装置102(诸如靠近其远端)布置)以监控局部pH。pH的测量值可用于提醒用户或改变一个或多个算法152以避免达到有害的酸度/碱度，但更重要地，pH的测量值还可以被优化并用作最佳转移条件/设置的度量。
C温度感测
另一种在细胞活力中起重要作用的生物刺激是温度。相对微小的温度变化可能会影响几乎所有细胞过程，包括新陈代谢、膜电位、细胞生长、物质穿过细胞膜的运动、细胞骨架的聚合状态和肌肉细胞中的收缩能力。在一些实施方式中，温度传感器沿能量递送装置102布置以监控局部温度。这将使得能够监控和维持局部温度在正常的生理范围内，同时减少或确保在能量递送期间中没有热损伤。此外，在一些实施方式中，温度感测与将分子110递送至靶部位相关并最终改善转移的适度冷却/加热结合使用，如前所述。可以理解，可以使用多种类型的温度传感器，例如热电偶、电阻温度检测器传感器、光纤等。
转移和消融
可以理解，在一些实施方式中，本文描述的装置、系统和方法还可适于除了分子110转移之外提供消融。这在治疗身体内肿瘤时可能特别有用。在这种情况下，能量递送装置10被配置为接近肿瘤，例如经皮或腔内。发生器104包括一种或多种算法152，其递送具有波形的PEF能量，所述波形在靶组织内的特定位置提供消融并提供分子转移至靶组织内的其他位置。在一些实施方式中，PEF能量产生从能量递送体108径向向外延伸的各种治疗区。例如，最靠近能量递送体108的区(即中央区)承受立即细胞死亡(例如经由坏死)，并且围绕中心区的区(即外围区)接收分子110的转移，诸如用于基因疗法。
可以理解，上文描述的一些PEF能量波形还可适于除了分子110的转移之外提供消融。例如，在一些实施方式中，图15B中所示的交替DC波形被配置为通过修改各种参数值除了转移分子110之外还提供消融。下面的表5提供了各种示例参数组合，以实现中心区的消融和外围区的分子110的转移：
表5
在一些实施方式中，通过修改各种参数值，图16的极性交替的“斩波”波形被配置为除了分子110的转移之外还提供消融。下面的表6提供了与此波形一起使用的各种示例参数组合，以实现中心区的消融和外围区的分子110的转移：
表6
在一些实施方式中，通过修改各种参数值，极性交替的图17的“斩波”双相波形被配置为除了分子110的转移之外还提供消融。下面的表7提供了与此波形一起使用的各种示例参数组合，以实现中心区的消融和外围区的分子110的转移：
表7
如前所述，在一些实施方式中，能量递送装置102包括轴106，该轴106在其远端附近具有能量递送体108，其中能量递送体108包括多个尖齿600。同样地，参见图6，在一些实施方式中，第一部分106a充当能量递送体108并且一个或多个尖齿600充当能量递送体108。不同的能量递送体108中的每一个可以递送相同或不同类型的能量；同样地，能量递送体108可以成组作用。特别地，在一些实施方式中，第一部分106a递送消融组织的能量并且一个或多个尖齿600递送将分子转移到组织细胞的能量。可以理解，在其他实施方式中，特定尖齿递送消融组织的能量，而其他尖齿递送将分子转移至组织细胞的能量。还可以理解，在一些实施方式中，相同的尖齿用于在不同的时间递送不同类型的能量。同样地，可以理解的是，在一些实施方式中，相同的尖齿用于在不同时间递送分子110或能量。并且在一些实施方式中，相同的尖齿可用于同时递送分子110和能量。当治疗诸如肿瘤等不期望的组织时，这些实施方式可能特别有用，其中肿瘤被消融并且分子110被递送到其周围以确保完全去除肿瘤。
附加临床应用
A.递送至心脏组织
图26图示了使用能量递送装置102将分子110递送至心脏H内的细胞的方法。在该实施方式中，能量递送装置102包括细长轴106和设置在其远端附近的能量递送体108。此外，轴106包括一个或多个递送端口702，其位于能量递送体108附近一定距离处，分子110通过该递送端口递送。在一些实施方式中，当能量递送体108定位在左心室LV内时，一个或多个递送端口702定位成处于主动脉瓣AV上方的主动脉A内。在图26的实施方式中，一个或多个递送端口702设置在冠状动脉分支附近的主动脉瓣AV上方，而能量递送体108定位在左心室LV的壁附近。这允许将分子110递送至冠状动脉分支，分子110在此处能够进入冠状动脉循环。图27图示了冠状动脉CA和冠状动脉分支相对于主动脉A和主动脉瓣AV的位置。因此，将分子110递送到主动脉瓣AV上方的主动脉A，允许分子110进入冠状动脉循环以便到达心脏H内的各种组织。由于单向主动脉瓣AV，分子110在很大程度上被阻止进入左心室LV。位于心脏H内(例如左心室LV内)的能量递送体108能够将能量递送至心脏H的壁，使得在附近循环通过冠状动脉CA的分子110能够进入心脏H的壁的组织细胞。
可以理解，能量递送装置102可以具有多种配置以便在一个位置或多个位置同时或以一定的图案向心脏H递送能量。同样地，附加的递送装置可用于将能量和/或分子110递送到心脏H内或附近的不同位置。这在将能量递送到最容易从各种腔室进入的心脏H的部分时可能是有用的。
可以理解，在一些实施方式中，分子110可从能量递送装置102的远端(例如在左心室LV内)递送，以便驻留在能量递送至的壁附近或通过穿入壁中使得分子110在能量递送之前或期间被递送到壁中。可以理解，可以利用分子110和能量递送的任何组合。在这些情景的任何一种情景中，分子110被递送至组织使得细胞能够在能量递送时摄取分子110。
B.递送至髓外造血肿块
造血是所有类型的血细胞的生成，包括血细胞的形成、发育和分化。出生前，造血发生在卵黄囊中，然后是在肝脏中，最后是在骨髓中。然而，在一些患者中，造血发生在骨髓外，或者是天然地或者是病理性地(例如，诸如地中海贫血、镰状细胞病和骨髓增生性疾病的慢性贫血症状中，特别是慢性特发性骨髓纤维化的典型的骨髓增生性病症患者中，以及诸如真性红细胞增多症和罕见的原发性血小板增多症的其他伴有“继发性骨髓纤维化”的骨髓增生性病症中)。少数情况下，它也可见于骨髓增生异常/骨髓增生性疾病(例如，慢性粒单核细胞白血病)或骨髓增生异常综合征患者。这被认为是髓外造血(EMH)，是指发生在骨髓外的造血。髓外造血常见于脾脏和肝脏，但也见于其他部位，如淋巴结、肺、浆膜表面、胸腔、肾上腺、泌尿生殖系统、皮肤、腹膜后和脊柱旁间隙。
假定EMH是对血液生产需求增加的补偿性反应。血红蛋白病患者的无效红细胞产生导致髓外造血(良性)肿瘤形成或身体多个部位肿块。这样的肿块尺寸上可以达到几厘米。由于这样的肿块通常是良性的，因此很少切除肿块。在一些实施方式中，这样的肿块中的细胞，例如CD34+细胞(造血干细胞，HSC)被靶向以利用本文描述的PEF能量、装置和方法来转移分子110。这样的位置，尤其是肝脏或脾脏内的位置相对容易到达，经过治疗(例如编辑基因突变)后产生的免疫细胞会释放到身体中，以修复或减轻相应的疾病。
C.递送至骨髓
在一些实施方式中，利用本文所述的PEF能量、装置和方法，将分子110转移至干细胞直接发生在患者的骨髓中。在一些实施方式中，能量递送装置102被配置为进入骨髓本身，而在其他实施方式中，能量递送装置102被配置为附件装置提供进入后被推进骨髓中。在一些实施方式中，造血干细胞被靶向用于转移。在这样的实施方式中，髂嵴(在骨盆中)被穿孔以进入骨髓内的靶细胞。髂嵴是富含造血干细胞的骨骼，易于获取，通常用于获取骨髓以进行骨髓捐赠。穿孔产生孔，通过该孔能量递送装置102可被推进以递送PEF能量。如所提到的，分子110可以通过能量递送装置102或通过各种其他途径递送。最终，分子110在PEF能量的帮助下转移到靶细胞。因此，在骨髓的造血干细胞(HSC)中直接(体内)递送分子110，例如基因编辑材料，以治愈遗传性血液病症。
将分子110直接递送至骨髓优于体外方法。在体外方法中，造血干细胞(CD34+细胞)从动员外周血中分离出来。动员外周血是用动员剂处理过的全身循环的血液。术语“动员”是指鼓励干细胞从骨髓迁移到外周循环的过程，在外周循环中可以经由白细胞分离术收集干细胞。动员剂使大量造血干细胞和祖细胞从骨髓动员并渗出到血流中。由于这些动员剂的性质以及捐赠者招募和收集的复杂性，必须密切监控捐赠者，并且必须持续管理收集以同时确保捐赠者安全和成功收集。
此外，使用生长因子体外扩增干细胞可以将干细胞转化为癌细胞。事实上，CRISPR临床试验中的一些镰状细胞性贫血患者在细胞回输后已患有血液系统癌症。将经过编辑的干细胞重新注入患者体内需要进行多轮化疗以抑制免疫系统并允许进行干细胞移植，否则身体会排斥它们。
在骨髓中，只有5-10％的CD34+是HSC。体外CD34+选择不会完全消除T细胞，这对同种异体移植有影响，因为无移植物抗宿主病(GvHD)的移植需要没有T细胞污染的纯HSC。约95％的内源性HSC处于细胞周期阶段G0。在经典的环磷酰胺/粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后，所有骨髓HSC进入细胞周期并扩张，并上调巨噬细胞“不要吃我”信号CD47的表达。它们在G0/G1进入血流，通过HSC整合素α4β1和正弦内皮血管细胞粘附分子之间的相互作用归巢至骨髓，巨噬细胞的交叉场，并且通过HSC CXCR4受体归巢至CXCL12生态位。当HSC使用因子进行体外培养时，它们进入细胞周期，进入G1，约30小时进入S阶段。在静脉注射时，S/G2/M中的HSC失去了归巢至骨髓的能力。在培养2-3天后，大部分HSC已变成无法自我更新的祖细胞。因此，开始时只有一小部分CD34+细胞是HSC，并且其中处于周期的HSC归巢能力弱。
此外，HSC的生物学和环境对病毒载体HSC基因修饰有影响。与细胞不同，病毒载体不能从血液中归巢至骨髓，它们也不太可能穿过骨髓血管进入HSC生态位。目前的动员方法只能在很短的间隔内在血液中提供载体和G0/G1 HSC两者，甚至动员的HSC也代表了罕见的群体。尽管病毒包膜蛋白可以促进与HSC的融合，允许病毒载体能够将其负荷释放到细胞内，但用于基因疗法的载体还需要HSC特异性结合位点和脱靶递送，而且整合仍然是一个难题。然而，生产具有结合富含HSC标记物的包膜胞外域的慢病毒载体可以实现体内基因转移，并且动员方案的实验操作可以延长HSC在血液中的载体可及性停留时间。如本文所述，这些策略中都没有设想直接在骨髓中递送分子110以及随后的效应，例如基因编辑。
可以理解，CRISPR/Cas9系统是用于基因编辑的优选系统。CRISPR/Cas9系统可用于使用本文所述的PEF能量、装置和方法在身体内不同位置(包括骨髓)进行基因编辑。这与用于HSC中基因编辑的传统工具，例如表达Cas9和向导RNA两者的慢病毒载体，形成对比；由于滴度低、转导后持续的Cas9表达以及实现转导的困难，该慢病毒载体并不是最佳选择。类似地，使用Cas9加向导RNA核糖核酸颗粒的常规电穿孔在体外工作有效率，但可能与高水平的毒性相关，不能用作体内施加。
D.递送至间充质干细胞
在一些实施方式中，利用本文所述的PEF能量、装置和方法，分子110向间充质干细胞的转移直接发生在体内，例如在患者的骨髓或脂肪组织中。间充质干细胞(MSC)是许多疾病，尤其是与肌肉骨骼系统相关的疾病的理想治疗靶点。MSC是成体干细胞，可以分化成中胚层谱系的细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。MSC是首先从骨髓(BM)中分离的罕见的非造血祖细胞。虽然主要存在于BM和脂肪组织中，但存在从外周血、脐带血、滑膜、乳牙、羊水和血管周围区域分离的示例。
已发现MSC具有低免疫原性和免疫调节性两者，可以归巢至受损组织并依赖生物活性分子的分泌来启动修复过程中的愈合。MSC表达各种趋化因子受体，这些受体允许它们响应发炎损伤部位产生的趋化因子吸引梯度而迁移。因此，这些细胞的遗传修饰，诸如使用本文所述的装置和方法，可用于治疗从癌症到心血管或骨骼疾病的多种疾病。
分子110向MSC的体内转移克服了体外转移的许多缺点。首先，避免长期细胞培养，这消除了细胞群异质性增加的后果。越来越多样化的细胞群使得很难清楚地限定功能群和负责任何可检测效应的机制。此外，长期培养还可导致功能性表面蛋白(例如CXCR4)下调，长期体外扩增的细胞显示体内迁移和归巢潜能降低。因此，避免了将结果从科研转到临床相关的任何问题。最后，除了对用于进入人体的移植物的血清依赖性生长的担忧，培养的MSC可能发生突变并变得具有转化性，就像在小鼠中看到的移植的MSC形成肉瘤的情况一样。体内转移也避免了这种情况。
期望在MSC所处的微环境中，将分子110转移到MSC中。MSC所处的微环境(无论是血管周围、BM中还是其他区域中)对MSC的归巢、分化和再生能力都有重大影响。周围的细胞和细胞外环境似乎也影响可用作识别标记的表面蛋白质和表位。
可以理解，可以在体内直接靶向MSC以进行基因编辑或基因疗法。MSC的这些操作有益于以下疾病。
增强造血干细胞移植的植入。MSCs首先从BM中分离，BM是造血作用的关键部位，现在认为MSC在造血作用中发挥作用。造血干细胞(HSC)需要基质支持细胞才能正常分化并维持BM骨内膜生态位内的静止状态，这两种支持功能都可以由MSC后代成骨细胞执行。这已成为将MSC与HSC移植结合使用的基础，以期增强供体HSC的植入和增殖。在移植部位进行基因改造的MSC将改善植入。
低磷酸酯酶症：低磷酸酯酶症是一种以骨矿化减少为特征的疾病，这是由于来自成骨细胞和软骨细胞的组织非特异性碱性磷酸酶(ALP)的失活突变所致。移植的MSC分化成成骨细胞可能是递送细胞群的有效治疗方法，能够产生正常ALP酶。全BM移植已与培养的成骨细胞组合用于治疗患有低磷酸酯酶症的婴儿。然而，使用本文所述的装置和方法将ALP酶局部(在BM中)转染到MSC将改善结果。
成骨不全症：成骨不全症(OI)是一组至少九种遗传病症，其特征是骨病导致不完全骨延长和不同严重程度的骨折风险增加。在大多数受影响的患者中，成骨不全症由I型胶原蛋白缺乏或异常合成引起。主要治疗是使用抗再吸收双膦酸盐来增加骨密度，但这未能解决根本原因。MSC可用于治疗OI患者，因为它们可以分化成成骨细胞并提供正常的I型胶原蛋白。成功靶向缺失突变型胶原蛋白的MSC将加工并形成类似于野生型细胞的胶原蛋白和胶原纤维。在体内，这些细胞能够在小鼠内形成异位骨。
心血管疾病：在过去十年中，涉及MSC和心血管疾病的研究激增。特别是在心肌梗塞中，在动脉闭塞导致心肌细胞缺氧损伤后，MSC的可塑性、归巢和炎症调节都是发挥作用的重要特性。心肌缺乏有效替换这些细胞的能力，因此任何治疗的目标都是替换心肌细胞。使用转基因MSC试图改善MSC的归巢、存活和旁分泌介导的效果。在一些实施方式中，本文描述的用于将分子110递送至骨髓中的MSC的装置和方法用于过表达MSC中的治疗基因，然后MSC将行进至心脏。
预防肺动脉高压：转基因MSC已被用于通过预防肺动脉高压来预防肺缺血。本文所述的装置和方法可用于将分子110递送至骨髓中的MSC。
癌症：MSC能够优先归巢至原发性和转移性肿瘤生长的部位，并将抗肿瘤剂递送至肿瘤周围的高度特异性生态位。基因靶向的两个主要类别是细胞毒性或促凋亡基因和免疫刺激基因。促凋亡基因TNF相关凋亡引起配体的受体在许多类型的肿瘤上并且当配体的可溶形式在MSC中表达时表达，并在人宫颈癌、乳腺癌和神经胶质瘤的异种移植小鼠模型中正确定位，减少了增殖和肿瘤大小并增加了细胞凋亡和存活时间。引起型一氧化氮合酶也被证明是潜力强大的抗肿瘤疗法，当通过基因修饰的MSC将其递送至小鼠的纤维肉瘤模型时，减少了肿瘤的生长。第二类治疗性转基因是免疫调节靶标。经工程改造以表达IL-2、-7、-12和-18的MSC在原发性、确诊性和转移性肿瘤的啮齿动物异种移植模型中减小了肿瘤大小。带有其他免疫细胞因子(例如IFN-α和–β以及CX3CL1/fractalkine)的MSC通过增加T细胞的激活来激活先天免疫活性(如自然杀伤细胞)或适应性免疫反应，增加前列腺癌、肺癌、胰腺癌和皮肤癌中的肿瘤细胞凋亡和动物存活时间。
I型糖尿病：1型糖尿病(T1D)是胰腺中由器官特异性自身免疫介导的胰岛素分泌β细胞的缺失所致。T1D患者使用外源性胰岛素疗法来控制血糖水平；然而，这并不能消除视网膜病变、肾病和神经病变等长期糖尿病并发症的发生。目前，胰腺或胰岛移植仍然是唯一的治愈方法；然而，这些治疗受限于供体器官短缺和终生免疫抑制需求。间充质干细胞(MSC)是自体和同种异体治疗T1D的富有吸引力的替代靶细胞。
靶向中枢神经系统：因其归巢特性，间充质干细胞(MSC)可以移动到身体的各个部位并执行从静脉管路到中枢神经系统的修复，充当载体，并且已经表明它们不会引起有意义的免疫反应。
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递送到眼睛
A背景
视网膜是排列在眼睛后部的一层薄的组织。视网膜的作用是接收晶状体聚焦的光线，将光线转化为神经信号，并将这些信号发送到大脑进行视觉识别。因此，视网膜是视觉过程的核心，其中，光被转换为可以在大脑中翻译的信号。
图28图示了视神经ON附近的视网膜R的横截面部分。视神经ON附近的视网膜的中央区域称为黄斑，并且包含高密度的颜色敏感感光(光感测)细胞。这些称为视锥的细胞产生最清晰的视觉图像，并负责中央视觉和色觉。围绕黄斑的视网膜周边区域包含称为视杆的感光细胞，它们对较低的光水平有反应，但对颜色不敏感。视杆负责周边视觉和夜视。视锥和视杆两者可见于视杆视锥层(雅各布膜)LRC中。视神经ON携带感光器(视锥和视杆)产生的信号。每个感光器都通过微小的神经分支联结到视神经。视神经连接到神经细胞，这些神经细胞将信号传送到大脑的视觉中心，在那里它们被翻译为视觉图像。
视神经ON和视网膜R具有大量的血管，该血管携带血液和氧气。部分血管供应来自脉络膜CH，脉络膜CH是位于视网膜R和称为巩膜SC的眼睛外白层之间的血管层。视网膜中央动脉(视网膜血液的另一个主要来源)到达视神经ON附近的视网膜R，然后在视网膜R内分支。血液从视网膜R流入视网膜中央静脉的分支。视网膜中央静脉在视神经ON内离开眼睛。
多种疾病和状况可导致视网膜功能障碍并最终导致失明。遗传性视网膜变性(IRD)，也称为遗传性视网膜营养不良，代表了一组多样化的可导致失明的进行性、视力衰弱疾病。在IRD中，对视网膜功能至关重要的基因突变会导致进行性感光细胞死亡和相关的视力丧失。对于大多数人来说，IRD只影响眼睛。但是，一些类型的IRD与其他健康问题有关。IRD具有遗传异质性，迄今为止已鉴定出260多种疾病基因。IRD是工作年龄成人失明的主要原因。总之，它们影响了全球约四千分之一的人或超过200万人。
迄今为止，用于改变或阻止疾病进展速度的治疗和治愈方法的研发受到限制。已经研究了可能减缓一系列遗传原因引起的感光器退化的疗法。维生素A和二十二碳六烯酸已被证明可适度降低视网膜色素变性(RP)患者的疾病进展速度。据报道，口服丙戊酸可减缓RP患者的一系列情况下的视野进展，但丙戊酸治疗常染色体显性RP患者的随机临床试验显示丙戊酸治疗与安慰剂治疗的患者之间无显著差异。
高通量筛选的进步加快了识别细胞靶标和候选神经保护剂的步伐。氧化损伤与感光器变性有关，在RP的临床前研究中，N-乙酰半胱氨酸(NAC)和N-乙酰半胱氨酸酰胺(NACA)已被证明可以预防视网膜变性。使用睫状神经营养因子(CNTF)的非特异性神经营养因子疗法已被证明可以在许多动物模型中减缓感光器退化，但在早期或晚期RP患者的人体临床试验中并未证明视觉功能有益。
此外，已针对研发针对特定遗传形式的IRD的基因增强疗法做出了重大努力。已经报道了针对RPE65和CHM相关视网膜变性的基因增强疗法的成功临床试验。基因组编辑和基因定向药理学疗法，包括反义寡核苷酸、过早终止密码子通读策略、碱基编辑和RNA编辑，也可能是治疗可能不适用于基因增强疗法的遗传疾病的有前景的方法。
然而，如前所述，将遗传物质引入细胞具有其挑战。与许多其他生物分子和治疗化合物不同，DNA序列和核酸并非设计用于穿过细胞膜。此外，它们缺乏内吞因子，该内吞因子会引起转运进细胞的备用机制。因此，所有基因疗法都需要至少两个特征的组合：治疗性编码分子(DNA序列、基因、siRNA等)和进入靶向细胞的给药途径。将遗传物质递送到细胞的一种方式是使用病毒载体。前面已经提到了病毒载体的各种缺点。此外，
电穿孔作为一种破坏细胞膜完整性并导致悬浮细胞摄取大分子的方法已超过三十多年。用于测试基因对细胞形态和行为影响的大量体外研究依赖于电穿孔作为将基因递送到细胞中的可靠方法。通常，细胞悬浮在培养基中，培养基被吸取到比色杯内。比色杯由分开既定距离的板电极组成。然后将一系列脉冲电场递送到细胞以转染遗传物质。体外环境允许非常精确地控制转染条件，允许高水平的基因递送而不杀死太大比例的细胞。通常，已经研发出专门针对不同细胞系优化的方案。总的来说，体外转染对于生成基因效应的基本理解或产生转基因实验动物模型具有很高的可靠性。然而，它在实施可行的临床基因疗法方面存在困难。需要转染培养细胞要求几个附加的步骤才能转化为针对患者的疗法。大多数情况下，使用基于单采血液成分术的方法提供基因疗法。这涉及通过抽血或活检对患者的细胞进行取样。然后分离并浓缩靶细胞群。通常，细胞群也会被扩增以产生有意义的转染细胞群大小。一旦细胞准备好，它们就会被基因治疗分子电穿孔。在转染后，细胞会重新分布在患者体内的必要部位，例如血液或靶器官中的靶位置。这些步骤增加了提供基因疗法的大量负担、成本、侵入性、时间和风险。总体而言，这些众多且实质性的缺点阻碍了大多数潜在治疗选择广泛采用基于脉冲电场的基因疗法作为最可能的治疗选择。
B.概述
提供了用于将分子，特别是小分子和/或大分子，递送至身体内的细胞，特别是递送至眼睛内的靶细胞，更特别是递送至视网膜内的靶细胞的装置、系统和方法。示例分子包括质粒、RNA(例如信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA)、反义寡核苷酸、蛋白质和/或引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的材料等。这样的分子通常有利于治疗多种疾病和病症，例如遗传性视网膜变性(IRD)，包括但不限于色素性视网膜炎(RP)、视杆细胞营养不良或视杆细胞营养不良、Usher综合征(USH)、Bietti结晶性营养不良(BCD)、Batten病、Bardet-Biedl综合征(BBS)、Alport综合征、Leber先天性黑蒙(LCA)或早发性视网膜营养不良(EORD)、视锥细胞营养不良、视杆细胞营养不良(CORD)、全色盲、先天性静止夜盲症(CSNB)、黄斑营养不良、Stargardt病、Best病、图形状营养不良、Sorsby眼底营养不良、Doyne蜂窝营养不良、无脉络膜症、X连锁视网膜劈裂症(XLRS)等。
分子可以通过多种机制递送至眼睛，包括注射到玻璃体腔(或晶状体和视网膜之间的区域)，注射到脉络膜上腔(巩膜和脉络膜之间横穿眼睛后段的圆周的潜在空间)和/或注射到视网膜下泡(通过将视杆视锥层(LRC)与其支持的视网膜色素上皮(RPE)分开而形成的小区域)。然后使用脉冲电场将分子递送通过靶细胞的细胞壁，使得分子被递送至靶细胞并且能够实现期望的效果。因此，在基因疗法的情况下，使用分子递送的核酸而不使用病毒来转染细胞。
这些装置、系统和方法优于腺相关病毒(AAV)递送，AAV是一种已知的基于病毒的基因疗法。AAV的有效载荷能力有限；AAV只能容纳小于4.7kb的基因，并且用于遗传控制元件(例如启动子等)的空间有限。有超过300种疾病基因，对于基于AAV的基因疗法来说太大了。这些疾病基因包括导致许多相对常见疾病(诸如Stargardt病、Usher 1B和1D，以及Leber先天性黑蒙10(LCA10))的基因。相比之下，本文所述的非病毒递送可以容纳大于10kb的基因，并且不受空间限制。因此，许多不能使用AAV递送的基因可以通过本文所述的装置、系统和方法递送。
装置、系统和方法利用能量递送系统100将脉冲电场能量递送至细胞。图29图示了被配置用于将能量递送至眼睛的部分的能量递送系统100的实施方式。在该实施方式中，能量递送系统100包括可移除地连接到波形发生器104的专用能量递送装置102。在该实施方式中，发生器104包括用户界面150、一个或多个能量递送算法152、处理器154、数据存储/检索单元156(诸如存储器和/或数据库)，以及产生并存储要递送能量的能量存储子系统158。可以使用附加的附件和装置。能量递送装置102根据一种或多种能量递送算法152递送由波形发生器104提供的能量。
在该实施方式中，能量递送装置102包括刚性轴106、电极体108和手柄105。通常，电极体108包括一个或多个电极。轴106具有足够的刚性以允许穿过眼睛的表面使得其远端进入眼睛的内部部分。在该实施方式中，轴106具有内腔，该内腔被配置为电极体108从中穿过，使得电极体108的至少一部分延伸超过轴106的远端。在该实施方式中，电极体108具有充当电极的导电棒或线的形式，其尺寸和构造被设计和配置为穿过轴106中的内腔。在该实施方式中，手柄105包括可操纵的致动器132以操纵电极体108。例如，在该实施方式中，致动器132包括按钮，该按钮推进电极体108并从轴106的远端缩回电极体108。这使得当轴106插入到眼睛内时，电极体108被缩回，并且一旦轴106被理想地定位，电极体108被推进朝向靶组织区域或进入靶组织区域。可以理解，可以使用其他类型的致动器132，包括滑块、棘轮、旋钮、刻度盘、传感器等。一旦电极体108暴露在期望的位置，脉冲电场能量就经由电极体108从发生器104传递到靶组织区域。在该实施方式中，轴106不导电或绝缘，使得电极体108提供的能量从电极体108的暴露部分发出。
可以理解，本文通篇描述的许多能量递送装置102被配置为提供单极能量递送。在这种情况下，返回电极位于患者的体表，例如躯干、臀部或下肢。当治疗眼睛时，返回电极可以更靠近眼睛定位，例如在眼睛的表面上。还可以理解，在一些实施方式中，能量递送装置102被配置为以双极或多极布置提供能量。在这样的实施方式中，能量递送装置102包括一个以上的电极体108，它们一起以双极或多极布置起作用，或者电极体被配置为以双极或多极方式起作用，诸如电极体108的一个以上的电极或部分充当双极对或多极组。同样地，在一些实施方式中，双极对或多极组的一部分位于单独的装置上。因此，递送或接收电流的单独装置即使用于接收电流也会被描述为能量递送装置102。同样地，能量递送体108和电极体108可互换使用。这是为了简化命名，因为递送或接收的功能可能会随着双极对或多极组的极性变化而变化。可以理解，能量递送体和电极体可以包括一个或多个电极。
可以理解，在一些实施方式中，能量递送装置102还递送将被靶细胞摄取的分子。然而，在其他实施方式中，分子通过单独的装置递送，例如通过针头注射。可选地，分子可以由能量递送装置和单独的装置两者递送。
诸如脉冲电场(PEF)能量的能量由发生器104提供并经由至少一个电极体108递送至眼睛内组织。这些电脉冲由至少一种能量递送算法152提供。在一些实施方式中，每个能量递送算法152规定具有包括一系列脉冲的波形的信号。算法152规定信号的参数，诸如能量振幅(例如电压)和施加能量的持续时间，该参数由脉冲的数量、脉冲宽度和脉冲间延迟等组成。在一些实施方式中，所述电极体中的一个或多个很小并且易于在电极周围耗散大量能量。因此，需要最佳的能量递送。在一些实施方式中，在这种情况下，利用具有半晶体管桥的大直流链路电容来递送有效的递送脉冲。在一些情况下，这优选与功率放大器(有限带宽)或指数衰减发生器递送的脉冲电压有关。在一些实施方式中，可以包括基于传感器信息和自动关闭规范等的反馈回路。
在一些实施方式中，可以使用双相脉冲。在这样的实施方式中，附加参数可以包括双相脉冲中的极性之间的切换时间和双相周期之间的停滞时间。在一些情况下，双相波形便于减少患者的肌肉刺激。这在能量递送体的轻微移动可能容易导致无效疗法的应用中尤为重要。双相波形涉及信号的相位/极性的快速变化，以最小化极性转换期间的神经激活。例如，在H桥结构或全桥中需要并采用以及配置多个快速开关元件(例如MOSFET、IGBT晶体管)。
C.视网膜下泡
如前所述，分子可以通过多种机制递送至眼睛，包括注入玻璃体腔(或晶状体和视网膜之间的区域)、注入脉络膜上腔(巩膜和脉络膜之间穿过眼睛后段的圆周的潜在空间)和/或通过注射到视网膜下泡(通过将视杆视锥层(LRC)与其支持的视网膜色素上皮(RPE)分开而产生的小区域)。图30图示了用于产生视网膜下泡RB的过程的实施方式，可被描述如下。
在手术前，放大眼睛E的瞳孔并施加局部抗生素滴剂。手术通常在局部麻醉辅助的全身麻醉下进行。
在该实施方式中，视网膜下水泡被描述为使用视网膜下注射设备201产生。这样的设备201被配置用于递送溶液，例如分子溶液，以产生水泡。在这样的实施方式中，能量由作为单独装置的能量递送装置102提供。然而，可以理解，可以使用配备有递送溶液(例如分子溶液)能力的能量递送装置102来进行该过程。在这种情况下，用能量递送装置102产生气泡，并且用同一装置递送能量。
在本实施方式中，在无菌手术区域准备视网膜下注射设备201。注射设备201和任何延长管被固定到含有分子(例如质粒、RNA、寡核苷酸、脱氧寡核苷酸、反义寡核苷酸或蛋白质等)的注射器(未示出)。确认可用于注射的分子体积。
放置开睑器并进行标准的3端口睫状体平坦部玻璃体切除术。通过瞳孔直接可视化输液套管的尖端，以确认其在玻璃体内的位置。此时，输注应保持运行直至操作完成。
核心玻璃体切除术在高切割率和低抽吸设置下进行。尽可能完全去除玻璃体。在核心玻璃体切除术完成后，确认完全性玻璃体后脱离(PVD)。此时，玻璃体皮质不再附接到黄斑区。然后使用玻璃体切割仪器尽可能完全地去除剩余的动员玻璃体。
在分子的视网膜下注射之前，检查视网膜。治疗任何识别出的视网膜裂孔。分子的注射分两步进行。首先，设备尖端被定位以便缩进视网膜并将视网膜覆盖在尖端上。该位置应距离中央凹足够远，以尽量减少注射对该结构造成的机械应力。注入少量分子以确认尖端未被阻塞并且位置正确。接下来，如果出现水泡，则注射分子以递送总体积高达0.3mL或任何预期体积(例如高达1mL)。如果在测试注射过程中没有产生水泡，或者如果进一步注射没有增加水泡的大小，则将插管尖端重新定位到远离原始视网膜切开术的位置，然后重复该顺序。第二视网膜切开术应距离足够远，以使任何附加的注射材料不会与第一视网膜切开术部位连接并通过其回流。在注射器的全部内容物被排出之后，注射设备201被保持在适当位置(以允许递送注射器的剩余内容物)。此后，注射设备201被移除。
视网膜下泡RB提供了空间，在该空间内邻近视网膜色素上皮细胞(RPE)和视杆视锥层(LRC)的感光器和/或用于递送PEF能量的电极体108放置分子。在一些实施方式中，这种接近度增加了在递送脉冲电场能量时细胞摄取分子的能力。在一些实施方式中，脉冲电场能量的方面确定哪些细胞摄取分子和摄取量。摄取可受多种因素控制或影响，例如信号参数的选择、信号波形、电极极性、电极放置、分子类型、解剖环境的阻抗特性等。因此，在一些实施方式中，LRC的感光器摄取分子。并且，在其他实施方式中，RPE摄取分子，并且在另外的其他实施方式中，感光器和RPE两者摄取分子。同样地，在其他实施方式中，可以靶向其他视网膜层、眼睛组织或周围区域。可以理解，在一些实施方式中，摄取基于信号参数选择，诸如其中一组参数导致由解剖结构的一部分(例如，LRC)摄取，一组参数导致由解剖结构的另一部分(例如RPE)摄取以及另一组参数导致由解剖结构的两个或更多个部分(例如LRC和RPE)摄取。同样地，改变反转或改变电极体的极性也可以改变哪些细胞摄取分子。
图31图示了将能量递送装置102的实施方式定位到眼睛E内使得电极体108定位在视网膜下泡RB内。在该实施方式中，轴106穿过眼睛E和视网膜R的表面，使得手柄105位于眼睛E的外部。尽管能量递送装置102被示为在与注射设备201不同的位置处进入眼睛E，可以理解，在移除注射设备201时，能量递送装置102可以通过相同的开口被引入眼睛E。一旦能量递送装置102被理想地定位，脉冲电场能量通过电极体108从发生器104递送。在该示例中，电极体108具有正电荷，并且眼睛外部的返回电极(诸如位于患者体表的远程返回电极)具有负电荷。在该实施方式中，电极体108以单极方式向视网膜下泡RB递送能量，其中能量流出视网膜下泡RB(由箭头指示)，负向驱动泡RB内的分子110进入视网膜R以及可选地眼睛E的其他结构。可以理解，能量驱动分子110的方向取决于分子110的电荷、电极的极性和电极的位置等。其他组合和结果将在后面的部分中描述。然后移除能量递送装置102。
图32A-图32B图示了在施加脉冲电场能量时已经进入RPE的分子110。特别地，图32A图示了眼睛E，其中已经产生包含分子的视网膜下泡RB(由星号*表示)。施加能量，使视网膜细胞能够摄取分子。图32B图示了存在于RPE中的分子110。
在关闭输注巩膜切开术之前，夹住输注管线以防止超脉络膜输注。缝合切口。接下来，结膜下注射0.5mL的4mg/mL地塞米松溶液(用于急性炎症)和0.5mL的抗生素溶液。用软膏和贴片敷在眼表面，将眼罩放在适当位置并固定在已接受视网膜下注射的眼睛上。
D.示例递送选项
可以理解，可以使用各种递送选项，例如分子递送的各种位置、电极放置的各种位置、各种类型的电极布置、各种类型的波形和信号参数的各种组合等。至少一些组合将在本文中被描述但不限于此。
表8列出了示例递送选项的各种组合。这里，分子110被递送至多个位置，例如至视网膜下泡、玻璃体腔或视网膜下泡和玻璃体腔的组合。同样地，电极体108可以定位在多种位置，例如在视网膜下泡、玻璃体腔、抵靠角膜或在眼周空间(例如结膜下、眼球筋膜下或眼球后)。可以理解，在一些情况下，在需要时可以在这些组合中将视网膜下泡置换为脉络膜上腔。同样地，脉络膜上腔可与一个或多个泡结合用于分子和/或能量递送。已证明向脉络膜上腔注射10–50μL具有良好的耐受性，并且眼部并发症的风险较低，在一些情况下可以注射多达1mL。当靶向视网膜色素上皮细胞时，脉络膜上腔递送可能特别有用。
脉络膜上腔一直被认为是脉络膜和巩膜之间的潜在空间。脉络膜的内缘，即布鲁赫膜，是紧凑的，而外缘更像是一个过渡区，由数个厚度可变的纤维薄片组成。已被证明约50％的50岁以上的人群中存在脉络膜上腔。脉络膜上腔的存在与远视屈光正相关，并且在年轻、健康的人的眼睛中通常不存在脉络膜上腔。理论上，在远视眼中，巩膜压迫涡静脉会增加静水压力，导致亚临床脉络膜上腔积液，使脉络膜上腔中的少量液体在成像上可见。也有人提出，随着年龄的增长，蛋白质从脉络膜血管渗漏到脉络膜上腔的情况增加，渗透压也增加，导致老年人的检出率更高。脉络膜上腔也存在于具有特殊病症的各种患者中。因此，在一些情况下，脉络膜上腔可用作递送位置。
表8：
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多种这些组合在本文中被更详细地描述和图示。可以理解，存在多种组合并且本文仅提供了样本。同样地，在一只眼睛中可能会产生一个以上的视网膜下泡。因此，可以将分子和/或能量递送装置递送到一个以上的泡用于进一步组合。甚至表1中列出的组合也包括子组合，例如每个双极对具有两种电荷变化(正极和负极)。同样地，在解剖位置内分子110的位置和/或电极体108的位置也可能影响结果。例如，将分子定位在玻璃体腔的一个区域内与将分子定位在玻璃体腔的不同区域内可能具有不同的结果。或者，集中在玻璃体腔的一个区域中的分子110与扩散到整个玻璃体腔中的分子可能具有不同的结果。同样地，解剖特征(例如可能影响分子110运动的特定组织的天然阻抗)可能影响结果。此外，不同类型的波形可能导致分子110不同地运动，包括以不同的速度和轨迹运动。例如，一些波形引起平移，而另一些波形引起旋转、抖动或其与平移的组合等。因此，可以理解，本文提供的示例是样品且不被认为是限制性的。
图33图示了一个实施方式，其中分子110被递送至视网膜下泡RB并且电极体108定位在视网膜下泡RB内用于向其递送单极能量。这里，分子带负电，电极体108带负电而远程返回电极带正电。这通常导致分子被驱离电极体108，例如进入视网膜色素上皮细胞RPE和视杆视锥层LRC。在一些情况下，可以通过将电极体108放置在视网膜下泡RB内、选择波形或其他因素来实现朝向RPE或朝向LRC转向。在类似的实施方式中，分子110也被添加到玻璃体腔V。可以理解，晶状体和视网膜之间的这个区域在本文中被称为玻璃体腔V，而不管这个区域充满玻璃体液或另一种溶液。玻璃体腔110中的分子110通常被驱动到更远离视网膜下泡RB的视网膜部分内。可以理解，分子110可以特定地定位在玻璃体腔V中以预先安排分子110移动到视网膜的特定区域内。
图34图示了一个实施方式，其中分子110被递送至视网膜下泡RB并且电极体108定位在眼睛E的玻璃体腔V内用于向其单极递送。再一次地，此处分子带负电，电极体108带负电而远程返回电极带正电。这通常导致分子110被驱离电极体108，例如进入视网膜色素上皮细胞RPE。可以理解，根据电极取向和极性，分子110可以被推向并进入视网膜色素上皮RPE细胞。在一些实施方式中，每个脉冲或多个脉冲(例如4个向上、4个向下……2个向上、2个向下等)后改变脉冲的极性(双相)朝一个方向驱动分子110然后再朝另一个方向驱动分子110，这可以允许靶向视网膜色素上皮RPE细胞和视杆视锥层LRC两者。在类似的实施方式中，分子110也被添加到玻璃体腔V。在这样的实施方式中，玻璃体腔110中的分子110通常被驱动到LRC内。可以理解，分子110可以特定地定位在玻璃体腔V中以预先安排分子110移动到视网膜的特定区域内。可以理解，在一些实施方式中，不同类型的分子110被放置在泡和玻璃体腔中。
图35图示了一个实施方式，其中分子110被递送至玻璃体腔V并且电极体108也被定位在玻璃体腔V中用于向其单极递送。在这种情况下，不会产生视网膜下水泡RB，因为期望的通路是直接进入玻璃体腔V。再一次地，此处分子110带负电，电极体108带负电，而远程返回电极带正电。这通常导致分子被驱离电极体108，例如进入LRC。可以理解，在一些情况下，分子110在递送能量之前集中在玻璃体腔V的特定区域或区域中。例如，在一些实施方式中，分子110被递送到玻璃体腔V内的特定位置，例如接近靶组织区域和/或产生特定浓度以提供增强的和/或更可预测的分子110递送到靶细胞。在这种情况下，电极体108可以理想地放置在与分子110的浓度相关的玻璃体腔V内以优化递送。在一些实施方式中，这在玻璃体腔V中的相同位置内，并且在其他实施方式中，这邻近与这个位置以便转向特别方向上的分子110。例如，在一些实施方式中，分子110邻近LRC定位并且电极体108邻近分子110定位，使得能量电流将分子110驱离电极体108，进入LRC。
在其他实施方式中，以双极方式递送能量，例如使用两个单独的能量递送装置102或使用具有电极体中的一对或更多个的单个能量递送装置102。例如，图36图示了设置在视网膜下泡RB内的分子110和位于眼睛E中的两个电极体以双极方式将能量从一个递送到另一个。参考图36，分子110被显示在视网膜下泡RB内，并且具有第一电极体108'的第一能量递送装置102'被示为插入眼睛E内使得第一电极体108'被设置在视网膜下泡RB内。在该实施方式中，具有第二电极体108”的第二能量递送装置102”被示为插入眼睛E内，使得第二电极体108”设置在眼睛E的玻璃体腔V内。在该实施方式中，电流被递送至第一电极体108'并以双极方式流到第二电极体108”。以这种设置在眼睛中使用两个双极电极，带负电的分子(例如DNA)可以被推向例如视杆视锥层LRC并进入视杆视锥层LRC。可以理解，可以选择第二电极体108”在玻璃体腔V中的位置以引发特定效果，例如将分子110驱动到LRC的特定部分或增加驱动的幅度。在类似的实施方式中，第二电极体108”定位在角膜C上而不是在玻璃体腔V中。结果可能类似于关于图36所描述的结果，但是能量场可能导致递送至RPE的小幅增加，然而，大部分分子110将继续被驱动到LRC内。
图37图示了类似于图36的实施方式，其中使用两个电极体，一个在视网膜下泡RB中，一个在玻璃体腔V中。然而，这里分子110设置在玻璃体腔V中并且这里电极体的极性被切换。因此，第一电极体108'定位在玻璃体腔V内并且具有第二电极体108”的第二能量递送装置102”被示为插入眼睛E内使得第二电极体108”被设置在视网膜下泡RB内。电流以双极方式递送至第一电极体108'并流到第二电极体108”。同样地，这里分子带负电，第一电极体108'带负电而第二电极体108”带正电。这通常导致分子被驱离第一电极体108'，诸如进入LRC。再一次地，可以理解，可以选择电极体108'、108”和分子110在玻璃体腔V内的位置以引发特定效果，例如将分子110驱动到LRC的特定部分或增加驱动的大小。在类似的实施方式中，第一电极体108'在角膜C上。结果可能类似于关于图37所描述的结果。
图38图示了与图37类似的实施方式，但是分子110设置在视网膜下泡RB和玻璃体腔V两者中。再一次地，第一电极体108'位于玻璃体腔V内，第二电极体108”设于视网膜下泡RB内。电流以双极方式递送至第一电极体108'并流到第二电极体108”。在一些实施方式中，分子带负电，第一电极体108'带负电而第二电极体108”带正电。这通常导致分子110被驱离第一电极体108。因此，玻璃体腔V中的分子110被驱动到LRC内并且视网膜下泡RB中的分子被驱离电极体108'，例如进入LRC或RPE。可以理解，在一些实施方式中，不同类型的分子110被放置在泡和玻璃体腔中。
图39还图示了双极能量递送至眼睛。此处，具有第一电极体108'的第一能量递送装置102'被示为插入眼睛E内，使得第一电极体108'设置在玻璃体腔V内。在该实施方式中，具有第二电极体108”的第二能量递送装置102”被示为插入眼睛E的球后腔RBS内。球后腔RBS在眼睛E后面，靠近肌锥MC内的视神经ON。电流以双极方式递送至第一电极体108'并流到第二电极体108”。在该实施方式中，分子110设置在视网膜下泡RB内。使用这种布置的装置102'、102”，带负电荷的分子(例如DNA)通常被推向并进入RPE。可以理解，如果电极体108'、108”的极性被切换，则带负电荷的分子可以被推向并进入LRC。在类似的实施方式中，第一电极体108'位于角膜C上，而第二电极体108”位于球后腔RBS中。结果可能类似于关于图39所描述的结果，然而在一些情况下，能量场更均质化。这可以导致分子110更持续地转移至RPE。
参考图40，再一次地，分子110显示在视网膜下泡RB内，然而这里具有第一电极体108'的第一能量递送装置102'被示为插入眼睛E内，使得第一电极体108'设置在视网膜下泡RB内。在该实施方式中，具有第二电极体108”的第二能量递送装置102”被示为插入眼睛E的眼球后腔RBS内。电流以双极方式被递送至第一电极体108'并流向第二电极体108”。使用这种布置的装置102'、102”，带负电荷的分子(例如DNA)可以例如被推向并进去RPE，但是少量分子可以被推向并进入LRC。
图41图示了类似的实施方式，但是这里分子110设置在玻璃体腔V内而不是视网膜下泡RB内。在该实施方式中，能量以双极方式递送至第一电极体108'并流向第二电极体108”。使用这种布置的装置102'、102”，带负电的分子(例如DNA)被第一电极体108'排斥但跟随第一电极体108'周围的电场朝向第二电极体108”。因此，分子110可以被驱动朝向视网膜的侧面，而不是直接驱动进入覆盖视网膜下泡RB的视网膜部分。当期望治疗这些区域中的特定视网膜部分时，这可能是有益的。
图42图示了与图40-图41类似的实施方式，然而这里分子110设置在视网膜下泡RB和玻璃体腔V中。电流以双极方式被递送至第一电极体108'并流到第二电极体108”。在一些实施方式中，分子带负电，第一电极体108'带负电而第二电极体108”带正电。这通常导致分子110被驱离第一电极体108。因此，玻璃体腔V中的分子110被驱动到LRC内并且视网膜下泡RB中的分子被驱动到RPE内。可以理解，在一些实施方式中，不同类型的分子110被放置在泡和玻璃体腔中。
图43图示了一个实施方式，其中分子110被递送至玻璃体腔V并且第一电极体108'位于玻璃体腔V内。在这种情况下，不产生视网膜下泡RB，因为所需的通路是直接进入玻璃体腔V。在这个实施方式中，第二电极体108”抵靠角膜C定位。可以理解，可以利用各种不同的设计来抵靠角膜C定位电极体。可以使用各种巩膜类型隐形眼镜电极。示例包括Burian-Allen隐形眼镜电极和DTLTM(Diagnosys LLC)纤维电极，它们是美国最常用的用于记录视网膜电图(ERG)的电极，并且可用于递送本文所述的电流。其他示例包括金环电极和Jet隐形眼镜电极。其他类型的装置包括在眼睛或窥器周围使用的镊子电极。
电流以双极方式递送至第一电极体108'并流到第二电极体108”。同样地，此处分子带负电，第一电极体108'带负电，第二电极体108”带正电。因此，设置在第一电极体108'和LRC之间的分子110可以被驱离第一电极体108'朝向LRC，然后朝向向着第二电极体108'弯曲的电场。因此，这些分子110被驱向并进入LRC。可以理解，将分子110定位在LRC附近并且将第一电极体108'定位在分子110和第二电极体108”之间可以加强这种效果。可以理解，在类似的实施方式中，第二电极体108”位于球后腔RBS中而不是角膜C上。通过这种修改，分子110也被驱动到LRC内，可能驱动更强，视情况而定。
E.示例装置
能量可由多种能量递送装置102递送。通常，能量递送装置102包括具有能够被推进到身体内的靶组织的远端的细长轴106，以及设置在远端附近的电极体108。电极体108包括一个或多个电极，其将PEF能量递送至靶组织。这样的装置被配置用于进入眼睛E上或眼睛E内的靶组织。在一些实施方式中，这样的装置被配置用于进入视网膜R内或附近的靶组织。
如前所述，在一些实施方式中，能量递送装置102被配置为将诸如含有分子110的溶液递送至靶组织。图44A-图44B图示了这样的实施方式。图44A图示了包括刚性轴106、电极体108和手柄105的能量递送装置102的实施方式。轴106足够刚性以允许穿过眼睛的表面以使其远端进入眼睛的内部。在该实施方式中，轴106具有内腔，该内腔配置为电极体108从其中通过，使得电极体108的至少一部分延伸超过轴106的远端。在该实施方式中，能量递送装置102包括流体连接到轴106的内腔的注射端口300。在一些实施方式中，注射端口300包括用于附接注射器的鲁尔配件302。通常，包含所需溶液的注射器附接到鲁尔接头302。当需要递送溶液时，缩回电极体108以允许溶液通过轴106的内腔。在该实施方式中，手柄105包括可操纵的致动器132以操纵电极体108。在该实施方式中，致动器132包括推进电极体108并从轴106的远端缩回电极体108的滑块。这允许电极体108缩回。
然后注射溶液，通过轴106的远端释放到靶组织区域。然后通过滑动致动器132推进电极体108通过内腔。可以理解，在一些实施方式中，内腔的尺寸被设计成允许溶液在电极体108就位时从其中注射。这允许同时将溶液和能量递送至靶组织区域。
图44B提供了具有流体连接到轴106的内腔的注射端口300的能量递送装置102的实施方式的附加视图。在该视图中，示出了可附接到鲁尔接头302的注射器304。同样地，电缆310被示为从手柄105延伸，其中电缆310具有配置为连接到发生器104的接头312。这将电能提供给能量递送装置102，特别是电极体108。
可以理解，能量递送装置102，特别是电极体108，可以采用多种形式。图45图示了能量递送装置102的实施方式，其示出了其远端的特写。这里，能量递送装置102包括具有内腔107的轴106，电极体108延伸穿过该内腔107。在该实施方式中，电极体108包括导电杆或线320。在该实施方式中，线320具有被配置为穿透组织的尖的远端，然而可以理解，远端可以具有多种形状，包括钝的或圆形的形状。
在本文档中，如专利文件中所常见，术语“一个”或“一种”用于包括一个或不止一个，而与“至少一个”或“一个或多个”的任何其他实例或用法无关。在本文档中，术语“或”用于表示非排他性的或，因此“A或B”包括“A但不是B”、“B但不是A”以及“A和B”，除非另有说明。在本文档中，术语“包括”和“其中”被充当相应术语“包括”和“其中”的简明英语等效项。此外，在以下权利要求中，术语“包括”和“包含”是开放式的，即，包括除一项权利要求中该术语之后所列出的那些要素之外的要素的系统、装置、物品、组合物、制剂或过程仍被视为属于该权利要求的范围内。另外，在以下权利要求中，术语“第一”、“第二”和“第三”等仅充当标签，而并不旨在对其对象施加数字要求。
以上描述旨在是说明性的，而不是限制性的。例如，上述示例(或其一个或多个方面)可以彼此组合使用。可以使用其他实施方式，例如由本领域普通技术人员在阅读以上描述后使用。提供摘要以符合37C.F.R.§1.72(b)，使读者能够快速确定技术披露的性质。提交的理解是其不会被用来解释或限制权利要求的范围或含义。此外，在以上详细描述中，可以将各种特征组合在一起以简化本公开内容。这不应被解释为意味着未要求保护的公开特征对于任何权利要求都是必不可少的。相反，发明主题可能不在于特定公开的实施方式的所有特征。因此，以下权利要求在此作为示例或实施方式并入详细描述中，每个权利要求作为单独的实施方式独立存在，并且设想到这些实施方式能够以各种组合或排列彼此结合。本发明的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同项的全部范围来确定。

Claims (65)

1.一种用于将分子转移到患者的身体内的靶组织细胞的系统，所述系统包括：
能量递送装置，其具有至少一个能量递送体，所述能量递送体被配置为定位在所述身体内的所述靶组织细胞附近；和
与所述至少一个能量递送体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少一种能量递送算法，所述至少一种能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的电信号以便传输脉冲电场能量，所述脉冲电场能量使所述分子中的至少一个进入所述靶组织细胞中的至少一个细胞。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中所述一系列脉冲包括具有正振幅的至少一个脉冲和具有负振幅的至少一个脉冲。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的电荷平衡。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述身体内的肌肉刺激。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的系统，其中所述一系列脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的充分电荷平衡，以避免所述靶组织细胞的消融。
6.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，所述一系列脉冲包括振幅或脉冲宽度不同的至少一个脉冲。
7.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有在10-500V范围内的电压。
8.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有在0.5-200ms范围内的脉冲持续时间。
9.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，所述一系列脉冲具有在10ms-10s范围内的至少一个脉冲间延迟。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲具有足够长度的基脉冲宽度以引起所述身体中的肌肉刺激，并且其中所述至少一个脉冲包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有足以至少减少所述肌肉刺激的分段延迟。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述至少一个分段脉冲具有不超过10μs的接通时间。
12.根据权利要求10所述的系统，其中所述至少一个脉冲包括由10ms-10s的延迟分开的至少两个脉冲。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述至少两个脉冲具有相反的极性。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述一系列脉冲中的所述脉冲的每一个具有足够长度的基脉冲宽度以引起所述身体中的肌肉刺激，并且其中所述一系列脉冲中的所述脉冲的每一个包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有足以至少减少所述肌肉刺激的分段延迟。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述一系列脉冲中的所述脉冲一起具有来自正振幅接通时间和负振幅接通时间的电荷平衡。
16.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列双相脉冲，其中至少一个双相脉冲具有0.01-10μs的周期长度，并且其中所述至少一个双相脉冲包括多个分段脉冲，所述多个分段脉冲在其间具有分段延迟。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述一系列双相脉冲被分组为其间具有封包间延迟的封包。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中所述一系列脉冲包括至少一个高压、高频脉冲，然后是至少一个低压、低频脉冲，其中高压在100-1000V的范围内，高频具有50ns-1ms的脉冲宽度，低压在5-100V的范围内，低频具有1ms-50ms的脉冲宽度。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述至少一个低压、低频脉冲包括具有相反极性的至少两个低压、低频脉冲。
20.根据权利要求18所述的系统，其中所述至少一个低压、低频脉冲包括DC波形。
21.根据权利要求18所述的系统，其中所述至少一个高压、高频脉冲包括双相波形。
22.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述电信号包括一系列脉冲，其中至少一个脉冲包括至少一个尖峰。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述至少一个脉冲具有初级电压并且所述至少一个尖峰包括围绕所述初级电压振荡形成的多个尖峰。
24.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述能量递送装置包括具有一个或多个可从其延伸的尖齿的轴。
25.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个能量递送体包括篮形电极。
26.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述能量递送装置包括细长轴，并且其中所述至少一个能量递送体包括至少两个突起，每个突起从所述细长轴径向向外延伸。
27.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述发生器包括至少一种其他能量递送算法，所述至少一种其他能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的另一个电信号，以便传输调节能量，所述调节能量在所述靶组织细胞的局部区域内引起流体从所述身体外渗。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述局部区域包括所述靶组织细胞周围的间隙空间。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的系统，其中所述分子被递送至所述身体的脉管系统，并且其中所引起的外渗将所述分子从所述脉管系统递送至所述局部区域。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的系统，其中所述另一个电信号包括多个单相脉冲，所述多个单相脉冲各具有超过500微秒的持续时间。
31.根据权利要求27-29中任一项所述的系统，其中所述另一个电信号包括多个脉冲，其中所述多个脉冲中的至少一个具有正振幅并且其中所述多个脉冲中的至少一个具有负振幅。
32.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述系统包括至少一个传感器。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述至少一个传感器包括监控压力、温度、阻抗、电阻、电容、电导率、pH、光学特性、相干性、回声性、荧光、介电常数、光介电常数和/或电导的传感器。
34.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述发生器包括附加的能量递送算法，所述附加的能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个能量递送体的消融电信号，以便传输引起所述靶组织细胞中的至少一个死亡的消融能量。
35.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括小分子和/或大分子。
36.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括质粒、DNA、合成DNA载体、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、靶向嵌合体的蛋白水解、锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
37.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括至少一个大于5kb的基因。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述至少一个分子包括至少一个大于10kb的基因。
39.根据上述权利要求中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括视网膜细胞。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括骨髓的细胞。
41.根据权利要求1-38中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括消化系统的细胞，所述消化系统包括肝脏、胰腺、肠和/或结肠。
42.根据权利要求1-38中任一项所述的系统，其中所述靶组织细胞包括心脏的细胞。
43.一种用于治疗患者的身体内的靶组织细胞的系统，所述系统包括：
能量递送装置，包括一轴，该轴具有从其延伸的一个或多个尖齿轴，其中所述一个或多个尖齿包括第一能量递送体和第二能量递送体，其中所述一个或多个尖齿被配置为定位在所述患者的身体内的所述靶组织细胞附近；
与所述第一和第二能量递送体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少第一能量递送算法以及至少第二能量递送算法，所述第一能量递送算法被配置为提供可递送至所述第一能量递送体的第一电信号，所述第二能量递送算法被配置为提供可递送至所述第二能量递送体的第二电信号。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述第一电信号生成使至少一个分子转移到所述靶组织细胞中的至少一个的能量。
45.根据权利要求43-44中任一项所述的系统，其中所述第二电信号生成使至少一个靶组织细胞的消融的能量。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的系统，其中所述一个或多个尖齿中的至少一个从所述轴的远端沿其纵轴向远侧延伸，并且其中所述第二能量递送体沿其布置。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的系统，其中所述一个或多个尖齿中的至少一个从所述轴径向延伸，并且其中所述第一能量递送体沿其布置。
48.根据权利要求43所述的系统，其中所述一个或多个尖齿被配置为允许所述靶组织细胞的第一区域的消融并且允许将分子转移到所述靶组织细胞的第二区域。
49.根据权利要求48所述的系统，其中所述第二区域至少部分地围绕所述第一区域。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的系统，其中能量递送装置被配置为使得所述一个或多个尖齿中的至少一个能够递送多个分子。
51.一种用于治疗患者眼睛的一部分的系统，所述系统包括：
具有至少一个电极体的仪器，所述电极体被配置为定位在所述眼睛中、所述眼睛上或所述眼睛附近；和
与所述至少一个电极体电连通的发生器，其中所述发生器包括至少一种能量递送算法，所述至少一种能量递送算法被配置为提供可递送至所述至少一个电极体的脉冲电场能量的电信号，以使至少一个分子进入所述眼睛的细胞。
52.根据权利要求51所述的系统，其中所述仪器包括具有远端的轴，其中所述至少一个电极体设置在所述轴的所述远端附近。
53.根据权利要求51-52中任一项所述的系统，其中所述轴被配置为可插入所述眼睛的玻璃体腔内。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的系统，其中所述至少一个电极体中的至少一个被配置为可插入眼睛内的视网膜下泡内。
55.根据权利要求51-54中任一项所述的系统，其中所述至少一个电极体包括双极电极体对。
56.根据权利要求51-55中任一项所述的系统，还包括返回电极，所述返回电极被配置为定位在距所述至少一个电极体中的至少一个一定距离处，使得所述至少一个电极体以单极方式起作用。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述返回电极被配置为抵靠或靠近所述眼睛的外表面定位。
58.根据权利要求56所述的系统，其中所述返回电极被配置为至少部分地定位在球后空间中。
59.根据权利要求51-58中任一项所述的系统，其中所述仪器包括用于递送流体的管腔。
60.根据权利要求59所述的系统，其中所述仪器包括与所述内腔流体连通的至少一个出口，使得所述流体可递送到所述电极体中的至少一个附近。
61.根据权利要求51-60中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括小分子和/或大分子。
62.根据权利要求51-61中任一项所述的系统，其中所述至少一个分子包括质粒、DNA、合成DNA载体、RNA、基于核酸的分子、反义寡核苷酸、寡聚物分子、核酶、核糖核蛋白、CRISPR、重组蛋白、靶向嵌合体的蛋白水解、锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶、引起细胞行为中遗传或表观遗传变化的蛋白质和/或材料。
63.根据权利要求51-62中任一项所述的系统，其中所述细胞位于所述眼睛的视网膜内。
64.根据权利要求63所述的系统，其中所述细胞位于所述视网膜的视杆视锥层内。
65.根据权利要求63所述的系统，其中所述细胞位于所述视网膜的视网膜色素上皮内。
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