CN116829580A - 用于融合蛋白的药物制剂 - Google Patents

用于融合蛋白的药物制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN116829580A
CN116829580A CN202180093681.9A CN202180093681A CN116829580A CN 116829580 A CN116829580 A CN 116829580A CN 202180093681 A CN202180093681 A CN 202180093681A CN 116829580 A CN116829580 A CN 116829580A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pharmaceutical composition
liquid pharmaceutical
cancer
seq
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180093681.9A
Other languages
English (en)
Inventor
R·D·简乐
K·S·劳
P·杰迪雅帕
S·杰雅卡尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bikala Treatment Co ltd
Original Assignee
Bikala Treatment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bikala Treatment Co ltd filed Critical Bikala Treatment Co ltd
Publication of CN116829580A publication Critical patent/CN116829580A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文提供了液体药物组合物，其包含：包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合人表皮生长因子受体(hEGFR)；和(ii)所述免疫调节部分包含人转化生长因子‑β受体II(hTGFβRII)的胞外结构域的氨基酸序列；以约5mM至约30mM的浓度存在的缓冲剂；和以约4％w/v至约10％w/v的浓度存在的张力剂；其中所述液体药物组合物具有约5.5至约7.0的pH。本文还提供了制备包含融合蛋白的液体药物组合物的方法，以及用于治疗癌症的方法。

Description

用于融合蛋白的药物制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月15日提交的印度临时申请号IN202011054539的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
背景技术
治疗性抗体是大而复杂的分子，因此容易发生降解过程，特别是在液态时。包含直接连接或通过接头连接的不同结构和功能的多个功能结构域的多功能融合蛋白，特别是抗体融合蛋白，甚至更加复杂。抗体和融合蛋白的不稳定性使得开发稳定且适合递送至受试者的制剂成为一项挑战。例如，这些蛋白质制剂可能具有较短的保质期，并且蛋白质可能由于例如储存期间，特别是长期储存期间的化学和物理降解而失去生物活性。化学降解过程包括例如脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除和二硫键交换。物理降解过程包括例如变性、聚集、沉淀和吸附。尽管具有共同的结构相似性，但不同单克隆抗体的制剂开发并不简单，因为它们在液体制剂中具有独特且不可预测的行为。对于多功能融合蛋白(例如，包含抗体和另一种蛋白质组分的融合蛋白)来说，这种不可预测性甚至更大，这是由于例如一级序列、结构、连接、多功能性和降解途径(例如，变性、聚集、表面吸附、脱酰胺、氧化、异构化、碎片化等)的相对严重性的显著差异。因此，仍然需要多功能融合蛋白(例如，本文所述的那些)的新的稳定制剂，其表现出例如稳定性、低至不可检测的物理或化学降解水平和即使在长期储存后，多功能生物活性也几乎没有损失。
发明内容
本发明通过提供下文进一步描述的多功能融合蛋白的稳定液体药物制剂(例如BCA101)来解决上述需求。具体地，本发明提供了本文公开的双功能融合蛋白的稳定液体药物制剂。本发明的制剂可用于施用(例如，通过静脉内施用)至哺乳动物，特别是患有癌症的人。
因此，在一个方面，本公开内容提供了一种液体药物组合物，其包含：(a)包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分包含特异性结合膜结合靶蛋白并具有碱性等电点(pI)的多肽；和(ii)所述免疫调节部分包含具有酸性pI的特异性结合可溶性靶蛋白的多肽；其中膜结合靶蛋白和可溶性靶蛋白是不同的；(b)以约5mM至约30mM的浓度存在的缓冲剂；和(c)以约4％w/v至约10％w/v的浓度存在的张力剂(tonifying agent)；其中所述液体药物组合物具有约5.5至约7.0的pH。
因此，在一个方面，本公开内容提供了一种液体药物组合物，其包含：(a)包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合人表皮生长因子受体(hEGFR)；和(ii)所述免疫调节部分包含人转化生长因子-β受体II(hTGFβRII)的胞外结构域的氨基酸序列；(b)以约5mM至约30mM的浓度存在的缓冲剂；和(c)以约4％w/v至约10％w/v的浓度存在的张力剂；其中所述液体药物组合物具有约5.5至约7.0的pH。
在一些实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂以约5mM至约25mM、5mM至约20mM、5mM至约15mM、5mM至约10mM或10mM至约30mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述缓冲剂以约5mM至约15mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述缓冲剂以约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM的浓度存在。在一些实施方案中，其中所述缓冲剂以约10mM的浓度存在。在一些实施方案中，其中所述缓冲剂包含约10mM柠檬酸盐磷酸盐。
在一些实施方案中，所述张力剂是糖。在一些实施方案中，所述张力剂是二糖。在一些实施方案中，所述张力剂是蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，所述张力剂是蔗糖。在一些实施方案中，所述张力剂以约5％w/v至约10％w/v、6％w/v至约10％w/v、7％w/v至约10％w/v、8％w/v至约10％w/v、5％w/v至约9％w/v、5％w/v至约8％w/v、6％w/v至约9％w/v、6％w/v至约8％w/v、7％w/v至约9％w/v或7％w/v至约8％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述张力剂以约5％w/v至约8％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述张力剂以约5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述张力剂以约8％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述张力剂是蔗糖并且以约8％w/v的浓度存在。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.005-0.1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.01-0.1％w/v、0.02-0.1％w/v、0.01-0.9％w/v、0.01-0.8％w/v、0.01-0.7％w/v、0.01-0.6％w/v、0.01-0.5％w/v、0.01-0.4％w/v、0.01-0.3％w/v、0.01-0.2％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.9％w/v、0.02-0.8％w/v、0.02-0.7％w/v、0.02-0.6％w/v、0.02-0.5％w/v、0.02-0.4％w/v、0.02-0.3％w/v、0.02-0.2％w/v、0.02-0.1％w/v、0.005-0.9％w/v、0.005-0.8％w/v、0.005-0.7％w/v、0.005-0.6％w/v、0.005-0.5％w/v、0.005-0.4％w/v、0.005-0.3％w/v、0.005-0.2％w/v或0.005-0.1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v或0.1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.02％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20并且以约0.02％w/v的浓度存在。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约5.5至约7.0、6.0至约7.0、5.5至约6.5、5.5至约6.0或6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约5.5、6.0、6.5或7.0的pH。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约6.0的pH。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约150mOsmol/kg至约400mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约150mOsmol/kg至约350mOsmol/kg、150mOsmol/kg至约300mOsmol/kg、200mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、250mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至约350mOsmol/kg、250mOsmol/kg至约350mOsmol/kg或250mOsmol/kg至约300mOsmol的重量渗透浓度。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约250mOsmol/kg至约350mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约250mOsmol/kg、300mOsmol/kg或300mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，所述液体药物组合物具有约300mOsmol/kg的重量渗透浓度。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物在-20℃储存时稳定至少12、18或24个月。在一些实施方案中，所述液体药物组合物在2-8℃储存时稳定至少12、18或24个月。
在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少12、18或24个月内基本相同。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少12、18或24个月内基本上相同。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少12、18或24个月内基本上相同。
在一些实施方案中，在-80℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在一些实施方案中，在-20℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在一些实施方案中，在2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物在1、2、3、4或5个冷冻和解冻循环后是稳定的。
在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述融合蛋白在至少12、18或24个月内保留双功能活性，如通过双功能酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述融合蛋白在至少12、18或24个月内保留双功能活性，如通过双功能酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述融合蛋白在至少12、18或24个月内保留双功能活性，如通过双功能酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。
在一些实施方案中，在-20℃或2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物与参考制剂相比具有选自以下的至少一个特征：(a)增加的保质期，(b)增加的温度稳定性，(c)减少的聚集体形成，(d)增加的化学稳定性，(e)减少的碎片化，和/或(f)减少的粘度。
在一些实施方案中，在-20℃或2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物与参考制剂相比具有选自以下的至少一个特征：(a)如通过尺寸排阻色谱(SEC)测量的，降低的聚集体百分比，(b)如通过SEC测量的，更高的单体百分比，和/或(c)更低的以浊度测定法单位(NTU)表示的浊度值。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以约5-50mg/ml、5-40mg/ml、5-30mg/ml、5-25mg/ml、10-50mg/ml、20-50mg/ml、25-50mg/ml、20-50mg/ml、20-40mg/ml、20-30mg/ml、25-50mg/ml、25-40mg/ml或25-30mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约20-30mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的浓度存在，在一些实施方案中，所述融合蛋白以约25mg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述靶向部分包含特异性结合hEGFR的抗体或其功能片段或功能变体。在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体是全长抗体、单链可变片段(scFv)、scFv2、scFv-Fc、Fab、Fab'、F(ab')2或F(v)。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VH，所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中(a)VH CDR1包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(b)VH CDR2包含与SEQID NO：2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(c)VH CDR3包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VL，所述VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中(a)VL CDR1包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(b)VL CDR2包含与SEQID NO：5的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(c)VL CDR3包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由重链组成，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含重链，所述重链由与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由重链组成，所述重链由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由轻链组成，所述轻链由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包括西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)，或前述任一项的功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述免疫调节部分包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫调节部分由与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述免疫调节部分间接融合至所述靶向部分。在一些实施方案中，所述免疫调节部分通过肽接头间接融合至所述靶向部分。
在一些实施方案中，所述免疫调节部分通过足够长度的肽接头间接融合至所述靶向部分，使得所述免疫调节部分和所述靶向部分可以同时结合各自的靶标。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO：24、25、26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的C末端。在一些实施方案中，所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的N末端。
在一些实施方案中，所述靶向部分是包含轻链和重链的抗体，并且其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的所述重链的C末端。
在一些实施方案中，所述靶向部分是包含轻链和重链的抗体，并且其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的所述轻链的C末端。
在一些实施方案中，所述靶向部分是特异性结合hEGFR的抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分的N末端通过接头间接融合至所述重链或所述轻链的C末端，并且其中所述接头包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述靶向部分是特异性结合hEGFR的抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分的N末端通过接头间接融合至所述轻链的C末端，并且其中所述接头包含与SEQID NO：24的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物是无菌的。
在一个方面，本文提供了液体药物组合物，其包含：(a)包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列；(b)约5mM至约20mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；(c)约6％w/v至约10％w/v蔗糖；其中所述液体药物组合物具有约5.5至约6.5的pH。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以约25mg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述液体药物组合物还包含约0.01-0.05％w/v聚山梨醇酯20。
在一个方面，本文提供了液体药物组合物，其包含：(a)包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列；(b)约10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；(c)约8％w/v蔗糖；其中所述液体药物组合物具有约6.0的pH。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含约0.02％w/v的聚山梨醇酯20。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以约25mg/ml的浓度存在。
在一个方面，本文提供了一种液体药物组合物，其包含：(a)约25mg/mL的融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向部分和免疫调节部分，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(b)约10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；(c)约8％w/v蔗糖；(d)约0.02％w/v聚山梨醇酯20；其中所述液体药物组合物具有约6.0的pH。
在一个方面，本文提供了治疗患有癌症的受试者中的人类癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的液体药物组合物。
在一些实施方案中，以有效治疗所述癌症的量施用所述液体药物组合物。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至2000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约20mg至1000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约30mg至1000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约40mg至1000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约50mg至1000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至100mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至900mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至800mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至700mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至800mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至700mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至600mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至500mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至400mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至300mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至100mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约10mg至50mg的剂量施用至所述人类受试者。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以约50mg、60mg、64mg、100mg、150mg、200mg、240mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900或2000mg的剂量施用至所述人类受试者。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约64mg、240mg、800mg或1600mg的剂量施用至所述人类受试者。
在一些实施方案中，每1、2、3或4周向所述人类受试者施用所述融合蛋白。在一些实施方案中，每周向所述人类受试者施用所述融合蛋白。
在一些实施方案中，将所述融合蛋白施用至所述人类受试者3周。
在一些实施方案中，施用步骤包括静脉内注射液体药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是转移性的。在一些实施方案中，所述癌症是复发性的。在一些实施方案中，所述癌症是难治性的。在一些实施方案中，所述癌症是转移性的、复发性的和/或难治性的，或其任何组合。
在一些实施方案中，所述癌症包含含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
在一些实施方案中，所述癌症包含含有KRAS基因中的基因组修饰的癌细胞。在一些实施方案中，KRAS基因中的所述修饰是G12D取代。在一些实施方案中，KRAS基因中的所述修饰是G13D修饰。
在一些实施方案中，所述癌症选自眼癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、乳腺癌、肛门癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、脑癌、脊髓癌、头癌和颈癌。
在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞肺癌(SqCLC)。在一些实施方案中，所述SqCLC包含如通过活组织检查测量的不表达可检测水平的程序性死亡配体1的癌细胞。在一些实施方案中，所述SqCLC包含含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述结直肠癌是RAS野生型微卫星稳定结直肠癌(RAS WT MSS CRC)。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，所述癌症是脊髓癌。在一些实施方案中，所述脊髓癌是脊索瘤。在一些实施方案中，所述癌症是眼癌。在一些实施方案中，所述眼癌是眼黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是脑癌。在一些实施方案中，所述脑癌是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述卵巢癌是上皮性卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是肝癌。在一些实施方案中，所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，所述癌症是甲状腺癌。在一些实施方案中，所述甲状腺癌是甲状腺未分化癌(ATC)。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，所述癌症是复发性HNSCC。在一些实施方案中，所述癌症是转移性HNSCC。在一些实施方案中，所述癌症是复发性和转移性HNSCC。在一些实施方案中，所述癌症是肛管鳞状细胞癌(SCCAC)。在一些实施方案中，所述癌症是复发性SCCAC。在一些实施方案中，所述癌症是转移性SCCAC。在一些实施方案中，所述癌症是复发性和转移性SCCAC。
在一个方面，本文提供了制备液体药物组合物的方法，其包括：(a)在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞已在其基因组中稳定掺入编码包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白的一种或多种核酸，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列，使得细胞将所述融合蛋白分泌到细胞培养基中；(b)从细胞培养基中纯化融合蛋白；和(c)制备本文所述的药物组合物。
附图简述
图1是显示本文所述制剂的开发策略的示意图。
图2是显示实施例1中描述的pH筛选研究的概要和在pH5.0、5.5、6.0和6.5下测试BCA101制剂的示意图。
图3是显示在每个测试pH(5.0、5.5、6.0和6.5)下主体切向流过滤组合物(TFF)和最终药物产品(FDP)中高分子量蛋白质(HMWP)的百分比的点图。
图4是显示在每个测试pH(5.0、5.5、6.0和6.5)下主体TFF组合物和FDP中低单体蛋白质的百分比的点图。
图5是显示在每个测试pH(5.0、5.5、6.0和6.5)下主体TFF组合物和FDP中低分子量蛋白质(LMWP)的百分比的点图。
图6是一系列线图，其显示实施例1中描述的对于所评价的每种BCA101测试制剂的差示扫描量热法(DSC)分析的结果。
图7是总结实施例1中描述的对于图6中所示的每种测试制剂的DSC分析的结果的点图。
图8A是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的HMWP百分比的线图。图8B是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的HMWP百分比斜率/周的点图。
图9A是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的单体百分比的线图。图9B是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的单体百分比斜率/周的点图。
图10A是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的LMWP百分比的线图。图10B是显示6.0和6.5pH测试制剂在40℃下的LMWP百分比斜率/周的点图。
图11是显示实施例1中描述的缓冲剂筛选研究的过程和所评估的测试制剂的组成的示意图。
图12A是显示pH为6.0的柠檬酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。图12B是显示pH为6.5的柠檬酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。
图13A是显示pH为6.0的琥珀酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。图13B是显示pH为6.5的琥珀酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。
图14A是显示pH为6.0的组氨酸缓冲制剂的DSC分析结果的线图。图14B是显示pH为6.5的组氨酸缓冲制剂的DSC分析结果的线图。
图15A是显示pH为6.0的柠檬酸盐磷酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。图15B是显示pH为6.5的柠檬酸盐磷酸盐缓冲制剂的DSC分析结果的线图。
图16是显示图12A-15B中呈现的DSC分析数据的总结的点图。
图17是显示检查包含蔗糖或海藻糖的测试制剂的实施例1中描述的张力调节剂筛选研究的过程的示意图。
图18是包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的制剂中BCA101融合蛋白的照片的副本，其中将BCA101液体制剂的颜色与药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液进行比较。
图19是显示毒理学研究批次、内参标准批次(IRS批次)和剂量范围发现批次的包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的制剂中BCA101融合蛋白在506nm处的吸光度的表。
图20是包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的制剂中BCA101融合蛋白的照片的副本，其中将BCA101液体制剂的澄清度和乳光度与药典标准(福尔马肼悬浮液，Ph.Eu.2.2.1)进行比较。
图21是显示包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的制剂中BCA101融合蛋白的浊度(以比浊法浊度单位(NTU)表示)的表。过滤前分析的批次用“BF”表示；和过滤后分析的批次表示为“AF”。该测定按照Ph.Eur.2.2.1进行，其全部内容通过引用并入本文。
图22是一系列点图，其显示了在包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的液体制剂中配制的BCA101药物物质(DS)在-20℃储存在5mL Celsius袋中24个月的过程中的pH、重量渗透浓度、蛋白质浓度和双功能能力。在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月对样品进行分析。
图23是一系列点图，其显示了在包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的液体制剂中配制的BCA101药物产品(DP)在-20℃储存在5mL Celsius袋中24个月的过程中的pH、重量渗透浓度、蛋白质浓度和双功能能力。在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月对样品进行分析。
图24是显示图22中呈现的BCA101 DS和图23中呈现的DP的长期稳定性数据的比较的表。
图25是一系列点图，其显示了在包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的液体制剂中配制的BCA101 DS在-20℃储存在5mL Celsius袋中24个月的过程中的LMWP百分比、单体百分比和HMWP百分比。在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月对样品进行分析。
图26是一系列点图，其显示了在包含25mg/ml BCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的液体制剂中配制的BCA101 DP在-20℃储存在5mL Celsius袋中24个月的过程中的LMWP百分比、单体百分比和HMWP百分比。在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月对样品进行分析。
图27是显示图25中呈现的BCA101 DS和图26中呈现的DP的长期稳定性数据的比较的表。
图28是显示本公开内容的制造本文所述的BCA101制剂(例如包含25mg/mlBCA101、8.0％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(pH6.0)的制剂)的示例性制造过程的图。
图29是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的pH的趋势的线图。
图30是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的重量渗透浓度的趋势的线图。
图31是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的蛋白质浓度的趋势的线图。
图32是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的高分子量蛋白质百分比的趋势的线图。
图33是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的单体蛋白百分比的趋势的线图。
图34是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的低分子量蛋白质百分比的趋势的线图。
图35是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的总峰前蛋白百分比的趋势的线图。
图36是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的总峰后蛋白百分比的趋势的线图。
图37是显示24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的主峰总蛋白百分比的趋势的线图。
图38是显示如通过双功能ELISA测量的24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的相对效力的趋势的线图。
图39是显示如通过增殖抑制(IOP)测定测量的24个月内在-20±5℃储存的BCA100药物物质(DS)稳定性数据的相对效力的趋势的线图。
图40是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的pH的趋势的线图。
图41是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的重量渗透浓度的趋势的线图。
图42是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的蛋白质浓度的趋势的线图。
图43是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的可提取体积的趋势的线图。
图44是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的高分子量蛋白质百分比的趋势的线图。
图45是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的单体蛋白百分比的趋势的线图。
图46是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的低分子量蛋白质百分比的趋势的线图。
图47是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的总峰前蛋白百分比的趋势的线图。
图48是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的总峰后蛋白百分比的趋势的线图。
图49是显示24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的主峰总蛋白百分比的趋势的线图。
图50是显示如通过双功能ELISA测量的24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的相对效力的趋势的线图。
图51是显示如通过增殖抑制(IOP)测定测量的24个月内在5±3℃储存的BCA100药物产品(DP)稳定性数据的相对效力的趋势的线图。
图52是BCA101 DS批次BL.14.0901/R/17/021/F DS(上图)和BCA101 DSGF19000040(下图)的iCE电泳图。左和右pI标记分别对应于4.05和8.4。
图53显示了使用MALDI-TOF显示BCA101 DS批次BL.14.0901/R/17/021/F DS(上图)和BCA101 DS GF19000040(下图)的完整质量的完整质谱。
图54显示了由BCA101 DS批次BL.14.0901/R/17/021/F DS(上图)和BCA101 DS批次GF19000040(下图)的胰蛋白酶消化产生的肽的UV色谱图。
图55显示了BCA101 DS批次GF19000040的重链N末端的MS2串联光谱。
图56显示了BCA101 DS批次GF19000040的重链C末端的MS2串联光谱。
图57显示了BCA101 DS批次GF19000040的轻链N末端的MS2串联光谱。
图58显示了BCA101 DS批次GF19000040的接头的C末端的MS2串联光谱。
图59显示了BCA101 DS批次GF19000040的TGFβRII链的C末端的MS谱。
图60显示了BCA101 DS批次GF19000040沿着BL.14.0901/R/17/021/F DS的远UVCD光谱叠加。
图61显示了BCA101 DS批次GF19000040沿BL.14.0901/R/17/021/F DS的近UV CD光谱叠加。
图62显示了BCA101 DS批次GF19000040的胰蛋白酶非还原肽沿着BL.14.0901/R/17/021/F DS的UV色谱图。
图63显示了BCA101 DS批次GF19000040的N-聚糖沿着BL.14.0901/R/17/021/F DS的NP-HPLC图谱的叠加。此处印出的N-聚糖已通过MS鉴定。“其他物种”的鉴定正在进行中。
图64显示了BCA101 DS批次GF19000040连同NGNA、NANA标准品和相应缓冲剂空白的唾液酸估计的RP-HPLC色谱图的叠加。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入一样。
发明详述
概览
本公开内容尤其提供了用于本文所述的双功能融合蛋白的药物制剂，其使得制剂能够长期储存而没有难以维持的蛋白质不稳定性(例如，降解)或双功能活性的损失。在一些实施方案中，融合蛋白的一个功能方面(例如，靶向部分)具有酸性pI，而第二功能方面(例如，免疫调节结构域)具有碱性pI。在一些实施方案中，hEGFR融合蛋白包含特异性结合hEGFR的靶向部分和包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列的免疫调节部分。本文公开的药物组合物可特别用于治疗hEGFR驱动的癌症。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同含义。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的任何主题。在本申请中，除非另外具体说明，否则单数的使用包括复数。
必须指出的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。此外，术语“包括”以及其他形式(例如“包含”、“含有”和“具有”)的使用不是限制性的。
应当理解，本文中无论在何处用语言“包括”描述各方面，均还提供了用“由...组成”和/或“基本上由...组成”来描述的其他类似方面。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
本文使用的术语“和/或”应被视为两个指定特征或组件中的每一个(与或不与另一个一起)的具体公开。因此，本文中诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。类似地，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,2nded.,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press；和the Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面的限制，其可以通过参考整个说明书而获得。因此，下面紧接着定义的术语通过参考整个说明书来更全面地定义。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
术语“约”或“基本上包含”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组合物的可接受的误差范围内的值或组合物，这将部分取决于如何测量或确定该值或组合物，即测量系统的限制。例如，“约”或“基本上包含”可以意指按照本领域的实践在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”或“基本上包含”可以意指高达20％的范围。此外，特别是对于生物系统或过程，这些术语可以意指高达一个数量级或值的高达5倍。当在申请和权利要求中提供特定值或组合物时，除非另有说明，否则“约”或“基本上包含”的含义应当被假定在该特定值或组合物的可接受的误差范围内。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括但不限于脊椎动物例如非人类灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物例如小鼠、大鼠和豚鼠。在一些实施方案中，受试者是人类。
如本文所用，术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将治疗剂(或在受试者体内代谢或改变以在体内产生治疗剂的治疗剂前体)物理引入受试者。示例性途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的术语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。治疗剂可以通过非肠胃外途径或口服施用。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。施用还可以进行例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行。
术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用，是指以体内异常细胞不受控制的生长为特征的一大类各种疾病。不受调节的细胞分裂和生长分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织，并且还可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。
治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的治疗剂的任何量，所述疾病消退通过疾病症状严重程度的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加或防止由于疾病折磨而导致的损伤或残疾来证明。治疗剂促进疾病消退的能力可以使用技术人员已知的多种方法进行评估，例如在临床试验期间在人类受试者中、在预测在人类中的功效的动物模型系统中或通过在体外测定中测定药剂的活性。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖完全组装的抗体；其可以结合抗原的功能性抗体片段及功能性变体(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如，VHH)、双抗体、抗体嵌合体、杂合抗体、双特异性抗体等)；和结合抗原的非抗体片段(例如重组纤连蛋白结构域)和包含前述的重组多肽。除非另有说明，提及抗体中特定氨基酸残基位置的编号是根据EU编号系统，如Kabat等人,U.S.Dept.of Health andHuman Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)(“Kabat”)中所述，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“可变区”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区和三个互补决定区。
如本文所用，术语“互补决定区”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上高度可变并形成结构上限定的环(“高变环”)。一般来说，天然四链抗体包含六个CDR；VH中的3个(H1、H2、H3)，和VL中的3个(L1、L2、L3)。Kabat等人,U.S.Dept.of Health and HumanServices,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)(“Kabat”)和Chothia等人,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述了CDR，其中定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体的CDR旨在落入本文所定义和使用的术语的范围内。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。除非另有说明，CDR是根据Kabat系统定义的。
本文所用的术语“融合蛋白”和语法等同物是指包含源自至少两种单独蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。所述至少两种单独的蛋白质的氨基酸序列可以通过肽键直接连接；或者可以通过氨基酸接头可操作地连接。因此，术语融合蛋白涵盖其中例如蛋白A的氨基酸序列通过肽键直接连接至蛋白B的氨基酸序列的实施方案(蛋白A-蛋白B)，以及其中例如蛋白A的氨基酸序列通过氨基酸接头可操作地连接至蛋白B的氨基酸序列的实施方案(蛋白A-接头-蛋白B)。
本文使用的术语“融合”及其语法等同物是指衍生自一种蛋白质的氨基酸序列与衍生自不同蛋白质的氨基酸序列的可操作连接。术语融合涵盖两个氨基酸序列通过肽键的直接连接和通过氨基酸接头的间接连接。
如本文所用，关于核酸序列的术语“修饰”是指与参考核酸序列相比包含至少一个核苷酸取代、添加或缺失的核酸序列。如本文所用，关于氨基酸序列的术语“修饰”是指与参考核酸序列相比包含至少一个氨基酸残基的取代、添加或缺失的氨基酸序列。出于确定两个氨基酸序列的百分比同一性的目的，天然存在的氨基酸衍生物不被认为是修饰的氨基酸。例如，出于确定两个氨基酸序列的同一性百分比的目的，谷氨酸氨基酸残基至焦谷氨酸氨基酸残基的天然存在的修饰不被认为是氨基酸修饰。此外，例如，谷氨酸氨基酸残基至焦谷氨酸氨基酸残基的天然存在的修饰将不被认为是本文定义的氨基酸“修饰”。修饰可包括包含非天然存在的氨基酸残基。
关于核酸序列或氨基酸序列的术语“相同”或“百分比同一性”是指分别具有特定百分比的当比较和比对以获得最大对应性时相同的核苷酸或氨基酸的至少两个核酸或至少两个氨基酸序列或子序列，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量的。对于序列比较，通常将一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于上文描述的那些的技术来确定，无论是否允许存在间隙。在计算同一性百分比时，通常只计算精确匹配。如上所述，百分比同一性基于两种蛋白质中较小的蛋白质之间的氨基酸匹配。
“稳定的”药物组合物是其中的蛋白质在含有本文所述的融合蛋白的药物物质和/或药物产品的加工(例如，超滤、渗滤、其他过滤步骤、小瓶填充)、运输和/或储存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的药物组合物。制剂中蛋白质的物理、化学和生物稳定性共同体现了蛋白质制剂(例如融合蛋白制剂)的“稳定性”，其特定于配制的药物产品(DP)的储存条件。
如果在目视检查颜色和/或澄清度时，或者通过紫外光散射或通过尺寸排阻高效液相色谱或其他合适的方法测量时，蛋白质显示出二级和/或三级结构(即，内在结构)或聚集和/或沉淀和/或变性的最小变化迹象，则该蛋白质在药物组合物中保持其“物理稳定性”。蛋白质的物理不稳定性，即物理稳定性的丧失，可能是由导致二聚体和更高阶聚集体、亚可见和可见颗粒形成以及沉淀的寡聚引起的。可以根据感兴趣的降解剂的类型使用不同的技术来确定物理降解的程度。二聚体和更高阶的可溶性聚集体可以使用尺寸排阻色谱法来定量，而亚可见颗粒可以使用光散射、光遮蔽或其他合适的技术来定量。
如果给定时间处的化学稳定性使得共价键不形成或断裂(这导致蛋白质组分(例如本文所述的融合蛋白)的一级结构发生变化)，则蛋白质在药物组合物中保持其“化学稳定性”。一级结构的改变可能导致蛋白质的二级和/或三级和/或四级结构的修饰，并且可能导致聚集体的形成或已形成的聚集体的逆转。典型的化学修饰可包括异构化、脱酰胺、N末端环化、主链水解、甲硫氨酸氧化、色氨酸氧化、组氨酸氧化、β-消除、二硫键形成、二硫键乱序、二硫键裂解以及导致一级结构改变的其他变化(包括D-氨基酸形成)。化学不稳定性，即化学稳定性的丧失，可以通过多种技术来检测，包括离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽消化物分析和多种类型的质谱技术。化学稳定性可以通过检测和定量蛋白质的化学改变的形式来评估。化学改变可能涉及尺寸修饰(例如剪切)，其可以使用例如尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)，其可以通过基于电荷的方法评估，例如但不限于离子交换色谱、毛细管等电聚焦或肽图谱。
物理和/或化学稳定性的丧失可能导致生物活性的变化，即感兴趣的生物活性的增加或减少，这取决于修饰和被修饰的蛋白质。如果蛋白质在给定时间处的生物活性在制备药物制剂时表现出的生物活性的至少30％以内，则蛋白质在药物组合物中保留其“生物活性”。如果活性低于其起始值的70％，则认为活性降低。生物测定可包括基于体内和体外的测定，例如配体结合、效力、细胞增殖或其生物制药活性的其他替代测量。作为示例，本文描述的BCA101的生物活性可以使用测量与hEGFR和hTGFβ两者的结合能力的ELISA来估计。简而言之，为了进行双功能ELISA，将重组hEGFR Fc包被的板封闭并随后与BCA101孵育约1小时，随后与重组hTGFβ1孵育。然后用生物素化的抗hTGFβ1抗体和随后链霉亲和素-HRP检测与BCA101的hTGFβRII ECD部分结合的hTGFβ1。因此，只有当两个臂均完整时才会获得信号。
药物组合物
在某些方面，本文描述的是药物组合物(例如，液体药物组合物)，其包含融合蛋白(例如，本文描述的融合蛋白)、缓冲剂和张力剂，具有预选的pH。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种另外的试剂，包括例如表面活性剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体或粉末形式。在一些实施方案中，药物组合物是液体形式。在一些实施方案中，药物组合物特别适合于静脉内施用至受试者(例如，人类受试者)。
缓冲剂
在一些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐磷酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是琥珀酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约5mM至约40mM、5mM至约35mM、5mM至约30mM、5mM至约25mM、5mM至约20mM、5mM至约15mM、5mM至约10mM或10mM至约30mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约5mM至约15mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约10mM。
在某些实施方案中，缓冲剂是以约5mM至约30mM、5mM至约25mM、5mM至约20mM、5mM至约15mM、5mM至约10mM或10mM至约30mM的浓度存在的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是以约5mM至约15mM的浓度存在的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是以约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM的浓度存在的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是以约10mM的浓度存在的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物具有约6.0至6.5的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约6.0的pH。
pH
在一些实施方案中，药物组合物具有约5.0至约8.0的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约5.5至约7.0、6.0至约7.0、5.5至约6.5、5.5至约6.0或6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约5.5、6.0、6.5或7.0的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约6.0的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约6.5的pH。
张力剂
在一些实施方案中，药物组合物包含张力剂，使得制剂具有约200-400mOsmol/kg的最终重量渗透浓度。在一些实施方案中，药物组合物包含张力剂，使得制剂具有约250-350mOsmol/kg的最终重量渗透浓度。在一些实施方案中，药物组合物包含张力剂，使得制剂具有约300mOsmol/kg的最终重量渗透浓度。
在一些实施方案中，张力剂包括蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇或甘油。在一些实施方案中，张力剂是蔗糖。在一些实施方案中，张力剂是海藻糖。在一些实施方案中，张力剂以约5％w/v至约10％w/v、6％w/v至约10％w/v、7％w/v至约10％w/v、8％w/v至约10％w/v、5％w/v至约9％w/v、5％w/v至约8％w/v、6％w/v至约9％w/v、6％w/v至约8％w/v、7％w/v至约9％w/v或7％w/v至约8％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，张力剂以约5％w/v至约8％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，张力剂以约5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，张力剂以约8％w/v的浓度存在。
在一些实施方案中，张力剂是蔗糖，其浓度使得制剂具有约300mOsmol/kg的最终重量渗透浓度。在一些实施方案中，张力剂包含浓度为约5％w/v至约10％w/v、6％w/v至约10％w/v、7％w/v至约10％w/v、8％w/v至约10％w/v、5％w/v至约9％w/v、5％w/v至约8％w/v、6％w/v至约9％w/v、6％w/v至约8％w/v、7％w/v至约9％w/v或7％w/v至约8％w/v的蔗糖。在一些实施方案中，张力剂包含浓度为约5％w/v至约8％w/v的蔗糖。在一些实施方案中，张力剂以约5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，张力剂是浓度为约8％w/v的蔗糖。
表面活性剂
在一些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯、聚乙二醇十二烷基醚、泊洛沙姆、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、烷基糖和烷基糖苷、35(即，聚乙二醇十二烷基醚)、泊洛沙姆(即，聚乙二醇-聚丙二醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚(环氧乙烷-共聚-环氧丙烷))，例如泊洛沙姆188(即，Pluronic F68)或TritonTM X-100(即，4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇))。示例性聚山梨醇酯包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯20。
在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.005-0.1％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.1％w/v、0.01-0.9％w/v、0.01-0.8％w/v、0.01-0.7％w/v、0.01-0.6％w/v、0.01-0.5％w/v、0.01-0.4％w/v、0.01-0.3％w/v、0.01-0.2％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.9％w/v、0.02-0.8％w/v、0.02-0.7％w/v、0.02-0.6％w/v、0.02-0.5％w/v、0.02-0.4％w/v、0.02-0.3％w/v、0.02-0.2％w/v、0.02-0.1％w/v、0.005-0.9％w/v、0.005-0.8％w/v、0.005-0.7％w/v、0.005-0.6％w/v、0.005-0.5％w/v、0.005-0.4％w/v、0.005-0.3％w/v、0.005-0.2％w/v或0.005-0.1％w/v。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v或0.1％w/v。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.02％w/v。
在一些实施方案中，表面活性剂是浓度为约0.005-0.1％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.1％w/v、0.01-0.9％w/v、0.01-0.8％w/v、0.01-0.7％w/v、0.01-0.6％w/v、0.01-0.5％w/v、0.01-0.4％w/v、0.01-0.3％w/v、0.01-0.2％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.9％w/v、0.02-0.8％w/v、0.02-0.7％w/v、0.02-0.6％w/v、0.02-0.5％w/v、0.02-0.4％w/v、0.02-0.3％w/v、0.02-0.2％w/v、0.02-0.1％w/v、0.005-0.9％w/v、0.005-0.8％w/v、0.005-0.7％w/v、0.005-0.6％w/v、0.005-0.5％w/v、0.005-0.4％w/v、0.005-0.3％w/v、0.005-0.2％w/v或0.005-0.1％w/v的聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，表面活性剂是浓度为约0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v或0.1％w/v的聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，表面活性剂是浓度为约0.02％w/v的聚山梨醇酯20。
重量渗透浓度
在一些实施方案中，药物组合物具有约100mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、约150mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、150mOsmol/kg至约350mOsmol/kg、150mOsmol/kg至约300mOsmol/kg、200mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、250mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至约400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至约350mOsmol/kg、250mOsmol/kg至约350mOsmol/kg或250mOsmol/kg至约300mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，药物组合物具有约250mOsmol/kg至约350mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，药物组合物具有约250mOsmol/kg、300mOsmol/kg或350mOsmol/kg的重量渗透浓度。在一些实施方案中，药物组合物具有约300mOsmol/kg的重量渗透浓度。
示例性功能特性
稳定性和储存
药物组合物可以储存在本领域技术人员已知的任何合适的容器中，例如袋子(例如袋子、/>袋子)或玻璃小瓶(例如USP 10R玻璃小瓶)。用于在不同温度(例如，-80℃、-20℃、2-8℃)下适当储存的容器是本领域技术人员已知的并且可以相应地选择。在一些实施方案中，当在-20℃测量稳定性时，将药物组合物储存在/>袋或/>袋中。在一些实施方案中，当在2-8℃测量稳定性时，将药物组合物储存在玻璃小瓶中。
在一些实施方案中，与参考药物组合物相比，当冷藏或冷冻时，药物组合物在至少3、6、12、18、24或36个月内表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，与参考药物组合物相比，当冷藏或冷冻时，药物组合物在至少3、6、12、18、24或36个月内表现出增加的化学稳定性。在一些实施方案中，与参考药物组合物相比，当冷藏或冷冻时，药物组合物在至少3、6、12、18、24或36个月内表现出增加的物理稳定性。
在一些实施方案中，所述药物组合物在冷藏或冷冻时稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述药物组合物稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当冷藏或冷冻时，所述药物组合物稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述药物组合物稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述药物组合物稳定至少3、6、12、18、24或36个月。
在一些实施方案中，当冷藏或冷冻时，药物组合物化学稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述药物组合物化学稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当冷藏或冷冻时，所述药物组合物化学稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述药物组合物化学稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述药物组合物化学稳定至少3、6、12、18、24或36个月。
在一些实施方案中，当冷藏或冷冻时，所述药物组合物物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述药物组合物物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述药物组合物物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述药物组合物物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。
在一些实施方案中，当冷藏或冷冻时，所述药物组合物化学和物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述药物组合物化学和物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述药物组合物化学和物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述药物组合物化学和物理稳定至少3、6、12、18、24或36个月。
在一些实施方案中，药物组合物在至少1、2、3、4或5个冻融循环中保持稳定，其中冻融循环包括在-80℃或-20℃下的48小时冷冻循环；并且解冻循环包括在培养箱中25℃解冻4小时。在一些实施方案中，所述药物组合物在至少1、2、3、4或5个冻融循环中是化学稳定的，其中冻融循环包括在-80℃或-20℃下的48小时冷冻循环；并且解冻循环包括在培养箱中25℃解冻4小时。在一些实施方案中，所述药物组合物在至少1、2、3、4或5个冻融循环中是物理稳定的，其中冻融循环包括在-80℃或-20℃下的48小时冷冻循环；并且解冻循环包括在培养箱中25℃解冻4小时。在一些实施方案中，药物组合物在至少1、2、3、4或5个冻融循环中是化学和物理稳定的，其中冻融循环包括在-80℃或-20℃下的48小时冷冻循环；并且解冻循环包括在培养箱中25℃解冻4小时。
在一些实施方案中，当在-80℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少3、6、12、18、24或36个月内基本相同。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少3、6、12、18、24或36个月内基本相同。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少3、6、12、18、24或36个月内基本相同。
在一些实施方案中，在-80℃储存3、6、12、18、24或36个月后，所述液体药物组合物中所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在一些实施方案中，在-20℃储存3、6、12、18、24或36个月后，所述液体药物组合物中所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在一些实施方案中，在2-8℃储存3、6、12、18、24或36个月后，所述液体药物组合物中所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
在一些实施方案中，当在-80℃储存时，药物组合物具有至少12个月、24个月、36个月或48个月的保质期。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，药物组合物具有至少12个月、24个月、36个月或48个月的保质期。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，药物组合物具有至少12个月、24个月、36个月或48个月的保质期。
在一些实施方案中，药物组合物包含少于约20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含少于约5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含少于约5％的聚集体形式的所述融合蛋白。在一些实施方案中，在-20℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含少于约30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。在一些实施方案中，在2-8℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含少于约30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。
在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或20％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％或5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-80℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或20％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-80℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-80℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-80℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或20％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-20℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或30％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-20℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或30％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或30％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-20℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％或5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含不超过5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在-20℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或30％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在2-8℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或20％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在2-8℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在2-8℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过1％、2％、3％、4％、5％的聚集体形式的融合蛋白。在一些实施方案中，在2-8℃储存至少12个月、24个月或36个月后，药物组合物包含不超过5％的聚集体形式的融合蛋白。可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量聚集，包括如本公开内容的实施例1中所描述的。可以例如通过尺寸排阻色谱法(SEC)来评价聚集。
稳定性可以通过本领域技术人员已知的任何测定来测量，包括本公开内容的实施例1中描述的那些。例如在Wang,W.(1999),Instability,stabilization and formulationof liquid protein pharmaceuticals,Int J Pharm 185:129-188中综述了用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术。可以在选定的温度下在选定的时间段(例如，1周、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月或36个月)测量稳定性。
融合蛋白的双功能性
本文所述的融合蛋白具有2种不同的功能：1)特异性结合hEGFR和2)特异性结合hTGFβ。在一些实施方案中，融合蛋白在冷藏或冷冻时在至少3、6、12、18、24或36个月内保留双功能活性。在一些实施方案中，当在-20℃储存时，融合蛋白在至少3、6、12、18、24或36个月内保留双功能活性。在一些实施方案中，当在2-8℃储存时，融合蛋白在至少3、6、12、18、24或36个月内保留双功能活性。
在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白保留其hEGFR结合活性的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，如通过ELISA测量的)。在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白保留其hTGFβ结合活性的95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，如通过ELISA测量的)。在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白保留其hEGFR结合活性的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，如通过ELISA测量的)；且保留其hTGFβ结合活性的至少96％、97％、98％、99％或100％(例如，如通过ELISA测量的)。
在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白损失其hEGFR结合活性的小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％(例如，如通过ELISA测量的)。在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白损失其hTGFβ结合活性的小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％(例如，如通过ELISA测量的)。在一些实施方案中，本文描述的融合蛋白损失其hEGFR结合活性的小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％(例如，如通过ELISA测量的)；且损失其hTGFβ结合活性的小于5％、4％、3％、2％、1％或0.5％(例如，通过ELISA测量)。
本文描述的融合蛋白的双功能性可以通过本领域已知的方法来评估，包括本公开内容的实施例1中描述的那些方法。例如，本文所述融合蛋白的双功能性可以通过两个单独的ELISA或测定本文所述融合蛋白的两种功能(即特异性结合hEGFR和2)特异性结合hTGFβ)的组合ELISA来评估。
融合蛋白
在某些方面，本文提供了包含多功能融合蛋白的药物组合物，所述多功能融合蛋白包含靶向部分和免疫调节部分，其中：i)所述靶向部分包含特异性结合膜结合靶蛋白并具有碱性等电点(pI)的多肽；和(ii)所述免疫调节部分包含具有酸性pI的特异性结合可溶性靶蛋白的多肽；其中膜结合靶蛋白和可溶性靶蛋白是不同的。
在某些方面，本文提供了包含多功能(例如，双功能)融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含靶向部分和免疫调节部分，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列。
hEGFR靶向部分
在一些实施方案中，hEGFR靶向部分包括抗体或其功能片段或功能变体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体、单链可变片段(scFv)、scFv2、scFv-Fc、Fab、Fab'、F(ab')2、F(v)、单结构域抗体、单链抗体或VHH。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体选自西妥昔单抗和帕尼单抗。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体是西妥昔单抗和帕尼单抗的功能片段。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体是西妥昔单抗和帕尼单抗的功能变体。
西妥昔单抗
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体是西妥昔单抗。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体与西妥昔单抗交叉竞争。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体与西妥昔单抗结合相同的表位。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体具有与西妥昔单抗相同的CDR。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含可变重链(VH)，其包含三个互补决定区：VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；VH CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和/或VH CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列，或内有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或内有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和/或VH CDR3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或内有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ IDNO：3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含可变轻链(VL)，其包含三个互补决定区：VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；VL CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和/或VL CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含可变轻链(VL)，其包含三个互补决定区：VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和/或VL CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含：VH CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；VH CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：3的氨基酸序列；所述VL包含：VL CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；VL CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含：VH CDR1，其包含SEQID NO：1的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：3的氨基酸序列；所述VL包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQID NO：6的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VH CDR2，其包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含与SEQID NO：4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VLCDR2，其包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含与SEQID NO：1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQ ID NO：2的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且所述抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：5的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ IDNO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH；和与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链；和含有与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链；和含有与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
帕尼单抗
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体是帕尼单抗。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体与帕尼单抗交叉竞争。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体与帕尼单抗结合相同的表位。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体具有与帕尼单抗相同的CDR。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含可变重链(VH)，其包含三个互补决定区：VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：12的氨基酸序列；VH CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和/或VH CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含SEQID NO：12的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：12的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和/或VH CDR3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含可变轻链(VL)，其包含三个互补决定区：VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：15的氨基酸序列；VL CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和/或VL CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含SEQID NO：15的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：15的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和/或VL CDR3，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含：VH CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：12的氨基酸序列；VH CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：14的氨基酸序列；所述VL包含：VL CDR1，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：15的氨基酸序列；VL CDR2，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含具有0、1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：12的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：14的氨基酸序列；所述VL包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：15的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含与SEQID NO：12的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VHCDR2，其包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含与SEQID NO：15的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VLCDR2，其包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含与SEQ IDNO：12的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：13的至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且所述抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VL CDR2，其包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含与SEQ IDNO：18至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH；和与SEQ ID NO：19的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链；和含有与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链；和含有与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含表1中的抗体。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体是表1中的抗体。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含：VH CDR1，其包含与表1中的VH CDR1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VHCDR2，其包含与表1中的VH CDR2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含与表1中的VH CDR3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含：VL CDR1，其包含与表1中的VL CDR1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VLCDR2，其包含与表1中的VL CDR2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与表1中的VL CDR3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含：VH CDR1，其包含与表1中的VH CDR1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VH CDR2，其包含与表1中的VH CDR2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含与表1中的VH CDR3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述VL包含：VL CDR1，其包含与表1中的VL CDR1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；VLCDR2，其包含与表1中的VL CDR2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含与表1中的VL CDR3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与表1中的重链的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与表1中的轻链的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含含有与表1中的重链的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的重链；和含有与表1中的轻链的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH，所述VH包含与表1中抗体的VH的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VL，所述VL包含与表1中抗体的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hEGFR抗体包含VH和VL，所述VH包含与表1中抗体的VH的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述VL包含与表1中抗体的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
表1.示例性抗hEGFR抗体
/>
/>
/>
/>
hTGFβTRAP
在某些方面，融合蛋白包含靶向部分和免疫调节部分，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域(ECD)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hTGFβRII ECD结合至少一种hTGFβ同种型。在一些实施方案中，hTGFβRII ECD结合hTGFβ1。在一些实施方案中，hTGFβRII ECD结合hTGFβ3。在一些实施方案中，hTGFβRII ECD不结合hTGFβ2。
在一些实施方案中，hTGFβRII ECD包含天然存在的hTGFβRII ECD的足够序列以使蛋白质能够结合hTGFβ。在一些实施方案中，hTGFβRII ECD包含天然存在的TGFβRII ECD的足够序列以使蛋白质能够结合hTGFβ1。在一些实施方案中，hTGFβRII ECD包含天然存在的hTGFβRII ECD的足够序列以使蛋白质能够结合hTGFβ3。
在一些实施方案中，hTGFβRII的胞外结构域包含能够结合hTGFβ的SEQ ID NO：23的截短部分。hTGFβRII的胞外结构域可以在N末端、C末端或N末端和C末端两者上被截短。截短可以包括1-10个氨基酸的缺失。截短可包括删除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。截短可包括从N末端、C末端或N末端和C末端两者删除1、2、3、4、5个氨基酸。
在一些实施方案中，hTGFβRII的胞外结构域包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，hTGFβRII的胞外结构域基本上由与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，hTGFβRII的胞外结构域由与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
表2.示例性hTGFβRII ECD
取向
在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至靶向部分的C末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至靶向部分的N末端。
在一些实施方案中，靶向部分是抗体(或其功能片段或变体)，其包含1)VH或重链，和2)VL或轻链。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至VH或重链的C末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至VL或轻链的C末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至重链恒定区的C末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至轻链恒定区的C末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至VH或重链的N末端。在一些实施方案中，免疫调节部分可操作地连接至VL或轻链的N末端。
接头
在一些实施方案中，融合蛋白的靶向部分和免疫调节部分直接可操作地连接。在一些实施方案中，融合蛋白的靶向部分和免疫调节部分间接可操作地连接。在一些实施方案中，融合蛋白的靶向部分和免疫调节部分通过接头间接可操作地连接。在一些实施方案中，接头是肽接头。
可以使用本领域已知的任何合适的肽接头，其使得免疫调节部分和靶向部分能够结合它们各自的抗原。表3中提供了包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸的示例性肽接头。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：24-28中任一项的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQID NO：24-28中任一项的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：24-28中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：24的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头基本上由与SEQ ID NO：24的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由与SEQ ID NO：24的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO：24的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：25的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头基本上由与SEQ ID NO：25的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由与SEQ ID NO：25的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO：25的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头基本上由与SEQ ID NO：26的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由与SEQ ID NO：26的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO：26的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头基本上由与SEQ ID NO：27的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由与SEQ ID NO：27的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO：27的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头基本上由与SEQ ID NO：28的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由与SEQ ID NO：28的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO：28的氨基酸序列或具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成。
表3.示例性接头
接头 氨基酸序列 SEQ ID NO
(GGGS)3 GGGGSGGGGSGGGGS 24
(GGGS)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGS 25
(GGGS)5 GGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGS 26
(GGGS)2 GGGGSGGGGS 27
(GGGS)1 GGGGS 28
示例性融合蛋白
表4中提供了本公开内容的示例性融合蛋白。
在一个实施方案中，融合蛋白包含BCA101。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，其包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，其包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQID NO：29的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，其中重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，其中轻链的氨基酸序列包含SEQID NO：29的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，其中重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；其中轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，所述重链包含具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：10的氨基酸序列；所述轻链包含具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：29的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列组成的重链；和包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的重链；以及由具有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：11的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：33的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：33的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
在一些实施方案中，融合蛋白包含重链，该重链包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含重链和轻链，该重链包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；该轻链包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。在一些实施方案中，融合蛋白包含由与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的重链；和由与SEQ IDNO：22的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成的轻链。
表4.示例性融合蛋白
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为约5-50mg/ml、5-40mg/ml、5-30mg/ml、5-25mg/ml、10-50mg/ml、20-50mg/ml、25-50mg/ml、20-50mg/ml、20-40mg/ml、20-30mg/ml、25-50mg/ml、25-40mg/ml或25-30mg/ml的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为约20-30mg/ml的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为约25mg/ml的本文所述的融合蛋白。
在一些实施方案中，融合蛋白是浓度为约50mg/ml、5-40mg/ml、5-30mg/ml、5-25mg/ml、10-50mg/ml、20-50mg/ml、25-50mg/ml、20-50mg/ml、20-40mg/ml、20-30mg/ml、25-50mg/ml、25-40mg/ml或25-30mg/ml的BCA101。在一些实施方案中，融合蛋白是BCA101并且以约20-30mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，融合蛋白是BCA101并且以约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，融合蛋白是BCA101并且以约25mg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，包含靶向部分和免疫调节部分，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且以约20-30mg/ml的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，包含靶向部分和免疫调节部分，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且以约25mg/ml的浓度存在于药物组合物中。
制造方法
在一些方面，本文提供了制造本文所述的药物组合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括在细胞培养基中培养包含编码本文所述的融合蛋白的一种或多种核酸的哺乳动物细胞，使得细胞将所述融合蛋白分泌到细胞培养基中；从细胞培养基中纯化融合蛋白；以及制备本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，细胞已将编码融合蛋白的一种或多种核酸稳定地掺入其基因组中。在一些实施方案中，细胞已将编码融合蛋白的一种或多种核酸瞬时掺入细胞中。在一些实施方案中，编码融合蛋白的一种或多种核酸通过转染或转导引入细胞中。转染和转导方法是本领域众所周知的。
任何合适的哺乳动物细胞都可以用于表达融合蛋白。例如，熟知的哺乳动物细胞包括但不限于通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚胎肾系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞(Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如，DG44)、小鼠支持细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等人,1982,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。
用于产生本文所述的融合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售培养基例如Ham’s F10(Sigma-Aldrich Co,St.Louis,Mo.)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma-Aldrich Co.)、RPML 1640(Sigma-Aldrich Co.)和Dulbecco’s改良Eagle’s培养基((DMEM),Sigma-Aldrich Co.)适合培养宿主细胞。此外，Ham等人,1979,Meth.Enz.58:44、Barnes等人,1980,Anal.Biochem.102:255、美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、WO 90/103430和WO 87/00195中的一个或多个中描述的任何培养基可以用作用于宿主细胞的培养基，其全部内容通过引用并入本文。
任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的其他补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员来说是明显的。
可以使用本领域已知的任何合适的方法纯化从细胞分泌的融合蛋白。例如，尺寸排阻色谱、羟基磷灰石色谱、亲和色谱、凝胶电泳、透析或切向流过滤。在一些实施方案中，融合蛋白或药物组合物经历无菌过滤。在一些实施方案中，药物组合物作为药物物质生产并经历无菌过滤以生产药物产品。
治疗用途
在一个方面，本文提供了通过向患有癌症的受试者施用本文所述的药物组合物来治疗受试者中的癌症的方法。
在一些实施方案中，使用本文公开的方法代替标准护理疗法。在某些实施方案中，标准护理疗法与本文公开的任何方法组合使用。用于不同类型癌症的标准护理疗法是本领域技术人员众所周知的。例如，由美国21个主要癌症中心组成的国家综合癌症网络(NCCN)发布了《NCCN肿瘤学临床实践指南》(NCCN )，其提供了有关多种癌症的标准护理治疗的详细最新信息。在一些实施方案中，本文公开的方法在标准护理疗法失败后使用。
示例性癌症
在一些实施方案中，癌症是转移性的。在一些实施方案中，癌症是复发性的。在一些实施方案中，癌症是转移性的和复发性的。
在一些实施方案中，癌症是EGFR驱动的。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是转移性的。在一些实施方案中，所述癌症是复发性的。在一些实施方案中，所述癌症是难治性的。在一些实施方案中，所述癌症是转移性的、复发性的和/或难治性的，或其任何组合。
在一些实施方案中，所述癌症包括含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
在一些实施方案中，所述癌症包含含有KRAS基因中的基因组修饰的癌细胞。在一些实施方案中，KRAS基因中的所述修饰是G12D取代。在一些实施方案中，KRAS基因中的所述修饰是G13D修饰。
在一些实施方案中，所述癌症选自眼癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、乳腺癌、肛门癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、脑癌、脊髓癌、头癌和颈癌。
在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞肺癌(SqCLC)。在一些实施方案中，所述SqCLC包含如通过活组织检查测量的不表达可检测水平的程序性死亡配体1的癌细胞。在一些实施方案中，所述SqCLC包含含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述结直肠癌是RAS野生型微卫星稳定结直肠癌(RAS WT MSS CRC)。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一些实施方案中，所述癌症是脊髓癌。在一些实施方案中，所述脊髓癌是脊索瘤。在一些实施方案中，所述癌症是眼癌。在一些实施方案中，所述眼癌是眼黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是脑癌。在一些实施方案中，所述脑癌是胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述卵巢癌是上皮性卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是肝癌。在一些实施方案中，所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，所述癌症是甲状腺癌。在一些实施方案中，所述甲状腺癌是甲状腺未分化癌(ATC)。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。
在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，癌症是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，癌症是复发性HNSCC。在一些实施方案中，癌症是转移性HNSCC。在一些实施方案中，癌症是转移性和复发性HNSCC。在一些实施方案中，癌症是肛管癌。在一些实施方案中，癌症是肛管鳞状细胞癌(SCCAC)。在一些实施方案中，癌症是复发性SCCAC。在一些实施方案中，癌症是转移性SCCAC。在一些实施方案中，癌症是转移性和复发性SCCAC。
示例性给药方案和时间表
在一些实施方案中，融合蛋白(即，包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列)以治疗有效剂量施用至患有癌症的受试者。在一些实施方案中，将融合蛋白以固定剂量施用至患有癌症的受试者。在一些实施方案中，以平剂量(flat dose)向患有癌症的受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，以基于体重的剂量向患有癌症的受试者施用融合蛋白。
在一些实施方案中，以约50mg至2000mg、100mg至2000mg、150mg至2000mg、200mg至2000mg、300mg至2000mg、400mg至2000mg、500mg至2000mg、600mg至2000mg、700mg至2000mg、800mg至2000mg、9000mg至2000mg、1000mg至2000mg、1500mg至2000mg、50mg至100mg、50mg至500mg、50mg至400mg、50mg至300mg、50mg至200mg、50mg至100mg、100mg至500mg、100mg至400mg、100mg至300mg或100mg至200mg的剂量向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，以约200mg至2000mg的剂量向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，以约50mg、60mg、64mg、100mg、150mg、200mg、240mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900或2000mg的剂量向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，以约64mg、240mg、800mg或1600mg的剂量向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白以约64mg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，融合蛋白以约240mg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，融合蛋白以约800mg的剂量施用至受试者。在一些实施方案中，融合蛋白以约1600mg的剂量施用至受试者。
在一些实施方案中，每1、2、3、4、5或6周向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，每周向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，每2周向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，每3周向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，每4周向受试者施用融合蛋白。在一些实施方案中，将融合蛋白施用至受试者5周。在一些实施方案中，每6周向受试者施用融合蛋白。
试剂盒
在一个方面，本文提供了用于治疗用途的包含本文所述的液体药物组合物的试剂盒。试剂盒通常包括标签，其指示试剂盒内容物的预期用途和使用说明。术语标签包括试剂盒上提供的或随试剂盒提供的或以其他方式随附于试剂盒的任何书写或记录材料。因此，本公开内容提供了用于治疗患有癌症的受试者的试剂盒，该试剂盒包含：(a)本文所述的药物组合物的剂量和(b)使用本文公开的治疗方法的说明。在用于治疗人类患者的某些实施方案中，试剂盒包含本文所述的包含BCA101的液体药物组合物。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为进一步限制。本申请全文引用的所有参考文献的内容均通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1.BCA101制剂的开发
本研究的目的是开发用于双功能融合蛋白的制剂，其中蛋白质的两个功能结构域具有不同的等电点。本研究利用BCA101作为这样的融合蛋白。如本文所述，BCA101是双功能融合蛋白，其包含抗hEGFR抗体和融合至抗hEGFR抗体轻链的C末端的hTGFβRII的胞外结构域。BCA101的抗hEGFR抗体结构域具有碱性pI(等电点)，而hTGFβRII胞外结构域具有酸性pI。因此，需要开发一种能够容纳包含两种具有不同功能、结构和pI的蛋白质的融合蛋白的制剂。该制剂需要在冷藏(例如，2-8℃)或冷冻(例如，-20℃)温度下长期储存(例如，12-24个月)时保持融合蛋白的物理化学稳定性、融合蛋白的功能和生物效力。该制剂是通过一系列研究开发出来的，如图1所示。
pH筛选研究
进行了pH筛选研究以确定BCA101最稳定时的pH。使用切向流过滤(TFF)在pH5.0、5.5、6.0和6.5下进行BCA101(～35mg/ml)超滤，将过滤产物配制在10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂(10mM)、0.02％w/v聚山梨醇酯20和25mg/ml BCA101中(图2)。通过尺寸排阻色谱法测量主体切向流过滤组合物(TFF)和最终药物产品(FDP)的高分子量蛋白质(HMWP)百分比(图3)、蛋白质单体百分比(图4)和低分子量蛋白质(LMWP)百分比(图5)。通过差示扫描量热法(DSC)进一步分析了BCA101在每种pH制剂中的稳定性。每个制剂的DSC线图显示在图6中，每个pH下的数据总结如图7和表5所示。
表5.每个pH的DSC数据汇总
*样品分析时的时间(age)：2-8℃下保存12个月；扫描速率：90℃/小时
进一步测定在pH6.0和pH6.5下制剂的在40℃下的HMWP百分比(图8A-8B)、单体百分比(图9A-9B)和LMWP百分比(图10A-10B)。基于上述数据，选择pH6.0和6.5制剂进行进一步开发。
缓冲剂筛选研究
在选定的pH值6.0和6.5下测试了四种不同的缓冲剂(柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸和柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物(0.573mg/mL)、磷酸氢二钠二水合物(1.294mg/mL)))。药物产品在2-8℃储存在2RUSP 1型玻璃瓶中，配有13mm灰色涂层橡胶塞和翻盖式密封件。每种制剂含有25mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mm测试缓冲剂(柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸和柠檬酸盐磷酸盐)(图11)。通过DSC测量每种制剂的BCA101的稳定性：柠檬酸盐缓冲剂(图12A-12B)、琥珀酸盐缓冲剂(图13A-13B)、组氨酸缓冲剂(图14A-14B)和柠檬酸盐磷酸缓冲剂(图15A-15B)。四个测试缓冲剂的DSC数据总结如图16所示。
进一步评估每种制剂的物理外观、过滤性、Tm(通过DSC)和HMWP(应激稳定性)(表6)。基于上述数据，选择柠檬酸盐磷酸盐(pH6.0)和琥珀酸盐(pH6.5)进行进一步开发。
表6.pH6.0和6.5时每种测试缓冲剂的DSC数据
张力调节剂筛选
针对上面选择的每种缓冲剂和pH值筛选张力调节剂。根据下表7，每种测试制剂含有25mg/ml BCA101、0.02％w/w、5.0％w/v张力调节剂(蔗糖或海藻糖)和10mM缓冲剂(柠檬酸盐磷酸盐(pH6.0)或琥珀酸盐(pH6.5))(图17)。
表7.用于张力调节剂筛选的制剂
应激稳定性研究
在40℃下进行应激稳定性研究，并且在冻存管中进行3个冷冻循环的冻融研究，其中每个冷冻循环是在-80℃和-20℃下冷冻48小时，并且每个解冻循环是在培养箱中在25℃下解冻4小时。冻融和应激稳定性研究的结果总结于表8中。对于任何测试制剂，在冷冻/解冻研究或应激研究中没有观察到pH、重量渗透浓度或蛋白质浓度的变化。
表8.稳定性和冷冻/解冻研究结果
评估了蔗糖制剂的重量渗透浓度(表9)。5％w/v导致在170-240mOsmol/kg范围内的重量渗透浓度值。在达到300mOsmol/kg的目标重量渗透浓度值的基础上，进一步优化了蔗糖浓度。在不存在蔗糖的情况下，含有0.02％w/v聚山梨醇酯20和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂的BCA101制剂的重量渗透浓度在30-35mOsmol/Kg范围内。8.0％w/v蔗糖浓度被认为可以使BCA101药物产品达到300mOsmol/kg。
表9.蔗糖浓度优化和重量渗透浓度
颜色和澄清度研究
与药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液相比，对包含25mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL、磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)的BCA101制剂的颜色进行了评估(图18)。下面的表10-12中提供了标准溶液参考表。BCA101批次(毒理学研究批次，IRS和DRF)在506nm处的吸光度显示于图19中。
表10.药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液
表11.药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液
表12.药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液
与药典标准(福尔马肼悬浮液，Ph.Eu.2.2.1)相比，对包含25mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL、磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)的BCA101制剂的澄清度和乳光度进行了评估(图20)。下表13提供了标准溶液参考。BCA101样品的NTU值如图21所示。该测定按照Ph.Eur.2.2.1进行，其全部内容通过引用并入本文。
表13.药典(Ph.Eu.2.2.2)颜色标准溶液
长期稳定性研究
如果药物物质(DS)在2-20℃下处于5mL Celsius袋中(图22和图25)，和药物产品(DP)在2-8℃下处于玻璃瓶中(图23和图26)，则针对毒理学研究批次对包含25mg/mlBCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL、磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)的制剂中BCA101的稳定性进行评估。在24个月内评估药物物质(图22)和药物产品(图23)的pH、重量渗透浓度、蛋白质浓度和BCA101融合蛋白双臂的功能(通过双功能ELISA测量结合hEGFR和hTGFβ的能力)，数据点在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和24个月获取。药物物质和药物产品之间的长期稳定性研究的结果的图形比较显示在图24中。简而言之，为了进行双功能ELISA，封闭重组hEGFR Fc包被的板并随后用BCA101孵育约1小时，随后用重组hTGFβ1孵育。然后用生物素化的抗hTGFβ1抗体和随后链霉亲和素-HRP检测与BCA101的hTGFβRII ECD部分结合的hTGFβ1。因此，只有当双臂均完整时才会获得信号。
如果药物物质(DS)在2-20℃下处于在5mL Celsius袋中(图25)并且药物产品(DP)在2-8℃下处于玻璃瓶中(图26)，则还针对毒理学研究批次评估了HMWP百分比、单体百分比和LMWP百分比。药物物质和药物产品之间的长期稳定性研究的结果的图形比较显示在图27中。
上述实施例中描述的示例性配制过程的图形表示如图28所示。
实施例2.BCA101药物物质(DS)的长期储存稳定性
本研究的目的是评估BCA101药物物质(DS)在-20±5℃下在24个月内的长期储存稳定性。评估了在-20±5℃储存在Flexboy袋(BL.14.0901/R/17/021 F DS)或Celsius FFT或Celsius Pak袋(BS17006883)中的两个不同批次的BCA100 DS(BL.14.0901/R/17/021 FDS(R&D毒理学批次)和BS17006883(GMP开发批次))，各自包含25mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL、磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)。在24个月内评估pH、重量渗透浓度、蛋白质浓度、单体％、高分子量蛋白质(HMWP)％、低分子量蛋白质(LMWP)％、BCA101融合蛋白双臂的功能(通过双功能ELISA测量结合hEGFR和hTGFβ的能力)、视觉描述、颜色、澄清度、蛋白质浓度、通过SEC-HPLC和RP-HPLC测定的纯度、EGFR表达细胞增殖的抑制、细菌内毒素和生物负载，数据点通常在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和24个月获取(下表14和15中注明的除外)。表14和15提供了两个批次的BCA101 DS的稳定性数据的汇编。下面以及图29-39中提供了每个单独的稳定性测试和趋势数据的描述。
下面的表14提供了在-20±5℃储存的BCA101 DS批次BL.14.0901/R/17/021 F DS的长期稳定性数据的汇编，其中下文进一步详细描述了各个稳定性测试。
表14.在-20±5℃储存的BCA101 DS BL.14.0901/R/17/021 F DS批次的长期稳定性数据汇编
/>
NLT＝不小于；NMT＝不超过；SEC-HPLC＝尺寸排阻色谱法-高效液相色谱法；UV-280＝280nm处的紫外光吸光度。
下面的表15提供了在-20±5℃储存的BCA101 DS的BS17006883(GMP批次)的长期稳定性数据的汇编，其中下文进一步详细描述了各个稳定性测试。
表15.在-20±5℃储存的BS17006883 BCA101 DS批次的长期稳定性数据汇编
/>
/>
NLT＝不小于；NMT＝不超过；NTU＝比浊法浊度单位；SEC-HPLC＝尺寸排阻色谱法-高效液相色谱法；RP-HPLC＝反相高压液相色谱法；UV-280＝280nm处的紫外光吸光度
目视观察
目视观察是对所制造药物物质的描述、澄清度和颜色的定性评估。基于制造数据，对于BCA101 DS设定以下规格：描述：不存在干扰性异物颗粒设定为“澄清乳白色液体，无异物”；澄清度：“乳白色不应超过欧洲药典参考标准III(NTU值应为NMT 18 NTU)”；和颜色：“颜色不比欧洲药典参考标准BY4更深”。BS17006883 BCA101 DS批次经过目视观察测试，并显示自生产之日起长达24个月内符合各项规格(参见表15)。BL.14.0901/R/17/021 F DSBCA101 DS批次未进行目视观察测试。
pH范围
基于BCA101 DS的最佳稳定性，BCA101 DS的pH范围设定为pH6.00±0.30单位。pH的任何变化都指示制剂中一种或多种成分的降解。两个BCA101 DS批次均经过测试并确定自生产之日起长达24个月内符合pH规格。根据DS批次的趋势分析，pH没有明显变化，如表14和15以及图29所示。
重量渗透浓度
重量渗透浓度是参数之一，对于肠胃外制剂需要将其控制为接近血浆的重量渗透浓度以避免在施用期间与注射低/高渗DS相关的不良反应。BCA101的等渗浓度主要使用制剂中的蔗糖实现，对于BCA101DS，重量渗透浓度规格设定为270至330mOsmol/kg。稳定期期间蔗糖浓度的任何变化都可能导致重量渗透浓度的变化，表明对物质的稳定性有影响。如图30以及表14和15所示，BL.14.0901/R/17/021 F DS BCA101 DS批次的重量渗透浓度在长达24个月内都在规格之内，并且BS17006883 BCA101 DS批次也被确定为在6个月和9个月时间点测量时在规格之内。BS17006883 BCA101 DS批次的重量渗透浓度在9个月的时间点后未进行测试。
蛋白质浓度
蛋白质浓度提供关于样品中DS的量的信息。基于开发数据，BCA101 DS蛋白浓度的限值设定为25.00±2.00mg/mL。如图31以及表14和15所示，两个BCA101 DS批次在自生产之日起长达24个月内均符合蛋白质浓度规格。
生物负载和细菌内毒素测试(BET)
BCA101 DS的BET和生物负载的接受标准分别设定为不超过(NMT)0.25EU/mg和不超过(NMT)10CFU/100mL。如表15所示，BS17006883 BCA101 DS批次自生产之日起长达24个月内均满足BET和生物负载规格。BL.14.0901/R/17/021 F DS BCA101 DS批次未进行生物负载或BET测试。
通过SEC-HPLC测定的纯度
SEC-HPLC提供有关单体含量和相关HMWP的信息。BCA101DS的接受标准如下设定：单体％NLT 93.00％，HMWP％NMT 3.00％，和LMWP报告结果。如图32(％HMWP)、图33(％单体)和图34(％LMWP)以及表14和15所示，对于两个BCA101 DS批次，自生产之日起长达24个月内SEC-HPLC纯度结果均符合规格限值。
通过RP-HPLC测定的纯度
RP-HPLC提供有关疏水变体的纯度的信息。BCA101 DS的接受标准如下设定：总主峰NLT 70.0％、总峰后NMT 24％和总峰前NMT 6％。如图35(总峰前)、图36(总峰后)和图37(％主峰)以及表14和15所示，自生产之日起长达24个月内，RP-HPLC纯度结果符合对于BS17006883 BCA101 DS批次的规格限值。BL.14.0901/R/17/021 F DS BCA101 DS批次未经过RP-HPLC测试。
双功能ELISA
使用双功能ELISA来测定BCA101与EGF受体(EGFR)和TGFβ1配体的同时结合功效。简而言之，将重组hEGFR Fc包被的板封闭并随后与BCA101一起孵育约1小时，随后与重组hTGFβ1一起孵育。然后用生物素化的抗-hTGFβ1抗体，随后用链霉亲和素-HRP检测与BCA101的hTGFβRII ECD部分结合的hTGFβ1。因此，只有当BCA101的两个抗原结合臂(结合EGFR和结合TGFβ1配体)完整时才会获得信号。测定接受标准设定为相对于参考标准的平均相对效价为0.80至1.25。
如图38所示，自生产之日起24个月直到最后一个测试时间点，两个BCA101 DS批次的相对效价均完全在测定接受标准之内。
增殖抑制(IOP)测定
使用增殖抑制(IOP)测定来确定BCA101 DS通过与其靶EGFR结合来抑制FaDu癌细胞生长的能力。该测定提供了一种通过定量存在的ATP的量来确定培养物中活细胞数量的方法。读出基于通过萤光素的单氧化的发光，其在Mg2+以及由活细胞释放的ATP的存在下由萤光素酶催化。测定接受标准设定为相对于参考标准的平均相对效价为0.80至1.25。
如图39(和表14)所示，BS17006883 BCA101 DS批次被确定在自生产之日起长达24个月内符合0.80至1.25的IOP规格。BL.14.0901/R/17/021 F DS BCA101 DS批次未经IOP测试。
结论
上述数据表明，自生产之日起长达24个月内在-20±5℃储存的多个BCA101药物物质批次符合多种且全面的关键质量属性(释放参数)规格。基于稳定性趋势分析，未观察到pH、重量渗透浓度、SEC-HPLC、蛋白质含量/浓度、RP-HPLC或功能性的显著变化。从R&D(BL.14.0901/R/17/021 F DS)和开发GMP批次(BS17006883)获得的数据指示了当在-20±5℃储存在Flexboy或Celsius FFT/Celsius Pak袋中时BCA101药物物质制剂自生产之日起24个月内的物理化学和功能稳定性。
实施例3.BCA101药物产品(DP)的长期储存稳定性
本研究的目的是评估在5±3℃储存24个月的BCA101药物产品(DP)的长期储存稳定性。评估了在5±3℃储存在10R USPI型透明玻璃瓶中的两个不同批次的BCA100 DP(BL.14.0901/R/17/021 FDP(R&D批次)和BS18002245(GMP开发批次))，其包含25mg/mlBCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL，磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)。在24个月内评估pH、重量渗透浓度、蛋白质浓度、％单体、％高分子量蛋白(HMWP)、％低分子量蛋白(LMWP)、BCA101融合蛋白两个抗原结合臂的功能(通过双功能ELISA测量结合hEGFR和hTGFβ的能力)、纯度(通过SEC-HPLC和RP-HPLC)、EGFR表达细胞增殖的抑制、视觉描述、澄清度、颜色、可提取体积、密封完整性、亚可见颗粒物质、细菌内毒素和无菌性，数据点通常在初始时间点、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和24个月获取(表16和17中注明的除外)。表16和表17提供了第一和第二批次的BCA101 DP的稳定性数据的汇编。下面以及图40-51中提供了每个单独的稳定性测试和趋势数据的描述。
下表16提供了在5±3℃储存的BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次(R&D批次)的长期稳定性数据的汇编，其中下文进一步详细描述了各个稳定性测试。
表16.在5±3℃储存的BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次的长期稳定性数据汇编
/>
NLT＝不小于；NMT＝不超过；SEC-HPLC＝尺寸排阻色谱法-高效液相色谱法；RP-HPLC＝反相高压液相色谱法；UV-280＝280nm处的紫外光吸光度；NAP＝不适用。
δ直到T12之前的稳定性样品储存在-80℃，并且在稍后的时间通过RP-HPLC进行纯度测试。
*T3M的超趋势RP-HPLC数据是由于测定相关偏差引起的，因为来自后续时间点的数据(包括T24M的最长可用数据)均在规格之内。这表明产品质量在规定的限值内，并且在T3M处观察到的偏差是异常的。
下表17提供了在5±3℃储存的BS18002245 BCA101 DS批次(GMP批次)的长期稳定性数据的汇编，其中下文进一步详细描述了各个稳定性测试。
表17.在5±3℃储存的BS18002245 BCA101 DP批次的长期稳定性数据汇编
/>
/>
NLT＝不小于；NMT＝不超过；NTU＝比浊法浊度单位；SEC-HPLC＝尺寸排阻色谱法-高效液相色谱法；RP-HPLC＝反相高压液相色谱法；UV-280＝280nm处的紫外光吸光度。
*该批次在制造后在5±3℃下进入长期稳定性，但可用的最早时间点数据是T5M。
目视观察
目视观察是对制造的药物产品的描述、澄清度和颜色的定性评估。基于制造数据，规格如下设定：描述：不存在干扰性异物颗粒设定为“澄清乳白色液体，无异物”；澄清度：“乳白色不应超过欧洲药典参考标准III(NTU值应为NMT 18 NTU)”；和颜色：“颜色不比欧洲药典参考标准BY4更深”。BS18002245 BCA101 DP批次经过目视观察测试，结果显示自生产之日起长达24个月内符合各项规格(参见表17)。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次未进行目视观察测试。
pH范围
基于BCA101 DP的最佳稳定性，BCA101 DP的pH范围设定为pH6.00±0.30单位。pH的任何变化都指示制剂中一种或多种成分的降解。如图40以及表16和17所示，两个BCA101DP批次在自填充/生产之日起长达24个月内均符合pH规格。根据DS批次的趋势分析，没有检测到pH的明显变化(图40、表16和表17)。
重量渗透浓度
重量渗透浓度是参数之一，对于肠胃外制剂需要将其控制为接近血浆的重量渗透浓度，以避免在施用期间与注射低/高渗DP相关的不良反应。BCA101 DP的等渗浓度主要使用蔗糖实现，并且重量渗透浓度规格设定为270至330mOsmol/kg。稳定期期间蔗糖浓度的任何变化都可能导致重量渗透浓度的变化，表明对蛋白质稳定性的影响。如图41和表16所示，BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次的重量渗透浓度在自填充/制造之日起长达24个月内都在规格之内。BS18002245BCA101 DP批次未测试重量渗透浓度。
蛋白质浓度
蛋白质浓度提供了关于样品中BCA101 DP的量的信息。基于开发数据，蛋白质浓度的限值设定为25.00±2.00mg/mL。如图42(以及表16和表17)所示，两个BCA101 DS批次在自填充/制造之日起24个月内均符合规格。
可见颗粒
基于注射剂中USP<790>可见颗粒和USP<1>注射剂(配制的溶液)，可见颗粒的规格被设定为：“注射制剂实际上应不含可见颗粒”。BCA101 DP小瓶是在受控环境中制造的，并在批次发布前检查了可见颗粒。在批次发布时和在稳定性研究过程(24个月)中没有观察到可见颗粒(由于小瓶是无菌密封的，因此这预计不会发生变化)。BS18002245BCA101 DP批次自生产之日起24个月内符合规格(见表17)。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次未进行可见颗粒测试。
亚可见颗粒物
基于根据药典限值(USP<788>)的亚可见粒径定义了两种规格。对于亚可见颗粒(>/＝10μm)：每个容器不超过(NMT)6000个颗粒；对于亚可见颗粒(>/＝25μm)：每个容器不超过(NMT)600个颗粒。BS18002245 BCA101 DP批次自生产之日起24个月内符合规格(见表17)。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次未进行亚可见颗粒物测试。
无菌测试和BET(细菌内毒素测试)
BET和无菌的接受标准基于标准药典限值，分别规定为低于0.25EU/mg和“不存在微生物生长”。自生产之日起在5±3℃储存24个月的BS18002245 BCA101 DP批次符合BET和无菌的接受标准(见表17)。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次未进行BET和无菌测试。
可提取体积
由于在储存期间与产品接触的小瓶和塞子中存在死体积，所以不可能从小瓶中完全100％取出产品。考虑到机器的填充精度，确定为～0.15-0.2ml；BCA101 DP的填充体积设定为不小于(NLT)10.0mL。因此，可提取体积设定为NLT 10.0ml。如图43(和表17)所示，BS18002245 BCA101 DP批次自生产之日起24个月时符合规格限值。BL.14.0901/R/17/021F DP BCA101 DP批次未测试可提取量。
密封完整性测试
容器封闭密封完整性测试(CCIT)是对无菌测试的补充，并且旨在确保储存和运输期间直至DP保质期结束时的微生物完整性(无菌)。CCIT的接受标准是“测试的小瓶均不应含有任何有色溶液的痕迹”。BS18002245 BCA101 DP批次自生产之日起24个月时符合规格(见表17)。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次未经CCIT测试。
通过SEC-HPLC测定的纯度
SEC-HPLC提供有关产品单体含量和相关HMWP的信息。BCA101 DS的接受标准如下设定：％单体NLT 93.00％，％HMWP NMT 3.00％，和LMWP结果待报告。如图44(％HMWP)、图45(％单体)和图46(％LMWP)所示，直到自填充/生产之日起24个月，SEC-HPLC纯度结果符合两个BCA101 DP批次的规格限值。
通过RP-HPLC测定的纯度
RP-HPLC提供有关疏水变体的产物纯度的信息。BCA101 DS的接受标准设定如下：主峰：NLT 70.0％，总峰后：NMT 24％，以及总峰前：NMT 6％。如图47(总峰前)、图48(总峰后)和图49(％主峰)所示，直到自生产之日起24个月，RP-HPLC纯度结果符合测试的BS18002245BCA101 DS批次的规格限值。
排除BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次的T3M时间点，DP批次的产品相关疏水变体对于两个BCA101 DP批次在自生产之日起24个月时符合规格限值。仅在T3M对于BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次观察到的不合规格结果是由于分析测定偏差造成的；因为观察到长达24个月的随后时间点的稳定性趋势符合接受标准。其他分析测试未观察到这种行为，并且自生产之日起长达24个月的BS18002245BCA101 DP批次稳定性趋势在指定限值内。
双功能ELISA
使用双功能ELISA同时测定BCA101与EGFR和TGFβ1配体的结合功效。简而言之，将重组hEGFR Fc包被的板封闭并随后与BCA101一起孵育约1小时，随后与重组hTGFβ1一起孵育。然后用生物素化的抗hTGFβ1抗体和随后链霉亲和素-HRP检测与BCA101的hTGFβRII ECD部分结合的hTGFβ1。因此，只有当两个结合臂都完整时才会获得信号。测定接受标准设定为相对于参考标准的平均相对效价为0.80至1.25。
如图50(和表16)所示，BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP批次的相对效价直到从填充/制造之日起24个月的最后一个测试时间点完全在测定接受标准内。类似地，BS18002245 BCA101 DP批次结果直到从填充/制造之日起24个月的最后一个测试时间点完全在测定接受标准内(参见图50和表17)。
增殖抑制(IOP)测定
使用增殖抑制(IOP)测定来确定BCA101 DP通过结合其靶EGFR来抑制FaDu癌细胞生长的能力。该测定提供了一种通过定量存在的ATP的量来确定培养物中活细胞数量的方法。读出基于通过萤光素的单氧化的发光，其在Mg2+以及由活细胞释放的ATP的存在下由萤光素酶催化。测定接受标准设定为相对于参考标准的平均相对效价为0.80至1.25。
如图51(和表17)所示，BS18002245批次BCA101 DP自填充/制造之日起长达24个月内符合IOP规格。BL.14.0901/R/17/021 F DP BCA101 DP未经IOP测试。
结论
上述数据显示，在5±3℃储存的多个BCA101药物产品批次自填充/生产之日起长达24个月内符合接受标准。基于稳定性趋势分析，未观察到pH、重量渗透浓度、每个容器的亚可见颗粒数、SEC-HPLC、蛋白质含量、RP-HPLC或功能性的显著变化。从R&D(BL.14.0901/R/17/021 F DP)和开发GMP批次(BS18002245)获得的数据指示了在5±3℃储存在USP 1型玻璃瓶中时BCA101 DP自填充/制造之日起24个月内的物理化学和功能稳定性。BS18002245BCA101DP批次进一步在测试的自填充/制造之日起24个月的最长时间点内符合BET和无菌的规格限值。
实施例4.BCA101 DS的物理化学和生物学表征
本研究的目的是进一步表征和确认两个批次的BCA101 DS的物理化学和生物学特性：1)BL.14.0901/R/17/021/F DS，其是包含25.58mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL，磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)的临床前R&D批次和内参标准；和2)GF19000040，其是包含26.60mg/ml BCA101、0.02％w/v聚山梨醇酯20、8.0％w/v蔗糖和10mM柠檬酸盐磷酸盐(柠檬酸一水合物0.573mg/mL，磷酸氢二钠二水合物1.294mg/mL)缓冲剂(pH6.0)的GMP批次。表18提供了本实施例中用于评估BCA101物理化学和生物学质量属性的分析工具的总结。
表18.BCA101 DS批次的表征所采用的方法的总结
本实施例中的数据显示BCA101 GMP DS批次GF19000040与内参标准批次BL.14.0901/R/17/021/F DS的可比性；并显示两个批次均符合设定的质量属性规格。下文和表19中提供了本实施例中进行的物理化学和生物学表征的总结，其中下文提供了所进行的每项分析的附加详细描述。
一级结构：发现GF19000040批次的完整分子质量与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次相当，并且两者均在质量属性规格之内(图53和表23)。由于广泛的糖基化，完整的分子量被发现高于预期的理论分子量。GF19000040批次和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的肽序列，包括N-和C-末端以及接头序列，是一致的并且使用多酶PMF方法确认(图54-59)。
二级和更高阶结构：发现GF19000040批次的远紫外和近紫外CD分布与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的远紫外和近紫外CD分布相当，并且两者均在质量属性规格之内(图60-61)。在215nm附近观察到负特征峰，指示特征性β-折叠蛋白。GF19000040批次中存在的所有二硫键联均被鉴定并确认与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次一致(表24-26)。
糖基化：GF19000040批次的N-聚糖特征谱被测定为与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的N-聚糖特征谱相当，并且在质量属性规格之内(表27-28和图63-64)。GF19000040批次中主要糖型的相对丰度被测定为与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次中的相对丰度相当。GF19000040批次中的唾液酸含量估计为8.8摩尔/摩尔蛋白质；并且BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的唾液酸含量被测定为12.2摩尔/摩尔蛋白质。平均唾液酸含量的此差异被确定为在方法变异性范围内并且对生物功能影响很小。
生物活性：针对其同时结合其靶标(EGFR和TGFβ1)、通过同源受体抑制信号传导以及通过Fc结构域触发ADCC的能力评估了BCA101批次的生物学活性。来自生物学测定的总体数据显示，GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的生物活性相当，并且在质量属性规格之内(表30-32)。
产品相关变体：尺寸变体-如通过SEC-HPLC分析的，单体、HMWP和LMWP种类百分比在GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次中相当，并且在质量属性规格之内(表20)。使用nrCE-SDS和rCE-SDS定量的片段的相对百分比也被确定为在GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次之间相当并且在规格之内(表21)。电荷变体-iCE分析积分后获得的电荷变体被称为区域1、区域2和区域3。这些特征谱相互对应，并且GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的值被确定为是相当的并且在质量属性规格之内(表22)。疏水性变体–显示主峰、总峰前和总峰后以及相应相对面积百分比的RP特征谱被确定为在GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次之间相当，并且在质量属性规格之内(表29)。
表19.对于BCA101 DS批次进行的物理化学表征测试的总结
/>
/>
/>
通过SEC-HPLC测定的BCA101 DS的纯度
产品相关的尺寸变体杂质包括高分子量蛋白质(HMWP)种类、低分子量蛋白质(LMWP)种类和片段。HMWP种类是由于两个或更多个单体分子的缔合而形成的。HMWP分离和评估的主要分析方法是本文采用的尺寸排阻色谱HPLC(SEC-HPLC)。如表20所示，第一批次的BCA101 DS(GF19000040)和第二批次BL.14.0901/R/17/021/F DS(内参标准)的SEC-HPLC特征谱在视觉上相似(色谱图未显示)，并且确定单体、HMWP和LMWP的相对百分比是相当的(参见表20)。此外，两个BCA101 DS批次的单体、HMWP和LMWP水平分别在对于HMWP的NMT3.0％和对于LMWP的NMT 7.0％的规格之内(参见表20)。
表20.通过SEC-HPLC分析的BCA101 DS的纯度
通过nrCE-SDS和rCE-SDS测定的BCA101 DS的纯度
毛细管电泳(CE)是传统平板凝胶电泳(SDS-PAGE)的自动化和仪器化版本，它采用窄孔(内径20-200μm)毛细管对大分子和小分子两者进行高效分离。这些分离是通过使用高电压来促进的，高电压可以在毛细管内分别产生缓冲溶液和离子物质的电渗流和电泳流。CE-SDS(还原和非还原)用于定量分析治疗产品的纯度和基于尺寸的异质性。使用非还原和还原CE-SDS分析两个BCA101 DS批次GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS，以量化产品相关片段。(非还原(nr)和还原(r))CE-SDS电泳图显示两个批次之间的相似性(色谱图未显示)，并且两者均在质量属性规格之内(表21)。观察到nrCE-SDS中的主峰组较宽且分叉，这可能是由于a)大蛋白质的不完全变性和b)糖型中的异质性导致的变性状态的异质构象引起的。GF19000040批次和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的nrCE-SDS分析显示主峰组的校正面积百分比分别为94.3％和94.4％。rCE-SDS分析显示，GF19000040批次和IRS中最丰富种类(峰1+峰2+峰3)之和的比例分别为97.5％和97.8％。因此，测试的两个批次之间的片段比例相似，并且在规格之内(表21)。
表21.通过nrCE-SDS和rCE-SDS分析的BCA101 DS的纯度
通过iCE测定的BCA101 DS的纯度
成像毛细管电泳(iCE)是一种广泛用于生物治疗中产品相关电荷变体的分离和定量的分析工具。该技术利用了施加的电流下pH梯度凝胶基质中蛋白质电荷分离的原理。基于净电荷，蛋白质在凝胶基质中迁移，直到实现pH单位与分子等电点(pI)的平衡。使用iCE技术评估了两个批次的BCA101 DS的电荷变体特征谱。由于从重唾液酸化引起的BCA101的异质性，电荷变体特征谱显示缺乏基线分离的多个峰。因此，为了便于比较，峰被聚集到R1、R2和R3区域中，如图52所示。R1、R2和R3区域的相对比例是根据每个簇的曲线下相对面积估算的。如表22所示，观察到两个批次在方法变化之内相当并且在规格之内。
表22.通过iCE分析的BCA101 DS的纯度
完整质量分析
BCA101的完整质量分析是使用基质辅助激光解吸和电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行的。MALDI-TOF-MS是一种通过将激光束应用到嵌入快速电离基质中的分析物中来执行的常规且快速的定性工具。矩阵吸收来自激光(波长337nm的氮激光)的紫外光并将其转换为热能。基质的一小部分快速加热并与样品一起蒸发，从电离产生的光谱产生单电荷离子。基于质谱的簇尺寸分布，软件标定所分析样品的平均分子质量。GF19000040批次和BL.14.0901/R/17/021/F DS的完整质谱显示于图53和表23中。
如上所述，基于氨基酸序列的BCA101的理论分子量为178105Da。如表23所示，观察到GF1900040批次和BL.14.0901/R/17/021/F DS批次中BCA101的观察到的分子量为约192kDa，由于糖基化这高于分子的理论质量。由于BCA101中N连接的糖基化的异质性，质谱显示出180kDa至210kDa范围内的宽分子量分布。
表23.通过MALDI-TOF-MS分析的BCA101 DS的完整质量
肽质量指纹图谱分析
还原性肽质量指纹图谱分析(PMF)提供了蛋白质的详细信息，包括一级序列、N-和C-末端序列的测定、翻译后修饰的位点和类型的识别等。这种方法使分子经历特定的酶消化程序，然后在MS和/或MS2分析之前对肽进行色谱分离。串联MS或MS2方法有助于在接头确认以及N末端和C末端测序方面评估一级结构。N末端和C末端的测序是确认感兴趣的蛋白质序列的起点和终点的重要数据集。PMF分析已被制药行业广泛用于为感兴趣的分子生成独特的指纹图谱，并帮助识别完整的蛋白质序列覆盖范围。建立了BCA101批次GF19000040和BCA101批次BL.14.0901/R/17/021/F DS的PMF特征谱叠加(图54)。对于LC-TGFβRII，使用胰蛋白酶和Glu-C可以观察到100％序列覆盖率，而对于HC，使用四种酶(胰蛋白酶、Glu-C、Asp-N、LysC)用于100％序列覆盖率。确定了多重酶消化后生成的重链和轻链-接头-TGFβRII ECD片段以及理论和观察到的质量及其各自的保留时间。
如图54所示，GF19000040批次以及BL.14.0901/R/17/021/FDS批次的还原烷基化胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析的UV色谱图彼此相当，并且在规格之内。发现接头的MS2是完整的。使用多种酶(Glu-C、AspN、LysC)未发现游离末端轻链，因此可以得出结论，融合体在两个批次中是完整的。
N末端和C末端测序
进行N末端和C末端测序实验以确认BCA101的蛋白质序列的起点和终点。PMF是一种稳健的方法，它使用MS和MS2数据提供N末端和C末端序列，并将实验光谱数据与胰蛋白酶消化的LC和HC片段的计算机生成的质量进行比较。从MS2光谱获得的HC、LC和接头的N-和C-末端序列的b和y子离子系列呈现在图55-图59中。
根据图55-图59中呈现的数据，重链和轻链-TGFβRII的N末端和C末端序列被确认为N末端HC：pyroQVQLK(SEQ ID NO：35)；C末端HC：SLSLSPG；N-末端LC-TGFβRII：DILLTQSPVILSVSPGER(SEQ ID NO：36)；LC-接头-TGFβRII：GECGGGGSGGGGSGGGGSTIPPHVQK(SEQ ID NO：37)。由于低强度和高分子量，TGFβRII ECD的C末端未被选择用于MS2，但支持电荷态是可见的(上文提供的MS数据)。
如图54所示，GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS的胰蛋白酶肽图谱的UV色谱图彼此对应，并且观察到序列与理论序列相同。重链的在N末端的第一个氨基酸是“Gln”，即“Q”，在分析的两个批次中均观察到其为PyroQ。焦谷氨酸(Q)是谷氨酰胺的自发环化的结果。重链C末端氨基酸序列以“PG”结尾，并且不显示作为“PGK”的赖氨酸的存在。轻链的N末端是完整的，并且在FmAb2批次中未显示任何修饰。轻链的C末端与TGFβRII ECD融合。TGFβRII ECD的C末端序列是完整的，并被确定符合现有的理论序列。
圆二色性(CD)
圆二色性是光吸收光谱的一种形式，其测量物质对右圆偏振光和左圆偏振光的吸光度的差异。蛋白质的二级结构可以通过“远紫外”光谱区(200-260nm)中的CD光谱来确定。在这些波长下，发色团是肽键，并且当它位于规则的折叠环境中时，信号上升。α-螺旋、β-折叠和无规卷曲结构各自产生特征性的CD光谱形状和大小。
“近紫外”光谱区(260-350nm)中蛋白质的CD光谱可能对三级结构的某些方面敏感。在这些波长下，发色团是芳香氨基酸和二硫键，并且它们产生的CD信号对蛋白质的整体三级结构敏感。250-270nm区域中的信号归因于苯丙氨酸残基，来自270-290nm的信号归因于酪氨酸，而来自280-300nm的信号归因于色氨酸。由于三级结构是蛋白质特异性的，因此它没有标准的特征谱。
图60和图61分别提供了BCA101 DS GF19000040批次和BCA101 BR.14.09015/R/16/021DS批次的远紫外和近紫外CD光谱。如图60-61所示，特征谱彼此对应，并且BCA101BR.14.09015/R/16/021DS批次显示在216.2nm处的波长最小值，BCA101 DS GF19000040批次显示在215.4nm处的波长最小值，指示相似的二级和三级结构。观察到两个批次的远紫外光谱中的负特征峰在215nm左右，指示特征性β-折叠结构。
非还原二硫键桥连
BCA101中抗体主链的重链、轻链和重轻链之间的二硫键联决定了其结构、稳定性和生物学功能。BCA101的抗体主链属于IgG1类，其具有16个二硫键；铰链区的4个链间二硫键，和与不同结构域相关的12个链内键。在四个链间二硫键中，两个将重链连接在一起，另外两个将轻链和重链连接在一起。轻链的C末端Cys214与重链中的Cys222形成二硫键，其连接轻链和重链。每条重链中的Cys228和Cys231连接以在两条重链之间形成两个平行的链间二硫键。4条多肽链(2条重链和2条轻链)通过这4个链间二硫键联以形成四聚体，其在抗体主链结构和功能中起着关键作用。二硫键乱序或二硫键形成不完全可能导致功能丧失。此外，BCA101的TGFβRII-ECD结构域富含Cys残基，其连接以形成6个链内二硫桥，其在受体结合结构域结构和功能中发挥着关键作用。分析二硫键联以确定正确的连接的存在以确保药物功能和质量。
采用质谱(ESI-MS)工具来表征二硫键结构，这涉及通过酶促方式裂解蛋白质，其中蛋白水解衍生的肽含有半胱氨酸残基，用于确定二硫键的存在和位置。通过质谱肽作图直接分析肽混合物。通过将观察到的离子信号分配给来自一级氨基酸序列的相应计算质量，使用分子质量分析来鉴定二硫键合的二肽。使用非还原肽作图对BCA101的二硫键结构进行了表征。一般来说，该方法涉及通过碰撞诱导解离(CID)来表征未还原的二硫键，确保在非还原条件下选择性裂解蛋白质并生成肽质量指纹图谱。在BCA101的抗体主链和TGFβRII-ECD结构域中观察到的二硫键联如表24所示。
表24.BCA101中的半胱氨酸键联及其区域和意义。
/>
在TGFβRII ECD中的二硫键联中，两个胰蛋白酶肽显示存在多个二硫键(表25中的峰10和11)。为了鉴定键联，使用多重酶消化和MS2确认进行了额外的表征测试。MS2还用于确认Cys258-Cys261键联。
表25.
表25.BCA101 DS GF19000040和BCA101 DSBL.14.0901/R/17/021/F DS的非还原二硫键连接的胰蛋白酶消化物及其预期和观察到的质量和相应的保留时间(RT)
/>
/>
#：含有糖基化肽
表26描述了来自多重酶消化的肽的预期质量及其保留时间(RT)。
表26.BCA101 DS GF19000040批次和BCA101 BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的非还原二硫键连接的多重酶消化、其预期和观察到的质量以及相应的保留时间
/>
如图62所示，BCA101 DS GF19000040批次的非还原PMF UV色谱图与BCA101BL.14.0901/R/17/021/F DS批次相当，并且在规格之内。将两个批次的通过多种酶蛋白水解消化后的二硫键连接的肽的质量列于表25和26中，并且发现各批次之间以及与相应的理论质量相当。在TGFβRII ECD中的六个二硫键联中，三个通过MS2分析确认-Cys258-Cys261(AspN)、Cys268-Cys274(AspN/PNGaseF)和Cys291-Cys308(Trp/GluC)。此外，在通过AspN消化产生的肽之一(…NCSIT…TVCH)中，由于Cys291-Cys308已经从GluC消化的肽MS2中得到证实，因此另一个二硫键的唯一可能性是在Cys278-Cys284之间，这证实了第四个二硫键联。相应的具有二硫键的肽的质量已得到确认，并且在两个批次之间相当。因此，TGFβRIIECD中的二硫键连接的肽通过多重酶消化和MS2确认得到证实。
使用正相液相色谱(NP-HPLC)和ESI-MS进行N-聚糖分析
哺乳动物细胞中表达的生物治疗剂的异质性很大程度上是由于翻译后修饰，例如蛋白质的保守区域中的糖基化。单克隆抗体中的N-连接糖基化在配体/抗原结合及其功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和清除率)中发挥重要作用。
为了确定BCA101的N-连接糖基化，用SDS使样品变性，用PNGaseF去糖基化，用2-氨基邻氨基苯甲酸(2-AA)标记释放的聚糖，在FLD-NP-HPLC中分离和定量。使用LC-ESI-MS测定每种聚糖种类的质量。
下表27提供了观察到的聚糖种类的相对丰度。使用LC-ESI-MS获得的聚糖种类的质量鉴定通过MS2进行确认。2-AA标记的N-聚糖NP-HPLC色谱图如图63所示并且BCA101 DSGF19000040批次和BCA101 DS BL.14.0901/R/17/021/F DS批次的相对丰度百分比(表27)是相当的并且在规格之内。
表27.两个批次的BCA101 DS(BCA101BL.14.0901/R/17/021/F DS和BCA101 DSGF19000040)中存在的聚糖种类的相对丰度
唾液酸含量
唾液酸以两种形式存在：N-糖基神经氨酸(NGNA)和N-乙酰神经氨酸(NANA)。人类糖基化蛋白含有NANA形式的唾液酸。在Fc聚糖上存在的各种单糖中，末端唾液酸特别令人感兴趣，因为它们在单克隆抗体功能中发挥着不同的作用。
许多糖蛋白的半衰期可以通过唾液酸化来延长，因为唾液酸充当帽子，其隐藏被肝脏脱唾液酸糖蛋白受体识别的倒数第二个半乳糖残基。因此，从获得用于各种生物治疗应用的安全可靠的单克隆抗体的角度来看，需要更好地了解和监测唾液酸化聚糖。
除了影响生物制药药物的生物和物理化学特性外，蛋白质治疗剂的唾液酸部分在血清半衰期中发挥着重要作用，因为作为糖蛋白暴露的半乳糖通过受体介导的内吞作用被肝脏脱唾液酸半乳糖受体内吞。唾液酸的释放是通过单克隆抗体的酸水解，然后净化以去除单克隆抗体并用OPD进行唾液酸种类的荧光标签标记。将标记的样品注入反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱中进行分析。测定的线性动态校准范围是通过运行不同浓度的NANA标准品组来确定的。
图64中所示的数据覆盖表明，基于25和300pmol的NGNA标准样品，对应于NGNA的峰在BCA101 DS中不存在，其仅显示对应于NANA的峰(基于NANA标准样品中看到的峰)。因此，数据显示BCA101中存在NANA，并且在浓度高达20pmol时未检测到NGNA。如表28所示，BCA101DS(GF19000040)中的平均(n＝4)唾液酸含量估计为8.8摩尔/摩尔蛋白质，并且BCA101 DS(BL.14.0901/R/17/021/FDS)的平均唾液酸含量测定为12.2摩尔/摩尔蛋白质。平均唾液酸含量的此差异在方法变异性范围内，并且对批次之间的生物功能几乎没有影响，如下文呈现的功能测定中所示。
表28.BCA101 DS批次GF19000140和批次BL.14.0901/R/17/021/F DS中测量的唾液酸含量
产品相关物质–RP-HPLC
反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法用于监测产品相关的疏水性变体，包括翻译后修饰、氧化蛋白质、剪切变体或片段、N末端环化等。基于疏水性，蛋白质在柱中分离；疏水性较低的蛋白质比疏水性较高的变体更早洗脱。
BCA101批次中与产品相关的疏水性变体被分类为主峰，主峰之前的峰被分组为总峰前，并且主峰之后的峰被分组为总峰后。观察到RP特征谱以及主峰、前峰和后峰的相对比例在两个BCA101 DS批次(GF19000140和BL.14.0901/R/17/021/F DS)之间相似(表29)。观察到总主峰含量为82.2％(GF19000140)和81.3％(BL.14.0901/R/17/021/FDS)，两者均在不低于(NLT)70％的规格之内。观察到总峰前百分比为4.9％(GF19000140)和4.8％(BL.14.0901/R/17/021/F DS)，两者均在不超过(NMT)6.0％的规格之内。观察到的总峰后含量为12.9％(GF19000140)和13.9％(BL.14.0901/R/17/021/F DS)，两者均在不超过(NMT)24.0％的规格之内。
表29.BCA101 DS批次GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS的RP-HPLC数据
增殖抑制(IOP)
BCA101与FaDu癌细胞上的EGFR结合。在此测定中，改变药物浓度能够对癌细胞增殖产生剂量依赖性抑制。细胞2.0测定提供了一种通过定量存在的ATP的量(其指示存在代谢活性细胞)来确定培养物中活细胞的数量的均质方法。读出基于通过萤光素的单氧化的发光，其在Mg2+以及由活细胞释放的ATP的存在下由萤光素酶催化。
以BL.14.0901/R/17/021/F DS批次作为标准，通过三个独立实验对GF19000040批次进行分析。三个实验的平均相对效价描述于下表30中。
如表30所示，GF19000040批次显示出0.99的平均相对效价，其落在0.8-1.25的测定可接受标准内。结果表明GF19000040和BL.14.0901/R/17/021/F DS显示出抑制FaDu细胞增殖的相似的效力。
表30.通过IOP测定测量的BCA101 DS的平均相对效价
功能测定 批次 平均相对效价(N＝3)
IOP测定 GF19000040 0.99
双功能ELISA
如上所述，使用双功能ELISA测定来确定BCA101的融合部分与其靶蛋白的结合功效，从而确定BCA101中的两个部分同时具有功能。FmAb2具有在轻链的C末端与抗EGFR单克隆抗体融合的TGFβRII ECD。TGFβRII ECD部分主要与TGFβ1结合，并且抗EGFR与EGFR结合。单独的靶标结合ELISA只能独立测定每个部分的结合亲和力，但不能测定双功能性。
使用BL.14.0901/R/17/021/F DS作为标准评估GF19000040批次的双功能活性。如表31所示，GF19000040显示0.93的相对效价值，其完全在0.8-1.25的接受标准之内。结果进一步表明，与BL.14.0901/R/17/021/F DS相比，GF19000040显示出双功能活性的相似的效力。
表31.通过双功能ELISA测量的BCA101 DS的平均相对效价
功能测定 批次 平均相对效价(N＝3)
双功能检测 GF19000040 0.93
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：
ADCC测定评估BCA101的Fc功能。ADCC报告因子生物测定是一种生物发光报告因子测定，其通过效应细胞中的NFAT(活化的T细胞的核因子)途径激活基因转录，在ADCC作用机制途径的早期点使用替代读出。ADCC报告因子生物测定是使用ADCC生物测定效应细胞增殖模型(Promega，CAT#G7102)进行的，该模型允许细胞库存和细胞增殖。这些细胞是工程化的Jurkat细胞，其稳定表达FcγRIIIa受体V158(高亲和力)变体。ADCC中的生物活性通过NFAT途径激活产生的萤光素酶进行量化。效应细胞中的萤光素酶活性使用发光读出进行定量。
用FmAb2 IRS作为标准来评估GF19000040批次的ADCC活性。如表32所示，GF19000040批次显示1.23的相对效价值，其在0.8-1.25的可接受标准内，并且还显示≤20的％CV。结果表明，与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次相比，GF19000040批次显示出ADCC活性的相似的效力。
表32.通过ADCC测定测量的BCA101 DS的平均相对效价
TGFβSMAD测定
TGFβSMAD测定是一种功能测定，其确定融合抗体的TGFβRII ECD臂的功能活性。简而言之，HEK293细胞系经过工程改造以确定TGFβ-SMAD信号传导途径的活性。该细胞系含有稳定整合到HEK293细胞中受SMAD响应元件控制的萤火虫萤光素酶基因。TGFβ蛋白与细胞表面上的受体结合，启动信号传导级联，其导致SMAD2和SMAD3磷酸化和激活，其然后与SMAD4形成复合物。然后SMAD复合物易位到细胞核并与细胞核中的SMAD结合元件(SBE)结合，导致TGFβSMAD响应基因的转录和表达。用人TGFβ1刺激增加发光信号，该信号在BCA101的存在下以剂量依赖性方式被中和。
如表33所示，用BL.14.0901/R/17/021/F DS作为标准评估GF19000040批次。GF19000040批次显示1.10的相对效价值，其完全在0.80至1.25的可接受范围内，并且还显示≤20的％CV。进一步确定GF19000040批次与BL.14.0901/R/17/021/F DS批次相当。
表33.通过TGFβSMAD测定测量的BCA101 DS的平均相对效价
****
本发明不受本文描述的具体实施方案的范围的限制。事实上，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将根据前面的描述和附图变得明显。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)均通过引用整体并入本文并用于所有目的，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)被具体且单独地指示通过引用整体并入用于所有目的。
其他实施方案在所附权利要求的范围内。

Claims (131)

1.一种液体药物组合物，其包含：
a.包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合人表皮生长因子受体(hEGFR)；和(ii)所述免疫调节部分包含人转化生长因子-β受体II(hTGFβRII)的胞外结构域的氨基酸序列；
b.以5mM至30mM的浓度存在的缓冲剂；和
c.以4％w/v至10％w/v的浓度存在的张力剂；
其中，所述液体药物组合物具有5.5至7.0的pH。
2.权利要求1的液体药物组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂。
3.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。
4.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂以5mM至25mM、5mM至20mM、5mM至15mM、5mM至10mM或10mM至30mM的浓度存在。
5.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂以5mM至15mM的浓度存在。
6.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂以5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM的浓度存在。
7.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂以10mM的浓度存在。
8.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述缓冲剂包含10mM柠檬酸盐磷酸盐。
9.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂是蔗糖或海藻糖。
10.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂是糖。
11.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂是二糖。
12.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂是蔗糖。
13.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂以5％w/v至10％w/v、6％w/v至10％w/v、7％w/v至10％w/v、8％w/v至10％w/v、5％w/v至9％w/v、5％w/v至8％w/v、6％w/v至9％w/v、6％w/v至8％w/v、7％w/v至9％w/v或7％w/v至8％w/v的浓度存在。
14.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂以5％w/v至8％w/v的浓度存在。
15.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂以5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v的浓度存在。
16.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂以8％w/v的浓度存在。
17.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述张力剂是蔗糖并且以8％w/v的浓度存在。
18.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其还包含表面活性剂。
19.权利要求18的液体药物组合物，其中所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。
20.权利要求19的液体药物组合物，其中所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20。
21.权利要求18-20中任一项的液体药物组合物，其中所述表面活性剂以0.005-0.1％w/v的浓度存在。
22.权利要求18-21中任一项的液体药物组合物，其中所述表面活性剂以0.01-0.1％w/v、0.02-0.1％w/v、0.01-0.9％w/v、0.01-0.8％w/v、0.01-0.7％w/v、0.01-0.6％w/v、0.01-0.5％w/v、0.01-0.4％w/v、0.01-0.3％w/v、0.01-0.2％w/v、0.01-0.1％w/v、0.02-0.9％w/v、0.02-0.8％w/v、0.02-0.7％w/v、0.02-0.6％w/v、0.02-0.5％w/v、0.02-0.4％w/v、0.02-0.3％w/v、0.02-0.2％w/v、0.02-0.1％w/v、0.005-0.9％w/v、0.005-0.8％w/v、0.005-0.7％w/v、0.005-0.6％w/v、0.005-0.5％w/v、0.005-0.4％w/v、0.005-0.3％w/v、0.005-0.2％w/v或0.005-0.1％w/v的浓度存在。
23.权利要求18-22中任一项的液体药物组合物，其中所述表面活性剂以0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v或0.1％w/v的浓度存在。
24.权利要求18-23中任一项的液体药物组合物，其中所述表面活性剂以0.02％w/v的浓度存在。
25.权利要求18-24中任一项的液体药物组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20并且以0.02％w/v的浓度存在。
26.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有5.5至7.0、6.0至7.0、5.5至6.5、5.5至6.0或6.0至6.5的pH。
27.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有6.0至6.5的pH。
28.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有5.5、6.0、6.5或7.0的pH。
29.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有6.0的pH。
30.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有150mOsmol/kg至400mOsmol/kg的重量渗透浓度。
31.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有150mOsmol/kg至350mOsmol/kg、150mOsmol/kg至300mOsmol/kg、200mOsmol/kg至400mOsmol/kg、250mOsmol/kg至400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至400mOsmol/kg、300mOsmol/kg至350mOsmol/kg、250mOsmol/kg至350mOsmol/kg或250mOsmol/kg至300mOsmol/kg的重量渗透浓度。
32.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有250mOsmol/kg至350mOsmol/kg的重量渗透浓度。
33.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有250mOsmol/kg、300mOsmol/kg或300mOsmol/kg的重量渗透浓度。
34.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物具有300mOsmol/kg的重量渗透浓度。
35.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在-20℃储存时，所述液体药物组合物稳定至少12、18或24个月。
36.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在2-8℃储存时，所述液体药物组合物稳定至少12、18或24个月。
37.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在-20℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少12、18或24个月内基本相同。
38.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在2-8℃储存时，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度在至少12、18或24个月内基本相同。
39.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中在-20℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
40.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中在2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物中的所述融合蛋白的浓度降低不超过0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
41.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物在1、2、3、4或5个冷冻和解冻循环后是稳定的。
42.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在-20℃储存时，如通过双功能酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的，所述融合蛋白在至少12、18或24个月内保留双功能活性。
43.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中当在2-8℃储存时，如通过双功能ELISA测量的，所述融合蛋白在至少12、18或24个月内保留双功能活性。
44.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体形式的所述融合蛋白。
45.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中在-20℃或2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物与对照制剂相比具有选自以下的至少一个特征：
a.增加的保质期，
b.增加的温度稳定性，
c.减少的聚集体形成，
d.增加的化学稳定性，和/或
e.减少的碎片化
f.减少的粘度。
46.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中在-20℃或2-8℃储存12、18或24个月后，所述液体药物组合物与参考制剂相比具有选自以下的至少一个特征：
a.如通过尺寸排阻色谱(SEC)测量的，降低的聚集体百分比，
b.如通过SEC测量的，更高的单体百分比，和/或
c.更低的以浊度测定法单位(NTU)表示的浊度值。
47.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以5-50mg/ml、5-40mg/ml、5-30mg/ml、5-25mg/ml、10-50mg/ml、20-50mg/ml、25-50mg/ml、20-50mg/ml、20-40mg/ml、20-30mg/ml、25-50mg/ml、25-40mg/ml或25-30mg/ml的浓度存在。
48.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以20-30mg/ml的浓度存在。
49.如前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的浓度存在。
50.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以25mg/ml的浓度存在。
51.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述靶向部分包括抗体或其功能片段或功能变体。
52.权利要求51的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体是全长抗体、单链可变片段(scFv)、scFv2、scFv-Fc、Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)。
53.权利要求51或52的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VH，所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中
a.VH CDR1包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
b.VH CDR2包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
c.VH CDR3包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
54.权利要求51-53中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VL，所述VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中
a.VL CDR1包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
b.VL CDR2包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
c.VL CDR3包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
55.权利要求51-54中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
56.权利要求51-55中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
57.权利要求51-56中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
58.权利要求51-57中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由重链组成，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
59.权利要求51-57中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含重链，所述重链由与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
60.权利要求51-57中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由重链组成，所述重链由与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
61.权利要求51-60中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
62.权利要求51-61中任一项的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体由轻链组成，所述轻链由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
63.权利要求51的液体药物组合物，其中特异性结合hEGFR的所述抗体或其功能片段或功能变体包括西妥昔单抗或帕尼单抗，或前述任一项的功能片段或功能变体。
64.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分包含与SEQ IDNO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
65.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分由与SEQ IDNO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
66.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分间接融合至所述靶向部分。
67.权利要求66的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分经由肽接头间接融合至所述靶向部分。
68.权利要求67的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分经由足够长度的肽接头间接融合至所述靶向部分，使得所述免疫调节部分和所述靶向部分可以同时结合各自的靶标。
69.权利要求66或67的液体药物组合物，其中所述接头包含SEQ ID NO：24、25、26、27或28的氨基酸序列。
70.权利要求67-69中任一项的液体药物组合物，其中所述接头包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
71.权利要求67-69中任一项的液体药物组合物，其中所述接头由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。
72.权利要求1-71中任一项的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的C末端。
73.权利要求1-71中任一项的液体药物组合物，其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的N末端。
74.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述靶向部分是包含轻链和重链的抗体，并且其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的所述重链的C末端。
75.权利要求1-74中任一项的液体药物组合物，其中所述靶向部分是包含轻链和重链的抗体，并且其中所述免疫调节部分融合至所述靶向部分的所述轻链的C末端。
76.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述靶向部分是特异性结合hEGFR的抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分的N末端通过接头间接融合至所述重链或所述轻链的C末端，并且其中所述接头包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
77.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述靶向部分是特异性结合hEGFR的抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述免疫调节部分的N末端通过接头间接融合至所述轻链的C末端，并且其中所述接头包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
78.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
79.前述权利要求中任一项的液体药物组合物，其中所述液体药物组合物是无菌的。
80.一种液体药物组合物，其包含：
a.包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的氨基酸序列；
b.5mM至20mM的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；和
c.6％w/v至10％w/v的蔗糖；
其中所述液体药物组合物具有5.5至6.5的pH。
81.权利要求80的液体药物组合物，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
82.权利要求80或81的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以25mg/ml的浓度存在。
83.权利要求80-82中任一项的液体药物组合物，其还包含0.01-0.05％w/v的聚山梨醇酯20。
84.一种液体药物组合物，其包含：
a.包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列；
b.10mM的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；和
c.8％w/v的蔗糖；
其中所述液体药物组合物具有6.0±0.3的pH。
85.权利要求84的液体药物组合物，其还包含0.02％w/v的聚山梨醇酯20。
86.权利要求84或85的液体药物组合物，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
87.权利要求84-86中任一项的液体药物组合物，其中所述融合蛋白以25mg/ml的浓度存在。
88.一种液体药物组合物，其包含：
a.25mg/mL的融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向部分和免疫调节部分，其中所述靶向部分包含抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
b.10mM的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂；
c.8％w/v的蔗糖；和
d.0.02％w/v的聚山梨醇酯20；
其中所述液体药物组合物具有6.0±0.3的pH。
89.一种治疗患有癌症的受试者中的人类癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-86中任一项的液体药物组合物。
90.权利要求89的方法，其中所述液体药物组合物以有效治疗所述癌症的量施用。
91.权利要求89或90的方法，其中所述融合蛋白以50mg至2000mg的剂量施用至所述人类受试者。
92.权利要求89-91中任一项的方法，其中所述融合蛋白以50mg、60mg、64mg、100mg、150mg、200mg、240mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900或2000mg的剂量施用至所述人类受试者。
93.权利要求89-92中任一项的方法，其中所述融合蛋白以64mg、240mg、800mg或1600mg的剂量施用至所述人类受试者。
94.权利要求89-93中任一项的方法，其中每1、2、3或4周向所述人类受试者施用所述融合蛋白。
95.权利要求94的方法，其中每周向所述人类受试者施用所述融合蛋白。
96.权利要求94的方法，其中每3周向所述人类受试者施用所述融合蛋白。
97.权利要求89-96中任一项的方法，其中施用步骤包括静脉内注射所述液体药物组合物。
98.权利要求89-97中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤。
99.权利要求89-98中任一项的方法，其中所述癌症是转移性的、复发性的、难治性的或其任何组合。
100.权利要求89-99中任一项的方法，其中所述癌症包含含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
101.权利要求89-100中任一项的方法，其中所述癌症包含含有KRAS基因中的基因组修饰的癌细胞。
102.权利要求101的方法，其中KRAS基因中的所述修饰是G12D取代。
103.权利要求101的方法，其中KRAS基因中的所述修饰是G13D修饰。
104.权利要求89-103中任一项的方法，其中所述癌症选自眼癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、乳腺癌、肛门癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、脑癌、脊髓癌、头癌和颈癌。
105.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是肺癌。
106.权利要求105的方法，其中所述癌症是鳞状细胞肺癌(SqCLC)。
107.权利要求106的方法，其中所述SqCLC包含如通过活组织检查测量的不表达可检测水平的程序性死亡配体1的癌细胞。
108.权利要求106或107的方法，其中所述SqCLC包含含有EGFR基因的基因组扩增的癌细胞，例如如通过活组织检查和荧光原位杂交检测的。
109.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是结直肠癌。
110.权利要求109的方法，其中所述结直肠癌是RAS野生型微卫星稳定结直肠癌(RASWT MSS CRC)。
111.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
112.权利要求111的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。
113.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是脊髓癌。
114.权利要求113的方法，其中所述脊髓癌是脊索瘤。
115.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是眼癌。
116.权利要求115的方法，其中所述眼癌是眼黑素瘤。
117.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是脑癌。
118.权利要求117的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
119.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
120.权利要求119的方法，其中所述卵巢癌是上皮性卵巢癌。
121.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是肝癌。
122.权利要求121的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。
123.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是甲状腺癌。
124.权利要求123的方法，其中所述甲状腺癌是甲状腺未分化癌(ATC)。
125.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
126.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是胃癌。
127.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是头颈癌。
128.权利要求127的方法，其中所述癌症是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
129.权利要求89-104中任一项的方法，其中所述癌症是肛门癌。
130.权利要求129的方法，其中所述肛门癌是肛管鳞状细胞癌(SCCAC)。
131.一种制备液体药物组合物的方法，其包括：
a.在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞已在其基因组中稳定掺入编码包含靶向部分和免疫调节部分的融合蛋白的一种或多种核酸，其中：i)所述靶向部分特异性结合hEGFR；和(ii)所述免疫调节部分包含hTGFβRII的胞外结构域的氨基酸序列，使得细胞将所述融合蛋白分泌到细胞培养基中；
b.从细胞培养基中纯化融合蛋白；和
c.制备权利要求1-88中任一项的药物组合物。
CN202180093681.9A 2020-12-15 2021-12-15 用于融合蛋白的药物制剂 Pending CN116829580A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN202011054539 2020-12-15
IN202011054539 2020-12-15
PCT/US2021/010066 WO2022132201A2 (en) 2020-12-15 2021-12-15 Pharmaceutical formulations for fusion proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116829580A true CN116829580A (zh) 2023-09-29

Family

ID=82060089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180093681.9A Pending CN116829580A (zh) 2020-12-15 2021-12-15 用于融合蛋白的药物制剂

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240084018A1 (zh)
EP (1) EP4263591A2 (zh)
JP (1) JP2023553209A (zh)
CN (1) CN116829580A (zh)
AU (1) AU2021400284A1 (zh)
CA (1) CA3202867A1 (zh)
WO (1) WO2022132201A2 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127284A2 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2014164427A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Biocon Ltd. Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
JP7061134B2 (ja) * 2017-03-20 2022-04-27 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア 薬剤負荷ナノ粒子が表面に結合したｃａｒ ｔ細胞の養子移入およびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4263591A2 (en) 2023-10-25
WO2022132201A8 (en) 2023-09-28
WO2022132201A3 (en) 2022-11-03
WO2022132201A2 (en) 2022-06-23
JP2023553209A (ja) 2023-12-20
CA3202867A1 (en) 2022-06-23
AU2021400284A1 (en) 2023-06-22
US20240084018A1 (en) 2024-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109937034B (zh) 阿柏西普制剂及其用途
US20100226928A1 (en) Lyophilised Antibody Formulation
KR20220012256A (ko) Il-2 조성물 및 이의 사용 방법
WO2019157340A1 (en) Low ph pharmaceutical antibody formulation
CN114450297A (zh) Il-2组合物及其使用方法
EP3932426A2 (en) Preparations containing anti-cd47 antibody, and preparation method and use therefor
EP3160511B1 (en) Protein formulations
KR20210089215A (ko) 항-lag3 항체 및 항-pd-1 항체의 공동-제제
KR20220036998A (ko) 항 cd47/pd-l1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도
JP7183268B2 (ja) 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用
CN116829580A (zh) 用于融合蛋白的药物制剂
KR20240024941A (ko) 항-pd1 항체의 제제
CN118234509A (zh) 抗-cd47抗体制剂
EP4085253B1 (en) Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
CN114206382B (zh) 包含抗pd-1/her2双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
US20230167175A1 (en) Pharmaceutical formulation
WO2022111612A1 (zh) 包含抗tigit/pd-1双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
CN117999101A (zh) 靶向EGFR的Fc抗原结合片段-药物缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40098180

Country of ref document: HK