CN116818964A - 肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，包括以下步骤：步骤一、提取鲜肉原料中的肌肉蛋白，获得蛋白溶液；步骤二、检测分析加热处理前后肌肉蛋白的性能变化；步骤三、取萜类化合物溶于溶剂中制成香味物质储备液，将其与所述蛋白溶液密封混合，测定肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力；步骤四、将肌肉蛋白的三维结构模型与萜类化合物的三维结构模型进行分子对接，选择自由结合能最低的构象，分析肌肉蛋白与萜类化合物的结合模式和位点，明确二者的相互作用机制。本发明为热加工中肌肉蛋白与香味物质相互作用机制提供了理论基础，对改善肉制品风味具有指导意义。

Description

肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法
技术领域
本发明涉及肉制品加工技术领域。更具体地说，本发明涉及一种肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法。
背景技术
肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)和肌浆蛋白(sarcoplasmic protein，SP)是肌肉蛋白的重要组成部分，分别占肌肉蛋白含量的50～55％和30～34％。蛋白自身没有风味，但可与风味物质结合，从而影响风味感知。蛋白与风味物质结合的影响因素主要包括蛋白和风味物质自身性质以及温度、离子强度、pH等外界因素。其中蛋白质结构(如氨基酸序列及二级、三级、四级结构)是影响风味化合物结合行为的基本因素。热处理是肉制品加工过程中最常见的加工方式。据报道，肌肉蛋白受热后发生变性并展开多肽链，暴露出埋藏在蛋白内部的疏水性风味结合位点从而提高蛋白结合风味能力。但目前关于肌肉蛋白与风味相互作用的报道主要基于MP体系，而关于SP的研究有限，如现有技术“《肌原纤维蛋白对挥发性风味物质吸附作用研究进展》，肉类研究，中国肉类食品综合研究中心，2020,Vol.34,No.09 105～112”中仅介绍了肌原纤维蛋白对醇、醛、酮、酯类典型的风味化合物的吸附能力做出了报道。因此，有必要明确热诱导变性对不同种类肌肉蛋白结合风味的影响。
肉制品加工过程中通常会添加香辛料，如八角、草果、胡椒、花椒、肉桂、小茴香等，以达到去腥除臭、提色增香的目的。萜类化合物被鉴定为香辛料中挥发性风味化合物的主要组分之一，其中3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇等化合物可赋予肉制品树脂、薄荷、柠檬香气，对肉制品香味具有重要贡献。目前关于醛、酮、醇、酯、呋喃、吡嗪等香味物质与肌肉蛋白的相互作用已有较多报道，而对于萜类化合物与肌肉蛋白的结合机制尚不明确。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，对改善肉制品风味具有指导意义。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、提取鲜肉原料中的肌肉蛋白，纯化，加热处理，获得蛋白溶液；
步骤二、检测分析加热处理前后肌肉蛋白的性能变化；
步骤三、取萜类化合物溶于溶剂中制成香味物质储备液，将其与所述蛋白溶液密封混合，测定肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力；
步骤四、将肌肉蛋白的三维结构模型与萜类化合物的三维结构模型进行分子对接，选择自由结合能最低的构象，分析肌肉蛋白与萜类化合物的结合模式和位点，明确二者的相互作用机制。
优选的是，所述肌肉蛋白为肌原纤维蛋白和肌浆蛋白。
优选的是，所述肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的提取方法为：
取鲜肉原料，去除可见脂肪和结缔组织，切碎，加入pH为7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液，冰浴匀浆后在4℃下离心，取上清液经纱布过滤后即得肌浆蛋白；
取沉淀加入4倍体积的pH为7.0的分离缓冲液，所述分离缓冲液为0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和1mmol/L EGTA的混合溶液，冰浴匀浆后4℃下离心，上述步骤重复3次后，收集沉淀，加入4倍体积的0.1mol/L NaCl溶液，冰浴匀浆后4℃下离心，重复4次，最后一次离心前，沉淀经纱布过滤，离心后的沉淀即得肌原纤维蛋白。
优选的是，所述步骤一中纯化的具体过程为：将提取的肌肉蛋白在含0.6mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液中用截留量为8～14kDa的透析袋于4℃透析24h，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，透析过程中每4h更换一次磷酸盐缓冲液，获得纯化后的肌肉蛋白。
优选的是，所述步骤一中加热处理的具体过程为：用含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液将纯化后的肌肉蛋白的质量浓度调整为4mg/mL，并在85℃下分别加热1～60min后立即冰浴冷却，获得所述蛋白溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0。
优选的是，所述萜类化合物为3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇，将三者按1：1：1的质量比同时溶于甲醇中，配置成质量浓度为100mg/L的香味物质储备液。
优选的是，所述步骤三中肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力测定方法为：
实验组：取质量浓度为4mg/mL的蛋白溶液，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
空白组：取含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
步骤c、采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用测定萜类化合物的顶空浓度，采用75μm的CAR/PDMS萃取纤维，将平衡后的混合液在25℃下吸附30min，250℃下脱附3min后，经GC-MS分析；
其中，GC-MS条件：采用DB-WAX色谱柱(30m×0.18mm×0.18μm)，不分流模式进样；升温程序：柱温在35℃保持3min，以5℃/min升至210℃；质谱离子源温度200℃，电子能量70eV，质量扫描范围m/z 35～500；
肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力用混合液中萜类化合物的自由比例表示：
优选的是，所述步骤四中分子对接过程为：将肌肉蛋白的三维结构模型与萜类化合物的三维结构模型经CHARMm力场优化后，采用Discovery Studio 2019软件中的CDOCKER模块进行分子对接。
优选的是，所述步骤二中加热处理前后肌肉蛋白的性能变化检测包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、表面疏水性检测、总巯基含量检测、粒径检测、二级结构含量检测。
本发明至少包括以下有益效果：本发明为明确热处理过程中肌肉蛋白与萜类化合物的相互作用规律及机制，采用气相色谱-质谱联用等方法，探究不同加热时间下肌原纤维蛋白和肌浆蛋白对3种萜类化合物(3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇)吸附能力与蛋白构象变化的相关性，并通过分子对接揭示肌肉蛋白与萜类化合物结合机制，研究结果可为热加工中肌肉蛋白与香味物质相互作用机制提供理论基础，对改善肉制品风味具有指导意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例2中不同加热时间下MP(A)的电泳图；
图2为实施例1中不同加热时间下SP(B)的电泳图；
图3为实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的表面疏水性变化图；
图4为实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的总巯基含量变化图；
图5为实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的粒径变化图；
图6为实施例1和实施例2中不同加热时间下MP和SP对3-蒈烯(A)、柠檬烯(B)和芳樟醇(C)吸附能力变化图；
图7为实施例2中肌球蛋白与3种萜类化合物的对接构象和对接位点图(A、B、C分别表示肌球蛋白与3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇的对接；数字1、2、3分别表示最优对接模式、对接3D图、对接2D图)；
图8为实施例1中肌红蛋白与3种萜类化合物的对接构象和对接位点图(a、b、c分别表示肌红蛋白与3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇的对接；数字1、2、3分别表示最优对接模式、对接3D图、对接2D图)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
目前，公开的香辛料中的关键萜类化合物包括但不限于草蒿脑，丁香酚，茴香脑，3-蒈烯，柠檬醛，香叶醇，α-松油醇，芳樟醇，β-水芹烯，月桂烯，β-石竹烯，桉叶油醇，β-蒎烯，柠檬烯等，其香气描述和来源如表1所示。其中3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇等化合物可赋予肉制品树脂、薄荷、柠檬香气，对肉制品香味具有重要贡献。
表1香辛料中关键萜类化合物
实施例1
一种肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其中肌肉蛋白选取肌浆蛋白(SP)，萜类化合物为3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇，三者的质量比为1：1：1，具体如下：
步骤一、取40g新鲜猪背最长肌，去除可见脂肪和结缔组织后切碎，加入80mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)，冰浴匀浆(10000rpm，1min)后离心20min(4℃，6000×g)，上清液经4层纱布过滤后即得SP；
将提取的SP在含0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)中用截留量为8～14kDa的透析袋于4℃透析24h，每4h更换一次磷酸盐缓冲液，纯化后的蛋白采用BCA法测定质量浓度，并于4℃冷藏，12h内使用；
用含0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)将SP的质量浓度调整为4mg/mL，在85℃下分别加热1、5、10、30、60min后立即冰浴冷却，获得SP溶液；
步骤二、将SP溶液的浓度调整为2mg/mL，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，分离胶浓度12.5％，浓缩胶浓度5％，上样量10μL，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳完毕后，采用考马斯亮蓝R-250染色2h，蒸馏水脱色，经凝胶成像仪成像；
采用ANS荧光探针法测定SP表面疏水性，将SP溶液的浓度分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，取4mLSP溶液与50μL 8-苯胺-1-萘磺酸ANS(8mM)混合均匀，避光静置10min，测定荧光强度，荧光测定条件：激发波长374nm，发射波长480nm，狭缝5nm，以含0.6MNaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)为空白，表面疏水性以荧光强度与蛋白质量浓度对应曲线的斜率表示；
蛋白总巯基含量测定：取1mLSP溶液添加9mL 50mM磷酸盐缓冲液(含0.6M KCl，10mM EDTA，8M尿素，pH 7.0)混合均匀，取5mL混合液添加0.5mL DTNB(0.2mM)，25℃下反应25min，于412nm测定吸光度，使用摩尔消光系数13600mol-1cm-1计算总巯基含量；
SP溶液稀释至1mg/mL后，采用激光粒度仪测定平均粒径，测量温度25℃，平衡时间1min；
SP溶液冷冻干燥后，采用多次衰减全反射技术(multi-bounceattenuated totalreflection，MB-ATR)结合傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared，FT-IR)测定蛋白二级结构含量，扫描范围400～4000cm-1，分辨率4cm-1，扫描100次，红外光谱经PeakFit 4.12软件进行傅里叶去卷积处理，计算蛋白二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲)含量；
步骤三、取3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇按1：1：1的质量比同时溶于甲醇，配置成质量浓度为100mg/L的香味物质储备液；
实验组：取质量浓度为4mg/mL的SP溶液，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
空白组：取含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
步骤c、采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用测定萜类化合物的顶空浓度，采用75μm的CAR/PDMS萃取纤维，将平衡后的混合液在25℃下吸附30min，250℃下脱附3min后，经GC-MS分析；
其中，GC-MS条件：采用DB-WAX色谱柱(30m×0.18mm×0.18μm)，不分流模式进样；升温程序：柱温在35℃保持3min，以5℃/min升至210℃；质谱离子源温度200℃，电子能量70eV，质量扫描范围m/z 35～500；
肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力用混合液中萜类化合物的自由比例表示：
步骤四、选取SP中的主要蛋白肌红蛋白为模型，探究其与香味化合物的相互作用机制，猪肉肌红蛋白的三维结构模型(PDB ID：1MWC)从美国国立生物技术信息中心蛋白数据库得到，3-蒈烯(ID：26049)、柠檬烯(ID：440917)、芳樟醇(ID：6549)的三维结构从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到，经CHARMm力场优化肌红蛋白和3种萜类化合物结构后，采用Discovery Studio 2019软件中的CDOCKER模块进行分子对接，选择自由结合能最低的构象；
每组实验进行3次重复，采用SPSS 25软件进行统计分析，通过Duncan多重比较或独立样本T检验分析组间差异，P<0.05表示差异显著。采用Origin 8.5软件绘图。
实施例2
一种肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其中肌肉蛋白选取肌原纤维蛋白(MP)，萜类化合物为3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇，具体如下：
步骤一、取40g新鲜猪背最长肌，去除可见脂肪和结缔组织后切碎，加入80mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)，冰浴匀浆(10000rpm，1min)后离心20min(4℃，6000×g)，向上述离心后的沉淀中加入4倍体积的分离缓冲液(0.1M NaCl，2mM MgCl2，1mM EGTA，pH 7.0)，冰浴匀浆(10000rpm，1min)后离心15min(4℃，6000×g)。上述步骤重复3次后收集沉淀，沉淀加入4倍体积的0.1M NaCl溶液，冰浴匀浆(10000rpm，1min)后离心15min(4℃，6000×g)，重复4次。最后一次离心前，沉淀经4层纱布过滤，离心后的沉淀即为MP；
将提取的MP在含0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)中用截留量为8～14kDa的透析袋于4℃透析24h，每4h更换一次磷酸盐缓冲液，纯化后的蛋白采用BCA法测定质量浓度，并于4℃冷藏，12h内使用；
用含0.6M NaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)将MP的质量浓度调整为4mg/mL，在85℃下分别加热1、5、10、30、60min后立即冰浴冷却，获得MP溶液；
步骤二、将MP溶液的浓度调整为2mg/mL，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，分离胶浓度12.5％，浓缩胶浓度5％，上样量10μL，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳完毕后，采用考马斯亮蓝R-250染色2h，蒸馏水脱色，经凝胶成像仪成像；
采用ANS荧光探针法测定MP表面疏水性，将MP溶液的浓度分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，取4mLMP溶液与50μL 8-苯胺-1-萘磺酸ANS(8mM)混合均匀，避光静置10min，测定荧光强度，荧光测定条件：激发波长374nm，发射波长480nm，狭缝5nm，以含0.6MNaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)为空白，表面疏水性以荧光强度与蛋白质量浓度对应曲线的斜率表示；
蛋白总巯基含量测定：取1mLMP溶液添加9mL 50mM磷酸盐缓冲液(含0.6M KCl，10mM EDTA，8M尿素，pH 7.0)混合均匀，取5mL混合液添加0.5mL DTNB(0.2mM)，25℃下反应25min，于412nm测定吸光度，使用摩尔消光系数13600mol-1cm-1计算总巯基含量；
MP溶液稀释至1mg/mL后，采用激光粒度仪测定平均粒径，测量温度25℃，平衡时间1min；
MP溶液冷冻干燥后，采用多次衰减全反射技术(multi-bounceattenuated totalreflection，MB-ATR)结合傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared，FT-IR)测定蛋白二级结构含量，扫描范围400～4000cm-1，分辨率4cm-1，扫描100次，红外光谱经PeakFit 4.12软件进行傅里叶去卷积处理，计算蛋白二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲)含量；
步骤三、取3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇按1：1：1的质量比同时溶于甲醇，配置成质量浓度为100mg/L的香味物质储备液；
实验组：取质量浓度为4mg/mL的MP溶液，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
空白组：取含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
步骤c、采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用测定萜类化合物的顶空浓度，采用75μm的CAR/PDMS萃取纤维，将平衡后的混合液在25℃下吸附30min，250℃下脱附3min后，经GC-MS分析；
其中，GC-MS条件：采用DB-WAX色谱柱(30m×0.18mm×0.18μm)，不分流模式进样；升温程序：柱温在35℃保持3min，以5℃/min升至210℃；质谱离子源温度200℃，电子能量70eV，质量扫描范围m/z 35～500；
肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力用混合液中萜类化合物的自由比例表示：
步骤四、选取MP中的主要蛋白肌球蛋白为模型，探究其与香味化合物的相互作用机制，猪肉肌球蛋白氨基酸序列(序列号：XP_020921876.1)从美国国立生物技术信息中心蛋白数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)得到，通过SWISS-MODEL工具(https://swissmodel.expasy.org/)搜索，以高同源性蛋白6FSA(同源性81.48％)为模板进行同源建模，将构建好的猪肉肌球蛋白三维结构模型通过PROCHECK程序(http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)进行验证，位于有利区域和可接受区域的氨基酸残基数大于99％，表明本模型可用于分子间相互作用，3-蒈烯(ID：26049)、柠檬烯(ID：440917)、芳樟醇(ID：6549)的三维结构从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到，经CHARMm力场优化肌球蛋白和3种萜类化合物结构后，采用Discovery Studio 2019软件中的CDOCKER模块进行分子对接，选择自由结合能最低的构象；
每组实验进行3次重复，采用SPSS 25软件进行统计分析，通过Duncan多重比较或独立样本T检验分析组间差异，P<0.05表示差异显著。采用Origin 8.5软件绘图。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果与分析
实施例2和实施例1中不同加热时间下MP和SP的电泳图分别如图1(A)和图2(B)所示。MP主要由肌球蛋白重链(200kDa)、肌动蛋白(43kDa)、原肌球蛋白(32kDa)和肌球蛋白轻链(22、17kDa)等组成。SP主要包括糖酵解途径的大部分酶、肌酸激酶和肌红蛋白。随加热时间延长，MP的肌球蛋白重链条带逐渐模糊变浅，表明加热诱导蛋白聚集或降解。随加热时间延长，SP中大部分肌浆酶条带逐渐变浅，可能由于SP受热后部分酶由可溶性转换为不可溶。此外，MP和SP凝胶顶部颜色逐渐加深，表明加热诱导了蛋白聚集和交联，形成大分子聚集体。肌肉蛋白受热后可通过二硫键或其他化学键聚集形成大分子团簇，导致分子量上升。
蛋白表面疏水性变化结果与分析
实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的表面疏水性变化如图3所示(注：a-f不同字母表示同一蛋白不同加热时间差异显著(P<0.05)；*表示相同加热时间MP与SP差异显著(P<0.05)。)。表面疏水性可以反映蛋白表面疏水基团的数量，评估蛋白的展开聚集状态。ANS可与蛋白疏水区结合发出荧光，因此被广泛应用于蛋白表面疏水性的测定。如图3所示，MP和SP的表面疏水性在加热5min内先升高，随后逐渐降低。可能原因为加热0～5min内，加热诱导蛋白质结构展开，暴露出内部埋藏的疏水基团，因此疏水基团含量逐渐增加。随着加热时间延长，蛋白的聚集起主导作用，大量暴露的疏水基团导致蛋白交联形成可溶性或不可溶性的聚集体，蛋白的疏水残基可能被嵌入聚集体而导致表面疏水性下降。此外，比较MP和SP的表面疏水性，发现加热1～5min内SP的表面疏水性高于MP，但继续加热后MP的表面疏水性始终较高。这可能由于SP变性温度较低，受热后更易展开而暴露出更多的疏水性氨基酸。随着继续加热，SP聚集速率更快，使更多疏水基团被掩埋。另外，MP和SP氨基酸组成的差异也会影响蛋白表面疏水性高低。
蛋白总巯基含量变化结果与分析
实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的总巯基含量变化如图4所示(注：a-f不同字母表示同一蛋白不同加热时间差异显著(P<0.05)；*表示相同加热时间MP与SP差异显著(P<0.05)。)。总巯基含量是反映蛋白分子间或分子内二硫键形成和断裂的重要参数。如图4所示，MP和SP在加热10min内总巯基含量上升，随后逐渐下降。微环境变化引起蛋白结构的解折叠会使半胱氨酸残基暴露，并最终形成二硫键。加热10min内总巯基含量的增加可归因于加热诱导的蛋白二硫键的断裂或蛋白内部半胱氨酸残基的暴露。随着继续加热，暴露的巯基逐渐形成二硫键以保持蛋白结构的稳定性，因此总巯基含量显著降低。此外，加热后SP的总巯基含量始终高于MP，可能由于SP主要由蛋白酶构成，这些酶多数具有较高含量的半胱氨酸残基，因此SP受热解折叠后能暴露出更多的巯基。
粒径变化结果与分析
实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的粒径变化如图5所示(注：a-f不同字母表示同一蛋白不同加热时间差异显著(P<0.05)；*表示相同加热时间MP与SP差异显著(P<0.05)。)。如图5所示，随着加热时间延长，MP和SP的粒径不断增加，表明加热诱导蛋白聚集形成大分子团簇，这与SDS-PAGE结果相一致。加热过程中蛋白分子可以通过疏水相互作用、二硫键和氢键等化学键聚集并形成团簇，导致粒径增大。加热初期，蛋白粒径增大可归因于蛋白肽链展开，内部疏水基团暴露，蛋白分子间疏水相互作用的增强。随着继续加热，暴露的巯基逐渐形成二硫键，蛋白分子间形成大分子聚集体，粒径继续增大。此外，SP受热后粒径始终显著高于MP(P<0.05)，表明SP的聚集程度更高，这可能与SP的变性温度较低，以及其巯基含量较高，蛋白肽链间更易形成二硫键有关。
二级结构含量变化结果与分析
表2不同加热时间下MP和SP二级结构含量变化
实施例1和实施例2中不同加热时间下SP和MP的二级结构含量变化如表2所示。红外光谱酰胺I带波段(1600～1700cm-1)可以反映蛋白质的二级结构信息，常被用来评估蛋白的构象变化。如表1所示，加热0～60min内，MP和SP的α-螺旋含量分别由46.36％和50.40％降低至37.89％和31.53％，β-折叠含量分别由21.47％和20.63％增加至27.06％和30.86％，无规则卷曲含量分别由14.58％和12.10％增加至16.70％和20.75％。结果表明，随加热时间延长，MP和SP的α-螺旋结构逐渐转化为β-折叠和无规则卷曲结构。加热会促进蛋白肽链“热运动”的增加，破坏维持蛋白结构的分子内力(如疏水作用、氢键、静电作用和二硫键)，并使蛋白结构重组。未加热时，蛋白二级结构以α-螺旋为主。α-螺旋结构的稳定主要由多肽链内部的氢键维持，β-折叠结构通过肽链之间的氢键维持。加热后，蛋白肽链氢键重排，造成α-螺旋向β-折叠的转化。同时，随着加热程度增加，有序结构逐渐消失，蛋白变为一种接近完全展开的无规则卷曲结构，导致无规则卷曲含量上升。此外，与MP相比，SP的二级结构含量变化更显著，表明SP的构象更易受热改变，这与表面疏水性和粒径结果一致。
蛋白对香味化合物吸附能力变化
实施例1和实施例2中不同加热时间下MP和SP对3-蒈烯(A)、柠檬烯(B)和芳樟醇(C)吸附能力的变化如图6所示。加热0～5min内MP和SP样品中3种香味化合物顶空浓度不断降低，表明加热促进了蛋白对香味化合物的吸附；但加热10～60min内，3种香味化合物顶空浓度持续上升，表明蛋白吸附香味能力下降。另外，MP在加热60min时芳樟醇的自由比例大于100％，以及SP加热30或60min时柠檬烯和芳樟醇的自由比例大于100％，表明此时蛋白的添加促进了这些化合物的释放。
前期研究证明，加热可通过改变蛋白构象而影响风味结合位点，温度足够高时蛋白发生变性展开而将结合位点暴露，但过高的温度或过长时间的加热会抑制吸附。由于大部分风味化合物在自然状态下疏水，疏水相互作用常被认为是风味物质与蛋白结合的主要驱动力。因此加热0～5min内，蛋白发生解折叠，内部疏水基团暴露，促进了香味化合物通过疏水相互作用与蛋白结合。另外，芳樟醇含有羟基，还可能通过氢键与蛋白结合。加热可破坏蛋白的α-螺旋结构，将更多的氢键结合位点暴露于蛋白表面。但随着继续加热，蛋白肽链之间相互作用增加，蛋白聚集形成大分子团簇，活性结合位点重新被嵌入蛋白内部，导致蛋白吸附香味能力下降。
表3 3种萜类化合物的性质
注：数据来源https://www.chemsrc.com/。logP表示油水分配系数或疏水系数，logP值越大，说明该物质越亲油。
3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇的性质如表3所示。除加热诱导的蛋白构象变化外，香味化合物和蛋白自身性质也会影响蛋白吸附香味能力。不同加热时间下MP样品中3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇的自由比例分别为59.97～86.22％、54.34～84.92％、76.24～108.68％，SP样品中3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇的自由比例分别为61.12～108.66％、57.87～112.22％、72.64～121.70％。MP和SP对3-蒈烯和柠檬烯的吸附能力强于芳樟醇，可能由于3-蒈烯和柠檬烯的疏水性相似，而芳樟醇疏水性较低。蛋白与香气的相互作用本质是疏水的，蛋白对香味物质的吸附能力与香味物质的疏水性呈正相关。另外，由于芳樟醇含有亲水羟基，水可能与芳樟醇竞争和蛋白的结合位点，这也降低了蛋白对芳樟醇的吸附能力。
此外，加热0～5min内MP和SP的吸附香味能力相似，但加热10～60min内SP的香味吸附能力明显低于MP。可能由于加热10～60min时SP聚集速率大于MP，导致SP中更多的疏水结合位点被掩埋，这与表面疏水性结果一致。另外，由于SP聚集程度更高(图5)，更大的空间位阻可能会阻止香味化合物进入蛋白内部疏水区域，这将进一步减弱SP的香味吸附能力。此外，当加热时间较长时，观测到添加MP或SP对部分香味物质有促释放的作用，可能由于蛋白的加入降低了溶液的表面张力，导致香味物质在气相中更多地被分配。因此，香气在蛋白基质中的释放/保留与蛋白结构特征(如表面疏水性、粒径、表面张力、空间位阻)和香味物质性质(如分子大小、极性、气/液分配系数)等多种因素有关。
分子对接结果分析
为进一步探究肌肉蛋白与萜类化合物的相互作用，采用分子对接技术分析了MP和SP中的主要蛋白组分(肌球蛋白和肌红蛋白)与3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇的结合模式和位点，如图7和图8所示，选取了蛋白与3种萜类化合物的最优对接模式，并在对接3D、2D图中列出了位于结合位点周围影响较大的残基。其中肌球蛋白的4个氨基酸残基(Leu270、Lys273、Lys599、Val651)与3-蒈烯和柠檬烯存在疏水作用力，3个氨基酸残基(Met93、Arg716、Leu774)与芳樟醇存在疏水作用力；肌红蛋白有8个(Val68、Ala71、Leu72、Leu89、His93、Ile99、Leu104、Ile107)、6个(Phe43、Val68、Leu89、His93、Ile99、Ile107)和7个(Leu29、Phe43、Val68、Leu72、Leu89、Ile107、Phe138)氨基酸残基分别与3-蒈烯、柠檬烯和芳樟醇存在疏水作用力。肌球蛋白和肌红蛋白与3-蒈烯和柠檬烯之间除疏水作用力外未检测到其他化学作用力，表明疏水相互作用占主要贡献。而肌球蛋白Ser715残基与芳樟醇之间还可形成键长为的常规氢键，肌红蛋白His93残基与芳樟醇之间形成了键长为/>的碳氢键。一般认为，键长越接近/>氢键作用力越强，越接近/>氢键作用力越弱。肌球蛋白和肌红蛋白与芳樟醇之间形成氢键键长较短，表明存在较强的氢键相互作用。
本发明探究了热处理过程中MP和SP对3种萜类化合物的吸附能力与蛋白构象变化的关联，明确了肌肉蛋白与萜类化合物的相互作用机制。研究发现，加热5min内，热处理使MP和SP二级结构展开，埋藏在蛋白内部的疏水、氢键等结合位点暴露，促进了蛋白对香味物质的吸附；但随着加热时间延长，蛋白逐渐聚集为大分子团簇，活性结合位点被掩埋，蛋白对香味物质吸附能力逐渐下降。SP由于受热后聚集程度更高，导致更多结合位点被埋藏及更高的空间位阻效应，使其在加热10～60min内吸附香味能力弱于MP。此外，由于芳樟醇较小的疏水系数(logP)，MP和SP对其吸附能力弱于3-蒈烯和柠檬烯。最后，分子对接结果证实，3种萜类化合物主要通过疏水相互作用与肌肉蛋白结合，芳樟醇还可通过氢键与肌肉蛋白结合。研究结果可为热加工中肌肉蛋白与香味物质相互作用机制提供理论基础，对改善肉制品风味具有指导意义。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (9)

1.肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、提取鲜肉原料中的肌肉蛋白，纯化，加热处理，获得蛋白溶液；
步骤二、检测分析加热处理前后肌肉蛋白的性能变化；
步骤三、取萜类化合物溶于溶剂中制成香味物质储备液，将其与所述蛋白溶液密封混合，测定肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力；
步骤四、将肌肉蛋白的三维结构模型与萜类化合物的三维结构模型进行分子对接，选择自由结合能最低的构象，分析肌肉蛋白与萜类化合物的结合模式和位点，明确二者的相互作用机制。
2.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述肌肉蛋白为肌原纤维蛋白和肌浆蛋白。
3.如权利要求2所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的提取方法分别为：
取鲜肉原料，去除可见脂肪和结缔组织，切碎，加入pH为7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液，冰浴匀浆后在4℃下离心，取上清液经纱布过滤后即得肌浆蛋白；
取沉淀加入4倍体积的pH为7.0的分离缓冲液，所述分离缓冲液为0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和1mmol/L EGTA的混合溶液，冰浴匀浆后4℃下离心，上述步骤重复3次后，收集沉淀，加入4倍体积的0.1mol/L NaCl溶液，冰浴匀浆后4℃下离心，重复4次，最后一次离心前，沉淀经纱布过滤，离心后的沉淀即得肌原纤维蛋白。
4.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述步骤一中纯化的具体过程为：将提取的肌肉蛋白在含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液中用截留量为8～14kDa的透析袋于4℃透析24h，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，透析过程中每4h更换一次磷酸盐缓冲液，获得纯化后的肌肉蛋白。
5.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述步骤一中加热处理的具体过程为：用含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液将纯化后的肌肉蛋白的质量浓度调整为4mg/mL，并在85℃下分别加热1～60min后立即冰浴冷却，获得所述蛋白溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0。
6.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述萜类化合物为3-蒈烯、柠檬烯、芳樟醇，将三者按1：1：1的质量比同时溶于甲醇中，配置成质量浓度为100mg/L的香味物质储备液。
7.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述步骤三中肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力测定方法为：
实验组：取质量浓度为4mg/mL的蛋白溶液，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
空白组：取含0.6mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0，向其中添加质量浓度为100mg/L的香味物质储备液，使混合液中萜类化合物的最终质量浓度为1mg/L，密封混匀后，于4℃下平衡12h；
步骤c、采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用测定萜类化合物的顶空浓度，采用75μm的CAR/PDMS萃取纤维，将平衡后的混合液在25℃下吸附30min，250℃下脱附3min后，经GC-MS分析；
其中，GC-MS条件：采用DB-WAX色谱柱(30m×0.18mm×0.18μm)，不分流模式进样；升温程序：柱温在35℃保持3min，以5℃/min升至210℃；质谱离子源温度200℃，电子能量70eV，质量扫描范围m/z 35～500；
肌肉蛋白对萜类化合物的吸附能力用混合液中萜类化合物的自由比例表示：
8.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述步骤四中分子对接过程为：将肌肉蛋白的三维结构模型与萜类化合物的三维结构模型经CHARMm力场优化后，采用Discovery Studio 2019软件中的CDOCKER模块进行分子对接。
9.如权利要求1所述的肌肉蛋白与香辛料中萜类化合物分子相互作用的检测方法，其特征在于，所述步骤二中加热处理前后肌肉蛋白的性能变化检测包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、表面疏水性检测、总巯基含量检测、粒径检测、二级结构含量检测。
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