CN116814513B

CN116814513B - 生防菌株hz109及其在预防水稻稻粒黑粉病中的应用

Info

Publication number: CN116814513B
Application number: CN202311112360.6A
Authority: CN
Inventors: 夏燃; 胡伟民; 胡晋; 关亚静; 剧佳华; 董文霞; 任禹琪
Original assignee: Hainan Research Institute Of Zhejiang University
Current assignee: Hainan Research Institute Of Zhejiang University
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2023-11-07
Anticipated expiration: 2043-08-31
Also published as: CN116814513A

Abstract

本发明公开了一种生防菌株HZ109及其在预防水稻稻粒黑粉病中的应用，该生防菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HZ109，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023798，保藏日期为2023年5月22日。本发明采用平板对峙法进行对比试验，发现该生防菌株在PDA培养基上对稻粒黑粉菌具有显著的抑制效果，平均抑制率达到了85.64%；利用该生防菌株制备的活菌发酵液能够显著降低杂交水稻制种田稻粒黑粉病的发病率，并优于常用药剂爱苗，同时对杂交稻种子生活力和活力没有不良影响，避免种子千粒重和发芽率的下降，保障收获后的种子品质。

Description

生防菌株HZ109及其在预防水稻稻粒黑粉病中的应用

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及生防菌株HZ109及其在预防水稻稻粒黑粉病中的应用。

背景技术

稻粒黑粉病( Rice kernel smut) 是一种发生于水稻上的真菌性病害，其主要分布在亚洲地区，美洲和非洲的部分稻区也有分布（Carris LM, Castlebury LA, GoatesBJ. Nonsystemic bunt fungi--Tilletia indicaandT. horrida: a review ofhistory, systematics, and biology. Annu Rev Phytopathol. 2006;44:113-133.）。稻粒黑粉病由稻粒黑粉菌（Tilletia horrida）引起，属于担子菌门腥黑粉菌属（黄富,程开禄,潘学贤.稻粒黑粉病菌的分类学研究进展[J].云南农业大学学报,1998,13(1):145-147.）。被稻粒黑粉病为害的水稻，发病的籽粒全部或部分被破坏，颖壳内部被黑色粉末状的的稻粒黑粉菌冬孢子充满。过去，稻粒黑粉病一直没有引起研究人员过多的重视，因为其对水稻造成的危害和经济损失较小。由于三系配套的特殊性，不育系柱头外露率越高，越有利于接收外部花粉，提高异交结实率，而这一特征恰恰会导致稻粒黑粉病的病原菌借机侵染雄性不育系。自此，稻粒黑粉病渐渐上升成为影响杂交水稻种子生产的重要病害之一，每年给杂交水稻制种产业造成大量的经济损失。一般年份，杂交水稻制种田中稻粒黑粉病病粒率约为5%～20%，发病严重年份病粒率甚至可达40%～60%（李华全.论水稻制种稻粒黑粉病的发病规律及防治技术[J].种子,2000(05):55-56.）。

尽管稻粒黑粉病给世界各地的杂交水稻种子生产造成了非常严重的经济损失，但人们一直依赖化学杀菌剂来预防和控制稻粒黑粉病（周素明.水稻稻粒黑粉病的发病特点与防治措施[J].湖北植保,2018(04):35-36+50.），其中化学药剂“爱苗”是目前使用最为广泛的稻粒黑粉病防治药剂（唐祖辉. 爱苗在杂交水稻制种中防治纹枯病和稻粒黑粉病的应用研究[J]. 杂交水稻, 2016, 31(01):31-32.）。化学药剂防治稻粒黑粉病的效果虽好，但是可能会造成环境污染，也容易引起病菌产生抗药性，不符合绿色发展理念。相比较而言，通过生物防治控制植物病害有着很多优点，对环境友好，且往往成本更低，符合农业的发展趋势。近年来，植物病害的生物防治技术得到了深入的研究，如张荣胜等筛选得到的解淀粉芽胞杆菌Lx-11能够有效防治水稻细菌性条斑病，其防治效果大于60%（张荣胜,陈思宇,王晓宇,罗楚平,刘永锋,陈志谊.解淀粉芽胞杆菌Lx-11防治水稻细菌性条斑病应用技术研究[J].中国生物防治学报,2013,29(04):595-600.）；公告号为CN115074278B的专利文献公开了生防菌株sx27及其在防治水稻稻粒黑粉病中的应用，该生防菌株命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）sx27，利用该生防菌株制备的活菌发酵液能够显著降低杂交水稻制种田稻粒黑粉病的发病率，田间相对防效达到35.19%，略好于常用药剂爱苗。但截止目前，生物防治在预防稻粒黑粉病危害上的实际应用仍未见报道。

综上所述，研发能够用于防治稻粒黑粉病危害的生防菌菌株及在杂交水稻制种田的具体应用技术有着非常重要的价值。

发明内容

本发明提供了一种生防菌株HZ109及其在预防水稻稻粒黑粉病中的应用，该生防菌株能够在保证种子千粒重和发芽率不下降的情况下，有效降低稻粒黑粉病的发病率。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种生防菌株HZ109，分类命名为Bacillus velezensisHZ109，中文命名为贝莱斯芽孢杆菌，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2023798，保藏日期为2023年5月22日。

具体的，所述生防菌株HZ109的gyrB序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种生防菌剂，活性成分为生防菌株HZ109。

其中，所述生防菌株HZ109的浓度为1×10⁷CFU·mL^-1～1×10⁸CFU·mL^-1。

本发明还提供了一种活菌发酵液，所述活菌发酵液中包含生防菌株HZ109。

其中，所述生防菌株HZ109的浓度为1×10⁷～1×10⁸CFU·mL^-1。

本发明还提供了生防菌株HZ109、或生防菌剂、或活菌发酵液在预防水稻稻粒黑粉病中的应用。

进一步地，所述水稻稻粒黑粉病发生在杂交水稻制种田中。

本发明还提供了一种预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病的方法，包括以下步骤：

在杂交水稻制种过程中，将所述的生防菌剂，或所述的活菌发酵液，向母本喷施n次，每次喷施时间间隔5～7 d；所述n为2~3。

进一步地，所述n为2；第一次施药，母本抽穗率在5%以内的初花刚见穗时期，均匀喷施于母本植株穗层；第二次施药，母本抽穗率在35%～45%之间的盛花初期，均匀喷施于母本植株穗层。

进一步地，所述生防菌剂或活菌发酵液的喷施量为20～30 L·（亩·次）^-1。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供的一种可拮抗杂交水稻制种田稻粒黑粉病的生防菌HZ109，在实验室条件下采用平板对峙法进行对比试验，其对稻粒黑粉菌具有显著的抑制效果，平均抑制率达到了85.64%；利用其制备的活菌发酵液能够显著降低杂交水稻制种田稻粒黑粉病的发病率，优于常用药剂爱苗，同时对杂交稻种子生活力和活力没有不良影响，避免种子千粒重和发芽率的下降，保障收获后的种子品质。

（2）本发明提供的预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病危害的方法属于植物保护技术-生物防治领域，主要依靠微生物间拮抗作用完成，对环境友好，不产生污染，不会引起稻粒黑粉病抗药性或耐药性的产生，符合未来农业发展趋势，生产工艺简单，适合推广。

（3）本发明生防菌HZ109为贝莱斯芽孢杆菌，有助于进一步拓宽生防菌在防治杂交水稻制种田稻粒黑粉病上的应用。

附图说明

图1为本发明生防菌HZ109在LB平板上的生长情况。

图2为实施例1中生防菌HZ109和稻粒黑粉菌的室内平板对峙试验结果；

其中，A为添加生防菌HZ109时稻粒黑粉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的生长图片；CK为未添加生防菌HZ109时稻粒黑粉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的生长图片（对照）。

图3为生防菌HZ109基于gyrB序列的系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例l稻粒黑粉病生防菌的分离、筛选和鉴定

生防菌菌株HZ109于2022年分离自浙江省杭州市浙江大学紫金港校区农业试验站杂交水稻制种田雄性不育系植株根际土壤，为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），保藏于中国典型培养物保藏中心（位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内），保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为Bacillus velezensisHZ109，保藏编号为CCTCC M2023798，该培养物已于2023年5月22日由本保藏中心收到，并登记入册。该培养物的存活性保藏中心于2023年05月29日检测完毕，结果为存活。

该菌株分离、筛选和鉴定分析的主要步骤如下：

1、供试材料

（1）稻粒黑粉菌分离自杂交水稻制种田中的稻粒黑粉病病粒，保存于实验室4℃冰箱。

（2）供试土样为采自杂交水稻制种田雄性不育系植株的根际土壤，保存于实验室4℃冰箱。

2、供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（1000 mL）：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，定容到1000 mL，121 ℃湿热灭菌20 min。

LB培养基（1000 mL）：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，定容到1000 mL，121 ℃湿热灭菌20 min。

3、试验方法

（1）根际土壤细菌的分离与纯化

称取5 g土样，放入装有小钢珠的三角烧瓶中，加入100 mL无菌水，置于37℃、180r·min^-1的恒温摇床中充分震荡1 h，取出并静置15 min，在无菌条件下取1 mL上清液，梯度稀释成1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5稀释液，分别吸取100 μL涂布在LB平板上，待长出单菌落后，选择具有不同形态特征的单菌落接入新的LB培养基中进行分离纯化，获得纯培养菌，然后将菌液与50%甘油1:1混合，放入-80℃冰箱中冷冻备用。

（2）稻粒黑粉菌生防菌的筛选

采用平板对峙法筛选对稻粒黑粉病菌具有生防活性的菌株，在超净工作台中，用菌落打孔器打取直径为5 mm的稻粒黑粉菌菌饼，接种于PDA培养基中心，在其四周2 cm处，接种四个直径为5 mm的初筛菌株的菌饼，以只接稻粒黑粉菌的平板作为对照，倒扣置于28℃生化培养箱中培养15 d，观察并计算抑菌率。

抑菌率（%）=[（对照组病原菌直径-处理组病原菌直径）/（对照组病原菌直径-0.5）]×100%。

（3）生防菌菌株鉴定

使用OMEGA细菌DNA提取试剂盒提取筛选出的拮抗菌株DNA。采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板。扩增gyrB基因采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，将所得产物送至杭州尚亚生物工程公司进行DNA测序。测序结果在NCBI上进行BLAST序列比对，利用Mega7.0软件进行序列分析，采用用Maximum likelihood tree进行构建进化树。

统计分析：采用SPSS 24.0软件进行数据统计分析，用Duncan氏新复极差法对试验数据进行差异显著性分析（P﹤0.05）。

4、实验结果

（1）生防菌的分离和筛选

从杂交水稻制种田雄性不育系根际土壤中分离到37株菌株，筛选结果如表1所示，其中对稻粒黑粉菌防效最好的菌株为HZ109，抑制率达到了85.64%（图2）。

如图2所示，其中A为添加生防菌HZ109时稻粒黑粉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的生长图片；CK为未添加生防菌HZ109时稻粒黑粉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的生长图片（对照）。

表1 生防菌株对稻粒黑粉菌生长的抑制效果

注：表中同一列数据后不同小写字母表示不同菌株对稻粒黑粉菌抑制情况的差异显著性（P﹤0.05，Duncan）

（2）生防菌HZ109的鉴定

将上述获得的对稻粒黑粉菌生长抑制效果好的菌株HZ109根据gyrB基因片段进行测序，得到长度为1135的gyrB基因序列，其碱基序列见序列表。由进化树可知菌株HZ109与Bacillus velezensis在同一分枝上，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（图3）。

实施例2生防菌HZ109预防“华浙优1号”制种田稻粒黑粉病的田间试验

实施例1确认了生防菌HZ109可显著拮抗和抑制稻粒黑粉菌的生长；本实施例进一步验证HZ109预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病发生的效果及施用后对种子质量的影响。

1、供试材料：“华浙优1号”；其母本为“华浙A”，父本为“华恢1号”，属于籼型三系杂交水稻，由中国水稻研究所、浙江勿忘农种业股份限公司联合选育，该杂交组合父母本材料均由浙江勿忘农种业股份有限公司提供。

2、供试药剂：供试生防菌为实施例1中筛选得到的在室内对峙试验中对稻粒黑粉菌抑制效果最好的菌株HZ109。对照化学药剂为“爱苗”，其通用名称为苯甲·丙环唑（30%苯醚甲环唑·丙环唑乳油），由瑞士先正达作物保护有限公司生产。

3、试验方法

试验于2022年在位于浙江省丽水市遂昌县云峰街道龙口村的浙江勿忘农种业股份有限公司杂交水稻制种田进行，根据亲本的生育期特点进行分期播种。移栽时父母本行比2：8，父母本间隔25 cm；父本双行，行距24 cm，株距24 cm，每行内第一期和第二期父本的比例为1：1，2本插；母本适当密植，插植密度15 cm（株距）×22.5 cm（行距），每蔸插5粒谷秧。抽穗后喷施赤霉素两次，以保证双亲花期相遇。

生防菌HZ109活菌发酵液的制备：用菌落打孔器取直径为5 mm的在LB培养基上活化的HZ109菌饼，放进装有LB培养基的锥形瓶，放入180 r·min^-1、36℃的摇床中震荡培养72h，分别调整菌液浓度至10⁷cfu·mL^-1和10⁸cfu·mL^-1两个浓度，分别作为HZ109（10⁷cfu·mL^-1）处理和HZ109（10⁸cfu·mL^-1）处理。

设置两个对照：CK-1是清水；CK-2是量取7.5 mL“爱苗”溶于15 L水中，作为化学药剂对照。

处理和对照均按照每亩30 L用量喷施，三次重复。结合田间肥力水平和地形，采取随机区组设计，单个重复小区南北向长度约为7 m，东西向宽度约为约为2.3 m，小区面积为16.1 m²。

喷施时间和方法：第一次施药，在母本刚见穗时（初花，母本抽穗5%以内）均匀喷施于母本植株穗层；第二次施药，在母本盛花初期（母本抽穗40%左右）均匀喷施于母本植株穗层。两次施药间隔6 d。

取样方法：母本黄熟期进行田间取样，采用五点取样法，每小区共割取25兜穗装入网袋，带回实验室统计母本结实率和病粒率等指标，计算相对防效；收获的种子干燥后，测定种子千粒重、发芽势与发芽率等指标。种子千粒重、发芽势和发芽率等指标的测定参照《农作物种子检验规程》（GB/T 3543，1995）规定进行。发芽试验采用纸上发芽，每盒100粒，重复三次。发芽条件为25℃黑暗12 h、光照12 h。从置种次日开始记录发芽种子数，第4 d计算发芽势，第7 d计算发芽率。

4、试验结果

由表2可知，经生防菌HZ109活菌发酵液的处理后，“华浙优1号”制种田中HZ109（10⁸cfu·mL^-1）处理的稻粒黑粉病病粒率为8.49%，显著低于CK-1（清水），也低于CK-2（爱苗）；相对于CK-1的防效达到47.56%，优于CK-2，但两者之间无显著差异。HZ109（10⁷cfu·mL^-1）处理的稻粒黑粉病病粒率也显著低于CK-1，与CK-2相仿。此外，两种不同浓度的HZ109活菌发酵液处理后，其母本的田间结实率和F₁代种子千粒重与CK-1相比，均无显著差异，说明菌液处理对其结实率和千粒重没有不良影响。

由表3可知，F₁种子的发芽势、发芽率、根长和苗高与CK-1相比，均无显著差异，说明田间喷施HZ109活菌发酵液对“华浙优1号”F₁代种子生活力和活力没有不良影响。

表2 HZ109活菌发酵液处理对“华浙优1号”制种田稻粒黑粉病的防效

处理编号	结实率/%	千粒重/g	病粒率/%	相对CK-1防效/%
					HZ109（108 cfu·mL-1）	40.71±4.61 a	21.40±0.20 a	8.49±1.42 a	47.56±8.80 a
HZ109（107 cfu·mL-1）	41.57±4.02 a	21.57±0.39 a	9.27±1.46 a	42.76±9.02 a
					CK-2（爱苗）	43.26±4.01 a	21.55±0.60 a	9.23±1.71 a	42.97±10.53 a
CK-1（清水）	42.50±4.25 a	21.65±0.24 a	16.19±0.92 b	-

表3 HZ109活菌发酵液处理对“华浙优1号”制种田种子发芽指标的影响

处理编号	发芽势/%	发芽率/%	根长/cm	苗高/cm
					HZ109（108 cfu·mL-1）	92.67±1.53 a	95.00±1.00 a	2.94±0.16 a	4.16±0.16 a
HZ109（107 cfu·mL-1）	91.67±0.58 a	95.33±1.53 a	3.13±0.12 a	4.41±0.22 a
					CK-2（爱苗）	91.67±1.15 a	95.67±0.58 a	3.09±0.10 a	4.48±0.12 a
CK-1（清水）	92.33±0.58 a	95.33±0.58 a	3.16±0.05 a	4.46±0.13 a

实施例3生防菌HZ109对“中浙优8号”制种田稻粒黑粉病防治的田间试验

本发明实施例2确认了生防菌HZ109施用后可预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病的发生且对种子质量无不良影响；本实施例进一步验证HZ109预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病发生的效果及施用后对种子质量的影响。

1、供试材料：“中浙优8号”；其母本为“中浙A”，父本为“T-8”，属于籼型三系杂交水稻，由中国水稻研究所、浙江勿忘农种业股份限公司联合选育，该杂交组合父母本材料均由浙江勿忘农种业股份有限公司提供。

2、供试药剂：供试生防菌和供试对照化学药剂“爱苗”同实施例2。

3、试验方法

试验于2022年在位于浙江省丽水市遂昌县云峰街道龙祥村的浙江勿忘农种业股份有限公司杂交水稻制种田进行，父母本种植方式、试验设计、小区面积、采用的生防菌处理及对照、喷施用量、喷施时间方法、取样方法、统计分析方法与实施例2一致。

4、试验结果

由表4可知，经生防菌HZ109活菌发酵液的处理后，“中浙优8号”制种田中HZ109（10⁸cfu·mL^-1）处理的稻粒黑粉病病粒率为6.58%，显著低于CK-1（清水）和CK-2（爱苗），相对于CK-1的防效达到了47.64%，并显著优于CK-2。HZ109（10⁷cfu·mL^-1）处理的稻粒黑粉病病粒率也显著低于CK-1，略低于CK-2。此外，两种不同浓度的HZ109活菌发酵液处理后，其母本的田间结实率和F₁代种子千粒重与CK-1相比，均无显著差异，说明菌液处理对其结实率和千粒重没有不良影响。

由表5可知，F₁种子的发芽势、发芽率、根长和苗高与CK-1相比，均无显著差异，说明田间喷施HZ109活菌发酵液对‘中浙优8号’F₁代种子生活力和活力没有不良影响。

表4 HZ109活菌发酵液处理对“中浙优8号”制种田稻粒黑粉病的防效

处理编号	结实率/%	千粒重/g	病粒率/%	相对CK-1防效/%
					HZ109（108 cfu·mL-1）	19.42±3.47 a	21.24±0.43 a	6.58±0.18 a	47.64±1.45 a
HZ109（107 cfu·mL-1）	19.57±4.44 a	19.91±0.57 a	6.76±0.21 ab	46.20±1.68 b
					CK-2（爱苗）	18.96±3.70 a	20.59±0.26 a	7.22±0.11 b	42.51±0.86 b
CK-1（清水）	21.97±4.35 a	20.91±0.54 a	12.56±0.47 c	-

表5HZ109活菌发酵液处理对“中浙优8号”制种田种子发芽指标的影响

处理编号	发芽势/%	发芽率/%	根长/cm	苗高/cm
					HZ109（108 cfu·mL-1）	88.67±1.15 a	94.33±1.15 a	3.51±0.10 a	4.32±0.24 a
HZ109（107 cfu·mL-1）	89.00±1.73 a	94.67±1.53 a	3.56±0.17 a	4.35±0.37 a
					CK-2（爱苗）	88.33±0.58 a	94.00±1.00 a	3.52±0.08 a	4.32±0.18 a
CK-1（清水）	90.00±1.73 a	93.67±0.58 a	3.54±0.29 a	4.35±0.05 a

Claims

1.一种生防菌株HZ109，其特征在于，命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HZ109，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023798，保藏日期为2023年5月22日。

2.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为权利要求1所述的生防菌株HZ109。

3.如权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中，所述生防菌株HZ109的浓度为1×10⁷CFU·mL^-1～1×10⁸CFU·mL^-1。

4.一种活菌发酵液，其特征在于，所述活菌发酵液中包含权利要求1所述的生防菌株HZ109。

5.如权利要求4所述的活菌发酵液，其特征在于，活菌发酵液中，所述生防菌株HZ109的浓度为1×10⁷～1×10⁸CFU·mL^-1。

6.如权利要求1所述的生防菌株HZ109，或权利要求2～3任一项所述的生防菌剂，或权利要求4～5任一项所述的活菌发酵液在预防水稻稻粒黑粉病中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水稻稻粒黑粉病发生在杂交水稻制种田中。

8.一种预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在杂交水稻制种过程中，将权利要求2～3任一项所述的生防菌剂，或权利要求4～5任一项所述的活菌发酵液，向母本喷施n次，每次喷施时间间隔5～7 d；所述n为2~3。

9.如权利要求8所述的预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病的方法，其特征在于，所述n为2；

第一次施药，母本抽穗率在5%以内的初花刚见穗时期，均匀喷施于母本植株穗层；第二次施药，母本抽穗率在35%～45%之间的盛花初期，均匀喷施于母本植株穗层。

10.如权利要求8所述的预防杂交水稻制种田稻粒黑粉病的方法，其特征在于，所述生防菌剂或活菌发酵液的喷施量为20～30 L·（亩·次）^-1。